determinaciondelacurvadecrecimientopormodleodegompertz final 130416221728 phpapp02

7/27/2019 Determinaciondelacurvadecrecimientopormodleodegompertz Final 130416221728 Phpapp02

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DETERMINACIN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA

Sacharomyces cerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA DE LOS PRODUCTOS

AGROINDUSTRIALES

PROFESOR: ING. SNCHEZ GONZALES, JESS ALEXANDER

CICLO: IX

HORARIO: JUEVES 11-1PM

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLOINGENIERA AGROINDUSTRIAL

TRUJILLO-2012


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Determinacin de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicando el

modelo de Gompertz UNT

INTEGRANTES

ALFARO LAYZA MASSIEL

AROCA CASTILLO RONALD

BANCES NEZ PEDRO

CALDAS REYES PATRICIA

CERQUN RODRGUEZ DIEGO

COLLANTES ARANA LUIS

ESQUIVEL PEREA VIRGINIAESPINOZA ROMERO DIEGO

GORDILLO SILVA CARLOS

GUERRERO MEDINA NEIVER

GUTIERREZ MARIN VIVIANA

IZZIGA LUNA NARDY

JARA PONTE ANVAL

LEN PICN BRUCE

LZARO HARO DANNY

LUCAS FLORES YOVEN

MARTNEZ SALDAA YURICO

MNDEZ SOSA JIMMY

MORALES NARVEZ CARLOS

RODRGUEZ ANTICONA ROBERTO

RODRGUEZ LEN ANDR

SANTILLN HONORIO HILBAR

VARGAS RAFAEL ANGIE


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DETERMINACIN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURASacharomy ces cerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ

I. INTRODUCCIN:

La microbiologa predictiva de alimentos (MPA) es un rea multidisciplinaria

emergente de la microbiologa de alimentos, que surge como alternativa a la

necesidad de acortar tiempos de respuestas, reducir costos econmicos,

reemplazar metodologas dispendiosas y disminuir la laboriosidad en los anlisis de

la microbiologa clsica de alimentos. Es un rea multidisciplinaria ya que abarcadistintas disciplinas como la microbiologa, matemtica, estadstica, informtica,

bioqumica, etc., con el fin de desarrollar y aplicar modelos de simulacin que

permitan predecir las respuestas de los microorganismos ante diversos factores

medioambientales.

La microbiologa predictiva se basa en la siguiente premisa: las respuestas de los

microorganismos ante los cambios en los factores ambientales pueden ser

reproducidas de forma controlada en el laboratorio, de esta forma, a travs de

diversos modelos es posibles posible predecir cul ser el comportamiento de estos

microorganismos cuando cambian las condiciones ambientales que les rodea.

Los modelos matemticos considerados en el mbito de la microbiologa predictiva

se pueden clasificar segn distintos criterios, usos y finalidades. Existen modelos

probabilsticos (que permiten estimar los lmites de crecimiento/no crecimiento o

produccin/no produccin de toxina), modelos cinticos de crecimiento, de

supervivencia o de inactivacin (para determinar el nmero de microorganismos en

funcin del tiempo). Tras ajustar la curva de crecimiento microbiana mediante

funciones matemticas (modelos primarios) y estudiar sus parmetros segn

cambios en las condiciones ambientales (modelos secundarios), es posible

modelizar el comportamiento microbiano en funcin de la temperatura, el pH, la

actividad del agua y otros factores, independientemente del alimento y a partir de

estos datos predecir lo que suceder durante el almacenamiento, procesado, etc.


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II. OBJETIVOS

Preparar medios de cultivo y manejar adecuadamente la autoclave.

Confeccionar la grfica de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae

mediante el modelo de GOMPERTZ.

Se conoci el modelo de Gompertz para el clculo de la curva de crecimiento

de las levaduras.

Identificar cada una de sus fases.

Calcular el Tiempo de Generacin por el mtodo grfico.

III. MARCO TERICO

A) FORMULACIN DE MEDIOS DE FERMENTACIN

La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una

etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Donde los

componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza

qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con

los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y adems

suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.

No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los

nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes

categoras de componentes:

a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estnrepresentados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg.

b) Micronutrienteso elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo,

Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o

microgramos por litro.

c) Factores de crecimiento, que estn constitudos generalmente por componentes

orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados nimetabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin


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metablica especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no

saturados, etc.

Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los

componentes, en:

Medios sintticos o medios qumicamente definidos.

Medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias de origen

animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz,

harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas,

pero que son qumicamente indefinidas y de composicin variable

B) CRECIMIENTO CELULAR

Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos porque

es necesario poder predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir

consumindose el substrato y cmo se va a ir acumulando el producto de una

fermentacin. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un

fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que

no podemos predecir qu va a pasar, cundo va a completarse el crecimiento, cmo

se va a acumular el producto, etc.

Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado

van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez

que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividindose en

cuanto han podido duplicar su masa y su material gentico. El tiempo que tarda una

clula en hacer. Cada vez que transcurre un tiempo de generacin, el nmero de

clulas se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial.

Si llamamos N0 al nmero de clulas inicial, y g al nmero de generaciones

transcurridas, el nmero de clulas final (N) ser:

Llamando Tal tiempo de generacin yt al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuacin

anterior puede transformarse en la siguiente:


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Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar grficamente, por ello

es mejor transformarlas en algo ms simple, como puede ser una recta.

Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los

dos trminos y resulta:

Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el tiempo a razn

de una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generacin T es muy grande, el

crecimiento tendr poca pendiente (ser lento) y si T es pequeo el crecimiento ser

rpido.Esto es: el incremento en el nmero de clulas, en la biomasa de cultivo y enla acumulacin de metabolitos primarios, protenas, cidos nucleicos etc., es

paralelo.

Otra forma de representar la cintica es considerando el incremento en el nmero

de clulas (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuacin que

describe la cintica es la siguiente:

Esto es: el incremento del nmero de clulas (dN) por unidad de tiempo (dt) es

proporcional al nmero de clulas presentes en el cultivo (N). A la constante de

proporcionalidad () se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo

as como la probabilidad de que una clula se divida en un tiempo determinado la

transformacin de esta ecuacin en una recta (tomando logaritmos) rinde lo

siguiente:

Esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta linealmente

con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad . Comparando esta

ecuacin con la similar presentada ms arriba, podemos concluir que = ln2/T y,

por consiguiente, que T = ln2/. Es decir, que hay una correlacin inversa entre el

valor de la tasa de crecimiento () y el tiempo de generacin.


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Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de clulas, masa

celular, etc. despus de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien, poder

calcular la tasa de crecimiento a partir de medidas experimentales del incremento

en el nmero de clulas, biomasa, etc.

Figura 1. Crecimiento celular

El grfico representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas, etc.) de un

cultivo (lnea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un

substrato cuya concentracin (lnea azul) decrece de forma proporcional al

crecimiento de la biomasa.

C)CINTICA DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA

Una fermentacin aerbica tipo batch o discontinua puede ser considerada como

un sistema cerrado. En el tiempo inicial el medio de cultivo estril dentro del

fermentador se inocula con microorganismos y la incubacin se da bajo condiciones

fisiolgicas ptimas. En el transcurso de toda la fermentacin, solo se adiciona

oxgeno (en forma de aire), un agente antiespumante, y un cido o base para el

control del pH, con el fin de garantizar las condiciones ptimas de operacin que

permitan obtener una alta concentracin celular. La composicin del medio de

cultivo, la concentracin de biomasa, y la concentracin del metabolito cambia

constantemente como resultado del metabolismo celular. En el transcurso de la

fermentacin hay 4 fases de crecimiento, por las cuales pasa el microorganismo a

travs el tiempo, como se muestra en la figura 4: fase lag, fase exponencial, fase

estacionaria y fase de muerte (Snchez, 2003).


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Figura 2. Curva de crecimiento de los microorganismos.

Fase Lag o de adaptacin: tambin llamada fase de latencia. Cuando las

clulas son transferidas de un medio a otro, no hay inicialmente un incremento

en el nmero de clulas. Durante esta fase los microorganismos se toman un

tiempo para adaptarse a su nuevo ambiente fisicoqumico y en ocasiones se

sintetizan nuevas enzimas o componentes estructurales (Snchez, 2003;

Duarte, 1998). La duracin de esta fase puede variar dependiendo del

crecimiento de las clulas en el inculo, el cual debe tener una edad tal que la

mayor parte de las clulas que contiene deben encontrarse en fase exponencial

y metablicamente activas (Barrera, 2004). Es recomendable utilizar inculos

entre aproximadamente 5 y 10% del volumen total del reactor con el fin de

reducir el tiempo de latencia (Soto, 2004).

Fase Exponencial o log:Al finalizar la fase lag, las clulas se han adaptado a

las nuevas condiciones de crecimiento. En este punto las clulas se reproducen

sin limitacin de sustancias nutritivas a velocidad mxima. El crecimiento de las

clulas se puede describir cuantitativamente como la duplicacin del nmero de

clulas o biomasa por unidad de tiempo. A travs de esta fase las clulas

alteran el medio constantemente tomando los sustratos y excretando losproductos metabolizados. El crecimiento permanece constante durante esta

fase. La velocidad de crecimiento es independiente de la concentracin de

sustrato mientras exista sustrato en el medio y se correlaciona con la velocidad

de crecimiento especfico y la concentracin de clulas x [clulas/ mL] segn

la ecuacin nmero 1.

(1)


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La velocidad de crecimiento especfico , es generalmente una funcin de tres

parmetros: la concentracin del sustrato limitante S , la tasa de crecimiento

mxima max , y la constante especifica de sustrato s K , en cuya concentracin

se obtiene la mitad de la mxima velocidad especfica de crecimiento ( = 0.5 mx.

