deterioro cerebeloso por aislamiento social temprano

REVISTA CHILENA DE NEURO-PSIQUIATRÍA56

DETERIORO CEREBELOSO INDUCIDO POR AISLAMIENTO SOCIAL TEMPRANO: ESTUDIO MORFOLÓGICO E INMUNOCITOQUÍMICO

ARTÍCULO ORIGINAL

Deterioro cerebeloso inducido por aislamiento socialtemprano: estudio morfológico e inmunocitoquímicoCerebellar Impairment Induced by Early Social Isolation:A Morphological and Immunocytochemical StudyRodrigo Pascual

In the present study, we analyzed the effect of early adverse experiences on the morpho-functional development of the cerebellar cortex by using the social isolation model. One hun-dred and three Sprague-Dawley rats were divided in two experimental groups 18 days afterbirth: (a) a control group (SC; 3-4 animals per cage) and (b) an isolated group (IC). IC ratswere maintained in small, individual compartments until 32 after birth (P32). Half of the ani-mals of both groups were sacrificed for neuronal studies, and the remaining IC rats werehoused under SC conditions for re-socialization between postnatal days 32 and 62. Theywere subsequently sacrificed for neuronal analysis. At both ontogenetic stages (P32 and P62)the dendritic development and the expression of calbindin-D28k (CBD) were studied in vermalPurkinje cells. The results obtained indicate that cerebellar Purkinje cells of IC animals show asignificant dendritic atrophy associated with a reduction in the expression of CBD. In addition,the re-socialization process was able to restore the expression of CBD, but the structural impair-ment remained. Thus, the early adverse postnatal experiences induced by the social isolationmodel alter the morphological and functional development of vermal Purkinje cells.

Key Words: adverse experiences, cerebellar development, dendritic arborizationRev Chil Neuro-Psiquiat 2001; 39: 56-67

Laboratorio de Neurobiología, Facultad de Salud, Universidad Católica del Maule, Talca (Chile), y Unidad de Fisiología Médica,Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Barcelona, Bellaterra (España).

Recibido: julio de 2000Aceptado: diciembre de 2000

Introducción

L as experiencias postnatales adversas constitu-yen importantes factores de riesgo que podrían

contribuir al desarrollo de diversos trastornosneuropsiquiátricos en individuos genéticamentevulnerables (12, 13, 14). En estudios pioneros Spitz(45) demostró que algunos niños criados enorfanatos o bien hospitalizados por largos perío-dos de tiempo presentaban alteraciones con-ductuales, caracterizadas por esterotipias motoras,

apatía, labilidad emocional y escasa interacciónsocial, las cuales han sido confirmadas en estudiosposteriores (40, 43, 46). El posible sustratoneurobiológico que podría dar cuenta de estosdesórdenes conductuales resulta obviamente difí-cil de abordar en estudios con seres humanos. Eneste contexto, la utilización de modelos animalesha sido particularmente útil considerando las li-mitaciones que comportan los estudios clínicosque, al margen de su incuestionable valor, son ge-neralmente retrospectivos y con numerosas varia-

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bles difíciles de controlar. Al respecto, el modeloanimal que se ha utilizado con mayor frecuenciaes el aislamiento social temprano en ratas de la-boratorio, donde se inducen condiciones ambien-tales adversas y evalúan luego sus consecuenciasconductuales y neuronales (17, 27, 33).

