detecção de vírus
TRANSCRIPT
Profa. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Instituto Biomédico
Universidade Federal Fluminense
VIROLOGIA GERAL
III Curso de Atualização
Microbiologia e Parasitologia no Contexto Atual
Introdução ao estudo dos Vírus
• 1884 Chamberland (filtração)
• 1892 Iwanowski
• 1898 Beijenrinck
“Vírus do mosaico do tabaco”
Filtrabilidade dos vírus: material filtrado
continha um veneno dissolvido de poder
extraordinário ou um agente descohecido tão
pequeno que era capaz de atravessar os poros
de um filtro que retinha bactérias
Vírus = Latim: Veneno
1 micron
Bactéria (Staphyllococcus aureus)
m ↓
cm 10-2m ↓
mm 10-3m ↓
µm 10-6m ↓
nm 10-9m ↓
Ǻ 10-10m
Características dos vírus:
• Pequenos (20 a 250 nm de diâmetro)
Microscópio eletrônico
Coloração negativa: AMOSTRA + corante de alta densidade eletrônica (ácido
fosfotungstico) grade de carbono microscópio o feixe de elétrons não
penetra no corante, mas sim no material orgânico, que aparece claro sobre um
fundo escuro.
Herpevírus
Microscopia eletrônica (ME)
uic.igc.gulbenkian.pt www.sciencedaily.com
Características dos vírus:
• Parasitas Intracelulares Obrigatórios
Métodos
de
estudo
dos
vírus
Cultura de células: 1949: Enders et al. propagação de poliovírus em cultura primária de célula humana
1933: isolamento de vírus Influenza suíno em ovo embrionado
www.molvis.org
alittleaboutvirology.blogspot.com
Características dos vírus:
• Constituição básica: proteína + ácido nucleico
enzimas
podem ter lipídeos
carboidratos
Características dos vírus:
• Possuem uma única espécie de ácido nucleico: DNA ou RNA
Vírus DNA:
DNA dupla fita linear
Adenovírus
Herpesvíus
Poxvírus
DNA simples fita linear
Parvovírus
DNA dupla fita circular
Papilomavírus
DNA simples fita circular
Circovírus
Características dos vírus:
• Possuem uma única espécie de ácido nucleico: DNA ou RNA
Vírus RNA:
RNA simples fita linear
polaridade (+) polaridade (-) polaridade (+)
Picornavírus Paramixovírus Retrovírus
Coronavírus Rabdovírus
Flavivírus
RNA simples fita segmentado RNA dupla fita segmentado
polaridade (-)
Ortomixovírus Rotavírus
TR
= transcriptase (RNA polimerase )
Icosaedro: 20 faces (cada face 1 triângulo equilátero)
12 vértices (cantos)
Simetria icosaédria (cúbica) Capsídeo:
www.web-books.com
hexons
pentons
cada face 3 unidades idênticas 60 sub-unidades capsômeros
Base do Penton
fibra
Adenovírus www.web-books.com
www.erain.com
Capsídeo: Simetria helicoidal
Capsídeo: Simetria complexa
Poxvírus
http://microbialuniverse.blogspot.com.br/2012/01/virology.html
Bacteriófagos
www.elu.sgul.ac.uk
www.poxvirus.org
www.mansfield.ohio-state.edu
NUCLEOCAPSÍDEO
(todos)
Genoma DNA ou RNA Informação genética
Infectividade
Capsídeo
Proteínas
Proteção do genoma
União a receptores celulares
Determinantes antigênicos
ENVELOPE
(alguns)
Lipídeos
Glicoproteínas virais
União a receptores celulares
Determinantes antigênicos
Estrutura de um virion (partícula viral completa):
Estrutura da partícula viral:
Vírus não envelopado: genoma + capsídeo
Vírus envelopado: genoma + capsídeo + envelope com glicoproteínas
Simetria do Capsídeo:
Icosaédrico (cúbico) Helicoidal (espiral)
nucleocapsídeo
Estabilidade da partícula viral:
• Temperatura
• pH
• Solventes de lipídeos e detergentes vírus envelopados
• Hipoclorito de sódio proteínas
• Formaldeído proteínas
• Luz UV genoma
1966 Comitê Internacional de Taxonomia Viral: Classificação dos vírus em famílias:
Família: - viridae
Sub – família: - virinae
Gênero: - vírus
Ác. Nucleico
Simetria do capsídeo
Envelope Tamanho Tipo Ac. Nucleico
Família Virus
DNA
Icosaédrica Ausente 50nm fita dupla circular
Papilomaviridae Papiloma
Presente 100nm fita dupla linear
Herpesviridae Herpes
RNA Icosaédrica Ausente 20nm fita simples linear (+)
Picornaviridae Poliomielite
80nm fita dupla segmentado
