detección de blee en el laboratorio de microbiología
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Detección de BLEE en el Perú:
¿Como? y ¿Porque?
Lic. TM. Javier Soto Pastrana [email protected]
Laboratorio de Microbiología Clínica Hospital San Bartolome
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BACTERIA SENSIBLE BACTERIA RESISTENTE
Antibiótico β-lactamicos
Difusión a través de la membrana externa
Alteración de porinas Bomba de expulsión
Difusión a través del peptidoglicano
PBP
Cambios en los PBP
Muerte celular
Β-lactamasas
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MECANISMOS DE RESISTENCIA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Proteínas Fijadoras de Penicilina
OmpF OmpC
Beta-lactamasas
Espacio periplasmatico
Bomba de
Eflujo
Imipenem
Cephalosporinas
Membrana externa
(Lipopolisacarido)
PBP3 PBP1b
Membrana interna
(fosfolipido) PB1a PBP2
Peptidoglicano
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Clasificación de las β-lactamasas
Bush, K. (2010). AAC. 54 (3): 969 - 976
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Definición de BLEE
Son enzimas de codificación plasmidicas Diseminación a otros microorganismos
Asociación a otros mecanismos de resistencia
Asociado a impermeabilidad produce resistencia a los carbapenems
Enzimas que tienen una actividad hidrolitica contra oximino-cefalosporinas o aztreonam mas del 10% que a bencilpenicilina. No pueden hidrolizar cefamicinas o carbapenems. Son inhibidas por inhibidores de β-lactamasa.
Sohei Harada y col. Korean J Lab Med 2008; 28: 401-412
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Origen de las BLEE
En 1983 (Alemania) se descubrió la primera BLEE (SHV-2)
En 1985 (Francia) se descubrió a la segunda BLEE (TEM-3)
En 1989 (Alemania-Argentina) se detecto un BLEE diferente a TEM y SHV, que se denomino CTX-M.
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Actualmente (2010)………
Mas de 160 variantes de TEM
• IRT (TEM resistente a inhibidores)
• CMT (complejo mutantes de TEM)
Mas de 115 variantes de SHV
Mas de 80 variantes de CTX-M
• Clasificadas en 5 Grupos: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8,
CTX-M-9, y CTX-M-25
Otras: PER, VEB, GES, SFO, TLA, BEL, BES e IBC.
http://www. lahey.org/studies/.
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Enferm Infecc Microbiol Clin. 2007; 25 Supl. 2: 2-10
BLEE Β-lactamasa relacionada
Pais de origen Especies en las que se detectaron inicialmente
Prevalencia elevada
SHV SHV-1/LEN Alemania (1983) Klebsiella ozaenae
TEM TEM-1, -2 Francia (1985) Klebsiella pneumoniae
CTX-M KLUA Kluyvera sp. Japón(1986) Alemania(1989) Argentina(1989)
Escherichia coli, Salmonella spp
OXA OXA-10 (PSE-2) Turquía (1991) Pseudomonas aeruginosa
PER Francia (1991) Pseudomonas aeruginosa
VEB PER (39%) Francia (Vietnam) (1996) Escherichia coli
Prevalencia baja
SFO AmpA S.fonticola (96%) Japón (1988) Enterobacter cloacae
TLA CME-1 (50%) México (1991) Escherichia coli
BES YENT (51%) Brasil (1996) Serratia marcescens
GES-1 YENT (36%)
Francia (Guayana francesa) (1998)
Klebsiella pneumoniae