Se ha postulado que una de las zonas involucradasen las alteraciones neuroconductuales descritas se-ría el cerebelo, estructura que no sólo participa enlas clásicas funciones de regulación motora sino tam-bién afectivas (28, 39) y cognitivas (12, 20). Uno delos primeros autores en sugerir la potencial vulnera-bilidad del cerebelo frente a la deprivación social fuePrescott (37), hipotetizando que el comportamien-to de tipo autista observado en monos expuestos aaislamiento temprano obedecería en parte a altera-ciones morfofuncionales localizadas en el tejidocerebeloso. Esta hipótesis ha sido apoyada por estu-dios electrofisiológicos realizados en la cortezacerebelosa de monos criados en aislamiento, dondese observan registros electrocorticográficos clara-mente anormales en relación con el trazado de losanimales control (criados bajo condiciones socialesnormales) (19), hecho que es consistente con des-cripciones clínicas donde se establecen relacionesentre algunos desórdenes afectivos y disfuncionescerebelosas (12, 39). Estos resultados han sido apo-yados por estudios nuestros donde hemos demos-trado que la deprivación sensoriomotriz y socialtemprana altera tanto el desarrollo estructural(dendrítico) (35) como la expresión de calbindina-D28k (CBD) en las células de Purkinje (36). Al res-pecto se debe recordar que estas neuronas expresanuna concentración de CBD notablemente alta (clavepara la regulación de la concentración intracelularde Ca2+), cuyo nivel de expresión ha sido utilizadocomo indicador del estado funcional de las neuronasde Purkinje. En este contexto, diversas evidencias ex-perimentales (11, 18, 22, 23, 32) y anatomopa-tológicas (2, 21, 22, 24, 29) indican que la CBD actúacomo un sistema neuroprotector regulando las po-sibles fluctuaciones de Ca2+ intracelular a objeto deevitar que este catión alcance niveles tóxicos.

Si bien las alteraciones cerebelosas descritas in-dican que las influencias ambientales adversas pue-den alterar el desarrollo morfofuncional del córtexcerebeloso, resulta fundamental determinar si és-

tos déficits son transitorios o permanentes, hechono demostrado hasta ahora. Por tanto, el objetivoprincipal del presente estudio fue evaluar si la res-titución del entorno social normal recupera las al-teraciones estructurales (dendríticas) y funcionales(expresión de CBD) inducidas en la cortezacerebelosa por el aislamiento social temprano.

Materiales y Métodos

Animales y Diseño Experimental

En esta investigación se emplearon 103 ratasalbinas de la cepa Sprague-Dawley que a los 18 díasde vida (P18) fueron separadas de sus madres yasignadas aleatoriamente a dos grupos de estudio:(a) grupo aislado (IC; n= 55), donde cada rata fuecolocada en compartimentos pequeños (10 x 10 x10 cm), impidiéndoles todo tipo de interacciónsocial, y (b) grupo control o social (SC; n= 48),cuyos animales fueron colocados grupalmente (3-4 ratas) en jaulas de dimensiones estándar (32 x29 x 15 cm). A los 32 días de vida (P32), el 50% delas ratas de cada grupo fue sacrificado para su es-tudio neuronal. Con el objeto de estudiar el posi-ble efecto compensatorio de la estimulación socialsobre el deterioro neuronal, los animales restan-tes del grupo IC fueron retirados de sus compar-timentos de aislamiento y colocados grupalmente(3-4 animales por jaula; ambiente social normal)durante 30 días consecutivos (P32-P62). En tan-to, los animales del grupo SC continuaron porigual período en su condición habitual.

Durante la fase experimental las ratas fueronmantenidas en el laboratorio con agua y alimen-tación ad-libitum, bajo condiciones ambientalescontroladas en cuanto a temperatura, ruido am-biental y ciclo día-noche de 12 horas luz/12 horasoscuridad (regulado por un reloj control).

Procedimiento de impregnación cerebral

Método de Golgi-Cox-Sholl

Una vez cumplidos los 32 o 62 días de vida losanimales fueron sacrificados bajo anestesia, proce-diéndose a la disección “en fresco” de sus respectivos



