detección bacillus cereus

PROCEDIMIENTO RECUENTO EN PLACA DE BACILLUS CEREUS EN ALIMENTOS Seccin Microbiologa de Alimentos 1. OBJETIVO

Fecha emisin: 1996 Revisin: 2 Fecha revisin: 28.07.2008 Pgina 1 de 13

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Detectar el nmero de unidades formadoras de colonias (ufc) o de esporas de Bacillus cereus en el alimento. 2. CAMPO DE APLICACION Y ALCANCE Aplicar este procedimiento en alimentos en los que se espera detectar >100 clulas o esporas/ g o mL. 3. FUNDAMENTO Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo, aerobio-anaerobio facultativo. Es formador de esporas, las que se encuentran en la tierra, polvo y por esta razn es un frecuente contaminante de alimentos. El fundamento del mtodo es utilizar la capacidad de precipitar la lecitina de la yema de huevo que contiene el medio y su caracterstica de no fermentar el manitol, estas 2 propiedades son utilizadas para diferenciar las colonias de B. cereus en el medio de cultivo MYP. La polimixina es un inhibidor del desarrollo de otros bacilos facultativos ambientales. 4. REFERENCIAS 4.1. Food and Drug Administration "Bacteriological Analytical Manual" online, enero 2001, carpeta 14 5. TERMINOLOGIA No Aplica.

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6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1. Materiales 6.1.1 Pipetas estriles de 1, 5 y 10 mL graduadas en 0,1 mL. 6.1.2 Propipetas 6.1.3 Placas Petri estriles 15 x 100 mm. 6.1.4 Asas desechables de nicrom o platino de aro 2 mm y 3 mm de dimetro. 6.1.5 Tubos estriles de 13 x 100 mm y tubos de 16 x 125 mm. 6.1.6 Jarra anaerobiosis, Anaerogen o Gas Pack con generador de H2 + CO2 y catalizador. 6.2 Medios de Cultivo y Reactivos 6.2.1 Agar Manitol-Yema de huevo y Polimixina (MYP). 6.2.2 Agar Tirosina. 6.2.3 Agar nutritivo para Bacillus cereus 6.2.4 Caldo Glucosa-Rojo fenol 6.2.5 Caldo Nitrato 6.2.6 Caldo Rojo de Metilo-Voges Proskauer (RM-VP) 6.2.7 Caldo lisozima 6.2.8 Solucin de Polimixina 0.1% para agar MYP 6.2.9 Solucin de naftol 0,5% en cido actico 5M 6.2.10 Solucin de cido sulfanlico 0,4% en cido actico 2,6M 6.2.11 Solucin de naftol 5% en etano 6.2.12 Solucin de KOH al 40% 6.2.13 Emulsin de Yema de Huevo al 50% 6.2.14 Reactivos para tincin de Gram 6.2.15 Zinc en polvo 6.2.16 Agua de dilucin de Butterfield en tubos con 9 mL 0,2 mL y de 450 mL 6.2.17 Cristales creatina 6.2.18 Solucin de tincin Fucsina bsica 6.2.19 Metanol 6.2.20 Medio movilidad B cereus 6.3 Equipos 6.3.1 Estufas de incubacin reguladas a 30 2 C y 35 2 C 6.3.2 Refrigerador 6.3.3 Vortex 6.3.4 Bao de agua 48-50 C.

PROCEDIMIENTO RECUENTO EN PLACA DE BACILLUS CEREUS EN ALIMENTOS Seccin Microbiologa de Alimentos 7 7.1 7.1.1 7.1.2 7.1.3 7.1.4 7.1.5 DESARROLLO DEL PROCESO Recepcin de la muestra en el laboratorio 339