Reoviridae Rotavirus
Presente 40nm fita simples linear (+)
Flaviviridae Dengue Febre amarela
Presente
100nm fita simples (+) linear diplóide
Retroviridae HIV
Helicoidal Presente
100nm fita simples linear (+)
Coronaviridae Coronavírus
150nm
200nm
fita simples linear (-)
Rhabdoviridae
Paramyxoviridae
Raiva
Sarampo
100nm fia simples (-) segmentado
Orthomyxoviridae Influenza
Replicação Viral
http://encarta.msn.com/
1. Adsorção
2. Penetração
3. Desnudamento
4. Replicação
5. Maturação
6. Liberação
Fases da replicação viral:
União do vírus ao receptor celular
Receptores: proteínas, carboidratos ou lipídeos na
membrana celular
Suscetibilidade celular presença de receptor
1. Adsorção
Vírus não envelopado Vírus envelopado
Entrada do vírus na célula
• Translocação: passagem direta da partícula viral através
da membrana celular
• Endocitose mediada por receptor: vírus envelopados
vírus não envelopados
• Fusão: somente para vírus envelopados
2. Penetração
2. Penetração
Endocitose mediada por receptor: vírus envelopados
www.rsc.org
Membrana da célula forma uma vesícula ao redor do vírus
Vesícula funde com endosoma
vírus no endosoma
Fusão do envelope do vírus com membrana do endosoma
Após adsorção
Nucleocapsídeo viral no citoplasma
2. Penetração
Endocitose mediada por receptor: vírus não envelopados
microbiologybytes.wordpress.com
Após adsorção
Membrana da célula forma uma vesícula ao redor do vírus
Vesícula funde com endosoma
vírus no endosoma Desestruturação do capsídeo viral
Genoma viral no citoplasma
2. Penetração
Fusão do envelope do vírus com a membrana celular: somente
para vírus envelopados
pathmicro.med.sc.edu
Após adsorção
Fusão direta do envelope do vírus com a membrana celular
Nucleocapsídeo viral no citoplasma
3. Desnudamento ou Decapsidação
Refere-se a separação física das proteínas do capsídeo e genoma
viral. Após o desnudamento o genoma viral fica livre no citoplasma
ou núcleo da célula para o processo de replicação viral.
http://www-micro.msb.le.ac.uk/109/structure.html
4. Replicação
• Formação de novas cópias do genoma viral
• Síntese das proteínas virais: enzimas associadas ao genoma
proteínas de capsídeo
glicoproteínas de envelope
Adsorção
Penetração Decapsidação Replicação Síntese de prot Montagem
Liberação
Vírus RNA
Adsorção
Penetração Decapsidação Replicação Síntese de prot Montagem
Liberação
Vírus DNA
citoplasma
núcleo
citoplasma
núcleo
4. Replicação
Genoma viral
Transcrição dos genes precoces RNAm early
Proteínas fase precoce (early): proteínas não estruturais
- param a síntese de ácido nucleico e proteínas celulares
- regulam a expressão do genoma viral
- enzimas requeridas para a replicação do genoma viral
Replicação do genoma
Transcrição dos genes tardios RNAm late
Proteínas fase tardia (late) proteínas estruturais
4. Replicação: de acordo com o tipo de ácido nucléico os vírus utilizam
diferentes estratégias para assegurar a replicação do genoma e a síntese de
proteínas virais, confome o esquema abaixo:
varuncnmicro.blogspot.com -
transcrição
atua como fita RNA (-) com
transcriptase associada
A partir da fita RNA (-) com transcriptase
associada formação
do provirus intermediário replicativo
T = transcripase (RNA polimerase RNA dependente) TR = transcriptase reversa (sintetiza DNA a partir de genoma RNA – retrovírus)
5. Maturação ou Montagem
Proteínas estruturais se associam espontaneamente
capsômeros capsídeo viral onde o ácido nucleico é inserido
6. Liberação
Vírus não envelopados: Lise da célula
Vírus envelopados: Brotamento envelope da membrana celular
Exocitose envelope de membranas internas
6. Liberação de vírus não envelopados: Lise Celular
Flores, E.F. Virologia Veterinária, 2007
6. Liberação de vírus envelopados: Brotamento
Vírus adquire o
envelope da
membrana
celular com as
glicoproteínas