cerebelos (IC: 31; SC: 31), dejándolos en solucionesde dicromato de potasio (K

2Cr

2O

7), cloruro de mer-

curio (HgCl2) y cromato de potasio (K

2CrO

4), todas

al 5%. Cada especimen fue conservado en un frascoindividual, en completa oscuridad y a temperaturaambiente por 60 días. Finalizada esta fase de fijación-impregnación, se procedió a su lavado y deshidrata-ción en soluciones de alcohol-acetona (50-50%, 24horas) y alcohol-éter (50-50%, 4 horas), siendo lue-go colocados en celoidina al 5% durante una sema-na y al 12% los siguientes 7 días. Posteriormente loscerebelos fueron incluidos en cubos de celoidina al12% y solidificados en vapores de cloroformo. Unavez estabilizado el tejido se realizaron cortes sagitalesde la corteza cerebelosa vermiana (120 µm de gro-sor), siendo colocados en cápsulas de vidrio,rehidratados en PBS (0.1 M; pH 7.4) e inmersos enuna solución de ácido oxálico dihidrato y sulfito depotasio (ambas al 5%) por 3 minutos y nuevamentedeshidratados en soluciones de alcohol-éter (50-50%) y alcohol-cloroformo (50-50%). Finalmentefueron montados en portaobjetos gelatinados, acla-rados con α-terpineol y cubiertos con el medio demontaje DPX (Fluka). Se debe destacar que este pro-cedimiento histológico (especialmente indicado paraimpregnar neuronas en proceso de desarrollo) mar-ca el soma neuronal y prácticamente todas lasdendritas en un porcentaje que fluctúa entre el 5-10% de las células (42). Esta selectividad permite rea-lizar un adecuado análisis neuronal morfométricosin el inconveniente de registrar sobreposiciones en-tre las proyecciones dendríticas de neuronas vecinas.

Método Inmunocitoquímico

Los animales (IC: 24; SC: 17) fueron aneste-siados con pentobarbital (50 mg kg-1 i.p.) y luegoperfundidos por vía intracardíaca con suero sali-no al 0.9% (heparinizado) durante 1 minuto, se-guido de una solución de paraformaldehído al 4%preparado en PBS (0.1 M; pH 7.4; 4°C) durante 5-7 minutos. Inmediatamente después los cerebelosfueron extraídos y dejados en el mismo fijador por24 horas a 6°C, para luego ser trasladados a unasolución crioprotectora de sacarosa al 20% y al-macenados a 4°C por 48 horas. Cumplida esta fasese realizaron cortes sagitales vermianos de 40 µm

con un micrótomo de congelación, siendo colo-cados en una mezcla de PBS, Tritón X-100 (0.3%;Fluka, Buchs, Suiza) y suero fetal de cabra (FCS;ICN, Costa Mesa, USA), en constante agitación ya 4°C por 1 hora. Enseguida fueron incubados enel anticuerpo primario policlonal anti-calbindina-D28k (1:2000, Chemicon) durante 24 horas, enconstante agitación. Cumplida esta etapa se reali-zaron 4 lavados adicionales con PBS-Tritón X-FCS(1 hora c/u), incubándose durante 48 horas en elanticuerpo secundario flurorescente IgG anti-cianina 3.18 (1:2000; Jackson Immunoresearch,West Grove, USA). Al día siguiente se realizaron 4lavados adicionales con PBS-Tritón X-FCS (1 horac/u), para luego proceder a su montaje enportaobjetos gelatinados, los cuales fueron seca-dos y deshidratados en soluciones progresivas dealcohol (96%-100%), clarificados en metilsa-licilato y cubiertos en el medio de montaje DPX(Fluka) (36).

Evaluación neuronal

Morfométrica

Se analizaron 368 cortes vermianos tratados conel método de Golgi-Cox-Sholl, los cuales fueron ob-servados bajo microscopía óptica (Olympus) si-guiendo una dirección rostro-caudal, desde ellóbulo 1 al 10 (de acuerdo con la terminología ana-tómica de Larsell, 1952). La selección de las célulasde Purkinje se realizó considerando los siguientescriterios: (i) neuronas localizadas en la regiónvermiana, (ii) árbol dendrítico simétrico y para-lelo al plano de sección, (iii) impregnación homo-génea, y (iv) ausencia de sobreposición neuronal.Se seleccionaron y dibujaron bajo cámara lúcida1.844 células de Purkinje, 1.006 pertenecientes alas ratas sacrificadas el día P32 (SC: 549; IC: 457)y 838 neuronas pertenecientes a los animales sa-crificados el día P62 (SC: 436; IC: 402). Una vezfinalizada la reproducción neuronal bajo cámaralúcida (400x) se procedió a cuantificar el períme-tro dendrítico por neurona (µm), realizándose untrazado lineal continuo sobre cada célula dibuja-da, uniendo los terminales dendríticos y midien-do luego su perímetro con un lápiz electrónico


