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Desenvolvimento de Métodos Bionalíticos Aplicação em HPLC
Farmacologia Clínica
Universidade Mogi das Cruzes
Março 2004
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Princípios Gerais
Em uma análise quantitativa de fármacos em matriz
biológica deve-se tomar cuidado em todas as etapas, para
evitar erros. A amostra a ser analisada deve ser
representativa do total; não deve haver perdas e nem
contaminações durante seu preparo.
A etapa de separação dos componentes da amostra
no cromatógrafo também pose ser fonte de erros como:
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• Adsorção irreversível de parte da amostra na fase
estacionária
• Resposta do detector afetada por alterações de
temperatura e vazão
• Quantidade de amostra injetada for da faixa linear
do detector e etc.
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Após a obtenção do cromatograma, faz a in-
tegração dos sinais, que tem por finalidade trans-
formar a intensidade do sinal emitido pelo detector
em uma medida relacionada com a quantidade da
substância analisada na amostra.
A integração dos sinais pode ser feita usando
os seguintes métodos:
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• Altura do pico: Este método não é muito usado
porque sofre influência de variações
instrumentais. Trata-se de uma perpendicular à
linha de base passando pela inflexão máxima do
pico; a medida desde a linha de base até este
ponto de inflexão máxima deste pico;
corresponde a altura do pico.
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• Área do pico: Pode-se calcular a área do pico
traçando -se tangentes nos dois lados do pico; a
intersecção destas duas tangentes com a linha
de base fornece um triângulo cuja área pode ser
calculada pela fórmula:
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A = a x w 2
Onde: A = área do pico
a = altura do pico
w = largura do pico na linha de base
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A área também pode ser calculada
utilizando-se a largura na meia meia altura, isto é,
formando um triângulo na metade superior do
pico. Neste caso, a area é calculada:
A = a x wH
onde: W H = largura do pico na meia altura
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1 2 3
aa
w
a2
WH
Métodos para a integração dos sinais fornecidos pelo registrador:
1. altura pelo pico
2. área do pico
3. área na meia altura
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Com base nas medidas obtidas na
integração,
estas poderão ser relacionadas com a
concentração de uma dada substância na amostra,
através dos seguintes métodos:
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• Normalização: Este método requer que todas as
substâncias presentes na amostra sejam eluídas,
e que a resposta do detector seja idêntica para
todas. Consiste em comparar a área obtida no
cromatograma com a porcentagem da
composição da mistura.
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% A = área A x 100
área total
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• Fator de resposta: Se o detector não responde de
maneira similar para todas as substâncias
presentes na amostra, é necessário corrigir esta
equação usando o chamado fator de resposta que é
determinado como a porcentagem conhecida e
observada para cada composto. Assim por
exemplo:
fA = % A conhecida
% A observada
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Para calcular a porcentagem da substância
presente na amostra, basta multiplicar a área
obtida pelo fator de resposta e dividir pela
somatória de todas as áreas multiplicadas pelos
respectivos fatores de resposta.
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• Calibração externa: Este método compara a área da
substância a ser quantificada na amostra com as
áreas obtidas desta mesma substância em
soluções padrão de concentrações conhecidas.
Dessa forma obtém-se um gráfico, relacionando as
áreas obtidas com as concentrações estabelecidas.
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Utilizando este gráfico, pode-se calcular a
concentração desta substância com a amostra.
Este método é sensível a erros de injeção das
soluções padrão e das amostras, bem como a
erros relacionados com a preparação dos padrões.
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Calibration curve
0 250 500 750 1000 1250
0
500
1000
1500
Slope
Y-intercept
X-intercept
1/slope
95% Conf idence Intervals
Slope
Goodness of Fit
r²
0.9644 ± 0.03746
-5.000
5.185
1.037
0.8727 to 1.056
0.9910
C (ng/mL)
Áre
a
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• Padronização interna: Consiste em adicionar uma
quantidade conhecida de uma sunstância padrão na
amostra a ser analisada, e relacionar ad duas áreas
resultantes. Normalmente, uma substância
empregada como padrão interno deve possuir
características:
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– mesma similaridade à substância em análise
– ter concentração e tempo de retenção a
substância em exame
– inerte
– não fazer parte da amostra analítica
– ter um perfil cromatográfico característico e
diferente das demais substâncias presentes na
amostra
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Após a análise dessas substâncias constrói-se um
gráfico, relacionando a razão de áreas (Ax/Api) com a
concentração desta substância. Através da razão de
áreas obtidas no cromatograma tem-se a concentração
da substância na amostra, utilizando o gráfico da
calibração externa.
