desempeÑo de un reactor sharon en la remociÓn de …
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA UNIDAD IZTAPALAPA
DESEMPEÑO DE UN REACTOR SHARON EN LA REMOCIÓN DE CARBONO Y NITRÓGENO
T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN BIOTECNOLOGIA P R E S E N T A :
ING. ANGELES XITLALLI TORRES BOJORGES
Directora: Dra. Mónica A. Meraz Rodríguez Asesores: Dr. Oscar A. Monroy Hermosillo
Dr. C. J. Juvencio Galíndez Mayer
Iztapalapa D.F., 2007
LA MAESTRIA EN BIOTECNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA
METROPOLITANA ESTA INCLUIDA EN EL PADRÓN NACIONAL DE
POSGRADO DEL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
(CONACYT) Y ADEMAS CUENTA CON APOYO DEL MISMO CONSEJO CON EL
NÚMERO DE REGISTRO 0471 - 0.
ESTE TRABAJO FUE REALIZADO EN EL LABORATORIO DE TRATAMIENTO
DE AGUAS RESIDUALES Y MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL CON APOYO DEL
CONACYT CON LA BECA No. 180902.
ii
Agradecimientos Esta sección del texto, que no admite correcciones, permite agradecer a todas y cada una de las personas que contribuyeron a la realización y culminación de este trabajo. Agradezco a mis padres, Guillermina y Faustino, por darme la vida, pero más importante por su inmenso apoyo, aún cuando nuestros criterios y expectativas difieran. Por su amor y por enseñarme que el trabajo duro siempre trae recompensas. A mi hermano, Victor, por ser mi cómplice y mi amigo, por todos los recuerdos acumulados a lo largo de los años y por el próximo hueso, jajajaja. Échele ganas mi lic! A Froy, por todo tu amor y tu apoyo. Gracias por estar a mi lado cuando más lo necesitaba, por mostrarme que siempre hay, por lo menos un motivo para no rendirse. Este trabajo también te pertenece. A mi directora de tesis, la Dra. Mónica Meraz, por su ayuda y apoyo durante el trabajo experimental y por su amistad. Al Dr. Oscar Monroy por permitirme formar parte de su grupo de investigación cuando comencé mi aventura en la UAM, por sus enseñanzas a lo largo de este proyecto y las críticas al mismo. Al Dr. Juvencio Galíndez por las charlas amenas y por aceptar ser parte de este trabajo. A los miembros del comité evaluador, la Dra. Anne Claire Texier y el Dr. Frédéric Thalasso, por el tiempo dedicado al revisar y sugerir mejoras al presente trabajo. A los compañeros del laboratorio de tratamiento de aguas residuales que hicieron agradable el trabajo experimental: Paty, Javier, Ulises G., Ulises D., Huizache, Gehovana, Edgar, Juan Carlos P., Juan Carlos M. A Alan Miramontes que realizó su servicio social con este proyecto, muchas gracias por tu apoyo. A los compañeros y amigos de generación: Ruth, Verónica, Eduardo, Itzamná, Nancy. A los amigos obtenidos a lo largo de toda la vida: Heidi, Vero, Marbella, Pilar, Efraín, Sarudy, Coatzin, Raquel.
iv
A mi familia política, Araceli y Heriberto, por las amenas charlas y por su apoyo durante el tiempo que me acogieron en su casa. A la industria de los videojuegos, el anime y el manga que me brindaron horas y horas de entretenimiento y desahogo emocional durante el trabajo experimental y la posterior escritura de este trabajo. A los contribuyentes, gracias a sus aportaciones este trabajo pudo llevarse a cabo. A todos aquellos que por falta de espacio y memoria no están incluidos. GRACIAS. “…Pero yo siempre digo que la vida es hermosa, que la vida merece ser vivida; en cambio la muerte merece ser morida...”
Disuacidio (Fragmento) Bromato de Armonio
Les Luthiers
v
C O N T E N I D O
RESUMEN ………………………………………………………………………………………………….viii ABSTRACT …………………………………………………………………………………………………..ix NOMENCLATURA …………………………………………………………………………………………..x
I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 2 I.1. JUSTIFICACIÓN....................................................................................................................................................... 2 I.2. OBJETIVOS............................................................................................................................................................... 5
I.2.1. General ............................................................................................................................................................... 5 I.2.2. Particulares ........................................................................................................................................................ 5
I.3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA .................................................................................................................................. 6 I.3.1. Ciclo del Nitrógeno............................................................................................................................................. 6 I.3.2. Nitrificación ........................................................................................................................................................ 7
I.3.2.1. Microorganismos nitrificantes................................................................................................................ 7 I.3.3. Bioquímica de la nitrificación............................................................................................................................. 8 I.3.4. Efecto de la materia orgánica sobre la nitrificación..........................................................................................10 I.3.5. Proceso SHARON ..............................................................................................................................................12 I.3.6. ANAMMOX: Una desnitrificación autotrófica...................................................................................................17
II. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................... 22 II.1. SISTEMA EXPERIMENTAL ...........................................................................................................................................22
II.1.1. Reactor .............................................................................................................................................................22 II.1.2. Inóculo..............................................................................................................................................................23
II.2. ENSAYOS EN REACTOR CONTINUO ..............................................................................................................................24 II.2.1. Etapa nitrificante ..............................................................................................................................................24 II.2.2. Etapa nitrificante-heterótrofa...........................................................................................................................24 II.2.3. Parámetros de operación..................................................................................................................................25 II.2.4. Condiciones de operación ................................................................................................................................27
II.3. ENSAYOS EN REACTORES INTERMITENTES ..................................................................................................................27 II.3.1. Actividad específica ..........................................................................................................................................28
II.3.1.1. Actividad específica nitrificante (qN) ................................................................................................29 II.3.1.2. Actividad específica desnitrificante (qDnit) ........................................................................................30 II.3.1.3. Coeficiente específico de consumo de oxígeno (qOD) y kLa ..............................................................31
II.3.2. Prueba abiótica ................................................................................................................................................32 II.4. TÉCNICAS ANALÍTICAS ..............................................................................................................................................33
II.4.1. Cuantificación de nitrito y nitrato ....................................................................................................................33 II.4.1.1. Electroforesis capilar ........................................................................................................................33 II.4.1.2. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).............................................................................34
II.4.2. Amonio..............................................................................................................................................................35 II.4.3. Sólidos suspendidos en el licor mezclado (SSLM) ............................................................................................35 II.4.4. Carbonato.........................................................................................................................................................36 II.4.5. Acetato..............................................................................................................................................................36 II.4.6. Nitrógeno molecular. ........................................................................................................................................37
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................... 39 III.1. OPERACIÓN DEL SISTEMA SHARON ........................................................................................................................39 III.2. BALANCE DE NITRÓGENO..........................................................................................................................................45
IV. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................... 54 V. BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................ 57 VI. ANEXO ....................................................................................................................... 66
VI.1. ANEXO 1. CURVAS DE REFERENCIA ........................................................................................................................66 VI.1.1. NO2
- y NO3-......................................................................................................................................................66
VI.1.1.1. Electroforesis capilar ........................................................................................................................66 VI.1.1.2. HPLC ................................................................................................................................................67
VI.1.2. NH4+ ................................................................................................................................................................68
VI.1.3. Acetato.............................................................................................................................................................68 VI.1.4. N2.....................................................................................................................................................................69
vi
VI.2. ANEXO 2. PRUEBAS EN REACTORES INTERMITENTES...............................................................................................69 VI.2.1. Cinética nitrificante. Etapa I ...........................................................................................................................69 VI.2.2. Cinética nitrificante. Etapa II ..........................................................................................................................70 VI.2.3. Cinética nitrificante. Etapa III.........................................................................................................................70 VI.2.4. Cinética desnitrificante....................................................................................................................................71
INDICE DE TABLAS Tabla I.1. Concentraciones (mg·L-1) de DQO, DBO, N y P de aguas residuales............................................... 4 Tabla I.2. Cambio de energía libre en la reacción de oxidación del amoniaco................................................. 8 Tabla I.3. Cambio de energía libre en la reacción de oxidación del nitrito..................................................... 10 Tabla II.1. Composición del medio mineral quimiolitotrófico. ........................................................................ 24 Tabla II.2 Composición del medio mineral para la etapa nitrificante-heterótrofa. ......................................... 24 Tabla II.3. Condiciones de operación del reactor a lo largo del estudio......................................................... 27 Tabla II.4. Composición del medio de cultivo utilizado para cinética nitrificante ......................................... 29 Tabla II.5. Composición del medio de cultivo para la prueba en lote desnitrificante...................................... 30 Tabla II.6. Condiciones analíticas para determinar iones NO2
- y NO3- por electroforesis capilar. ................ 34
Tabla II.7. Condiciones analíticas para determinar iones NO2- y NO3
- por HPLC ......................................... 34 Tabla II.8. Condiciones de operación del cromatógrafo de gases HP 5890.................................................... 37 Tabla II.9. Condiciones de operación del cromatógrafo de gases Gow-Mac .................................................. 37 Tabla III.1. Constantes cinéticas reportadas en la literatura y obtenidas en este trabajo de los organismos presentes en el reactor...................................................................................................................................... 44 Tabla III.2. Tasa de consumo y transferencia de oxígeno en cada etapa de operación del reactor. ............... 45 Tabla III.3. Concentraciones teóricas de amoniaco libre en cada etapa de operación ................................... 48 Tabla III.4. Valores teóricos y experimentales de gas amoniaco perdido en el sistema por desorción........... 49 Tabla III.5. Sumario de resultados de la operación del reactor SHARON. ..................................................... 50
INDICE DE FIGURAS
Figura I.1. Alternativas convencionales para la eliminación de C y N de aguas residuales. ............................ 3 Figura I.2. Esquematización del ciclo del nitrógeno.......................................................................................... 6 Figura I.3. Transporte de electrones en Nitrosomonas europaea...................................................................... 9 Figura I.4. Efecto de la temperatura sobre la tasa máxima de crecimiento de las BAO y BNO. Calculado con la ecuación de Arrhenius a partir de los valores descritos por van Hulle (2005)............................................ 13 Figura I.5. Mecanismo propuesto para la oxidación anaerobia de amonio por Brocadia anammoxidans. .... 19 Figura II.1. Representación esquemática del sistema experimental empleado en este estudio. ...................... 22 Figura II.2. Representación esquemática del sistema empleado para la prueba abiótica............................... 33 Figura III.1. Comportamiento de los compuestos nitrogenados y promedios de concentración de oxígeno disuelto durante la operación del reactor. ....................................................................................................... 40 Figura III.2. Relación de la eficiencia de conversión y tasa de producción de NO2
- con respecto al TRC. .... 41 Figura III.3. Fluctuación de los compuestos carbonados y nitrogenados durante las etapas IV y V .............. 42 Figura III.4. Tasas volumétricas de consumo y producción en función de BN................................................. 46 Figura III.5. Esquematización de los posibles procesos realizados en el sistema estudiado........................... 50
vii
RESUMEN
El nitrógeno presente en las descargas de aguas residuales, generalmente, se encuentra como amonio (NH4
+). Para eliminarlo se requieren dos procesos biológicos: la nitrificación autotrófica, donde el amonio es transformado a nitrato bajo condiciones aerobias, y posteriormente en la desnitrificación heterotrófica, el nitrato obtenido es reducido hasta N2 en un proceso anóxico. Sin embargo, en la actualidad existen diversas alternativas biotecnológicas para la remoción del nitrógeno que resultan competitivas gracias a los ahorros en costo, tiempo y espacio.
Una de estas tecnologías es el sistema SHARON (Single reactor High activity Ammonia Removal Over Nitrite) en el que se realiza una nitrificación parcial, es decir, el amonio solo es oxidado hasta nitrito. El objetivo para producir solamente el intermediario deseado es la eliminación de la población nitrito-oxidante del sistema. Esto se consigue empleando estrategias como: mantener una baja concentración de oxígeno disuelto (<2 mg·L-1), incrementar el valor de pH por arriba de 7.5 a fin de elevar la concentración de amoniaco libre (NH3) en el medio, el cual resulta tóxico para las bacterias nitrito-oxidantes a concentraciones de 0.1 a 10 mg N-NH3·L-1, o ajustar la tasa de dilución, de tal manera que sea mayor que la tasa de crecimiento de las bacterias nitrito-oxidantes pero menor que la tasa de crecimiento de las bacterias amonio-oxidantes.
Si este sistema se desea emplear con efluentes cuya relación Corg:N sea mayor que 1 como son los efluentes industriales, se debe considerar que uno de los factores que afectan a la nitrificación es la presencia de materia orgánica en el sistema, ya que favorece el crecimiento de bacterias heterotróficas, las cuales competirán con los microorganismos autotróficos por el oxígeno y los nutrientes, desplazándolos del sistema.
En el presente trabajo se evaluó la capacidad de remoción simultánea de carbono y nitrógeno del sistema SHARON estudiando el efecto de la materia orgánica en la oxidación parcial del NH4
+. Para alcanzar este objetivo se puso en marcha un reactor continuo de tanque agitado para llevar a cabo la nitrificación parcial, a una velocidad de carga de N-NH4
+ de 0.18 kg·m-3·d-1, con una relación Cinorg:N de 5 y con tiempo de residencia hidráulico (TRH) de 1 día en donde la concentración de oxígeno disuelto (OD) fue menor a 2 mg·L-1. Durante el arranque se obtuvieron eficiencias de consumo de amonio y conversión a nitrito de 92% y 38%, respectivamente, con problemas de lavado de biomasa. En dos etapas posteriores de la operación del reactor, el sistema se alimentó a una velocidad de carga de N-NH4
+ de 0.08 y 0.156 kg·m-3·d-1, respectivamente. A partir de la segunda fase el TRH se estableció en 3 días, además de que se incorporó un sedimentador al sistema con lo que disminuyeron los problemas de lavado de biomasa. También se modificó la relación Cinorg:N disminuyéndola a 0.3. Se observó que la oxidación del amonio a nitrito, al operar el sistema a bajas concentraciones de oxígeno disuelto, es independiente de la edad del lodo. La limitación de oxígeno en el sistema favoreció la presencia de procesos de remoción de amonio y nitrito simultáneos. Las eficiencias de consumo de amonio y conversión a nitrito en la segunda etapa fueron de 93% y 53%, respectivamente. En la tercera etapa estas eficiencias fueron de 96% y 53%. En la cuarta fase del proceso, se adicionó materia orgánica, siendo el acetato la fuente de carbono orgánico. La relación Corg:N fue de 1.0. El TRH y la relación Cinorg:N continuaron en 3 días y 0.3, respectivamente. La velocidad de carga de N-NH4
+ fue de 0.168 kg m-3 d-1. Al inicio de esta fase, la concentración de oxígeno disuelto fue de 2 mg·L-1. Al adicionarse la materia orgánica al sistema se apreció un incremento en la concentración de sólidos suspendidos volátiles, de 1.1 g·L-1 a 1.32 g·L-1. Sin embargo, el lodo presentó un esponjamiento lo que ocasionó falta de sedimentación. A pesar de esto, la concentración de biomasa se estableció en 1.4 g·L-1. La materia orgánica tuvo un efecto negativo sobre el proceso nitrificante, ya que la eficiencia de consumo y de conversión disminuyó hasta 45% y 6% en cada caso. Al observarse esta caída en el consumo de amonio y la subsecuente conversión a nitrito, en la última etapa de operación, se incrementó la concentración de oxígeno disuelto en el medio hasta 4 mg·L-1. Con este incremento las eficiencias de consumo y conversión de nitrógeno se recuperaron al cabo de 30 días, situándose en 76% y 49%, respectivamente. En ninguna de las etapas de operación se observó la producción de nitrato. En cuanto al carbono, el sistema tuvo eficiencias de consumo de acetato del 100%.
viii
Abstract
Discharges of nitrogen into the wastewaters, which is generally ammonium, has been removed through a two step sequential process: autotrophic nitrification and heterotrophic denitrification. As a first step ammonium is converted to nitrate under aerobic conditions (nitrification). In a second step nitrate is reduced to nitrogen gas (denitrification). At the present time, there are technologies that could offer an alternative for the biological nitrogen removal.