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calibrado (cada centímetro recorrido en el papelequivalía a 32 µm del preparado histológico).

Inmunohistoquímica

Se analizaron 396 cortes parasagitales, 209 delos cuales pertenecían a los animales sacrificadosel día 32 (SC: 96; IC: 113) y 164 provenían de losanimales estudiados el día 62 (SC: 74; IC: 85). Lainmunorreactividad a calbindina-D28k fue anali-zada por medio de un microscopio Olympus BX-40, equipado con un sistema de epifluorescencia yuna cámara digital (Olympus DP-20), situada enel extremo ocular del microscopio. Cada seccióncerebelosa fue captada por la microcámara y pro-cesada en un computador Apple Power Macintosh,equipado con un programa de análisis de imáge-nes (NIH), cuantificándose el porcentaje de sec-ciones vermianas que presentaban “bandas” deinmunofluorescencia negativa por cada lóbulocerebeloso. A modo de criterio, se registraron to-das las zonas que presentasen una banda negativasuperior a 100 µm de diámetro.

Análisis de datos

Los datos obtenidos fueron analizados estadís-ticamente con la prueba t de Student para datosno pareados y Z para diferencias de proporciones,empleando el programa estadístico StatView.

Resultados

Desarrollo dendrítico

Inmediatamente después del período de privaciónsocial (P32) se observó que las células de Purkinjepertenecientes a las ratas criadas en condiciones ais-ladas presentaron una menor arborización respectode sus homólogas pertenecientes al grupo control,constatándose una reducción del 26% en su períme-tro dendrítico (p<0.05) (Figura 1). Este deterioro semantuvo incluso después de 30 días de interacciónsocial normal (P62), donde la diferencia aumentó al51% (p<0.01). Analizando la Figura 1 desde un puntode vista ontogenético se observó que las células dePurkinje de las ratas control (SC) experimentaron

un marcado crecimiento dendrítico (aproximada-mente un 125%) entre los días postnatales 32 y 62días de edad, desarrollo que en las ratas aisladas (IC)alcanzó sólo al 13.3%. En la Figura 2 se muestranmicrofotografías de células de Purkinje impregna-das con el método de Golgi-Cox-Sholl, donde esposible observar una menor complejidad dendríticaen las células pertenecientes a ratas criadas en aisla-miento, tanto a los 32 (Figura 2B) como a los 62 díasde edad (Figura 2D).

Inmunorreactividad a calbindina-D28k (CBD)

En la Figura 3A se muestra el porcentaje de ban-das carentes de inmunorreactividad a CBD por ló-bulo cerebeloso, observándose que las ratas aisladas(IC) de 32 días presentaron un significativo descen-so en la expresión de esta proteína, alteración espe-cialmente marcada en los lóbulos cerebelosos 3 a 8.A diferencia de lo observado en el desarrollo estruc-tural de las células de Purkinje, la disminución en elcontenido de CBD se recuperó notablemente luegode la restitución de su ambiente social habitual entrelos días postnatales 32 y 62 (Figura 3B), sugiriendouna importante capacidad de recuperación funcio-nal. En la Figura 4 se muestran imágenes represen-tativas de los datos señalados, donde es posibleobservar una menor expresión de CBD en las sec-ciones vermianas de las ratas aisladas. Así, las imáge-nes analizadas a un aumento de 400x (Figura 4 a yb) dejan en evidencia lo irregular del patrón deinmunofluorescencia a CBD registrado en los ani-males del grupo IC (Figura 4b), hecho que contrastaclaramente con lo regular del marcaje cerebeloso enlas ratas control (SC). Los perfiles neuronianos cap-tados a un aumento mayor (1.000x) muestran quela ausencia de células de Purkinje en la zona deinmunorreactividad negativa corresponden realmen-te a una menor expresión de CBD más que a muerteneuronal (flechas en la Figura 4d).

