Determinación de proteínas

Curso EMA2013

Ing. Agr . Marta del Puerto

Métodos para determinar proteínas

Se basan en:

a. Propiedad de las proteínas de absorber luz en el UV

absorción A=280nm

a. Capacidad de unirse a ciertos colorantesBiuretLowryAcido Bicinconínico BCABradford

a. Formación de derivados químicos

Propiedad de absorber luz en el espectro UV

• La mayoría de las proteínas muestran una absorción a 280 nm, la cual se atribuye al grupo fenólico de la tirosina y al grupo indólico del triptofano

• Tiene la ventaja de que no es necesario utilizar reactivos y la muestra no se daña o destruye durante la determinación.

Método de absorción UV• Se determina la cantidad de luz absorbida una

solución proteica.• Para el cálculo de la concentración de dicha

solución se aplica la ley de Lambert –Beer:

A = ε ·c ·l Donde:• A = absorbancia• = Coeficiente de extinción molar.• l = longitud de la celda.• C = concentración

€ - coeficiente de extinción molecular : la cantidad de luz absorbida por unidad de concentración

Se utiliza el coeficiente de extinción de la Albúmina de Suero Bovino (BSA) que es de 43824 M-1 cm-1

Métodos colorimétricos

• Usan reactivos determinantes de color

• Miden por colorimetría en espectro luz visible

• Usa curva de proteína patrón (albumina suero bovino)

• Métodos donde la muestra se destruye

Curva patrón para métodos colorimétricos

Curva patrón albumina suero bovino BSA

Método de Biuret

• Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el ion Cu+2 y los grupos NH4 de los enlaces pépticos en medio básico (NaOH o KOH)

Consideraciones del método de Biuret

• Reacción específica• Color violeta se lee a 540nm contra curva

estándar BSA• La intensidad del color es proporcional a la

cantidad de proteína• Baja sensibilidad alta concentración

de proteína

Método de Lowry

• Combina la reacción del Biuret con la reducción del reactivo de FOLIN-CIOCALTEAU por los grupos aromáticos de residuos de tirosina, triptófano, cistina cisteína e histidina.

• Origina compuesto azul intenso • Mide a 750nm

Método del ácido bicinconínico BCA

• Se basa en que las proteínas reducen los iones cúpricos del reactivo BCA a iones cuprosos en medio básico.

• Cambio de color del verde (BCA) al morado.

proteína + Cu+2 Cu+1

Cu +1 + BCA BCA-Cu+1

OH-

Método de Bradford

• Se basa en la unión del reactivo Comassie-blue G250 a las proteínas en medio ácido

• Reconoce los aa arginina, fenilalanina, triptófano y prolina

• Origina color azul intenso A=595nm

Aa que reconoce el reactivo de Bradford

Nitrógeno total o kjeldahl

• El método Kjeldahl se basa en la transformación del nitrógeno contenido en la muestra en sulfato de amonio mediante la digestión con ácido sulfúrico en presencia de un catalizador. El ion amonio obtenido se transforma en medio básico en amoníaco que se destila y valora con una solución de ácido patrón.

•

DIGESTIÓN

n - C -NH2 + mH2SO4 catalizadores CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2

proteína calor

NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN

(NH2)SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O

NH3 + H3BO3 (ácido bórico) NH4 + H2BO3- (ión borato)

TITULACIÓN

H2BO3- + H+ H3BO3

Tamaño de la muestra

CONT. DE PROTEINA %

PESO DE MUESTRA mg

Mas de 5% 1000 - 5000

5 a 30% 500 - 1500

Menos 30% 200 - 1000

Conc de N mg/l

Vol muestra ml

Menor a 20 100

Entre 20 y 50 50

Entre 50 y 100 25

Materiales sólidos Muestras liquidas

IMPORTANTE: homogeneizar la muestra: molido (<1mm) y mezclado

Proceso de digestión

• Romper los enlaces nitrogenados y liberar el nitrógeno como ion amonio

• Digestión en medio ácido H2SO4

• Catalizador• Temperatura• Tiempo

Cantidad de ácido a agregarmuestra ml acido/

g muestra

Suelo 10.0

Grasa 9.7

Proteína 4.9

Carbohidratos 4.0

Arcilla 0.6

TRIGO

PC---- ----- 12.5%CHO------- 66.6%MG ------- 3.5%

CALCULO

PC = 12.5% * 4.9 ml/g = 0.61CHO = 66.5% * 4.0 ml/g = 2.66MG = 3.50% * 9.7 ml/g = 0.34

TOTAL 3.61 ml ácido

CATALIZADOR

• Mejorar la velocidad y eficiencia de la digestión

• MERCURIO • COBRE• SELENIO• TITANIO

• MEZCLAS

• Se usa en algunos compuestos que requieren ser reducidos antes de digerir

• Sulfato de cromo, zinc, sucrosa, acido salicilico

AGENTE REDUCTOR

AGENTE OXIDANTE• Acelera la descomposición• Agente antiespumante

• H2O2

DESTILACION• OBJETIVO: Convertir el nitrógeno amoniacal (NH4) en

amonio (NH3) mediante el agregado de una álcali (KOH , NaOH) que se recoge en acido bórico

• (NH)2SO4 + 2NaOH ---- + Na2SO4 + 2H2O

+ H3BO3 --------- NH4 + H2BO3-

2NH3

NH3

acborico

ion borato

Titulación y cálculo de %N

• El ion borato se titula con un ácido débil

• H2BO3- + HCl ---------- H3BO3

• Se determina el gasto de HCl para neutralizarlo

• %N = NHCl x gasto x 14 x 100peso muestra

N normalidad del acido mol/lGasto ml de HCl14 g/mol peso atómico del N100 Factor de correcciónPeso muestra gramos

Calculo de % proteína

• Se usa un factor de conversión según al % de N de la muestra

• En general se usa 6.25 = 10016

%N x 6.25 = %PC

Factor según la proteína en estudio

Ejemplo de determinaciónmuestra P muestra

frescaGasto % nitrógeno Factor % PC

Forraje fresco

0.8214 14.9 2.47 6.25 15.44

Forraje fresco

0.8383 15.7 2.55 6.25 15.94

Avena 0.5053 20.4 18.66 5.36 10.0

Hongos n2 0.2177 7.1 4.82 4.38 21.11

Pupasp512Base seca

0.2140 9.8 6.89 6.25 43.06