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Recibir la dilucin 10-1 de la muestra procesada en el laboratorio de Recepcin de muestras segn PRT-712.01-002. Preparar a partir de dilucin 10-1 diluciones seriadas hasta 10-6 si es necesario, transfiriendo 1 mL a 9 mL de diluyente. Anotar en la hoja de registro la inscripcin de muestras del laboratorio, la clave, N, fecha de recepcin, naturaleza de la muestra, fecha de anlisis y analista. En el caso de muestras de brotes de ETA, anotar la informacin adicional que se disponga, si la hay. El perodo transcurrido entre la preparacin del homogeneizado de la muestra y la siembra no debe superar los 20 minutos. Siembra recuento de clulas viables de Bacillus cereus Secar las placas preparadas con anterioridad con medio MYP por 10 minutos aproximadamente, colocndolas ligeramente abiertas en forma invertida sobre su propia tapa en estufa a 55 C. Hacer diluciones segn corresponda al tipo de muestra a analizar. Sembrar en superficie y en duplicado 0,1 mL de cada dilucin. Diseminar el inculo con rastrillo estril por toda la superficie del agar. Incubar las placas invertidas a 30C 2 C por 24 hrs. Observar las placas a las 24 horas y si la reaccin no es clara dejar por 24 horas adicionales. Lectura Recuento presuntivo para clulas viables y esporas

7.2 7.2.1

7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.2.6

7.3 7.3.1

7.3.1.1 Seleccionar las placas que contienen entre 15 y 150 colonias. 7.3.1.2 Contar todas las colonias de color rosado, reaccin manitol negativo y que presenten reaccin de precipitacin producto de la lecitinasa. 7.3.1.3 Registrar la lectura en la hoja de Registro de anlisis del laboratorio RG-712.00-081. Recuento presuntivo = Lectura x factor de dilucin



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7.3.1.4 En caso de no tener colonias aisladas, proceder como sigue: 7.3.1.5 Tomar una porcin de cultivo con asa. 7.3.1.6 Sembrar por agotamiento en una placa de agar MYP previamente seca. 7.3.1.7 Incubar las placas invertidas a 30 C 2 C por 24 horas. 7.3.1.8 Registrar las caractersticas de este cultivo en la hoja de Registro de anlisis del laboratorio RG-712.00-081. 7.3.1.9 Realizar pruebas bioqumicas a las colonias seleccionadas. 7.4 7.4.1 7.4.2 7.4.3 Pruebas confirmativas Repicar 5 o ms colonias segn el recuento (si el recuento es bajo, repicar colonias necesarias) para realizar las pruebas bioqumicas. Del agar MYP transferir a agar nutritivo tendido. Incubar 24 horas a 30 C 2 C. Realizar Gram y observar microscpicamente. B. cereus aparece como bacilo largo Gram positivo, en cadenas cortas a largas; de esporas elipsoidales de disposicin central o subterminal y el esporangio no engrosado. Transferir cultivo con asa de 3 mm a tubos de 13 x 100 mm que contienen 0,5 mL de agua de dilucin buffer fosfato, suspenda el cultivo y mezcle en vortex. Use esta suspensin para inocular los siguientes medios confirmatorios:

7.4.4

7.4.4.1 Prueba de Fermentacin de glucosa: Inocular con asa de 2 mm el cultivo en 3 mL de caldo glucosa rojo fenol e incubar en anaerobiosis por 24 horas a 35C 2 C. 7.4.4.2 Prueba RM_VP: Inocular el cultivo en 5mL de medio VP con el cultivo, utilizando asa de 3mm de dimetro. Incubar por 482 h a 35 C. 7.4.4.3 Prueba lisozima: Inocular el cultivo con asa de 2 mm en 2,5 mL de caldo nutritivo que contenga 0,001% de lisozima. Tambin inocular en 2,5 mL de caldo nutritivo como control positivo. Incubar por 24 horas a 35C 2 C. 7.4.4.4 Prueba tirosina: Inocular con asa de 3 mm, en toda la superficie del agar tirosina tendido. Incubar por 48 horas a 35C 2 C. Incubar los tubos que no presenten crecimiento hasta por 7 das antes de considerar el resultado como negativo. 7.4.4.5 Prueba de reduccin de nitratos a nitritos: Inocular en 5 mL de caldo nitrato con el cultivo, utilizando asa de 3 mm. Incubar por 24 horas a 35 C 2 C. 7.4.4.6 Agar MYP: puede ser omitido si los resultados son determinantes en el MYP original o inicial. Si no es as dividir la placa en 6-8 secciones iguales y rotular cada seccin e inocular con asa de 2 mm el cultivo en la superficie del agar en un rea de 4 cm2 de agar Incubar a 35C 2 C por 24 horas.

