L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g 2

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

D A N M A R K S

F A R M A C E U T I S K E

H Ø J S K O L E

Lægemiddelforskningudgives af Danmarks FarmaceutiskeHøjskole.

Ansvarshavende:Mette Rasmussen, DFH.

Redaktion:Videnskabsjournalist Rolf HaugaardNielsen, informationsmedarbejderJesper Munck og forskningsbibliote-kar Annemette Møller Hansen.

Grafisk produktion:Levison+Johnsen+Johnsen a/s

LayoutP.Z. Design

Fotos:Jesper Munck, Tue Askaa, Henrik Fylking Nielsen, Erik Nielsen,Henrik Lund, Bjarke Ebert, LotteSkjold og Fotogruppen Aps.

Forside:Scanning af snit af rottehjerne tilført radioaktivt stof.

LÆGEMIDDELFORSKNING LÆGEMIDDELFORSKNING 1 9 9 7

0µM 0.3µM 1µM

3µM 10µM 100µM

DF963394 - Omslag 97.12.09 09.57 Side 1

Indholdsfortegnelse Side

H.C. Ørsted: Farmaceut og naturstofkemiker 4-5Af Jerzy W. Jaroszewski

Bedre behandling af urinvejsinfektioner 6-7Af Hanne Hvidberg, Niels Frimodt-Møller og Søren N. Rasmussen

Genvej til nye lœgemidler 8-9Af Hans Bräuner-Osborne og Povl Krogsgaard Larsen

Alzheimers syge og hukommelsens kemi 10-11Af Alex Haahr Gouliaev og Mikael Begtrup

Et forsvar mod nervedød? 12-13Af Harald S. Hansen, Birthe Moesgaard, Henrik H. Hansen,Inga Björnsdottir, Jerzy W. Jaroszewski og Steen Honoré Hansen

Lœgemiddelforskning med rene spejlbilledformer 14-15Af Tommy N. Johansen og Erik Falch

Ny strategi for behandling af epilepsi 16-17Af Orla Miller Larsson, Tina Bolvig og Arne Schousboe

Regulering af hjernens blodkar 18-19Af Inger Jansen-Olesen og Anette Sams

Model af blod-hjerne barrieren 20-21Af Lise Lund, Lars Hovgaard og Lona Christrup

Vœksthormon gennem nœsen? 22-23Af Charlotte Vermehren, Peter B. Johansen og Harald S. Hansen

Stoffer kan frigøre vœksthormon fra hypofysen 24-25Af Bjarne Fjalland, Thomas Anderson og Peter B. Johansen

Computer beregner om lœgemidlet kommer ud i blodet 26-27Af Lene Krarup og Inge Thøger Christensen

Den svœre vej gennem tarmvœggen 28-29Af Bente Steffansen, Sven Frøkjœr og Mitchell E. Taub

Membraner og transport af lœgemidler 30-31Af Kent Jørgensen

Fra lakridsrod til lœgemiddel 32-33Af Søren Brøgger Christensen, Simon F. Nielsen og Tommy Liljefors

Børn skal informeres om deres lœgemidler 34-35Af Anna Birna Almarsdóttir

De samfundsmœssige omkostninger ved afhœngighed af 36-37psykofarmakaAf Marlene Gyldmark og Ebba Holme Hansen

Økotoksikologiske tests påviser hormoneffekter 38-39Af Bent Halling-Sørensen, Henrik Rasmus Andersen,Søren Nors Nielsen, Sven Erik Jørgensen og Steen Honoré Hansen

Protein binder giftige og livsvigtige metaller 40-41Af Carsten Boye Knudsen, Inga Bjørnsdottir, Ole Jønsog Steen Honoré Hansen

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.07 Side 1

alkaloider – blev fundet på et ratio-nelt grundlag, som bestod i udnyt-telsen af stoffernes syre-base egen-skaber. Isolering af et stort antal afde fysiologisk aktive alkaloider i1820'erne og 1830'erne skabte for-stærket behov for strukturelle analy-ser og var særdeles vigtig for udvik-lingen af moderne organisk kemi,blandt andet i form af perfektione-ring af organisk elementæranalysegennemført af Liebig – der ogsåbegyndte sin kemiske karriere i far-macien.

Ørsted giver i sine artiklerudtryk for sine intentioner med hen-syn til at fortsætte sine naturstofke-miske studier, men kort efter, i april1820, så han under en forelæsningen magnetisk nål bevæge sig i det

øjeblik, han satte strøm til en kob-berledning placeret lige ved sidenaf, og Ørsteds liv fortsatte ad enanden vej.

Naturstofkemi er som sagt etfag, som er et driftigt forskningsom-råde på DFH den dag i dag. Områ-det oplever sin store renæssance påverdensplan i disse år. Forskningenomkring naturligt forekommendekemiske forbindelser fortsætter medat være en vigtig naturvidenskabeliggrunddisciplin, som stimulerer denorganisk-kemiske tankegang. Denbidrager også til identifikation afnye farmakologisk vigtige stoffer,hvilket har en særlig interesse herpå DFH.

Samtidig fuldføres sammen-smeltningen af naturstofkemi med

en anden gammel farmaceutiskdisciplin, nemlig farmakognosi.Farmakognosi, oprindeligt “lærenom lægemidler og deres ydre kende-tegn”, har altid benyttet sig af dendeskriptive naturstofkemi, men, somallerede påpeget af den tidligereprofessor i naturstofkemi HelmerKofod under hans festtale på DFHden 20. oktober 1955, “det er en føl-ge af den almindelige udvikling, athovedvægten mere og mere synes atblive lagt på denne [naturstofkemi-ske] side af faget, på bekostning afden makroskopiske og mikroskopi-ske drogeidentifikation”.

Rustet med moderne stofidenti-fikations metoder, især NMR (kerne-magnetisk resonansspektroskopi),favoriseret af en global adgang tilplanteressourcer, og støttet af biolo-gernes farmakologiske ekspertise,står Højskolens naturstofkemikereog farmakognoster sammen ibestræbelser på at videreføre destolte traditioner af faget i detteland.

Fig. 3

Hans Christian Ørsted skrev sigind i historien med opdagelsen afelektromagnetismen, som fikafgørende betydning for denmoderne fysik. Men han begynd-te sin akademiske karriere somfarmaceut. I år er det 200 årsiden, Ørsted bestod sin farma-ceutiske eksamen.

Af Jerzy W. Jaroszewski

Idet Herrens år 1797 gik dentyveårige Hans Christian Ørsted optil farmaceutisk eksamen ved Køben-havns Universitets medicinske fakul-tet efter Kong Christian V's Forord-ning om “Medicis oc Apotecker” fra1672. For 200 år siden fandtes deringen farmaceutisk højskole – denblev først indviet i 1892.

Eksamen var en forudsætningfor at få apoteksbevilling, mennogen egentlig undervisning af far-maceuter fandtes ikke. Farmaceut-uddannelsen bestod i en læretid påapotek kombineret med selvstudi-um, samt eventuelt forelæsningerved Københavns Universitet eftermuligheder og lyst. Eksamineringblev varetaget af professorer i medi-cin fra Københavns Universitet samtaf københavnske apotekere.

Ørsteds far var apoteker i Rud-købing, og den unge Hans Christianhjalp sammen med sin yngre bror tilpå sin fars apotek fra 12 års alderen.I denne periode studerede Ørstedmed stigende interesse farmaci ognaturvidenskab. I 1794 tog han tilKøbenhavn for at fortsætte sine stu-dier.

Efter en periode op til de akade-miske adgangseksaminer, der vardomineret af sprogstudier, filosofiog æstetik, valgte Ørsted kemi somsit hovedfag. Han studerede farma-ceutiske arbejder og gik blandtandet til de netop indførte fore-læsninger i kemi, som blev holdt afprofessor Ludvig Manthey, indehave-ren af Løveapoteket.

Henimod det 18. århundredes

slutning eksisterede der ikke nogenselvstændig eksamen i fysik og kemived Københavns Universitet. Kemivar jo kun på tærskelen til at udviklesig til et moderne fag, og vejen tileksperimentel naturvidenskab førte ihøj grad gennem et apoteks labora-torium. Det er således denne vej,Ørsted har betrådt.

Den 20. maj 1797 gik han op tilExamen chemico-pharmaceuticum,som bestod af fem fag. Af de fireeksaminatorer var tre læger og enapoteker. En af eksaminatorerne,professor J. C. Tode, skrev lidt omØrsteds eksamen i det af ham udgiv-ne tidsskrift “Medizinisches-chirurgi-sches Bibliothek” under titlen “Einausgezeichnetes Apothekerexa-men”. Her beskriver Tode, at Ørstedblandt andet identificerede forelag-te friske planter, inklusive deresbotaniske og farmaceutiske navnesamt deres egenskaber, og udvistefint kendskab til den nye “antiflogis-tiske” kemi (teorierne om, at allestoffer indeholder såkaldt flogiston,en æterisk substans, muligvis med

en negativ vægt, der slipper udunder forbrænding, var netop ble-vet tilbagevist af Lavoisier).

Ørsted bag eksamenfor farmaceuterI 1800 blev Hans Christian Ørstedudnævnt til ulønnet adjunkt for“Materia medica og pharmaceutik”ved Københavns Universitet og fun-gerede som apoteker ved Løveapo-teket. Som 23-årig var Ørsted såle-des både en udøvende farmaceut oglærer for fremtidige farmaceuter.

Endnu vigtigere for den farma-ceutiske verden var det arbejde hangjorde, efter han er blevet udnævnttil professor i fysik i 1806, for at for-bedre den farmaceutiske uddannelse– ofte under modstand fra denmedicinske side. Allerede i 1806 og i1813 fremsatte Ørsted forslag tilreformering af farmaceuteksamen.Det var dog først i 1828 at det lykke-des ham, sammen med kemikerenZeise, at indføre “Ordning for phar-maceutisk eksamen” og den farma-ceutiske eksamenskommision, hvoriØrsted, som medlem, eksaminerede ifysik. Eksamen omfattede blandtandet praktiske prøver i kemi. I 1838blev censorinstitution indført ved defarmaceutiske eksaminer, og detblev overladt til eksamenskommisio-nen at fastsætte reglerne forbedømmelse. Som resultat heraf ind-førte Ørsted en karakterskala, somer blevet en forløber til modernekaraktergivning.

Naturstofkemi gennem 200 årAf de fag, som Ørsted beskæftigedesig med i sit særdeles rige professio-nelle liv er naturstofkemi det eneste,der er repræsenteret på Højskolen idag.

I 1820 publicerede Ørsted enafhandling, hvor han beskriver isole-ring af “Et nyt æsk [dvs. alkaloid] frapeberen” – det skarpt smagendestof piperin. Opdagelsen af piperinkom i kølvandet på Sertüners isole-ring af morfin fra opium i 1817, ogØrsted har således deltaget i en bøl-ge af nye landvindinger inden forkemi, hvor en række rene stoffer –

Fig. 1

5L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Lic.scient. Jerzy W. Jaroszewski

er professor ved Institut for

Medicinalkemi.

4

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

H.C. Ørsted:Farmaceut og

naturstofkemiker

Ørsteds farmaceutiske eksamensbevis fra år 1797.

Teksten lyder:

“1797 d. 20. Maji Indstillede sig til Examen Chemico Pharmaceuticum Candida-

tus Pharmaci Hans Christian Ørsted Fød i Rudkiøbing paa Langeland, hvor hans

Forœldre var Apoteker Søren Christian Ørsted, hans Moder Karen Hermansen.

Efter at have erholdt Kundskab i de Academiske Videnskaber og Undervisning af

hans Fader i de pharmaceutiske, blev han i Aaret 1794 demitteret til Universitetet

og erholdt i October Maaned s:a: in Examine Charact: laudab: Aaret derpaa Exa-

mine philosophico og Philogogico Charact. laudab. med Udmœrkelse. I Vinteren

1795 - 96 lagde han igien Vind paa Pharmacien under hans Faders Opsigt, fort-

satte derpaa sin Academiske Løbebane i Khavn, skrev en Afhandling i Æsthetiquen

som blev tilkiendt Prœmie, hørte imidlertid Forelœsninger i de medicinske Viden-

skaber under EtatsR Saxtorph Prof. Tode og Prof. Aashejm, og i de Chemiske under

Prof. Manthey - gjorde derpaa Chemien til sit Hovedfag, og ønskede sig nu Prøvel-

se i samme.”

Herefter følger karakterer og underskrifter.

Hans Christian Ørsted (1777-1851) er en af

de mest kendte danske forskere gennem tiderne.

Det viste billede er Chrétiens blyantsforlæg til

et kobberstik af 1803. Dette ungdomsportræt

pryder Danmarks Farmaceutiske Højskoles

H.C. Ørsted-medaille af 1956 der indgår,

præget i guld, i Rektors embedskæde.

Ørsteds afhandling om piperin, det stærke

smagsstof i peber, publiceret i Schweiggers Jour-

nal für Chemie und Physik, vol. 29, s. 80-82,

i feb. 1820. En kortere, fransk version blev pub-

liceret i Journal de Physique, vol. 90, s. 173-

174, i marts 1820. Stoffets bruttoformel blev

fastlagt i 1839, og strukturen opklaret i

1880’erne. Det var dog først i 1970, at struk-

turen af piperin og lignende stoffer fremgik med

stor klarhed ud fra en NMR undersøgelse.

Fig. 2

“1797

men C

Pharm

Rudkiø

Forœld

Ørsted

Efter

miske

Fader

1794

i Octo

ct: lau

hico og

Udmœ

han ig

Faders

miske

ling i Æ

Prœmi

medici

torph P

Chemi

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.07 Side 4

lægemidlernes virkning. Effektenblev målt ved at bestemme antalletaf bakteriekolonier i hver nyre, iblæren og pr. milliliter urin. Virknin-gen af hvert enkelt antibiotikumblev derefter relateret til stoffernesomsætning i musene.

Effekten af de forskellige typerantibiotika har ved andre infektions-typer kunnet relateres til specifikkefarmakokinetiske parametre, somigen afhænger af stoffernes antibak-terielle drabseffekt. Således kaneffekten af ß-lactam antibiotika,som udviser koncentrationsuafhæn-gig drabseffekt, relateres til den tid,hvor koncentrationen er over en vistærskel, der kaldes for den mindstehæmmende koncentration (MIC).Effekten af quinoloner og amino-glycosider, hvis drabseffekt derimoder afhængig af koncentrationen,kan relateres til den maksimale kon-centration, der opnås efter indgift af

stoffet samt til, hvordan koncentrati-on aftager med tiden.

Dosisstørrelse og doseringsintervalInficerede mus blev behandlet endag med forskellige doser cefurox-im, hvis drabseffekt er koncentrati-onsuafhængig, eller gentamicin, hvisdrabseffekt er afhængig af koncen-trationen. Stofferne blev givet medforskellige intervaller, og doserneblev valgt, så de gav aktive koncen-trationer i urin alene, eller i urin,serum og nyrevæv samtidig.

Cefuroxim havde bedst effekt påbakterietallet i urin samt på bakterie-tallet i nyrevæv, såfremt koncentrati-onen oversteg den mindste hæm-mende koncentration i hele urinvejs-systemet. På trods af høje urinkon-centrationer kunne cefuroxim ikkesterilisere blærevævet.

Gentamicin havde god effekt påbakterietallet i blæren og var gene-relt mere effektivt end cefuroxim.Men vævsakkumulation i nyrene,der forlængede tilstedeværelsen afstoffet i nyrevævet, gjorde det sværtat relatere effekten til urin- ellernyrevævskoncentrationer.

De største doser af begge stoffervar de mest effektive, men de valgtedoseringer var ikke i stand til at ste-rilisere urinvejene, og vi antog, atdet skyldtes utilstrækkelig behand-lingsvarighed.

Varigheden af behandlingenVi undersøgte derfor betydningenaf, hvor længe behandlingen vare-de. Inficerede mus blev behandlet ien, to eller fire dage med et af otteantibiotika: Fem ß-laktam antibioti-ka, to quinoloner samt gentamicin.Det viste sig nu, at effekten af allebehandlingerne var størst efter fire

dage. Endvidere var quinolonerneog gentamicin generelt mere effek-tive end ß-laktam antibiotika, hvil-ket svarer til resultater af kliniskeundersøgelser.

For ß-laktam antibiotika fandt vien signifikant sammenhæng mellemomfanget af nyreinfektion og dentid antibiotikakoncentrationerne varover den mindste hæmmende kon-centration i nyrevæv og blodserumefter fire dages behandling.

Blæreinfektionen viste sig atvære relativt uafhængig af antibio-tikabehandling, hvilket kan skyldes,at bakterierne sidder indkapslet iblærens slimlag eller er dækket afbiofilm. Begge dele kan forhindreantibiotika i både urin og i blodse-rum i blærevæggen i at påvirke bak-terierne. Man mener generelt, atreinfektion forårsages af bakterier,som overlever i nyrerne på trods af

behandling, men vores resultatertyder på, at det i lige så høj gradkan være blæren, som vedligeholderinfektionen.

Resultaterne viser ydermere, atsteril urin ikke nødvendigvis er ens-betydende med sterile urinveje, ognetop urindyrkning bliver i praksisbrugt som indikator for effekten afbehandling. Det vil derfor være rele-vant at undersøge, om der er bakte-rievækst i blærevægsbiopsier frapatienter, der efter endt behandlingfor nyrebækkenbetændelse har ste-ril urin.

Model med bred anvendelighedUrinvejsinfektionsmodellen i mushar vist sig at afspejle sammerespons på behandling, som kliniskeundersøgelser på patienter har vist.Modellen kan derfor anvendes til atundersøge, hvor i urinvejene bakte-

rierne sidder efter endt behandling,og hvilken form for behandling, dervil kunne sterilisere de forskelligevæv.

Modellen kan også bruges til atundersøge, om der er sammenhæn-ge mellem effekten af forskelligeantibiotikabehandlingsregimer ogspecifikke egenskaber hos visse E. coli stammer, der gør disse bak-terier særligt urinvejspatogene. Stu-dierne vil kunne belyse vigtighedenaf detaljerede undersøgelser ogtypebestemmelse af kliniske isolatermed henblik på valget af behand-ling.

Endelig kan modellen ogsåanvendes i tilsvarende undersøgelseraf behandlingseffekt ved infektionerforårsaget af andre urinvejspatoge-ne bakterier end E. coli.

Fig. 1

7L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Cand.pharm. Hanne Hvid-

berg er ph.d.-studerende ved

Institut for Farmakologi.

Dr.med. Niels Frimodt-

Møller er overlæge ved Klinisk

Mikrobiologisk afdeling,

Statens Seruminstitut.

Cand.pharm. Søren N.

Rasmussen er lektor ved

Institut for Farmakologi.

6

Ved urinvejsinfektioner i musøges effekten af antibiotika, nårviden om lægemidlets skæbne ikroppen tages med i beregnin-gerne af dosis, doseringsintervalog behandlingsvarighed. Muse-forsøg viser også, at antibiotikaikke altid har udryddet bakterier-ne, selv om urinen er steril. Détmå læger være opmærksommepå ved behandling af blærebe-tændelse og nyrebækkenbe-tændelse hos mennesker.

Af Hanne Hvidberg, Niels Frimodt-Møller og Søren N. Rasmussen

Urinvejsinfektioner er blandtde hyppigste infektionssygdommehos mennesker og forekommer isærhos kvinder; således vil mere endhver fjerde kvinde opleve mindst éttilfælde af urinvejsinfektion.

Normalt begrænser infektionensig til blæren, og disse tilfælde erikke livstruende og medfører ikkevarige mén.

Men hvis infektionen breder sigtil nyrerne, så der opstår nyrebæk-kenbetændelse, er der risiko for

vævsskader af blivende karakter, for-di nyrevævet omdannes til inaktivtbindevæv. Samtidig stiger risikoenfor, at infektionen spreder sig til blo-det. En sådan blodforgiftning kanvære livstruende.

Principperne for behandling afblærebetændelse er ganske veldoku-menterede, men dokumentationenfor varigheden af antibiotikabe-handling ved nyrebækkenbetændel-se er ikke god, og ofte finder der enreinfektion sted.

Langt den største del af tilfælde-ne af urinvejsinfektion forårsages afEscherichia coli. Antibiotika, der ereffektive overfor bakterier som E.coli, er ß-lactamer, herunder penicil-liner og cefalosporiner, quinolonerog aminoglykosider. Det er karakte-ristisk for disse stoffer, at de efterindgift resulterer i meget høje kon-centrationer i urinen i forhold til iblodet.

Mus som model for menneskerMus er generelt følsomme over forde samme bakterielle egenskaber,som sætter bakterier i stand til atkolonisere urinvejene hos menne-sker. Med en eksperimentel urinvejs-infektionsmodel i mus kan man der-for undersøge indflydelsen af dosis-størrelse, doseringsinterval og

behandlingsvarighed på effekten afbehandlingen. Samtidig kan manstudere sammenhængen mellemantibiotikas effekt og farmakokine-tik, hvilket vil sige lægemidlernesomsætning i kroppen. Undersøgel-serne er baseret på resultater frahele organer og er derfor meredetaljerede, end det er muligt atopnå ved kliniske undersøgelser påpatienter.

Vi har etableret en urinvejsinfek-tionsmodel i hunmus med det for-mål at efterligne forløbet af ennaturligt fremskridende infektion iurinvejene hos mennesker. Et lillevolumen bakterieopløsning beståen-de af et klinisk isolat af en urinvejs-patogen E. coli stamme blev injicereti blæren via et urinrørskateter, somblev fjernet umiddelbart efter injek-tionen. På denne måde opnåede vien reproducerbar urinvejsinfektion,som etablerede sig i tre fjerdedeleaf nyrerne hos musene.

Mikroskopi på nyrevæv viste heren signifikant sammenhæng mellemtilstedeværelsen af bakterier i vævetog forandringer i vævet af mereeller mindre permanent karakter.

Behandling med antibiotika Næste trin var at behandle musenemed forskellige antibiotika og måle

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Bedre behandlingaf

urinvejsinfektioner

En bakterieopløsning bestående af en urinvejs-

patogen E. coli stamme injiceres i musens blære

via et urinrørskateter. På denne måde opnåede

vi en reproducerbar urinvejsinfektion.

Fig. 2

Figuren viser effekten af 4 dages behandling af urinvejsinfektion induceret i mus. Musene blev behandlet med hhv. amoxicillin + clavulansyre, ciproflox-

acin og gentamicin. Figuren til venstre viser bakterietallet pr. ml. urin, den midterste figur viser bakterietallet pr. blære, og figuren til højre viser bakte-

rietallet pr. nyre. Bakterietallene i kontrolgruppen, der blev behandlet med saltvand, er vist til sammenligning.

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.07 Side 6

Fig. 2

Fig. 1

9

for enzymet beta-galactosidase. Det-te enzym spalter et farveløst sub-strat til et gult produkt. Idet cellernevokser på grund af stimulationen frasignalstoffet, vil de samtidig produ-cere mere enzym, og dermed øgesintensiteten af den gule farve, nårsubstratet tilsættes cellerne. Manidentificerer således nye stoffer, derstimulerer receptoren ved at måleintensiteten af den gule farve.

