diagnostic methods in virology - masarykova univerzita · diagnostic methods in virology rndr. lud...
TRANSCRIPT
Diagnostic Methods in Virology
RNDr. Luděk Eyer, Ph.D.Veterinary Research Institute, Brno
Department of VirologyEmerging Viral Diseases
Why? • Identify virus/clusters
• Virus subtyping• Chain transmission
• Identification of drug-resistant mutants• Strain evolution
• Detect emerging pathogens
more effective therapy
Klasické metody pro diagnostiku virů
Culture methods in virologyCytopathic effect examination
Mock-infected cells: (no CPE) Tick borne encephalitis virus infected cells: (strong CPE)
Cell lines for TBE: porcine kidney cells (PS), human neuroblastoma cells (UKF-NB-4 )
TBEV-induced cytopathic effect quantification
(Eyer et al. 2015)
Histopathological changes
(Růžek et al., 2010)
1 4 5 8
Non-infected
TBEV infected, non-treated
TBEV infected, treated with 7-deaza-2´-CMA (50 mg/kg)
Days post infection Monitoring the course of infection using in vivo imaging system
Plaque titration assay
Immunofluorescence staining
TBEV protein E
rabbit anti-TBEV protein E antibody (primary ab)
goat anti-rabbit antibody (secondary ab)
Fluorophore
cell structures
Fluorescence/confocal microscopy
Immunofluorescence staining of TBEV-infected PS cells
Immunofluorescence staining: antiviral activity testingTick-borne ecephalitis virus
no antivirals
7-deaza-2´-C-methyladenosine(Eyer et al., 2015)
Immunofluorescence staining: antiviral activity testingZika virus
Elektronová mikroskopie
Transmisní elektronový mikroskopNepohyblivý svazek elektronů, detekují se elektrony prošlé vzorkem, vhodnépro velmi malé objekty (viry, bakterie) případně se mikroskopují řezy (např. z buněk), velkými objekty elektrony neprojdou.-větší vzorky (buňky) se před prohlížením musí fixovat, odvodnit, zalít do pryskyřice a nařezat na ultramikrotonu-malé vzorky (hlavně viry) se přichytí na síťku a negativně barví (viz. protokol a ukázkové fotografie virů)
Rastrovací elektronový mikroskop Pohyblivý svazek elektronů, detekují se odražené sekundární elektrony (tedy používá se pro zobrazení povrchu vzorku)-vzorky se musí před mikroskopováním fixovat, odvodnit a vysušit
Morfologické studie virových částic
herpes simplex poxvirus paramyxovirus
adenovirus coronavirus rotavirus
Fotografie virových částic (transmisní EM, negativní barvení)
Molekulárně-biologickémetody pro diagnostiku virů
Molekulárně-biologické metody pro diagnostiku virů
znalost sekvence molekulární otisk (pattern, fingerprint)
Molekulární techniky bez amplifikace DNA/RNA
Molekulárně-biologické techniky nevyžadujícípředchozí amplifikaci pomocí PCR
•pulsní gelová elektroforéza•hybridizační techniky
•restrikční analýza
Hybridizace in situsondy značené fluorescenční protilátkou, nebo sondy tvořeny fluorescenčně
značenými nukleotidy – fluorescenční hybridizace in situ (FISH).
Multiplex detection in Huh-7 cells using the RNA FISH assay. Multiplex fluorescence RNA in situ detection of HCV viral genomic RNA (green) and 18S RNA (red) in Huh-7 cells lacking (-HCV) or containing (+HCV) an HCV replicon (Ikeda et al., 2002, J. Virol., 76: 2997-3006). In both panels, nuclei are stained with DAPI (blue).
HIV-1 is expressed in HeLa and collected at different time points. Viral RNA expression is tracked in green while the cellular protein, hnRNP A1, is stained in red. Size bars are 10 µm.