virais inseridas
Síntese das proteínas
não glicosiladas
ribosomas livres no
citoplasma
Síntese das glicoproteínas
ribosomas associados ao RER
Transporte das
glicoproteínas para a
membrana Golgi
Proteínas se associam ao genoma viral
glicoproteínas
na membrana
Genoma viral Nucleocapsídeo
RNAm
proteínas
Proteínas estruturais
Proteínas não estruturais (enzimas)
Duplicação do genoma
(1)
(2)
glicoproteínas
proteínas
Lise celular
Brotamento
1. Adsorção
2. Penetração
3.Decapsidação 4. Replicação
5. Maturação ou Montagem
6. Liberação
Ação dos antivirais
Vírus Influenza HIV
Patogenia das Viroses
Resposta do Hospedeiro às Infecções Virais
Patogenia das viroses
Penetração Disseminação Replicação Lesão Doença
Características do vírus: Virulência Dose
Características do hospedeiro: Genética
Idade
Estado nutricional
Estado hormonal
Estado imunológico
Patogenia: mecanismos pelos quais os vírus induzem doença no hospedeiro
Portas de entrada: Pele
www.prints-online.com
www.prints-online.com
mordedura de animal raiva
inoculação por seringas retrovírus
picada de artrópode dengue
Portas de entrada: Mucosas
Trato respiratório
www.nursingunlimited.com
Trato gastrointestinal
Adaptado de Monreno-Espinosa et al. Semin Pediatr Infect Dis 2004: 15(4): 37-245.
Portas de entrada: Mucosas
Trato genital
Transmissão vertical: in utero
Vírus pode causar:
Infecção localizada Infecção disseminada
Viremia Neuronal
• Limitada à proximidade do sítio de penetração e replicação primária
• Não faz viremia
Transporte no sangue: vírus livre ou associado à célula
cc
cc
Contágio Aquisição Local de
replicação primário
Local de replicação secundário
Tecido-alvo
Disseminação neuronal
VIREMIA primária
Sistema nervoso central
Replicação no SRE baço, fígado, medula óssea
VIREMIA secundária
Cérebro Pele Pulmões Órgãos Glândulas Etc.
contágio aquisição
Replicação no local primário
Respiratórios Entéricos Herpes Papiloma
Vetor artrópode Arbovírus
HIV
HBV
Reposta do Interferon Anticorpos hospedeiro Defesas locais resposta imune não imunes mediada por células
Período de incubação Sintomas específicos Período prodrômico
(sintomas inespecíficos)
Inespecíficos: barreiras físico-químicas
Interferons
Específicos: Resposta Imune
Mecanismos de resistência do hospedeiro:
Flores, E.F. Virologia Veterinária,
2007
Componentes:
Interferon tipo 1 (IFN-I)
Sistema complemento
Células:
- Células dendríticas (DCs)
- Macrófagos
- Células NK (natural killer)
Resposta imune Inata (natural ou inespecífica)
Mecanismo de ação dos Interferons e
Estado de resistência antiviral: inibição da síntese proteica degradação de mRNA
Sistema Complemento
C5b associado ao vírus pode iniciar uma
nova sequência de reações que resulta na
participação de outros componentes do
complemento e na formação do complexo
de ataque à membrana (MAC) MAC
cria poros no envelope lipídico lise do
vírus ou de células infectadas
- Reconhecem a baixa expressão de MHC I em
células infectadas
- atividade citotóxica: liberam grânulos que
contém perforinas e granzimas, que induzem a
apoptose da célula alvoc
Células Natural Killer (NK):
Mecanismos efetores da imunidade inata:
IFN-1
1) Célula infectada por vírus
2) produção de IFN-1
3) IFN-1 atua sobre as células vizinhas estado antiviral
4) IFN-1 estimula células NK
5) IFN-1 estimula células dendríticas
6) IFN-1 estimula Linf Tc
7) IFN-1 estimula atividade fagocítica dos macrófagos
8) Ativação do complemento
9) Complemento ativam Macrófagos
10) e 11) Complemento opsoniza vírus facilitando a fagocitose
12) Complemento Lise de Vírus envelopado
Células dendríticas (DC):
Dcs sao células mononucleares que
estão nos tecidos periféricos (pele,
TGI e Trato respiratorio) onde
capturam, fagocitam antigenos e
dirigem-se a órgãos linfoides
secundários onde apresentam para
linfócitos B e T.