Fordelen ved metoden er, at dener uhyre simpel og relativt nemt harkunnet tilpasses robotudstyr, sommuligør HTS. Alle reagenserne er bil-lige, hvilket også er vigtigt, når stof-biblioteker med et meget stort antalstoffer skal screenes. Vigtigst af alter det dog, at metoden giver resul-tater, der svarer nøje til resultaterneaf mere traditionelle og besværligebiologiske tests.

Lægemidler mod Alzheimers sygdomPå Institut for Medicinalkemi har vibl.a. anvendt R-SAT til at undersøgestoffer, der aktiverer receptorernefor acetylcholin, et af hjernens sig-nalstoffer.

Det har vist sig, at acetylcholinlangsomt forsvinder fra dele af hjer-nen hos patienter, der lider af Alzhei-mers sygdom. Man håber derfor påat kunne lindre sygdommen ved atindgive stoffer, som påvirker recep-torerne for acetylcholin.

Acetylcholin selv nedbrydesmeget hurtigt i kroppen og er der-for ikke selv egnet som lægemiddel.For at et nyt stof skal være effektivt

mod Alheimers syge, skal det væreselektivt for den rette receptor foracetylcholin. I hjernen er der nemligidentificeret adskillige receptorer foracetylcholin. Der findes i alt 5såkaldte muscarine acetylcholinreceptorer i hjernen, som betegnesmAChR1-5.

I forbindelse med Alzheimerssygdom er interessen samlet omreceptoren mAChR1, som menes atvære involveret i sygdommen. Sam-tidig er det sandsynligt, at en andenreceptor for acetylcholin, mAChR3,er årsag til nogle af de bivirkninger,som acetylcholinlignende midlerofte giver.

På Institut for Medicinalkemi harvi derfor arbejdet på at udvikle nyestoffer, som gerne skulle være selek-tive for mAChR1 receptoren. To afdisse stoffer er 0-Methyl-THPO og 0-Methyl-THAO. Der er en vis struktur-lighed mellem acetylcholin og denye stoffer, men i modsætning tilacetylcholin, nedbrydes stoffernelangsomt i kroppen, hvorfor de erpotentielt mere anvendelige somlægemidler mod Alzheimers syg-dom.

De to stoffer er testet med R-SAT metoden, som viste, at begge eri stand til at stimulere de muscarineacetylcholin receptorer mAChR1 ogmAChR3. Desværre påvirker beggestofferne de to receptorer mednæsten samme styrke, hvilket be-grænser deres mulige anvendelsesom Alzheimermiddel, fordi stoffer-ne formentlig vil have bivirkninger.Ved at ændre yderligere på struktu-

rerne og syntetisere nye analoger erder dog mulighed for at øge selekti-viteten for mAChR1 receptoren ogdermed for udvikling af stoffer, derkan anvendes mod Alzheimers syg-dom.

Test på humane receptorerDer er andre fordele ved R-SAT endden store kapacitet og mulighedenfor at teste stoffers virkning på spe-cifikke receptorer. F.eks. kan manindsætte gener for flere receptorersamtidigt og dermed screene stof-biblioteker mod flere målreceptorerpå en gang. Dermed spares både tidog penge. Stoffer, der viser sig atvære aktive, vil herefter kunnetestes på hver enkelt receptor for atidentificere stoffets selektivitet.

Under udvikling af nye læge-middelstoffer er det først i de sidstestadier af udviklingsprocessen, at denye lægemiddelstoffer testes påmennesker i kliniske forsøg. Traditio-nelt har man udviklet disse stofferpå baggrund af farmakologiske stu-dier på forsøgsdyr. Selvom lighedenmellem receptorerne hos menneskerog f.eks. rotter oftest er meget stor,vil der altid være små forskelle, somnogle gange viser sig at have storbetydning. Man risikerer således atstå med et potentielt nyt lægemid-delstof, som har den ønskede virk-ning på rottens receptorer, men somhar en anden virkning på de tilsva-rende receptorer i mennesker.

Da man i R-SAT anvender gener,der koder for receptorer, kan manisolere genet for receptorerne framenneskets DNA, og dermed harman altså mulighed for at teste påhumane receptorer på et meget tid-ligere tidspunkt i udviklingsforløbetog dermed reducere risikoen for atudvikle et nyt rottelægemiddel.Metoder som R-SAT vil dog aldrighelt kunne erstatte dyreforsøg.Receptorer er en del af en hel orga-nisme, og det vil derfor altid ogsåvære vigtigt at teste stofferne i dyr,hvor receptorerne sidder i deresnaturlige miljø og indgår i et kom-plekst samspil med andre receptorer.

L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Ph.d. Hans Bräuner-Osborne

er forskningsadjunkt ved

Institut for Medicinalkemi.

Dr.pharm. Povl Krogsgaard-

Larsen er professor ved

Institut for Medicinalkemi.

8

Det tager år og koster milliarderat udvikle et nyt lægemiddel.Derfor forskes der intensivt i nyemetoder, som hurtigere og billi-gere kan identificere nye læge-middelstoffer. DFH er med til atudvikle en genteknologisk meto-de, som kan screene tusindvis afstoffer på en dag. Metodenanvendes nu til at teste potenti-elle lægemidler til behandling afAlzheimers sygdom.

Af Hans Bräuner-Osborne og Povl Krogsgaard-Larsen

De gennemsnitlige omkostnin-ger ved udvikling af nye lægemidlerer i dag på omkring to milliarderkroner. Samtidig tager det typisk 13år fra et projekt startes, til lægemid-let endelig kan markedsføres.

For at sænke omkostningerneog reducere tidshorisonten satsesder voldsomt på at udvikle nyemetoder, som vil gøre processen bil-ligere og hurtigere. Der er flereårsager til, at man ønsker en hurti-gere udvikling af nye lægemidler.Dels konkurrerer medicinalfirmaerneom at komme først med nye pro-dukter, dels gælder patentet på etlægemiddelstof kun i 20 år, hvorafde første 10 til 15 år går med udvik-lingen af medicinen. Ved at mar-kedsføre lægemidlet hurtigere vil

man have eneretten på produktet ilængere tid, hvilket øger indtje-ningsmuligerne.

Der er især to områder, hvorman satser stærkt på at udvikle nyemetoder. Det første er kombinato-risk kemi, hvor syntesen af nyelægemiddelstoffer systematiseres, sårobotter på kort tid kan fremstille etvæld af forskellige stoffer. Det andeter biologisk screening (High-Through-put Screening, HTS), hvor den biolo-giske testning af nye lægemiddel-stoffer ligeledes primært foretagesaf robotter.

Disse metoder har en meget storkapacitet, og det er i øjeblikketmuligt at teste op mod 10.000 stof-fer om dagen. Indenfor få år spåsdet, at antallet kommer op på mel-lem 100.000 og en million stoffer omdagen.

Stoffer og receptorerUnder et studieophold på Universityof Vermont i USA indgik Hans Bräu-ner-Osborne meget centralt i et pro-jekt vedrørende udviklingen af etnyt HTS system, som kaldes ReceptorSelection and Amplification Techno-logy (R-SAT). Vi anvender nu syste-met til at teste den biologiske aktivi-tet på receptorer i hjernen af stoffer,som er syntetiseret på Institut forMedicinalkemi, og systemet er sam-tidig hjørnestenen i det nye firmaAcadia Pharmaceuticals, som netophar startet et datterselskab i Glo-strup.

Metoden bruges til at teste,hvordan lægemiddelstoffer ognaturlige signalstoffer påvirker cel-ler, og ideen bag R-SAT er egentligret simpel. Udgangspunktet er encellelinie, der består af celler, som iprincippet kan blive ved med at delesig i det uendelige. Den anvendtecellelinie hedder NIH-3T3, og celler-ne har den specielle egenskab, at dehar “berøringsangst”, hvilket inde-bærer, at cellerne stopper med atdele sig og går i en slags dvaletil-stand, når de er vokset så meget, atde begynder at røre hinanden.

Det er dog muligt at overvindedenne kontakthæmning, når manstimulerer cellerne med visse signal-stoffer. Da cellerne stammer fra enhudcelle, er der dog mange af hjer-nens receptorer, som ikke findes påcellerne, hvorfor de ikke reagerer påen del af hjernens signalstoffer. Net-op hjernens signalstoffer er vortforskningsfelt, men problemet løsesdog nemt ved at tilføre cellen detgen, som koder for den pågældendereceptor, som man har isoleret frahjernen ved hjælp af genteknologi.Herefter vil cellen reagere på hjer-nens signalstof og begynde at voksei takt med, at koncentrationen afstoffet øges.

Vækstøgningen kan i princippetmåles på mange måder, men i R-SATvalgte vi en metode, som er enkelog let at håndtere. Samtidigt med,at vi indfører genet for receptoren,indfører vi også et gen, der koder

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Genvejtil nye

lægemidler

0-Methyl-THPO og 0-Methyl-THAO er ana-

loger af signalstoffet acetylcholin, hvor den

hydrolyserbare esterfunktion er blevet udskiftet

med en heterocyklisk bioisoster gruppe. Dermed

bliver de to analoger ikke nedbrudt så hurtigt

i kroppen. De to analoger er blevet testet med

R-SAT på de to muscarine receptorer, mAChR1

og mAChR3. Som det ses, er stofferne ikke spe-

cifikke for en receptor subtype.

Hans Bräuner-Osborne arbejder her ved en sterilbænk med hudceller, der har fået indsat gener, så de

danner receptorer, som findes på hjernens nerveceller. Cellerne bruges bl.a. til at undersøge de struk-

turelle krav til potentielle lægemidler til behandling af Alzheimers sygdom.

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.07 Side 8

Fig. 3

11L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

hvilket er af afgørende betydningfor udviklingen af lægemidler. Manmener i dag, at det stimulerendesignalstof glutaminsyre og enbestemt modtagerstation for stoffet,NMDA-receptoren, spiller en centralrolle i hukommelsesprocesserne.

Når glutaminsyre fra en afsen-dercelle bindes til modtagerensNMDA-receptorer, er det imidlertidikke nok til at aktivere modtagercel-len. Den skal også depolariseres.

Dette forløb kan ske på tomåder. Ved synkron stimuleringforårsager en eller flere afsendereden nødvendige depolarisering,medens en eller flere andre afsende-re samtidig frigiver det nødvendigeglutaminsyre til stimulering afNMDA-receptoren. Alternativt kanvedvarende stimulering gennem englutaminsyrefrisættende afsender-celle forårsage den nødvendigedepolarisering og samtidig stimulereNMDA-receptoren. I begge tilfældeskabes der en langtidspotentiering,hvorigennem hukommelsesindtryk-ket lagres.

Når NMDA-receptoren aktiveres,sker der en indstrømning af ioner icellen, hvilket starter en række kas-kadeprocesser, som fører til dannelseaf nye sekundære budbringere. Deter stoffer, som aktiverer en rækkeforskellige enzymer, der selektivtændrer faconen af bestemte prote-iner og dermed deres egenskaber.

Sådanne proteiner indgår iopbygningen af ionkanaler i nerve-cellernes membraner. Når proteiner-ne ændrer facon, ændres kanalernesstruktur således, at nervecellen lette-re aktiveres, hvorved tærskelværdienfor den nødvendige mængde af sti-mulerende signaler sænkes. Samti-dig fører en længerevarende depo-larisering af modtagercellen via desekundære budbringere til stabili-tetsændringer af forskellige enzy-mer, hvilket igen fører til øget syn-aptisk effektivitet.

Gener aktiveres ved langtidshukommelseDe hidtil beskrevne forstærknings-processer finder sted indenforminutter. Længerevarende potentie-ringer kræver aktivering af gener,efterfulgt af produktion af proteinerog overordnede strukturelle ændrin-ger i nervekredsløbene.

Tidligt i hukommelsesforløbet,ca. 30 minutter efter, at forstærk-ningsprocesserne er startet, begyn-der bestemte gener at producereproteiner. Disse førstdannede prote-iner binder sig til nye DNA-områder.Herved aktiveres en lang rækkeandre gener, som fremstiller prote-iner, der er af stor vigtighed for deoverordnede strukturelle ændringer.Ændringerne omfatter sandsynligvisen forøgelse af kontaktfladen mel-lem neuronerne samt flytning afsynapsen til en slags udposning pånervecellen. Flytningen bevirker, atdepolariseringsforløbet effektivise-res, hvorved tærskelværdien og der-med modtagernervecellens depolari-sering lettere nåes.

Ud over glutaminsyresystemetindvirker en lang række modulatori-ske signalstofsystemer på hukom-

melsesprocessen. Dette meget kom-plekse biokemiske samspil rummeret stort antal angrebsmål for læge-midler, der indvirker på hukommel-sesprocessen og som således kantænkes anvendt i behandlingen afdemens.

Udvikling af lægemidlerSyntesegruppen har fremstillet flerenye receptorselektive glutaminsyre-analoger. Disse unikke forbindelservil forhåbentligt bidrage til forståel-sen af de strukturelle krav til stoffer,som kan påvirke de enkelte under-typer af glutaminsyrereceptorer.Sådanne informationer er værdiful-de ved udviklingen af lægemidler tilbehandling af demens.

Gruppen udvikler samtidig stof-fer, som selektivt påvirker forskelligereceptorer for gamma-aminosmørsy-re (GABA), der hæmmer nerveceller-nes aktivitet. Det antages her, ataktivering af den såkaldte GABAB-receptor fører til formindsket GABA-frisættelse og dermed en svækkelseaf det hæmmende signal. Stoffer,som blokerer denne receptor, vil der-for føre til en øget inhibitorisk akti-vitet, hvilket kan tænkes hensigts-mæssigt i behandlingen af de syg-domsprocesser, som fører til Alzhei-mers syge. Stoffer, som stimulererreceptoren, vil derimod mindske dehæmmende signaler, hvilket vil værehensigtsmæssigt på et senere stadieaf Alzheimers syge.

Under medicinalkemikernessøgen efter nye potente og selektiveforbindelser spiller det en stor rolle,at synteserne kan udføres i stortudbytte og renhed. Det er medsådanne forhold in mente, at syn-tesegruppen lægger særlig storvægt på udvikling af nye syntese-metoder, der kan opfylde de krav,som fremstillingen af nye, interes-sante forbindelser stiller.

10

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Alzheimerssyge og

hukommelsens kemiPatienter med Alzheimers syg-dom mister gradvist og uigenkal-deligt hukommelsen. Udviklin-gen af lægemidler, som kan øgederes evne til at huske, kræverindsigt i de biokemiske processerbag hjernens behandling, lagringog genkaldelse af hukommel-sesindtryk.

Af Alex Haahr Gouliaev og Mikael Begtrup

Ved Institut for Medicinalkemiarbejder flere forskningsgrupper påat udvikle et effektivt lægemiddel ibehandlingen af Alzheimer’s syge.En mulig behandling omfatter for-bindelser, som mildner demenstil-standen ved at fremme evnen tillagring og genkaldelse af hukom-melsesindtryk.

Tilvejebringelsen af sådannelægemidler kræver en god indsigt ide biokemiske mekanismer i hjer-nen. I de seneste årtier er der påinternationalt plan gjort så væsentli-ge opdagelser, at man efterhåndenkan give rimelige forklaringer på,hvorledes hjernen behandler, lagrerog genkalder information.

Den menneskelige hjerne funge-rer ved hjælp af neurale netværk.Nettene består af et stort antal ner-veceller, som indbyrdes er forbundetmed kontakter, der kaldes synapser.Hver nervecelle i et netværk kanantage to tilstande: aktiv eller inak-tiv. Den øjeblikkelige tilstandafgøres af de input, cellen modta-ger. Disse signaler virker enten hæm-mende eller stimulerende.

Alle impulser forårsager imidler-tid ikke lige stor effekt på modta-gercellen. Derfor taler man om sva-

ge og stærke synapser. Den styrke,hvormed en modtager opfatter enimpuls fra en bestemt afsender, kal-des for den synaptiske effektivitet.For at modtagernervecellen kan skif-te til aktiv tilstand kræves det, atsummen af de enkelte input erstørre end en vis tærskelværdi.

Indtryk lagres i hukommelsessporLagring af informationer finder stedgennem indstillinger af synaptiskeeffektiviteter og tærskelværdier. Nårdisse reguleres, ændres den vigtig-hed, som modtagernervecellerne til-lægger indkommende impulser frabestemte afsendere. Herved dannesforudbestemte aktivitetsmønstre,som kaldes potentierede netværk.Der er hermed skabt et hukommel-sesspor.

Når der efterfølgende sendes enlignende impuls ud i nettet, er deren øget sandsynlighed for, at netopdet potentierede net aktiveres. Ensådan reaktivering af et alleredepotentieret net opfattes som engenkaldelse af information.

Efterhånden som mængden aflignende informationer vokser, vilrelaterede informationer ikke blivelagret individuelt i separate net,men i net der forbindes med detallerede eksisterende. Denne fusi-onsproces kan betragtes som en pro-grammeringsfase, hvor resultatet bli-ver et program, som kan foretageberegninger på nye input. Herved

mindskes enkeltinformationernesbetydning til fordel for en associativog intuitiv hukommelse.

Vedvarende impulser bag hukommelsenMan mener i dag, at kraftig vedva-rende stimulering fra en eller flereafsendernerveceller kan føre til enændring i synaptiske effektiviteter ogtærskelværdier i de synapser, som erinvolverede i processen. Herved dan-nes de potentierede net, som opbe-varer vore hukommelsesindtryk. Selveprocessen er dog underlagt modulati-on fra andre net, som på et overord-net fortolkningsniveau kan betragtessom værende motivation/opmærk-somhed/interesse overfor et givetinput. Disse modulatoriske systemerhar dermed også indflydelse på,hvorvidt en information skal lagreslang tid, kort tid eller slet ikke.

I hjernesnit fra forsøgsdyr harman kunnet inducere korte potentie-ringer med varigheder af 20-30 sek.,potentieringer med varigheder afminutter, samt potentieringer, som erlangtidsstabile. De forskellige poten-tieringstyper repræsenterer muligvisen form for kort-, mellem- og lang-tidshukommelse, og ændringer iinformationslagringen fra kort tid tillang tid kaldes hukommelseskonsoli-dering.

Biokemien bag processerneSpørgsmålet er nu, hvordan sådanneprocesser kan beskrives biokemisk,

Ph.D. Alex Haahr Gouliaev

er seniorkemiker ved firmaet

Neurosearch.

Lic. techn. Mikael Begtrup er

professor ved Institut for Medi-

cinalkemi.

Fig. 2Fig. 1

Figuren illustrerer det komplekse biokemiske

samspil, som finder sted under hukommelses-

processen. De biokemiske processer udgør

angrebsmål i jagten på lægemidler til behand-

ling af senil demens.

Her ses et udvalg af de forbindelser, som syntese-

gruppen arbejder med. Stofferne påvirker selek-

tivt forskellige receptorer på nervecellerne, som

er involveret i hukommelsesprocessen.

I et moderne synteselaboratorium arbejdes der

ofte med reaktionsdygtige, fugtfølsomme og

eksotiske udgangsstoffer i en kemisk inaktiv

beskyttelsesatmosfære. Her sættes med kanyle en

organisk palladium katalysator til en reaktions-

blanding. Trykket i reaktionskammeret styres

fra ballonen, der indeholder nitrogen.

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.07 Side 10

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 1

13L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Dr.scient. Harald S. Hansen

er docent ved Institut for

Farmakologi.

Cand.scient., ph.d. Birthe

Moesgaard er forskningsadjunkt

ved Institut for Farmakologi.

Cand.pharm. Henrik H.

Hansen er ph.d.-studerende

ved Institut for Farmakologi.

Cand.pharm., ph.d. Inga

Björnsdottir er forsknings-

adjunkt ved Institut for Ana-

lytisk of Farmaceutisk Kemi.

Lic.scient. Jerzy W. Jaroszewski

er professor ved Institut for

Medicinalkemi.

Dr.pharm. Steen Honoré

Hansen er professor ved

Institut for Analytisk of

Farmaceutisk Kemi.

NAPE-dannelse i hjernevævVi forsøger at etablere en række ana-lysemetoder, der kan måle mængdenaf NAPE i hjernevæv fra forsøgsdyr.NAPE udgør kun en forsvindende lilledel af hjernens fosfolipider, så derforskal analysemetoden være megetspecifik og følsom. Vi anvender ker-ne-magnetisk-resonans-spektroskopi(NMR) til at kvantisere akkumuleringaf NAPE i rottehjerner.

NMR-teknikken er baseret på, atprøven, f.eks. ekstrakter af rottehjer-ne, anbringes i et kraftigt magnet-felt. Herved ordner atomkernerne sigsom små stangmagneter, så de liggerlangs med magnetfeltets linier. Den-ne orden kan forstyrres med radio-bølger. Radiobølgerne udsendes ikorte pulser, og når en puls afbrydes,roterer atomkernerne tilbage påplads i magnetfeltet. Derved frem-bringer de elektriske signaler, somgiver oplysninger om atomernes artog deres kemiske placering i moleky-lerne. Sådanne informationer gør detmuligt at bestemme prøvens sam-mensætning.

Radiobølgernes frekvens kan ind-stilles, så de påvirker specifikke ato-mer. I dette tilfælde har målet væretfosfor-31, som findes i alle typer fos-folipider. Da signalet fra fosfor-31afhænger af de kemiske omgivelser,har det været muligt at bestemmemængden af de forskellige fosfolipi-

der i ekstraktet fra rottehjernerne.På den baggrund kunne vi påviseNAPE-dannelse som følge af den ilt-mangel i hjernen, der indtræder veddøden (se fig. 2).

NAPE findes i flere former, deradskiller sig ved deres indhold afforskellige fedtsyrer, og som derforhar forskellig masse. En anden tek-nik, som kaldes electrospray-ionise-rings massespektroskopi, har gjortdet muligt at påvise mængderne afhvert enkelt type NAPE-molekyle,som findes på ionform. Ionerne sen-des nu gennem et magnetfelt, hvorderes baner afbøjes. Graden afafbøjningen afhænger af ionernesmasse, hvorved NAPE-molekyler medvarierende masse adskilles. Metodenbestemmer samtidig mængden af deforskellige molekyler (se fig. 3).

Stofferne i den levende hjerneDer er endnu en række uafklaredespørgsmål: Dannes NAPE og NAE iforbindelse med nervedød i hjer-nen? I givet fald, hvor, hvornår, ihvor store mængder og hvorlænge?Har stofferne en beskyttede effektmod nervedød i den levende hjerne?Og hvordan virker de? Disse spørgs-mål søges afklaret ved at målemængden og fordelingen af NAPE ihjernen fra forsøgsdyr. Der anvendesforsøgsmodeller for neurodegenera-tive sygdomme og efter blodprop-per i hjernen, hvor nerveceller går tilgrunde.