PROCEDIMIENTO RECUENTO EN PLACA DE BACILLUS CEREUS EN ALIMENTOS Seccin Microbiologa de Alimentos 7.5


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Pruebas adicionales para diferenciar otros miembros del B. cereus: B. mycoides, B, thuringiensis y B. anthracis

7.5.1 Prueba de la motilidad: Inocular en medio BC motilidad en picadura en el centro del tubo con asa de 3 mm con cultivo de una suspensin de 24 horas. Inocule 18 a 24 horas a 30 C y examine crecimiento a lo largo de la lnea de inoculacin. Alternativamente, aada 0,2 mL de agua destilada estril a la superficie de agar nutritivo tendido e inocule con asa de 3 mm del cultivo de una suspensin. Incube 6 a 8 horas a 30 C 2 C y suspenda con asa de 3 mm el lquido a acumulado en la base del agar tendido en una gota de agua estril sobre un portaobjeto, ponga un cubreobjeto y observe al microscopio. 7.5.2 Desarrollo rizoidal: en agar nutritivo (18 a 20 mL) en placa, dejar secar completamente a temperatura ambiente por 1 a 2 das. Inocular suspensin del cultivo con asa de 2 mm suavemente slo tocando la parte central del agar en la placa.Incubar a 30 C 2 C por 48 a 72 horas. 7.5.3 Actividad hemoltica: en un placa de agar soya tripticase co sangre de cordero inocular con asa de 2 mm una suspensin de 24 horas, se pueden usar cuas de agar. Incubar a 35 C 2 C por 24 horas. 7.5.4 Prueba de cristales de protena txicos: inocular en agar nutritivo tendido con asa de 3 mm una suspensin de un cultivo de 24 h .Incube a 30 C 2 C por 24 h y dejar a temperatura ambiente por 2 a 3 das. Preparar extendido o frotis con agua destilada estril en un porta objeto. Secar al aire y fijar con la llama de un mechero Bunsen.En un soporte de tincin inunde con metanol, deje por 30 segundos, elimine el metanol y seque al aire. Ubique nuevamente el porta objeto en el soporte de tincin e inunde completamente con fucsina bsica al 0,5 % o con colorante carbolfucsina de TB. Caliente con un pequeo mechero Bunsen hasta que se desprenda vapor. Espere 1 a 2 min y repita este paso, deje 30 segundos, elimine el colorante y enjuague profundamente con agua corriente. Deje secar y examine al microscopio en inmersin. 7.6 7.6.1 Lectura de las pruebas bioqumicas En caldo Fermentacin de glucosa, agitar vigorosamente el tubo y observar desarrollo por incremento de la turbiedad y viraje del indicador de rojo a amarillo, lo que indica que el cido ha sido producido anaerbicamente desde la glucosa, un cambio parcial de color rojo a naranjado puede ocurrir incluso en los tubos de control sin inculo debido a la reduccin de pH debido a la exposicin del medio a CO2 formado en la jarra de anaerobiosis. Asegurarse usar controles positivos y negativos para distinguir reacciones falso-positivo. La prueba en RM_VP para la produccin de acetilmetil-carbinol es positiva al pipetear 1 mL y transferirlo a tubos de 16 x 125 mm, luego aadir 0,6 mL de solucin de alfanaftol al 5% en etanol y 0,2 mL de NaOH al 40% .Agitar y se puede aadir unos pocos

