diagnóstico citogenético genético de llc y mm - rticc.org · normal alterado cariotipos. un...
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Universidad de Navarraun
LLC: bajo índice mitótico escasez metafases
análisis cariotípico
convencional
35 - 45 %
Alteraciones cromosómicas
nuevas técnicas
FISH
GCH
75 - 80%
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Parámetro Bajo riesgo Alto riesgo
Biológicos
Citogenética Normal,13q-(única) 17p-,11q-
IgVH Mutado No mutado
CD38 ≤30% >30%
ZAP70 ≤20% >20%
β2-MG,LDH, sTK, sCD23 Normal Aumentado
Factores Pronósticos
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Factores Pronósticos
ANÁLISIS CITOGENÉTICO:FISH JERÁRQUICO
Categorías: 17p- > 11q- > trisomía12 > Normal > 13q-
Mal pronóstico Buen pronóstico
Döhner y col., NEJM, 2000Supervivencia en Meses
100
13q- single
36 72 108 144 1800
20
40
60
80
11q-+12
17p-
0
n=325
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ANÁLISIS MUTACIONAL DE LOS GENES IgVH
Pro-B
Pre-B
CENTRO GERMINAL
Célula pluripotencial linfoide
Célula B de memoria
Célula plasmática
•Hipermutación somática
•Cambio de clase
•Recombinación variable
Centroblasto Centrocito
Presentación del antígeno
progenitor
Célula B inmadura
Célula B madura
ApoptosisCs. en anergia
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ANÁLISIS MUTACIONAL DE LOS GENES IgVH
24 48 72 96 120 144 168 1920
25
50
75
100 mutadosn=132
no mutadosn=168
Supervivencia en Meses
Factor pronóstico independiente
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1. Establecer un protocolo de trabajo para el estudio genético de muestras de LLC al diagnóstico
• determinar el tipo de muestra óptimo para el cultivo
• desarrollar un ensayo multi-FISH
• optimizar la técnica de detección de mutaciones en los
genes IgVH
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3,0%
SP
50,0%
SP + TPA
23,5%
MO
32,5%
MO + TPA
NuloNormalAlterado
Cariotipos
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RP11-199F11 y RP11-241D13(TP53) (ATM)
CEP 12 DNA Probe Kit LSI D13S25
B.Ensayo Multi-FISH
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2. Amplificación genes IgVH
1. Obtención de cDNA
3. Purificación PCR
+
4.Secuenciación 5. Identificación del segmento reordenado y análisis
VH3
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast
98% de homología
C.Hipermutación somática
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NUEVA MUESTRA AL DIAGNÓSTICO
Muestra de SP recogida
sobre heparina
Muestra de SP recogida
sobre EDTA
EXTRACCIÓN DE PBLs
DETECCIÓN DE HIPERMUTACIÓN
SOMÁTICA GENES IgVH
CULTIVO DE SP
ESTIMULADO CON TPA
MULTI-FISH EN CÉLULAS FIJADAS
DEL CULTIVO ESTIMULADO
CARIOTIPO
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SONDAS UTILIZADAS:
p53 (17p13.1) (Sonda no comercial)
ATM (11q22.3) (Sonda no comercial)
CEP 12 (centrómero12) (Vysis)
LSI D13S25 (13q14.3) (Vysis)
RESULTADOS:
200 núcleos en interfase de muestra del paciente, para cada sonda,
del(17)(p13) negativo
del(11)(q22.3) 57% con deleción
trisomía 12 negativo
del(13)(q14) x2 44% deleción homocigótica
del(13)(q14) 46,5% deleción heterocigótica
INFORME FISH
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INFORME HIPERMUTACIÓN
TÉCNICA:
(Hamblin, et al Blood.1999; 94:1848-1854)
RESULTADO:
MONOCLONAL
Familia: 3
Segmento: 09
Porcentaje: 100% de homología
NO MUTADO
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INFORME HIPERMUTACIÓN
TÉCNICA:
(Hamblin, et al Blood.1999; 94:1848-1854)
RESULTADO:
MONOCLONAL
Familia: 4
Segmento: 04
Porcentaje: 90,63% de homología
MUTADO
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Diagnóstico genético del MM
(por el momento utilizamos cariotipo y/o FISH)
El diagnóstico con arraystodavía no es utilizado en la
rutina
El curso clínico está determinado por eventos genéticos de las células tumorales……….
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Conventional Chromosome Analysis in Multiple Myeloma
Normal karyotype70%
Department ofGenetics
University ofNavarra
Universitätsklinikum Kiel
Institut für Humangenetik
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Recommendations for FISH in multiple myelomaLondon on March 11th 2005
• It is recommended that all labs should test for deletion 13, t(11;14) and t(4;14) and include p53 deletion wherever possible.
• The use of the Abbott/Vysis 5, 9, 15 probe set is encouraged to detect hyperdiploidy.
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MOHeparina
CariotipoSegún % CP
CP >15-20%
FISH MM
13q
TP53
IGH
Diagnóstico citogenético del MM
5, 9, 15 probe
Universidad de Navarraun
MOHeparina
CariotipoSegún % CP
CP >15-20%
FISH MM
13q
TP53
IGH
negativo
t(11;14)(q13;q32) CCND1t(4;14)(p36;q32) FGFR3/MMSETt(14;16)(q32;q23) MAFt(14;20)(q11;q32) MAFBt(6;14)(p21;q32) CCND3t(6;14)(p25;q32) IRF4 negativo
positivo
t(8;14)(q24;q32) MYC
Diagnóstico citogenético del MM
5, 9, 15 probe
Universidad de Navarraun
MOHeparina
CariotipoSegún % CP
CP <15-20% CP >15-20%
FISH MM
13q
TP53
IGH
Hiperdiploidia
t(11;14)(q13;q32) CCND1t(4;14)(p36;q32) FGFR3/MMSETt(14;16)(q32;q23) MAFt(14;20)(q11;q32) MAFBt(6;14)(p21;q32) CCND3t(6;14)(p25;q32) IRF4 negativo
positivo
t(8;14)(q24;q32) MYC
Diagnóstico citogenético del MM
FICTIONMACS
5, 9, 15 probe
MOEDTAMACS CP
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MACS - magnetic cell sorting
CD138 (Syndecan-1) MicroBeadsfor Plasma CellIsolation
Universidad de Navarraun
multicolor FICTION“Fluorescence Immunophenotyping and Interphase
Cytogenetics as a Tool for the Investigation Of Neoplasms”
Staining for VS38c surface antigen Plasma Cell specificPrimary Ab: VS38 mouse anti human CD38, Secondary Ab 1st Rabbit (*Alexa 350) anti mouse, Secondary Ab 2nd goat (*Alexa 350) anti rabbit and Secondary Ab 3rd monkey (*Alexa 350) anti goat
Plasma cell VS38 + VS38 -
Department ofGenetics
University ofNavarra
Universitätsklinikum Kiel
Institut für Humangenetik
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2008 cambio, realismo ?? FUTURO INMEDIATO (definir pacientes de
alto riesgo estimado en un 25% de pacientes) Clínica Mayo
•FISH t(4;14),t(14;16) y del(17p)•Cariotipo para monosomia/del 13q e hipodiploidia
Definir pacientes alto riesgo: cariotipo, FISH, GEF, aCGH, B2m, PCLI,)