På længere sigt håber vi på, atundersøgelserne kan bidrage til bed-re behandling af de neurodegenera-tive sygdomme og eftervirkninger aff.eks. blodpropper i hjernen.

12

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Et forsvar mod nervedød?

Nerveceller dør efter en blodpropi hjernen samt ved Alzheimerssygdom og Parkinsons syge. For-søg med cellekulturer tyder på,at hjernen søger at forsvare sigmod celledøden ved at danne tospecifikke stoffer. Stoffernes bio-logiske funktioner skal nu nær-mere afklares i dyreforsøg. Håbeter, at denne viden kan bidrage tilat udvikle nye behandlingsfor-mer mod disse stærkt invalide-rende og dødelige sygdomme.

Af Harald S. Hansen, Birthe Moesgaard, Henrik H. Hansen, Inga Björnsdottir, Jerzy W. Jaroszewski ogSteen Honoré Hansen

Hvis man anbringer dyrkedenerveceller i et reagensglas og til-sætter høje koncentrationer af sig-nalstoffet glutaminsyre, så dør cel-lerne gradvist. En tilsvarende procesfinder sandsynligvis sted i hjernenved sygdomme som Alzheimers syg-dom, Parkinsons sygdom og Hun-tingtons sygdom. Desuden bidragerforhøjede koncentrationer af gluta-minsyre sandsynligvis til at slå nerve-celler ihjel, når der opstår iltmangeli hjernen efter en blodprop.

Imidlertid viser forsøg med celle-kulturer ikke blot, at høje doser afglutaminsyre kan få de dyrkede ner-

veceller til at henfalde og dø. Veddette henfald producerer nervecel-lerne to stoffer, som kaldes NAPE ogNAE. Disse stoffer dannes sandsyn-ligvis som en forsvarsmekanismemod cellebeskadigelsen.

Teorien bygger bl.a. på, at ner-vecellerne bedre overlever høje kon-centrationer af glutaminsyre, nårman samtidig tilfører NAE til celle-kulturen. På den baggrund er detinteressant at studere, hvordan deto stoffer dannes i nervecellerne ogundersøge deres biologiske funktio-ner i hjernen.

Aktive lipider fra membraner NAE og NAPE dannes ud fra bygge-stenene i biologiske membraner.Alle celler indeholder membraner,herunder også cellemembranen, somomgiver cellen. Byggestenene imembranerne er en type fedtstoffer,der hedder fosfolipider. En lille delaf membranernes fosfolipider bliverjævnligt spaltet af enzymer, såledesat der dannes bioaktive lipider, derfungerer som signalstoffer; dels påcelleoverfladen, dels inde i cellen.

Prostaglandiner er et eksempelpå bioaktive lipider, der virker ikommunikationen mellem cellerne.Prostaglandinerne er lokalhormoner,der medvirker i forskellige processersom f.eks. fødsel og betændelsestil-stande. Diacylglycerol er et eksempelpå et bioaktivt lipid, der virker somet signalstof inde i cellerne. Stoffetaktiverer her specielle enzymer, somstyrer cellens funktioner.

Stofferne dannes i cellekulturerNAPE forekommer normalt ikke ipattedyrceller. Stoffet kan dog dan-nes relativt langsomt i nervecellerfra hjernen, når cellerne beskadiges.Denne dannelse udføres af etenzym, der aktiveres af calciumioner,som optages af cellen ved beskadi-gelse af dens cellemembran. En lilledel af det dannede NAPE omdannesderpå til det mindre lipid NAE vedhjælp af et andet enzym (fig. 1).

I øjeblikket har man ikke en klarforståelse af de to stoffers biologi-ske funktion. En række resultater afforsøg med cellekulturer kan imid-lertid tolkes i retning af, at stoffernevirker som bioaktive lipider, der sta-biliserer cellen. De dannes måskesom en forsvarsmekanisme mod cel-lebeskadigelsen.

Høje koncentrationer af signal-stoffet glutaminsyre er giftigt fornerveceller. Et forhøjet niveau afglutaminsyre i hjernen bidragersandsynligvis til det henfald af ner-veceller, som man ser både ved ilt-mangel i hjernen efter en blodprop,og ved en række neurodegenerativesygdomme som Alzheimers sygdom,Parkinsons sygdom og Huntingtonssygdom.

I dyrkede nerveceller stimulererhøje koncentrationer af glutaminsy-re dannelsen af NAPE og NAE. Indtilvidere er produktionen af NAPE ogNAE især blevet studeret i cellekul-turer, og man ved endnu ikke nøjag-tigt, hvor og hvornår disse lipiderdannes i den levende hjerne.

Figuren viser dannelse af NAPE og NAE samt

nedbrydning af NAE ved hjælp af enzymer.

NAPE kan dannes ud fra fosfolipidet PtdEtn

ved overførsel af en fedtsyre fra PtdCho til Ptd-

Etn. Dette sker ved hjælp af enzymet N-acyl-

transferase. NAPE kan spaltes til NAE og Ptd-

OH ved hjælp af fosfolipase D-enzymet, og

NAE kan nedbrydes til fedtsyre og ethanolamin

ved hjælp af amidaseenzymet.

Her ses et fosfor-31-NMR spektrum af fosfoli-

pider i et ekstrakt af en rottehjerne, der blev

udtaget fire timer efter aflivningen. Arealet af

toppene er proportional med mængden af de

pågældende fosfolipider. Det ses at NAPE kun

udgør en lille del af den samlede fosfolipid-

mængde. Der kan ikke påvises NAPE, når hjer-

nen ekstraheres umiddelbart efter dødens ind-

trædelse.

Figuren viser et massespektrum af samme hjer-

neekstrakt med angivelse af de negativt ladede

ioner, som repræsenterer individuelle fosfolipid-

molekyler. Toppene med masserne 976-1057

repræsenterer forskellige NAPE-molekyler og de

andre toppe er ioner af mere simple fosfolipider

som PtdEtn. Højden af toppene er proportional

med mængden af de pågældene molekyler.

Cardiolipin NAPE

PtdEtnplas

PtdEtn

PtdSer

Sphingo-myelin PtdIns

ppm 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.08 Side 12

Fig. 4

Fig. 3

Fig. 1

Fig. 2

15L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Ph.d. Tommy N. Johansen

er lektorvikar ved Institut

for Medicinalkemi.

Akademiingeniør Erik Falch

er forskningslektor ved Insti-

tut for Medicinalkemi.

Studier af stoffers biologiske aktivitetFor nogle år siden blev forbindelsenAPPA syntetiseret på Institut forMedicinalkemi. Ved undersøgelse afstoffets biologiske aktivitet, viste detsig, at racemisk APPA var en partielagonist ved en undertype af (S)-glu-taminsyre receptorerne.

For bedre at kunne forstå bag-grunden for stoffets evne til at akti-vere receptorerne uden at oversti-mulere dem har vi adskilt de tospejlbilledformer og undersøgt deresbiologiske aktivitet. Disse studierviste, at (S)-formen af APPA stimule-rer receptorerne maksimalt, mens(R)-formen blokerer de sammereceptorer.

Disse modsat rettede effekterhar vi undersøgt nærmere ved atsyntetisere nye stoffer, der struktu-relt ligner APPA. Biologiske studiermed racemisk 2-Py-AMPA og 2-Fu-AMPA viste, at de to stoffer er væ-sentlig stærkere end racemisk APPA.Desuden viste studierne, at de nyestoffer til forskel fra racemisk APPAikke er partielle agonister, men at destimulerer receptorerne maksimalt.Men hvordan ser billedet ud, hvisman i stedet studerer de rene spejl-billedformer? For at finde ud af det-te måtte vi adskille spejlbilledfor-merne.

Rene spejlbilledformer medHPLC kromatografiInden for de seneste år er det tek-nisk blevet lettere at opnå renespejlbilledformer. Det skyldes bl.a.nye kolonner til højtryksvæske kro-matografi (HPLC), som specifikt erudviklet til formålet. Kolonnen be-står af et stålrør fyldt op med et fin-kornet pakkemateriale, som kanmodstå det høje tryk, der etableres,når væske presses gennem kolon-nen.

De nye, såkaldte chirale kolon-ner indeholder typisk en optisk aktivforbindelse, som sidder fast bundettil kolonnens pakkemateriale. For-bindelsen udvælges således, at dener i stand til at danne kompleksermed de to spejlbilledformer, derønskes adskilt.

I den ideelle situation vil kunden ene af de to spejlbilledformerdanne et stærkt kompleks med denoptisk aktive forbindelse og dervedblive kraftigt tilbageholdt i kolon-nen, mens den anden spejlbilled-form bindes og tilbageholdes i langtmindre udstrækning. Herved opnåsadskillelse af de to spejlbilledformer.På en udskrift registreres dette somto lige store toppe, der stammer frahver sin spejlbilledform.

Chirobiotic T kolonnen er en for-

holdsvis ny chiral HPLC kolonne, derhar det optisk aktive stof teicoplaninbundet til kolonnens inderside. Den-ne kolonne er særdeles velegnet tiladskillelse af aminosyrer som 2-Py-AMPA og 2-Fu-AMPA.

Renhedsanalyse af spejlbilledformerVed undersøgelse af en ren spejlbil-ledforms biologiske aktivitet er detvigtigt, at indholdet af den modsat-te spejlbilledform er meget lavt. Tid-ligere blev renheden typisk bestemtved måling af molekylernes optiskedrejning, men på grund af en lavfølsomhed er denne metode ikkevelegnet. Chiral HPLC har nu fundetstor anvendelse på grund af væsent-lig højere følsomhed.

Et problem ved anvendelse afchiral HPLC til renhedsanalyse erimidlertid toppenes form, fordispejlbilledformer ved analyse på chi-rale kolonner ofte giver toppe medudtalt “haledannelse”. Det betyder,at en given chiral HPLC kolonne ermest velegnet til renhedsanalyse,når den uønskede spejlbilledform,urenheden, kommer ud af kolonnenfør den ønskede form. I praksis erdet ofte nødvendigt at anvende toforskellige kolonner med selektivitet

for hver sin spejlbilledform for atkunne foretage en nøjagtig ren-hedsanalyse af begge former.

Design af nye modelstofferBiologisk karakterisering af de renespejlbilledformer viste, at (S)-former-ne af 2-Py-AMPA og 2-Fu-AMPA i lig-hed med (S)-APPA, er i stand tilselektivt at stimulere AMPA-recepto-rene maksimalt. De to nye stoffer erer henholdsvis 40 og 100 gangestærkere end (S)-APPA.

Dette viser, at tilstedeværelsenaf kvælstof eller ilt i den cykliskegruppe i molekylet tilsyneladendehar stor betydning for stoffernesbiologiske potens. Endvidere vistemålingerne, at de to (R)-former med6-ledede cykliske grupper, (R)-APPAog (R)-2-Py-AMPA, var lige gode tilat blokere receptorerne, mens (R)-2-Fu-AMPA, som har en lidt mindre 5-ledet gruppe, ikke havde denneegenskab.

Racemisk 2-Py-AMPA består såle-des af en (S)-form, der kan stimulerereceptorerne maksimalt og en (R)-form, der kan blokere de sammereceptorer, men da (S)-2-Py-AMPA ermeget kraftigt virkende, ses kun denstimulerende komponent, når manundersøger racematets effekt. Detteviser, at aktivering og blokade afreceptorer stiller forskellige struktu-relle krav.

De komplicerede sammenhængemellem de omtalte spejlbilledfor-mers struktur og deres biologiskeaktivitet vil blive udnyttet i design afnye modelstoffer til behandlingen afAlzheimers sygdom.

14

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Lægemiddelforskning med rene

spejlbilledformerMange lægemiddelstoffer findes ito spejlbilledformer, som erkemisk ens, men er rumligt for-skellige – ganske som højre ogvenstre hånd. Normalt er kun denene form aktiv, mens den andenkan medføre bivirkninger. For atminimere risikoen for bivirkningerer det vigtigt at anvende den rene,virksomme spejlbilledform frem-for en blanding af begge former.

Af Tommy N. Johansen og Erik Falch

Mange lægemidler på detdanske marked tilhører en gruppe afstoffer, som forekommer i to spejl-billedformer. Det vil sige stoffer, derhar identiske fysiske og kemiskeegenskaber, men som er rumligt for-skellige. På trods af, at det ofte kuner den ene spejlbilledform, som harden ønskede virkning, anvendes alli-gevel en blanding af de to formerved lægemiddelfremstillingen.

Når lægemidlerne indeholderbegge spejlbilledformer, skyldes det,at lægemiddelstofferne normalt syn-tetiseres som en lige blanding afbegge former. En sådan ligelig blan-ding kaldes et racemat eller en race-misk forbindelse. Samtidig har dettidligere været svært at skille spejl-billedformerne fra hinanden. En nyvariant af højtryksvæske kromato-grafi (HPLC) gør det imidlertidmuligt at adskille formerne. Dermedkan hver spejlbilledform nu renfrem-stilles.

Adskillelse af et lægemiddelstofsspejlbilledformer kan blive til gavnfor patienterne, fordi man kan redu-cere dosis og dermed formindskerisikoen for bivirkninger. Ydermereer rene spejlbilledformer et fremra-gende forskningsværktøj ved udvik-

ling af nye lægemidler, f.eks. tilbehandling af hjernens sygdomme.

Alzheimers sygdom og spejlbilledformerPå Institut for Medicinalkemi har vigennem en årrække beskæftiget osmed udvikling af potentielle læge-middelstoffer til behandling af alvor-lige sygdomme i hjernen, f.eks. Alz-heimers sygdom, der medfører sværdemens og ender med døden. Syg-dommen kan ikke behandles i dag.

Alzheimers sygdom er en til-stand, hvor områder af hjernen ikkefungerer normalt. På nuværendetidspunkt har man ringe kendskab tilde processer, der forårsager Alzhei-mers sygdom, men overaktivitet i vis-se nervebaner menes at være afbetydning.

Disse nervebaner benytter denene spejlbilledform af signalstoffet

glutaminsyre til at sende impulserfra en nervecelle til den næste. Den-ne form kaldes for (S)-formen, mensden anden, (R)-formen, ikke findes ihjernen. Overaktiviteten i glutamin-syresystemet i de pågældende ner-vebaner medfører, at nervecellerhenfalder og dør. En blokade af ner-vecellernes receptorer for (S)-gluta-minsyre er derfor en mulig behand-lingsstrategi.

En fuldstændig blokade er imid-lertid uheldig, fordi der kræves envis aktivitet i nervebanerne for atopretholde nogle af hjernens grund-læggende funktioner som evnen tilindlæring og hukommelse. Teoretiskkan denne situation løses ved atanvende en forbindelse, der aktive-rer receptorerne, men som samtidigtforhindrer overstimulationen. Et stofmed sådanne biologiske egenskaberkaldes en partiel agonist.

Den kemiske struktur af spejlbilledformerne af

APPA, 2-Py-AMPA og 2-Fu-AMPA.

Ved stereokemisk renhedsanalyse ved chiral

HPLC er det vigtigt at anvende forskellige

kolonner, så urenhederne kommer ud før hoved-

toppen. Til højre ses analyse af (S)-2-Fu-AMPA

på en (S)-pipecolinsyre kolonne, og til venstre ses

analyse af (R)-2-Fu-AMPA på en Chirobiotic

T kolonne. De stereokemiske urenheder på hhv.

0.05 og 0.1% er markeret med pile.

Et HPLC-system består af en pumpe (nederste

modul) og en UV-detektor. Til højre ses en chi-

ral HPLC-kolonne, som er forbundet til syste-

met ved hjælp af stålrør. Det drejer sig om en

Chirobiotic T kolonne beregnet til analytiske

formål.

Begrebet spejlbilledformer er illustreret ved hjælp af (R)- og (S)-glutaminsyre. De to spejlbilledformer

kan ikke bringes til fuldstændigt at overlejre hinanden. I hjernen findes kun (S)-glutaminsyre.

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.08 Side 14

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 1

17L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Lic. scient. Orla Miller

Larsson er lektor ved Insti-

tut for Farmakologi.

Cand. pharm. Tina Bolvig er

ph.d.-studerende ved Institut

for Farmakologi.

Dr. scient. Arne Schousboe

er professor ved Institut for

Farmakologi.

hæmme GABA-optagelsen i astrocyt-ter end i nerveceller. Samtidig vistefarmakologiske undersøgelser, at detvar blandt disse selektive hæmmereaf GABA-optagelsen i astrocytter,der var størst mulighed for at findestoffer med antiepileptisk effekt.

Grunden er sandsynligvis, atGABA nedbrydes i astrocytterne.Derimod viste vore forsøg med dyr-kede nerveceller, at det GABA, somnervecellerne optog, kunne genbru-ges som signalstof. En selektiv hæm-ning af optagelsen i astrocytterbetyder derfor dels, at opholdet afGABA i det extracellulære rum for-længes, dels at en mindre del afGABA mistes ved nedbrydning iastrocytter. Begge mekanismer føreri den aktuelle situation til en mereeffektiv GABA-transmission og der-med dæmpning af eventuelle kram-per.

På baggrund af forsøgene skel-nede man mellem de GABA-trans-portører, som primært er tilknyttethenholdsvis nerveceller og astrocyt-ter. I dag er billedet mere komplice-ret, idet man nu har klonet fire for-skellige GABA-transportører frasåvel mus som rotter. Samarbejdemed den israelske forsker NathanNelson har ført til, at vi nu har fåetadgang til de fire klonede transpor-tører fra mus.

Fire klonede GABA-transportørerVed molekylærbiologiske metoder ervi i stand til at få celler fra enbestemt cellelinie til at udtrykke deforskellige transportører i cellemem-branen. Dermed kan vi undersøgeeffekten af GABA-analoger overforoptagelsen af GABA formidlet afhver af de fire transportører.

Undersøgelser af to humaneGABA-transportører har afsløret enmeget stor lighed med de tilsvaren-de transportører fra mus og rotter.Således har alle undersøgte GABA-analoger, som hæmmer funktionenaf GABA-transportører fra mus ogrotter, også haft effekt på de tilsva-rende humane transportører. Detbetyder, at sådanne GABA-analogerhar interesse som modelstoffer forudvikling af nye lægemidler tilbehandling af epilepsi hos menne-sker.

De forskellige GABA-transpor-tører er ikke cellespecifikke. Manfinder en blanding af to eller flereGABA-transportører på både nerve-celler og astrocytter. Den aktuelleblanding i de forskellige cellerafhænger muligvis af centralnervesy-stemets udviklingstrin og er sandsyn-ligvis også afhængig af i hvilkenhjerneregion, den pågældende celle-type er lokaliseret.

Epileptiske anfald kan afhængigaf type og person involvere fejlfunk-tion i forskellige dele af hjernen.Det kan derfor være forskelligetyper af GABA-transportører, som errelevante for en målrettet og effek-tiv behandling hos den enkelte pati-

ent. Vore undersøgelser er nu pri-

mært koncentreret om at klarlæggespecificiteten af kendte og nyeGABA-analoger overfor de fire typeraf GABA-transportører. Det er håbet,at undersøgelserne vil afsløre selek-tive hæmmere for hver af de firetransportører. Analoger med disseegenskaber vil være gode model-stoffer for udvikling af lægemidlertil behandling af former for epilepsi,som endnu ikke kan behandles, samt

16

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Ny strategi for behandling

af epilepsiStoffer, som hæmmer hjernecel-lers optagelse af signalstoffetGABA, giver mulighed for enmere målrettet behandling afepilepsi, der vil medføre færrebivirkninger for patienterne.

Af Orla Miller Larsson, Tina Bolvig og Arne Schousboe

I en rask hjerne er der en perfektbalance mellem de stimulerende oghæmmende impulser i nerveceller-nes indbyrdes kommunikation. Nårbalancen forrykkes, kan det føre tilneurologiske sygdomme som epilep-si.

Ved flere former af epilepsisvækkes de impulser, der formidlesaf signalstoffet gamma-aminosmør-syre, GABA, hvilket kan udløse alvor-lige anfald. Stoffer, som øger effek-tiviteten i GABA-systemet, er derformulige lægemidler til behandling afdisse former af sygdommen.

Nervecellers kommunikationforegår ved, at cellerne udsender ogmodtager signalstoffer. Det vigtigstehæmmende signalstof i centralner-vesystemet er GABA, medens gluta-minsyre er det mest betydningsfuldestimulerende signalstof. Såvel stimu-lerende som hæmmende signalover-førsel mellem nervecellerne skerved, at de forskellige signalstofferfrisættes fra en nervecelle til væskenmellem cellerne, hvorefter stoffetpåvirker andre nerveceller via en

kortvarig binding til receptorer påoverfladen af cellerne (fig. 1).

For at undgå en vedvarendeaktivering af nervecellerne er detvigtigt, at signalstofferne fjerneshurtigt og effektivt fra det ekstracel-lulære rum. Da GABA ikke kan pas-sere cellemembranen, sker fjernelsenved hjælp af et specifikt system, dersluser GABA ind i cellerne. Systemetbestår af et transportørmolekyle, et protein, der er indlejret i nerve-cellers og astrocytters membraner(fig. 2).

Astrocytter er en speciel typeceller, som findes i nervevæv, hvorde støtter nervecellernes funktioner.Koncentrationen af transportørmo-lekyler er størst i astrocytternesudløbere, som findes i nervevævettæt på de områder af nervecellerne,hvorfra signalstofferne frisættes, oghvor der er mange receptorer.

GABA-systemet er svækket ved epilepsiEn af de strategier, som er blevetanvendt for at optimere effekten afGABA, har været at fremstille stof-fer, som hæmmer optagelsen ogdermed fjernelsen af GABA fravæsken mellem hjernecellerne. Der-ved forlænges tilstedeværelsen afGABA i receptorernes nærhed, hvil-ket giver mulighed for en mereeffektiv påvirkning af receptorerne.

På Institut for Farmakologi har

vi i en årrække undersøgt effektenaf mange forskellige stoffer på opta-gelsen af GABA i dyrkede nervecel-ler og astrocytter. Disse stoffer,GABA-analoger, er blevet syntetise-ret af kemikere ved Institut forMedicinalkemi og Lundbeck A/S.GABA-analogerne er kendetegnetved at afspejle en af de mange muli-ge tredimensionelle strukturer, somGABA kan indtage.

GABA-analogerne er syntetiseretsåledes, at deres struktur er langtmere fastlåst og stiv end strukturenaf det meget fleksible GABA-mole-kyle (fig. 3). Mange af analogerne ersåkaldte konkurrerende hæmmereaf optagelsen af GABA i såvel nerve-celler som astrocytter. Denne typehæmmere bindes til det område påtransportøren, hvor også GABA skalbindes. Hæmmeren optager såledesbindingspladser for GABA og ned-sætter dermed binding og efterføl-gende transport af GABA ind i cel-lerne.

Bedre udnyttelse af signalstoffetResultater fra studierne har væretvæsentlige for klarlæggelsen af destrukturelle krav, som skal opfyldesaf potentielle antiepileptiske læge-midler med virkningsmekanisme viaGABA-transportører.