One of these technologies is a partial nitrification, such as the SHARON (Single reactor
High activity Ammonia Removal Over Nitrite) process, where the ammonium is oxidized to nitrite only. To achieve partial nitrification the most common strategy employed is to deter aerobic nitrite oxidizers controlling environmental parameters such as dissolved oxygen (OD) concentration, pH and hydraulic residence time (HRT). Due to their lower affinity for oxygen, nitrite oxidizers do not compete well with ammonium oxidizers at low DO concentrations (<2 mg·L-1). A raise in pH above 7.5, increases the amount of free ammonia (NH3). Therefore, small changes in pH may cause significant inhibition on nitrite oxidizing activity at concentrations above 10 mg N-NH3·L-1. Nitrite oxidizers may be washed out by lowering enough the hydraulic retention time, so the dilution rate becomes higher than the growth rate of nitrite oxidizers but lower than the growth rate of ammonium oxidizers.
Usually the effluents generated from industry contain high organic carbon load and low
nitrogen concentrations. Therefore, the total organic carbon to nitrogen ratio (C/N) from wastewater is a fundamental parameter to take into account. The organic concentration has been considered a major factor affecting the nitrification performance. The inhibitory effect is the localized competition between the heterotrophs and the nitrifiers for oxygen, nutrients and space.
The objectives of this study were to evaluate, through an experimental set up, the capacity
of SHARON process to remove organic carbon and nitrogen, and the effect of organic matter on the partial nitrification. The partial nitrification according to the SHARON process was carried out in a continuous stirred tank reactor. In a first stage, the start up of the SHARON reactor was set with a nitrogen loading rate of 0.18 kg N·m-3·d-1 and a inorganic carbon/nitrogen ratio of Cinorg:N = 5. The HRT and OD concentration were fixed at 1 d and below 2 mg·L-1. The ammonium uptake and oxidation efficiencies were 92% and 38%, respectively. The second and third stage were fed with a nitrogen loading rate of 0.08 and 0.156 kg N·m-3·d-1, respectively. The HRT was set in 3 d, besides a settling tank was incorporated to the system. The Cinorg:N ratio was reduced to 0.3. The oxidation of ammonium to nitrite is independent of the sludge age when the system is operated at low OD concentrations. In the second stage, the ammonium uptake and oxidation efficiencies were of 93% and 53%, respectively, and in the third stage were of 96% and 53%. In the fourth stage, organic matter was added in form of acetate. The nitrogen loading rate was 0.168 kg N·m-3·d-1 and organic loading rate was 0.56 kg C·m-3·d-1 at a organic carbon/nitrogen ratio of Corg:N = 1.0. The HRT and Cinorg:N ratio was set in 3 d and 0.3, respectively. OD concentration was kept below 2 mg·L-1. A significant growth of biomass occurred in the system. At the end of third stage, the mixed liquor volatile suspended solids (MLVSS) were 1.1 g·L-1 and in the fourth stage these solids were 1.32 g·L-1. However, the sludge developed “bulking”, in other words, sludge with inefficient settling characteristics. The organic matter showed a negative effect on the nitrifying process. The ammonia uptake and oxidation efficiencies decreased to 45% and 6%, respectively. In the last operational stage, OD concentration was increased between 3 and 4 mg·L-1. Ammonium uptake and oxidation efficiencies were recovered after 30 days with this increment in OD level attaining 76% and 49%, respectively. In any operational stage, no nitrate production was observed. Acetate uptake efficiency was 100% in the fourth and fifth stages.
ix
NOMENCLATURA
ANAMMOX Oxidación anaerobia del amonio
AMO Amonio monooxigenasa
BAO Bacterias amonio-oxidantes
BBN Velocidad de carga de amonio
BNO Bacterias nitrite-oxidantes
BBV Velocidad de carga organica
C* Concentración de saturación de O2
CL Concentración de O2 en el medio líquido
HAO Hidroxilamina oxidorreductasa
kLa Coeficiente de transferencia de oxígeno
KeNH Constante de equilibrio amonio:amoniaco
KNH4 Constante de saturación de amonio
KO Constante de saturación de oxígeno
N Nitrógeno, concentración de nitrógeno amoniacal en el efluente
N0 Concentración de nitrógeno amoniacal en la alimentación
N2 Nitrógeno molecular
NH4+ Amonio
NH3 Amoniaco
Nor Reductasa del óxido nítrico
NOX- Nitrógeno oxidado, representa al nitrato (NO3
-) y al nitrito (NO2-)
NOR Nitrito oxidorreductasa
OD Oxígeno disuelto
OTR Tasa de transferencia de oxígeno
pH Logaritmo negativo de la concentración de protones
PTAR Planta de tratamiento de aguas residuales
qDnit Velocidad específica desnitrificante
qN Velocidad específica nitrificante
qO2 Velocidad específica de consumo de oxígeno
qP Velocidad específica de producción de nitrito
S Concentración de acetato en el efluente
S0 Concentración de acetato en la aliemntación
SHARON Reactor para la remoción de amoniaco por la ruta del nitrito
SSV Sólidos suspendidos volátiles
SSVLM Sólidos suspendidos volátiles del licor mezclado
T Temperatura
x
TRC Tiempo de retención celular
TRH Tiempo de retención hidráulico
X Concentración de biomasa en el reactor
Xe Concentración de biomasa en el efluente
μ Tasa de crecimiento
μMAX Tasa máxima de crecimiento
γN Tasa específica de remoción de amonio
γP Tasa específica de producción de nitrito
xi
INTRODUCCIÓN
Introducción
I. INTRODUCCIÓN
I.1. JUSTIFICACIÓN Las descargas de aguas residuales en los cuerpos acuíferos conllevan problemas
ambientales y de riesgos a la salud. El nitrógeno presente en estos efluentes,
generalmente, se encuentra como amonio (NH4+), por lo que para eliminarlo
biológicamente se emplean generalmente dos procesos: la nitrificación autotrófica y la
desnitrificación heterotrófica.
La nitrificación tiene como objetivo la oxidación del amonio hasta nitrato (NO3-) en
sistemas completamente aireados en los que la concentración de oxígeno supera los 2
mg·L-1. En la desnitrificación, el nitrato obtenido es reducido a nitrógeno gaseoso (N2),
bajo condiciones anóxicas, empleando compuestos orgánicos como metanol, acetato o
propionato que aporten los electrones necesarios, pero la adición de materia orgánica
encarece y complica el proceso, por lo que las tecnologías desarrolladas permiten reducir
los costos de los procesos de remoción biológica de nitrógeno.
El proceso SHARON (Single reactor High activity Ammonia Removal Over Nitrite)
es, básicamente, un sistema de nitritación continuo que se lleva a cabo en un tanque
agitado de mezcla completa (Hellinga et al., 1999). El objetivo en este proceso es realizar
una nitrificación parcial estable, es decir, la oxidación de 50% del amonio a nitrito,
evitando la subsiguiente oxidación de nitrito a nitrato, de tal manera que el efluente
contenga una relación molar NH4+:NO2
- de 1:1.32 (reacción I.1), la cual se ajusta a las
necesidades del proceso desnitrificante llamado ANAMMOX (ANaerobic AMMonium
OXidation) de acuerdo a la estequiometría propuesta por Strous (2000).
4 2 3 2 3 2 0.5 0.151.32 0.066 0.13 1.02 0.26 0.066 2.03NH NO HCO H N NO CH O N H O+ − − + −+ + + → + + + 2 Reacción I.1
2
Introducción
Figura I.1. Alternativas convencionales para la eliminación de C y N de aguas residuales.
Los autores que han investigado el proceso SHARON, se han enfocado en el
tratamiento de los efluentes de la digestión de lodos, los cuales presentan una relación
Corg:N de 0.015 a 0.03 (Strous et al., 1997b; Fux et al., 2002), obteniendo efluentes que se
ajustan a las necesidades del proceso ANAMMOX. Sin embargo, la gran mayoría de los
efluentes industriales que continuamente se descargan presentan una proporción Corg:N
superior a 1 (Tabla I.1). Estos efluentes, generalmente, se depuran empleando trenes de
tratamiento que constan de tres reactores en serie. En el primer reactor, el carbono se
elimina de manera eficiente y en el segundo se realiza la nitrificación (Figura I.1). Sin
embargo, cuando no se tiene una alta eficiencia de eliminación de compuestos orgánicos,
éstos pueden pasar al reactor nitrificante y favorecer el crecimiento de bacterias
heterotróficas, las cuales competirán con los microorganismos autotróficos por el oxígeno,
los nutrientes y el espacio. Por lo que es importante implementar estrategias de operación
en el sistema SHARON, de tal manera que ambos metabolismos, autótrofo y heterótrofo,
puedan coexistir en el reactor.
3
Introducción
Tabla I.1. Concentraciones (mg·L-1) de DQO, DBO, N y P de aguas residuales
Agua Residual DQO DBO5Nitrógeno
Total Fósforo
Efluentes urbanos * 262-358 n.r. 31-40 n.r.
Fracción líquida de abono n.r. 2912 707 55
3969 1730 1700 147
9000-13000 n.r. 3100-4300 20-40
6456 n.r. 695 91.8 Lixiviados de
basurero 2000-5000 1500-4000 500-1000 20-50
n.r. 45 310 n.r.
1300-1600 n.r. 160-270 n.r. Residuos de
tenerías 300-1400 n.r. 50-200 n.r.
1940-2700 n.r. 123-185 n.r. n.r. No reportado
Fuente: (*) Esquivel, 2003; van Hulle, 2005.
4
Introducción
I.2. OBJETIVOS
I.2.1. General
Estudiar el efecto de la materia orgánica en la oxidación parcial de amonio a nitrito.
I.2.2. Particulares
Estudiar la influencia del tiempo de retención celular (TRC) sobre la nitritación
Estudiar el efecto de la materia orgánica sobre la nitritación parcial con una
relación Corg:N de 1
Estudiar la influencia de la concentración de oxígeno disuelto en el medio sobre la
oxidación de materia orgánica y la formación de nitrito en el proceso SHARON
5
Introducción
I.3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
I.3.1. Ciclo del Nitrógeno
El nitrógeno es el componente principal del aire que respiramos.
Desafortunadamente, las plantas no pueden usarlo directamente de la atmósfera por lo
que recurren a la fijación biológica, la cual es responsable de la mayor parte del proceso
de conversión del nitrógeno. Se produce por la acción de bacterias libres fijadoras del
nitrógeno; bacterias simbióticas que viven en las raíces de las plantas (sobre todo
leguminosas y alisos); algas azul verdosas; ciertos líquenes; y epífitas de los bosques
tropicales (Kätterer, 2002).
Figura I.2. Esquematización del ciclo del nitrógeno.
La segunda fuente en importancia es el proceso Haber-Bosch que produce
amoníaco a partir del nitrógeno y el hidrógeno. Este amoníaco se utiliza para producir
ácido nítrico y a través de la reacción de ambas sustancias producen el nitrato de amonio.
El proceso Haber-Bosch emplea alrededor del 1% del consumo de energía de la Tierra
para suministrar la mitad del nitrógeno necesario en la agricultura.
6
Introducción
El nitrógeno, fijado en forma de amoníaco y nitratos, es absorbido directamente
por las plantas e incorporado a sus tejidos en forma de proteínas vegetales. Después, el
nitrógeno recorre la cadena alimentaria desde las plantas a los herbívoros, y de estos a
los carnívoros. Cuando las plantas y los animales mueren, los compuestos nitrogenados
se descomponen produciendo amoniaco, un proceso llamado amonificación (figura I.2).
Parte de este amoniaco es recuperado por las plantas; el resto se disuelve en el
agua o permanece en el suelo, donde los microorganismos lo convierten en nitratos o
nitritos en un proceso llamado nitrificación. Los nitratos pueden almacenarse en el humus
en descomposición o migrar del suelo por lixivación, siendo arrastrado a los arroyos y los
lagos. Otro camino es la desnitrificación que lo regresa a la atmósfera donde el ciclo
vuelve a comenzar.
I.3.2. Nitrificación
I.3.2.1. Microorganismos nitrificantes
Las bacterias capaces de crecer quimiolitotróficamente a expensas de compuestos
reducidos del nitrógeno se denominan bacterias nitrificantes. Estos microorganismos
están ampliamente distribuidos en el suelo y el agua donde exista una concentración de
amonio considerable, por ejemplo donde se produce una descomposición proteica
(amonificación) o donde se lleva a cabo el tratamiento de aguas residuales.
Hasta la fecha, no se conoce ningún quimiolitótrofo que lleve a cabo la oxidación
completa desde amonio hasta nitrato; por ello la nitrificación es el resultado de la acción
secuencial de dos grupos de organismos, las bacterias amonio-oxidantes (BAO) y las
bacterias nitrito-oxidantes (BNO), las verdaderas bacterias nitrificantes o productoras de
nitrato. Durante mucho tiempo se pensó que estos organismos eran aerobios obligados,
sin embargo actualmente se tienen reportes de especies que pueden vivir en ambientes
7
Introducción
con bajas concentraciones de oxígeno o anóxicos llevando a cabo la reducción del nitrito
y el nitrato (Bock, 1988, 1995; Bodelier et al., 1996; Poth, 1986).