IBC YENT (51%) Grecia (1999) Enterobacter cloacae
BEL GES-1 (50%) Bélgica (2004) Pseudomonas aeruginosa
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Β-lactamasa Posición del aminoácido
19 37 102 162 203 235 236 237 261
TEM-1 Leu Gln Glu Arg Gln Ala Gly Glu Thr
TEM-2 Lys
TEM-3 Lys Lys Ser
TEM-4 Phe Lys Ser
TEM-5 Ser Thr Lys
TEM-6 Lys His
TEM-7 Lys Ser
SHV-1 Gln Asp Arg Arg Ala Gly Glu Leu
SHV-2 Ser
SHV-3 Leu Ser
SHV-4 Leu Ser Lys
Base Molecular de las BLEE
Gln: Glutamina, Glu: Acido glutamico, Asp: Acido aspartico, Thr: Treonina, Leu: Leucina, Phe: fenilalanina
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Prevalencia de BLEE en K.pneumoniae y E. coli en Latinoamerica
País Microorganismos
K. pneumoniae Escherichia coli β-lactamasa
Argentina 57% 5% SHV-2, -5, CTX-M-2, PER-2
Brasil 38% 12% CTX-M-8, SHV-5
Chile 73% 22% SHV-5, -2
Colombia 44% 27% SHV-5, -2, CTX-M-12
Costa Rica 32% 7% SHV-5, -4
Ecuador 26% 27% SHV-5, -4
Guatemala 52% 27% SHV-5, -4
México 56% 28% TLA-1, SHV-5, -12
Perú * 63% SHV-2, -5, -12
Uruguay 38% 7% SHV-5, -2, TEM-144
Venezuela 63% 32% SHV-5, SHV-2
Infectio 2007; 11(1): 23-35 Mendes et al. No reportaron prevalencia
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Problemas en la Detección de BLEE
Muchas cepas portadoras de BLEE no aparecen resistente a C2G, C3G y C4G o aztreonam en el antibiograma.
Algunos antibióticos son mejores para detectar la presencia de BLEE (p.e. ceftazidima, aztreonam, cefpodoxima).
Detección es imperativo para advertir a los clínicos que la terapia con algunos nuevos -lactamicos puede no ser exitoso
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Recomendaciones de la CLSI para la deteccion de BLEE
OBJETIVO
Si se usan:
Punto de corte M100-S19 (2009)
Punto de corte M100-S20 (2010)
PARA SEGUIMIENTO DEL PACIENTE
Realizar screening y confirmar BLEE
SI NO
Cambiar “S” a “R” para las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam
SI NO
PARA CONTROL DE INFECCIONES
Realizar screening y confirmar BLEE
SI SOLO SI SE SOLICITA
Cambiar “S” a “R” para las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam
SI NO
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Cambios de los MICs: C3G en Enterobacterias
Antibiótico CLSI M100-S19 (2009) CLSI M100-S20 (2010)
S I R S I R
Cefazolina ≤ 8 16 ≥ 32 ≤ 1 2 ≥ 4
Cefotaxima ≤ 8 16 - 32 ≥ 64 ≤ 1 2 ≥ 4
Ceftizoxime ≤ 8 16 - 32 ≥ 64 ≤ 1 2 ≥ 4
Ceftriaxona ≤ 8 16 - 32 ≥ 64 ≤ 1 2 ≥ 4
Ceftazidima ≤ 8 16 ≥ 32 ≤ 4 8 ≥16
Aztreonam ≤ 8 16 ≥ 32 ≤ 4 8 ≥16
Interpretación basado en 1 gr. Cada 24 horas
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¿Porque cambios en los breakpoints?
Antimicrobiano Nuevos Breakpoints Antiguos Breakpoints
Cefazolina 100 % 80 %
Cefotaxima 80 % 33 %
Ceftriaxona 89 % 40 %
Ceftazidima 84% 62 %
Aztreonam 87 % 87 %
LOS NUEVOS BREAKPOINTS DETECTARIA MAS BACTERIAS PRODUCTORAS DE BLEE Porcentajes de cepas productoras de BLEE dando resultados RESISTENTES
Kohner y col. 2009. Journal Clinical Microbiology 47: 2419
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Detección BLEE: ¿ya no es necesario?