). Esta relacin puede ser expresada por medio de la ecuacin de Monod (2):

La velocidad mxima de crecimiento especfico max es de considerable

importancia a nivel industrial, debido a que es en este punto donde se obtiene el

valor mximo de a niveles de saturacin de sustrato, relacionando la dependenciade los microorganismos con las condiciones del fermentador, donde a medida que

aumenta la densidad de poblacin decrece la concentracin del sustrato limitante

del crecimiento, causando un descenso de . Fase estacionaria: ocurre cuando se

agota una sustancia nutritiva y el sustrato se ha metabolizado, cuando se han

formado sustancias txicas o ha ocurrido un cambio de condiciones como pH,

temperatura y concentracin de oxgeno disuelto. El crecimiento celular desciende

lentamente o para completamente y en el caso en el que aun pueda estar

ocurriendo crecimiento, este se contrarresta por la rapidez de muerte o lisis celular.

La biomasa incrementa slo gradualmente o permanece constante durante la fase

estacionaria, aunque la composicin de las clulas puede cambiar (Snchez, 2003;

Duarte, 1998).

Fase de muerte:tambin llamada fase de decaimiento. En esta fase la reserva

de energa de las clulas se ha acabado, debido a condiciones de inanicin o

como consecuencia del metabolismo de mantenimiento de algunas clulas. Eltiempo entre la fase estacionaria y la fase de muerte depende del

microorganismo y el proceso utilizado (Snchez, 2003; Duarte, 1998).

D) CONSUMO DE SUBSTRATOS LA LEVADURA Sacchharom yces cerevis iae

La levadura Sacchharomyces cerevisiaees capaz de asimilar una gran variedad de

monosacridos. Tambin puede hidrolizar y consumir algunos carbohidratos

mayores, como la sacarosa, maltosa, rafinosa, maltotriosa y pectina, pero carece delas enzimas necesarias para utilizar la lactosa, el glucan y el almidn. Estos ltimos

(2)


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substratos deben ser desdoblados previamente, ya sea por hidrlisis cida y calor

(pH 2.5), o por la actividad de enzimas exgenas de origen microbiano o vegetal:

lactasa, glucanasa, a y b-amilasas o glucoamilasa. En los mostos de procesos

industriales, las concentraciones de carbohidratos fermentables fluctan

generalmente entre 6-12% (p/v).

Los carbohidratos asimilados son degradados y oxidados durante el catabolismo a

travs del ciclo de la Gluclisis (o va Embden-Meyerhof-Parnas). La levadura

aprovecha la energa liberada de cada mol de glucosa: para formar dos moles de

ATP y los usa en la etapa anablica. El ciclo se estabiliza al reducir finalmente dos

moles de NAD+, mientras forma los productos de la fermentacin.

Adems de la fuente de carbono, la levadura requiere que el medio de cultivo tenga

fuentes apropiadas y suficientes de otros macronutrientes: N, O, H, S y P; de

micronutrientes: Na, K, Ca, Mg, Mn y Fe; de elementos traza y de vitaminas. Se ha

observado un mejor aprovechamiento del nitrgeno cuando sus fuentes son

aminocidos libres o pptidos pequeos, en comparacin con las protenas, porque

las proteasas de la levadura tienen actividad limitada.

La velocidad de consumo de substrato limitante (fuente de carbono) est ligada

directamente a la velocidad de crecimiento de la levadura. Al entrar en la clula, el

substrato tiene tres destinos: para funciones de mantenimiento, para crecimiento

microbiano y para la formacin de productos excretados. En un cultivo sumergido

discontinuo (cintica) la cintica de consumo de substrato limitante se representa

as:

Dnde:

qs: Velocidad especfica de consumo de substrato

m: Tasa de mantenimiento

Velocidad de consumo de substrato para el crecimiento microbiano:


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Velocidad de consumo de substrato para la formacin de los productos ligados alcrecimiento microbiano:

E) CRECIMIENTO DE LA LEVADURA

El proceso de reproduccin normal de Saccharomyces cerevisiae es asexual

(mitosis) y se llama gemacin. En ste se observa la formacin de yemas o

blastosporas que dan origen a nuevas clulas haploides al crecer. Slo en

condiciones crticas se combinan dos clulas para formar un cigoto diploide, y

despus de la reduccin de cromosomas (meiosis) se forman 4 esporas sexuales

(ascosporas) que al germinar producen nuevas clulas haploides.

Saccharomyces cerevisiaees anaerobia facultativa, por lo que se obtiene un mayor

rendimiento de biomasa en aerobiosis que en anaerobiosis. El cultivo aerobio es

importante durante la propagacin del inculo, llamado tambin cultivo semilla

El cultivo principal se realiza en condiciones anaerobias o microaerfilas

El valor de la velocidad especfica de crecimiento microbiano (m) en anaerobiosis

flucta entre: 0.13 y 0.408 h-1

. El rendimiento aproximado de biomasa con respectoal consumo de substrato en estas condiciones es:

Y el de produccin de ATP es de:

F)CRECIMIENTO Y SNTESIS DEL PRODUCTO EN PROCESOS INDUSTRIALES.