Discusión

Desarrollo dendrítico

Las células de Purkinje de las ratas sometidas adeprivación social mostraron un menor desarro-



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P32 P62

Edad postnatal(días)

Per

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ron

a(m

icra

s)Grupo control Grupo aislado

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* *

Figura 1. Arborización dendrítica en neuronas de Purkinje pertenecientes a ratas control (SC) y aisla-das (IC) de 32 (P32) y 62 (P62) días de vida. * p<0.05; ** p<0.01 (t-test).

P32

P62

Figura 2. Neuronas de Purkinje impregnadas con el método de Golgi-Cox-Sholl. A y C:ratas control (SC), B y D: ratas aisladas (IC), de 32 y 62 días de vida.


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Figura 3. Porcentaje de secciones cerebelosas con bandas de inmunofluorescencia negativa a calbindina-D28k (CBD) a los 32 (A) y 62 (B) días postnatales.

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Grupo control Grupo aisladoA

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Lóbulos cerebelosos

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Grupo control Grupo aisladoB



llo dendrítico en relación con los animales con-trol. Este resultado es consistente tanto con la hi-pótesis postulada por Prescott (37) como en lodescrito por nuestro grupo en estudios previos(35). Hace algunos años, Floeter y Greenough (16)evaluaron el efecto que produce el aislamientosocial temprano sobre la diferenciación de las cé-lulas de Purkinje en monos. Contrariamente a loobservado en la presente investigación, ellos nodetectaron diferencias significativas en relacióncon los animales control. Esta discrepancia puedetener su origen ya sea en la región cerebelosa ana-lizada y/o en el método de evaluación morfo-métrico empleado. En primer lugar, estos autoresestudiaron muestras neuronales tomadas desde elarquicerebelo (paraflóculo ventral, nódulo yflóculo), región filogenéticamente antigua y cuyafunción principal se relaciona con la función ves-tíbulo-ocular. En el presente estudio, en cambio,se evaluaron neuronas paleocerebelosas (región

vermiana), anatómica y funcionalmente muchomás relacionada con los desórdenes conductualesy electrofisiológicos observados en animales deexperimentación (8, 19). En este sentido, numero-sas evidencias clínicas, anatomopatológicas y deneuroimágenes han mostrado que el vermis es unade las regiones cerebelosas involucradas en algunostrastornos neuropsiquiátricos (5, 6, 20, 30, 47). Ensegundo lugar, la evaluación morfométrica emplea-da en el presente estudio (perímetro dendrítico)informa principalmente sobre el grado de expan-sión de las ramas dendríticas distales, las cuales seencuentran en proceso de crecimiento y remode-lación durante el período en que se manipularonlas variables ambientales (3, 4); en tanto que Floetery Greenough utilizaron el método de círculosconcéntricos (42) que informa sobre el número deintersecciones dendríticas por neurona. Este pro-cedimiento resulta mucho más adecuado para elestudio de células con una menor complejidad es-

SC SC

Figura 4. Imágenes inmunofluorescentes de la corteza cerebelosa tratada conanticuerpos para calbindina-D28k (CBD) en ratas control (SC) y aisla-das (IC) (a y b: 400x; c y d: 1000x). M: capa molecular; P: capa decélulas de Purkinje; G: capa granular interna.

a

d

b

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tructural como es el caso de las neuronas pirami-dales de la corteza cerebral, que suelen presentarentre 20 y 40 segmentos dendríticos, en tanto quelas células de Purkinje poseen un número muy su-perior (entre 200 y 300 ramas por célula) (25), dis-tribuidas en un espacio cortical relativamenterestringido, muchas de las cuales escaparán al re-gistro cuando se utiliza el método de Sholl.