Detection of H1N1 Influenza A RNA migration in MEF cells using RNA fluorescence in situ hybridization. Murine embryonic fibroblasts (MEFs) were incubated on ice with influenza A virus (H1N1, PR8 strain). The cells were fixed and processed with the probe set against the nucleoprotein (NP) viral genomic segment (green). DNA is stained blue with DAPI.
DNA-microarrays
• Labeled PCR product is hybridized to the probes, and hybridization signals are mapped to sevral positions within the array.
• Sequencing by hybridization
• Confocal microscopy is used to can the chip.
• First application: rapid sequencing to detect HIV mutations associated with drug resistance.
Techniky založené na amplifikaci signálu•bDNA assays•hybrid capture assays
Techniky založené na amplifikaci cílovésekvence•PCR techniky•amplifikační metody založené na transkripci•amplifikace vytěsňováním řetězce
Techniky založené na amplifikaci sondy•cleavase-invander technology•ligázová řetězová reakce•technologie cyklující sondy
Molekulární techniky založené na amplifikaci
Metody založené na polymerázové řetězové reakci (PCR)
Tick-borne encephalitis diagnosis
ELISA, FIA, neutraliz. tests
Fatal cases: el. microscopy / RT-PCR from brain and other organs
Zpětná PCR (RT-PCR)• metoda určená k amplifikaci molekul RNA• RNA – cDNA – DNA• retrovirové zpětné traskriptázy: M-MuLV, AMV
(termolabilita, enzym ztrácí funkčnost nad 42°C)
• termostabilní Tth DNA-polymeráza, za přítomnosti Mn2+ se vyznačuje RNA-dependentní DNA-polymerázovou aktivitou
• pro zahájení RT-PCR se využívá jako jeden z primerů oligo(dT)-primer rozeznávající poly(A)-konce mRNA nebo náhodné hexanukleotidy v případě, že mRNA není polyadenylovaná
• možnost využití taktéž sekvenčně specifických primerů
Revese transcriptase-PCR methods for tick-borne encephalitis diagnostics
• 252-bp long portion of highly conserved NS5 region of TBEV genome
• AMV reverse transcriptase
PCR-method for early differential diagnosis of tick-borne encephalitis
(Saksida et al., 2005)
Mnohonásobná („MULTIPLEX“) PCR• do reakční směsi je přidáno několik párů primerů
rozpoznývajících několik rozdílných cílových sekvencí, což umožňuje detekci několika genů současně v jednéreakční směsi
• výhoda: nižší cenové náklady než při samostatných amplifikacích a proto se používá pro vyhledávání změn na dlouhých úsecích DNA, testování vzájemněnesouvisejících oblastí na DNA a zejména pro amplifikaci vnitřních kontrol současně se vzorky.
Multiplex RT-PCR for subtyping of tick-borne encephalitis virus isolates
Unique conmbination of oligonucleotide primers hybridizing with subtype-specific signature positions of the sequence encoding viral E protein. (Růžek et al., 2007)
Multiplex RT-PCR for subtyping of tick-borne encephalitis virus isolates
Subtyping of TBEV strains using the multiplex RT-PCR. Members of separate subtypes were analyzed individually (a) and in all possible combinations (b).
(Růžek et al., 2007)
Diagnosis of TBEV in ticks
virus RNA isolationQIAamp RNA kit
(Qiagen)
tick samples
tick homogenisation
PCR amplification of sequence encoding E protein
identification of TBEV positive samples
(Růžek et al., 2007)
Real time PCR/Kvantitatvní real time PCR
• amplifikace a detekce probíhají simultánně• kvantifikace amplikonu v reálném čase se provádí
prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve specálním zařízení, které kromě cyklického střídání teplot umožňuje detekci fluorescence a monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat produkty PCR elektroforeticky
• pro kvantitativní detekci produktu v průběhu PCR existují tři obecné metody založené na použití:
1. interkalačního barviva vázajícího se na DNA2. fluorescenčně značených sond vázající se na střední část
amplifikovaného produktu3. fluorescenčně značených primerů
Quantitative real-time RT-PCR for the laboratory detection of tick-borne encephalitis virus RNA
• targeting the 3´-noncoding region of the TBEV genome • highly sensitive and specific method to quantify of even low viral loeads in serum/CSF/tick
homogenate samples.