CLSI M100 – S21 (2011)
ANTIMICROBIANOS S I R
Cefotaxima ≥ 26 23 - 25 ≤ 22
Ceftizoxime ≥ 25 22 - 24 ≤ 21
Ceftriaxona ≥ 23 20 - 22 ≤ 19
Ceftazidima ≥ 21 18 - 20 ≤ 17
Aztreonam ≥ 21 18 - 20 ≤ 17
NUEVOS TAMAÑOS DE LOS HALOS DE INHIBICION PARA TODAS LAS ENTEROBACTERIAS
Ventaja de los cambios de los breakpoints (CLSI2010) es que bacterias como Enterobacter spp. los cuales no son considerados en las guías de la CLSI para detectar BLEE, serian considerados
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Recomendaciones del INEI - Argentina
Se sugiere seguir informando las cepas productoras de BLEEs como BLEE positiva e informar todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactamicos como resistentes, pero acompañado de una llamada aclaratoria para cada una de las drogas que presentara resultado de aparente sensibilidad cuando se aplican los puntos de corte del 2011, citando:
"De acuerdo a CLSI M100-S20 2011, Ceftazidima y/o Cefotaxima y/o Cefepima y/o Aztreonam, sería(n) sensible(s) en base a
parámetros PK/PD. Sin embargo, no se disponen de suficientes datos clínicos que aseguren la eficacia de esta(s) droga(s) en
aislamientos con este mecanismo de resistencia (BLEE)"
Servicio Antimicrobianos - INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
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INEI: ejemplo de Informe de BLEE
Servicio Antimicrobianos - INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”
(*) “De acuerdo a CLSI M100-S20 2010, CAZ y AZT serían sensible y FEP intermedio en base a parámetros PK/PD. Sin embargo, no se disponen de suficientes datos clínicos que aseguren la eficacia de estas drogas en aislamientos con este mecanismo de resistencia (BLEE)”
Antibiótico Halo de inhibición Informe
Cefotaxima 12 mm R
Cefatzidima 22 mm R (*)
Aztreonam 21 mm R (*)
Cefepima 15 mm R (*)
CULTIVO: Klebsiella pneumoniae
Sinergismo entre AMC-CTX: positivo BLEE POSITIVO
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RECOMENDACIONES INEI ESTUDIO DE BLEE ENTEROBACTERIAS
Continuar con la búsqueda reporte e informe de BLEE en las pruebas de rutina. Usar tabla suplementaria 2A-S1 de CLSI M100-S21 (2011).
BLEE positivo: informar R a todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactamicos independientemente de las zonas de inhibición o MIC obtenidas.
BLEE negativo: informar según punto de corte actualizado CLSI 2011
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Punto de corte nuevo
CLSI 2009: S ≥ 18 mm; R ≤ 14 mm CLSI 2010: S ≥ 21 mm; R ≤ 17 mm Tamizaje de BLEE: ≤ 22 mm
DISTRIBUCION DE LOS HALOS DE INHIBICION DE CEFTAZIDIME DE 254 CEPAS DE Escherichia coli productoras de BLEE
HOSPITAL SAN BARTOLOME 2005 - 2010
Punto de corte antiguo
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CLSI 2009: S ≥ 21 mm; R ≤ 13 mm CLSI 2010: S ≥ 23 mm; R ≤ 19 mm Tamizaje de BLEE: ≤ 22 mm
Punto de corte nuevo
DISTRIBUCION DE LOS HALOS DE INHIBICION DE CEFTRIAXONA DE 254 CEPAS DE Escherichia coli productoras de BLEE
HOSPITAL SAN BARTOLOME 2005 - 2010
Punto de corte antiguo
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MIC (µg/ml)
% (No/total) de pacientes quienes:
Experimentan falla
Tto con Cefalosporina Muerte en los 14 dias
de bacteremia
8
4
2
1
Total
100 (6/6)
67 (2/3)
33 (1/3)
27 (3/11)
54 (15/28)
33 (2/6)
0 (0/3)
0 (0/3)
18 (2/11)
Pacientes que Fallaron al Tratamiento con C3G en Infecciones Graves por Bacterias Productoras de
BLEE
Paterson et al. J Clin Microbiol 2001;39:2206–2212
(NCCLS breakpoint S = 8 g/ml)
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Métodos de Detección de BLEE
“Cada laboratorio deberia tener un Microbiólogo con el tiempo, el interés, y la experiencia para liderar en pruebas de resistencia a los antibióticos. Esta persona leería publicaciones relevantes, se relacionaria con otros laboratorios, y evaluaría pruebas potencialmente útiles para detectar nuevas formas de resistencia antes que las nuevas pruebas recomendadas por la CLSI sean disponibles”
Rol del laboratorio de Microbiología
Ken Thomson, Emerging Infect. Dis., 2001
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Método de Screening para BLEE
Antibiótico Disco difusión (mm) MIC (μg/ml)
Cefpodoxima ≤ 17 (≤ 22) ≥ 4 (≥ 1)
Ceftazidima ≤ 22 (≤ 22 ) ≥ 1 (≥ 1)
Aztreonam ≤ 27 ≥ 1
Cefotaxima ≤ 27 (≤ 27) ≥ 1 (≥ 1)
Ceftriaxona ≤ 25 ≥ 1
( ) zona de inhibición y MIC para el screening de BLEE en Proteus mirabilis
M100-S21 (2011)
Screening para E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca y Proteus mirabilis.