Hay dos tipos fundamentales de productos metablicos: primarios y secundarios. Un

metabolito primario es el que se forma durante la fase primaria del crecimiento del

microorganismo, mientras que un metabolito secundario es el que se forma cerca

del final de la fase de crecimiento, frecuentemente cerca de, o en la fase

estacionaria del crecimiento. Las diferencias entre un metabolito primario y un

metabolito secundario se ilustran en la imagen de la izquierda.


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Metabolitos primarios microbianos.

Un proceso microbiano tpico, en el que el producto se forma durante la fase

primaria del crecimiento, es el alcohol (etanol) obtenido por fermentacin*. El etanol

es un producto del metabolismo anxico de la levadura y de algunas bacterias y se

forma como parte del metabolismo de la energa. Debido a que el crecimiento slo

puede tener lugar si puede producirse energa, la formacin de etanol tiene lugar en

paralelo con el crecimiento.

Metabolitos secundarios microbianos.

Un tipo ms complejo de productos industriales es aquel en el que el producto

deseado no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la fase

estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan

metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos ms comunes y ms

importantes de inters industrial. Mientras que el metabolismo primario es

generalmente similar en todas las clulas, el metabolismo secundario presenta

claras diferencias entre un organismo y otro. Las caractersticas reconocidas del

metabolismo secundario son:

Cada metabolito secundario slo lo forman relativamente pocos

organismos.

Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el

crecimiento y la reproduccin.

Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo

de estructuras estrechamente relacionadas.

Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproduccin demetabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados

como estn al metabolismo primario, usualmente no se pueden

superproducir de una manera tan espectacular.


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G) MEDIO DE CULTIVO.

La produccin de levadura, requiere adems de unas condiciones ambientales

ptimas, de una variedad de nutrientes esenciales y vitaminas (Gmez, 2003). Los

nutrientes existentes en los medios de cultivo dan a la clula microbiana todos los

ingredientes requeridos para que produzca ms clulas semejantes a ella misma

(Ramrez y Pedroza, 2001). Por lo tanto, es conveniente considerar un diseo de

medio de fermentacin que genere las mejores garantas de crecimiento, el mejor

desarrollo para el microorganismo y el mximo rendimiento de produccin. El medio

debe satisfacer los requerimientos nutricionales y ambientales del microorganismo,

adems de las restricciones tcnico-econmicas para minimizar los costos de

separacin y purificacin. La determinacin de los requerimientos nutrimentales,ambintales y la composicin, dependen de la estequiometra de crecimiento y

formacin de producto (Duarte, 1998).

En la Figura 3, se muestran los requerimientos bsicos de nutrientes para los

microorganismos y las formas comunes de satisfacerlos en los cultivos

Figura 3. Requerimientos nutrimentales para los medios de cultivo


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Determinacin de la curv a de crecim iento de levadura Sacharom yces cerevisae, apl icando

el modelo de Gomp ertz

UNT

Los medios se clasifican de acuerdo a la naturaleza de los componentes, en: 1)

medios sintticos o tambin llamados medios qumicamente definidos y 2)

medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias de origen

animal y vegetal, como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz,harina de soya, de pescado, de sangre, extracto de carne, entre otros, que

aportan las sustancias fundamentales (macro y micronutrientes) (Ramrez y

Pedroza, 2001).

La formulacin del medio tiene que ver con los aspectos cuantitativos,

estableciendo las concentraciones y cantidades de cada componente. Para

promover el crecimiento celular son requeridos factores esenciales en los

medios de cultivo como ciertos aminocidos y vitaminas (Ramrez y Pedroza,2001). En el caso de la clula de levadura, para su desarrollo sta requiere de

nutrientes como el nitrgeno (sales de amonio, sulfato de amonio y urea),

fsforo (fosfato diamnico y cido fosfrico), magnesio (sales de magnesio),

potasio, calcio, azufre, hidrocarburos y trazas de hierro, zinc, cobre, manganeso

y molibdeno (Guilliermond, 1920; CNMA, 1998). En cuanto a las vitaminas son

necesarias la biotina, inositol, cido pantotenoico y tiamina (Asenjo, 1995;

CNMA, 1998).

Para la fabricacin industrial de levadura de panadera las principales materias

primas son el cultivo puro de levadura y la melaza de caa que constituye la

principal fuente de carbono del medio de cultivo, debido a su alto contenido de

azcares fermentables (45 a 55% en peso) en forma de sacarosa, glucosa y

fructosa (CNMA, 1998). A nivel de laboratorio S. cerevisiae se cultiva en medios

complejos que aportan a la clula los nutrientes necesarios para su crecimiento,

entre los que se destacan YM, Goering y Van Soest y el de Pell y Pschofield.Sin embargo, la composicin de los medios de cultivo debe ser constantemente

adaptada a los procesos de fermentacin (Ramrez y Pedroza, 2001).


