DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA

I. INTRODUCCIÓN

Las enzimas son biocatalizadores específicos de naturaleza proteica que actúan

acelerando las reacciones químicas experimentando cambios físicos durante ellas, pero

recuperando su estado original cuando dichas reacciones han culminado. De manera

general, una reacción química catalizada por una enzima se representa de la siguiente

manera:

SUSTRATO + ENZIMA ↔ COMPLEJO ENZIMA - SUSTRATO → ENZIMA + PRODUCTO

La ureasa, aislada y cristalizada en 1926 por el bioquímico estadounidense J. B.

Summer, se puede aislar de vegetales, mohos y bacterias, no encontrándose presente en

las células de mamíferos. Esta enzima actúa sobre enlaces carbono - nitrógeno (C-N)

diferente de los enlaces peptídicos y cataliza la siguiente reacción:

UREA + H2O → CO2 + 2NH3

Pudiendo ser inhibida por iones plata, mercurio y otros metales pesados. Se señala que

un reductor suave como el sulfito produce su inactivación reversible. Una unidad de

ureasa se define como aquella que libera un micromol de amoníaco a partir de urea, por

minuto, bajo condiciones de ensayo específicos de pH y temperatura (pH 7.2 y 37°C).

El objeto de la presente experiencia es demostrar la actividad enzimática, determinando

para ello la actividad de la ureasa.

II. MATERIALES

1. Material Biológico:

Enzima Ureasa (E.C.3.5.1.5. Urea amidohidrolasa)

2. Material y Equipo de Laboratorio:

Gradillas para tubos.

Tubos de ensayo de 13 x 100 mm (07).

Pipetas de 1 mL (02; una al 1/100), 2 mL, 5 mL y 10 mL.

Baño María a 37°C

Goteros o pipetas descartables de plástico.

Pizeta con agua destilada.

Espectrofotómetro SPECTRONIC-20.

3. Reactivos:

Buffer Tris-HCI 0.05 M, pH 7.2

Solución de urea 0.075 M en buffer Tris-HCI 0.05M, pH 7.2

Solución de ureasa 0.05%

Solución de HgCl2 1 %

Solución de rojo de metilo 0.04%.

III. PROCEDIMIENTO

A. SISTEMA DE INCUBACIÓN:

COMPONENTES (mL) Y

PROCESO

TUBOS

1 2

Buffer Tris-HCI 0.05 M pH 7.2 0,5 0,5

Urea 0.075 M bufferada 3,0 3,0

Mezclar y pre-incubar a 37°C por 5 minutos

Ureasa 0.05% ---  0,5

Mezclar suavemente e incubar a 37°C por 15 minutos

HgCI21%, mezclar 2 gotas 2 gotas

Ureasa 0.05% 0,5 --- 

Mezclar, preparar y seguir con los siguientes sistemas.

B. VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE UREASA POR EL

MÉTODO DE LOS PRODUCTOS FORMADOS:

1) Cuantificación de producto formado. Reacción de neutralización:

Se pasa 2 mL de contenido del tubo 1 (Control o Blanco) a otro tubo marcado

(1B), se añade una gota del indicador rojo de metilo al 0.04% y se titula con

HCl 0.05N (usar una pipeta de 1 mi graduada al 1/100). El punto final es la

aparición de un color rosa pálido. Se anota el volumen del ácido gastado, el

cual se restará del valor de titulación a obtener en el tubo 2. Este blanco

representa el ácido necesario para neutralizar los componentes del medio

inicial.

Luego se pasa 2 ml del contenido del tubo 2 (Problema) a otro tubo marcado

(2B) y se procede a titular como en el paso anterior. Como se produce una

base en esta reacción, el tubo experimental problema (tubo 2) necesita más

ácido para lograr la neutralización.

CÁLCULOS: Se calculan los resultados en términos de velocidad de

reacción o actividad enzimática expresados como micromoles de urea

desdoblados por minuto a 37°C (unidades de ureasa).

Velocidad=(Vol .de HCl gastado ( problema )−Vol . HCl( blanco )) ( Molaridad del HCl ) (1000 )(4)

(15 minutos ) (2 )(2)

Expresar la actividad de ureasa en términos de unidades enzimáticas

(unidades de ureasa), considerando, además de la temperatura y el tiempo, la

cantidad (en peso) de ureasa empleada y el pH.

2) Cuantificación de producto formado. Método Espectrofotométrico,

Reacción de Nessler:

COMPONENTES (mL) Y PROCESOTUBOS

Blanco 1 2

Tubo 1 de sistema de incubación --- 0,1 ---

Tubo 2 de sistema de incubación --- --- 0,1

Agua destilada 4,5 4,4 4,4

Reactivo de Nessler 0,5 0,5 0,5

Dejar en reposo durante 10 minutos y leer en espectrofotómetro a 540 nm.

CÁLCULOS:

a) Corrección de lecturas: Restar lectura del tubo blanco ce reactivos de las

lecturas de los tubos 1 (control o blanco) y 2 (problema). Luego, restar la lectura

del tubo 1 de la lectura del tubo 2.

b) Velocidad de reacción o actividad de ureasa: Se determina en términos de mg

de NH3 producido por mL, mediante la siguiente fórmula:

Velocidad=( lectura deltubo 2 ) (factor de calibracion )=…mg NH3/mL

Factor de calibración 37 mg NH3 /mL para espectrofotómetro Spectronic-20.

IV. RESULTADOS

1) Reacción de neutralización

Vol. HCl gastado (problema): 0.38 mL

Vol. HCl gastado (blanco): 0.05 mL

Velocidad: 1.1 unidades de ureasa

2) Reacción de Nessler( espectrofotómetro)

Lectura tubo 1: 0.01

Lectura tubo 2: 0.19

Velocidad: 6.66 mg NH3/mL

V. DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en la reacción de neutralización muestran la formación

de NH3 (base) en el tubo 2 del sistema de incubación, que necesita ser

neutralizado por el HCl (acido).

En la reacción de Nessler se puede observar la cantidad de NH3 presente en el

sistema.

Si llevamos el resultado de la reacción de Nessler a unidades de ureasa

notaremos que los datos coinciden. . Lo cual demuestra la actividad enzimática

realizada por la ureasa.

VI. CONCLUCIONES

La ureasa lleva a cabo la transformación de urea en NH3 y CO2, demostrando así

su actividad enzimática.

BIBLIOGRAFÍA

Stryer L., Mark Berg J., Tymoczko J.L. Bioquímica. España. Editorial

REVERTE. 2008. Pg 205