Vore undersøgelser afsløredeendvidere hurtigt, at nogle afGABA-analogerne var bedre til at

generelt en mere målrettet og indi-viduel behandling af epilepsi.

GABA-analoger med effekt over-for GABA-transportører har somantiepileptiske midler den fordel, atde kun er aktive i forbindelse meden aktiv GABA-transmission. Kun ide områder af nervesystemet, hvorder er en fysiologisk betinget GABA-transmission, vil hæmmere af opta-gelsen af GABA påvirke overførslenaf impulser mellem nervecellerne.Dette forhold kan betyde, at sådan-ne lægemidler vil yde en meremålrettet og effektiv behandlingmed færre bivirkninger.

Skematisk billede af GABA-transmissionen.

GABA udsendes fra nervecellen til venstre. Efter

at have påvirket nabocellens GABA-receptor

frisættes stoffet til væsken mellem cellerne.

GABA optages nu af nerveceller og astrocytter

via særlige GABA-transportører, der sluser sig-

nalstoffet ind i cellerne. I nervecellen kan

GABA dels blive genbrugt som signalstof, dels

blive omsat til ravsyre. GABA , som optages i

astrocytter, omdannes udelukkende til ravsyre.

Stoffer, som kan hæmme nervecellers og astrocytters optagelse af GABA, er potentielle lægemidler til

behandling af epilepsi. Her ses en skematisk fremstilling af virkningsmekanismen for en GABA-trans-

portør, som fører GABA fra cellevæsken ind i cellerne. Det fælles bindingssted for GABA og konkur-

rerende hæmmere, GABA-analoger, er vist. Samtidig med transporten af GABA ind i cellerne over-

føres to natriumioner og en kloridion.

Strukturen af GABA sammenholdt med to af de

mange GABA-analoger, nipecotinsyre og

THPO. “GABA-delen” af nipecotinsyre- og

THPO-molekylet er fremhævet.

GABA THPO Nipecotinsyre

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.08 Side 16

Fig. 4

Fig. 2

Fig. 1

Fig. 3

19L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Cand.pharm., dr.med. Inger

Jansen-Olesen er lektor ved

Institut for Farmakologi.

Cand.pharm. Anette Sams er

forskningsstipendiat ved Insti-

tut for Farmakologi.

bl.a. signalstoffet CGRP. De sensori-ske nervefibre er involveret i enrefleks, som blandt andet beskytterhjernen mod for kraftige karsam-mentrækninger. Signalstoffers sam-mentrækkende eller dilaterendeevne kan undersøges i en dyremo-del, hvor man studerer diameterenaf hjernens blodkar in situ. Effektenaf signalstoffer, som får hjernensblodkar til at trække sig sammen,har hos det normale dyr en varighedaf ca. halvandet minut. I dyr, hvortrigerminusnerven er skåret over, fårnerveterminaler på blodkarrene ikketilført CGRP gennem nerven. Dettefører til, at karsammentrækkendestoffer giver en tilsvarende redukti-on af blodårernes diameter, meneffekten er tre gange så langvarigsom hos de dyr, hvor trigerminusner-ven er intakt. Dette skyldes, at ensensorisk refleks, som frigør det kar-udvidende stof CGRP ikke aktiveres.Denne refleks beskytter hjernenmod karsammentrækninger, som vialav ilttilførsel kan slå hjernecellerihjel.

CGRP receptorer i hjernens blodkarAf alle stoffer i hjernens nerver erCGRP det stof, som giver den kraf-tigste og mest potente udvidelse afblodkarrene. Hos mennesket er hjer-nens blodkar ca. 10 gange merefølsomme overfor CGRP end blodkarfra andre områder i kroppen.

CGRP består af 37 aminosyrer,og stoffet findes i to varianter, somhar forskelle i tre aminosyrer. De tovarianter syntetiseres ud fra togener på kromosom 11. Det ene gengiver anledning til dannelse af entencalcitonin i skjoldbruskkirtlen ellerhumant α-CGRP i centralnervesyste-met. Det andet gen producererhumant β-CGRP.

For at forstå signalstoffets virk-ningsmekanismer er det nødvendigtat klarlægge, hvilke receptorer påoverfladen af blodkarrene, stoffetpåvirker. CGRP aktiverer en gruppereceptorer, som i dag deles op i treforskellige typer, CGRP, amylin ogadrenomedulin. En undergrupperingaf disse receptorer kan ikke udeluk-kes.

Ved at studere blodkarsreaktio-nen i vævsbade har vi fundet, ateffekten af α-CGRP, men ikke af β-CGRP, kan blokeres af stoffet CGPR8-37. En CGPR receptor blev fornylig klonet, og vi har fundet, athjernens blodkar netop er forsynetmed denne receptor.

CGRP analoger som lægemidlerDer er endnu ikke udviklet stoffer,som henholdsvis efterligner ellermodvirker CGRP, som er egnet tilbrug som lægemidler. CGRP selv erheller ikke egnet som lægemiddel,

da det også virker dilaterende påperifere kar med kraftigt blodtryks-fald til følge. For at finde terapeu-tisk anvendelse skal der findes fremtil varianter af CGRP, som selektivtstimulerer hjernens CGRP-receptorer.

Samtidig kan stoffer, som selek-tivt blokerer CGRP-receptorerne ihjernens blodkar, måske give en nybehandlingsmulighed ved migræne.Den øgede frigørelse af CGRP, som vihar set under et migræneanfald, kanvære årsagen til udvidelse af de sto-re blodkar i hjernen, som sandsynlig-vis fremkalder migrænesmerterne.

18

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Regulering af

hjernens blodkarUnder et migræneanfald er destore blodårer i hjernen kraftigtudvidede. Omvendt trækkerblodkarrene sig sammen efter enblødning mellem hjernehinder-ne, hvilket kan fremkalde dødeli-ge spasmer. Studier af et signal-stof i hjernen kan føre til udvik-ling af nye lægemidler mod beg-ge sygdomme.

Af Inger Jansen-Olesen og Anette Sams

Signalstoffet calcitonin gen-relateret peptid (CGRP) spiller envigtig rolle ved regulering af hjer-nens blodkar. Øget viden om signal-stoffets virkningsmekanismer kanføre til bedre forståelse og behand-ling af migræne og visse apopleksi-formers hjerneblødninger.

Mellem 10 og 15 procent af dendanske befolkning har på et tids-punkt i deres liv migræne, som med-fører en ensidig pulserende sværhovedpine, kvalme og i nogle tilfæl-de også overfølsomhed for lys oglyd.

Migræne opdeles i migrænemed og uden aura. Ved migrænemed aura begynder anfaldet medsynsforstyrrelser eller føleforstyrrel-ser. Måling af hjernens blodgennem-strømning under et migræneanfaldmed aura har vist et område mednedsat blodgennemstrømning, som

langsomt flytter sig fremad i hjerne-barken. Dette fænomen finder manikke hos patienter med migrænean-fald uden aura. Under migrænean-faldet har man både hos patientermed og uden aura fundet, at de sto-re blodårer i hjernen er udvidede.Desuden har man vist, at der sker enøget frigørelse af signalstoffet CGRP,som netop får blodkarrene til atudvide sig.

CGRP spiller ligeledes en centralrolle ved subarachnoidal blødning,hvilket vil sige blødning mellemhjernehinderne. Cirka hver fjerdepatient med disse blødninger dør.Tre til fire dage efter blødningenopstår spasmer i hjernens blodkar.En uge efter blødningen når spas-men sit maksimum, og den varerofte ved i to til tre uger. Vi mener, atde kraftige spasmer i hjernens blod-kar aktiverer en sensorisk refleks,som stimulerer frigørelsen af detkarudvidende stof CGRP fra nerve-terminaler på hjernens blodkar.Blodkarrenes diameter normaliseresderved i nogle dage, indtil kroppenikke længere er i stand til at produ-cere tilstrækkelige mængder CGRP.Så tager spasmen overhånd, ogmange patienter dør på grund af ilt-mangel i hjernen som følge af ned-sat blodtilførsel.

Vi har målt mængden af CGRP ihjerneblodkar fra mennesker, som erdøde af blødningerne og har sam-menlignet dette med blodkar framennesker, som er døde af blodpropi hjertet. Blodkar fra patienter medblødninger mellem hjernehindernehavde signifikant lavere koncentrati-oner af CGRP.

CGRP har altså stor betydningved både migræne og subarachnoi-dal blødning. Når det gælder blød-ningerne, har stoffer, som efterlig-ner CGRP's karudvidende effekter, etpotentiale som lægemidler, mensmigræne måske kan behandleseffektivt med stoffer, som blokerervirkningen af CGRP. På den bag-grund er det interessant at under-søge i detaljer, hvor og hvordan sig-nalstoffet CGRP påvirker hjernensblodkar.

Nervesystemet i hjernens blodkarHjernens blodkar er forsynet med etfint net af nervefibre, som indehol-der en række signalstoffer, der stam-mer fra hjernens forskellige ganglier.Blodkarrene påvirkes både af nerve-fibre fra det autonome nervesystemog af sensoriske nervefibre.

Sensoriske nervefibre udgår fraganglion trigemini og indeholder

Under et migræneanfald med aura flytter et

område med nedsat blodgennemstrømning sig

langsomt fremad i hjernebarken. Fænomenet,

som er påvist ved hjernescanninger, ses her i et

tidsforløb, som varer 70 minutter.

Figuren giver et overblik over forandringer i hjernens blodgennemstrømning under et migræneanfald

med aura. CGRP-koncentrationen i blod fra kraniet stiger, mens patienten har hovedpine og falder

til normale værdier, når patientens hovedpine aftager.

Her ses aminosyresekvensen for humant α-

CGRP. Tre aminosyrer forsynet med pile

peger på de steder, hvor humant α-CGRP

adskiller sig fra humant β-CGRP.

Hjernens blodkar er forsynet med et fint net af nervefibre fra det parasympatiske nervesystem, det

sympatiske nervesystem og det sensoriske nervesystem. Tegningen viser den cerebrovaskulære innerve-

ring og nervernes forskellige signalstoffer.

Calcitonin gen-relateret peptid

aura

og

hove

dpin

eR

elat

iv e

nhed

for

CB

F,

CGRP

normal CBF

hyperfusion

hypoperfusion

CGRP

tid (timer)

aura hovedpine

2 4 6 8 10

Sympatiske

Sensoriske Parasympatiske

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.09 Side 18

Fig. 3

Fig. 2

Fig. 1

Mange lægemidler virker i hjer-nen, og derfor skal de kunnetrænge gennem blod-hjerne bar-rieren. Traditionelt undersøgeslægemidlers evne til at kommeind i hjernen i dyreforsøg. Nu fin-des der et godt alternativ; enmodel af blod-hjerne barrieren,som er baseret på dyrkede celler.

Af Lise Lund, Lars Hovgaard og LonaChristrup

Mange lægemiddelstoffersom f.eks. morfin udøver deres far-makologiske virkning i hjernen. Forat kunne nå hjernens celler fra blo-det, skal et lægemiddelstof passereblod-hjerne barrieren, som er en afkroppens mest uigennemtrængeligebarrierer.

Ved udvikling af nye lægemidlertil hjernen er det derfor vigtigt atundersøge deres evne til at trængegennem blod-hjerne barrieren. Det-te har traditionelt været gjort vedhjælp af dyreforsøg.

Behovet for at undersøge, om etstort antal af potentielle lægemid-delstoffer kan komme ind i hjernen,har været med til at fremskyndeudviklingen af en cellekulturmodelaf blod-hjerne barrieren. Modellen,som nu er sat op på Institut for Far-maci, gør det muligt på kort tid atteste mange stoffers evne til at pas-sere barrieren.

21L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Cand. pharm. Lise Lund er

ph.d. studerende ved Institut

for Farmaci

Ph.d. Lars Hovgaard er

lektor ved Institut for

Farmaci.

Lic. pharm. Lona Christrup

er lektor ved Institut for

Farmaci.

fra en dyrehjerne og udsåes på envækstoverflade, hvor de kan dele sigog danne et sammenhængende cel-lemonolag.

I øjeblikket eksisterer der celle-kulturmodeller af blod-hjerne barri-eren fra kvæghjerne, svinehjerne ogrottehjerne. Vækstmediets sam-mensætning og vækstoverfladen harstor betydning for, hvordan cellekul-turen udvikles, og mange forskelligevækstbetingelser er afprøvet for atoptimere cellekulturerne, så de lig-ner forholdene i den levende hjernemest muligt. For eksempel er celle-kulturens evne til at danne tightjunctions afhængig af både vækst-overfladen og vækstmediet.

En cellekultur, som dyrkes overmange generationer, en såkaldt cel-lelinie, vil gradvist miste nogle afblod-hjerne barrierens karakteristi-ka. Det kan forhindres ved at dyrkeendothelcellerne sammen medastrocytter, som kan foranledigedannelsen af både tight junctions ogforskellige enzymer. Vi har valgt at

sætte en model op baseret påendothelceller fra kvæghjerne, derdyrkes som en primær kultur, d.v.s.over et kortere antal generationer.Herved undgås det mere kompleksesystem med to forskellige celletyper.

Selve isoleringsproceduren erinddelt i to trin. Under aseptiske for-hold fjernes hjernebarken fra enkvæghjernes to hjernehalvdele. Hjer-nebarken homogeniseres og filtre-res, hvorefter de små blodkar, hjer-nekapillærerne, kan opsamles fra fil-terklædet. Efter en enzymatisk ned-brydning, hvor kontaminerende cel-ler som astrocytter, pericytter ogbasalmembranen fjernes, udsåeskapillærerne i vækstflasker medvækstmedium.

Endothelcellerne vil nu begyndeat dele sig, og efter én uge kan cel-lerne “høstes” fra flaskens bund.Cellerne udsåes nu på filtre, og efteren uge vil de have dannet et tætcellemonolag med blod-hjerne barri-ere karakteristika.

Transportstudier med cellemodellenDisse filtre med cellemonolag kannu bruges til transportstudier aflægemiddelstoffers evne til at passe-re blod-hjerne barrieren. Det eroplagt at anvende modellen til kvali-tativt at screene nye potentiellelægemiddelstoffers transport overbarrieren.Man kan bestemme transportenbåde ind i hjernen og ud af hjernenved at tilsætte stoffet på henholds-vis oversiden og undersiden af filte-ret. Det er ligeledes muligt at under-søge, om stofferne transporteresigennem cellerne via et aktivt trans-portsystem, såfremt dette transport-system udtrykkes i cellerne. Mangelægemiddelstoffer trænger ikke indi hjernen, fordi de pumpes ud afendothelcellerne. Med cellekultur-modellen kan man også afklare, ompotentielle lægemiddelstoffer ude-lukkes fra hjernen med denne meka-nisme.

20

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Model af blod-hjerne

barrierenBlod-hjerne barrieren er lokalise-

ret i hjernebarkens små blodkar,hjernekapillærerene. Når lægemid-delstoffer optages i hjernen, skerdet fra blodet, der løber igennemhjernens forskellige områder bådevia de små og de store blodkar. Detindebærer, at stofferne har mulig-hed for at blive optaget i hjernenuden om blod-hjerne barrieren. Menda de store blodkars overflade kunudgør en meget lille procentdelsammenlignet med blod-hjerne bar-rierens overflade, er det lægemid-delstoffers evne til at passere blod-hjerne barrieren, som i praksis erafgørende for, om de har en farma-kologisk virkning.

Dette blev første gang beskre-vet, da et forsøg med injektion af etfarvestof i rotter viste, at alle andreorganer end hjernen blev farvet.

Blod-hjerne barrierens opbygning og funktionHjernens små blodkar er opbyggetaf flere lag af forskellige celletyper. Idirekte kontakt med blodet liggerendothelcellerne, som udgør selveblod-hjerne barrieren. Bagvedendothelcellerne ligger nogle hjæl-peceller, som kaldes pericytter ogastrocytter, samt udløbere fra hjer-nens nerveceller.

Endothelcellerne er først ogfremmest karakteriseret ved deresevne til at danne såkaldte tightjunctions. Disse tight junctions er enfusion mellem cellemembranerne,som forhindrer ioner, vand og små

vandopløselige stoffer i at passeremellem cellerne fra blodet og ind ihjernen. Da en række livsnødvendi-ge stoffer som f.eks. glukose ogaminosyrer heller ikke kan trængegennem barrieren, reguleres deresoptagelse i hjernen ved hjælp afaktive transportsystemer, som er spe-cifikke for de enkelte stoffer. Speci-elt optaget af glukose er vigtigt, dadet er hjernens eneste brændstofkil-de.

Endothelcellerne er ligeledes istand til at tilbageholde fedtopløse-lige stoffer, der normalt kan passereigennem celler. Det sker ved hjælpaf mekanismer, der pumper stoffer-ne ud af endothelcellerne. Tilstede-værelsen af tight junctions, aktivetransportsystemer og pumpemeka-nismer i endothelcellerne betyder, atpassagen af stoffer ind og ud afhjernen kan reguleres med det for-mål at holde hjernens følsommeindre kemiske miljø stabilt.

Hjælpecellerne, pericytter ogastrocytter, er med til at opretholdeog regulere blod-hjerne barrierensamt til at udvikle den fra fostersta-diet. Specielt astrocytter menes athave en afgørende rolle for blod-hjerne barrierens funktion.

Endothelceller fra kvæghjerneI starten af 1980'erne, da man blevklar over, at blod-hjerne barrierenbefandt sig i hjernens små blodkar,begyndte udviklingen af en cellekul-turmodel for barrieren. Modellenbestår af endothelceller, som isoleres

Her ses en skematisk tegning af et “udfoldet”

hjernekapillær; et af hjernens små blodkar.

Yderst mod blodet ligger endothelcellerne, som

er bundet tæt sammen af tight junctions, og som

udgør blod-hjerne barrieren. Direkte herunder

ligger hjælpecellerne, som kaldes pericytter. Dis-

se to celletyper er omkranset af basalmembra-

nen, hvorigennem astrocytter og nerveceller kan

regulere blod-hjerne barrierens funktioner.

Figuren viser, hvordan hjernekapillærer isoleres

fra kvæghjerne og udsåes i vækstflasker. Endot-

helceller deler sig ud fra kapillærstykkerne, og

efter én uge kan cellerne høstes fra flaskebunden

og udsåes på filtre. Efter endnu en uge har de

dannet et cellemonolag og kan anvendes til

transportforsøg, der viser lægemiddelstoffers evne

til at trænge gennem blod-hjerne barrieren.

Figuren viser den procentdel af sucrose, der

transporteres fra oversiden af filteret til undersi-

den af filteret, som funktion af tiden. Til tiden

= 0 tilsættes sucrose til oversiden af filteret, og til

forudbestemte tider udtages prøver fra undersi-

den af filteret. Kurvens retlinede forløb viser, at

der er en konstant flux af sucrose fra oversiden

til undersiden.

Tid (min.)

% T

rans

por

tere

t

Nervecelle

Blod

Astrocytter

Basalmembran

Pericytter

Endothelceller

Tight junctions

Hjernebark fra kvæg

FiltreringEnzymatisk nedbrydning

Kapillærer i vækstflaske

Én uge

Endothelceller rundt om kapillær

Høstning

Filter med endothelceller

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.09 Side 20

Fig. 2

Fig. 1

Fig. 3

23L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Cand. pharm, ph.d. Charlotte

Vermehren er adjunkt ved

Institut For Farmaci.

Lic.pharm. Peter B. Johansen er

specialkemiker ved Growth

Hormone Biology på Novo

Nordisk A/S.

Dr.scient. Harald S. Hansen er

docent ved Institut for Farma-

kologi.

af hypofyser fra afdøde. I midten af1980'erne lykkedes det imidlertid atfremstille humant væksthormon vedhjælp af gensplejsede gærceller. Denøgede tilgængelighed af biosynte-tisk væksthormon muliggjorde enøget forskning på området. NovoNordisk blev tidligt involveret iarbejdet og målrettede sin indsatsmod at udvikle en optimal metodetil at indgive hormonet på.

Vejen gennem næseslimhindenVæksthormon er et peptid. Vækst-hormon og andre peptidlægemidlersom f.eks. insulin må i dag injiceres,hvilket er forbundet med væsentligegener for patienterne. Man har der-for søgt alternative medicineringsve-je, og indgift gennem næsen har hervist sig som en særligt lovendemetode.

Imidlertid udgør næseslimhin-den en effektiv barriere mod pepti-der som væksthormon. Desuden ernedbrydende enzymer og slimlagets

konsistens væsentlige hindringer foroptagelse af peptider gennem næs-en. Alligevel er næseslimhinden ide-elt indrettet med henblik på opta-gelse af lægemiddelstoffer. De gun-stige fysiologiske omstændighederbestår især i en høj blodgennem-strømning og begrænset enzymatiskaktivitet. Herudover er det let atdosere medicinen, og lægemiddel-stoffet optages hurtigt, hvilket resul-terer i en høj koncentration i blodet.Dette er netop ønskeligt i forbindel-se med væksthormonterapi, da manher har mulighed for at efterlignevæksthormons naturlige episodiskeudskillelsesmønster.

Hjælpestoffer er nødvendigeDa væksthormon ikke selv kan træn-ge gennem næseslimhinden, er detnødvendigt samtidig at indgivehjælpestoffer, som fremmer hormo-nets evne til at passere. Sådannestoffer kaldes for absorptionsfrem-mere.

Der findes flere typer absorpti-onsfremmere, som er af forskelligkemisk natur og har forskellige virk-ningsmekanismer, der ikke er klar-lagt fuldtud. Dog tyder en rækkestudier på, at stofferne kan øgetransporten af peptidlægemidlerover slimhinden på fire måder. Fordet første kan slimlagets viskositetnedsættes, så slimen bliver meretyndtflydende. For det andet kanaktiviteten af nedbrydende enzymerdæmpes. For det tredie kan porernemellem de enkelte celler i næseslim-hinden åbnes, og endelig kan slim-hinden blive blødere.

I mange tilfælde har disseabsorptionsfremmere dog udvistskadelige egenskaber, og man harsat spørgsmål ved, om den optagel-sesfremmende effekt hænger sam-men med skadevirkningerne.

Novo Nordisk har afprøvet man-ge absorptionsfremmere for at findefrem til de mest effektive. Valgetfaldt på et fosfolipid og et cyclodex-trin, som begge forekommer natur-ligt i organismen. Fosfolipidet, dide-canoylfosfatidylcholin (DDPC), ersyntetisk, men minder om de naturli-

ge fosfolipider i f.eks. cellemembra-ner. Det andet stof, α-cyclodextrin(α-CD), er det mest almindeligenaturlige nedbrydningsprodukt frastivelse. Molekylet indeholder enringstruktur med en vandopløseligyderside og et vandskyende indre,hvilket muliggør kompleksdannelsemed vandskyende komponenter inæseslimhinden. Denne egenskabmedvirker sandsynligvis til, at stoffetkan transportere væksthormon overnæseslimhinden.