Resposta imune Adaptativa
Componentes:
Células T:
Linfócitos T auxiliares Linfócitos T citotóxicos
(CD4+) Th1 / Th2 (CD8+)
Linfócitos B
plasmócito
Th
Th ativado
Linfócito T citotóxico
Linfócito B
lise de célula infectada
anticorpos
Th = linfócito T auxiliar
Resposta imune Adaptativa
IgG
Resposta Imune humoral no controle das infecções virais
Anticorpos neutralizantes
www.nature.com
Resposta Imune humoral no controle das infecções virais
(c) Lise do vírus pela
ativação do complemento
(c) Fagocitose:
pela ativação do
complemento (b)
(d)
Anticorpos importantes no controle da infecção viral: • IgM: marcador de infecção aguda
diagnóstico de infecção congênita
• IgG: imunidade à reinfecção
resposta vacinal
• IgA: imunidade de mucosa
(trato respiratório, trato gastrointestinal)
www.panbio.com.au
Tipos de Infecção
Tipo de infecção
Replicação do vírus
Transmissão Resposta Imune
Sintomas Manifestação da infecção
Exemplo
Aguda (clinicamente aparente)
sim sim
sim
sim
doença Influenza
(gripe)
Sub-clínica (inaparente)
sim sim sim não assintomática Febre aftosa
Latência
1ª infecção
Latência Latência
Recorrência Recorrência
Tipo de infecção
Replicação do vírus
Transmissão
Resposta Imune
Sintomas
Exemplo
Persistente
sim sim sim sim ou
não
resposta imune não elimina o
vírus do organismo
Retrovírus
Latente não não sim não resposta imune não impede
Herpesvírus
Recorrência sim sim sim sim a latência
Tipos de infecção persistente:
Infecção Latente
Replicação viral transmissão
www.respig.com
Infecção congênita: mãe soronegativa na época da infecção
Depende da época da gestação em que ocorre a infecção
Diagnóstico laboratorial das viroses
(
Confirmação do diagnóstico clínico infecções com sinais clínicos
confundíveis: gastrenterites;
Necessidade de confirmação de uma infecção devido às sérias
implicações que a mesma pode ter para o paciente: AIDS, hepatites,
rubéola gestacional;
Na seleção de doadores de sangue: hepatites B e C, AIDS.
Quando o tratamento é possível: infecções herpéticas, AIDS e
hepatite C;
Durante surtos epidêmicos adoção de medidas profiláticas
adequadas (vacinação, combate a vetores, etc.). Ex: febre amarela,
dengue, sarampo, raiva, entre outras;
Na avaliação da imunidade artificialmente induzida após
vacinação: pesquisa de anticorpos da classe IgG;
Na busca de um agente etiológico de uma dada doença, seja ela
nova ou não. Ex: Coronavírus da SARS, Influenza (gripe).
Por que e quando solicitar o exame laboratorial de uma virose?
Diagnóstico Laboratorial das Viroses
Métodos diretos:
Detecção do vírus na amostra clínica
Métodos indiretos:
Detecção de anticorpos no soro do paciente
Métodos clássicos (isolamento viral)
Métodos rápidos
O que coletar ?