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Este método é menos sensível a erros de
injeção, variações instrumentais, etc. É o melhor
método para análise quantitativa.
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Calibration curve
0 250 500 750 1000 1250
0
500
1000
1500
Slope
Y-intercept
X-intercept
1/slope
95% Confidence Intervals
Slope
Goodness of Fit
r²
0.9644 ± 0.03746
-5.000
5.185
1.037
0.8727 to 1.056
0.9910
C (ng/mL)
Ra
tio
(A
x /
AP
I)
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General Procedure of Liquid/Liquid
Extraction
Applied Bioequivalence Studies
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Step 1 Step 2 Step 3
SampleSample
+Internal standard
Vortexmixing
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Step 4 Step 5 Step 6
Adittion OrganicSolvent
sample extractionvortex mixing
Centrifugation
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Separation phases Collection organic phase
Driedorganic phase
N2
Step 7 Step 8 Step 9
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Reconstitutedsample
Brief mixing
Injection sample
Step 10 Step 11 Step 12
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Phase Solid Extraction
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Quantitative Determination of Drugs in Serum by HPLC
Applied Bioequivalence Studies
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Determination of diclofenac in Human Plasma by HPLC
Method:
• System Chromatography: consisted of a LKB-Bromma 2150
HPLC, pump coupled to a VWM 2141 dual wavelenght UV
detector (Pharmacia-LKB,Uppsala, Sweden). The output sinal
was registered in a Nryans 28000 chart recorder ( Bryan
Souththern Instruments, Kent, Great Britain)
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• Mobile Phase: acetonitrile;water (40:60, v/v) and 0.1 mol/L
acetic acid solution; the pH was ajusted to 5.6 with 3 mol?L
sodium hidroxide.
• Flow rate: 2.3 mL/min
• Column Chromatography: Spherisorb ODS-25mm, 4.6 mm x
250mm Sigma Aldrich (ST. Louis,MO,USA
• Detection: 276nm (U.V absorbance)
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500 µL calibretion point or serum sample + 580 ng Indometacina (I.S) + 200 µL of 5% phosphoric acid
4 mL Dicloromethane
Phase organic washed with 200 µL amonium acetate 1:20 in water
Brief vortex mixing
Extraction Procedure
Vortex mixing 1 min
Centrifuged 2000 rpm 10 min
Centrifuged 2000 rpm 2 min
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Organic Phase 45 ºC under nitrogen stream
The residue
100 µL of acetonitrile
Analytical Sample
20 µL
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Determination of Terbinafine in Human Plasma by LC/MS-MS
Method:
• System Chromatography: consisted of a Hewlett Packard
HPLC, binary pump, autosampler injector, degasser,
thermostat column, variable-wavelenght UV, coupled a The
Quatro II (Micromass, Altringham, Cheshire UK equipped with a
electrospray source.
• Mobile Phase: Acetonitrile:water (80:20) containing 10 mmol/L
formic acid
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• Flow rate: 0.50 mL/min
• Column Chromatography: Genius C18 4um analytical
column (150 mm x 4.6 mm i.d) 40°C
• Detection: The Quatro II equipped with a electrospray
source using a crossflow counter electrode in mode (ES+)
and mutiple reaction mode (MRM), monitoring 292.2>140.7
and. 288.2>116.9 for terbinafine and naftifine, repectively.
The cone voltage and collission energy were 35V and 15 eV
for terbinafine and 12 eV for naftifine.
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200 µL calibretion point or serum sample + 20 µL Naftifine ( 1 µg/mL methanol: water 50:50)
4 mLDiethyl Ether:Hexane (80:20)
Organic Phase 37 ºC under nitrogen stream
Brief vortex mixing
Extraction Procedure
Vortex mixing 1 min
Centrifuged 2000 rpm 10 min
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The residue200 µL of acetonitrile: water (80:20)
containing 10 mmol/L formic acid
Analytical Sample
50 µL
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Determination of Fluconazole in Human Plasma by LC/MS-MS
Method:
• System Chromatography: consisted of a Hewlett Packard
HPLC, binary pump, autosampler injector, degasser,
thermostat column, variable-wavelenght UV, coupled a The
Quatro II (Micromass, Altringham, Cheshire UK equipped
with a electrospray source.