Hjælpestoffer medførte skaderBåde vi og andre har vist, at beggeabsorptionsfremmere øger optagel-sen af både insulin og væksthormontilstrækkeligt til, at man kan opnåeffektive koncentrationer af læge-middelstofferne ved indgift gennemnæsen.

Det næste skridt var så at under-søge, hvilke skadelige virkninger, derer forbundet ved en sådan behand-ling. Forudsætningen for nasalterapimå være, at næseslimhinden bevaresintakt. Den optimale effekt af enabsorptionsfremmer vil være enkortvarig virkning, der aftager straksefter, at lægemiddelstoffet er opta-get. Dette vil være et udtryk for, atnæseslimhindens barriere hurtigtgendannes.

På den baggrund gennemførtevi forsøg med kaniner, som fik indgi-vet absorptionsfremmeren α-CD inæsen og derefter til forskelligetider fik væksthormon. Koncentrati-onen af væksthormon i kaninernesblod blev derpå målt for at vurdere,hvor meget der var blevet absorbe-ret. Når væksthormon blev givet enhalv, en hel og tre timer efter α-CD,var hormonkoncentrationen væsent-ligt nedsat i forhold til, når vækst-hormon og hjælpestoffet blev indgi-

22

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Væksthormongennem

næsen?Væksthormon afhjælper dværg-vækst hos børn og bruges nuogså til at behandle voksne, somlider af mangel på hormonet. Idag injiceres væksthormon, mendet vil være behageligere forpatienterne og sandsynligvisogså mere effektivt at indtagelægemidlet gennem næsen. Nyestudier viser imidlertid, at næse-slimhinden kan tage skade veddaglig indgift.

Af Charlotte Vermehren, Peter B. Johansen og Harald S. Hansen

Omkring 250 danske børnbehandles for dværgvækst medvæksthormon, der injiceres på sam-me måde som insulin. Hvis hormonetkunne indtages som spray gennemnæseslimhinden, ville man sandsyn-ligvis kunne opnå en bedre effekt.

Væksthormon er et naturligtstof, som frigives fra hypofysen. Fri-givelsen er episodisk, og det er vig-tigt at efterligne dette episodiskeudskillelsesmønster i forbindelsemed væksthormonterapi. Dyreforsøghar vist, at hyppige injektioner afvæksthormon resulterer i bedrevækst, end når der kun gives éninjektion i døgnet, hvilket i dag erpraksis ved behandling af menne-sker.

Hyppig indgift gennem næsener langt behageligere for patientenend mange injektioner, og metodengør det samtidig muligt at optimerebehandlingen ved at efterligne hor-monets naturlige udskillelses-mønster.

Væksthormon er imidlertid et såstort molekyle, at stoffet kun van-skeligt kan trænge gennem næse-slimhinden og komme ud i blodet.Af den grund er det nødvendigt attilsætte hjælpestoffer, som fremmeroptagelsen af hormonet. Nogle afdisse hjælpestoffer kan imidlertidmedføre skader på næseslimhinden.

Derfor er det vigtigt at få kend-skab til, hvilke konsekvenserbehandling med nasalpræparater vilfå for næseslimhinden. Det er natur-

ligvis en forudsætning for nasalbehandling med væksthormon, atnæseslimhindens integritet og funk-tioner bevares.

Væksthormon til børn og voksneVæksthormon er med til at opret-holde normal vækst. Selv om men-neskets gennemsnitshøjde stiger påverdensplan, findes der et stigendeantal børn med dværgvækst. Sådan-ne børn bliver højere, når debehandles med væksthormon.

Voksne, der lider af klassiskvæksthormonmangel, som bl.a. kanmedføre knogleskørhed, svækkedemuskler, depressioner og unormaltræthed, har ligeledes gavn af hor-monbehandlingen. I dag anvendes

væksthormon desuden til atbehandle kvinder med den arveligesygdom Turners syndrom, hvis vækster nedsat. Samtidig bruges vækst-hormon til behandling af børn medkronisk nyresvigt, og det er sandsyn-ligt, at der vil findes nye anvendel-sesområder i de kommende år.

Behandling af voksne patienterhar hidtil været meget begrænsetpå grund af mangel på væksthor-mon, som før i tiden måtte udvindes

Koncentrationen af væksthormon varierer

stærkt i blodet hos mennesker. Her ses den

naturlige variation over et døgn. Ved behand-

ling af bl.a. dværgvækst med væksthormon

opnår man størst effekt ved hyppig indgift af

lægemidlet, fordi behandlingen kommer så tæt

på den naturlige episodiske udskillelse som

muligt.

Transport over næseslimhinden kan undersøges

på en kaninslimhinde. Før forsøgene anbringes

næseskillevæggen på en ramme. Der anvendes

en pincet til forsigtigt at løsne næseslimhinden,

som anbringes i Ussingkammer-opstillingen.

En Ussingkammer-opstilling, der anvendes ved

elektrofysiologiske målinger på kaninslimhin-

den. Næseslimhinden spændes op mellem de to

kammerhalvdele, og ved hjælp af elektroder på

begge sider kan man bl.a. måle spændingsfor-

skellen over vævet. Spændingsforskellen giver

udtryk for slimhindens tilstand.

vet samtidig.Resultatet var umiddelbart

lovende, da det tydede på, at næse-slimhindens barriere blev genopret-tet inden for en halv time. Men sam-me forsøg udført med DDPC visteingen genoprettelse af barrieren.Andre forsøg demonstrerede lige-ledes, at både DDPC og α-CD forår-sagede drastiske ændringer i næse-slimhinden hos kaniner.

Måling af elektrofysiologiskeparametre som spændingsforskellenover kaninnæseslimhinden giver etudtryk for slimhindens tilstand.Sådanne målinger viste, at spænd-ingsforskellen blev kraftigt nedsatmed stigende koncentrationer afbåde DDPC og a-CD. Ved høje kon-centrationer var næseslimhindenikke i stand til at genetablere denoprindelige spændingsforskel, hvil-ket tyder på, at celler i næseslimhin-den var døde.

Alt i alt må det konkluderes, atselvom absorptionsfremmerneseffekt på optagelsen af væksthor-mon over næseslimhinden var til-fredsstillende, syntes sikkerhedenved lang tids anvendelse af stoffernei forbindelse med indgift af vækst-hormon at være tvivlsom. Men dentilfredsstillende absorptionsfrem-mende effekt betyder, at disse stof-fer muligvis er anvendelige vednasal indgift af andre peptidlæge-midler i engangsterapi.

Det kunne f.eks. være indgift afglucagon ved akut fald i blodsukke-ret hos sukkersygepatienter, hvilketkan være livstruende. En hurtig ind-gift af glucagon vil kunne normalise-re blodsukkerkoncentrationen, og iet sådant tilfælde vil en kortvarig,lokal skade i næsen være mindrebetydningsfuld.

Væksthormonkoncentrationen i plasma (ng/ml)

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.09 Side 22

Fig. 2

Fig. 3

Fig. 1

25L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Lic. pharm. Bjarne Fjalland

er lektor ved Institut for Far-

makologi.

Cand. pharm. Thomas

Anderson, Institut for

Farmakologi.

Lic. pharm. Peter B. Johansen

er specialkemiker ved Growth

Hormone Biology på Novo

Nordisk.

hypothalamus, som fører til hypofy-sens blodkarnet, og som indeholderde to overordnede hormoner GHRHog somatostatin.

De biologiske virkninger af de tooverordnede hormoner i denne delaf hypofysen er ukendte. Derforbesluttede vi at undersøge, hvordankroppens væksthormonfrigørendehormon GHRH samt et GHS-stof(GHRP-2, en analog af GHRP-6)påvirker udskillelsen af hypofysebag-lappens hormoner oxytocin og vaso-pressin.

Målinger på rottehypofyserFra rotter kan hypofysebaglappenisoleres og bringes til at overleve ikunstige næringsvæsker. Man kanherefter ved elektrisk påvirkningefterligne de naturlige nerveimpul-ser og fremkalde hormonudskillelse,således som det sker i den intakteorganisme. Mængden af udskilt hor-mon bestemmes ved biologiske ogradioimmunologiske målinger.

Ved den biologiske analyseanvendes en livmoder fra en rotte.De hormoner, som hypofysebaglap-pen danner, drypper ned på livmo-deren og får den til at trække sigsammen. Sammentrækningen øgesmed stigende mængder af de hor-moner, som hypofysebaglappen dan-ner. Den radioimmunologiske meto-de er baseret på mærkning af hor-monerne med radioaktivt jod, hvor-ved mængden kan måles i en tæller.

Tilførsel af organismens overord-nede væksthormonfrigørende hor-mon, GHRH, til organbadet medfør-te en markant nedsat udskillelse afbegge hypofysebaglaphormoner.Spørgsmålet var så, om det synteti-ske GHS-stof havde en tilsvarendeeffekt. Overraskende viste det sig, atdette stof ligeledes hæmmedeudskillelsen af vasopressin og oxyto-cin.

Virkningen af GHRH og GHS-stoffet var maksimal i det fysiologi-ske område, hvilket vil sige i koncen-trationer, der svarer til koncentratio-nen af GHRH i kroppen. Både størreog mindre doser gav en ringereeffekt. Virkningen af GHS-stoffet sti-ger med stigende dosis indtil et vistpunkt, hvorefter effekten aftager.Hvis man forud for behandlingenpåvirkede hypofysebaglappen medet stof, der er kendt for at ophæveGHS-stoffets væksthormonfrigøren-de effekt, ophævedes stoffets hæm-ning på udskillelsen af vasopressinog oxytocin.

Nye områder for behandlingNoget tyder altså på, at vi her har atgøre med en stofgruppe, der udoverat have markante og terapeutisk

interessante virkninger i forbindelsemed forskellige tilstande med vækst-hormonmangel, også kan påvirkefrigørelsen af hypofysebaglaphor-moner og dermed have andre tera-peutiske muligheder.

Dette fordrer imidlertid enadskillelse af stoffernes effekter påhypofysens forlap og baglap, sålægemiddelstofferne specifikt kanpåvirke hypofysebaglappen. Yder-mere er det nødvendigt med enadskillelse af den hæmmende virk-ning på vasopressin og oxytocin.Hvis et stof f.eks. specifikt kan hæm-me frigørelsen af vasopressin, vilstoffet kunne bruges som et vand-drivende middel. Det skyldes, at enformindsket koncentration af vaso-pressin i blodet vil medføre nedsatreabsorption af salt og vand i nyrer-ne.

For nylig blev den receptor påcellerne, man mener GHS stoffernevirker over, identificeret. Dennereceptor er fundet i hypothalamus

og i hypofyseforlappen. Hvorvidtreceptoren også findes i hypofyse-baglappen er endnu uvist.

Man taler allerede om eksisten-sen af forskellige undertyper af den-ne receptor. Hvis sådanne underty-per findes, er det muligt, at nogle afdem er specifikke for henholdsvisudskillelse af vasopressin og oxyto-cin. I så fald vil det sandsynligvisvære muligt at designe GHS-stoffer,som selektivt påvirker den ønskedereceptor.

Receptoren er imidlertid forskel-lig fra den receptor, som GHRH vir-ker over. Det er derfor på nuværen-de tidspunkt umuligt at udtale sigom hvilke virkningsmekanismer, derer involveret i begge stoffers hæm-mende effekt. Der forestår såledeset meget stort udredningsarbejde,før det er muligt at give en realistiskvurdering af den farmakologiskebetydning af vores observationer.Første skridt på vejen må imidlertidvære at påvise, om stoffernes hæm-mende effekt på udskillelsen af vaso-pressin og oxytocin også kan doku-menteres i en intakt organisme.

24

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Stoffer kan frigøre væksthormon

fra hypofysenVæksthormon anvendes i dag tilbehandling af dværgvækst ogkronisk nyresvigt hos børn samtpiger med Turners syndrom.Uheldigvis kan hormonet ikkeindgives i tabletter, men må inji-ceres. En mulig fremtidig løsninger stoffer, som kan frigøre vækst-hormon fra hypofysen, og somkan indtages gennem munden.Ny forskning tyder tilmed på, atdisse stoffer har andre interes-sante farmakologiske virkninger.

Af Bjarne Fjalland, Thomas Anderson og Peter B. Johansen

Væksthormon har mange faci-nerende fysiologiske virkninger, sombedst kan illustreres ved de sympto-mer, der opstår hos patienter, somlider af væksthormonmangel. Detdrejer sig om øget kropsvægt, størrefedtmasse og mindre muskelmasse.Yderligere har disse patienter øgetrisiko for at udvikle hjerte-karsyg-domme og har nedsat mineral-tæthed i deres knogler. Omvendtvides væksthormon bl.a. at øge for-brændingen af fedt og vil måskevise sig at kunne hjælpe svært over-vægtige mennesker af med over-flødige kilo.

Desværre egner væksthormonsig ikke til at blive indtaget i tablet-ter, fordi hormonet nedbrydes afenzymer i tarmen, inden det når ud iblodet, hvorfra det udøver sine virk-ninger. Derfor må man injicere stof-fet, hvilket begrænser anvendelses-mulighederne.

En elegant, alternativ løsning vilvære at få de væksthormonproduce-rende celler i hypofysen til at frigøremere væksthormon. Derfor er derstor farmakologisk interesse for engruppe stoffer, som netop er vist atkunne frigøre væksthormon frahypofysen. Stofferne er små synteti-ske peptider, som består af fem ellerseks aminosyrer.

Frigørelse af væksthormonDe væksthormonfrigørende stofferkaldes med en fælles betegnelse forGHS-stoffer efter det engelske navnGrowth Hormone Secretagogues. Deførste GHS-stoffer blev syntetiseretallerede i slutningen af 1970'erne;det vil sige nogle år før kroppenseget overordnede væksthormonfri-gørende hormon (GHRH) blev identi-ficeret og isoleret.

Fra hjernen reguleres udskillel-sen af væksthormon af GHRH i sam-spil med et andet overordnet hor-mon, somatostatin, som hæmmerudskillelsen. Disse to hormoner dan-nes i specifikke nervecentre i hypo-thalamus, en hjernedel, som er pla-ceret lige over hypofysen. De over-ordnede hormoner transporteresderpå via nervebaner til hypofyse-forlappens blodkarnet, hvor de frigi-ves og udøver deres virkning.

Hvorledes GHS-systemet spillermed i processen, er endnu ikke fuldtopklaret, men man forestiller sig, atGHS-stofferne efterligner et ukendthormon, som der i øjeblikket søgesihærdigt efter.

På internationalt plan foregårder en intens medicinalkemisk ogfarmakologisk forskning med hen-blik på at udvikle GHS-stoffer. Ud frateoretiske overvejelser over moleky-lernes rumlige struktur er det bl.a.lykkedes at syntetisere det megetpotente og stabile peptid GHRP-6.Første generation stofferne var imid-lertid dårligt absorberbare efter ind-tagelse som tabletter. Det vil derforvære et stort fremskridt, hvis detlykkes at frembringe et GHS-stof tilindtagelse gennem munden. Dettemål synes at være inden for række-vidde.

Disse nye potentielle lægemid-delstoffer udvikles med henblik på

behandling af børn og voksne medvæksthormonmangel. Andre interes-sante anvendelsesområder erbehandling af knogleskørhed, sværfedme og tilstande med øget prote-innedbrydning, f.eks i forbindelsemed svære kirurgiske indgreb. Ende-lig kan GHS-stofferne bruges i for-bindelse med diagnostisk påvisningaf væksthormonmangel.

Stoffernes selektivitetDer bliver naturligvis fokuseretmeget på, hvor specifikke GHS-stof-ferne er, da man kun ønsker fri-gørelse af væksthormon og ikke afandre hormoner, som også udskillesfra hypofyseforlappen.

Hidtil er der imidlertid ingen,som har set på, om stofferne påvir-ker hypofysebaglappen. Denne delaf hypofysen udskiller hormonersom vasopressin, der har betydningfor henholdsvis organismens salt- ogvandbalance, samt oxytocin, som sty-rer mælkeproduktionen.

Man har indtil videre ikke påvistnogen kommunikation mellem de tohypofysehalvdele. Men for nylig erder påvist nervebaner mellem hypo-fysebaglappen og de områder i

Hypofysen er placeret under hypothalamus, som

udsender hjernens overordnede væksthormonfri-

gørende hormon GHRH. GHRH transporteres

til hypofyseforlappen, som herved bringes til at

udskille væksthormon.

Fra rotter kan hypofysebaglappen isoleres. Ved

elektrisk stimulering fremkaldes hormonudskil-

lelse, som det sker i organismen. Ved den biolo-

giske analyse anvendes en livmoder fra en rotte.

Jo større mængder hormon, der drypper ned på

livmoderen, jo mere trækker den sig sammen. I

den radioimmunologiske metode mærkes hor-

monerne med radioaktivt jod, hvorved mæng-

den kan måles i en tæller.

Det syntetiske peptid, GHRP-2, hæmmer

udskillelsen af vasopressin og oxytocin fra hypo-

fysebaglappen. Virkningen er maksimal i det

fysiologiske område.

Hypothalamus

Hypothalamus

Hypofyseforlap

Væksthormonfrigørelse Vasopressin- og oxytocinfrigørelse

Hypofysebaglap

Hypofyse

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.09 Side 24

Fig. 3

Fig. 2

Fig. 1

27L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Cand. pharm. Lene Krarup

er ph.d.-studerende ved

Institut for Farmaci.

Lic.pharm. Inge Thøger

Christensen er forskningslektor

ved Institut for Medicinal-

kemi.

danne brintbindinger, dvs. depolære atomer. Dette udtryk kaldesdet polære vandtilgængelige over-fladeareal (PVO).

Molekylernes facon og fleksibilitetImidlertid er det polære vandtilgæn-gelige overfladeareal ikke en enty-dig størrelse, hvis der er tale omfleksible molekyler, hvilket ofte ertilfældet. I et fleksibelt molekyle eratomerne bundet til hinanden vedenkelt- eller dobbeltbindinger. Detkoster kun lidt energi at flytte toatomer, som er adskilt af tre bindin-ger, i forhold til hinanden. Det sva-rer til at rotere omkring en enkelt-binding i molekylet. Resultatet er, atatomernes indbyrdes placering i dettredimensionelle rum let kan ænd-res, hvilket resulterer i mange kom-binationsmuligheder for atomernesindbyrdes placering. Hver kombinati-onsmulighed betegnes som en kon-formation.

Størrelsen af det polære vandtil-gængelige overfladeareal for denenkelte konformation afhænger af, ihvor høj grad apolære atomer“spærrer” for vandmolekylernesadgang til de polære atomer. Detpolære vandtilgængelige overflade-areal er typisk større i en udstraktkonformation end i en mere sam-menfoldet konformation, hvor depolære atomer delvist skjules af deøvrige atomer. Variationen i vandtil-gængeligheden mellem konformati-onerne er så betydelig, at det ernødvendigt at tage højde for den,når man ønsker at bruge det polærevandtilgængelige areal til at forudsi-ge absorptionen af et lægemiddel-stof.

Dertil kommer, at nogle konfor-mationer forekommer hyppigereend andre. Energien eller stabilite-ten er bestemmende for hyppighe-den af konformationerne. En højenergi betyder, at afstandene ogvekselvirkningerne mellem atomer-ne i konformationen ikke er favo-rable. Derfor er sådanne højenerge-

tiske konformationer sjældnere endkonformationer med lav energi. Enenkelt dosis af et lægemiddelstofbestår af milliarder af molekyler, sågraden af absorption afhænger af,om de dominerende konformationerhar et favorabelt polært vandtil-gængeligt overfladeareal.

Computere på hårdt arbejde Størrelsen af konformationernesenergi bruges til at beregne et væg-tet gennemsnit af det polære vand-tilgængelige overfladeareal i for-hold til hver enkelt konformationssandsynlighed for at forekomme.Problemet er så at bestemme, hvilkeog hvor mange forskellige konfor-mationer, molekylet kan antage.Dette problem er ikke trivielt, hvismolekylet har mere end 3-4 bindin-ger med mulighed for rotation, fordiantallet af kombinationsmulighederhurtigt bliver uoverskueligt.

For at løse problemet udføres ensåkaldt konformationsanalyse. Tildette bruger vi et computerpro-gram, som ved hjælp af indbyggedeparametre og formler for molekylersopførsel kan beregne bl.a. ændrin-gen i energi, når konformationenforandrer sig. Desuden kan man vedhjælp af computergrafik få vistmolekylerne på skærmen.

Fremfor at vi selv ændrer mole-kylernes konformation ved at rotereatomerne i forhold til hinanden,sættes computeren i arbejde. I denproces, der kaldes molekyldynamik,bliver computeren instrueret om at

give hvert atom et lille puf i entilfældig retning. Hvis puffene er til-strækkeligt store, ændres atomernesindbyrdes position og en ny konfor-mation dannes, som så bruges somudgangspunkt for de næste puf, enny konformation dannes og så frem-deles. Hvis man bliver ved længenok og gør puffene tilstrækkeligtstore, får man ideelt set besøgt alletænkelige konformationer.

Indtil videre har vi analyseret 15modelstoffer med denne metode.Resultaterne er meget lovende, da vihar fundet en lineær sammenhængmellem absorptionshastigheden iCaco-2 tarmceller og det konforma-tionsafhængige polære vandtilgæn-gelige overfladeareal. Vi er nu igang med at undersøge, om en til-svarende sammenhæng gælder forandre typer af molekyler med mulig-hed for endnu flere forskellige kon-formationer.

Selv om vi bruger store, kraftigecomputere, kræver metoden allige-vel lang beregningstid. For tidentager det en til to dage at beregnepå et enkelt molekyle. Før metodenbliver praktisk anvendelig i udviklin-gen af nye lægemidler, må bereg-ningstiden reduceres væsentligt; sådet er en vigtig del af det viderearbejde.

26

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Computer beregner om lægemidlet

kommer ud i blodetMange lovende lægemiddelstof-fer er blevet kasseret efter enlangvarig og kostbar udviklings-indsats, fordi de ikke kan trængegennem tarmvæggen og derforikke kommer ud i blodet. Nyecomputermetoder kan afsløreproblemet, allerede inden etpotentielt lægemiddelstof frem-stilles i laboratoriet.

Af Lene Krarup og Inge Thøger Christensen

Et lægemiddelstof kan kunudøve sin virkning, hvis det bliveroptaget – absorberet – af organis-men og dernæst bliver transporteretmed blodet til det tiltænkte virk-ningssted. Normalt overvejes detteaspekt først sent i udviklingen af etnyt lægemiddel, fordi man somregel fokuserer på at fremstillelægemiddelstoffer, som er så effekti-ve som muligt.

I medicinindustrien findes dersåledes mange eksempler på, at etellers lovende lægemiddelstof erblevet kasseret efter flere års kost-bar udvikling, fordi man ikke hartaget højde for, om det nye stofkunne absorberes i f.eks. mave-tarm-kanalen. Det vil derfor være af storværdi, hvis man på et tidligt tids-punkt i udviklingen kan forudsige,om de nyudviklede lægemiddelstof-fer har en chance for at blive opta-get i organismen.