En cuanto al desarrollo dendrítico evaluado alos 62 días de vida, se observó que las ratasdeprivadas y luego expuestas a un entorno socialnormal continuaron presentando un significativoretraso estructural. De hecho, las diferencias en-tre ambos grupos fueron incluso mayores que lasdetectadas el día P32. Comparando la evolucióndel crecimiento dendrítico entre P32 y P62 se ob-servó que las ratas controles incrementaron suarborización mucho más que los animales del gru-po deprivado, donde también se detectó ciertogrado de crecimiento dendrítico aunque muy in-ferior. Una posible interpretación de estos datoses que las células de Purkinje de los animales ais-lados presenten una velocidad de diferenciaciónneuronal menor que la de sus pares control, al-canzando un nivel de desarrollo similar pero enuna etapa ontogenética posterior al día P62, dan-do la apariencia de un deterioro estructural per-manente. Otra alternativa es que realmente existaun retraso que más tarde no será compensado dadala menor plasticidad existente a medida que la ratase aproxima a la edad adulta (alrededor de los 70-80 días). Para dilucidar este punto sería necesarioestudiar a más largo plazo si las células de Purkinjepertenecientes al grupo aislado logran alcanzar elgrado de arborización presente en las ratas del gru-po control. En todo caso, existen evidencias queapoyan la hipótesis de que los cambios estructu-rales inducidos por experiencias postnatales tem-pranas son más o menos permanentes. Porejemplo, Katz y Davies (26) observaron que la ga-nancia de peso cortical producida por estimu-lación sensorio-motriz temprana no es revertidaaunque los sujetos sean posteriormente manteni-dos en aislamiento por un período adicional de30 días. Camel et al. (9) encontraron resultadossimilares al analizar el desarrollo dendrítico enneuronas de la corteza visual, cuyo incremento

inducido por la estimulación sensorio-motora semantiene a pesar de exponer luego a los animalesa un ambiente socialmente deprivado.

Resulta difícil identificar cuál o cuáles seríanlas causas que potencialmente produjeron el de-terioro dendrítico en las células de Purkinje. Alrespecto, no se pone en duda la existencia de unnexo entre el ambiente que rodea al individuo y elmicromedio que rodea a las neuronas; el proble-ma es lograr identificar la naturaleza neurobio-lógica de esta relación. Ciertamente es un aspectomuy complejo y difícil de resolver con los antece-dentes de que disponemos en la actualidad; sin em-bargo, considerando que el aislamiento social serealizó durante el período crítico del desarrolloneuronal, se pueden establecer ciertas aproxima-ciones a la luz de algunos de los mecanismosinvolucrados en la ontogenia dendrítica de estasmacroneuronas. En primer lugar, las aferenciasque reciben las células de Purkinje resultan de-terminantes para su diferenciación postnatal. Esnecesario recordar que el árbol dendrítico de cadaneurona de Purkinje recibe, en promedio, alre-dedor de 200.000 sinapsis, el 75% de las cualesprovienen de las neuronas granulares (fibras pa-ralelas), en tanto que el 25% restante se distribu-ye entre las aferencias provenientes de lasneuronas estrelladas, en cesto y fibras trepadoras(olivocerebelosas). Al respecto, el potencial papelneurotrófico que pueden jugar estas aferenciasgranulares sobre el desarrollo dendrítico de lasneuronas de Purkinje ha sido sugerido por estudioshistológicos realizados en ratones mutantes comoel weaver, cuyo cerebelo presenta un déficit total oparcial de neuronas granulares. En este caso las cé-lulas de Purkinje, privadas de su principal fuenteaferente, exhiben un notable deterioro del creci-miento dendrítico (38, 44). Estos resultados hansido ampliados por estudios in vitro donde es posi-ble observar que el árbol dendrítico de las neuronasde Purkinje se desarrolla sólo en presencia de célu-las granulares (7). El hecho que la interacción célu-la-célula sea necesaria para una diferenciaciónneuronal óptima sugiere que entre las estructuraspresinápticas (fibras paralelas) y postsinápticas(dendritas de Purkinje) debe existir algún tipo demensaje que dé cuenta de esta dependencia. En este