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Método de Screening para BLEE
M100-S21 (2011)
Antibiótico Disco difusión
(mm)
Cefpodoxima ≤ 17
Ceftazidima ≤ 22
Aztreonam ≤ 27
Cefotaxima ≤ 27
Ceftriaxona ≤ 25
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Método Confirmatorio de BLEE
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Método Confirmatorio de BLEE
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Método Confirmatorio de BLEE
E. Coli productora de BLEE y alto nivel de AmpC Klebsiella pneumoniae productora de CTX-M-9 y CMY-2
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E. cloacae con AmpC
Cromosomal inducible y
BLEE
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E. cloacae mutante con AmpC
Cromosomal desreprimida y
BLEE
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S. marcescens con AmpC Cromosomal
y BLEE
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Métodos de Detección de BLEE
Jarlier V. et al. Rev Infec Dis 1988; 10:867-878
E. Coli CTX-M
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Métodos de Detección de BLEE
Prueba de difusión del doble disco Prueba de disco sobre disco o del reemplazo del disco
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Métodos de Detección de BLEE
Vercauteren E. et al. J Clin Microbiol 1997 ;35:2191–2197
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Métodos de Detección de BLEE
Thomson K, Sander C. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36:1877-1882
Prueba Tridimensional
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Detección de BLEE en Proteus mirabilis
• Proteus mirabilis - prueba BLEE 2005
• Búsqueda de rutina no es recomendado
• Realizar prueba BLEE cuando sea clínicamente relevante (bacteremia) – Consultar a un medico para determinar cuando
probar.
– Un enfoque practico, probar aislamientos de sitios corporales estériles.
• Usar prueba fenotípica confirmatoria estándar disco difusión o MIC sin modificación (CLSI)
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P. mirabilis con BLEE
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37
K. oxytoca con hiperproduccion -lactamasa K1
La SFM recomienda informar al clínico como cepa con sensibilidad intermedia de aquellos antibióticos que presenten sinergia, independientemente de la sensibilidad
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K. oxytoca con hiperproduccion -lactamasa K1
![Page 39: Detección de BLEE en el Laboratorio de Microbiología](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050619/553665a64a795936258b496f/html5/thumbnails/39.jpg)
39
E. coli with CTX-M ESBL
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MICs (g/ml): Citrobacter freundii productora SHV-3
Inoculo
CFU/ml
Cefotaxima Ceftazidima Aztreonam Cefepime
5 x 105 2 1 0.5 0.5
KS Thomson and ES Moland, Creighton University
(CLSI breakpoint 2009 Sensible: 8 g/ml)
Detección de BLEE: Efecto Inoculo
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MICs (g/ml): Citrobacter freundii productora SHV-3
Inoculo
CFU/ml
Cefotaxima Ceftazidima Aztreonam Cefepime
5 x 105 2 1 0.5 0.5
5 x 107 256 32 32 >1024
Detección de BLEE: Efecto Inoculo
KS Thomson and ES Moland, Creighton University
(CLSI breakpoint 2009 Sensible: 8 g/ml)
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Detección de BLEE: E-test
CEFOTAXIMA CEFOTAXIMA + ACIDO CLAVULANICO
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Advanced Expert System™
Detección de BLEE: ViteK ESBL cards
DETECCION DE BLEE: FEP: 1 μg/ml FEP/CA: 1/10 μg/ml CTX: 0.5 μg/ml CTX/CA: 0.5/4 μg/ml CAZ: 0.5 μg/ml CAZ/CA: 0.5/4 μg/ml AST-GN24
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ANALISIS DE ISOELECTROENFOQUE CARACTERISTICAS DE LOS PACIENTES EN LAS SALAS DE LA UCI NEONATAL
Se identificaron 7 cepas de K. pneumoniae y 3 cepas de E. cloacae .