Det er ikke praktisk eller økono-misk muligt at teste absorptionen afalle nye lægemiddelstoffer på dyr,fordi der ofte syntetiseres tusindvisaf stoffer i jagten på et enkelt nytlægemiddel. I stedet kan man f.eksdyrke tarmceller i laboratoriet ogbruge dem som modelsystemer. Eteksempel herpå er cellelinjen Caco-2, som i vid udstrækning anvendespå Institut for Farmaci som modelfor absorption af lægemiddelstofferover tarmslimhinden.

Beregninger afløser laboratoriearbejdeEn anden mulighed er en rent teore-

tisk beregning af absorptionen udfra viden om lægemiddelstoffetsmolekylære struktur. Herved undgåsarbejdskrævende laboratoriearbejdeog dermed også brugen af potenti-elt miljøskadelige kemikalier. Enyderligere fordel er, at man kan for-udsige absorptionsegenskaberne aflægemiddelstoffer, allerede inden desyntetiseres.

Med en tilstrækkelig udvikletteoretisk basis vil det også væremuligt at give anvisninger på, hvor-dan strukturen af et lægemiddelstofskal ændres for at optimere absorp-tionsegenskaberne. Det vil alt andetlige være en fordel, at lægemiddel-stoffet fra starten har så høj enabsorption som muligt, idet manderved minimerer behovet for ensenere udvikling af absorptionsfrem-mende foranstaltninger.

De eksisterende metoder til atberegne et lægemiddelstofs evne tilat blive optaget i organismen er imange tilfælde utilstrækkelige. For-målet med vores arbejde er at udvik-le nye og bedre beregningsmetoderved at uddybe kendskabet til sam-menhængen mellem molekylstruk-tur og absorption. Med vores nyeberegningsprincip er det muligt atopnå en nøjagtig forudsigelse afabsorptionen ud fra molekylæreegenskaber.

Struktur bestemmer stoffets optagelseNår et lægemiddelstof skal gennemtarmslimhinden og ud i blodet, måmolekylet være i stand til at passereskiftevis vandige og fedtholdige mil-jøer for at nå over tarmcellen og indi blodbanen. Lægemiddelstoffer erbygget op af to grupper af atomer –polære og apolære atomer. Polæreatomer har en delvis positiv ellernegativ elektrisk ladning, mens apo-lære atomer er overvejende neutrale.

Gruppen af polære atomeromfatter bl.a. ilt og kvælstof, menskulstof hører til de apolære atomer.De polære atomer kan danne svagebindinger, såkaldte brintbindinger, tilde omgivende vandmolekyler, somogså er polære. Disse bindinger skalbrydes, før molekylet kan passereigennem det apolære miljø i celle-membranen, som omgiver tarmcel-len. Jo færre brintbindinger, der skalbrydes, jo nemmere slipper moleky-lerne taget i vandet og jo flere mole-kyler passerer cellemembranen pr.tidsenhed.

Det er derfor rimeligt at antage,at et molekyles evne til at dannebrintbindinger også fortæller nogetom dets absorptionsegenskaber. Etsådant udtryk fås af overfladearealetaf de atomer, der er i stand til at

Når et lægemiddelstof skal fra tarmen over i blodbanen, må det først passere det yderste lag celler,

tarmepitelet. Før den fedtholdige cellemembran kan passeres, må brintbindingerne mellem lægemid-

delstoffet og de omgivende vandmolekyler brydes.

Den relative placering af atom 1 og 4 i det tre-

dimensionelle rum ændres ved rotation omkring

enkeltbindingen mellem atom 2 og 3. Hver

kombinationsmulighed for indbyrdes placering

af alle molekylets atomer betegnes en konforma-

tion. Som eksempel er her vist 3 forskellige kon-

formationer af det samme stof, butan.

Størrelsen af det polære vandtilgængelige over-

fladeareal (PVO) afhænger af konformationen.

PVO af den udstrakte konformation til venstre

er betragteligt større end af den sammenfoldede

til højre. De mørke prikker viser polært overfla-

deareal, de lyse prikker viser ikke-polært over-

fladeareal.

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.09 Side 26

Fig. 3

Fig. 2

Fig. 1

29L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Ph.d. Bente Steffansen er

lektor ved Institut for

Farmaci.

Ph.d. Sven Frøkjær er

professor ved Institut for

Farmaci.

Ph.d. Mitchell E. Taub

er forskningsadjunkt ved

Institut for Farmaci.

Asparaginsyre eller glutaminsyreindgår som én af aminosyrerne i allede dipeptider, der anvendes somtransportarm for benzylalkohol. Vianvender stabiliserede dipeptider,hvilket er nødvendigt for at undgå,at der sker enzymatisk nedbrydningaf selve transportarmen i mave-tarmkanalen.

D-asparaginsyre-L-alanin er etsådant stabiliseret dipeptid, fordiasparaginsyren anvendes i dets D-konfigurationsform, som er et spejl-billede af den naturlige L-asparagin-syre. De to former er kemisk ens,men har forskellig facon ligesomhøjre og venstre hånd. Ved atanvende D-formen opnår man, atenzymer i mave-tarmkanalen ikkegenkender dipeptidet og dermedikke nedbryder det til de respektiveaminosyrer, hvilket ville være tilfæl-det, hvis den naturlige L-asparagin-syre havde været anvendt.

Transportøren for små peptidergenkender imidlertid stadig dipepti-der, hvor den ene aminosyre findespå D-konfigurationsform. Hvis deri-mod begge aminosyrene er på D-formen, kan transportøren ikke gen-kende stoffet. Ved således at anven-de D-asparaginsyre-L-alanin med énspejlvendt og én normal aminosyreer det muligt at undgå nedbrydningi mave-tarmkanalen og samtidigbevare transportarmens evne til atbinde sig til transportøren.

Kobles modellægemiddelstoffetbenzylalkohol til den ovenforbeskrevne transportarm D-Asp(OBzl)-Ala opretholdes såvel bindingsevnensamt evnen til at passere tarmslim-hinden og komme ud i blodet.

Studier på humane cellekulturerDe ovenfor beskrevne bindings- ogtransportstudier er udført på celle-kulturer stammende fra en humantyktarmscancer, hvilket betyder, atcellerne deler sig hurtigt. Dette eren stor fordel, da man allerede efterca. tre ugers dyrkning opnår et rela-tivt tæt og homogent cellelag, hvortransportøren er udtrykt. Cellelagetvirker som en kunstig tarmslimhin-de.

Binding til transportøren målesved fortrængningsstudier. Man til-sætter her et radioaktivt mærketstof, som man ved binder sig tiltransportøren, samtidig med detstof man ønsker at undersøge. Her-ved vil det stof, man undersøger,helt eller delvist fortrænge det radi-oaktivt mærkede stof fra bindings-stedet, fordi de to stoffer konkurre-rer om det samme bindingssted.Radioaktiviteten vil således væremindre i de prøver, der udover det

radioaktivt mærkede stof indeholderet andet stof, som er i stand til atbinde sig til transportøren.

Transport over cellelaget målesved, at tilsætte det stof, man ønskerat undersøge på den side af cellela-get, som svarer til cellernes naturligetarmside. Derpå måler man, hvormeget stof, der findes på cellelagetsanden side. Målingerne viser, hvormeget af stoffet, der har været istand til at passere den kunstigetarmslimhinde.

Transportstudier på intakte tarmeI samarbejde med Hans Lennernäspå Uppsala Universitet i Sverige erD-Asp(OBzl)-Ala's binding til trans-portøren blevet undersøgt på intaktrottertarm.

Resultaterne bekræfter resulta-terne udført på cellekulturer. Indgi-ves D-Asp(OBzl)-Ala sammen medmarkørstoffer, som er istand til atbinde sig til transportøren, mindskesabsorptionen af markørstofferne.

Det ser således ud til, at trans-portøren for di- og tripeptider kananvendes til at transportere læge-middelstoffer fra tarmen og over iblodet, når et stabiliseret dipeptidanvendes som transportarm.

28

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Den svære vejgennem

tarmvæggenMange lægemidler skal ud i blo-det for at virke. Men en del afdisse stoffer bremses af tarm-væggen, når de indtages somtabletter, kapsler eller lign. Enmulig løsning er at bruge detransportsystemer, der slusersmå peptider fra føden gennemtarmslimhinden, til at sendelægemiddelstofferne ud i blodet.

Af Bente Steffansen,Sven Frøkjær og Mitchell E. Taub

En række lægemiddelstoffer,som virker, når de indgives direkte iblodet ved injektion, er uvirksommei tabletform. Årsagen er typisk, atdet aktive lægemiddelstof ikketrænger gennem tarmslimhinden.Det medfører, at lægemiddelstoffetikke får adgang til blodet, som ellersskulle transportere stoffet videre tilvirkningsstedet.

Da det ubetinget er behagelige-re at indtage tabletter end at injice-re stofferne, forskes der intenst imetoder til at få disse lægemiddel-stoffer sendt gennem tarmslimhin-den. Og der er en mulig løsning. Vedat koble stoffet til en transportarm,som passer til et bindingssted i tarm-slimhinden, en såkaldt aktiv trans-portør, kan man måske alligevel fådet virksomme stof transporteretover i blodet og dermed opnå denønskede effekt.

Et stof som indgives gennemmunden kan passere tarmslimhindenenten ved passiv eller aktiv trans-port. Passiv transport kræver, at stof-fet har sådanne fysisk-kemiske egen-skaber, at det af sig selv trængergennem tarmslimhinden. Ved aktivtransport er det nødvendigt, at stof-fet har en kemisk struktur, der pas-ser til en aktiv transportør som ennøgle i en lås.

Der findes en række aktivetransportører, som transportererstoffer fra føden over i blodbanen.Dette gælder visse stoffer, som ernødvendige for, at kroppen kan fun-

gere optimalt, såsom glucose,aminosyrer og små proteinfragmen-ter, der kaldes peptider.

Transportør for små peptiderMange steder i kroppen, men især ityndtarmen, findes en transportør,som sender små peptider ud i blo-det. Transportørens naturlige funkti-on er at optage di- og tripeptider,som kun består af henholdsvis to ogtre aminosyrer. Disse peptider stam-mer fra fødens proteiner.

Peptiderne har kemiske struktu-rer, som på nogle områder er megetens, men som på andre er vidt for-skellige. Dette gør, at transportørenikke er udtalt strukturspecifik, nårblot de strukturer, som de små pep-tider har tilfælles tilnærmelsesvisbevares i molekylet. Det har da ogsåvist sig, at nogle kendte peptidlig-nende lægemiddelstoffer såsom vis-se antibiotika, penicilliner og ce-phalosporiner, transporteres fra tarmen og over i blodet via dennetransportør.

Man kan også forestille sig, attransportøren for di- og tripeptiderkan benyttes til at fragte lægemid-delstoffer med helt andre strukturergennem tarmvæggen. Ved at udvik-

le en transportform (produg) be-stående af det oprindelige lægemid-delstof koblet til en transportarm,som er i stand til at binde sig tiltransportøren, vil man måske kunnefå lægemiddelstoffet sendt ud i blo-det.

Så længe lægemiddelstoffet erkoblet til transportarmen, er detuvirksomt. Det er således hensigten,at transportarmen under eller eftertransporten frigiver det oprindeligelægemiddelstof. Det er f.eks. vist, atstoffet valaciclovir, som er en trans-portform af aciclovir, transporteresfra tarmen og over i blodet via den-ne transportør. Valaciclovir er regi-streret under navnet Zelitrex® oganvendes til behandling af herpes.

Transportformer af lægemiddelstofferGruppen arbejder på nuværendetidspunkt med modeltransportfor-mer. Vi koncentrerer primært arbej-det omkring modellægemiddelstof-fet benzylalkohol, som kobles til for-skellige dipeptider. Dipeptiderne ervalgt således, at de indeholder ensåkaldt ekstra funktionel gruppe,hvortil det er muligt at koble benzyl-alkohol.

En transportform binder sig til di- og tripeptidtransportøren på tarmslimhinden. Herved bliver trans-

portformen sendt over i blodet, hvor lægemiddelstoffet frigives under enzymatisk nedbrydning af

transportformen.

Cellekultur opsat til transportstudier.

Kemisk struktur af modeltransportformen D-

Asp(OBzl)-Ala. Modellægemiddelstoffet benzyl-

alkohol er koblet til dipeptidet D-Asp-Ala ved

en simpel esterbinding.

Tarmlumen

Transportarm Lægemiddelstof Transportform

Tarmslimhinden Blod

Tilsætning af produg

Udtagning af prøver

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.10 Side 28

Fig. 2

Fig. 1

31L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Ph.d. Kent Jørgensen er lektor

ved Institut for Farmaci.

Faseovergange i lipidmembranerVed basale studier af lipidmembra-ners struktur og dynamik anvendeshyppigt liposomer som modelsyste-mer. Liposomer dannes spontant,når lipidmolekyler blandes medvand. Lipidernes molekylære struk-tur og de anvendte præparations-metoder er bestemmende for liposo-mernes størrelse og antallet af lipid-dobbeltlag, som liposomerne eropbygget af.

Lipidmembraner kan undergåadskillige faseovergange, der bl.a.afhænger af lipidernes molekylærestruktur og fysisk-kemiske forholdsom f.eks. ionstyrke og pH. Denbedst undersøgte faseændring i lipidmembraner er den såkaldte gel-fluid faseovergang, hvor lipidmem-branen ændrer sig fra en fast til enflydende struktur. Overgangen erkarakteriseret ved, at de langekæder på lipiderne smelter og æn-drer tilstand fra en overvejende ord-net konformation til en uordnetkonformation.

Vigtig indsigt i lipidmembranerskooperative opførsel er fremkom-met ved anvendelse af Monte Carlocomputersimuleringer af statistisk-

30

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Membranerog transport af

lægemidlerLipidmembraner danner grund-strukturen i cellemembraner ogvirker samtidig som en transport-barriere for lægemiddelstoffer.Kendskab til lipidmembranersmolekylære struktur og dynamiker derfor vigtigt for at forstå,hvorledes lægemiddelstoffer nårud til virkningsstederne. Samti-dig kan lipidmembraner og lipo-somer anvendes til at transporte-re lægemiddelstoffer til bestem-te steder i kroppen.

Af Kent Jørgensen

Lipidmembraner indtager ennøgleposition som et strukturelt ogfunktionelt grundelement i allebiomembraner. Et eksempel er celle-membraner, der omslutter og af-grænser alle levende celler.

Grundstrukturen i en biomem-bran udgøres af lipidmolekyler, derdanner en dobbeltlagsstruktur, hvorde hydrofile, vandsøgende hovederpå lipiderne vender ud mod vandfa-sen og de lange hydrofobe, vandsky-ende fedtsyrekæder udgør membra-nens indre. Ud over lipidmolekylerneindeholder cellemembraner forskelli-ge proteiner, der blandt andet med-virker ved den aktive stofudvekslingmellem cellen og omgivelserne.

Biomembraner har generelt enlav gennemtrængelighed for læge-middelstoffer. Kendskab til lipid-membraners molekylære struktur ogdynamik er vigtigt for at forstågrundlæggende barriereegenskaberaf biomembraner. Dertil kommer, atmange lægemiddelstoffer påvirkerbiomembraners strukturelle ogdynamiske opførsel og derved kanudøve en effekt.

Resultater fra den seneste mem-branforskning, der involverer fysisk-kemiske, farmaceutiske og biologi-ske discipliner, har vist, at lipidmem-braners dynamiske mikrostruktur harafgørende betydning for funktionel-le membranegenskaber som f.eks.den passive gennemtrængelighed aflægemiddelstoffer samt for aktivite-

ten af membranassocierede prote-iner og enzymer.

Grundlæggende eksperimentelleog teoretiske studier af lipidmem-braners mikrostruktur har samtidigfrembragt viden og indsigt i vigtigematerialeegenskaber af lipidmem-braner, som har betydning for udvik-ling af transportsystemer, der kanbringe lægemiddelstoffer hen til deønskede virkningssteder i kroppen.

Et eksempel på et lovende trans-portsystem er liposomer, som er småkugleformede lipidaggregater. Lipo-somer har potentielle anvendelses-muligheder som avancerede trans-portsystemer for vand- og fedtop-løselige lægemiddelstoffer, der kaninkorporeres i liposomerne og påden måde være delvist beskyttetmod nedbrydning i blodbanen.

I de senere år har der været for-sket intenst i at anvende liposomertil målrettet transport og afgivelseaf lægemiddelstoffer til bestemteområder i kroppen. Anvendelse afliposomer som målrettede transport-systemer vil samtidig kunne reduce-re mange af de bivirkninger, derofte optræder ved indgift af poten-te lægemiddelstoffer.

Liposomer har et potentiale som transportsystemer for lægemiddelstoffer. Til venstre ses en skematisk

illustration af små og store liposomer, der kan bestå af et eller flere lipiddobbeltlag. I midten er vist

en forstørrelse af lipiddobbeltlaget, der udgøres af fosfolipider. De mørke områder på membranens

ydersider er lipidmolekylernes hydrofile hoveder, mens membranens indre består af de lange hydrofo-

be fedtsyrekæder. Membranen kan undergå en gel-fluid faseovergang som vist øverst til højre.

Ved inkorporering af lipopolymerer i membranen beskyttes liposomerne mod nedbrydning i blodet

(Stealth-liposomer).

Monte Carlo computerberegninger af lokalstruktur og lipiddomæner i fosfolipidmembraner. A viser en lipidmembran i ligevægt. B viser en lipidmembran

ude af ligevægt.

mekaniske molekylære modeller.Beregningerne, der giver mulighedfor at studere fordelingen af lipider-ne i membranen, har afsløret, atfaseovergangen mikroskopisk mani-festerer sig ved dannelsen af dyna-miske lipidstrukturer med en størrel-se, der rækker over adskillige mole-kylære afstande.

Eksistensen af lipiddomæner ogdifferentierede områder i cellemem-braner har bl.a. betydning for mem-branens gennemtrængelighed forlægemiddelstoffer samt for aktivite-ten af membranassocierede enzymerog proteiner. Specielt er en sådanstruktur-funktionssammenhæng vel-beskrevet for enzymet fosfolipaseA2, der er et hyppigt forekommendeenzym i organismen.

I modelmembraner, der eropbygget af flere forskellige slagslipider, kan en tilsvarende variation imembranstrukturen forekomme somlipiddomæner med en lokal kompo-sition, der er forskellig fra den glo-bale komposition. Påvisning af lokal-struktur i lipidmembraner i den fly-dende tilstand er af speciel interesseset i relation til de fysiske forhold ibiomembraner, der på trods af deresglobale flydende karakter alligevelkan have en betydelig grad af lokal-struktur med funktionel betydning.

Studier af faseseparationsdyna-mikken i lipidmembraner har endvi-dere været i stand til at afdække enuventet og overraskende langsomtidsskala for vækstprocessen affaseseparerede lipidområder. Detteviser sig ved dannelsen af en mem-branstruktur, der udgøres af lipiddo-mæner med en varierende levetidog størrelse. En opdeling af lipid-membranen i afgrænsede områderhar indflydelse på fordelingen og

bevægeligheden af f.eks. membran-associerede proteiner og enzymer.

Transport af lægemiddelstofferDen forøgede indsigt i lipidmembra-ners mikroskopiske struktur, der erfremkommet fra teoretiske og eks-perimentelle modelstudier, harbidraget til en bedre forståelse affunktionelle og strukturelle forhold ibiomembraner. Sideløbende hermeder der opnået øget indsigt i vigtigematerialeegenskaber af lipidmem-braner, der har betydning for enrationel udvikling af liposomer sommålrettede transportsystemer forlægemiddelstoffer.

Et eksempel på en vellykketforsknings- og udviklingsstrategihentet fra den internationale forsk-ningsverden er overflademodificere-de liposomer med små mængderpolymerlipider indbygget i membra-nen. Sådanne stabiliserede Stealth-liposomer, der nu markedsføres somtransportsystemer for lægemiddel-stoffer, udviser både en forøget sta-bilitet i blodet og en forbedret evnetil at bringe medicinen hen til detønskede virkningssted.

Fremtidige undersøgelser afmodelmembraner med stigendegrad af kompleksitet må forventesat give dybere indsigt i lipidmembra-ners strukturelle og funktionelleegenskaber. En forøget klarlæggelseaf de mikroskopiske forhold i lipid-membraner er en forudsætning foren bedre forståelse af lipidmembra-ners funktionelle rolle i biologiskesystemer. Sideløbende hermed åbnesder op for en rationel måde atdesigne liposomer med nye og for-bedrede egenskaber, der kan brugessom målrettede transportsystemerfor lægemiddelstoffer.

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.10 Side 30

Fig. 2

Fig. 1

33L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Lic.pharm. Søren Brøgger

Christensen er docent ved

Institut for Medicinalkemi.

Ph.d. Simon F. Nielsen har

været ph.d.-studerende ved

Institut for Medicinalkemi i

perioden 1994 til 1997.

Fil.dr. Tommy Liljefors er

forskningsprofessor ved

Institut for Medicinalkemi.

om det var muligt at ændre stoffetsstruktur. Målet var at fjerne bivirk-ningen og øge stoffets dræbendeeffekt på parasitterne. Da sygdom-me fremkaldt af parasitter er infekti-onssygdomme, er det samtidig væ-sentligt, at lægemidlet ikke hæm-mer immunsystemet.

På baggrund af overvejelser afdenne type blev det besluttet atbelyse, hvorledes stoffets strukturkunne ændres, så det kunne opfyldedisse kriterier. Vi valgte her at gen-nemføre en såkaldt 3-DimensionelKvantitativ Struktur Aktivitets Relati-ons analyse (3D-QSAR). Metodenomfatter tre trin; design af relevantestoffer, fremstilling og afprøvning af

disse stoffer samt selve QSAR-analy-sen.

I dette tilfælde blev stoffernevalgt ved et statistisk eksperimenteltdesign for at sikre så stor en variati-on som muligt i deres egenskaber.Denne computerbaserede regnetek-nik gør det muligt at designe etbegrænset antal stoffer og samtidigsikre at et bredt udsnit af stofgrup-pens egenskaber bliver afprøvet.Selv om mange variable ændres påén gang, er regneteknikken i standtil at belyse de enkelte komponen-ters betydning. På basis af analysenblev ca. 100 stoffer fremstillet ogden koncentration (IC50), der med-fører en halvering af parasitternes

32

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Fra lakridsrodtil

lægemiddelDer er hårdt brug for nye læge-midler mod parasitære sygdom-me som malaria og leishmania-sis. Lakridsrod indeholder et stof,som kan dræbe parasitter, mensom også frygtes at være svagtkræftfremkaldende. Computer-beregninger bruges nu til atundersøge, hvordan stoffetsstruktur kan ændres, så bivirknin-gen elimineres og den helbreden-de effekt forstærkes.

