DETEKSI DAN DIFERENSIASI VIRUS KERDIL PISANG DENGANTEKNIK PCR-RFLP

DETECTION AND DIFFERENTIATION OF BUNCHY TOP VIRUS IN BANANA BYPCR-RFLP TECHNIQUES

RahmaAyu Priani*, Susamto Somowiyarjo, Sedyo Hartono, dan Siti SubandiyahJurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

*Penulis untuk korespondensi. E-mail: rahmaayupriani@yahoo.com

ABSTRACTBanana bunchy top disease (BBTD) can be caused by the infection of two different viruses, Banana bunchy top virus

(BBTV) or Abaca bunchy top virus (ABTV). Both viruses can be transmitted persistently by aphid Pentalonianigronervosa Coq. The research was conducted to detect and to differentiate the virus by polymerase chain reaction –restriction fragment length polymorphism (PCR – RFLP) techniques. Infected plants were collected from Yogyakarta(Sleman, Yogyakarta city, Bantul, Gunung Kidul, and Kulon Progo). Nucleon Phytopure DNA Extraction Kit methodwas used to extract the total DNA of infected plants. Universal primers of Common DNA region (S-CRF and S-CRR)and specific primers DNA-R (C1-CRF and CI-CRR) were used for PCR amplification. PCR products were analyzedby RFLP technique using the restriction enzyme ofDra I. The results reconfirm previous reports that bunchy top diseaseof banana in Yogyakarta is caused by BBTV. The ABTV was not detected in this present study. Based on the RFLPanalysis it was concluded that BBTV collected in this study could be divided into three groups. Group 1 consisted ofBBTV isolate from Sleman and Yogyakarta city with two fragments DNA of 400 and 388 bp. Group 2 consisted of isolateBBTV from Kulon Progo and Gunung Kidul with three fragments DNA of 400, 388, and 323 bp. Group 3 consisted ofisolate from Bantul with two fragments DNA of 723 and 376 bp. Further study on the complete characteristics of thesegroups is still needed.

Key words: Abaca bunchy top virus, Banana bunchy top virus, bunchy top disease, DNA extraction, PCR, RFLP

INTISARIPenyakit kerdil pisang dapat disebabkan oleh infeksi virus yang berbeda yaitu Banana bunchy top virus (BBTV)

atau Abaca bunchy top virus (ABTV). Kedua virus tersebut ditularkan secara persisten oleh kutu daun Pentalonianigronervosa Coq. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi dan membedakan virus dengan polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Tanaman terinfeksi dikoleksi dari Yogyakarta (Sleman, KotaYogyakarta, Bantul, Gunung Kidul, dan Kulon Progo). Metode Phytopure DNA Extraction Kit dan CTAB digunakanuntuk mengisolasi DNA total. Primer universal Common DNA region (S-CRF/S-CRR) dan primer spesifik DNA-RBBTV (C1-CRF dan CI-CRR) digunakan dalam amplifikasi dengan PCR. Produk PCR BBTV dianalisis dengan teknikRFLP menggunakan enzim restriksi Dra I. Hasil penelitian memperkuat laporan sebelumnya bahwa penyakit kerdilpisang di Yogyakarta disebabkan oleh BBTV, dan belum ditemukan ABTV. Berdasarkan analisis RFLP, BBTV dapatdibedakan menjadi tiga kelompok. Kelompok 1 yaitu BBTV isolat Sleman dan Kota Yogyakarta dengan dua fragmenDNA berukuran sekitar 400 dan 388 bp. Kelompok 2 yaitu BBTV isolat Kulon Progo dan Gunung Kidul dengan tigafragmen DNA berukuran sekitar 400, 388, dan 323 bp. Kelompok 3 yaitu BBTV isolat Bantul dengan dua fragmen DNAberukuran sekitar 723 dan 376 bp. Penelitian tentang karakterisasi dari ketiga kelompok tersebut masih diperlukan.

Kata kunci: Abaca bunchy top virus, Banana bunchy top virus, ekstraksi DNA, penyakit kerdil, PCR, RFLP

PENGANTAR

Pisang (Musa sp.) merupakan tanamanhortikultura asal Asia Tenggara yang telah tersebarluas ke seluruh dunia termasuk Indonesia. Salahsatu kendala biologis dalam budidaya pisang danpisang abaca di Indonesia adalah adanya penyakitkerdil pisang (bunchy top) yang disebabkan olehBanana bunchy top virus (BBTV) dan di Filipinadisebabkan oleh dua virus yaitu BBTV dan Abacabunchy top virus (ABTV).

