Det nya blodgruppsystemet FORS

Annika Hult1,2

BMA, PhD

Equalis användarmöte, Transfusionsmedicin 131023

Lola Svensson3, Robert Stamps4, Jill R

Storry1,2, René Jørgensen5, Lennart Rydberg3,

Stephen M Henry6 och Martin L Olsson1,2

1. Dept. of Laboratory Medicine, Lund University, Lund, Sweden.

2. Dept. of Clinical Immunology and Transfusion Medicine, University and Regional Laboratories of

Region Skåne, Lund, Sweden.

3. Dept. of Clinical Chemistry and Transfusion Medicine, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden.

4. Red Cell Immunohaematology Laboratory, NHS Blood and Transplant, Sheffield, United Kingdom.

5. Carlsberg Laboratories, Copenhagen, Denmark.

6. Auckland University of Technology, Auckland, New Zealand.

Transfusionsmedicin, den moderna erans början

Landsteiner K. Zur Kenntnis der antifermentativen, lytischen und

agglutinierenden Wirkungen des Blutserums und der Lymphe. Zbl Bakt.

1900;27:357-362.

Landsteiner K. über Agglutinationserscheinungen normalen Menschlichen

Blutes. Wiener Klinische Wochenschrift. 1901;14:1132-1134.

Upptäckten av ABO-blodgruppsystemet

Blandade blod från kollegor i labbet och

såg ett mönster

A, B, O (och senare även AB)

Fick Nobelpriset 1930 för denna upptäckt

Karl Landsteiner (1868-1943)

Vad är ett kriterierna för ett blodgruppssystem?

Antigenet ska finnas på erytrocyter

Någon ska ha gjort en antikropp mot antigenet (human alloantikropp)

Ärftlighet ska vara visad

Genetiska bakgrunden ska vara definierad ”controlled at a single gene locus, or by two or more very

closely linked homologous genes”

Godkänns av ISBT (International Society of Blood Transfusion)

http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cell-immunogenetics-and-blood-group-terminology/blood-

group-terminology/

Hur många blodgrupper finns det?

Idag finns 33 blodgruppssystem, t.ex. ABO, Rh, Kell, Duffy

(vilket totalt inkluderar 297 antigen)

Dessutom finns 42 antigen som inte uppfyller kriterierna för

blodgruppssystem och därför hamnar i….

Blood group collection

700 serien (lågfrekvensantigen, <1%)

901 serien (högfrekvensantigen, >90%)

http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cell-

immunogenetics-and-blood-group-terminology/blood-

group-terminology/

ABO

P1Pk

Lewis

GLOB

FORS

H

I

Host defence/

innate immunity

Glycoproteins of

structural or

unknown function

Complement

regulation

Adhesion molecules

Transporters

and channels

Enzymes

LW

Xg

Duffy

Lutheran

Indian

Scianna

Raph

JMH

Oka

Blodgrupper

Figur lånad av Jill Storry

Genen Genetisk nivå

Glycosyltransferas (GT) Enzymnivå

Kolhydratantigen Glykokonjugatnivå

Antikroppar Immunologisk nivå

Kolhydratantigen, fyra nivåer

Antikropparna är inblandade i

Hemolytiska transfusionsreaktioner

Hemolytisk sjukdom hos nyfödda

Upprepade missfall

Antigenen kan vara Receptorer för olika patogener

Förändrat uttryck vid malignitet

Förändrat uttryck under graviditet

Varför är kolhydratblodgrupper viktiga?

Blodgrupp/

antigen Microorganism Sjukdom

ABO, MNS Plasmodium falciparum Malaria

P1, Pk Escherichia coli UTI

P Escherichia coli UTI

Leb Helicobacter pylori Gastritis

H, Leb Burkholderia ambifaria Lung infection

ABO, LE Vibrio cholerae Cholera

P Parvovirus B19 Fifth disease

Pk HIV AIDS

H/Leb Norovirus Gastroenteritis

ABO LE H Rotavirus Infantile

gastroenteritis

Serologin – en paradox

Pab (anti-A, anti-A,B) pos/neg

Mab (anti-A)

neg

Helix Pomatia pos

Anti-A detekterbart i plasma

Applied Blood Group Serology

P. Issit & D. Anstee

Vår hypotes var att detta skulle kunna vara en

A-lik men unik glykolipid-struktur.

Apae#1

Apae#2

Borde inte

A-subgrupper vara

heterozygota för en

A-allel….?