Los estudios basados en el análisis de secuencias 16s rRNA han demostrado que
las bacterias amonio-oxidantes pertenecen a los subgrupos β (Nitrosomonas,
Nitrosospira, Nitrosolobus y Nitrosovibrio) o γ (Nitrosococcus) de las Proteobacterias.
Entre los nitrito-oxidantes, los géneros Nitrobacter, Nitrococcus y Nitrospina se sitúan en
los subgrupos α, γ y δ de las Proteobacterias, respectivamente (Teske et al., 1994). El
género Nitrospira se asocia con el phylum Nitrospira, el cual fue descrito hace una década
y representa una línea independiente dentro del dominio Bacteria (Ehrich et al., 1995
citado por Bock y Wagner, 2001).
I.3.3. Bioquímica de la nitrificación
En la tabla I.2 se muestran las reacciones consecutivas para llevar a cabo la
oxidación de amoniaco (Kowalchuk y Stephen, 2001; Bernet, 2002, Schimdt et al., 2003):
Tabla I.2. Cambio de energía libre en la reacción de oxidación del amoniaco
ΔGº, kJ · mol-1
3 2 20.5NH O NH OH+ → 17 Reacción 1.2.a
2 20.5 2 2O H e H+ −+ + → O
2
-137 Reacción 1.2.b
2 23 2 2NH O H e NH OH H O+ −+ + + → + -120 Reacción I.2
2 2 2 4 4NH OH H O HNO H e+ −+ → + + 23 Reacción 1.3.a
2 20.5 2 2O H e H+ −+ + → O -137 Reacción 1.3.b
2 2 20.5 2 2NH OH O HNO e H− ++ → + + -114 Reacción I.3
3 2 21.5NH O HNO H O+ → + 2 -234 Reacción I.4
8
Introducción
La reacción I.2 describe la oxidación del amoniaco a hidroxilamina llevada a cabo
por la amoniaco monooxigenasa (AMO). Los sustratos de la AMO son el amoniaco, el
oxígeno y dos electrones. Un átomo de oxígeno molecular se reduce a agua, mientras
que el segundo átomo se incorpora a la hidroxilamina (Arp et al., 2002).
Citoplasma
Periplasma
Oxidación de sustratos
alternativos
Figura I.3. Transporte de electrones en Nitrosomonas europaea.
Las rutas establecidas están representadas con líneas continuas y las rutas hipotéticas se representan con líneas punteadas. AMO, amoniaco monooxigenasa; HAO, hidroxilamina oxidorreductasa; C-P460, citocromo P460; Q, Ubiquinona-8; Cu NiR, nitrito reductasa con cobre; CCP, citocromo c peroxidasa; NOR, nitrito oxidorreductasa; Cu aa3, citocromo c oxidasa; CcM552, citocromo membranal c552. Tomado de Whittaker et al. (2000).
En la oxidación de hidroxilamina que es llevada a cabo por la hidroxilamina
oxidorreductasa (HAO) no se consume oxígeno (reacción I.3.a); dos de los cuatro
electrones removidos del sustrato deben regresar a la reacción catalizada por la AMO de
la siguiente forma: 1.65 electrones pasan a la oxidasa terminal (o a una reductasa del
nitrito) y 0.35 pasan al NAD (Whittaker et al., 2000), el resto de los electrones se emplean
en la fijación de CO2 y en la cadena respiratoria. En la figura 1.3 se esquematiza dicha
cadena respiratoria y de transporte de electrones en Nitrosomonas europaea.
A partir del cambio de energía libre obtenido de la reacción global de oxidación de
amoniaco (reacción I.4), puede pronosticarse que la energía disponible para el
9
Introducción
crecimiento de las bacterias amonio-oxidantes será baja debido a la limitada cantidad de
ATP que puede obtenerse de cada par de electrones introducidos (Madigan et al., 2004).
La reacción global de la oxidación del amonio incluyendo la producción de
biomasa es la siguiente:
4 2 3 5 7 2 2 2 255 76 109 54 57 104NH O HCO C H NO NO H O H CO+ − −+ + → + + + 3 Reacción I.5
El segundo paso de la nitrificación, la oxidación de nitrito, se lleva a cabo por la
acción de la nitrito oxidorreductasa (NOR), una enzima unida a la membrana (tabla I.3).
Esta enzima oxida el nitrito a nitrato empleando agua como fuente de oxígeno (reacción
1.6.a), los electrones liberados de esta reacción se transfieren a un citocromo oxidasa tipo
aa3 (Cu aa3) a través de citocromos tipo a y c (Schmidt et al., 2003).
Tabla I.3. Cambio de energía libre en la reacción de oxidación del nitrito
ΔGº, kJ · mol-1
2 2 3 2 2NO H O NO H e− − ++ → + + − 83 Reacción 1.6.a
2 20.5 2 2O H e H+ −+ + → O
3
-137 Reacción 1.6.b
2 20.5NO O NO− −+ → - 54 Reacción I.6
El cambio en energía libre de esta reacción es 4 veces menor al de la oxidación
del amonio, por lo que estas bacterias presentarán un crecimiento microbiano aún más
bajo, lo que es un factor que debe tomarse en cuenta en el caso de la eliminación de esta
población bacteriana del reactor.
I.3.4. Efecto de la materia orgánica sobre la nitrificación
La nitrificación es un proceso sensible a la presencia de materia orgánica pues
favorece el crecimiento de bacterias heterotróficas, las cuales compiten ventajosamente
con los microorganismos autotróficos por el oxígeno y los nutrientes. Desde la década de
los 60, se han realizado estudios acerca del efecto de la materia orgánica y otros
10
Introducción
nutrientes sobre microorganismos del género Nitrosomonas y Nitrobacter, presentándose
dos puntos de vista diferentes.
El primero de ellos asegura que compuestos como α-cetoglutarato, piruvato,
acetato, succinato y aminoácidos como ácido glutámico, ácido aspártico, serina y
glutamina benefician el crecimiento y metabolismo de las bacterias nitrificantes (Clark y
Schmidt, 1966, 1967, 1967b; Smith y Hoare, 1968; Wallace et al., 1970). A raíz de que el
estudio de la secuencia genómica de N. europaea mostrara la presencia de un sistema
de transporte por fosfotransferasa para azúcares (Chain et al., 2003), Hommes et al.
(2003) demostraron que este organismo es capaz de asimilar la fructosa como sustrato
para la síntesis celular.
La postura contraria argumenta que la materia orgánica tiene un efecto negativo
sobre la actividad nitrificante. Zhu y Chen (2001) realizaron estudios en biofiltros de
película fija reportando que en presencia de carbono orgánico, el proceso de nitrificación
se inhibe debido a los procesos heterotróficos. La tasa de remoción de amonio se redujo
70% cuando adicionaron sacarosa con una relación C/N = 1 ó 2 comparada con un
proceso de nitrificación puro sin la adición de materia orgánica (C/N = 0). Hanaki et al.
(1990a, b) empleando glucosa como fuente de carbono orgánico, observaron que la
oxidación de amonio fue menor al 20% cuando la relación Corg:N = 2.3 debido,
presumiblemente, a que la asimilación de amonio por parte de los heterótrofos redujo la
concentración de amonio disponible para los microorganismos amonio-oxidantes. Así
mismo, determinaron que la materia orgánica no tuvo efecto alguno sobre la μmáx de los
autótrofos, sin embargo, el valor de la KNH4 incrementó de 1.0 mg·L-1 (Corg:N = 0) a 7.2
mg·L-1 (Corg:N = 4.7). Finalmente, estos investigadores observaron que el efecto inhibidor
de la materia orgánica aumenta cuando la concentración de oxígeno disuelto en el medio
es menor que 1 mg·L-1. Mosquera-Corral et al. (2005) determinaron que la presencia de
11
Introducción
materia orgánica tiene un efecto negativo sobre la nitrificación parcial cuando ésta se
presenta en una relación Corg:N mayor que 0.3. En su caso, el acetato fue la fuente de
carbono orgánico y observaron que la conversión de amonio a nitrito disminuyó hasta el
10% de la capacidad oxidativa original del consorcio. Yun et al. (2004) observaron, en un
reactor de biopelícula, que al adicionar materia orgánica al sistema se perdía
gradualmente la actividad nitrificante. Sin embargo, tras una aireación prolongada, esta
actividad se recuperaba indicando que la nitrificación en presencia de materia orgánica
requiere períodos de arranque largos para que las bacterias se aclimaten. En las plantas
de tratamiento de aguas residuales (PTAR), la nitrificación se lleva a cabo en ausencia de
materia orgánica (figura I.1).
I.3.5. Proceso SHARON
La nitrificación parcial del proceso acoplado SHARON-ANAMMOX promete
mejorar los tratamientos de aguas residuales. En el proceso SHARON el reto es detener
la oxidación del nitrito empleando como estrategias la temperatura, el pH, la
concentración de oxígeno disuelto y el TRH, de tal manera que se establezcan las
condiciones apropiadas para obtener un efluente que se ajuste a las necesidades del
proceso ANAMMOX. El empleo de estos parámetros ambientales se describen a
continuación.
a) Temperatura. Este parámetro es clave en el proceso nitrificante, ya que un
incremento en la temperatura crea dos efectos opuestos: incrementa la inhibición
por amoniaco libre y por otra parte, estimula la activación de los organismos de
acuerdo a la ecuación de Arrhenius. La tasa máxima de crecimiento a 20 ºC para
las bacterias amonio-oxidantes y nitrito-oxidantes es prácticamente igual, 0.8 d-1
y 0.79 d-1 respectivamente, con energías de activación de 68 y 44 kJ·mol-1 para
12
Introducción
cada caso (van Hulle, 2005). Esto indica que la actividad de las BAO se
incrementará más rápidamente que la actividad de las BNO. El proceso SHARON
emplea este principio, de tal manera que al operar un quimiostato a temperaturas
superiores a los 25 ºC, se puede mantener un tiempo de retención celular
adecuado (1 a 1.5 días) para que las bacterias amonio-oxidantes se mantengan
en el reactor mientras las nitrito-oxidantes se lavan del mismo previniendo la
conversión del nitrito a nitrato (figura I.4).
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40Temperatura [ºC]
μM
AX [
d-1]
50
Bact. Amonio-oxidantes Bact. Nitrito-oxidantes
Figura I.4. Efecto de la temperatura sobre la tasa máxima de crecimiento de las BAO y BNO. Calculado con la ecuación de Arrhenius a partir de los valores descritos por van Hulle (2005).
b) pH. Los intervalos de pH en los que las bacterias amonio-oxidantes y nitrito-
oxidantes crecen son (Holt et al., 1994): de 5.8 a 8.5 y de 6.5 a 8.5,
respectivamente. Ruiz et al. (2003) reportan que la nitrificación se inhibe
completamente a un pH menor a 6.45 o mayor a 8.95, de tal manera que no se
presenta oxidación de amonio o de nitrito. Belser (1984) menciona que la
concentración de carbono inorgánico en el medio tiene un factor importante sobre
el proceso nitrificante ya que determina el pH del mismo y por tanto la relación
13
Introducción
entre la forma ionizada y la no ionizada lo que se traduce en la disponibilidad del
amoniaco que es el sustrato fisiológico de la enzima amonio monooxigenasa
(Suzuki et al., 1974). Anthonisen et al. (1976, citado por Bernet et al., 2005)
reportan que las bacterias nitrito-oxidantes son más sensibles que las bacterias
amonio-oxidantes al amoniaco, de tal manera que concentraciones tan bajas
como 10 mg N-NH3·L-1 inhiben la oxidación del nitrito, mientras que la oxidación
de amonio se inhibe a concentraciones de 10 a 150 mg N-NH3·L-1.
c) Concentración de oxígeno disuelto (OD). Cuando se lleva a cabo la nitrificación, la
concentración de OD es de suma importancia tanto para las bacterias amonio-
oxidantes como para las nitrito-oxidantes (Philips et al., 2002). Estudios con
cultivos mixtos de Nitrosomonas europaea (BAO) y Nitrobacter winogradskyi
(BNO) muestran que una concentración limitada de oxígeno disuelto (menor que 2
mg·L-1) frena la oxidación del NO2-, ocasionando una acumulación de nitrito y
gases nitrogenados (NO y N2O) (Laanbroek y Gerards, 1993; Kester et al., 1997).
Esto se debe a la diferencia en la constante media de saturación de oxígeno (Ko)
para ambos géneros (Hanaki et al., 1990b). De acuerdo a Kim et al. (2005) la KO
para la oxidación de amonio y la oxidación de nitrito es de 0.3 y 1.1 mg·L-1,
respectivamente. Es decir, la deficiencia de oxígeno ocasionada por una baja
concentración de OD en el sistema (< 2 mg·L-1) influye más significativamente
sobre la actividad de las BNO que sobre las BAO. Aunque manejar una condición
de limitación de oxígeno puede considerarse una estrategia más para eliminar a
las bacterias nitrito-oxidantes del sistema, algunos autores mencionan que la
inhibición por hidroxilamina libre más que la diferencia entre las constantes de
afinidad es la responsable de la acumulación de nitrito en los sistemas nitrificantes
14
Introducción
operando a concentraciones de oxígeno disuelto menores a 2 mg·L-1 (Yang y
Alleman, 1992).
d) Tiempo de residencia hidráulico. El proceso SHARON es un reactor de flujo
mezclado que se caracteriza por la ausencia de retención de lodo. Al manejar
TRH suficientemente corto e igual al TRC, las bacterias nitrito-oxidantes se
eliminan del sistema debido a su menor velocidad de crecimiento, ocasionando
que la oxidación del amonio se detenga en el nitrito. Sin embargo, Pollice et al.
(2002) observaron que bajo condiciones de limitación de oxígeno se puede
obtener una conversión estable de amonio a nitrito, independientemente de la
edad del lodo, permitiendo que los reactores puedan operarse a mayores TRC
empleando la recirculación de células a fin de evitar el riesgo de que se presente
lavado de biomasa.
El proceso SHARON es un sistema continuo de nitritación que fue diseñado en la
Universidad Tecnológica de Delft para tratar el efluente de la digestión de lodos de la
planta de tratamiento de Dokhaven en Rotterdam. Hellinga et al. (1999) lograron obtener
un proceso de nitrificación parcial estable manipulando parámetros como el TRH, la
temperatura y el pH. En su caso, el nitrito producido en el proceso SHARON era reducido
mediante un proceso desnitrificante heterótrofo.