BBTV merupakan anggota genus Babuvirus,famili Nanoviridae, sedangkan ABTV merupakananggota baru dari genus yang sama. ABTVmempunyai komponen genom yang sama denganenam komponen genome BBTV dan jugamenginfeksi Musa di Asia Tenggara (Thomas,2008). BBTV dan ABTV ditularkan oleh kutu daunpisang Pentalonia nigronervosa Coquerel dantersebar luas terutama terbawa pada saatpengangkutan bibit pisang (Furuya et al., 2006).

Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia, Vol. 16, No. 1, 2010: 1–5

Penyakit kerdil pisang pertama kali dilaporkandi Fiji pada tahun 1891. Di Australia penyakit inimasuk pada tahun 1913 kemudian meluas dengancepat dan menyebabkan kematian sekitar 90 % per-tanaman pisang pada tahun 1927. Selain pada pi-sang, penyakit ini juga terdapat pada abaca (Musatextilis Nee) yang ditanam oleh satu perkebunanswasta di Banyuwangi (Semangun, 2004).

Penyakit kerdil pada abaca menjadi masalahserius di Filipina sekitar 40 tahun yang lalu,ditemukan pertama kali di Silang, Cavite tahun1915 dan menyebar ke negara bagian tempat petanimenanam abaca. Hasil identifikasi menunjukanvirus yang ditemukan pada abaca mempunyaikarakter yang sama dengan BBTV dan termasukdalam kelompok Asia (Furuya et al., 2006). Perta-nyaan muncul mengenai benar atau tidaknya kerdilabaca atau kerdil pisang disebabkan oleh virus yangsama atau berbeda. Terdapat indikasi bahwa penya-kit pada abaca (ABTV) tidak dapat ditularkan kepisang (Simmonds, 1959). Di Indonesia belum adaklarifikasi mengenai keberadaan ABTV sebagai pe-nyebab kerdil pisang.

Untuk mengetahui penyebab penyakit kerdilpisang secara jelas diperlukan teknik deteksi yangakurat. Deteksi penyebab penyakit kerdil pisang diIndonesia yang pernah dilakukan antara lain denganuji penularan melalui vektor (P. nigronervosa Coq.)(Agustina, 2000), enzyme-linked immunosorbentassay (ELISA) dan polymerase chain reaction(PCR) (Furuya et al., 2004). Penelitian ini bertujuanuntuk memastikan penyebab kerdil pisang danmengetahui adanya perbedaan dari isolat virus yangterkumpul.

BAHAN DAN METODE

Koleksi Daun Pisang Bergejala Penyakit KerdilPengambilan sampel dilakukan di beberapa da-

erah di Yogyakarta yaitu Sleman, Kota Yogyakarta,Bantul, Gunung Kidul, dan Kulon Progo. Daun ba-gian pangkal nomor 2 atau 3 dari tanaman pisangdiambil menggunakan pisau, kemudian dimasukkankotak pendingin agar daun tetap segar. Sebelum di-proses, sampel disimpan dalam freezer suhu -20ºCatau dalam keadaan kering segar (fresh dry) denganmenggunakan silika gel sebagai absorban.Deteksi Virus dengan Teknik Polymerase ChainReaction

Sampel daun yang digunakan yaitu seberat ± 0,1gram untuk ekstraksi DNA dengan menggunakanmetode Nucleon PhytoPure DNA Extraction Kit(Amersham Biosciences Inc.). Daun digerus dalam

mortar berisi 600 µl reagent 1, kemudian 200 µlreagent 2 ditambahkan. Setelah itu, ekstrak tanamandiinkubasi dalam penangas air pada suhu 65ºCselama 10 menit kemudian dalam es selama 20menit. Setelah inkubasi, ditambahkan 500 µlkloroform dingin dan 100 µl Nucleon PhytoPureDNA extraction ditambahkan, lalu dikocok selama10 menit pada suhu ruang. Selanjutnya, dilakukansentrifugasi pada 4300 rpm selama 10 menit.Supernatan hasil sentrifugasi dipindahkan ke tabungyang baru, kemudian isopropanol dingin (1:1)ditambahkan. Setelah itu, supernatan disentrifugasipada 15.000 rpm selama 5 menit dan didapatkanpelet. Pelet dicuci dengan etanol 70% dandisentrifugasi pada 15.000 rpm selama 5 menit.Pelet dikeringanginkan selama 10 menit di suhuruang, kemudian disuspensikan dengan bufer TEsebanyak 30–50 µl, diaduk sampai pelet DNAtersuspensi secara sempurna.