7.6.2



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cristales de creatinina. Despus de una hora a temperatura ambiente se puede observar la aparicin de color rosado intenso o violeta lo que indica que la reaccin es positiva. 7.6.3 7.6.4 En caldo lisozima se observa desarrollo por la presencia de turbidez por desarrollo positivo. Si la lectura fuese negativa incubar por 24 horas adicionales antes de descartar. En el agar tirosina se observa una zona clara en el medio cerca o alrededor de desarrollo de B. cereus. Incubar por un total de 7 das antes de considerar la prueba como negativa. En caldo nitrato observar la paricin color rojo anaranjado al agregar 0,25 mL de cido sulfanlico al 0,8 % en cido actico 5 N y 0,25 mL de naftol al 0,5% en cido actico 5N, un cambio de color a anaranjado indica que la prueba es positiva, si no aparece color naranjo dentro de 10 minutos, indica que la prueba es negativa y se debe agregar polvo de Zn, no debe observarse cambios para interpretar la prueba como positiva, de lo contrario si al agregar Zinc en polvo se presenta coloracin anaranjada, se debe interpretar la prueba como negativa. En agar MYP observar la produccin de lecitinasa indicada por una zona de precipitacin alrededor de las colonias. El manitol no es fermentado por lo tanto las colonias son rosadas. Interpretacin de los resultados: B. cereus es un bacilo Gram positivo con esporas, produce lecitinasa y no fermenta manitol en agar MYP, crece y produce cido en condiciones anaerbicas a partir de la glucosa, reduce nitratos a nitritos, produce acetilmetil-carbinol, descompone la tirosina, y crece en presencia de lisozima la 0,001%. Pruebas adicionales:

7.6.5

7.6.6

7.6.7

7.6.8

7.6.8.1 Prueba de la motilidad, los microorganismos mviles producen desarrollo difuso en el medio de cultivo. Los inmviles crecen slo en la lnea de inoculacin. Si realiza la prueba en agar tendido la observacin al microscopio se observan microorganismos mviles. 7.6.8.2 El desarrollo rizoidal se manifiesta por el crecimiento en arborizacin o desarrollo similar a races que se extienden por varios centmetros del centro de la inoculacin y es caracterstico de B. mycoides. 7.6.8.3 Actividad hemoltica en B. cereus es fuerte y marcada produciendo 2 a 4 mm de zona de .- hemlisis (hemlisis completa) alrededor de las colonias. (Seis o ms colonias pueden ser testeadas en cada placa). 7.6.8.4 En la prueba de cristales txicos de protena se observan esporas libres y los cristales se observan como formas tetragonales y se tien en forma muy oscura. Los cristales son usualmente ms pequeos que las esporas. 7.6.8.5 Interpretacin resultados pruebas adicionales: B. cereus es mvil, presenta una marcada - hemlisis, no presenta desarrollo rizoidal y no produce cristales txicos de protena.



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7.7 7.7.1 7.7.2

Clculo y expresin de resultados Anotar todas las colonias que cumplen con las pruebas, de acuerdo a los respectivos instructivos Para realizar el clculo, aplicar la siguiente frmula:

Recuento confirmado = Promedio obtenido en dilucin * N colonias confirmadas * dilucin * 10 N colonias repicadas 7.8 7.8.1 Informe de resultados El resultado se expresa en ufc o esporas de Bacillus cereus por g o mL de producto analizado segn corresponda. REGISTROS Tiempo retencin y disposicin 5 aos y disposicin en basura normal partidos en trozos.

8.

Identificacin Almacenamiento Proteccin Recuperacin del registro azul Acceso restringido Papel RG-712.00-081 Archivador rotulado registro al personal de la Registro resultados de informes laboratorio Seccin anlisis Recuento 339. Microbiologa. en placa de Bacillus cereus en alimentos. RG- 712.00-098 Archivador Registro Acceso restringido Papel Registro control controles laboratorio al personal de la esterilidad 339. Seccin medios de cultivo Microbiologa. laboratorio 339. RG 712.00-099 Archivador Registro Acceso restringido Papel Registro batera controles laboratorio al personal de la bioqumica de 339. Seccin cepa control Microbiologa. positivo y control negativo Bacillus cereus

5 aos y disposicin en basura normal partidos en trozos. 5 aos y disposicin en basura normal partidos en trozos.