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UNT

IV. MATERIALES Y METODOLOGA

A. MATERIALES Y EQUIPOS

Materiales

Sacarosa

Harina de soya

fosfato de amonio

Tiosulfato de sodio

cido fosfrico

cido ctrico

Agua destilada

Levaduras Fleshman

Equipo:

Microscopio

Cmara de Neubauer.

Bioreactor

Balanza analtica.

Cocina.

Otros:

Lmina cubreobjetos

Jeringa de carga

Baln

Vaso de precipitacin


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UNT

B. METODOLOGA

Procedimientos

Clc u lo s

En primer lugar se procedi hacer los clculos el medio de cultivo, tomando en

cuenta las necesidades de la levadura Sacharomyces Cerevisae y teniendo

en cuenta que la levadora se trat de calcular un medio lo ms natural posible.

Preparacin d el medio d e cul t ivo (ver en Anexos)

Se procedi a pesar los materiales necesarios en base a nuestros clculos,

para la preparacin el medio de cultivo los cuales son los siguientes:

200g de sacarosa

100g de harina de soya

8.117g fosfato de amonio pentahidratado

8.96g Tiosulfato de sodio

469g cido fosfrico

800g agua destilada

En un recipiente se combin los materiales, la harina de soya fue agregada

poco apoco y paralelamente se fue removiendo con el fin de que no quedase

ningn grumo por la harina de soya.

Enseguida se procedi a medir los grados Brix del medio, el cual fue de 20

Brix y con un pH de 6.2, se ajust el pH con cido ctrico hasta que llegase a

un pH de 5.

Luego esta solucin se puso en un baln de vidrio con un corcho en la boca, el

cual tena un pequeo orificio para el termmetro.


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UNT

Paralelamente en una olla se puso a calentar agua hasta que llegue a una

temperatura de 50C.

A esta temperatura de 50C recin se puso el baln conteniendo el medio de

cultivo, y se sigui calentando hasta que la solucin dentro del baln llegase a

80 C y se conserv a esta temperatura por 15min con el fin de pasteurizar el

medio de cultivo.

Luego se dej enfriar el medio de cultivo hasta 30C.

Act ivacin de las levaduras

Se hizo una solucin de 20 brix, con el fin de activar la levadura en polvo.

Se adiciono la levadura en polvo, se removi y se dej reposar por unos

minutos.

Despus de algunos minutos se not rpidamente el crecimiento y la

activacin de la levadura, puesto que la levadura la espuma que daba la

levadura (CO2) rebos el vaso de precipitacin donde se estaba

preparando el medio de cultivo.

Luego se hizo un recuento en la cmara de neubauer, pero no se pudocontabilizar pues eran demasiadas. Motivo por lo cual se procedi a hacer

una dilucin de 1/10 para que la concentracin llegara 107 levaduras/mL

esto de acuerdo a las indicaciones del docente.

Crecimiento d e las levaduras en el birreactor

Luego que se lleg a enfriar medio de cultivo a 30C recin se agreg las el

10% de levaduras en funcin al medio. En seguida se agreg esta solucin al birreactor, el cual estaba en

constante agitacin.

Seguidamente por un lapso de 2 horas se extrajo muestra cada 15

minutos. La primera muestra extrada con una jeringa fue vertida en la


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UNT

cmara de Neubauer sobre una laminilla y luego fue colocada en el

microscopio

Luego procedimos con un aumento de 40X se realiz el conteo respectivo

de clulas Pasada ya las 2 horas las se iniciaron a extraer las muestras cada 30

minutos.

Despus de unas horas el crecimiento de la poblacin aumento

considerablemente por ello se consider realizar una dilucin 10 -1.

Finalmente se procede a realizar la respectiva curva de crecimiento para la

produccin de levadura.


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Determinacin de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicandoel modelo de Gompertz

UNT

V. RESULTADOS DETERMINACIN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA Sacharomycescerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ

TABLA 1. Datos de los nmeros de levaduras de Sacharomyces cerevisae, tomadas al azar