Primer yang digunakan pada analisis ini terdiridari dua pasang primer. Primer S-CRF (5’-GGGGCTTATTATTACCCCCAGC-3’) dan S-CRR(5’-AGCGCTTACCTGGCGC AGCACTAACT-3’)yang mencetak atau memperbanyak stem-loopCommon Region (CR-SL) dari BBTV dan ABTVyang menghasilkan pita DNA dengan ukuran samasebesar sekitar 1100 bp. Kemudian primer C1-CRF(5’-CAGGCGCACACCTTGAGAAACGAAAGGGAA-3’) dan C1-CRR (5’-GGAAGAAGCC TCTCATCTGCTTCAGAGAGC-3’) yang mencetakDNA-1 yang hanya terdapat pada BBTV denganukuran pita DNA sekitar 1100bp (Su, 1999). Apa-bila sampel teramplifikasi dengan primer S-CRmaka sampel positif terinfeksi BBTV atau ABTV,apabila sampel teramplifikasi dengan primer C1-CRmaka sampel positif terinfeksi BBTV dan apabilatidak teramplifikasi maka sampel positif terinfeksiABTV.

Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR(GeneAmp PCR System 9700). Reaksi PCRmenggunakan KOD polymerase (Novagen) dandilakukan dengan 30 siklus. Untuk primer C1-CRF/C1-CRR, denaturasi pada 94ºC selama 4 menitdan suhu 94ºC selama 30 detik, annealing 56ºCselama 30 detik, extension pada 72ºC selama 1menit dan 72ºC selama 10 menit. Untuk primerS-CRF/S-CRR, denaturasi pada 94ºC selama 4menit dan pada suhu 94ºC selama 30 detik,annealing pada 60ºC selama 30 detik, extensionpada 72ºC selama 1 menit dan 72ºC selama 10menit (Su, 1999). Hasil amplifikasi DNA selanjut-nya divisualisasi dengan elektroforesis dalamPolyacrylamide Gel Electrophoresis 6% (PAGE),dengan target DNA fragmen sebesar 1111 bp.

Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia Vol. 16 No. 12

Analisis DNA dengan Retriction Fragment LengthPolymorphism

Hasil amplifikasi PCR pada tiap sampeldipindahkan sebanyak 5 µl ke tabung baru,kemudian DNA dipotong dengan menggunakanenzim restriksi Dra I. Campuran reaksi berupa 5 µlDNA ditambah 1 µl enzim restriksi dan 1,5 µl buferenzim (10×). Volume campuran reaksi ditambahkanakuades sampai 15 µl dan diinkubasi pada 37ºCselama 2–3 jam di dalam penangas air (Yasmin etal., 2005). Hasil amplikasi DNA selanjutnyadivisualisasi dengan elektroforesis dalam PAGE6%.

HASILDAN PEMBAHASAN

Deteksi BBTV dan /atau ABTV dengan PCRHasil amplifikasi PCR menunjukkan bahwa

penyakit kerdil pisang di daerah Yogyakarta

disebabkan oleh BBTV. Pita DNA berukuran sekitar1111 bp berhasil teramplifikasi menggunakanpasangan primer S-CRF/S-CRR dan C1-CRF/C1-CRR dari semua sampel (Gambar 1 dan Gambar 2).Hal ini sejalan dengan hasil penelitian Furuya et al.(2004), yang meneliti pisang yang bergejala kerdildi Kebun Plasma Nutfah Pisang Yogyakarta dansesuai dengan ukuran genom DNA-1 (DNA-R)BBTV sebesar 1111 bp (Vishoi, et al., 2009). ABTVbelum terdeteksi pada pisang bergejala kerdil diYogyakarta, kemungkinan karena masih terbatasnyajumlah sampel yang diuji. Sampel yang diuji hanyasatu untuk tiap wilayah Yogyakarta.