Första ABO-subgruppen

utan ett funktionellt ABO

transferas?! Njaaee…

O1O1

O1O1v

ABO-genotypning av Apae-individer

Avsaknad av A-specifika band när man testar med anti-A

Band motsvarande Forssman (Fs) glycolipiden när man testar med Helix pomatia

Fs-glycolipiden verifierad med Mab anti-Fs

Strukturanalys av glycolipider med MS/MS och NMR identifierar Forssmanstrukturen som Apae-antigenet

Tunnskiktskromatografi

H Prekursor

Donator

socker

Antigen

På

erytrocyter

P

α3GalNAc α3GalNAc

A Fs

Däggdjur (ej primater)

A glykosyl-

transferas Forssman-

syntas

Människa/

Apor

GalNAcα3GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ1Cer GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer

Vad är Forssman i jämförelse med ABO?

Forssman ABO

a b MAb Anti-Fs X-test

Grupp B plasma

Apae #1 Apae #2

O Får

Hund

A1

Apae #1

Apae #2

O

Fs-antigen finns på Apae-erytrocyter Anti-Fs i plasma från icke-Apae-givare

Korstest med eluat från Apae#2

O A2 A1 Apae#1 Hund Får

Flödescytometrisk karaktärisering av

erytrocyter från Apae-individer

Turcot-Dubois A-L et al. Glycobiology, 2007;17(5):516-28.

ABO Homo sapiens

GBGT1

Homo

sapiens

GBGT1

Canine

ABO-kluster FS-kluster

Fylogenetiskt dendrogram av ABO (GT6) gen-superfamiljen

Human

konsensus 887G*

Human Apae#1

887G>A

(Arg296Gln)

Gorilla

konsensus 887G**

Apae#1 pos neg H2O M

PCR-ASP 887G>A

Arginin = human +

primat

konsensus

Glutamin = hund

konsensus

GBGT1, en förmodad pseudogen, ändras till

hundvarianten i Apae-individer!

* >250 givare med normal ABO-grupp **fem andra primater var också negativa *** hittad i 7 av 104 givare

Apae#1-

familjen Apae#1

O1O1

GBGT1

887G/A

A

A

A1O1

GBGT1

887G/G

Apae

O1O1

GBGT1

887G/A

O

O

O1O1

GBGT1

887G/G

nt

A

A1O1

GBGT1

887G/G

nt

A A

A1O1

GBGT1

887G/G

I

II

III A

A1O1

GBGT1

887G/G

Apae#2-

familjen Apae#2

O1O1v

GBGT1

887G/A

Apae

O1O1v

GBGT1

887G/A

O

†

O

O1O2

GBGT1

887G/G

O

O1O1v

GBGT1

887G/G

O

O1vO1v

GBGT1

887G/G

I

II

Apae

III

nt O

O1O1v

GBGT1

887G/G

?

O1O1

GBGT1

887G/A

887G>A

detekterades i

olika alleler hos

dessa två familjer!

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

BM n=1 Blood n=4

%

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Blood n=4 Apae#1 Apae#2

%

GBGT1-mRNA från perifert blod i vanliga vs. Apae-fenotyper

GBGT1-mRNA från benmärg vs. perifert blod

% o

f h

igh

est e

xp

ressio

n

% o

f h

igh

est e

xp

ressio

n

GBGT1-mRNA uttrycks i blod och benmärg

ABO

hFS

Acceptor

ABO:

His301

Donator

socker

3D-modell av Forssman-syntaset baserat på

kristallstrukturen av ABO-transferaset

O A2 A1 O

3 2 1

– – –

+ + +

+ + +

– – – –

+ + + +

– – – –

Parent

Strain, K12

(HB101)

P-fimbriated

strain, papG

(HB101.AD110)

Fs-binding

strain, prsG

(HB101.JFK102)

Sheep Apae#2 Apae#1

Neg kont.

Pos kont.

Negativ Positiv

Fs-positiv

Fs-bindande E.Coli agglutinerar får- och Apae-erytrocyter

Vidare studier….

Expressionsstudier

- Kan (887G>A) Arg296Gln aminosyraskiftet

göra enzymet aktivt?

Hemolysintest

- Är anti-Fs en kliniskt signifikant antikropp?

VEKTOR VEKTOR MED INSERT

+

Transfektion av MEG-01

GBGT1 vildtyp 887G

GBGT1 mutant 887A

B3GALNT1 P-transferas

DNA Mutation introducerad via mutagenes

+

ELEKTROPORERING

Transfektion av MEG-01

P Fs

P Fs

Odlar cellerna i

ytterligare 48h

Glc Gal GalNAc

P

Fs

P-antigenet

Nomenklatur enligt Consortium for Functional Glycomics

P

Fs

P-antigenet

Fs-antigenet

GBGT1 887G

vildtyp GBGT1 887A

mutant

Transfektion av MEG-01

Pk-antigenet Pk-antigenet β3

β3 α3

***

Resultat av transfektion av MEG-01

- Tre experiment

- Trippelprover i varje experiment

887A 887G inget

Forssman-negativitet i människa

Hemolysintest

Metod modifierad från Mollison (Blood Transfusion in Clinical Medicine, 10th edition 1997)