PROCEDIMIENTO RECUENTO EN PLACA DE BACILLUS CEREUS EN ALIMENTOS Seccin Microbiologa de Alimentos 9. TABLA DE MODIFICACIONES Pg. Modificada 1 1 Motivo del cambio Se elimina pgina 1 por cambio en formato documento institucional. Se cambi formato del encabezado de pgina en todo el documento. Se corrige PRT-702.04-034 por PRT712.04-034. Se cambi nmero de revisin N 0 por revisin N 1 y el total de pginas. Se deja pie de pgina slo en pgina 1 y se actualizan los cargos. Se actualiz la referencia del punto 4.1 y se eliminaron las referencias del 4.2 al 4.4 Se complet el punto 6.1.3 y se agregaron los puntos 6.1.4 al 6.1.6 En el punto 6.2.2 se agreg para Bacillus cereus. Se agregaron los puntos 6.2.16 al 6.2.19. En el punto 6.3.1 se modific 30 2C y 35 2C Se agreg el punto 6.3.5 En el punto 7.1.1 corrigi PR-712.01-022 por : PRT-712.01.002. Se agreg el punto 7.1.2. En el punto 7.1.2 se cambi cuaderno por hoja de registro. Se elimin el punto 7.1.4 Se eliminaron los puntos 7.2.1 al 7.2.3. Se agreg al punto 7.2.5:... superficie en ..... Se agreg el punto 7.2.4 En el punto 7.2.8 se agreg: 30 1C. En el punto 7.4.1 se cambi a :...15 y 150 colonias. En el punto 7.4.3 se agreg:... reaccin


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Revisin N 0 0

Fecha Aprobacin 28/07/2008 28/07/2008

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PROCEDIMIENTO RECUENTO EN PLACA DE BACILLUS CEREUS EN ALIMENTOS Seccin Microbiologa de Alimentos Revisin N Pg. Modificada 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5


PRT- 712.04-035 Motivo del cambio manitol negativo y que presenten reaccin de precipitacin producto de la lecitinasa Al punto 7.4.3 se agreg:... la hoja de Registro de anlisis del laboratorio RG712.00-081 En el punto 7.4.8 se agreg: ...en la hoja... RG-712.00-081. Al punto 7.5 se agreg nuevos temes correspondiente al 7.5.2 al 7.5.4 cambiando el orden correlativo. El punto 7.5.2 cambi a 7.5.4.1 y se agreg: ... de 2 mm.... En el punto 7.5.3 se cambi a 7.5.4.2 y se agreg: ... 2... El punto 7.4.3 se cambi a 7.4.3.3 y se agreg:... de 2 mm ...e inocule en 2,5 mL de caldo nutritivo como control... El punto 7.5.4 se cambi a 7.5.4.4 y se agreg:... de 3 mm, en toda la superficie... hasta ... En el punto 7.5.5 se camb a 7.5.4.5 y se agreg:... en 5 mL... caldo nitrato ...de 3 mm... El punto 7.5.6 Prueba de reduccin nitratos a nitritos se cambi a 7.5.4.6 Agar MYP Se agreg el punto 7.5.4.7 Pruebas adicionales para diferenciar otros miembros del B. cereus: B. mycoides, B, thuringiensis y B. anthracis Se agregaron los temes 7.5.4.7.1 al 7.5.4.7.4 Se modific el contenido de los puntos 7.6.1 al 7.6.5 y se agregaron los puntosa 7.6.6 al 7.6.7 Se agreg el punto 7.6.8 Pruebas adicionales y sus temes del 7.6.8.1 al 7.6.8.5 En el punto 7.8 se agreg a l frmula:... X dil X 10...

Fecha Aprobacin

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6 6 6

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PROCEDIMIENTO RECUENTO EN PLACA DE BACILLUS CEREUS EN ALIMENTOS Seccin Microbiologa de Alimentos Revisin N 0 Pg. Modificada 6


PRT- 712.04-035 Motivo del cambio En el punto 8.0 RESPONSABLES se cambi por REGISTROS y sus temes. Se incluy tabla de registros. El punto 9.0 Distribucin se cambi por: TABLA DE MODIFICACIONES. Se agreg el punto 10. ANEXOS y sus temes N1 al N6

Fecha Aprobacin 28/07/2008

0 0

6 6

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10.