Mengingat PCR memiliki tingkat sensitivitasdan ketelitian yang tinggi, maka metode inimempunyai harapan untuk dikembangkan lebihlanjut sebagai alat deteksi BBTV dalam rangkapengelolaan penyakit tersebut.

Gambar 1. Visualisasi fragmen DNA hasil amplifikasi PCR menggunakan primer S-CRF & S-CRR padaPAGE 6%. M: DNA marker 1 kb ladder, Line 1: Sleman, Line 2: Kota Yogyakarta, Line 3:Bantul, Line 4: Kulon Progo, dan Line 5: Gunung KidulTanda panah menunjukkan pita DNA hasil amplifikasi

Gambar 2. Visualisasi fragmen DNA hasil amplifikasi PCR menggunakan primer C1-CRF & C1-CRRpada PAGE 6%. M: DNA marker 1 kb ladder, Line 1: Sleman, Line 2: Kota Yogyakarta,Line 3: Bantul, Line 4: Kulon Progo, dan Line 5: Gunung KidulTanda panah menunjukkan pita DNA hasil amplifikasi

Priani et al.: Deteksi dan Deferensiasi Virus Kerdil Pisang dengan Teknik PCR-RFLP 3

M 1 2 3 4 5 M

M 1 2 3 4 5 M

1111 bp

1111 bp

Keberhasilan teknik PCR dalam mendeteksivirus pada tanaman pisang menunjukkan bahwateknik tersebut dapat dipilih sebagai alat deteksi dinidalam rangka diagnosis BBTV. Keberhasilan dankeakuratan diagnosis penyakit tanaman akan sangatmenentukan keberhasilan dalam penentuan strategipengendalian penyakit. Akhir-akhir ini perbanyakantanaman pisang dilakukan dengan teknik kulturjaringan, sehingga penggunaan eksplan bebas virushasil skrining dengan teknik PCR akan sangatberguna dalam penyediaan sumber bibit sehat danmengurangi sumber inokulum awal bagi penularanpenyakit di lapangan.

Diferensiasi isolat BBTV di YogyakartaTeknik RFLP dapat digunakan untuk

mengetahui hubungan kekerabatan maupun variasigenetik dari beberapa isolat BBTV yang ditemukan.Berdasarkan runutan nukleotida segmen DNA-Rdari isolat BBTV asal Kanpur (India) terdapat duasitus pemotongan dengan enzimDra I (TTT↓AAA)yang menghasilkan tiga potongan pita DNAmasing-masing berukuran sekitar 404, 386, dan 321bp (Raj & Vishnoi, 2006).

Analisis RFLP DNA BBTV dengan enzimDra Ipada sampel penelitian yang berasal dari Yogyakartamenghasilkan tiga kelompok berdasarkan polapotongan DNA. Kelompok I terdiri dari BBTVisolat Sleman dan Kota madya Yogyakarta dengandua fragmen DNA masing-masing berukuransekitar 400 dan 388 bp. Kelompok 2 terdiri dariisolat Kulon Progo dan Gunung Kidul dengan tiga

fragmen DNA masing-masing berukuran sekitar400, 388, dan 323 bp. Sedangkan kelompok 3 hanyaterdiri dari BBTV isolat asal Bantul dengan duafragmen DNA masing-masing sekitar 723 dan 376bp. Pada isolat Kulon Progo terdapat pita DNABBTV berukuran 1111 bp, pita tersebut merupakanDNA yang tidak terpotong oleh enzimDra I. Selainpita DNA yang tidak terpotong, terdapat pitaberukuran sekitar 700 bp, pita tersebut tidaktermasuk ke dalam pola potongan DNA BBTVmelainkan pita DNA tanaman atau DNA lain. Halini menunjukkan bahwa hasil PCR tidak murnikarena masih terdapat pita DNA non-target.

Perbedaan pola potongan pita DNA BBTV padabeberapa isolat Yogyakarta dapat diakibatkanadanya mutasi gen. Jika mutasi terjadi pada situspemotongan maka akan menyebabkan situspemotong tersebut berubah. Selain itu geneticrearrangement dapat menyebabkan situs tersebuttidak lagi dikenali oleh enzim, atau enzim restriksiakan memotong daerah lain yang berbeda. Prosesini menyebabkan terbentuknya fragmen-fragmenDNA yang berbeda ukurannya dari satu organismeke organisme lainnya. Polimorfisme ini selanjutnyadigunakan untuk membuat pohon filogeni/dendogram kekerabatan kelompok (Suryanto,2003).