(Schwaiger and Cassinotti, 2003)
(DeBiasi and Tyler, 2004)
Miniature RT–PCR system for diagnosis of RNA-
based viruses
Molecular diagnosis of TBE: future perspectives
(Liao, 2005)
Asymetrická PCR• technika pro přípravu PCR produktů pro sekvencování (Sangerova metoda vyžadující
ssDNA)• při asymetrické PCR jsou preferenčně tvořeny ssDNA• výchozí koncentrace primerů: jeden z primerů je ve 100x vyšší koncentraci než druhý
primer. Dvouřetězcové formy se tvoří až do okamžiku, kdy se jeden z primerů vyčerpá. Druhý primer pak dále syntetizuje pouze jeden z řetězců
• asymetrická PCR může být prováděna rovněž pouze s jedním primerem, zejména pro účely automatického sekvencování
Imunologické metody pro diagnostiku virů
Imunologické metody• Založeny na interakci protilátka-antigen
• Polyklonální protilátky-imunizace zvířat• Monoklonální protilátky-hybridomová technologie
• Rekombinantní protilátky-mol.biol.techniky• Nanoprotilátky-velbloudovití, paryby
Antigen Antigen
Protilátka
• Klasické imunologické metody (aglutinační techniky, imunodifuzní
techniky, imunoelektroforetické metody) • Imunoanalytické metody (immunoassays)• Rychlé imunologické metody (lateral flow
immunoassays, dipstick techniky)• Biosenzorové technologie
Imunologické metody
Klasické imunologické techniky
• Precipitační metody• Aglutinační metody• Komplement-fixační reakce• Imunodifuzní metody• Imunoelektroforetické metody• Neutralizační testy
Klasické imunologické techniky
+
HEMAGLUTINACE
Aglutinační testy
Komerčně dostupné latexové aglutinační testy pro detekci Shiga toxin produkující E. coli
• Dryspot E. coli Seroscreen (Meridian BioScience, Inc., Cincinnati, OH)detekce non-O157 E. coli
• VTEC-RPLA (Oxoid Ltd. Hampshire, UK)detekce non-O157 E. coli
• VTEC-RPLA SEIKEN (Denka Seiken Co., Ltd., Tokyo, Japonsko)detekce non-O157 E. coli
Virus neutralizační testSérologická metoda, při které se detekují protilátky z vyšetřovaného séra jedince proti virům. Je tedy určena k diagnostice některých virových nemocí člověka a zvířat. Test je založen na principu vazby specifických protilátek proti viru a následné inhibici cytopatického efektu.