Posteriormente, cuando el proceso ANAMMOX fue estudiado, surgió la necesidad
de acoplar ambos procesos, por lo que el reto en el proceso SHARON era obtener un
efluente que se ajustara a las necesidades del proceso anóxico, es decir una relación
1:1.32 (NH4+:NO2
-) de acuerdo a la estequiometría propuesta por Strous (2000).
van Dongen et al.(2001) empleando un reactor continuo de tanque agitado
(CSTR, por sus siglas en inglés) de 10L a una temperatura de 30 ºC y un TRH de 1 d,
obtuvieron un efluente que se ajustó a las necesidades del proceso ANAMMOX. Fux et al.
15
Introducción
(2002) trabajaron con un CSTR para obtener un efluente que alimentara a un reactor
anóxico. Operaron un reactor de 2.1 m3 a un TRH de 1.1 d, una temperatura de 30 ºC y
una concentración de OD de 2.7 a 4.5 g O2·m-3. Como alimentación emplearon el efluente
de la digestión de lodos de dos plantas de tratamiento de aguas residuales. Esta
alimentación presentaba una relación Cinorg:N de 1.2. El efluente del sistema presentó una
proporción de NH4+:NO2
- de 1:1.32. Udert et al. (2003) describen la nitrificación parcial de
orina en un CSTR con un TRH de 4.8 d y una concentración de OD de 3 a 5.2 g O2·m-3.
La alimentación presentó una alta concentración de nitrógeno amoniacal (8200 mg N·L-1)
y un pH de 9.2. El efluente obtenido presentó una relación equimolar NH4+:NO2
-. Egli et al.
(2003) también obtuvieron un efluente que se ajustaba a las necesidades de alimentación
del proceso ANANMMOX en un reactor continuo de 3 L. El sistema operó a 30 ºC, un pH
de 7.5 y un TRH de 3.33 días. van Hulle et al. (2005b) operaron un CSTR de 2 L a un
TRH de 1.54 d. Cuando la alimentación presentó una relación Cinorg:N de 1.1, el efluente
que se obtuvo tenía una relación equimolar.
En resumen, el proceso SHARON es adecuado para tratar efluentes con altas
concentraciones de nitrógeno amoniacal (aprox. 1 g N-NH4+·L-1). Típicamente se aplica al
tratamiento de efluentes de la digestión de lodos. Un proceso SHARON a escala real se
encuentra operando desde enero de 1999 en la planta de tratamiento de lodo de
Rotterdam (van Kempen et al., 2001). El nitrito producido por el proceso SHARON puede
emplearse como aceptor de electrones para la oxidación del amonio residual gracias a la
reacción ANAMMOX, los cuales combinan NO2- y NH4
+ para formar nitrógeno gaseoso
(Jetten et al., 1999).
Los beneficios al acoplar el proceso SHARON con el proceso ANAMMOX son la
reducción en un 50% de los costos de aireación, ya que solo la mitad del nitrógeno
amoniacal es convertido, la eliminación de la fuente carbonada adicional para el proceso
desnitrificante, la virtual ausencia de producción de lodo y la posibilidad de obtener un
16
Introducción
efluente con bajas concentraciones de nitrógeno a través de la reacción autotrófica
ANAMMOX. Esto último ha sido un punto de arranque para el desarrollo de sistemas de
tratamiento de aguas residuales municipales sustentables (Jetten et al., 1997). Un estudio
experimental del tratamiento de aguas residuales ricas en amonio por el proceso
combinado SHARON-ANAMMOX fue desarrollado por van Dongen et al. (2001)
mostrando que este sistema es estable y que el proceso está listo para su implementación
a escala real.
I.3.6. ANAMMOX: Una desnitrificación autotrófica
La desnitrificación autotrófica comprende la reducción del nitrito a N2. Este proceso
puede llevarse a cabo por la acción de bacterias del género Nitrosomonas o bien con el
proceso ANAMMOX.
Broda (1977, citado por Kelly y Wood, 2000) fue el primero en discutir acerca de la
existencia de dos tipos de bacterias amonio-oxidantes, uno de los cuales realizaría una
oxidación anaerobia del amonio empleando nitrito como aceptor de electrones de tal
manera que el N2 sería el producto final (reacción I.7).
2 24HNO H NH OH H O++ → + 2
2
Reacción I.7.a
2 3 2 4NH OH NH N H H O+ → + Reacción I.7.b
2 4 2 4N H N H +→ + Reacción I.7.c
2 3 2 22HNO NH N H O+ → + ΔGº= -360 kJ·mol-1 Reacción I.7
A partir de la reacción I.7 se deduce que el proceso está completamente
balanceado. No se obtiene poder reductor, el cual es esencial para la fijación del dióxido
de carbono por los organismos autótrofos. Para conseguir estos equivalentes reducidos
las células necesitan oxidar parte del nitrito a nitrato (reacción I.8). Por lo tanto la cantidad
17
Introducción
de nitrito consumido es 20% mayor a lo que se plantea en la reacción I.7 (van de Graaf et
al., 1996):
2 2 3 2HNO H O NAD HNO NADH+ + → + Reacción I.8
Bajo condiciones anóxicas, Nitrosomonas es capaz de utilizar hidrógeno, piruvato
o amoniaco como donadores de electrones para reducir el nitrito a N2 (Bock et al., 1995),
esa reacción depende del N2O para llevarse a cabo. Poth y Focht (1985) demostraron que
Nitrosomonas europaea es capaz de producir N2O al reducir el nitrito y no como producto
de la oxidación de la hidroxilamina, además se ha reportado que Nitrosomonas sp. es
capaz de producir N2 bajo condiciones de estrés de oxígeno (< 2 mg·L-1), lo que sugiere la
posibilidad de que estos microorganismos al igual que los desnitrificantes heterótrofos
cuenten con una reductasa del N2O (Poth, 1986). La enzima responsable de la reducción
del nitrito es una nitrito reductasa con cobre (NirK) que se encuentra en el periplasma de
Nitrosomonas, sin embargo, el producto de esta reducción es el óxido nítrico el cual
resulta muy tóxico para la célula, así que para prevenir los efectos tóxicos de este gas,
esta bacteria cuenta con los genes necesarios para sintetizar una reductasa del NO (Nor)
que catalice la reducción de NO a N2O (Beaumont et al., 2004) similares a las
encontradas en organismos desnitrificantes como Paracoccus denitrificans.
En el proceso ANAMMOX, los organismos responsables pertenecen a los
Planctomycetes. Se han identificado dos organismos Candidatus Brocadia anammoxidans
y Candidatus Kuenenia stuttgartiensis, siendo esta última la que se encuentra en mayor
proporción en los reactores analizados (Jetten et al., 2001; Jetten et al., 2002; Strous et
al., 2006).
Candidatus Brocadia anammoxidans es un organismo quimiolitótrofo con una
velocidad de crecimiento baja (0.003 h-1) que crece en un intervalo de temperatura de 20
a 43 ºC (Jetten et al., 1999). Este organismo cuenta con un compartimiento unido a la
18
Introducción
membrana llamado “anamoxosoma”, el cual ocupa del 30 al 60% del volumen de la célula,
dentro del cual se localizan las enzimas que llevan a cabo la reacción ANAMMOX (Figura
I.5). Este proceso difiere del proceso aerobio llevado a cabo por las bacterias amonio-
oxidantes aerobias, ya que el amoniaco se oxida con hidroxilamina como el aceptor de
electrones más probable, para producir hidracina como el primer intermediario detectable.
A continuación, la hidracina se oxida a N2, el principal producto final del proceso. Los
cuatro electrones obtenidos se transfieren al nitrito para formar nuevamente la
hidroxilamina (Jetten et al., 2001).
Figura I.5. Mecanismo propuesto para la oxidación anaerobia de amonio por Brocadia anammoxidans.
HAO, Hidroxilamina oxidorreductasa; NIR, Nitrito reductasa; HH, Hidracina hidrolasa.
En contraste con B. anammoxidans, Nitrosomonas produce cantidades
significativas de NO y N2O durante la oxidación de amonio, por lo que estos compuestos
son intermediarios obligados en la oxidación del amoniaco, además de que tienen efectos
reguladores sobre el metabolismo de los nitrificantes (Zart et al., 2000). En la literatura se
reporta que B. anammoxidans presenta una velocidad específica de oxidación de amonio
entre 79 y 130 mmol NH4+·g-1 proteína·d-1 (Jetten et al., 1999; Jetten et al., 2001; Schmidt
Citoplasma
Anamoxosoma
19
Introducción
et al., 2002), mientras que Nitrosomonas oxida el amonio anaeróbicamente a una tasa
específica de 3 mmol NH4+·g-1
proteína·d-1 (Schmidt y Bock, 1997; Schmidt et al., 2002;
Jetten et al., 2001, 2002) aunque se ha reportado que la presencia de óxido nitroso (NO2)
favorece en N. eutropha la oxidación anaerobia de amonio elevando la actividad
específica de este proceso más de 10 veces (Schmidt et al., 2002).
20
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos
II. MATERIALES Y MÉTODOS
II.1. Sistema Experimental
II.1.1. Reactor
Se utilizó un reactor continuo en tanque agitado (CSTR, por sus siglas en inglés)
de 3 L de volumen de trabajo (0.15 m de diámetro y 0.17 m de altura), con impulsor de
turbina de 6 aspas, de 8 cm de diámetro. La representación esquemática del reactor se
muestra en la figura II.1. El reactor contaba con control de oxígeno disuelto (OD),
velocidad de agitación (va) y pH. La concentración del oxígeno disuelto se determinó con
un electrodo PHOENIX y el pH se midió con un electrodo de vidrio.
Aire
Acido o base
Influente Efluente
Electrodo OD
Electrodo pH
PC – Sistema de Adquisición de
Datos
Biomasa
Aire
Acido o base
Influente Efluente
Electrodo OD
Electrodo pH
PC – Sistema de Adquisición de
Datos
Biomasa
Figura II.1. Representación esquemática del sistema experimental empleado en este estudio.
El medio sintético se alimentó con una bomba peristáltica con una velocidad de
flujo que varió a lo largo del experimento desde 1 hasta 3 L·d-1 (TRH = 3 a 1 d,
22
Materiales y Métodos
respectivamente). Al inicio del experimento el efluente era desechado, sin embargo, al
presentarse problemas de lavado de biomasa, éste pasaba a un sedimentador donde la
biomasa era recirculada nuevamente al sistema. El reactor se aireó a través de un difusor
de burbuja empleando aire de una bomba de pecera con una potencia de 3.5 watts, de tal
manera que se alimentó de 0.33 a 1.0 vvm. El sistema se operó a temperatura ambiente.
La determinación de OD y de pH se registró cada 10 s empleando el software
Cinda-VerCtrl4 instalado en la computadora. El pH se controló adicionando ácido (HCl) o
base (NaHCO3) de acuerdo a la medida de este parámetro y al punto de ajuste definido.
II.1.2. Inóculo.
Se obtuvo a partir de lodos activados del sedimentador secundario de la planta de
tratamiento de aguas residuales “Cerro de la Estrella” de la Delegación Iztapalapa en el
D.F.. La biomasa se cultivó en lote secuenciado alimentándola con NH4+ y HCO3
- como
únicas fuentes de nitrógeno y carbono para favorecer el crecimiento de las bacterias
nitrificantes litoautotróficas. Cada lote tuvo una duración de 48 horas y se suministró aire
mediante una bomba de pecera con una potencia de 5 watts a fin de mantener una
concentración de OD cercana a la saturación. Al final de cada lote se determinó la
concentración de amonio consumido y nitrito y nitrato producidos. La concentración de
biomasa medida como sólidos suspendidos volátiles (SSV) fue de 23 g·L-1 y el reactor se
inoculó con 100 mL de este lodo, para tener una concentración de SSV en el licor
mezclado de 0.77 g·L-1. La actividad nitrificante específica del inóculo fue de 0.35 kg N-
NH4+·kg SSV·d-1.
23
Materiales y Métodos
II.2. Ensayos en reactor continuo
II.2.1. Etapa nitrificante
El medio de cultivo para los organismos quimiolitotróficos que llevarían a cabo la
etapa nitrificante se dividió en dos disoluciones (A y B), separadas para evitar la
precipitación de alguno de los componentes. El medio se utilizó sin esterilizar y la
composición se muestra en la tabla II.1.
Tabla II.1. Composición del medio mineral quimiolitotrófico.
Medio A Medio B g/L
(NH4)2SO4 6.6
MgSO4 0.38
MnCl2 0.02
K2HPO4 0.087
CaCl2·6H2O 0.2
NaHCO3 3.0
pH 7.4
C:N 0.3
II.2.2. Etapa nitrificante-heterótrofa
Para probar el efecto de la materia orgánica sobre el sistema se adicionó la fuente
carbonada orgánica al medio de cultivo B. La composición del medio se presenta en la
tabla II.2.
Tabla II.2 Composición del medio mineral para la etapa nitrificante-heterótrofa.
Medio A Medio B g/L
(NH4)2SO4 36.6
MgSO4 0.38
MnCl2 0.02
K2HPO4 0.087
CaCl2·6H2O 0.2
24
Materiales y Métodos
NaHCO3 3.0
NaCH3COO · 3H2O 8.5
pH 7.4
Cinorg:Corg:N 0.3:1.0:1.0
II.2.3. Parámetros de operación
• Tiempo de residencia hidráulica (TRH).
[ ]VTRHQ
θ= = Ecuación II.1
• Tiempo de retención celular (TRC)
[ ]e e
XVTRCF X
θ= = Ecuación II.2
• Velocidad de carga volumétrica (Bv)
[ ]03
S MBvTRH L θ
= = Ecuación II.3
• Velocidad de carga de amonio (BN)
[ ]03N
N MBTRH L θ
= = Ecuación II.4
• Velocidad de carga de lodo (Bx)
[ ]0X
N MBTRH X Mθ
= =i
Ecuación II.5
• Eficiencia de consumo de amonio (ηN)
0
0N
N NN
η⎛ ⎞−
= ⎜⎝ ⎠
⎟ Ecuación II.6
• Eficiencia de consumo de acetato (ηCons)
25
Materiales y Métodos
0
0Cons
S SS
η⎛ ⎞−
= ⎜⎝ ⎠
⎟ Ecuación II.7
• Eficiencia de conversión (ηConv)
0Conv
PN N
η⎛ ⎞
= ⎜ −⎝ ⎠⎟ Ecuación II.8
• Tasa específica de remoción de amonio (γN)
[ ]·N NN
B MX Mηγ
θ= = Ecuación II.9
• Tasa específica de producción de nitrito (γP)
[ ]·N ConvP
B MX Mηγ
θ= = Ecuación II.10
En donde:
V = Volumen del reactor [=] L3
Q = Flujo [=] L3·θ-1
X = Concentración de biomasa en el reactor [=] M·L-3
Fe = Flujo del sedimentador [=] L3·θ-1
Xe = Concentración de biomasa en el efluente [=] M·L-3
S0 = Concentración de acetato en la alimentación [=] M·L-3
N0 = Concentración de N-NH4+ en la alimentación [=] M·L-3
S = Concentración de acetato en el efluente [=] M·L-3
N = Concentración de N-NH4+ en el efluente [=] M·L-3
P = Concentración de N-NO2- en el efluente [=] M·L-3
26
Materiales y Métodos
II.2.4. Condiciones de operación
Se trabajó con el reactor continuo de tanque agitado descrito en el apartado II.1.1.