Adanya bukti awal BBTV di Yogyakartadan sekitarnya dapat dikelompokan menjadi tigakelompok mengisyaratkan perlunya kajian lanjutantentang karakterisasi ketiga kelompok virustersebut.

Gambar 3. Visualisasi pita DNA BBTV hasil pemotongan menggunakan enzim Dra I pada PAGE 6% M:DNA marker 1 kb ladder, Line 1: Sleman, Line 2: Kota Yogyakarta, Line 3: Bantul, Line 4:Kulon Progo, dan Line 5: Gunung KidulTanda panah menunjukkan pita DNA hasil pemotongan dengan enzim Dra I

Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia Vol. 16 No. 14

M 1 2 3 4 5 M

1111 bp

711 bp400 bp388 bp

323 bp

UCAPAN TERIMAKASIH

Penulis mengucapkan terima kasih kepadaProject ACIAR dengan judul Integrated CropProduction of Banana in Indonesia and Australiabagian aktivitas Validate and Confirm MitigationStrategies for the Management of BBDP, nomorproject HORT/2008/040 yang telah membiayaisebagian dari penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA

Agustina, L. 2000. Pengaruh Makan InokulasiBerantai Pentalonia nigronervosa (Homoptera:Aphididae) terhadap Penularan Penyakit KerdilPisang (Bunchy Top). Skripsi. Fakultas Pertanian.Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.Furuya, N., S. Somowiyarjo, & K.T. Natsuaki.2004. Virus Detection from Lokal Banana Cultivarsand The First Molecular Characterization of BananaBunchy Top Virus in Indonesia. Journal ofAgricultural Science 49: 75–81.Furuya, N., T.O. Dizon, & K.T. Natsuaki. 2006.Molecular Characterization of Banana Bunchy TopVirus and Cucumber Mosaic Virus from Abaca(Musa textilisNee). Journal of Agricultural Science,Tokyo University of Agriculture 51: 92–101.Raj, S.K. & R. Vishnoi. 2006. Banana Bunchy TopVirus Isolate Kanpur Segment DNA-1, CompleteSequence. http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi, modified 8/01/10.Simmonds, N.W. 1959. Bananas. John Wiley &Sons Inc, New York. 466 p.

Su, H.-J. (1999) Development and Application ofMolecular Diagnostic Probes for Detection,Characterization, and Management of BananaViruses. p. 35–51. In A.B. Molina & V.N. Roa(eds.), Advancing Banana and Plantain R&D inAsia and the Pacific: Proceedings of the 9thINIBAP-ASPNET regional Advisory Committeemeeting held at South China AgriculturalUniversity, Guangzhou, China, 2–5 November1999, INIBAP, Montpellier, France.Sulandari, S., Sumardiyono, S. Somowiyarjo,Triharso & Ambarwati H. 1994. InventarisasiPenyakit Virus pada Tanaman Pisang di DaerahIstimewa Yogyakarta. Laporan Penelitian,Yogyakarta. 27 p.Sunarjono, H. 2002. Budidaya Pisang dengan BibitKultur Jaringan. Penebar Swadaya, Jakarta. 96 p.Suryanto, D. 2003. Melihat KeanekaragamanOrganisme Melalui Beberapa Teknik GenetikaMolekuler. http://library.usu.ac.id/download/fmipa/biologi-dwis.pdf, modified 20/4/10. 12 p.Thomas, J.E. 2008. Banana Bunchy Top Virus.p. 94–100. In Mahy B.W.J & M.H.V. VanRegenmortel (eds.), Desk Encyclopedia of Plantand Fungal Virology. Elsevier Ltd, London.Vishnoi, R, S. Krishna R, & Vivek P. 2009.Molecular characterization of an Indian isolate ofBanana bunchy top virus based on six genomicDNA components. Virus Genes 38: 334–344.Yasmin, T., S.M. Saqlain Naqvi, H.Shah, &S.Khalid. 2005. RFLP-based Relationship ofPakistani Isolate of Banana Bunchy Top Virus withSouth Pacific Virus Group. Pakistan Journal ofBotany 37: 399–406.

Priani et al.: Deteksi dan Deferensiasi Virus Kerdil Pisang dengan Teknik PCR-RFLP 5