- Färskt serum från blodgrupp O och B givare med starkt anti-Fs

- Apae erytrocyter

- ABO-kompatibla och icke-kompatibla erytrocyter

- Både nativa och papainiserade erytrocyter användes

- Hemoglobin-nivåer lästa på HemoCue Low

Anti-Forssman, en naturligt förekommande antikropp

Hemolysin test; group B serum

Apae#1 Apae#2 O O A1 B

0

2

4

6

8

10

12

Apae

#1

Apae

#2

O O A1 B

Hem

oglo

bin

g/l

Apae#1 Apae#2 O O A1 B

Hemolysin test; group O serum

0

2

4

6

8

10

12

Apae

#1

Apae

#2

O O A1 B

Hem

oglo

bin

g/l

Apae#1 Apae#2 O O A1 B

Apae#1 Apae#2 O O A1 B

Hemolysintest - Resultat

Konklusion

Hemolysintest

- Indikerar att anti-Fs kan binda komplement

- Vilket potentiellt kan orsaka intravaskulär hemolys av

Fs-positiva erytrocyter

Bör dessa individer vara blodgivare?

BAS-test? MG-test?

Expressionsstudier

- Signifikant skillnad av Fs-antigenuttryck vid transfektion av

vildtyp och mutant

- Detta indikerar att bytet 887G>A (Arg296Gln) ger upphov

till aktivering av Forssman-syntaset

Lactosylceramide

Pk, Gb3 (CD77) Lactotriaosylceramide

P1

4-α-galactosyltransferase (A4GALT)

4-β-galactosyltransferase 3-β-N-acetylgalactosaminyltransferase

(B3GALNT1)

3-β-galactosyl- transferase

(B3GALT5)

3-α-galactosyl- transferase

(ABO)

3-α-N-acetylgalactos-aminyltransferase

(ABO)

3-β-N-acetylglucosaminyltransferase

Paragloboside, nLc4

Gb5 (SSEA-3)

2-α-fucosyl- transferase

(FUT1)

A B

H

Globo-H

A type 3

4-α-galactosyl-transferase (A4GALT)

3-α-N-acetylgalactosaminyltransferase (ABO)

LKE (SSEA-4)

3-α-galactosyl- transferase

(ABO)

3-α-N-acetylgalactos-aminyltransferase

(ABO)

Globo-A Globo-B

2-α-fucosyltransferase (FUT1)

α-sialyltransferase (?)

NOR 1

4-α-galactosyl- transferase

(A4GALT)

PX2

3-β-N-acetylgalactos-aminyltransferase

(?)

2-α-fucosyltransferase (FUT1)

P, Gb4 (globoside)

Forssman 3-α-N-acetylgalactos-

aminyltransferase (GBGT1)

…till ära av John Forssman (1868-1947), som 1911 beskrev antigenet

Professor i Mikrobiologi, Patologi och Allmän Medicin Lunds Universitet, Lund

Vi föreslog att Forssman-antigenet blir godkänt av ISBT som ett nytt histo-blodgruppssystem, FORS (031)….

Vid 32nd International Congress of the ISBT, Cancun, Mexico

godkändes Forssman som ett eget blodgruppsystem

Nummer 031

Systemnamn FORS

Systemsymbol FORS

Antigen FORS1

Gen GBGT1

Blodgruppsystem 031

“ABO-subgruppen” Apae visades vara ABO-oberoende

Forssman-antigen påvisades för första gången i normal hematopoetisk vävnad

Strukturen av Forssman-antigenet konfirmerades med MS/MS och NMR

I GBGT1-genen hos alla Apae-individer påvisades en djur-associerad mutation som

ej fanns hos icke-Apae familjemedlemmar, normala givare och sex andra primater.

Signifikant skillnad av Fs-antigenuttryck vid transfektion av vildtyp och mutant

Den kliniska signifikansen av anti-Fs är ej känd men Apae-givare kan bli

korstestpositiva med patientplasma

Hemolysintest indikerar att anti-Fs kan binda komplement vilket potentiellt kan

orsaka intravaskulär hemolys av Fs-positiva erytrocyter

Konklusion

FORS

Transfusion cover, 2010

Fs, 1911

JR

LAN

VEL

Blodgruppsystem 031

Tack till:

Göteborgs Universitet, Göteborg

Lola Svensson

Lennart Rydberg

Susann Teneberg

Jonas Ångström

Bo Samuelsson

Michael Breimer

Gunnar Hansson

Göran Larsson

Jonas Nilsson

Auckland University of Technology,

Auckland, New Zealand

Steve Henry

Lunds Universitet, Lund

Martin L Olsson

Jill R Storry

Britt Thuresson

Maj-Lis Svensson

Catharina Svanborg

NHSBT, Sheffield, UK

Robert Stamps

Carlsberg Research Laboratory,

Copenhagen, Denmark

René Jørgensen

Och naturligtvis Apae-familjerna!