Las condiciones de cada etapa se describen en la tabla II.3.
Tabla II.3. Condiciones de operación del reactor a lo largo del estudio.
Parámetro Etapa I Etapa II Etapa III Etapa IV Etapa V
TRH (d) 1 3 3 3 3
Q (mL· min-1) 2.02 0.7 0.7 0.7 0.7
OD (mg·L-1) 1.9 – 2.2 1.7 – 2.2 1.7 – 2.2 1.7 – 2.2 2.2 – 4.0
Agitación (rpm.) 250 250 250 250 250
Temperatura (ºC) 25 25 25 25 25
[N-NH4+] (kg·m-3) 0.183 0.246 0.467 0.438 0.438
BN promedio (kg·m-3·d-1) 0.185 0.080 0.156 0.168 0.162
Bv promedio (kg·m-3·d-1) 0.600 0.600
Relación Cinorg:N 5 0.3 0.3 0.3 0.3
Relación Corg:N - - - 1.0 1.0
pH 7 – 7.7 7 – 7.5 7 – 7.5 7 – 7.5 7 – 7.5
II.3. Ensayos en reactores intermitentes Paralelamente a la operación en continuo del reactor se realizaron ensayos en lote
para determinar la actividad nitritificante durante las etapas I a III, una vez que el proceso
era estable. Se empleó el reactor descrito en el apartado II.1.1 en régimen de operación
intermitente, con un nivel de aireación de 1.7 a 2.2 mg·L-1 y un pH de 7 a 7.5. Los gráficos
de los ensayos en reactores intermitentes para determinar la actividad nitrificante y
desnitrificante se muestran en el Anexo 2.
27
Materiales y Métodos
II.3.1. Actividad específica
Se define como la velocidad de consumo de sustrato o generación de producto
efectuada por la biomasa presente en el licor mezclado.
Inicialmente, los procesos microbianos se pueden modelar con una cinética de
primer orden, por lo que a partir de la gráfica del logaritmo natural de la concentración de
sustrato contra tiempo de reacción, se obtiene la constante de reacción de primer orden
(k) que nos permite calcular la actividad específica a partir de las siguientes ecuaciones
NdN kN q Xdt
− = = Ecuación II.11
Integrando e igualando ambas ecuaciones:
( )0
0
lnN
k N Nq
NXN
− −=
⎛ ⎞⎜ ⎟⎝ ⎠
Ecuación II.12
Donde:
qN: Actividad específica de consumo de sustrato (M·M-1·θ -1)
k: Constante de reacción de primer orden (θ -1)
X: Concentración de biomasa en el sistema (M·L-3)
N0: Concentración de sustrato inicial (M·L-3)
N: Concentración de sustrato al tiempo t (M·L-3)
De igual manera, se calculó la velocidad específica de formación de producto
(Ecuación II.13). El balance de masa para el producto:
PdP kN q Xdt
= = Ecuación II.13
Integrando ambas ecuaciones:
28
Materiales y Métodos
0
0
0
ln
P
PN
k Pq
NXPN
Y
⋅=
⎡ ⎤⎢ ⎥⎢ ⎥⎢ ⎥⋅ ⎢ ⎥⎛ ⎞⎢ ⎥⎜ ⎟−⎢ ⎥⎜ ⎟⎜ ⎟⎢ ⎥⎝ ⎠⎣ ⎦
Ecuación II.14
Donde:
qP: Velocidad específica de aparición de producto (M·M-1·t-1)
k: Constante de reacción de primer orden (t-1)
X: Concentración de biomasa en el sistema (M·L-3)
P: Concentración de producto al tiempo ‘t’ (M·L-3)
II.3.1.1. Actividad específica nitrificante (qN) La caracterización cinética del consorcio nitrificante se llevó a cabo con ensayos
en lote con un reactor de 3L, el cual contaba con control automático de la concentración
de oxígeno disuelto en el medio, así como registro en línea. Los niveles de pH y oxígeno
disuelto se ajustaron de 7.1 a 7.5 y de 1.9 a 2.4 mg·L-1, respectivamente. Se tomaron
muestras para cuantificación de amonio, nitrito y nitrato cada 30 minutos.
En un inicio el consorcio se evaluó con dos condiciones: una con limitación de
fuente de carbono inorgánico (C:N = 0.1) y otra sin limitación (C:N = 5.0), esto de acuerdo
a la reacción I.5 ya que se requiere una relación C:N = 0.5 para producir biomasa. El
consorcio nitrificante contenido en el reactor se mantuvo en ayuno por 48 horas antes de
iniciar la cinética. El medio de cultivo empleado en la cinética se describe en la tabla II.4.
Tabla II.4. Composición del medio de cultivo utilizado para cinética nitrificante
Componente g·L-1
(NH4)2SO4 1.2
NH4H2PO4 2.07
MgSO4 0.6
29
Materiales y Métodos
Componente g·L-1
NaCl 1.0
K2HPO4 1.3
CaCl2·6H2O 0.07
NaHCO3 (C/N: 5) 17.7
NaHCO3 (C/N: 1) 3.54
NaHCO3 (C/N: 0.3) 1.063
II.3.1.2. Actividad específica desnitrificante (qDnit) La operación del sistema a bajas concentraciones de oxígeno disuelto (<2 mg·L-1)
pudo favorecer la presencia de procesos de eliminación de amonio y nitrito simultáneos
como la oxidación anaerobia del amonio o ANAMMOX, de tal manera que se evaluó la
capacidad desnitrificante del consorcio con objeto de poder realizar, posteriormente,
balances de nitrógeno.
La caracterización cinética de la actividad desnitrificante se llevó a cabo en
botellas serológicas con volumen nominal de 60 mL. Se adicionaron 3 mL de lodo
proveniente del reactor nitrificante y 37 mL de medio de cultivo (tabla II.5). Las botellas
fueron selladas con tapones de hule y anillos de aluminio y se intercambió su atmósfera
con helio para asegurar condiciones anaerobias. Las botellas se incubaron en agitación
(150 rpm) a temperatura ambiente y en oscuridad. Se tomaron muestras de la fase
gaseosa y la fase líquida para cuantificación de N2, NH4+ y NO2
- cada 12 horas.
Tabla II.5. Composición del medio de cultivo para la prueba en lote desnitrificante
Componente g·L-1
(NH4)2SO4 0.12
NaNO2 0.12
MgSO4 0.06
NaCl 0.10
K2HPO4 0.13
30
Materiales y Métodos
Componente g·L-1
CaCl2·6H2O 0.07
NaHCO3 (C/N: 0.3) 0.11
pH 7.45
II.3.1.3. Coeficiente específico de consumo de oxígeno (qOD) y kLa La determinación de qO2 y kLa se realizó en experimentos dinámicos a partir de los
datos de OD obtenidos del registro en línea del reactor. Este método dinámico se basa en
la medición de la concentración de oxígeno disuelto en el medio con respecto al tiempo
durante la saturación de la fase líquida y en la fase de consumo de oxígeno por la
biomasa presente en el sistema. El balance de masa para el oxígeno es:
( )2
*LL L
transf
dC k a C C q Xdt
⎛ ⎞ = − −⎜ ⎟⎝ ⎠
O Ecuación II.15
Donde:
dCL/dt: Cambio de concentración del oxígeno disuelto
kLa: Coeficiente de transferencia de oxígeno (t-1)
C*: Concentración de saturación de oxígeno en el intervalo dt (M L-3)
CL: Concentración de oxígeno en la solución (M L-3)
qO2X: tasa de consumo de oxígeno (M L-3 t-1)
Si la alimentación de aire u oxígeno cesa, el término del lado derecho de la
ecuación II.15 es cero.
2
LO
dC q xdt
⎛ ⎞− =⎜ ⎟⎝ ⎠
Ecuación II.16
Entonces, la concentración de oxígeno disuelto disminuye a una velocidad
equivalente a la tasa de consumo de oxígeno (qO2X). Cuando nuevamente se suministra
31
Materiales y Métodos
aire al sistema, la concentración de oxígeno disuelto se incrementa hasta el valor inicial y
empleando el valor estimado de qO2, el valor de kLa puede determinarse a partir del perfil
de las mediciones de oxígeno disuelto con la ecuación II.16.
2
*0
OL
q Xk a
C C=
− Ecuación II.17
II.3.2. Prueba abiótica
Para determinar la cantidad de amoniaco que se pudiese perder en la fase gas y
que por tanto no hubiese sido cuantificado como producto o sustrato residual, se realizó
una prueba abiótica. Este experimento se realizó con ensayos en lote en un reactor de 5L
con volumen operacional de 3L.
El reactor contó con control automático del pH y de la concentración de oxígeno
disuelto en el medio, así como registro en línea de estos parámetros. Los valores de pH y
oxígeno disuelto se ajustaron de 7.1 a 7.5 y de 1.9 a 2.4 mg·L-1, respectivamente. La
salida de gas del reactor se conectó a un aspersor sumergido en agua acidificada a pH 2
con HCl 5N, de tal manera que el gas amoniaco que se liberaría del sistema se
recuperaría como amonio en la fase acuosa (figura II.2). Cada experimento tuvo una
duración de 24 horas. Se determinó la concentración de amonio en el reactor al tiempo
inicial y final del experimento, así como en el sistema de recuperación. El amonio se
alimentó junto con medio mineral a una concentración de 1000 ppm.
32
Materiales y Métodos
Aire
PC – Sistema de Adquisición de
Datos
Aire
PC – Sistema de Adquisición de
Datos
Figura II.2. Representación esquemática del sistema empleado para la prueba abiótica.
II.4. Técnicas Analíticas
II.4.1. Cuantificación de nitrito y nitrato
Las muestras obtenidas del efluente se filtraron con filtros de nitrocelulosa
(Millipore) de 13 mm de diámetro y un tamaño de poro de 0.45 μm.
II.4.1.1. Electroforesis capilar El equipo utilizado fue un analizador de iones modelo CIA 4000 de Waters. En esta
técnica de separación, la muestra es inyectada en un extremo del capilar. En éste se
separan los iones, según su movilidad bajo el efecto del campo eléctrico que se aplica
entre los dos extremos del capilar. El detector se sitúa en el capilar. La detección de las
33
Materiales y Métodos
especies separadas se realiza mediante la lectura de la absorbancia en la región UV/Vis.
Las condiciones analíticas para la detección de los iones nitrito y nitrato se describen en la
tabla II.6.
Tabla II.6. Condiciones analíticas para determinar iones NO2
- y NO3- por electroforesis capilar.
Electrolito Sulfato de sodio anhidro 0.1 M CIA-Pak OFM Anion BT, pH 8 0.3 mM
Capilar Sílica fundida, 60 cm x 75 μm Fuente de alimentación Voltaje negativo
Potencial de análisis 15 kV
Intensidad de corriente aplicada 11 a 13 μA Modo de inyección Hidrostático
Detección UV indirecta 214 nm
Temperatura 25 ºC
Tiempo de análisis 5 minutos
La determinación de la concentración se realizó interpolando el área
obtenida en la curva de referencia realizada con 10 a 50 ppm de NO2- y NO3
- (Anexo 1).
II.4.1.2. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Alternativamente también se empleó un HPLC Waters 600. Las condiciones
analíticas para la detección de los iones nitrito y nitrato se describen en la tabla II.7.
Tabla II.7. Condiciones analíticas para determinar iones NO2
- y NO3- por HPLC
Fase móvil p-Hidroxibenzoato de sodio 5mM, pH 8.5 (LiOH)
Columna Anion/R 250 x 4.1 mm Flujo de alimentación 1 mL/min Modo de inyección Isocrático
Detector Conductividad Temperatura 25 ºC
Tiempo de análisis 17 minutos
34
Materiales y Métodos
La determinación de la concentración se realizó interpolando el área obtenida en la
curva de referencia realizada 20 a 100 ppm de NO2- y NO3
- (Anexo 1)
II.4.2. Amonio
Se utilizó un electrodo específico para amonio marca ORION, modelo 95-12. El
electrodo posee una membrana hidrófoba selectiva al gas amoniaco pero no a los iones
OH-. El potencial medido es directamente proporcional a la cantidad de gas amoniaco que
ha pasado a través de la membrana.
Se emplea un volumen de muestra de 20 mL, el cual se alcaliniza a un pH mayor a
13.0 con una solución de NaOH 10 N. La muestra ya tratada se agita con la ayuda de un
agitador magnético teniendo precaución de evitar la formación de vórtex. Se sumerge el
electrodo por 3 minutos, al término de este tiempo se toma la lectura en milivolts relativos
(RMV). La determinación de la concentración se realizó interpolando la lectura obtenida
en la curva referencia que se realizó con 1000, 100 y 10 ppm de N-NH4+ (Anexo 1).
II.4.3. Sólidos suspendidos en el licor mezclado (SSLM)
Se realizó la determinación de SSLM como se describe en los métodos estándar
para el análisis de agua y aguas residuales (APHA, 2002).
Se colocan filtros Wahtman de fibra de vidrio de 55 mm de diámetro en charolas
de aluminio del mismo tamaño o en crisoles de peso conocido. Se secan en un horno a
105 ºC hasta obtener peso constante (W1). A continuación se filtran 10 mL del licor
mezclado del reactor y se procede a colocar los filtros en horno a 105 ºC por 1 hora, al
enfriarse se registra el peso constante (W2). Posteriormente, los filtros son transferidos a
una mufla a 550ºC por 30 minutos para incinerar la materia orgánica, al enfriarse se
registra el peso nuevamente (W3).