ANEXOS

Anexo N 1 Tabla diferencial de grupo Bacillus cereus. Anexo N 2 Preparacin Medios de cultivo. Anexo N 3 Preparacin Reactivos. Anexo N 4 Hoja de registro informe Recuento en placa de Bacillus cereus en alimentos RG712-00-081. Anexo N 5 Hoja de Registro cepa control positivo y control negativo anlisis B. cereus RG 712.00-099. Anexo N 6 Hoja control esterilidad medios de cultivo laboratorio 339 RG-712.00-098.



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ANEXO N 1-PRT-712.04-035 TABLA DIFRENCIAL GRUPO BACILLUS CEREUSTable 1. Differential characteristics of large-celled Group I Bacillus species Feature Gram reaction Catalase Motility Reduction of nitrate Tyrosine decomposed Lysozyme-resistant Egg yolk reaction Anaerobic utilization of glucose VP reaction Acid produced from mannitol Hemolysis (Sheep RBC) Known pathogenicity(e)/characteristica

B. cereus +(a) + +/-(b) + + + + + + + produces enterotoxins

B. thuringiensis + + +/+/ + + + + + + endotoxin crystals pathogenic to insects

B. mycoides + + -(c) + +/+ + + + + rhizoidal growth

B. anthracis + + + -(d) + + + + (d) pathogenic to animals and humans

B. megaterium + + +/-(d) +/+ -

+, 90-100% of strains are positive. +/-, 50-50% of strains are positive. c -, 90-100% of strains are negative. d -, Most strains are negative. e See Section H, Limitations of method for B. cereus.b



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ANEXO N 2-PRT-712.04-035 PREPARACION MEDIOS DE CULTIVO Agar soya tripticase con sangre de cordero Frmula: Peptona tripticasa Peptona phytone Na Cl Agar Agua destilada 15 g 5g 5g 15 g 1L

Calentar hasta disolver. Autoclavar 15 min a 121C, pH final 7,3 0,2C. Enfriar a 50C y aadir 5 mL de sangre de cordero desfibrinada a 100 mL de agar base. Mezclar y dispensar 20 mL en placas Petri de 15 x 100 mm.

Medio motilidad para Bacillus cereus Frmula: Tripticasa Extracto de levadura Dextrosa Na 2 HPO4 Agar Agua destilada 10 g 2,5 g 5g 2,5 g 3g 1L

Calentar con agitacin hasta disolver. Dispensar 100 mL en frascos Schott de 250 mL. Autoclavar por 15 min a a121C. El pH final 7,4 0.2. Enfriar a 50C. Dispensar aspticamente 2 mL en tubos estriles de 13 x 100 mm. Almacenar a temperatura ambiente 2 das antes de su uso.



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ANEXO N 3-PRT-712.04-035 PREPARACIN REACTIVOS Solucin Lisozima Disolver 0.1 g de lisozima en 65 mL de HCl 0,01 N estril. Calentar hasta ebullicin por 20 min. Diliur a 100 mL con HCl 0,01 N. Alternativamente, disolver 0,1 g de lisozima en 100 mL de agua destilada. Esterilizar por filtracin a travs de membrana filtrante de 0,45 m. Confirmar esterilidad antes de usar. Aadir 1 mL de solucin lisozima a 99 mL de caldo nutritivo. Mezclar y dispensar 2,5 mL a tubos estriles de 13 x 100 mm.

Suspensin Tirosina Suspender 0,5 g de L- tirosina en 10 mL de agua destilada en tubos de 20 x 150 mm. Mezclar con Vortex. Autoclavar 15 min a 121C. A 100 mL de agar base agregar los 190 mL de la suspensin de tirosina. Mezclar bien invirtiendo el tubo 2 3 veces. En forma asptica dispensar 3,5 mL en tubos de 13 x 100 mm y mezclar. Tender los tubos y enfriar rpidamente para prevenir la separacin de la tirosina.

Solucin de Fucsina Bsica Disolver 0,5 g de fucsina bsica en 20 mL de etanol al 95%. Diluir a 100 mL con agua destilada. Filtrar si es necesario con papel filtro Whatman N 3 para remover colorante sin disolver. Tambin se puede usar TB carbolfucsina ZN.

detección bacillus cereus

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