Amostras clínicas do paciente: depende do tropismo do vírus
suspeito e da fase da doença
- Doença localizada no trato respiratório
- Doença localizada no trato genital
- Doença localizada no trato gastrointestinal
- Doença localizada na pele
Amostras ambientais
Alimentos
Detecção do vírus na amostra clínica
Infecção respiratória: aspirado de nasofaringe
Amostra clínica para detecção do vírus
http://ptxiv.blogspot.com/2009/10/should-
color-of-nasal-discharge-dictate.html
Infecção entérica: Fezes
Infecção no trato genital
- Suabes genitais
- Tecidos, placenta, fetos abortados
Herpes genital
www.colegiosaofrancisco.com.br www.stanford.edu
Amostra clínica para detecção do vírus
Herpes labial
http://www.dermatologia.net/novo/base/
doencas/herpeslabial.shtml
Infecção na pele:
- Suabe (Líquido das vesículas)
- Papilomas (verrugas)
www.dermatologia.net
Verruga vulgar
Amostra clínica para detecção do vírus
Infecção no SNC:
Raiva: morcego cérebro
Doença sistêmica: tecidos afetados
(depende dos sinais clínicos, fase da doença)
Morte do paciente: qualquer tecido
Coleta e envio do material para o laboratório
Todo material deve ser acompanhado de uma FICHA contendo:
• Identificação do paciente:
nome
idade
dados clínicos: dias de doença, sinais clínicos
histórico de vacinas (nome da vacina, data de vacinação)
• Data da coleta da amostra clínica
Matrizes ambientais: Água de consumo humano (Mineral),
Água de reuso (águas residuárias),
Água de recreação (lagoas, rios, piscinas, praias)
Água de lastro;
Águas subterrâneas;
Lodo e sedimentos;
Superfícies
Virologia Ambiental
Vírus em alimentos
Diagnóstico Laboratorial das Viroses
Métodos diretos:
Detecção do vírus:
Métodos clássicos: Isolamento do vírus
Métodos rápidos
INOCULAÇÃO EM OVOS EMBRIONADOS
Embrião em desenvolvimento: ideal para multiplicação de vírus
Requisitos
- Livres de contaminação
- Viabilidade
- Idade ideal
Utilizados para: Isolamento de vírus Diagnóstico
Produção de vacinas
Vantagem: Obtenção do agente viável (vírus infeccioso)
classes.midlandstech.edu
Membrana corioalantoide: Herpesvírus, Poxvírus
Cavidade alantoide: Influenza Vírus da Doença de Newcastle
Saco da gema
Cavidade amniótica
Vias de inoculação em ovos embrionados
Isolamento vírus aviários:
Influenza
Vírus da Doença de Newcastle
Propagação de vírus Influenza humano
Preparação de vacinas
Inoculação na cavidade alantoide
OVOS EMBRIONADOS
Reação de hemaglutinação (HA):
HA
Vírus Influenza
http://www.springerlink.com/content/4786735395530u38/fulltext.pdf
OVOS EMBRIONADOS
Inoculação na cavidade alantoide
Reação de inibição da hemaglutinação (HI): Identificação do vírus isolado
Inoculação na membrana corioalantoide
Isolamento e propagação de vírus
que produzem lesões – pocks - nesta
membrana (poxvírus e herpesvírus)
www.anicon.eu
Focos esbranquiçados pocks
OVOS EMBRIONADOS
Produção de vacinas
http://www.rnceus.com/flu/vaccine.html www.vaccinews.net
OVOS EMBRIONADOS
Cultura de células é o termo utilizado para se referir às células
quando estas estão sendo cultivadas in vitro .
As cultura de células podem ser utilizadas para :
isolamento e identificação do agente confirmação do
diagnóstico clínico
preparo de massa viral vacinas
Cultura de células (CC)
Vantagem: Obtenção do agente viável (vírus infeccioso)
CULTIVO CELULAR
Cultura de células primárias
- estabelecidas diretamente a partir do tecido fresco
- baixa resistência a repiques morrem após 2 ou 3 passagens
Estufa 37°C
MEM
+
Soro
Linhagem de células
Diploide
Contínua
Passagem das células
Linhagem diploide Linhagem contínua
Origem Células de cultura primária que resistiram ao repique
Tumores ou tecido normal (diplóide) transformado in vitro.