sentido, se ha demostrado que durante el períodode crecimiento dendrítico las células granularesexpresan neurotrofina 3 (NT-3) (15), mientras quelas células de Purkinje expresan el receptor tirosinakinasa C (trkC) donde la NT-3 actúa como ligan-do. Consistentemente, cuando se administra NT-3in vitro, ocurre un marcado rebrote dendrítico (31),asociado a un incremento en los niveles decalbindina-D28k. Estos antecedentes indican que laNT-3 es al menos uno de los agentes epigenéticosque participa en el proceso de diferenciación de lascélulas de Purkinje, cuyos niveles de expresión encondiciones de aislamiento social pretendemos es-tudiar en el futuro.

Expresión de calbindina-D28k (CBD)

Como se ha señalado, la expresión de CBD enlas células de Purkinje de las ratas aisladas dismi-nuyó significativamente en relación con los ani-males control, constatándose amplias regionescarentes de inmunorreactividad. Considerandoque el desarrollo de las neuronas de Purkinje co-rre paralelo al aumento ontogenético de CBD, sudéficit podría estar relacionado con la menorarborización dendrítica detectada en las ratas ais-ladas. Sin embargo, estudios histológicos einmunohistoquímicos recientes no parecen apo-yar esta hipótesis ya que las neuronas de Purkinjeque caracen totalmente de CBD (ratones mutantes,CBD -/-) desarrollan una arborización y sinapto-génesis normal (1). Es posible que los potencialesefectos deletéreos de la ausencia parcial o total deCBD sean compensados por otras proteínasfijadoras de Ca2+ como la parvalbúmina, que tam-bién es expresada por las células de Purkinje (10).La única disfunción objetiva detectada en la fisio-logía de aquellas neuronas de Purkinje que no ex-presan CBD corresponde a diferencias en la curvade incremento de Ca2+ intracelular, en particular desu fase rápida (1). Se debe destacar que estas evi-dencias en ningún caso indican que la disminuciónde CBD sea un evento inocuo para las neuronas;por ejemplo, si ocurren concomitantemente fenó-menos fisiopatológicos que determinen incremen-tos atípicos de Ca2+ intracelular (como en la hipoxia/isquemia), puede ocurrir un importante daño ce-

lular con la subsecuente degeneración y muerteneuronal. De hecho, estudios in vitro han demos-trado que sólo las neuronas inmunorreactivas aCBD resisten niveles elevados de Ca2+ intracelular,en tanto que sus homólogas restantes que expresanniveles bajos de CBD degeneran irremediablemen-te (11, 32). Luego, es probable que las neuronas dePurkinje bajas en CBD sean realmente vulnerablessi los sujetos son expuestos a condiciones ambien-tales adversas (estresantes).

Uno de los agentes que regulan los niveles deCBD en las células de Purkinje es el factor decrecimiento IGF-I (“insulin-like growth fac-tor”). Las neuronas del complejo olivar inferior–cuyos axones (fibras trepadoras) inervan a lascélulas de Purkinje– liberan IGF-I que resultaesencial para el desarrollo y mantención de laarquitectura dendrítica, en particular de sus es-pinas. Al respecto, Nieto-Bona et al. (34) han de-mostrado que la inhibición del IGF-I en lasneuronas olivares reduce significativamente laexpresión de CBD en las células de Purkinje aso-ciada a una importante pérdida de espinasdendríticas, sugiriendo que este factor trófico nosólo regula la expresión de CBD sino que parti-cipa también en eventos de plasticidad neuronal.Cabe la posibilidad de que éste sea otro de losfactores que contribuyen al deterioro morfo-funcional observado en las células de Purkinjeluego del aislamiento social. Sería interesanteestudiar en trabajos futuros si los niveles de IGF-I se alteran en respuesta a esta manipulaciónambiental temprana.