Imunonalytické metody
Imunoanalytické metody
•Radioizotopové metody
•Imunoenzymové metody
•Fluorescenční metody
•Chemiluminiscenční metody
•Alternativní metody
Imunoanalytické metody
Homogenní x heterogenní
Kompetitivní x nekompetitivní
Antigen
Signálanalyt
tracer
Imunoenzymovémetody (EIA)
protilátka nebo antigen značený enzymem
kolorimetrické stanovení (absorbance)
Enzymy používané v EIA
ELISAEnzyme linked immunosorbent assay
Přímá nekompetitivní ELISA
Antigen
Protilátka
Enzym
Substrát
Produkt Signál
Nepřímá nekompetitivní ELISA
Antigen
Protilátka
Protilátka značenáenzymem
Enzym
Substrát
Produkt Signál
Sandwich ELISA
Záchytnáprotilátka
Enzym
Antigen
Substrát
Produkt Signál
Protilátka značená
enzymem
Epitop 1
Epitop 2
Stanovení
•mikrobiální antigen = přítomnost mikroorganismu v daném prostředí (např. v krvi pacienta, ve vzorku potraviny, ve vzorku životního prostředí)•specifickou protilátku proti mikroorganismu v klinických vzorcích
Standardní k řivka pro nekompetitivní ELISA
Signál je přímo úměrný koncentraci analytu
ELISA-based (serological) methods for tick-borne encephalitis diagnostics
TBEV protein E
IgM / IgG from serum or CSF
Secondary anti-IgM or anti-IgG antibody
Enzyme
Substrate
Product Signal
Commercial IgG/IgM-ELISA kits for the detection of anti-TBEV antibodies
(Niedrig, 2000)
Virological interpretations of serological test results in case of a clinically suspected TBE
Subviral particle-based ELISA• co-expression of recombinant prM/E protein
of TBEV in mammalian cells• realease of subviral particles (SPs) into the
culture medium• using the SPs as antigen for development of
TBE-specific ELISA • SP-IgG and SP-IgM ELISA systems• No cross-reactivity with antibodies against
other flaviviruses
Komerčně dostupné kity pro detekci filovirů
Technologie dipstick(Lateral flow immunoassay)
Technologie dipstick
kontrolní
testovacíkontrolní
RychlostNízké náklady
Vysoký počet vzorkůNekvalifikovaný personál
Polní a provozní podmínky
Nižší citlivost Preenrichment
Předběžné stanovení
Rychlé imunologické metody:
PanBio Dengue Duo IgM and IgG Rapid Strip Test (PanBio,
Brisbane, Australia)
Proteomické metody pro diagnostiku virů
Elektromigra ční metody
Elektromigrační metodySeparace nabitých látek ve stejnosměrném elektrickém poli
+
- +El. síla Fe Frikční síla Ff
= tření
mobilita: µ=v/E=Q/f [m-2V-1s-1]
ElektroforézaDělení nabitých částic na základě rozdílných mobilit
Volná Zónová
Stabilizující prost ředí
•rotace
•gradienty hustoty
•porézní médium
•kapilára
Separace probíhávoln ě v elektrolytu
Porézní média
chromatografický papír
agar, agaróza
acetát celulózy
škrob (hydrolyzovaný)
sypané (nalévané) vrstvy (Sephadex)
polyakrylamid
Polyakrylamid
kopolymer akrylamidu a N,N-bisakrylamidu
polymerace katalyzovaná TEMED
iniciátor persíran amonný
síťovaný gel
!!!! monomery jsou silné neurotoxiny !!!!
Denaturační polyakrylamidová gelováelekroforéza (SDS-PAGE)
polyakrylamidový gel + aniontový detergent (SDS, dodecylsulfát sodný)
na 1 g bílkoviny se váže 1,4 g SDS – uniformnínáboj bílkoviny na jednotku Mr
Denaturační polyakrylamidová gelováelekroforéza (SDS-PAGE)
Mr1
Mr2
Mr3
Mr1>Mr2>Mr3
Studium proteomu a identifikace strukturních proteinůpolyvalentního stafylokokového bakteriofága
Izoelektrická fokusaceElektroforéza v prostředígradientu pH. Látky se rozdělujípodle izoelektrických bodů (pI).
Proteiny se v elektrickémpoli pohybují podle náboje ažna místo, kde pH = pI.
Náboj má nulovou hodnotu a tamzůstávají stát.