Af Søren Brøgger Christensen, SimonF. Nielsen og Tommy Liljefors.

Mange naturstoffer harspændende medicinske egenskaber,men nøjere undersøgelser afslørerofte, at de samme stoffer besidderen række uheldige bivirkninger, dergør dem uegnede som lægemidler.

Ændring af naturstoffernesstruktur kan i nogle tilfælde føre tilforbindelser, hvor stoffets favorableegenskaber er fremmet på bekost-ning af de uønskede. Uheldigvis fin-des der ingen sikker metode til atforudsige, hvorledes de ønskedeegenskaber kan fremmes, men nyecomputerbaserede statistiske meto-der kan anvendes som et værktøj forat lette denne proces.

Vi har anvendt computerbereg-ninger til at undersøge et stof fralakridsrod, som kan helbrede musfor infektionssygdomme forårsagetaf parasitter. Uheldigvis er der enrisiko for, at stoffet måske kan frem-kalde kræft, og derfor kan det ikkebruges til at behandle parasitæresygdomme hos mennesker. Compu-termodellen peger på, hvordan stof-fet kan ændres, så det bliver egnetsom lægemiddel.

Der er hårdt brug for nye læge-midler mod sygdomme forvoldt afparasitter, fordi mange af de syg-domsfremkaldende parasitter er ble-vet resistente overfor de eksisteren-de former for medicin. Alene mala-ria dræber hvert år over over to mil-lioner mennesker.

Biologisk aktive plantestofferPlanteindholdsstoffer inddeles tradi-tionelt i primære metabolitter ogsekundære metabolitter. Karakteris-tisk for de primære metabolitter er,at de er fælles for et bredt udsnit aflevende organismer, og at det ersimpelt at forklare deres betydningfor organismens livsfunktioner; eteksempel er druesukker. Desekundære metabolitter findes kun iganske få, oftest nært beslægtedeorganismer, og deres betydning fororganismen er ikke umiddelbart ind-lysende.

Alle naturstoffer, der er anvendteller stadig anvendes som lægemid-ler, tilhører gruppen af sekundæremetabolitter. Flere af dem virkersærdeles stærkt, hvilket gør det pro-blematisk at benytte den rå ellertørrede plante som lægemiddel. Imange tilfælde svinger mængden afsekundære metabolitter nemligstærkt med plantens udviklingstrin.

Såfremt en plante anvendes pågrund af tilstedeværeslen af etstærktvirkende stof, er det et pro-blem for en behandling, hvis stoffeti nogle præparationer findes i stormængde, mens det stort set ikke ertilstede i andre.

Tidligere blev mange patientermed hjerteproblemer behandletmed tørrede digitalisblade. Da ind-holdet af de aktive metabolitter idisse blade svinger en del, blev hverenkelt præparation af bladene der-for styrkebestemt ved at måle dendosis, der kunne dræbe et marsvin.Problemet kan løses ved at renfrem-stille de aktive indholdsstoffer. I dagbenyttes de aktive indholdsstoffer,der stadig isoleres fra digitalisblade.Den ønskede dosis kan så simpeltafvejes.

Udvikling af lægemidlerMange naturstoffer har gennemtiden været brugt som lægemidler,og en række stoffer anvendes sta-dig. Der er dog i nogle tilfælde kon-stateret uheldige bivirkninger. Såle-des kan kinin, der anvendes sombehandling af malaria give uhelbre-delige skader i centralnervesystemt.Med udgangspunkt i kinin har man

så ved mere eller mindre systemati-ske variationer af stoffets strukturformået at fremstille en beslægtetforbindelse, der ikke besidder denneuheldige bivirkning, men stadig kanbekæmpe malariaparasitten.

Der er gennem de senere årudviklet metoder, som gør detmuligt at afprøve planteekstrakterfor spændende egenskaber. Dissemetoder er baseret på reagensglas-forsøg med cellekulturer og kræversåledes ikke anvendelse af levendeforsøgsdyr. Da metoderne både erhurtige og effektive, kan et stortantal planteekstrakter afprøves, ogde interessante ekstrakter udpeges.Samtidig kan de aktive indholdsstof-fer isoleres og karakteriseres.

Denne udvikling har medført enstigende interesse for at anvendeplanter som udgangspunkt forudvikling af lægemidler. Det fascine-rende ved denne metode er, at detikke på forhånd kan forudsiges, hvil-ken type naturstoffer, der viser sig atvære de aktive indholdsstoffer.Metoden kan derfor lede til heltuventede og interessante resultater.

Medicin fra lakridsrodFor nogle år siden gennemførte vortinstitut i samarbejde med forskerepå Rigshospitalet og Panuminstitut-tet en sådan undersøgelse af kine-sisk lakridsrod. Det var allerede pådet tidspunkt kendt, at lakridsrodenindeholdt forbindelsen licochalconA, men studiet viste overraskende,at dette stof var i stand til at dræbesåvel malaria- som leishmaniapara-sitter.

For at afklare, om stoffet kunneanvendes som lægemiddel til men-nesker, blev det underkastet en ræk-ke forsøg med forskellige cellekultu-rer. Et af eksperimenterne viste, atstoffet kunne fremkalde forandrin-ger i nogle cellers arvemasse. Detmå derfor frygtes, at licochalcon Akan fremkalde kræft i menneskereller dyr.

Selv om den anvendte testproce-dure er meget følsom, og det derforkan vise sig, at forbindelsen i realite-ten ikke er kræftfremkaldende, blevdet alligevel besluttet at undersøge,

Lakridsrod indeholder stoffet licochalcon A,

som kan nedkæmpe parasitter. Stoffets kemiske

formel er vist nederst til venstre.

Figuren viser et tredimensionelt billede af en chalcon omgivet af konturer af områder. Disse områder er beregnet ved hjælp af 3D-QSAR. Såfremt chal-

conen påsættes en kemisk gruppe, der okkuperer disse områder forudsiger modellen, at den pågældende forbindelse vil have mindre aktivitet over for para-

sitter (a) samt lymfocytter (b). En tilsvarende tredimensionel model, der viser de områder, som forøger stoffernes aktivitet, er også blevet beregnet. Den sto-

re forskel mellem områdernes placering og omfang i henholdsvis a og b tyder på, at det er muligt at fremstille en forbindelse med høj aktivitet over for

parasitterne og ringe effekt på lymfocytterne og dermed på immunforsvaret.

og lymfocytters evne til at formeresig blev målt. Lymfocytter er en typehvide blodlegemer, der indgår iimmunsystemet.

I den følgende 3D-QSAR analyseblev stoffernes kemiske egenskaber,der blev repræsenteret ved nogletalværdier, ved statistiske metodersammenholdt med den biologiskeaktivitet (IC50). For en trænet personer det ud fra denne model muligt atse, hvorledes ændringer af opbyg-ningen af molekylet vil påvirke denbiologiske aktivitet. Det næste skridtbliver så at fremstille de forbindel-ser, som denne model peger på, ogundersøge om de virkelig er bedreend udgangsstoffet.

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.10 Side 32

Fig. 3

Fig. 2

Fig. 1

35L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Cand.pharm., ph.d. Anna

Birna Almarsdóttir er

adjunkt ved Institut for

Samfundsfarmaci.samles undervisningsmaterialer omastma; i Danmark stammer de isærfra læger og apoteker samt fra Ast-ma og Allergiforbundet. Derefterbeskrives materialerne kvalitativtmed henblik på at afklare, om deresindhold, sværhedsgrad og billedvalggør dem velegnede til børn. I densidste del af projektet studeres bru-gen af undervisningsmaterialernefor at undersøge, hvordan børnønsker at blive undervist om astmaog lægemiddelanvendelse.

Den danske projektgruppe be-står af undertegnede og antropologSussi Skov Jensen fra DSI – Institutfor Sundhedsvæsen. Vi har fokuseretpå astmaskolerne i Danmark og isærpå astmaskolen i Odense, der starte-de i 1991 som den første her i lan-det. Skolen er for børn og unge ialderen 6-18 år, og kurserne foregårto dage om ugen i et forløb overseks uger. Børnene henvises typisk tilskolen af praktiserende læger.

Odenseskolen har vist megetlovende kliniske resultater. Kort for-talt har undervisningen medført, atbørnene har det bedre i dagligda-gen. Vi har anvendt en kvalitativmetode, observation, til at forstå,hvorfor skolen har opnået så goderesultater. Her lyttes der til, hvad derbliver sagt, hvordan det siges, og deinvolveredes kropsprog studeres.

Observationerne tyder på, at deter vigtigt at tilpasse informations-materialet og undervisningsmådentil aldersgrupperne. Personalet påOdenseskolen og især sygeplejer-sken Betty Østergaard har anvist engod måde at kommunikere medbørn og unge. Når der er tale omsmå børn, sætter hun sig på gulvetmed dem, får børnene til at fortælleog bidrager selv med de relevanteoplysninger under samtalen. Når detdrejer sig om unge, taler hun til demsom voksne.

For fremtidige astmaskoler ogandre programmer, der fokuserer påkronisk syge børn, er det nødvendigtat kunne kommunikere effektivt.Erfaringerne fra Odense er bl.a. rele-vante for den nye astmaskole, somer startet i København.

Anvendelse i Danmark og USAAfhandlingens resultater er blevetanvendt helt bevidst to steder – iNordjyllands Amt og hos UnitedStates Pharmacopeia (USP).

I 1994 blev jeg inviteret til atdeltage i et “advisory panel” hosUSP omkring børn og lægemidler.USP blev stiftet i 1820 til at varetageudgivelsen af standarder og mono-grafier over lægemidlers indhold.Organisationen har nu udvidet sitarbejdsområde til også at omfattelægemiddelinformation. USP blev ibegyndelsen af 90'erne opmærksompå, at børn har behov for informati-on om deres lægemidler og oprette-de det rådgivende udvalg, som jegmedvirkede i. Udvalget har netopanbefalet ni principper for brug aflægemidler til børn. Den centraleanbefaling er, at børn skal informe-res på en måde, der passer til deresalder, følelser og kulturelle bag-grund.

Planlægnings- og udviklingskon-toret ved Nordyllands Amt udarbej-dede i 1996 en sundhedsprofilblandt de 13-19 årige nordjyder,Unge i profil. Undersøgelsen blevgennemført som en spørgeskemaun-dersøgelse med næsten 1000 tilfæl-digt udvalgte unge. Et af de mesttankevækkende resultater var, at

31% af de adspurgte angiver athave indtaget smertestillende medi-cin inden for de sidste 14 dage. For-bruget var størst hos de unge kvin-der.

I begyndelsen af 1997 holdtamtet en temadag om emnet. Jegblev inviteret til at fortælle omresultater af forskning omkring børnog unges brug af lægemidler somforberedelse til debatgrupper om,hvorvidt dette var et problem, somskulle behandles af sundhedsmyn-dighederne og i så fald, hvilken ind-sats amtet kunne gøre for at frem-me et rationelt forbrug af smertestil-lende medicin.

Der er siden blevet fremlagt enrække konkrete initiativer for atmindske de unges forbrug af smer-testillende medicin. Et af forslageneer aldersdifferentieret oplysning i deenkelte skolers sundhedsundervis-ning. Målet er at forandre de ungesholdning til det at anvende smerte-stillende medicin. Et andet er oplys-ning og holdningsbearbejdning iforhold til forældre samt lærere ogandet personale på de skoler, derudleverer smertestillende medicin.Andre muligheder er bedre diagno-sticering hos de praktiserende lægerog forbud imod reklamer for smer-testillende medicin.

34

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Børn skalinformeres om

deres lægemidlerNår børn får medicin, skal deinformeres om lægemidlerne påen måde, der er passer til deresalder og udviklingstrin. Det erikke nok, at forældrene fårbesked. God oplysning fremmerbehandlingen og gør det letterefor kronisk syge børn at leve medderes sygdom.

Af Anna Birna Almarsdóttir

I dette årti er børn og unge kom-met mere i fokus som lægemiddel-brugere. Især kronisk syge børn ogunge har fået større opmærksom-hed i kraft af, at de er i stand til – tildels – at afgøre om deres behand-ling er effektiv. Livlig forskning ogudnyttelse af resultaterne er fulgt ikølvandet af den voksende interessefor emnet.

Netop børns opfattelse af syg-domme og lægemidler var emnetfor min ph.d.-afhandling, som jegforsvarede i 1994 fra University ofNorth Carolina, School of PublicHealth. Afhandlingen udsprang af etsamarbejde jeg havde med forskere iUSA og Europa omkring børns læge-middelforbrug. Samarbejdet varfinansieret af EU´s BIOMED program,som på det tidspunkt hed COMAC.

Problemformuleringen i hele deteuropæiske projekt var: Hvad erbørns oplevelser og tanker omkringsygdomme og brug af lægemidler iforskellige europæiske lande ogUSA? Formålet var at oplyse prakti-kere og politikere om, hvad børnved og tror om lægemidler, og der-med sætte barnet som bruger i cen-trum.

COMAC projektet var banebry-dende med hensyn til formålet, sam-mensætningen af forskergruppen ogbrugen af metoder. Forskerne komfra ni lande og fra vidt forskelligediscipliner. Antropologer, farmaceu-ter, læger, lærere og psykologerarbejdede tæt sammen i et relativtnyt forskningsfelt.

Børns opfattelse af lægemidlerMin egen afhandling fokuserede påbørn i 7 og 10 års alderen. De blevrekrutteret fra middelklassen i NorthCarolina. Metoderne bestod af kvali-tative interviews og kvantitativespørgeskemaer samt skalaer. Skalaerbestår af standardiserede spørgsmål,hvor svarene giver et antal point.Resultatet er et tal, som udgør etmål for, hvor god eller dårlig denadspurgte mener, at en behandlinger. De anvendte skalaer stammedefra Children’s Health Promotion, etforskningscenter ved GeorgetownUniversity.

Ved de kvalitative interviewsblev børnene bedt om at tegne etbillede af den sidste gang, de varsyge. Spørgsmålene blev så stillet udfra tegningens indhold. Hændelser,følelser og tanker i relation til syg-dom og lægemiddelanvendelse blevderpå analyseret.

Hvad tænker børn om lægemid-ler? Et kortfattet svar fra minafhandling kunne lyde, at de ikketænker ret meget på lægemidler. Ideres tegninger forekom lægemidlerkun undtagelsesvis, og forskerneblev nødt til at spørge direkte tilmedicinforbrug i næsten alle tilfæl-de. Det afspejler, at børn ikke ersærlig autonome i deres beslutnin-ger omkring sygdom; afgørelserne

træffes af lægerne og børnenesforældre.

Der var – ikke overraskende –forskelle mellem 7 og 10 årige ideres måde at omtale lægemidlerpå. Syvårige var tilbøjelige til atmene, at lægemidler var gavnlige,mens 10 årige var mere neutrale ideres holdning. Den yngre gruppebeskrev lægemidlerne generelt i far-ver og smag, mens de ældre omtaltedem på en mere voksen manér. Debrugte ofte medicinnavne ellerbetegnelser som f.eks. hostemiddel.

Internationale sammenligningerblev udført af andre forskere i COM-AC projektet. De viste bl.a., at børn ide fleste samfund synes, at læge-midler er et vigtigt led i terapien,selv om de ikke uopfordret omtaltedem i interviewene. Alle rapporterfra de europæiske lande, men ikkeden amerikanske, pegede på, at bør-nene havde gjort sig tanker omnegative eller farlige sider af læge-middelterapien.

Fokus på astmaskolerSamarbejdet fra COMAC projektetforsætter nu i et europæisk BIOMEDprojekt, som består af tre delområ-der. Det første er en kortlægning afastmatiske børns opfattelser og for-ståelse af deres sygdom og lægemid-ler i hverdagen. I den anden del ind-

Betty Østergaard kommunikerer livligt med den

yngre gruppe børn på Astmaskolen i Odense.

En 10-årig pige med influenza og hendes mor.

Pigen siger, at hun er imod at tage lægemidler.

En 7-årig dreng med skoldkopper

og hans mor. Han ligger i et

havregrynsbad, som han siger

hjælper ham med at blive af med

skoldkopperne.

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.10 Side 34

Fig. 1

Fig. 2

37L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Cand.pharm. Ebba Holme

Hansen er professor ved

Institut for Samfundsfarmaci.

Cand.polit., ph.d. Marlene

Gyldmark er ekstern lektor

ved Institut for Samfunds-

farmaci.

Men metoden har flere proble-mer. Nogle gange kan det væresvært at bestemme, hvad der egent-lig er en omkostning. Det samledebeløb repræsenterer desuden et mixaf bærere af omkostninger, hvorafnogle aldrig vil blive realiseret iform af egentlige værdier, såfremtproblemet forsvandt. At tale ombyrden for samfundet er derfornogle gange misvisende.

Vil man undersøge de samfunds-økonomiske omkostninger afafhængighed og misbrug af psyko-farmaka, bør man stille følgendespørgsmål: Hvad koster det ud fraen samfundsmæssig synsvinkel atbehandle og reducere afhængig-hed? Hvad er effekten? Hvilke alter-native metoder er anvendelige?Hvad er disse metoders omkostnin-ger og effekter? Hvad er prisen forat gøre ingenting? Metoden til atbesvare denne type spørgsmål hed-der Cost-effectiveness analyse.

Det næste spørgsmål er: Er denene fordeling af ressourcer bedreend den anden? Bliver de, som bli-ver bedre stillet ved et nyt tiltag, såmeget bedre stillet, at det kan beta-le sig at gennemføre det? Eller eromkostningerne for store? Dennetype økonomisk analyse kaldes enCost-benefit analyse. Heller ikkedenne type analyse har væretudført inden for psykofarmakaom-rådet.

Ressourceforbrug ved afhængighedAfhængighed af psykofarmaka tæ-rer på mange forskellige ressourcer:* Det offentlige sundhedsvæsen;

herunder sygehussektoren, denprimære sektor, information ogmedicin.

* Andre offentlige instanser; her-under sociale ydelser, der dæk-ker patienter, som vil ophøreforbrug, patienter som ikke vilophøre samt patienter med ille-galt forbrug.

* Retslige instanser; herunderretshjælp og omkostninger vedsvindel og illegalt forbrug.

* Den private sektor; herunderprivate klinikker.

* Frivillig hjælp; herunder hjælpog behandling fra organisatio-ner.

* Omkostninger ved uheld ogulykker; herunder ulykker i tra-fikken, på arbejde og i fritidensamt for tidlig død.

* Ikke-institutions hjælp; herun-der støtte, hjælp, behandling,pleje fra familie og venner samtomkostninger for familie ogvenner i form af humøreffekteretc.

36

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

De samfundsmæssigeomkostninger

ved afhængighed afpsykofarmaka

Flere hundrede tusinde danskerefår ordineret psykofarmaka,typisk nerve- og sovemedicin. Etukendt antal bliver afhængige afmedicinen. Hvad koster det sam-fundet? Beløbet kan ikke opgøresi dag. Men en kortlægning afudgifterne vil være et skridt i ret-ning af at spare ressourcer ogforbedre mange menneskers livs-kvalitet.

Af Marlene Gyldmark og Ebba Holme Hansen

For et par år siden blev vi kon-taktet af et canadisk regeringsor-gan, som bad os om at skrive en rap-port om de samfundsøkonomiskeomkostninger ved misbrug af psy-kofarmaka. Vi påtog os med glædeopgaven, da der her var en mulig-hed for at kombinere vor forsknings-mæssige baggrund inden for såvelpsykofarmaka som sundhedsøkono-mi.

Vi aftalte at lave en kritisk vur-dering af den eksisterende litteraturpå området og at opstille retningsli-nier for fremtidige analyser. Detviste sig snart, at planerne var van-skelige at realisere. En omfattendelitteratursøgning i internationaledatabaser opsporede ikke en enestepubliceret undersøgelse af omkost-ningerne ved misbrug af psykofar-maka.

Herefter var vi overladt til selvat forsøge at opstille et regnestykke.Ved en samfundsøkonomisk analyseer det nødvendigt at identificeresamtlige konsekvenser af misbrug afpsykofarmaka. Men det betyder, atvi må kunne definere både “psyko-farmaka” og “misbrug”. Som det vilfremgå, er dette ikke uden proble-mer, og det er endnu sværere atkvantificere omfanget af misbruget.

Psykofarmaka og afhængighedAnvendelsen og udbredelsen af psy-kofarmaka er kultur- og tidsbestemt.

Særligt i de seneste årtier har manset en meget stor udskiftning af detregistrerede sortiment af psykofar-makapræparater.

Mange af de lægemidler, somhar været anvendt til behandling afdepression, angst og søvnløshed, erblevet markedsført som værende“uden risiko for afhængighed”. Mensenere har man så opdaget, at virke-ligheden var anderledes. Reglen harværet, at et nyt lægemiddel herefterhar overtaget markedet.

Afhængighed, vanedannelse,overforbrug, misbrug... et stort vo-kabularium betegner de uønskedevirkninger ved behandling med ner-vemedicin og sovemedicin, menbegreberne er ikke veldefinerede.For tiden anbefaler WHO primært atbruge betegnelsen "afhængighed" irelation til psykofarmaka. Men ogsåher skifter definitionerne ved hverny udgave af de diagnostiske kriteri-er.

Mange brugere udtrykker imid-lertid afhængigheden ganske enkeltpå følgende måde: “Jeg er ikke istand til at kontrollere pillerne – pil-lerne kontrollerer mit liv.”

Ingen viden om problemets omfangNår afhængighed er vanskeligt atdefinere, er det selvfølgelig ogsåvanskeligt at måle. Vi må derforogså konstatere, at der hverken iDanmark eller udlandet findespræcise og pålidelige data omomfanget af afhængighed og mis-brug af psykofarmaka. En direkteopgørelse vil bestå i en undersøgelseaf hvor mange, der falder ind underdefinitionen "afhængige". Men diag-

nosen kan ikke stilles ved almindeli-ge kliniske undersøgelser eller if.eks. telefoninterviews, og man kanderfor højst tilnærme sig problemetsomfang igennem indikatorer ogindirekte mål.

Såfremt kun ét mål skal vælgessom indikator, må det blive varighedaf kontinuert brug. Vi må regnemed, at dagligt forbrug af nerveme-dicin af typen benzodiazepiner udover et år med stor sandsynlighed vilføre til afhængighed som kan giveabstinenssymptomer ved ophør. Detsamlede antal modtagere af ordina-tioner på benzodiazepiner i Dan-mark var i 1995 et sted mellem350.000 og 600.000. Hvor mange afdisse, der er langtidsbrugere, videsendnu ikke.

Samfundsøkonomiske omkostningerCost-of-Illness er den metode, manoftest har anvendt til at beregne desamfundsøkonomiske konsekvenseraf misbrug. Metoden består i atopregne samtlige tænkelige omkost-ninger og ressourceforbrug ved engiven tilstand. Hver komponent til-regnes en værdi, og totalen forven-tes så at repræsentere den samledebyrde for samfundet.