Por otra parte, las células de Purkinje de las ra-tas deprivadas y luego colocadas en un entornosocial normal por 30 días (P32-P62) mostraronuna notable recuperación en los niveles de CBDintracelular. Este resultado indica que, a diferen-cia de las alteraciones estructurales del árboldendrítico, el déficit en la expresión de CBD es unevento reversible. Dado que la interacción socialinvolucra diversos grados de estimulación poli-sensorial y motora, es probable que esta nuevacondición ambiental demande una mayor adap-tabilidad conductual por parte de los animalesdeprivados, determinando a su vez incrementos dela actividad neuronal en los circuitos cerebelosos,


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en estrecha relación con la imperiosa necesidad demantener la homeostasis del Ca2+ intracelular víaCBD. Si esta conjetura es correcta, el incrementoen los niveles de CBD post-estimulación socialpuede ser interpretado como un mecanismoadaptativo inducido por aumentos transitorios dela concentración de Ca2+.

En concreto, los datos presentados en esta in-vestigación demuestran que las experiencias tem-pranas adversas alteran de manera permanente eldesarrollo estructural de las células de Purkinje,deterioro que se asocia a una disminución transi-toria de una de las principales proteínas regula-doras del Ca2+ intracelular (calbindina-D28k).Considerando por una parte que las neuronaspaleocerebelosas modulan la actividad no sólo desistemas motores sino también límbicos (hipotá-lamo, hipocampo, amígdala, núcleo acumbens,septum y corteza orbitofrontal) (41) y, por otra,

que el deterioro de esta zona vermiana en sereshumanos se relaciona con algunos síndromesneuropsiquiátricos (5, 6), es posible hipotetizarque las alteraciones detectadas en esta investiga-ción constituyen al menos uno de los sustratosneuroanatómicos que potencialmente podría es-tar involucrado en los desórdenes psicoafectivosdescritos en individuos expuestos tempranamen-te a entornos crónicamente adversos.

Agradecimientos

Mis agradecimientos a la valiosa y desinteresa-da ayuda prestada por el Prof. Dr. Xavier Navarro,Catedrático de Neurología (Universidad Autóno-ma de Barcelona) en cuanto a la donación deanticuerpos policlonales y facilitación del equipode microscopía epifluorescente, sin los cuales nohubiese sido posible realizar esta investigación.

En el presente trabajo se utiliza el modelo de aislamiento social en animales a objeto deestudiar el efecto que producen las experiencias tempranas adversas sobre el desarrollomorfofuncional de la corteza cerebelosa. Se utilizaron 103 ratas de la cepa Sprague-Dawleyde 18 días de vida, las cuales fueron separadas en dos grupos de estudio: (a) control (SC; 3-4 ratas por jaula) y (b) aislado (IC); estas últimas se colocaron en compartimentos individualeshasta los 32 días de edad (P32). En esta etapa, el 50% de los animales IC y SC fueronsacrificados para su estudio neuronal; el resto de las ratas del grupo IC fue retirado de suscompartimentos individuales y reubicado en un entorno social normal hasta el día P62, reali-zándose el análisis neuronal respectivo. En ambas fases ontogenéticas (P32 y P62) se estudióel desarrollo dendrítico y la expresión de calbindina-D28k (CBD) en células de Purkinje vermianas.Los resultados obtenidos mostraron que la deprivación social y sensoriomotriz temprana alterael crecimiento dendrítico en estrecha relación con una disminución del contenido intracelularde CBD. Además, la interacción social post-deprivación sólo logró recuperar la expresión deCBD, permaneciendo el deterioro estructural. Estos resultados indican que las experienciaspostnatales adversas alteran el desarrollo morfológico y funcional de las neuronas de Purkinjevermianas cuando se emplea el modelo de aislamiento social.

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deterioro cerebeloso por aislamiento social temprano

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