diagnostik von legionelleninfektionen und nachweis von...
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Diagnostik von Legionelleninfektionen und Nachweis von Infektionsketten
Wolfsburg, 13.09.2012
Christian LückInstitut für Medizinische Mikrobiologie und HygieneTU DresdenKonsiliarlabor für Legionella am Robert Koch Institut
Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene/ Institut für Virologie
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Legionellen im Plattenbaugebiet
• Legionellen im Wasser• Keine Erkrankungen• Mieterin wollte Mietschulden
„sparen“• Durch technische Maßnahmen der
Wohnungsgesellschaft Nachweisrate von ca. 30% auf 1% gesenkt
– Nachweisgrenze 10/ 100ml• .
• Alle Legionellen müssen sich in der Umwelt vermehren
• Amöben bestimmen die Kolonisierung eines Endstranges
• Umweltresistenz
• 57 beschrieben Spezies
– L.pneumophila• Serogruppe 1• MAb 3-1
positiv– L.bozemanii– L.micdadei– L.longbeachae
AbuKwaik 2002
Ökologie von Legionellen
C Lück IMMH TU Dresden
Übertragung von Legionella:Protozoen - aerogen
• Protozoen ermöglichen die Replikation von
Legionella
• KEIN extrazelluläres Wachstum an /im Biofilm
• Protozoen setzen teilweise Vesikel <5µm frei,
die virulente Legionellen enthalten
• Intrazellulär gewachsene Legionellen sind
infektiöser für Zellkulturen und Versuchstiere
(ID50 steigt 100 -1000)
• Keine Übertragung von Mensch zu Mensch
• Geringe Manifestationsrate in Epidemien (und
bei sporadischen Fällen)
C Lück IMMH TU Dresden
Übertragung von Legionella:Rolle der Protozoen /Vesicles
• Größe der Vesicle 1-10 µm – aerogen übertragbar– Lungengängig!
• Kann mehre hundert Meter bis Km fliegen–
• Kann mehre 10-100 Bakterien enthalten
• Mechanisch belastbar und resistent gegen Austrocknen
• Legionellae bleiben innerhalb eines Vesicles lange Zeit lebensfähig
Corby + A. castellanii ,3d pi
C Lück IMMH TU Dresden
Joseph C EWGLI Meeting Stockholm, 2007
Europe: Rate per million population per year
C Lück IMMH TU Dresden
Legionnaires’ disease 2007-2008 (n=11,867)
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Einzelfälle n=11.867
Cluster/Outbreaks n=243
Cluster Fälle n=890
Andere/ unbekannt
Reise über die Grenze
Reise innerhalb des Landes
Ambulant erworben
Nosokomial
• Fall-Definitionen bevorteilen CAP
nosokomialambulant erworbenReise-assoziiert
sporadische Einzelerkrankungen
Gruppenerkrankungen(7,5%)
ClusterEpidemien
zeitlich begrenzthyperendemisch
C A Joseph Euro Surveill. 2010;15C Lück IMMH TU Dresden
9
Reise nach ItalienKultur von L. pneumophila Sg1, MAbtyp Philadelphia
• Erkrankungen:– Pneumonie (Legionärskrankheit)– Pontiac-Fieber– Extrarespiratorische
Manifestationen– Klinisch inapparente
Serokonversion• Übertragung:
– Direkte Inhalation – Mikroaspiration – Alimentär Kontakt über
Trinkwassser?