35
Materiales y Métodos
Sólidos suspendidos totales del licor mezclado
( ) [ ]2 1W W gSSTLMVol muestra L
−= = Ecuación II.18
Sólidos suspendidos fijos del licor mezclado
( ) [ ]3 1W W gSSFLMVol muestra L
−= = Ecuación II.19
Sólidos suspendidos volátiles del licor mezclado
[ ] gSSVLM SSTLM SSFLML
= − = Ecuación II.20
Donde:
W1: Peso del crisol + Filtro con muestra húmeda
W2: Peso del crisol + Filtro con muestra seca
W3: Peso del crisol + Filtro con muestra incinerada
II.4.4. Carbonato
La cuantificación del carbonato se realizó como carbono inorgánico total con un
analizador de carbono orgánico total TOC-5000A marca Shimadzu. Las muestras se
centrifugaron y filtraron con filtros de nitrocelulosa (Millipore) de 13 mm de diámetro y un
tamaño de poro de 0.45 μm. El volumen de muestra empleado fue de 5 mL.
II.4.5. Acetato
La cuantificación de acetato se realizó por cromatografía de gases en un
cromatógrafo Hewlett Packard modelo 5890. Las muestras se centrifugaron y filtraron con
filtros de nitrocelulosa (Millipore) de 13 mm de diámetro y un tamaño de poro de 0.45 μm.
Para su inyección, la muestra debe acidificarse adicionando 50 μL de HCl al 50%. El
36
Materiales y Métodos
volumen de muestra empleado fue de 1 mL. Las condiciones de operación se detallan en
la tabla II.8
Tabla II.8. Condiciones de operación del cromatógrafo de gases HP 5890.
Temperatura de la columna 80 ºC
Tempearatura del detector 280 ºC
Temperatura del inyector 200 ºC
Detector FID
Gas Acarreador Nitrógeno
Flujo del gas acarreador 40 mL·min-1
Columna AT1000
Volumen de inyección 0.1 mL
La determinación de la concentración se realizó interpolando la lectura obtenida en
la curva referencia que se realizó con 2 a10 mM de acetato (Anexo 1).
II.4.6. Nitrógeno molecular.
La cuantificación del nitrógeno molecular se realizó por cromatografía de gases en
un cromatógrafo Gow-Mac con detector de conductividad térmica. Las condiciones de
operación se detallan en la tabla II.9.
Tabla II.9. Condiciones de operación del cromatógrafo de gases Gow-Mac
Temperatura de la columna 140 ºC
Tempearatura del detector 190 ºC
Temperatura del inyector 170 ºC
Corriente del detector 120 mA
Gas Acarreador Helio
Presión 40 psi
Flujo del gas acarreador 25 mL·min-1
Empaque de la columna Carbosphere 80/100
Volumen de inyección 0.1 mL
La determinación de la concentración se realizó interpolando la lectura obtenida en
la curva referencia que se realizó con volúmenes de 1 a 10 mL de gas (Anexo 1).
37
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados y Discusión
III. Resultados y discusión
III.1. Operación del sistema SHARON En la figura III.1 se presenta el comportamiento de los compuestos nitrogenados
durante el arranque del reactor (etapa I) y en las subsecuentes etapas (II a V), así como el
promedio diario de la concentración de oxígeno disuelto en el sistema; las fluctuaciones
en la alimentación del reactor se deben a fallas técnicas en el suministro eléctrico a la
bomba de alimentación.
La figura III.2 presenta los promedios obtenidos de eficiencia de conversión y de la
tasa volumétrica de producción de nitrito para cada etapa en función del tiempo de
residencia celular.
En la etapa I, el sistema (sección II.1.1) se operó a un TRH de 1 día,
alimentándose una BN de 0.186 kg·m-3·d-1 a una relación Cinorg:N de 5. La concentración
de OD y el pH se fijaron en un máximo de 2.2 mg·L-1 y 7.0, en cada caso. Durante esta
etapa, el amonio se consumió en un 92%, mientras que sólo un 38% de este consumo se
transformó a nitrito y no se detectó producción de nitrato.
La concentración de sólidos suspendidos volátiles fue de 0.5 g·L-1, sin embargo, se
observaron problemas de lavado de biomasa (Xe = 0.30 a 0.48 gSSV·L-1), por lo que ésta
era recirculada manualmente al reactor. En la etapa II se optó por incrementar el TRH a 3
días para paliar este problema, además de disminuir la relación Cinorg:N a 0.3 para
promover un proceso desasimilativo, lo que implicó alimentar el sistema a una
concentración de N-NH4+ en la alimentación de 0.25 kg N·m-3 (BN = 0.082 kg·m-3·d-1).
Aunque en la etapa II el TRH era de 3 días, continuó observándose lavado de
biomasa durante los primeros días de operación. Por lo tanto, se integró un sedimentador
al sistema para recircular la biomasa al reactor, como resultado el TRC fue de 3.2 días y
la concentración de SSVLM se restableció en 0.7 g·L-1. La eficiencia de consumo de
39
Resultados y Discusión
amonio en esta etapa fue superior al 90% y la conversión a nitrito aumentó de 38% a
53%. A pesar de incrementarse el TRC, nuevamente no se observó la producción de
nitrato en el sistema. La tasa volumétrica de producción de NO2- (γP) disminuyó debido a
que el reactor se alimentó con una menor velocidad de carga de N-NH4+.
Figura III.1. Comportamiento de los compuestos nitrogenados y promedios de concentración de oxígeno disuelto durante la operación del reactor.
Para la etapa III, el reactor se alimentó a una concentración de nitrógeno
amoniacal de 0.47 kg N·m-3 (BN = 0.16 kg·m-3·d-1), TRH de 3 días y una relación Cinorg:N de
0.3. La concentración de biomasa en el sistema fue de 1.1 gSSV·L-1 y el tiempo de
retención celular fue de 6.5 días. En esta etapa, la eficiencia de consumo fue de 93% y la
de conversión a nitrito fue igual a la de la etapa anterior, 53%, aunque la tasa volumétrica
40
Resultados y Discusión
de producción de NO2- se recuperó al incrementar la velocidad de carga de N-NH4
+, no se
observó producción de nitrato.
I II III
IV
V
Figura III.2. Relación de la eficiencia de conversión y tasa de producción de NO2- con respecto al TRC.
En la fase IV de la operación, se adicionó acetato de sodio como fuente de
carbono orgánico al medio (figura III.3), esto se hizo para estudiar el efecto que la materia
orgánica ejerce sobre la nitritación. La relación Cinorg:N se mantuvo en 0.3 y la relación
COrg:N fue de 1.0 al alimentarse el acetato a una Bv de 0.188 kg C·m-3·d-1. La
concentración de N-NH4+ en esta etapa fue de 0.504 kg N·m-3 (BN = 0.168 kg N·m-3·d-1). El
TRH fue de 3 d, el pH y la concentración máxima de oxígeno disuelto fueron de 7.5 y 2
mg·L-1 en cada caso. La adición de acetato al sistema tuvo dos efectos principales, el
crecimiento de biomasa y la inhibición del proceso amonio-oxidante.
41
Resultados y Discusión
La concentración de sólidos suspendidos volátiles pasó de 1.1 g·L-1 a 1.4 g·L-1. Sin
embargo, cuando el oxígeno se convierte en un factor limitante para el crecimiento
bacteriano predominan los organismos filamentosos que tienden a formar flóculos que se
mantienen en suspensión, este fenómeno se conoce como esponjamiento o bulking. Este
esponjamiento afectó negativamente la capacidad de sedimentación del lodo ocasionando
que la concentración de sólidos en el efluente fuera de 0.26 gSSV·L-1. A pesar de este
problema, la concentración de biomasa nunca fue menor a 1.4 g·L-1.
IV V
Figura III.3. Fluctuación de los compuestos carbonados y nitrogenados durante las etapas IV y V
Por otra parte, se observó que la tasa específica de producción de N-NO2-
disminuyó de 0.07 a 0.014 kgN·kgSSV-1·d-1. La eficiencia de consumo de amonio
disminuyó hasta el 45% y la eficiencia de conversión a nitrito se situó en 6%. Es probable
42
Resultados y Discusión
que parte del nitrógeno amoniacal alimentado haya contribuido al crecimiento de las
bacterias heterótrofas.
Para explicar este efecto negativo sobre la nitrificación en la literatura encontramos
diversas hipótesis. En sistemas con células en suspensión se ha observado que el efecto
negativo de la materia orgánica se fortalece cuando la concentración de oxígeno disuelto
es menor a 2 mg·L-1 (Hanaki et al., 1990b) debido a las diferencias existentes en la Ko y la
μmáx entre las bacterias amonio-oxidantes y heterótrofas, siendo estas últimas las más
beneficiadas ya que presentan valores de Ko y μmáx de 0.08 mg·L-1 y 7.2 d-1,
respectivamente, contra 0.3 mg·L-1 y 0.8 d-1 de las bacterias nitrificantes. En la tabla III.1
se presenta un cuadro comparativo con los valores de las constantes cinéticas reportados
en la literatura y datos obtenidos en este trabajo. Dangcong et al. (2001) observan que la
disminución de la tasa específica de consumo de N-NH4+ está relacionada con el
decremento de la fracción de bacterias nitrificantes en el consorcio, debido al lento
crecimiento de estos organismos comparado con las bacterias heterótrofas, es decir que a
largo plazo los organismos amonio-oxidantes son desplazadas del sistema. Nogueira et
al. (2002) mencionan que en los reactores de biopelícula, las bacterias heterótrofas
crecen en las capas exteriores donde la concentración de sustrato es alta dejando a las
bacterias nitrificantes en las capas interiores, de tal manera que si se opera un sistema
con bajas concentraciones de oxígeno se tiene como resultado el consumo y la
resistencia a la transferencia de O2 dentro de la capa heterótrofa lo que afecta
negativamente el desempeño de la nitrificación.
De acuerdo a lo reportado en la literatura, se observa que la concentración de
oxígeno disuelto en el sistema es el parámetro que debe modificarse a fin de que ambos
procesos oxidativos se lleven a cabo. Por esto, se decide incrementar la concentración de
OD en el sistema.
43
Resultados y Discusión
Tabla III.1. Constantes cinéticas reportadas en la literatura y obtenidas en este trabajo de los organismos presentes en el reactor
μ, d-1
Microorganismo μmáx, d-1 Ko, mg·L-1
Etapa I Etapa II Etapa III Etapa IV
Bacterias amonio-oxidantes 0.8* 0.3*** <0.33 0.31 0.155 0.186
Bacterias nitrito-oxidantes 0.79* 1.1***
Bacterias heterótrofas 7.2** 0.08**
* van Hulle, 2005 ** Hellinga et al., 1999 *** Kim et al., 2005
En la etapa V, se alimentó una concentración de N-NH4+ de 0.486 kg N·m-3 (BN =
0.162 kg N·m-3·d-1). La relación Cinorg:N se mantuvo en 0.3 y la relación COrg:N fue de 1.0
al alimentarse el acetato a una Bv de 0.188 kg C·m-3·d-1. La El TRH fue de 3 d, el pH y la
concentración máxima de oxígeno disuelto fueron de 7.5 y 4 mg·L-1. Este incremento en la
concentración de OD permitió que mejorara la tasa específica de producción de nitrito en
el sistema, situándose en 0.056 kgN·kgSSV-1·d-1. Este fenómeno puede explicarse si
consideramos la hipótesis de que cada bacteria nitrificante está rodeada por
microorganismos heterótrofos que limitan el transporte de oxígeno. Si la concentración de
oxígeno disuelto aumenta puede llegar a un nivel en el que será suficiente para llevar a
cabo ambos procesos oxidativos. Otros autores mencionan que, en presencia de materia
orgánica y tras una aireación prolongada, la recuperación de la actividad nitrificante en el
reactor se debe a que las bacterias amonio-oxidantes requieren largos períodos de
arranque para que los microorganismos se aclimaten (Yun et al., 2004).
En esta etapa se observó la presencia de NO2- en el efluente del reactor mas no la
producción de nitrato. Una explicación de esto se deriva de la determinación de la tasa de
transferencia de oxígeno (OTR) y el cálculo teórico del oxígeno necesario para producir el
nitrito detectado en el efluente y oxidar la materia orgánica en cada etapa (tabla III.2). Se
observa que en la etapa V, la cantidad de oxígeno teórico necesario para obtener 122
44
Resultados y Discusión
mg·L-1 de NO2- y oxidar el acetato alimentado supera la cantidad de oxígeno transferido al
reactor. Por lo que, muy probablemente no existió oxígeno disponible para llevar a cabo la
oxidación de nitrito a nitrato.
Tabla III.2. Tasa de consumo y transferencia de oxígeno en cada etapa de operación del reactor.
Etapa qO2
·X, mg O2·L-1·h-1 kLa, h-1 OTR,
mg O2·d-1O2 teórico, mg O2·d-1
I 9.31 2.18 671.8 227.7
II 10.24 2.39 736.5 466.3
III 10.52 2.46 758.1 822.9
IV 9.87 2.31 711.9 1523.1
V 15.43 3.61 1111 1991.6
Durante la etapa V, las concentraciones promedio de amonio y nitrito en el efluente
fueron 100 y 121.6 mg·L-1, respectivamente. Estas concentraciones dan como resultado
una relación molar NH4+:NO2
- de 1:1.22, la cual se aproxima a las necesidades del
proceso ANAMMOX que generalmente se acopla al sistema SHARON. Las eficiencias de
consumo de amonio y conversión a nitrito fueron 76% y 49% en cada caso.
III.2. Balance de nitrógeno La eficiencia de consumo de amonio fue superior al 90% en las etapas I a III y la
eficiencia de conversión a nitrito no superó el 55% en las mismas etapas (figura III.2). Así
mismo, se observa que la oxidación de amonio a nitrito a la concentración de oxígeno
manejada puede llevarse a cabo con éxito, independientemente de la edad del lodo que
se maneje en el reactor. Se sabe que al incrementar el TRC, las bacterias nitrito-oxidantes
permanecen en el sistema, sin embargo, no se observó producción de nitrato en el
efluente. Pollice et al. (2002), reportan que se puede conseguir una producción estable de
45
Resultados y Discusión
nitrito si el sistema opera a bajas concentraciones de oxígeno disuelto, aún cuando la
edad del lodo incremente hasta valores cercanos a los 15 días.