Cariótipo Diploide Aneuploide (n, 3n, 4n, etc)
Vantagens Isolamento e propagação de vírus
Preparo de vacinas
Propagam indefinidamente in vitro perderam a inibição de contato
Muito utilizadas no isolamento de vírus para diagnóstico, pois podem ser mantidas no laboratório através de repiques sucessivos
Desvantagens Resistem 50 passagens
Contaminação com vírus adventícios
Contaminação com vírus adventícios
Microscópio invertido
fibroblastos Células epitelióides
Processamento do material para inoculação em Cultura de células (CC)
Amostra clínica
tratamento com antibiótico
+ antimicótico
Maceração,
homogeneização,
centrifugação
inoculação em CC
Replicação viral em cultura de células
Monitoramento
Observação da CC ao microscópio observar efeito citopático(CPE)
Efeito citopático: alterações morfológicas que ocorrem na célula devido a replicação viral
picnose nuclear: células pequenas, arredondadas e soltas do tapete
Ex. picornavírus
formação de sincícios: células gigantes, multinucleadas
Ex. Vírus respiratório sincicial, herpesvírus
Formação de Corpúsculos de Inclusão: Corpúsculo de Negri (raiva)
Efeito citopático ???
Vírus Influenza em CC
Detecção e identificação de vírus em CC: técnicas imunológicas
Reação de Imunofluorescência (IF)
Métodos diretos de diagnóstico: Detecção do vírus
Amostra clínica
Métodos rápidos
Métodos clássicos
Inoculação
Ovos embrionados Cultura de células
Detecção de vírus
Microscopia eletrônica (ME) Reações Imunológicas:
Imunofluorescência (IF)
Ensaio Imunoenzimático (EIE)
Imunoperoxidase (IP)
Detecção do genoma viral:
Reação de hibridização
Reação em cadeia pela polimerase (PCR)
Métodos rápidos
Métodos rápidos: Observação da partícula viral
Microscopia eletrônica (ME)
Observa a morfologia do vírus
Alta concentração de vírus : 106 – 108 partículas virais/ml
Amostras para diagnóstico:
- cutâneas: líquido vesicular (herpesvírus)
verrugas (papilomavírus)
- material fecal (rotavírus )
Imunomicroscopia:
amostra clínica + soro imune coloração negativa
www.Virology.net/Big-Virology/BVRNAreo.html
Detecção de Ag virais no interior das células:
- aspirado de nasofaringe
- Corpúsculos de Negri Raiva
Marcador da reação Ag – Ac é um corante fluorescente
(isotiocianato de fluoresceína , rodamina).
Reação de Imunofluorescência (IF): detecção de vírus
Anticorpo marcado
Célula infectada por vírus respiratório
Teste positivo para vírus da raiva
Vantagens: alta sensibilidade, reagentes estáveis, manual ou
automatizada
Detecção de Ag virais: rotavírus, astrovírus
Princípio básico: imobilização de um dos reagentes em uma fase
sólida (p.ex. poliestireno), enquanto que o outro reagente é ligado
a uma enzima
Marcador da reação Ag-Ac é uma enzima (peroxidase, fosfatase
alcalina).
Leitura se baseia no desenvolvimento de cor: A degradação do
substrato cromogênico pela enzima dá origem a produtos solúveis
coloridos (leitura da D.O. em espectrofotômetro)
Pode testar um grande número de amostras
Ensaio Imunoenzimático (EIE)
Ac de
captura
Ag viral
Ac de
captura
Ac de
captura
Ac de
captura
Amostra clínica Amostra clínica
Ensaio Imunoenzimático (EIE): detecção de vírus
Anticorpo marcado com enzima conjugado Anticorpo marcado com enzima conjugado
Substrato Substrato
Desenvolvimento
de cor positivo
Ausência de cor
negativo
Ensaio Imunoenzimático (EIE): detecção de vírus
Leitor de microplaca: ELISA quantitativo
cut – off = Média das D.O. dos controles negativos X 2.1
Amostras com DO > cut-off positivas
Amostras com DO < cut-off negativas
Imunoperoxidase (IP): detecção de vírus
Detecção de Ag virais em tecidos ou células
Ac específico marcado com uma enzima (peroxidase)
desenvolvimento de cor
Preparações permanentes observa ao microscópio ótico.