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PRUEBA DE SINERGIA DE DOBLE DISCO TRANSFERENCIA DE RESISTENCIA (CONJUGACION BACTERIANA)
CAZ AZT
CTX
FOX
IMP AMC
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ANALISIS DE PATRON DE BANDA PLASMIDICA
GENOTIPIA DE LOS AISLAMIENTOS K. pneumoniae y E. coli
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Gerhard F. 2003 AAC. 47: 2385-2392
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METODO CONFIRMATORIO CLSI METODO DE JARLIER
METODO HODGE METODO TRIDEMENSIONAL
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Brote por Klebsiella pneumoniae Lisina
Descarboxilasa Negativa productora de
ß-Lactamasa de Espectro Extendido en una
Unidad de Cuidados Intensivo Neonatal Nazario Silva, Javier Soto, Socorro Torres, Juan Carlos Riveros , Rosa Sacsaquispe, Víctor Suarez
HONADOMANI San Bartolome , Instituto Nacional de Salud , Lima, Perú, 2007
XI CONGRESO PERUANO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y TROPICALES 2009
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Paciente H.C. Cod. Lab. Edad Servicio Fecha Cultivo Bacteria Biotipo API BLEE
Ayala Lorenzo RN. 616819 07D-2075 4 días UCI 01/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si
Ayala Lorenzo RN. 616819 07D-2086 6 días UCI 03/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si
Requena Saucedo RN. 618226 07D-2126 4 días UCI 07/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si
Jiménez Valverde RN. 618197 07D-2133 3 días UCI 10/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si
Alamo Sanchez RN. 617751 07D-2135 3 días UCI 10/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si
Requena Saucedo RN. 618226 07D-2157 11 días UCI 11/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si
Alamo Sanchez RN. 617751 07D-2156 6 días UCI 11/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si
Requena Saucedo RN. 618226 07C-1597 10 días UCI 14/09/07 Cateter K. pneumoniae 1215773 si
Paciente H.C. Cod. Lab. Edad Servicio Fecha Bacteria Biotipo API BLEE
Lopez Sanches RN 618350 P-01 5 días UCI 11/09/07 K. pneumoniae 1215773 si
Alamo Sanchez RN. 617751 P-05 6 días UCI 11/09/07 K. pneumoniae 1215773 si
Llano Meneses RN. 612990 P-07 10 dias UCI 11/09/07 K. pneumoniae 1215773 si
Estudio de Portadores (3/7)
Muestra Cod. Lab. Servicio Fecha Bacteria Biotipo API BLEE
Leche Materna
(Alamo Sanches RN) M-12 UCI 11/09/07 K. pneumoniae 1215773 si
Estudio Ambiental (1/14)
Muestras Clínicas
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PACIENTES 1 (AL) 2 (RS) 3 (JV) 4 (AS) Fecha de nacimiento 27/08/07 03/09/07 05/09/07 05/09/07
Catéter Umbilical Si si si si
Ventilación Mecánica Si si si si
Peso al nacer 840 1320 785 860
Edad Gestacional 34 32 26 28
Edad Materna - 27 24 31
CPN Inadec 1 1 0
T' hosp materna (horas) - 1 120 168
Tipo de parto PV Cesárea Cesárea P.V
Infecc Materna - no no no
RPM 10 días no no 7 días
Fecha de Dx de Infección 03/09/07 04/09/07 07/09/07 07/09/07
Fecha de Hemocultivo (KP) 03/09/07 08/09/07 08/09/07 10/09/07
SDR, EMH Si NO SI Si
Depresion Severa ASFIXIA No SI SI si
CARACTERÍSTICAS DE FALLECIDOS CON CULTIVO POSITIVO A KLEBSIELLA PNEUMONIAE
UCIN HONADOMANI SB. SETIEMBRE 2007
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Klebsiella pneumoniae Productora de BLEE
N° Biotipo 1215773
N° Biotipo 3043
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MP SB-A SB-B SB-C SB-D SB-E SB-F SB-G SB-H SB-I CS
Para comparar genéticamente las cepas
se realizó la prueba molecular ERIC-PCR,
la cual amplifica regiones repetitivas de
enterobacterias mediante PCR.