I II IIIIV
V
Figura III.4. Tasas volumétricas de consumo y producción en función de BN
En la operación en continuo se observó una marcada diferencia entre la
concentración del N-NH4+ consumido y el N-NO2
- producido. En las etapas I a III, sólo el
50% del nitrógeno consumido era transformado a nitrito, esta relación entre el nitrógeno
amoniacal consumido y el nitrito producido disminuye hasta 7% al adicionarse materia
orgánica al sistema (etapa IV) y tras una aireación prolongada se recupera al 45%. Al
analizar los valores obtenidos de las tasas volumétricas de consumo (γN) y de producción
46
Resultados y Discusión
(γP) se observa esta misma tendencia (figura III.4), donde la relación entre la producción y
el consumo se sitúa entre 0.55 y 0.64 en las etapas I a III, para observar una caída en la
etapa IV a 0.25, debido a la adición de la materia orgánica. Y tras incrementar la
concentración de oxígeno en el sistema ésta se recupera hasta un valor de 0.64 (tabla
III.4).
Con objeto de explicar la pérdida de nitrógeno del sistema se realizaron dos
experimentos complementarios: una prueba abiótica (sección II.3.2) donde se cuantificó el
nitrógeno perdido en forma de amoniaco debido a la desorción con aire, y la
determinación de posible actividad desnitrificante autotrófica (sección II.3.1.2) resultada
de la limitada concentración de oxígeno presente en el medio durante las etapas I a III.
Como paso preliminar a la prueba abiótica se calculó la concentración teórica de
amoniaco que era desorbida del sistema, para lo cual había que determinar cual era la
concentración de amoniaco libre en la fase líquida. Ford et al. (1980, citado por Yang et
al., 2004) obtiene la siguiente ecuación:
[ ] [ ]43
1010
pH
NH pHe
N NHNH
K−
=+i
Ecuación III.1
Donde:
NH3]: Concentración de amoniaco en la fase líquida
[N-NH4+]: Concentración de nitrógeno amoniacal en la fase líquida
pH: pH actual en el medio (7.0)
El valor de la constante de equilibrio se calcula de la siguiente manera:
6344273NH T
eK e += Ecuación III.2
Donde:
T: Temperatura de sistema en ºC
47
Resultados y Discusión
En la tabla III.3 se presentan las concentraciones calculadas de amoniaco libre
considerando valores promedio de T y pH de 22 ºC y 7.3, respectivamente.
Tabla III.3. Concentraciones teóricas de amoniaco libre en cada etapa de operación
Etapa [N-NH4+], mg·L-1 [N-NH3], mg·L-1
I 183 1.656
II 246 2.225
III 468 4.234
IV 504 4.560
V 486 4.400
Posteriormente, se realizó el cálculo de la concentración de amonio en la fase
gaseosa utilizando la Ley de Henry (ecuación III.3).
3 3· ·
3NH T NH NHY P X H= Ecuación III.3
Donde:
YNH3: Fracción mol de amonio en la fase gas
XNH3: Fracción mol de amonio en la fase líquida
HNH3: Constante de la ley de Henry para el amonio (0.016 atm·L·mol-1)
PT: Presión del sistema
3 3
3
3
3
· 0.0000974 0.016 · 10.771
NH NHNH
T
X H molNH atm LYP L molNH atm
= = × ×
3
6 32.021 10NHmolNHY x
mol−=
Si QAire = 144 L·d-1, entonces
144 1 0.771 273 4.5422.4 1 298aire
L mol atm K molAireQd L atm K d
= × × × =
3
3 3
3
2.021 06 174.54· 1aire NH3.56 04E molNH gNH gNHmolAireQ Y E
d molAire molNH d−
= × × = −
48
Resultados y Discusión
En la tabla III.4 se presentan los valores teóricos de desorción y los resultados
experimentales obtenidos a partir de la prueba abiótica. Los valores teóricos han sido
calculados para una concentración de 1000 ppm NH4+.
Tabla III.4. Valores teóricos y experimentales de gas amoniaco perdido en el sistema por desorción.
Flujo de Aire, L·min-1
Teórico, mg·d-1
Experimental, mg·d-1
% Amoniaco perdido
Desviación estándar
0.1 1.04 28 2.4 2.475
1.0 10.4 105 11 4.525
3.0 31.2 223 21.2 5.15
A pesar de que teóricamente las pérdidas de amoniaco en el sistema son bajas, se
observa que en la prueba abiótica esto puede representar hasta el 20% del sustrato
alimentado, dependiendo del flujo de aire que se esté alimentando. Durante la operación
del reactor, se suministraron 3 L·min-1 de aire en la etapa I, posteriormente, en las etapas
II y III, el flujo de aire fue de 1 L·min-1 y finalmente en las etapas IV y V, se alimentó un
flujo de aire de 0.1 L·min-1.
Por otra parte, la prueba en lote para determinar la presencia de actividad
desnitrificante en el sistema arrojó datos interesantes. Diversos autores han reportado que
la operación de sistemas nitrificantes a bajas concentraciones de oxígeno disuelto (<2
mg·L-1) puede favorecer a los procesos de eliminación de amonio y nitrito simultáneos
como son los procesos ANAMMOX, CANON (Completely Autotrophic Nitrogen removal
Over Nitrite) y OLAND (Oxygen Limited Autotrophic Nitrification-Denitrification).
El valor obtenido para este proceso fue de 2.8 mmol NH4+·g-1 SSV·d-1. Si
consideramos que en promedio, cada gramo de SSV contiene 0.5 gramos de proteína, la
actividad específica sería de 5.6 mmol NH4+·g-1 proteína·d-1. En este caso, la actividad
específica obtenida es, bajo la consideración antes expuesta, similar a la que se reporta
49
Resultados y Discusión
para los microorganismos amonio-oxidantes (Schmidt y Bock, 1997; Schmidt et al., 2002;
Jetten et al., 2001, 2002). De tal manera que existe la posibilidad que 24% del nitrógeno
alimentado se hubiera convertido a N2,, tal como sucedió en la prueba en lote.
Ambos experimentos arrojan datos que permitirían esclarecer el destino de 50%
del nitrógeno amoniacal alimentado que no se cuantifica como NO2-. El proceso llevado a
cabo en el sistema se esquematiza en la figura III.5.
NH4+ NO2- NO3-
NH3
N2
Hasta un 50% de conversión
Hasta un 20% de desorción
Hasta un 24% de conversión
Biomasa Hasta un 6% de asimilación
X
Figura III.5. Esquematización de los posibles procesos realizados en el sistema estudiado.
En la tabla III.5 se presenta un sumario de los resultados obtenidos a lo largo de la
operación del sistema.
Tabla III.5. Sumario de resultados de la operación del reactor SHARON.
ETAPA Parámetro
I II III IV V
Periodo de prueba (d) 27 34 132 45 30
TRH (d) 1 3 3 3
TRC (d) 1 3.2 6.45 5.37
Influente (mg N L-1 )
N-NH4+ 183 246 468 504 486
50
Resultados y Discusión
ETAPA Parámetro
I II III IV V
Efluente (mg N L-1)
N-NH4+ 7.6 0.6 18 276 100
N-NO2- 66.4 136 240 16 122
N-NH4+ desplazado * 36.6 27.1 47 16 15
N2 teórico ** 43.9 59 112
N- Biomasa*** 20 25 32 35
NTotal 154.5 242.7 442 340 272
% Recuperación de N 84 99 94 67 56
Tasa específica de consumo N (kg N kg SSV-1 d-1) 0.34 0.065 0.14 0.054 0.087
Tasa específica de formación de nitrito (kg N kg SSV-1 d-1) 0.14 0.04 0.075 0.014 0.056
γP : γN 0.41 0.62 0.54 0.26 0.64
Velocidad nitrificante específica (kg N kg SSV-1 d-1) 0.73 0.40 0.28
* Calculado a partir de los datos obtenidos de la prueba abiótica ** Calculado a partir de los datos obtenidos de la prueba desnitrificante *** Calculado a partir de la concentración de biomasa en el efluente
De los datos mostrados en la tabla III.4, se observa que aunque se ha considerado
en el balance de nitrógeno el amonio que pudo ser desplazado por arrastre con aire, el N2
que posiblemente se formó debido a procesos desnitrificantes autotróficos y el nitrógeno
que se asimiló para la formación de biomasa, aún existe un faltante.
Burgess et al. (2002) reportan que el N2O se produce a concentraciones de
oxígeno disuelto que van de 1 a 4 mg·L-1. Otros estudios han demostrado que el principal
mecanismo por el que las bacterias amonio-oxidantes producen N2O tiene que ver con el
51
Resultados y Discusión
proceso desnitrificante llevado a cabo por estos microorganismos (Bock et al., 1995; Poth
y Fotch, 1985).
En las etapas IV y V, no se ha considerado la aportación del N2 formado por
procesos desnitrificantes autotróficos ya que se debe considerar que con la presencia de
bacterias heterótrofas en el sistema, las condiciones han cambiado y pueden existir otros
procesos que no se estudiaron en este trabajo.
52
CONCLUSIONES
Conclusiones y recomendacones
IV. Conclusiones y recomendaciones Las principales conclusiones con respecto a este trabajo son:
• El arranque del reactor a un TRH de 1 día no fue adecuado pues se presentaron
problemas de lavado de biomasa. El proceso tuvo una eficiencia de consumo del
92%, la eficiencia de conversión a nitrito fue del 38%.
• La operación del reactor con una baja concentración de oxígeno disuelto fue una
buena estrategia. El sistema tuvo una eficiencia de consumo de N-NH4+ de 96%
y una eficiencia de conversión de 53% al finalizar la etapa autotrófica.
• Bajo condiciones de limitación de oxígeno, es posible obtener una conversión
estable del amonio a nitrito la cual sea independiente del tiempo de retención
celular (TRC).
• Se obtuvo un proceso de nitrificación parcial tipo SHARON junto con la probable
remoción de especies nitrogenadas por procesos desnitrificantes autotróficos
como el proceso ANAMMOX.
• La baja concentración de oxígeno disuelto y la presencia de materia orgánica
tuvieron un efecto negativo sobre la nitrificación parcial. La tasa específica de
producción de NO2- se redujo un 80%. Las eficiencias de consumo y de
conversión disminuyeron hasta 45% y 6%, respectivamente.
• Al incrementar la concentración de oxígeno disuelto se recuperó la actividad
oxidante de amonio a nitrito. Con esta estrategia, la tasa específica de formación
de nitrito aumentó un 400% al finalizar la operación del reactor.
54
Conclusiones y recomendacones
Recomendaciones.
Es importante señalar que la alimentación de aire al sistema ocasionó conflictos al
momento de encontrar el destino del amonio faltante en el balance de nitrógeno, por lo
que se recomienda que el sistema se airee con oxígeno puro. De esta manera, será más
sencillo determinar la producción de N2 u óxidos de nitrógeno. Además de que al manejar
flujos de aireación bajos disminuirá la cantidad de amoniaco que puede perderse por
desorción.
Los sistemas de células en suspensión, como el que se operó en este trabajo,
dependen de la tasa máxima de crecimiento, por lo tanto tienen un tiempo de retención
hidráulico mínimo. Es necesario evaluar el proceso de nitrificación parcial en presencia de
materia orgánica en sistemas de biopelícula para evitar los problemas de lavado de
biomasa. Además de determinar si estos sistemas pueden ser más eficientes que los
sistemas de células en suspensión
El empleo de técnicas de biología molecular para conocer las poblaciones
presentes en el reactor. Determinar, por ejemplo, si la desnitrificación autotrófica solo es
realizada por bacterias amonio-oxidantes.
55
BIBLIOGRAFIA
Bibliografía
V. Bibliografía American Public Health Association (APHA) (2002) Standard methods for examination of
water and wastewater. APHA – AWWA – WPCF. Washington, D.C.
Arp D.J., Sayavedra-Soto L.A. & Hommes N.G. (2002) Molecular biology and biochemistry
of ammonia oxidation by Nitrosomonas europaea. Arch. Microbiol. 178: 250 – 255.
Beaumont H.J.E., van Schooten B., Lens S.I., Westerhoff H.V. & van Spanning R.J.M.
(2004) Nitrosomonas europaea expresses a nitric oxide reductase during nitrification.
J. Bacteriol. 186(13): 4417 – 4421.
Belser L.W. (1984) Bicarbonate uptake by nitrifiers: Effects of growth rate, pH, substrate
concentration, and metabolic inhibitors. Appl. Environ. Microbiol. 48(6): 1100 – 1104.
Bernet N. (2002) Microbial processes for biological nitrogen and phosphorus renoval from
wastewater. Apuntes del IV curso internacional de microbiología industrial. UAM-I.
Bernet N., Sanchez O., Cesbron D., Steyer J.-P. & Delgenès J.-P. (2005) Modeling and
control of nitrite accumulation in a nitrifying biofilm reactor. Biochem. Eng. J. 24: 173 –
183.
Bock E., Wilderer P.A. & Freitag A. (1988) Growth of Nitrobacter in the absence of
dissolved oxygen. Wat. Res. 22(2): 245 – 250.
Bock E., Schmidt I., Stuven R. & Zart D. (1995) Nitrogen loss caused by denitrifying
Nitrosomonas cells using ammonium or hydrogen as electron donors and nitrite as
electron acceptor. Arch. Microbiol. 163: 16 – 20.
Bock E. & Wagner M. (2001). Oxidation of inorganic nitrogen compounds as an energy
source en Dworkin M eds., The Prokaryotes: An Evolving Electronic Resource for the
Microbiological Community, 3a ed., versión 3.7, Springer-Verlag, New York. Disponible
en internet en: http://link.springer-ny.com/link/service/books/10125/
57
Bibliografía
Bodelier P.L.E., Libochant J.A., Blom C.W.P.M. & Laanbroek H.J. (1996) Dynamics of
nitrification and denitrification in root-oxygenated sediments and adaptation of
ammonia-oxidizing bacteria to low-oxygen or anoxic habitats. Appl. Environ. Microbiol.
62(11): 4100 – 4107.
Burgess J. E., Colliver B. B., Stuetz R. M. & Stephenson T. (2002) Dinitrogen oxide
production by a mixed culture of a nitrifying bacteria during ammonia shock loading
and aeration failure. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 29: 309 – 313.
Chain P., Lamerdin J., Larimer F., Regala W., Lao V., Land M., Hauser L., Hooper A.,
Klotz M., Norton J., Sayavedra-Soto L., Arciero D., Hommes N., Whittaker M. & Arp D.
(2003) Complete Genome Sequence of the Ammonia-Oxidizing Bacterium and
Obligate Chemolithoautotroph Nitrosomonas europaea. J. Bacteriol. 185(9): 2759 –
2773.
Clark C. & Schmidt E. L. (1966) Effect of mixed culture on Nitrosomonas europaea
simulated by uptake and utilization of pytuvate. J. Bacteriol. 90(1): 367 – 373.
Clark C. & Schmidt E. L. (1967) Growth response of Nitrosomonas europaea to amino
acids. J. Bacteriol. 93(4): 1302 – 1308.