MEDIDAS NMEROS DE LEVADURAS AL AZAR TOTAL PROMEDIO VOLUMEN DILUCIN

MUESTRA

ORIGINAL1 79 88 73 77 83 400 80 0.000004 - 20000000

2 132 120 81 75 101 509 101.8 0.000004 - 25450000

3 16 20 22 13 13 84 16.8 0.000004 10 42000000

4 17 23 18 12 16 86 17.2 0.000004 10 43000000

5 16 14 15 17 9 71 14.2 0.000004 10 35500000

6 25 19 7 12 26 89 17.8 0.000004 10 44500000

7 25 26 23 24 22 120 24 0.000004 10 60000000

8 22 18 17 20 21 98 19.6 0.000004 10 49000000

9 25 21 28 25 24 123 24.6 0.000004 10 61500000

10 24 28 21 29 24 126 25.2 0.000004 10 63000000

11 27 28 23 25 27 130 26 0.000004 10 65000000

12 27 25 26 22 32 132 26.4 0.000004 10 66000000

13 41 43 40 38 35 197 39.4 0.000004 10 98500000

14 40 41 37 46 43 207 41.4 0.000004 10 103500000

15 42 46 35 39 47 209 41.8 0.000004 10 104500000


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UNT

TABLA 2. Determinacin de los parmetros de crecimiento de levaduras Sacharomyces cerevisae del medio de cultivo.

TABLA 3. Parmetros para clculo de grfica de Gompertz

MUESTRAS TIEMPO (h)MUESTRA ORIGINAL

LOG( N/N0)(UFC/g)N

1 0.166667 20000000 0

2 0.333333 25450000 0.104657791

3 0.500000 42000000 0.3222192954 0.666667 43000000 0.33243846

5 0.833333 35500000 0.249198357

6 1.000000 44500000 0.347330015

7 1.166667 60000000 0.477121255

8 1.333333 49000000 0.389166084

9 1.500000 61500000 0.48784512

10 2.000000 63000000 0.498310554

11 2.500000 65000000 0.511883361

12 3.000000 66000000 0.51851394

13 3.500000 98500000 0.692406235

14 4.000000 103500000 0.713910354

15 4.500000 104500000 0.718086295

a 0.676447

b 0.706306

c 1.095409

mximo 0.74098544

-0.2681135

G 0.93543968


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UNT

Figura 4. Determinacin de la Curva de Crecimiento de la Sacharomyces cerevisae aplicando modelo de Gompertz


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UNT

Figura 5.Tiempo (horas) vs Log (UFC/g) en Sacharomyces cerevisae

y = 0.2099ln(x) + 0.3749R = 0.9256

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.0000000.5000001.0000001.5000002.0000002.5000003.0000003.5000004.0000004.5000005.000000

Log(N/N0)(UFC/g)

Tiempo (horas)


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UNT

Segn Ventanas (2000); nos cuenta que el desarrollo de los microorganismos

puede representarse mediante una grfica que corresponde a una funcin

matemtica relativamente compleja. El estudio de estas funciones matemticas

tiene gran inters desde el punto de vista microbiolgico, ya que puede servir parapredecir el crecimiento de los microorganismos, y de este modo saber mediante

un simple clculo matemtico, con un ordenador, la evolucin que tendran los

microorganismo de inters en un producto determinado. De hecho, se est

haciendo un considerable esfuerzo para disear y validar los modelos

matemticos que permiten establecer el desarrollo microbiano y que son de gran

valor a la hora de tomar decisiones respecto al diseo de instalaciones y procesos,

adquisicin de equipos o caractersticas de los productos. Una de las frmulas

ms ampliamente utilizadas es la ecuacin de Gompertz. As mismo; en la Figura

4 podemos observar los resultados arrojados por STATISTICA validados para el

modelo de Gompertz; donde, el valor de a es igual a 0.676 nos indica el numero

inicial de microorganismos viables. El valor de b nos indica una velocidad de

crecimiento relativa de 0.706 en unidades de 1/horas a la velocidad mxima de

crecimiento en las condiciones trabajadas. La diferencia entre el nmero inicial y el

recuento mximo que se puede alcanzar en el medio est indicado por el valor c

que es 1.095.

Segn Hernndez (2008), nos dice que la curva de crecimiento de un

microorganismo representa el comportamiento de su crecimiento a travs del

tiempo. Con base en ella, se determina cuando se produce la mayor cantidad de


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biomasa o de metabolitos (primarios o secundarios). Si hacemos un contraste

entre la curva de la figura 1 obtenida en el software statistica 7; y la curva de

crecimiento extrada de bibliografa (Figura 5); observamos que la fase de latencia

que present la levadura no fue tan marcada, casi imperceptible, esto se debe aque la levadura presente en el inculo entr al biorreactor en una fase logartmica,

esto porque se puso a la levadura en un medio con sustrato (azcar) y a la misma

temperatura que se trabaj en el biorreactor para que vaya adaptndose antes de

ser vertido en el reactor. En un proceso de obtencin de biomasa la fase de mayor

importancia es la fase logartmica, pues de la velocidad de cmo se de sta

dependen factores como el costo. En la figura 4 se aprecia que la mayor pendiente

de la curva de crecimiento, es decir la mxima velocidad de crecimiento de la

levadura Saccharomyces cerevisiaese da entre los tiempos de 0.5 y 1 horas, es

decir el mayor crecimiento se dio entre los 30 min y 60min.