Detecção de vírus
Detecção do genoma viral:
Métodos rápidos
Reação em cadeia pela polimerase (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Método para produzir cópias de um segmento de DNA específico
PCR amplifica uma
seqüência alvo
Reação da Polimerase em Cadeia: detecção de vírus
Polimerização é feita por uma DNA polimerase termoestável
(Taq polimerase)
São utilizados dois “primers” (iniciadores), que delimitam o
segmento amplificado
Triagem X Tipagem
Sensibilidade : 10 cópias de genoma
DNA polimerase
Reagentes da PCR
Primer Sense
Primer Antisense
DNA molde
Extração prévia do DNA
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus
Reação no Termociclador:
PCR: ciclos
1º ciclo 2º ciclo
3 passos na reação que são repetidos de 30 a 40 vezes CICLOS
1o passo desnaturação: 94oC por 30 seg
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus
Primer sense: se liga a fita antisense
Primer Antisense: se liga a fita sense
2o passo anelamento dos primers 55oC
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus
3o passo extensão a 72oC: temperatura ótima para Taq polimerase
Incorporação de 35 a 100 nucleotídeos por segundo
Como ambas as fitas são copiadas durante a PCR, há um aumento exponencial do
número de cópias do gene. Por exemplo: se há 1 cópia do gene antes da reação
iniciar, após o 1o cliclo serão 2 cópias, após 2 ciclos serão 4 cópias, 3 ciclos serão 8
cópias e assim por diante.
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus
http://palmer-dna-technology-wikis.wikispaces.com/Leah+Vander+Vorst
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus
? ?
? ?
?
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus
Eletroforese em gel de agarose: visualização do produto da PCR
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus
Visualização das bandas no gel Coloração com brometo de etídio O brometo de etídio é um intercalante de DNA
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus
Marcador de PM
Produtos da reação
PCR precedida pela transcrição reversa (RT-PCR)
Para vírus de genoma RNA:
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus
Realização da reação de
transcrição reversa:
Transcriptase Reversa
http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_07.htm
PCR em tempo real (PCR quantitativo - qPCR)
Detecção viral Diagnóstico
Quantificação viral
Monitoramento da resposta anti-viral Prognóstico
Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus
Permite o sequenciamento genético
da amostra amplificada
Necessita de técnicas de revelação:
eletroforese
Detecção e quantificação (no. de
cópias) da amostra
PCR convencional PCR em tempo real
sim não
sim não
não sim
Comparação
PCR em tempo real (qPCR) – TaqMan
www.iba-lifesciences.com
Sonda complementar ao segmento do produto da PCR, localizada entre os iniciadores da reação
Avalia o momento de aparecimento do sinal, e não quanto sinal é gerado após um dado número de ciclos.
A fluorescência é proporcional à quantidade do produto da PCR
PCR em tempo real (qPCR) – TaqMan
SEQÜENCIAMENTO DE DNA
Definição: processo que determina a ordem dos nucleotídeos (A, C, T e G) na seqüência do DNA utilizado como molde.
Molécula de DNA
Informação Seqüência
nucleotídica
blog.cca.ufscar.br
As sequencias são comparadas entre si e com protótipos de
acordo com as modificações entre os nucleotídeos
(substituições, deleções e inserções)
Análise filogenética
GenBank www.ncbi.nlm.nih.gov BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) www.blast.ncbi.nlm.nih.gov Análise dos dados e Construção da árvore Programa MEGA 5.1
Métodos diretos de diagnóstico: Detecção do vírus
Amostra clínica
Métodos rápidos
Métodos clássicos
Partícula viral:
Microscopia eletrônica (ME)
Antígeno viral:
- Ensaio Imunoenzimático (EIE)
-Imunofluorescência (IFA)
- Imunoperoxidase (IPX)
Genoma viral:
- PCR convencional
- PCR em tempo real (qPCR)
Detecção do (a)
Inoculação
Ovos embrionados Cultura de células
Métodos indiretos