MP: Marcador de peso molecular 1 Kb ladder Fermentas; SB-A: cepa K. pneumoniae 2126.: SB-B: cepa K. pneumoniae 2133; SB-C: cepa E. coli 196-07 (cepario del INS); SB-D: cepa K. pneumoniae 2135;S B-E: cepa K. pneumoniae 206-07 (cepario del INS); SB-F: cepa K. pneumoniae 2086;S B-G: cepa K. pneumoniae 1; SB-H: cepa K. pneumoniae 12; SB-I: cepa K. pneumoniae 223-07 (cepario del INS); CS: Control de sistema.
INFORME DEL INS: Los resultados moleculares muestra que las cepas de K. pneumoniae aisladas e identificadas
por laboratorio de Microbiología del Hospital San Bartolomé están genéticamente relacionadas.
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• Campos F, Soto J, Torres S, Bazan C, Silva N. Klebsiella pneumoniae productora de -lactamasa de espectro extendido (BLEE) en una Unidad de Cuidado Intensivo Neonatal. Lima .Dic 2003
• XXIII Congreso Peruano de Pediatría, Oct 12-15, Trujillo Perú 2003
• Aranda M, J Campos F, Torres S, Soto J, Silva N. Primer Brote de Escherichia coli productora de -lactamasa de espectro extendido (BLEE) en la Unidad de Cirugía Neonatal del Hospital San Bartolome. V Congreso Panamericano de Control de Infecciones y Epidemiología Hospitalaria; 2004 Oct 7-10, Lima, Peru.
• Rev Peru Enferm Infecc y Trop 2004; 3:34
![Page 69: Detección de BLEE en el Laboratorio de Microbiología](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050619/553665a64a795936258b496f/html5/thumbnails/69.jpg)
DETECCIÓN FENOTÍPICA DE LOS MECANISMOS DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS BETALACTAMICOS EN E. coli CAUSANTE DE INFECCIONES URINARIAS EN EL
HOSPITAL NACIONAL DOCENTE MADRE NIÑO SAN BARTOLOMÉ - 2011
Autor: Blgo. Oscar Jhian Gibran Rios Rios
N° MUESTRAS SCREENING(CLSI) BLEE
CONFIRMADOS(SFM)
389 76 60
![Page 70: Detección de BLEE en el Laboratorio de Microbiología](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050619/553665a64a795936258b496f/html5/thumbnails/70.jpg)
ENTEROBACTERIAS PRODUCTORAS DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO EN MUESTRAS DE HECES DE PACIENTES AMBULATORIOS EN EL
HOSPITAL “SAN BARTOLOMÉ” - 2011.
ESPECIES BLEE + BLEE - TOTAL
E. coli 65 11 76
K. pneumoniae 6 2 8
P. mirabilis 4 0 4
E. cloacae 2 2 4
P. vulgaris 1 0 1
S. sonnei 1 1 2
K. oxytoca 0 1 1
A. caviae 0 1 1
TOTAL 79 17 96
Autor: Blga. María del Carmen Molina Carpio
Pacientes de la UCPTD n: 273 muestras de heces Medio utilizado: Agar karmali (cefoperazona) Prevalencia de bacterias productoras de BLEE: 28.9 %
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![Page 72: Detección de BLEE en el Laboratorio de Microbiología](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022050619/553665a64a795936258b496f/html5/thumbnails/72.jpg)
La salud y el bienestar de los pacientes esta en sus manos...
AGUA JABON SENTIDO
Y
COMUN
SON LOS MEJORES
DESINFECTANTES