Direkte omkostninger ved medicinafhængighed

Fordeling af årlige udgifter på aktører:

Afhængigheds- Aftrapnings-tiden tiden

Patient 14.033 40.155Arbejdsgiver 180.630 182.502Sygesikring 43.495 95.462Sygehus og specialistbehandling 120.272 216.500Kommune – 36.000

I alt 358.430 516.619

Peters erfaringer – en caseDa Peter arbejdede på skifteholdog samtidigt byggede sit eget hus,fik han problemer med maven ogfølte sig ofte stresset. Han gik tilbedriftslægen, som ordineredeLibrium. Han skulle tage medici-nen efter behov.

“Jeg opdagede hurtigt, at jegikke kunne undvære pillerne. Devar altid med i lommen. Noglegange blev det tre om dagen,nogle gange blev det seks tablet-ter”.

Sådan gik det i ti år. Peter vid-ste, at han var afhængig af tablet-terne, men han talte ikke medandre om det. Hjertet slog ure-gelmæssigt og hurtigt. Da hanopsøgte en hjertespecialist, fortal-te lægen, at han var nødt til athave en hjerteklapoperation.Lægen skrev en recept på oxaze-pam. Peter tog for givet, at detvar hjertemedicin.

“Nu tog jeg tre typer benzodi-azepiner samt tabletter mod surmave. Jeg syntes fra starten, atoxazepam virkede fantastisk godt.Men snart begyndte jeg at mærkeuro, når medicinen ikke længerevar i kroppen. Der måtte værenoget galt".

Peter ville holde op med detsamme. Men da han stod i kø tilen hjerteoperation, fortsatte han.I 14 måneder ventede han på at

blive opereret. Dagen efter operati-onen sluttede han helt med denberoligende medicin.

“Men jeg blev forbandetdårlig. Jeg kunne af og til slet ikkestå på fødderne. Når jeg lå i sen-gen, troede jeg, at loft og væggeville falde ned. Jeg var bange for atgå ud. I butikker vovede jeg migslet ikke”.

Peter tog kontakt med en pa-tientorganisation, som sendtenoget materiale om, hvordan mantrapper benzodiazepiner ned oghvilke abstinenser, man kan få.

“Det materiale reddede mit liv.Men efter et halvt års nedtrapningblev jeg endnu dårligere og måtteindlægges på en medicinsk afde-ling. Jeg var voldsomt forgiftet. Detskreg i kroppen. Jeg mærkede etstærkt sug efter tabletterne. Jegmåtte være forfærdelig forsigtig ogkun fjerne en kvart tablet omugen”.

Peter var på hospitalet i seksuger, hvor sygeplejerskerne tålmo-digt hjalp ham.

“Jeg manglede selvtillid. Jegtroede ikke, benene kunne bæremig. Men fysioterapeuterne varstædige. Bid for bid trænede demed mig, jeg fik selvfølelsen tilbageog klarede til sidst at gå rundt”.

To år efter hjerteoperation ognedtrapning begyndte Peter påhalvtidsarbejde.

Beretningen er fra “Till priset av vad”, KILEN, 1996

Ingen ved i dag, hvor mange danskere, der er

afhængige af nervemedicin og sovemedicin.

* Private omkostninger; herunderudgifter til den afhængigheds-skabende medicin, behandlingaf bivirkninger og behandling afpatienter, som ønsker at holdeop. Desuden konsekvenser somensomhed, depression, selv-mordstanker og mistet selv-værdsfølelse.

* Indirekte omkostninger; herun-der omkostninger for samfundetpga. mistet produktion.

Der er store vanskeligheder med atindhente den nødvendige informati-on, og beregning af de samfunds-mæssige omkostninger af afhængig-hed af psykofarmaka er således ikkemulig i dag. Men det vil være nyttigtat kortlægge de direkte udgifter forat give et skønsmæssigt indtryk af,hvilke ressourcer afhængighedenkoster samfundet. En sådan bereg-ning kan ses som et skridt på vejentil at gøre noget ved problemet.

Brugere afnerve/sovemedicin

Vedvarendebrugere

Afhængige

Behandlet forafhængighed

Befolkning

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.10 Side 36

Fig. 2a

Fig. 2b

Fig. 1

39L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Lic.pharm Bent Halling-

Sørensen er adjunkt ved

Institut for Analytisk og

Farmaceutisk Kemi.

Stud.scient Henrik Rasmus

Andersen er specialestuderende

ved Institut for Analytisk og

Farmaceutisk Kemi.

Ph.d. Søren Nors Nielsen er

ekstern lektor ved Institut for

Analytisk og Farmaceutisk

Kemi.

Dr.scient. Sven Erik Jørgensen

er docent ved Institut for

Analytisk og Farmaceutisk

Kemi.

Dr.pharm. Steen Honoré

Hansen er professor ved

Institut for Analytisk og

Farmaceutisk Kemi.

skibstrafik er konstateret pseud-ohermafrodisme hos snegleartenNucella lima, idet der er en nøjesammenhæng imellem tinind-holdet og graden af pseudo-hermafrodisme. TBT er sværtopløseligt, og har hormonvirk-ning ved meget lave koncentra-tioner.

Mangel på test på levende dyrI dag er der kun udviklet meget fåscreeningstests, der kan detekteremiljøfremmede stoffers hormonlig-nende effekt. Dertil kommer, at defleste af disse tests er baseret på cel-lekulturer og ikke på levende orga-nismer.

Der findes kun én test på dyr,nemlig på regnbueørred. Her måleset øget niveau af fiskeproteinetvitellogenin, som produceres i leve-ren ved østrogen stimulering. Prote-inet føres med blodet til æggestok-kene, hvor det optages i de voksen-de æg. Både hanfisk og hunfisk hargenetisk anlæg for dannelse af vitel-logenin. Da hannen dels ikke harnævneværdig østrogenproduktion,dels ikke kan fjerne vitellogenin frablodet på grund af manglendeæggestokke, kan et vitellogenin ind-hold i hanfisk tages som udtryk foren udefra kommende østrogenpåvirkning.

Ny test på krebsdyr Miljøkemigruppen på DFH er sam-men med forskere på Danmarks Tek-niske Universitet (DTU) i gang medat udvikle en økotoksikologisk scree-ningstest på zooplankton krebsdyretAcartia tonsa (projektet er financie-ret af det strategiske miljøforsk-ningsprogram), der er almindeligtforekommende i indre danskefarvande. Testen måler virkningen aføstrogenlignende stoffer på krebs-dyrets reproduktion. Der er brug forscreeningsmetoder, der kan udføreshurtigt. Acartia tonsa er her interes-sant på grund af en kort livscykluspå ca. tre uger.

Krebsdyrets kønnede formeringstyres af en kompliceret hormonalstimulation. Derfor arbejder vi meden meget simplificeret hypotese;nemlig at det er muligt at påvirkereproduktionen ved at tilføre natur-ligt østrogen eller stoffer med hor-monlignende egenskaber. Dennepåvirkning kan resultere i måleligefaktorer såsom stimulering til tidli-gere modenhed til at lægge æg,øget ægproduktion, faldende larve-udvikling eller ændring af livsstadie-tiden.

Ved 20 grader Celsius begynderkrebsdyret normalt at lægge æg på

den niende dag efter dets fødsel.Her lægges meget få æg, men antal-let forøges på tiende og elvte dag,for så igen at klinge af. Når krebsdy-rene stimuleres med østrogen ivækstmediet, bliver de tidligerekønsmodne og lægger hurtigere enstørre del af æggene. På niende ogtiende dag af deres livscyklus har delagt henholdsvis dobbelt så mangeog tre gange så mange æg sammen-lignet med ubehandlede krebsdyr.

Vi har udført et tilsvarende for-søg med Bisphenol-A. Det ses ogsåher, at krebsdyrene stimuleres tilhurtigere at lægge en større del afden samlede æglægning på denførste dag i æglægningsperioden.På niende og tiende dagen af dereslivscyklus er henholdsvis tre gangeog 40 procent flere æg lagt i forholdtil ubehandlede dyr.

Forsøgene med Bisphenol-A erudført af studerende Franziska Kra-mer og Karin Høgsbro Pedersenunder projektarbejde ved miljøke-migruppen på DFH. De anvendte tokoncentrationer af stoffet. Den lave-ste koncentration på 50 µg/l er abso-lut miljørelevant, da der er målt op

til 9 µg/l bisphenol A i forurenedejapanske floder.

Screeningstests, der kan identifi-cere stoffer med en hormonlignendeeffekt, bør udvikles også for dyr påandre udviklingstrin end krebsdyr, såman i reguleringsøjemed og til vur-dering af nye stoffer har en vifte aftestmetoder, der kan identificeredenne uheldige sideeffekt. Det vilgøre det muligt at udfase eksisteren-de stoffer og undgå, at nye stoffermed en østrogen virkning ekspone-res til miljøet.

38

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Økotoksikologisketests påviser

hormoneffekterForurening med kemiske stoffermed hormonlignende effektermistænkes for at være skyld i fal-dende sædkvalitet hos mænd.Desuden skader stofferne enrække dyr. Nye økotoksikologi-ske tests kan identificere kemika-lier, som har hormonlignendevirkninger på levende organis-mer.

Af Bent Halling-Sørensen, Henrik Rasmus Andersen, Søren Nors Nielsen, Sven Erik Jørgensen og Steen Honoré Hansen

Kemiske stoffer, der virker somhormoner – især som det kvindeligekønshormon østrogen – er udbredt imiljøet og findes også i forskelligefødevarer. Stofferne kan skadereproduktionen hos en rækkedyrearter, og kemikalierne mistæn-kes ligeledes for at være skadeligefor mennesker.

Mistanken skyldes især, at dergennem de seneste halvtreds år ersket en generel nedsættelse afmænds fertilitet på grund af et mar-kant fald i antallet af sædceller. Etandet foruroligende tegn er, at hyp-pigheden af testikelkræft er øget.Samtidig rammes flere og flere dren-ge af mangelfuld nedsynkning aftestiklerne til pungen eller mangel-fuldt anlæg af kønsorganerne.

Forskere verden over har derforsat fokus på, om der er en sammen-hæng mellem disse effekter ogudsendelsen af en række kemiskestoffer til miljøet. Man har herpåvist, at disse stoffer kan efterlignehormoners biologiske aktivitet, spe-cielt virkningerne af det kvindeligekønshormon østrogen.

I dag er der identificeret 25-30naturlige og syntetiske stoffer medøstrogenlignende virkning. Velkend-te eksempler er insektgiften DDT ogPCB, der tidligere har været anvendti plast. Derudover gælder det enkel-te insektgifte, ukrudtsmidler, for-brændingsprodukter, blødgørere fra

plastindustrien og nedbrydningspro-dukter fra grænsefladeaktive stofferi rensemidler. Alle disse kemikalierhar vist sig at have en bemærkelses-værdig dårlig nedbrydelighed samten stor evne til at kunne ophobes ivores fødekæder.

Ingen af stofferne ligner ikemisk struktur hormoner, hvorforman for øjeblikket ikke kan forudsi-ge, hvorvidt et stof har en hormon-lignende effekt ved analyser af detsstruktur. Derfor er der i høj gradbrug for økotoksikologiske tests,som kan vise, hvordan stoffernepåvirker levende organismer.

Mange stoffer med hormonvirkning De vigtigste grupper af stoffer medhormonlignende virkninger er:* Alkylphenol polyethoxylater

(APEs), der anvendes som græn-sefladeaktive stoffer i rensemid-ler, i maling, som olieadditiver,samt som antioxidanter i plast-varer. Den globale produktion erpå ca. 360.000 tons årligt, og iDanmark forbruges der ca. 2400tons årligt. Stoffernes er vand-opløselige og ret akkumulerba-re. I spildevandsslam nedbrydespolyethoxylatkæden bakterieltunder iltholdige forhold til alkyl-phenoler eller alkylphenol car-boxylsyre. Ved en videre stabili-sering af slammet sker der enyderligere anaerob nedbrydningaf stofferne til diverse alkylphe-

noler. Alle disse nedbrydnings-produkter bioakkumuleres let islammet samt i fødekæderne ogmistænkes for at udvise den hor-monlignende effekt.

* Bisphenol-A (BPA) anvendes iproduktionen af polykarbonat-resiner, der bruges i plastpro-dukter. BPA´s virkningsmekanis-me beror på, at det kan fjernenaturligt østrogen fra detsreceptorer på cellerne. BPA vir-ker østrogent ned til meget lavekoncentrationer.

* Pthalater anvendes primært somblødgørende midler ved frem-stillingen af plast, især PVC.Pthalater kan frigives til omgi-velserne ved for eksempel atvandre fra plastembalage tilfede fødevarer som ost, mælke-produkter og kød. I Norge erpthalatet DEHP påvist i råmælk,skummetmælk og fløde. Detdaglige humane indtag afpthalater anslås til at ligge på10-30 mg. Ved spildevandsbe-handling fjernes hovedparten afpthalaterne fra vandet. Ikkedesto mindre er der i USA fun-det phatalater i vandmiljøet.

* Tributyltin (TBT) bruges somsvampedræber i træbeskyttelseog har indtil fornyligt væretanvendt i stor målestok i skibs-maling for at hæmme vækstenaf alger og orme på skibssider.Stoffets udbredelse har betydet,at der i områder med kraftig

Krebsdyret Acatia tonsas

reproduktion påvirkes af

østrogen samt af mil-

jøfremmede kemikalier

med hormonlignende

effekter. Krebsdyret er

derfor velegnet til øko-

toksikologiske tests.

Når krebsdyret Acatia tonsa udsættes for østrogen i vækstmediet i koncentrationen 23 µg/l, stimuleres

det til hurtigere at lægge en større del af dets samlede æglægning (a). På 9. og 10. dagen af deres liv-

scyklus er henholdsvis dobbelt så mange og tre gange så mange æg som normalt.

Det samme billede ses for Bisphenol-A (b), et miljøfremmed stof, som mistænkes for at virke som østro-

gen. Ved en koncentrationen på 50 µg/l Bisphenol-A er der på 9. og 10. dagen af krebsdyrets livscyk-

lus henholdsvis ca. tre gange og 40 % flere æg end normalt. For koncentrationen 500 µg/l ses stimu-

leringen ikke så markant, formodenligt fordi der nu begynder at indtræffe andre giftvirkninger end

de reproduktionstoksiske.

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.11 Side 38

Fig. 2

Fig. 1

41L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g

Cand.pharm Carsten Boye

Knudsen er ph.d.-studerende

ved Institut for Analytisk og

Farmaceutisk Kemi.

Cand.pharm., ph.d. Inga

Bjørnsdottir er forsknings-

adjunkt ved Institut for

Analytisk og Farmaceutisk

Kemi.

Lic.pharm. Ole Jøns er lektor

ved Institut for Analytisk og

Farmaceutisk Kemi.

Dr.pharm. Steen Honoré

Hansen er professor ved

Institut for Analytisk og

Farmaceutisk Kemi.

Kapillarelektroforese har indenfor de seneste år opnået stor anven-delse til separation af molekylermed forskellige masse-ladnings for-hold. Separationen foregår i et tyndtsilica kapillar med en indre diameterpå mellem 50 og 150 µm. Kapillareter et rør, som fyldes med en væske.Der pålægges en spænding overkapillaret, hvorefter molekylernebevæger sig gennem kapillaret meden hastighed, der afhænger af deresstørrelse og ladning.

Normalt detekteres molekylerneved hjælp af deres evne til at absor-bere ultraviolet lys, og mængderneaf de forskellige molekyler udskrivessom toppe som funktion af den tid,det tager molekylerne at vandregennem kapillaret. Da mange mole-kyler absorberer ultraviolet lys, ermetoden imidlertid ret uspecifik oggiver derfor ringe informationer omindholdet og renheden af de detek-terede toppe, som i dette tilfælderepræsenterer metallothioneins for-skellige isoformer.

Ved yderligere at anvende etmassespektrometer som detektor erdet muligt at få flere informationerom den analyserede prøve. Masse-spektrometrien giver oplysninger ommolekylvægt og strukturelle egen-skaber samt om renheden af de for-skellige isoformer i toppene.

Før molekylerne i en prøve kananalyseres ved massespektrometri,skal de gøres elektrisk ladede. Mole-kylerne bringes på ionform ved atforstøve væsken i kapillaret, indenintroduktion i massespektrometeret.Forstøvningen opstår ved, at derudenom kapillaret er placeret ennål, som er pålagt en spænding. Derelativt store dråber, der dannes, nårvæsken sprøjtes ud af kapillarenden,får overført ladninger fra den pålag-te spænding på nålen. En strøm afnitrogen omkring kapillarenden ognålen øger fordampning af væskefra dråberne, som så formindskes istørrelse.

Ladningstætheden på overfla-den af dråberne forøges, hvilketbetyder, at dråberne spaltes op iendnu mindre dråber som følge afelektrostatisk frastødning. Denneprocess fortsætter indtil hver dråbebestår af et enkelt molekyle med eneller flere ladninger. Denne forstøv-nings teknik mindsker desuden dan-nelse af associerede molekyler, hvil-ket er væsentligt, da molekylerneanalyseres efter deres masse-lad-nings forhold og en association villegive anledning til fejlagtige resulta-ter.

Efter forstøvningen ledes deladede molekyler videre ind i masse-spektrometeret. Her sendes ionernegennem et magnetfelt, hvor deresbaner afbøjes. Graden af afbøjnin-gen afhænger af ionernes masse ogladning, hvorved metallothioneinsforskellige isoformer kan separeres.

Metallothionein i fostertilstandenI et samarbejde med partnere frathe Rowett Research Institute i Skot-land har vi tidligere undersøgt sam-mensætningen af metallothioneinshovedisoformer i fostre fra får vedhjælp af kapillarelektroforese ogdetektion af ultraviolet lys.

Vi fandt her, at koncentrationenaf den totale mængde metallo-thionein falder med tiden hen modfødslen, samt at forholdet mellemhovedisoformerne varierer gennemgraviditeten. Metallothioneins funk-tion som stressprotein er i dettetilfælde tvivlsom. Forklaringen skalsandsynligvis findes i, at fosterceller-ne mindsker deres omsætning afzink og kobber hen mod slutningenaf graviditeten.

Når man alene anvender ultra-violet lys til detektion, er det ikkemuligt at belyse undergruppesam-mensætningen af hovedisoformer-ne. Det har vi imidlertid opnået vedat supplere med massespektrometri.Sidstnævnte metode har også væretanvendt til strukturopklaring af tomodificerede former for gær-metal-lothionein samt undersøgelse afmetallothionein isoformer fra kani-ner.

Kombinationen af kapillarelek-troforese og massespektrometri erderfor et vigtigt værktøj til opnåelseaf en bedre viden om metallothione-in isoformernes funktion inden foret bredt spektrum af arter.

40

Læ

ge

mi

dd

el

fo

rs

kn

in

g

Protein bindergiftige og livsvigtige

metallerMetallothioneiner er naturligtforekommende proteiner, sombinder metaller i kroppen. Demenes at beskytte celler mod gif-tige metaller som kadmium, sølvog kviksølv, og de indgår i cellenszink- og kobberstofskifte. Nyestudier skal afklare proteinernesspecifikke biologiske funktioner.

Af Carsten Boye Knudsen, Inga Bjørnsdottir, Ole Jøns og Steen Honoré Hansen.

Metallothioneiner er engruppe proteiner, som er megeteffektive til at binde en rækkemetaller som zink, kobber, kadmi-um, sølv og kviksølv. Det første afproteinerne blev oprenset fra heste-nyre i 1957 og siden er der fundetmetallothionein i lever, blod, fedt-væv og hjerne fra andre pattedyr, ifisk, insekter, bløddyr og mikroorga-nismer.

Proteinet overproduceres vedflere former for fysisk og kemiskstress, hvilket har gjort det svært atopklare den specifikke biologiske

funktion. Da proteinet overproduce-res ved tilstedeværelsen af giftigemetaller, er det muligt, at metallo-thionein har en rolle i beskyttelse afcellerne mod cadmium, sølv og kvik-sølv.

Dette er dog en yderst kontro-versiel hypotese, fordi proteinet fin-des i et væld af dyrearter, hvilkettyder på, at det har eksisteret langttilbage i evolutionen, mens den sto-re påvirkning af giftige metallerførst for alvor har taget fart eftersamfundets industrielle udvikling.Flere forskere mener derfor, atmetallothioneins grundlæggendefunktion har forbindelse med celler-nes omsætning af de livsvigtigespormetaller zink og kobber, somproteinet binder i sin naturligt fore-kommende form.

De biologiske funktionerEn faktor, som har gjort det vanske-ligt at opklare proteinets biologiskefunktioner, er eksistensen af isofor-mer. Isoformer er proteiner fra sam-me gruppe, men med små forskelle isammensætningen af de aminosyrer,som proteinerne er opbygget af.

Der er til dato blevet fundet firehovedisoformer af metallothionein,som klassificeres som MT-1 til MT-4.

Yderligere er der fundet undergrup-per i to af hovedisoformerne, somklassificeres med bogstaver, f.eks.MT-1a og MT-1b.

MT-1 og MT-2 findes hovedsag-lig i leveren og nyrerne, hvor protei-nerne sandsynligvis indgår somzinkleverandør i produktionen afzinkholdige enzymer, og man menerogså, at de fungerer som antioxi-danter ved øget eksponering over-for frie radikaler, UV-stråling og oxy-gen. De endelige beviser manglerdog fortsat.

MT-3 er fundet i hjernen, hvorproteinet har en hæmmende effektpå væksten af nerveceller. Diverge-rende opfattelser af MT-3’s indvirk-ning på Alzheimers sygdom er rap-porteret i litteraturen.

MT-4 findes specifikt i hudceller.Man ved her, at zinkmangel giverhudforandringer samt dårlig sårhe-ling, men der er til dato ikke påvistnogen sammenhæng mellem MT-4,zink og hudopbyggende processer.

Separation af proteinerneEt vigtigt led i opklaringen af metal-lothioneins biologiske funktioner erudviklingen af analysemetoder medstor følsomhed samt mulighed for atdetektere de forskellige isoformer.

Figuren viser resultatet af en kombineret kapil-

larelektroforese og massespektrometri under-

søgelse af en leverprøve fra et 90 dage gammelt

fårefoster. Nederst ses et UV-spor af prøven,

hvor de to hovedtoppe stammer fra henholdsvis

MT-1 og MT-2. Øverst ses de respektive masse-

spektre, hvor MT detekteres som multiladede

ioner (z = 5+, 6+, 7+ og 8+). Af spektrene ses

det, at den første top i UV-sporet indeholder to

MT-1 isoformer, henholdsvis MT-1a og MT-1c.

Derimod ses, at UV toppen fra MT-2 kun inde-

holder en MT-2 isoform (MT-2a).

Opsætning af CE-MS udstyret. Til venstre ses kapillarelektroforesen og til højre massespektrometeret.

DF972914 - Indhold 97.12.09 10.11 Side 40