• Mobile Phase: Acetonitrile:water (40:60) containing 5 mM
acetic acid pH= 3.7
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• Flow rate: 0.9 mL/min isocratic gradient
• Column Chromatography: Genesis C18 4um analytical
column (10 mm x 4.0 mm i.d) 40°C
• Detection: The Quatro II equipped with a electrospray
source using a crossflow counter electrode in mode (ES+)
and mutiple reaction mode (MRM), monitoring 171.8>127.7
and 306.9>219.8 for metronidazole and fluconazole,
repectively. The cone voltage and collission energy were
30V and 20eV, respectively.
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200 µL calibretion point or serum sample + 200 µL of carbonate-bicarbonate buffer containing metronidazole (I.S) 1 µg/mL
3 mL Diethyl ether/dicloromethane (70:30)
Organic Phase 37 ºC under nitrogen stream
Brief vortex mixing
Extraction Procedure
Vortex mixing 5 min
Centrifuged 2000 rpm 10 min
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The residue
Acetonitrile:water (40:60) containing 5 mM acetic acid
Analytical Sample
10 µL
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Propanolol in Serum
HPLC Method
• Column: Symmetric Shield ® RP8 3.9 x 150 mm, 5 µm
• Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm
• Mobile Phase: 20mM phosphate potassium, pH 7/methanol
39:62
• Flow rate: 1 mL/min
• Injection volume: 20 µL porcine serum
• Temperature: 30 Cº
• Detection: 254 nm (U.V)
• Components: Propanolol and Butyl Paraben (I.S)
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Oasis® HLB Extraction MethodOasis® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge
Condition1mL methanol/1ml water
Load1mL spicked porcine serum
Wash1mL 5% Methanol in water
Eluent1mL Methanol + 5µg butyl
paraben
Evaporate and Constitute40 ºC under nitrogen stream
200µL Methanol
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Tetracyclines in Serum
HPLC Method
• Sample: 1 mL spicked porcine serum / 2% phosphoric acid
solution / demecycline as I.S
• Column: Symmetric Shield ® RP8 3.9 x 150 mm, 5 µm
• Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm
• Mobile Phase: 0.1 % TFA in water Acetonitrile:methanol (91:7:2)
• Flow rate: 0.9mL/min
• Injection volume: 20 µL porcine serum
• Temperature: 30 Cº
• Detection: 279 nm (U.V)
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Oasis® HLB Extraction MethodOasis® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge
Prepare SampleMix 20µL (H2 PO4) to 1mL serum
Condition1mL methanol
Rinse 1mL water
Load1mL sample
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Elute1mL Methanol
Evaporate to 0.2 mL
Reconstitute with mobile phase
Wash1mL 5% Methanol in water
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Sulfa Drugs in Serum
HPLC Method
• Column: Symmetric Shield ® RP8 3.9 x 150 mm, 5 µm
• Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm
• Mobile Phase: 1% glacial acetic acid and 4% methanol in water
• Flow rate: 1 mL/min
• Injection volume: 10 µL porcine serum
• Temperature: 25Cº
• Detection: 254 nm (U.V)
• Components: Sulfadiazine, Sulfathiazole (I.S) and Sulfamerazine
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Condition1mL methanol/1ml water
Load1mL spicked porcine serum with 10µg/mL sulfathiazole
(I.S), 20 µL phosphoric acid
Wash1mL 5% Methanol in water
Oasis® HLB Extraction MethodOasis® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge
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Eluent1mL Methanol
Evaporate and Constitute40 ºC under nitrogen stream
1mL mobile phase
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![Page 78: Desenvolvimento de Métodos Bionalíticos Aplicação em HPLC Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Março 2004](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022051615/552fc102497959413d8be215/html5/thumbnails/78.jpg)
![Page 79: Desenvolvimento de Métodos Bionalíticos Aplicação em HPLC Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Março 2004](https://reader033.vdocuments.net/reader033/viewer/2022051615/552fc102497959413d8be215/html5/thumbnails/79.jpg)
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