Clark C. & Schmidt E. L. (1967b) Uptake and utilization of amino acids by resting cells of
Nitrosomonas europaea. J. Bacteriol. 93(4): 1309 – 1315.
Dangcong P., Bernet N., Delgenes J-P. & Moletta R. (2001) Simultaneous organic carbon
and nitrogen removal in an SBR controlled at low dissolved oxygen concentration. J.
Chem. Technol. Biotechnol. 73: 553 – 558.
Egli, K., Langer, C., Siegrist, H.-R., Zehnder, A. J. B., Wagner, M. & van der Meer, J. R..
(2003). Community analysis of ammonia and nitrite oxidizers during start-up of
nitritation reactors. Appl. Environ.l Microbiol. 69: 3213 – 3222.
58
Bibliografía
Esquivel-Martínez M. (2003) Parámetros que influyen en el diseño de un sistema aerobio
para el postratamiento de efluentes anaerobios. Tesis de Maestría. Universidad
Autónoma Metropolitana. Pp. 19, 26.
Fux, C., Boehler M., Huber, P., Brunnen I. & Siegrist H. (2002) Biological treatment of
ammonium-rich wastewater by partial nitrification and subsequent anaerobic
ammonium oxidation (anammox) in a pilot plant. J. Biotechnol. 99: 295 – 306.
Hanaki K., Wantawin C. & Ohgaki S. (1990a) Effects of the activity of heterotrophs on
nitrification in a suspended-growth reactor. Wat. Res. 24(3): 289 – 296.
Hanaki K., Wantawin C. & Ohgaki S. (1990b) Nitrification at low levels of dissolved oxygen
with and without organic loading in a suspended-growth reactor. Wat. Res. 24(3): 297
– 302.
Hellinga C., van Loosdrecht M. C. M. & Heijnen J. J. (1999) Model based design of a
Novel process for nitrogen removal from concentrated flows. Math. Comp. Model.
Dynam. Syst. 5(4): 351 – 371.
Holt J. Krieg N. Sneath P. Staley J. & Williams S. (1994) Bergey´s Manual of
Determinative Bacteriology. 9a. ed. Editorial William & Hensyl. Pp. 1818 - 1825.
Hommes N., Sayavedra-Soto L. & Arp D. (2003) Chemolithoorganotrophic growth of
Nitrosomonas europaea of fructose. J. Bacteriol. 185(23): 6809 – 6814.
Jetten M.S.M., Horn S.J. & van Loosdrecht M.C.M. (1997) Towards a more sustainable
municipal wastewater treatment system. Wat. Sci. Tech. 35(9): 171 – 180.
Jetten M.S.M., Strous M., van de Pas-Schoonen K.T., Schalk J., van Dongen U.G.J.M.,
van de Graaf A.A., Logemann S., Muyzer G., van Loosdrecht M.C.M. & Kuenen J.G.
(1999) The anaerobic oxidation of ammonium. FEMS Microb. Rev. 22: 421 – 437.
Jetten M.S.M., Wagner M., Fuerst J., van Loosdrecht M., Kuenen G. & Strous M. (2001)
Microbiology and application of the anaerobic ammonium oxidation (‘anammox’)
process. Current Opinion Biotech. 12: 283 – 288.
59
Bibliografía
Jetten M.S.M., Schmid M., Schmidt I., Wubben M., van Dongen U., Abma W., Sliekers O.,
Revsbech N. P., Beaumont H. J. E., Ottosen L., Volcke E., Laanbroek H.J., Campos-
Gomez J. L., Cole J., van Loosdrecht M., Mulder J. W., Fuerst J., Richardson D., van
de Pas K., Mendez-Pampin R., Third K., Cirpus I., van Spanning R., Bollmann A.,
Nielsen L. P., den Camp H. O., Schultz C., Gundersen J., Vanrolleghem P., Strous M.,
Wagner M. & Kuenen J. G. (2002) Improved nitrogen renoval by application of new
nitrogen-cycle bacteria. Re/Views in Environmental Science & Bio/Technology 1: 51 –
63.
Kätterer T. (2002) Nitrogen Budgets. Encyclopedia of life sciences. Macmillan Publishers
Ltd., Nature Publishing Group. Disponible en internet en: http://www.els.net
Kelly, D.P. & Wood, A. P. (2000) The Chemolithotrophic Prokaryotes en Dworkin M eds.,
The Prokaryotes: An Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community,
3a ed., versión 3.1, Springer-Verlag, New York. Disponible en internet en:
http://link.springer-ny.com/link/service/books/10125/
Kester R.A., de Boer W. & Laanbroek H.J. (1997) Production of NO and N2O by pure
cultures of nitrifying and denitrifying bacteria during changes in aeration. Appl. Environ.
Microbiol. 63(10): 3872 – 3877.
Kim D-J., Ahn D.H. & Lee D-I. (2005) Effects of free ammonia and dissolved oxygen on
nitrification and nitrite accumulation in a biofilm airlift reactor. Korean J. Chem. Eng.
22(1): 85 – 90.
Kowalchuk G.A. & Stephen J.R. (2001) Ammonia-Oxidizing Bacteria: A model for
molecular mocrobial ecology. Annu. Rev. Microbiol. 55: 485 – 529.
Laanbroek H.J. & Gerards S. (1993) Competition for limiting amounts of oxygen between
Nitrosomonas europaea and Nitrobacter winogradskyi grown in mixed continous
cultures. Arch. Microbiol. 159: 453 – 459.
60
Bibliografía
Madigan, M.T., Martinko J.M. & Paker J. (2004) Brock. Biología de los microorganismos.
10ª ed. Pearson-Prentice Hall. Madrid. p. 359, 565.
Mosquera-Corral A., González F., Campos J. L. & Méndez R. (2005) Partial nitrification in
a SHARON reactor in the presence of salts and organic carbon compounds. Proc.
Biochem. 40: 3109 – 3118.
Mulder A., van de Graaf A.A., Robertson L.A. & Kuenen J.G. (1995) Anaerobic ammonium
oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor. FEMS Microbiol. Ecol. 16:
177 – 183.
Mulder J.W., van Loosdrecht M.C.M., Hellinga C. & van Kempen R. (2001) Full-scale
application of the SHARON process for treatment of rejection water of digested sludge
dewatering. Wat. Sci. Tech. 43(11): 127 – 134.
Philips, S., Laanbroek, H.J. & Verstraete, W. (2002). Origin, causes and effects of
increased nitrite concentrations in aquatic environments. Re/Views in Environmental
Science and Bio/Technology. 1: 115-141.
Pollice A., Tandoi V. & Lestingi C. (2002) Influence of aeration and sludge time on
ammonium oxidation to nitrite and nitrate. Wat. Res. 36: 2541 – 2546.
Poth, M. (1986) Dinitrogen production from nitrite by a Nitrosomonas isolate. Appl.
Environ. Microbiol. 52(4): 957 – 959.
Poth, M. & Pocht D.D. (1985) 15N kinetic analysis of N2O production by Nitrosomonas
europaea: an examination of nitrifier denitrification. Appl. Environ. Microbiol. 49(5):
1134 – 1141.
Ruiz G., Jeison D. & Chamy R. (2003) Nitrification with high nitrite accumulation for the
treatment of wastewater with high ammonia concentration. Wat. Res. 37: 1371 – 1377.
Schmidt I. & Bock E. (1997) Anaerobic ammonia oxidation with nitrogen dioxide by
Nitrosomonas eutropha. Arch. Microbiol. 167: 106 – 111.
61
Bibliografía
Schmidt I., Hermelink C., van de Pas-Schoonen K., Strous M., op den Camp H. J., Kuenen
G. & Jetten M. S. M. (2002) Anaerobic ammonia oxidation in the presence of nitrogen
oxides (NOx) by two different lithotrophs. Appl. Environ. Microbiol. 68(11): 5351 – 5357.
Schmidt I., Sliekers O., Schmid M., Bock E., Fuerst J., Kuenen J.G., Jetten M.S.M. &
Strous M. (2003) New concepts of microbial treatment processes for the nitrogen
removal in wastewater. FEMS Microbiol. Rev. 27: 481 – 492.
Smith A. J. & Hoare D. S. (1968) Acetate assimilation by Nitrobacter agilis in relation to its
“obligate autotrophy”. J. Bacteriol. 95(3): 844 – 855.
Strous M. (2000) Microbiology of anaerobic ammonium oxidation. Tesis Doctoral.
Universidad Técnica de Delft. Pp. 21, 80.
Strous M., van Gerven E., Kuenen, J.G. & Jetten M. (1997) Effects of aerobic and
microaerobic conditions on anaerobic ammonium-oxidizing (Anammox) sludge. Appl.
Environ. Microbiol. 63(6): 2446 – 2448.
Strous, M., Van Gerven, E., Ping, Z., Kuenen, J.G. & Jetten, M.S.M. (1997b). Ammonium
removal from concentrated waste streams with the anaerobic ammonium oxidation
(Anammox) process in different reactor configurations. Wat. Res. 31: 1955 – 1962.
Strous M., Pelletier E., Mangenot S., Ratter T., Lehner A., Taylor M.W., Horn M., Daims
H., Bartol-Mavel D., Wincker P., Barbe V., Fonknechten N., Vallenet D., Segurens B.,
Schenowitz-Truong C., Médigue C., Collingro A., Snel B., Dutilh B.E., Op den Camp
H.J.M., van der Drift C., Cirpus I., van de Pas-Schoonen K.T., Harhangi H.R., van
Niftrik L., Schmid M., Keltjens J., van de Vossenberg J., Kartal B., Meier H., Frishman
D., Huynen M.A., Mewes H.-W., Weissenbach J., Jetten M.S.M., Wagner M. & Le
Paslier D. (2006) Deciphering the evolution and metabolism of an anammox bacterium
from a community genome. Nature 440: 790 – 794.
Suzuki I., Dular U. & Kwok S.C. (1974) Ammonia or ammonium ion as substrate for
oxidation by Nitrosomonas europaea cells and extracts. J. Bacteriol. 120(1): 556 – 558.
62
Bibliografía
Teske A., Alm E., Regan J.M., Toze S., Rittman B.E. & Stahi D.A. (1994) Evolutionay
relationships among ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria. J. Bacteriol. 176(21):
6623 – 6630.
Udert, K., Fux, C., Munster, M., Larsen, T., Siegrist, H., & Gujer, W. (2003). Nitrification
and autotrophic denitrification of source-separated urine. Wat. Sci. Tech. 48(1): 119 –
130.
van de Graaf A. A., Mulder A., de Bruijin P., Jetten M. S. M., Robertson L. A. & Kuenen J.
G. (1995) Anaerobic oxidation of ammonium is a biologically mediated process. Appl.
Environ. Microbiol. 61(4): 1246 – 1251.
van de Graaf, A. A., de Bruijn P., Robertson L. A., Jetten M. S. M. & Kuenen J. G. (1996).
Autotrophic growth of anaerobic ammonium-oxidizing micro-organisms in a fluidized
bed reactor. Microbiology 142: 2187 – 2196.
van Dongen U., Jetten M. S. M. & van Loosdrecht M. C. M. (2001) The SHARON-
Anammox process for treatment of ammonium rich wastewater. Wat. Sci. Tech. 44(1):
153 – 160.
van Hulle, S. (2005) Modelling, simulation and optimization of autotrophic nitrogen removal
process. Tesis Doctoral, Universidad de Ghent, Facultad de Ciencias Biológicas
Aplicadas. p 10.
van Hulle S. W. H., van den Broeck S., Maertens J., Villez K., Donckels B. M. R.,
Schelstraete G., Volcke E. I. P. & Vanrolleghem P. A. (2005b) Construction, start-up
and operation of a continuosly aereated laboratory-scale SHARON reactor in view of
coupling with an Anammox reactor. Water SA 31(3): 327 – 334.
van Kempen R., Mulder J.W., Uijterlinde C.A. & Loosdrecht M.C.M. (2001) Overview: full
scale experience of SHARON process for treatment of rejection water of digested
sludge dewatering. Wat. Sci. Tech. 44(1): 145 – 152.
63
Bibliografía
Wallace W., Knowles S.E. & Nicholas D.J.D. (1970) Intermediary metabolism of carbon
compounds by nitrifying bacteria. Arch. Mikrobiol. 70: 26 – 42.
Whittaker M., Bergmann D., Arciero D. & Hooper A.B. (2000) Electron transfer during the
oxidation of ammonia by the chemolithotrophic bacterium Nitrosomonas europaea.
Biochim. Biophys. Acta 1459: 346 – 355.
Yang, L. & Alleman, J.E. (1992). Investigation of batchwise nitrite build-up by an enriched
nitrification culture. Wat. Sci. Technol. 26(5-6): 997-1005.
Yang S-F., Tay J-H, Liu Y. (2004) Inhibition of free ammonia to the formation of aerobic
granules. Biochem. Eng. J. 17: 41 – 48.
Yun, Z., Jung, Y-H., Lim, B-R., Choi, E., Min, K. S. (2004) The stability of nitrite nitrification
with strong nitrogenous wastewater: effects of organic concentration and microbial
diversity. Wat. Sci. Technol. 49(5): 89 – 96.
Zart D., Schmidt I. & Bock E. (2000) Significance of gaseous NO for ammonium oxidation
by Nitrosoomonas eutropha. Antonie Leeuwenhoek 77: 49 – 55.
Zhu S. & Chen S. (2001) Effects of organic carbon on nitrification rate in fixed film
biofilters. Aqu.Eng. 25: 1 – 11.
64
ANEXO
Anexo
VI. ANEXO
VI.1. ANEXO 1. Curvas de referencia
VI.1.1. NO2- y NO3
-
VI.1.1.1. Electroforesis capilar
Compuesto a b R
NO2- 3350.2 224.4 0.980
NO3- 2491.8 252.4 0.982
66
Anexo
VI.1.1.2. HPLC
Comp. a b R NO2
- -397239.3 105805.9 0.997NO3
- 409117 46460.1 0.994
67
Anexo
VI.1.2. NH4+
Comp. a b R NH4
+ -101.45 -57.84 0.999
VI.1.3. Acetato
Comp. a b R C2H3O2
- 35118.5 24389.85 0.997
68
Anexo
VI.1.4. N2
Comp. a b R N2 511.21 7980.64 0.998
VI.2. ANEXO 2. Pruebas en reactores intermitentes
VI.2.1. Cinética nitrificante. Etapa I
69
Anexo
VI.2.2. Cinética nitrificante. Etapa II
VI.2.3. Cinética nitr
ificante. Etapa III
70
Anexo
VI.2.4. Cinética desnitrificante
71