Detecção de Anticorpos no soro do paciente
Utilização freqüente porque muitas vezes o isolamento viral é
difícil
Confirmar laboratorialmente uma enfermidade causada por vírus
Estudar epidemiologicamente o comportamento de uma virose na
comunidade
Determinação de imunidade (p.ex. resposta vacinal)
Identificar o vírus isolado em cultura
Sorologia:
Diagnóstico de infecção recente:
Detecção de IgM específica
Conversão sorológica: soro de fase aguda
soro de fase convalescente
Observar um aumento, de pelo menos 4 vezes, no título de
anticorpos do soro de fase convalescente em relação ao soro de
fase aguda
Métodos indiretos: Detecção de Ac no soro
Coleta de sangue soro
Detecção de anticorpos no soro do paciente
http://www.sciencephoto.com/media/274242/view
http://www.topnews.in/blood-samples-yield-clues-help-
fight-cancers-2239442
Reações Imunológicas:
Imunofluorescência (IF)
Ensaio Imunoenzimático (EIE)
Imunodifusão em gel de agarose (AGID)
Western Blot
Métodos indiretos: Detecção de Ac no soro
Reações de precipitação (meio gelatinoso)
Imunodifusão (ID)
Diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina
Agar Gel Immunodiffusion (AGID) ou Teste de Coggins
(detecção de Ac no soro do animal)
Ag
Soro em
teste
Linha de precipitação tamanho dos agregados é maior que diâmetro dos poros
Reação de Imunofluorescência (IF): detecção de Ac
Antígeno
Soro do paciente
Conjugado
Soro (+) Soro (-)
Ensaio Imunoenzimático (EIE): detecção de Ac
Amostra clínica: soro
Sensibilização da placa: Ag
conjugado: anti-Ig marcada com enzima
Lisado de proteínas
Eletroforese em gel de
poliacrilamida
Western Blot : pesquisa de Ac
Transferência
para membrana
Antígenos imobilizados
em membranas
detectados por
anticorpos específicos
Santos et al. Introdução a virologia humana, 2008
Amostra clínica depende dos sinais clínicos
Métodos diretos: Detecção do vírus Métodos indiretos
Rápidos Clássicos
Partícula viral:
Microscopia eletrônica (ME)
Antígeno viral:
- Ensaio Imunoenzimático (EIE)
-Imunofluorescência (IFA)
- Imunoperoxidase (IPX)
Genoma viral:
- PCR
Cultura de células
Ovos embrionados
Isolamento viral
Diagnóstico laboratorial das viroses
Amostra clínica
soro
Imunofluorescência (IF)
Ensaio Imunoenzimático
(EIE)
Imunodifusão em gel de
agarose (AGID)
Western Blot
Reações imunológicas
Controle e Prevenção das Viroses
Controle e Prevenção das Viroses
Medidas higiênicas e sanitárias: Hepatite A
Controle de Vetores: Febre Amarela, Dengue
Mudança de estilo de vida: HIV, HBV, HCV Quarentena Vacinas
1798: Edward Jenner
virus vivo atenuado derivado do cowpox virus vaccinia
VACINA latim VACCA
1885: Pasteur
virus rábico “vírus fixo” inoculado em medula espinhal de
coelho medula dessecadas menino ferido por um cão
raivoso
1950s: Culturas de células desenvolvimento de
vacinas atenuadas e inativadas
Atualmente: tecnologia de DNA recombinante
Tipos de vacinas virais
Vacinas não replicativas: não contêm o agente viável
- vírus inteiro (inativadas)
- sub-unidades
- proteínas recombinantes
Vacinas replicativas: contêm o vírus viável
- vírus heterólogos
- Atenuadas
Vírus inteiro inativado: Agentes químicos ou físicos para
destruir a infectividade, mas não a imunogenicidade.
Inativantes mais comuns : formaldeído 37%
-propiolactona raiva
etileno-iminas febre aftosa
Vacinas não replicativas:
Sub – unidades (Ex. Influenza)
Vacina
HBsAg Vetor de expressão
+
DNA recombinante
Transfecção e cultivo celular
Purificação protéica
Inoculação
Vacina recombinante
Vacinas de vírus heterólogo:
- vacina de Jenner
Vacinas de vírus atenuados:
- atenuação do vírus por adaptação a um hospedeiro diferente
do habitual Cultura de células e/ou Ovos embrionados
- atenuação do vírus por seleção de mutantes sensíveis à
temperatura (ts) vírus respiratórios
- manipulação genética
Vacinas replicativas:
Replicação do vírus vacinal no organismo Sim Não
Flores, E. Virologia Veterinária, 2ª. Ed, 2012
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