Segn Scragg (1996), nos dice que la fase lag, es un tiempo de aparente no

crecimiento, el cual se da en nuestro caso para la primera 0.5 hora, pero estudios

bioqumicos demuestran actividad metablica, indicando que las clulas estn en

proceso de adaptacin a las condiciones ambientales y que un nuevo crecimiento

comenzar, eventualmente. Existe, luego, una fase de aceleracin transitoria

cuando el inculo comienza a crecer que es seguida, rpidamente, por una fase

de crecimiento exponencial, esta fase exponencial se aprecia a un tiempo de 4

horas aproximadamente, ya que luego comienza a decaer. Esta fase final del ciclo,

es la fase de muerte, cuando la velocidad de crecimiento ha cesado. Y segn el

mismo autor, la mayora de los procesos biotecnolgicos por lotes se detiene

antes de esta fase, debido a la disminucin en el metabolismo y a la lisis celular.

Segn Hidalgo (2003), nos recalca que los azcares fermentables por las

levaduras son la principal fuente de alimentacin carbonadas, especialmente la

glucosa y la fructosa como azucares mayoritarios, sirviendo de base para la

sntesis de los compuestos que necesitan, as como tambin de fuente de energa

para atender sus funciones vitales como en el caso de la prctica que se le aadi


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soya que es un alimento con alto contenido de nitrgeno; adems de fsforo,

azufre y amonio que se apoy de compuestos qumicos tales como el cido

sulfrico, fosfato de amonio y tiosulfato de sodio. As el autor nos dice que en

medios muy pobre, con menos de 10 gramos/litro, la velocidad es muy lenta,acelerando hasta concentraciones de 20 gramos/ litros, donde a partir de este

valor la velocidad se mantiene hasta los 200 gramos/ litro. Despus de esta

cantidad la velocidad de fermentacin decrece a medida que la concentracin

aumenta, cesando totalmente a partir de los 600 gramos/litro por la elevada

presin osmtica presente en el medio. Esto se nota en la experimentacin ya que

segn la curva de crecimiento, existe un punto en el cual el crecimiento aumenta

la velocidad de crecimiento y otro punto en el cual este se detiene.

Segn Doran (1998), nos afirma que una de las condiciones que se tiene que

tener en cuenta en el biorreactor para el crecimiento de la biomasa es el aporte de

oxgeno, y si analizamos lo que se dio en nuestra practica podemos decir que este

fue continuo para ayudar al aporte de estas (levaduras) y para evitar la

fermentacin y as conllevar a la produccin de alcohol y CO2. El autor tambin

expresa que este aporte de oxigeno adems de evitar la fermentacin, sirve para

mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen del cultivo a

fin de prevenir la sedimentacin o la flotacin, mantener constante y homognea la

temperatura.

Segn IICA (1989), la biomasa de microorganismos es una excelente fuente de

nutrientes (protenas, grasa, vitaminas, minerales y otros factores). Por lo tanto,

siempre ha existido un inters de incorporarla al sistema alimentario humano tanto

en forma directa como indirecta (a travs de animales). Entre ellas, es la

proveniente de levaduras la que posiblemente se ha estudiado con mayor

profundidad. Por lo dicho se puede afirmar que no solo es un proceso previo a la

fermentacin de un vino, cerveza o cualquier bebida alcohlica el hecho de poner

en un biorreactor un inculo de levaduras con el fin de aumentar el nmero de

clulas y hacer ms factible la fermentacin alcohlica; si no es un proceso que


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puede manejarse a nivel alimentario con el fin de obtener una fuente rica en

protenas como lo son las levaduras, para ello se necesitara produccin de

grandes cantidades de biomasa en cortos tiempos. Todo esto se podra llevar a

cabo evaluando los mejores parmetros de temperatura, pH y nutrientes quenecesitan las levaduras.

VI. CONCLUSIONES

Se prepar un medio de cultiv basado en soja, azcar rubia y dems

componentes y se manej adecuadamente la autoclave.

Se confeccion la grfica de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae

mediante el modelo de Gompertz, obteniendo el modelo matemtico de

y=0.2099Ln(x)+0.3749, con un R2 de 0.9256, un valor alto que se acerca a

uno, lo cual nos indica un ndice de confianza aceptable. En las cuadros 1 y 2

se puede observar cmo va creciendo la levadura hasta llegar a un valor donde

se tiende a hacerse constante, lo cual nos indica que ha llegado a su punto

mximo de crecimiento.

Se conoci un poco ms acerca del mtodo de Gompertz en el crecimiento de

levadura Sacharomyces cerevisae.

Se identific sus fases, las cuales se pueden apreciar en la Figura 1. Curva de

crecimiento microbiano, utilizando el mtodo de Gompertz, las cuales son:Fase

Lag: Del Punto inicial hasta la interseccin del punto 0.0-0.1. Fase exponencial:

Desde el segundo punto (0.0-0.1) hasta la lectura del punto 13. Fase

Estacionaria: Desde el punto 13 hasta el punto 15 donde tiene una tendencia a

mantenerse constante. Fase Muerte: No se determin dado que solo se obtuvo

hasta Fase Estacionaria.