IEF fokusace patří mezi metodys největší rozlišovací schopností.Gradient pH se tvoří pomocíamfolytů (komerčně dostupné)
Nosič - polyakrylamid
2-D SDS-PAGEstudium proteomu
vysoká rozlišovací schopnost
I. klasická isoelektrická fokusace
II. SDS-PAGE
detekce stříbrem
srovnání jednotlivých gelůdensitometry
+ -
+ -
pI
Mr
Proteinové profily polyvalentního stafylokokového bakteriofága získané pomocí 2-D SDS-PAGE
Western blotting
Blotting (přesávka)
Přenesení biomolekuly na membránu
Southern blotting – přenos DNA
Northern blotting – přenos RNA
Western blotting – přenos proteinu
gel
membránaprotein
Blotting (přesávka)
difuzní
kapilární
vakuový
elekroblotting
polosuchý (semidry blot)
kapkovací (dot blot)
ElektroblottingKapilární blotting
Kapkovací blottingPolosuchý blotting
Vakuový blotting
Membrány pro blotting
PVDF (polyvinyldendifluoridová) –hydrofobní interakce
nitrocelulosová – hydrofobní interakce
nylonová (+polymer) – elstat interakce
membrána s NH 2 skupinami –kovalentní reakce
Western blot EBOLA-specifických glykoproteinů (GP) izolovaných ze séra 8 osob s akutní infekcí EBOLA
Komerčně dostupnéwestern blot testy pro
detekci protilátek proti HIV
Proteinové mikro čipy (biočipy)
• Slibný experimentální přístup pro analýzu proteinů v budoucnosti
• Použití pro purifikaci proteinů, stanovení expresních profilů, meziproteinových interakcí
• Imobilizace protilátek, receptorů, ligandů, nukleových kyselin, uhlovodíků, látek s určitými biologickými vlastnostmi (kationty, anionty, látky s hydrofilním/fobním povrchem)
• Některé mají nízkou specifitu a vážou celé skupiny proteinů, jiné jsou vysoce specifické
• Kombinace s hmotnostní spektrometrií nebo biosenzory
• Stacionární vs. průtočné uspořádání
DNA chips
microfluidic
surface plasmon resonance
fluorescent probes
Schematické znázornění principu mikročipových/microarrayových technologií
Multi-analytové mikro čipy (arrays)detekce a identifikace mnoha antigenů
v jediném stanovení
Mikročip pro studium interakce virus-hostitel
Aplikace mikročipů pro studium vztahů virus-hostitel
Aplikace mikročipůpro detekci
biomarkerů infekce v séru pacienta
Mikročip pro detekci protilátek proti mnohočetným patogenům v lidském séru
Mikrofluidní (průtočné) mikročipy pro detekci
virů v klinických vzorcích
Hmotnostníspektrometrie
Hmotnostní spektrometrie• Hmotnostní spektrometrie je analytická metoda sloužící k
převedení molekul na ionty, rozlišení těchto iontů podle poměru hmotnosti a náboje (m/z) a následnému záznamu relativních intenzit jednotlivých iontů
• Hmotnostní spektrometr je iontově-optické zařízení, kterérozlišuje ionty podle poměru jejich m/z
• Výhody: vysoká citlivost, kvalitativní analýza (určení M.W. a dalších strukturních informací), kvantitativní analýza (odezva závislá na koncentraci), minimální spotřeba vzorku
• Nevýhody: destruktivní metoda, vysoké provozní náklady
Základní části hmotnostního spektrometru1. iontový zdroj – slouží k převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice (tzv.
ionizace), konstrukce se liší podle použité ionizační techniky2. hmotnostní analyzátor – slouží k rozdělení iontů v plynné fázi za vysokého vakua podle
jejich m/z3. detektor – slouží k detekci iontů po jejich rozdělení podle m/z a k určení relativní
intenzity (četnosti) jednotlivých iontůDalší důležité části přístroje:- vakuový systém- iontová optika sloužící k urychlení a fokusaci iontů- počítač na ovládání a ladění přístroje, sběr, ukládání a zpracování dat, porovnání spekter
s knihovnou
Hmotnostní spektrum bakterie Mycobacterium tuberculosis
Peptidové mapování s využitím hmotnostní spektrometrie pro studium proteomu stafylokokového bakteriofága
vzorek 2D-PAGE štěpenítrypsinem
MALDI TOF MS/MS
MS spektrumsrovnání s databázíidentifikace proteinu
přirazení k sekvenci DNA, identifikace ORF
Obr. 3. Lokalizace genů kódujících identifikované proteiny fága 812