Se calcul el tiempo de generacin mediante el modelo:y=0.2099Ln(x)+0.3749; donde Y= Log (N/No)X=tiempo.


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VII. BIBLIOGRAFA

ASENJO A. (1995). Microbiologa de las fermentaciones industriales. (7 ed.).

Zaragoza: Editorial Acribia.

DORAN, P. (1998) .Principios De Ingeniera De los Bioprocesos. Edit.Acribia. S.A

Zaragoza- Espaa.

DUARTE P. (1998). Biotecnologa de la fermentacin, Primera Edicin, Editorial

Acriba S.A., Zaragoza (Espaa).

GOMEZ E. (2003), ASPECTOS BSICOS DE BIOTECNOLOGA. Instituto

Tecnolgico y de Estudios Superiores de Occidente, A

HERNNDEZ, A. (2008). Microbiologa Industrial.

Hidalgo J. (2003) Tratado de etnologa Editoria: Mundi-Prensa Libros S.A., Mxico.

IICA (1989). Oportunidades de las biotecnologas Agropecuarias en Amrica

Central. Programa II; Generacin y Transferencia de Tecnologa.

RAMREZ O. PEDROZA M. (2001). Evaluacin De Parmetros Cinticos Para La

Sacharomyces Cerevisiae Utilizando Agua De Coco Como Sustrato, San Jos,

Costa Rica.

SANCHEZ A. (2003). Las biotecnologas: desafos y promesas InvestigacionesBiolgicas. La Habana..

SCRAGG, A.(1996). Biotecnologa. Edit. El Manual Moderno. Mxico D.F.

VENTANAS, J. (2000). Tecnologa del jamn Ibrico: Delos sistemas tradiciones a

la explotacin racional del sabor y el aroma. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid.

Espaa.


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ANEXOS

ANEXO 01.Diseo de un medio de cultivo

Reaccin general

A C12H22O11 +BO2 +C NH3 C3.72H6.11O1.95N0.61 +D CO2 +E H2O

Donde:

Si:

100g sacarosa100g levadura10,4 (NH3)102,6g (O2)

Para el diseo de un medio se necesita de ciertos componentes tales como Macronutrientes

(CHONPS) y Micronutrientes (P y S) teniendo

Materiales.

Harina de soya (100g)Fuente.

P 0.61g

Mg 0.27gS 0.42

Zn 0.5gProtena 43g

Protena

Sacarosa (azcar rubia) 200g20Brix

Fosfato de amonio (NH3)4 PO4 63g/mol Acido fosfrico H3PO4 98g/mol

Tiosulfato de sodio Na2S2O3 164g/mol

Levadura

90.5g (90%)

10g (10%)

100g


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UNT

Requerimientos

Macronutrientes

Fosforo (P) 4gAzufre (S) 4g

Amonio (NH3) 10.4gSacarosa 200gOxigeno 102.6g

MicronutrientesZinc (Zn) 5mg

Magnesio (Mg) 5mg

Dnde: la harina de soya se completa los requerimientos de Zn (5mg), de P(faltara 3,39g), de Mg

se completa , de S (falta 3,5g) y del NH3 ( faltara 2.g)

Entonces calculamos para completar:

NH3

Azufre

Fosforo

g P

Entonces nos faltara3,39-1.905=1.485g P

Finalmente nuestras molculas para el medio de cultivo serian.

200g sacarosa

100g harina de soya

8.117g fosfato de amonio

8.96g tiosulfato de sodio 469g

Buffer

El cual se encontrara en agitacin constante

800g H2O


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UNT

Figura 6. Materiales para el diseo

del medio de cultivo

Figura 7. Harina de Soya para

el medio de cultivo

Figura 8. Pesado de la

Harina de Soya.

Figura 9. Pesado de los

materiales

Figura 10. Preparacin delMedio de Cultivo

Figura 11. Medio de Cultivo

Figura 12. Medio de cultivo 2 Litros Figura 13. Medicin de la

temperatura del medio de

cultivo

Figura 14. Medio de Cultivo en

Coccin.


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UNT

Figura 13. Pesaje del

Cultivo para la medicin

de Levaduras

Figura 14. Medio de Cultivo Figura 15. Materiales para el conteo

de Levaduras Sacharomyces

cerevisae

TUTORIAL MICROBIOLOGA PREDICTIVA GOMPERTZ


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UNT


33/37



UNT


34/37



UNT

Model is: YA=a*exp(-exp(b-c*TA))

OK , OK


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UNT

OK


36/37



UNT

Summary: Parameter estimates


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UNT

determinaciondelacurvadecrecimientopormodleodegompertz final 130416221728 phpapp02

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