Legionellose
C Lück IMMH TU Dresden
Transmission von Legionellen: little and large particle theory
• little particles• Schlechte Adaptation an
intrazelluläres Milieu• freie Legionellen• viable but not culturable• Pontiac-fever
C Lück IMMH TU Dresden
• large particle = infizierte Amöben
• Gute Adaptation an intrazelluläres Milieu• Legionella-
Pneumonie
Antibiotika-Therapie der LegionellosenProbleme der BewertungIntrazelluläre Erreger (Testsysteme!)Keine repräsentativen prospektiven Studien (geringe Prävalenz)Retrospektive Studien und EinzelbeobachtungenKlinischer Erfolg hängt ab von Grundleiden und AbwehrlageTraditionelle Therapie: Erythromycin /evtl. RifampicinTherapieversager Philadelphia 1976: Erythromycin 11 %
Tetracyclin 10 %andere 25 - 40 %
Heute: Chinolone, neue Makrolide, Kombination mit Rifampicin bringt keine VorteileBisher keine Resistenzentwicklung
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Diagnostik Legionella-Infektionen
• Kultur
• Antigennachweis im Urin
• Antigennachweis im respiratorischen Material
• Nachweis von DNA
• Nachweis von Antikörpern im Patientenserum
C Lück IMMH TU Dresden
Kultur von Legionella
11
6
2
43
68
10
39
7
100
11
57
9
13
20
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Koide 2006
Blasquest, 2005 Murcia Outbreak
Ramirez, 1994
Mentasti, 2009 Paris P 38
Lück 2008 CAPNETZ
Lindsay, 2004
Franzin Paris 2009 P33
true pos
false neg
Kultur hat akzeptableSensitivitätEpidemiologischeUntersuchungen
Nested PCR für“direct typing”
Dauer (4-10 Tage)Intensives “Nachuntersuchen” von PCR oder Urinantigen-positiven Fällen
C Lück IMMH TU Dresden
Kultur von Legionellen aus klinischen Proben
•Acid washing (5 min, pH = 2,2)• Hitze (3 min 60 °C)
• Antibiotika
Cefamandol,
Polymyxin B,
Vancomycin, Anisomycin
Vorbehandelte Patienten: Reduzierte Anzuchtrate
Non-pneumophila-spp.: schwieriger
BAL: immer auf Legionella ansetzenBreiter Ansatz bei „positiven“ PatientenC Lück IMMH TU Dresden
Diagnostik Legionella-Infektionen
• Kultur
• Antigennachweis im Urin
• Antigennachweis im respirastorischen Material
• Nachweis von DNA
• Nachweis von Antikörpern im Patientenserum
C Lück IMMH TU Dresden
Nachweis von Legionella-Antigen im Urin
Charakteristik des Urin-Antigens– ca. 10 kDa– Resistent gegenüber
Proteinasen; Hitze-stabil– Hauptkomponente:
Lipopolysaccharid• Beginn und Dauer der Antigen-
Ausscheidung – 1-3 Tage nach Symptome– intermittierend oder
kontinuierlich– 42 Tage und länger nach
Beginn der Antibiotikatherapie- selten
– keine Therapiekontrolle • Problem: Serogruppenspezifität
C Lück IMMH TU Dresden
Urin-Antigen Nachweis
• Urine Antigentest ist hochspezifisch mit ELISA
• Immunochromatographic assays ????
• Hohe Sensitivität bei
– schweren Verläufen Lp1,
– MAb /3-1 positiv
– Travel –associated and CAP
• Geringe/ moderate Sensitivität in nicht schweren Verläufen Lp1
• Geringe/ moderate Sensitivität bei MAb 2 / 3-1 negativen and non Lp1
Fällen
• Sensitivität hoch in Routine Laboratorien
C Lück IMMH TU Dresden
Diagnostik Legionella-Infektionen
• Kultur
• Antigennachweis im Urin
• Antigennachweis im respiratorischen Material
• Nachweis von DNA
• Nachweis von Antikörpern im Patientenserum
C Lück IMMH TU Dresden
Legionella DFA in der Lunge 10-L124L. pneumophila, Serogruppe 1, MAb Subtyp Benidorm
MAb 8-4
MAb 10-6
• DFA • L. pneumophila
species-spezifisch, nicht genus-
• anti-OmpM Mab
• Falsch-positive:• St. aureus
• Unspezifisch/ Artefakte
• Sensitivität 25-60%• Fixiertes Gewebe
C Lück IMMH TU Dresden
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Legionella DFA in der Lunge 10-L124L. pneumophila, Serogruppe 1, MAb Subtyp Benidorm
MAb 3-1 MAb 8-4
MAb 20-1 MAb 10-6
MAb 26-1, MAb3 = negativ
Diagnostik Legionella-Infektionen
• Kultur
• Antigennachweis im Urin
• Antigennachweis im respiratorischen Material
• Nachweis von DNA
• Nachweis von Antikörpern im Patientenserum
C Lück IMMH TU Dresden
Legionella PCR
• In-house nested mit Sequencing Bestätigung oder Typisierung
• Real-time PCR• Nachweis
– alle Legionella species (16s rRNA, 5s rRNA, mip)– L. pneumophila 16S rRNA gene, mip gene – Sg1 LPS gene– clone specific Paris clone ( IS elements)
• Nchweisgrenze10-50 cfu• Hochspezifisch• Quantifizierung nicht notwendig• Direktes Typisieren aus klinischen Proben
C Lück IMMH TU Dresden
Detection of Legionella DNA in Serum samples
• Detects all species / serogroups• Sensitivity depends on the „ load“ – severity of disease
54
4
44
16
1
45
10
36
13
11
27
8
10
13
1
31
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Lindsay 2004, nPCR
Koide 2006, 5S-PCR
Diederen, 2005 Taqman
Mentasi Paris 2009 P38 cultur pos
Mentasi Paris 2009 P38 cultur neg
Lück CAPNETZ, TaqMan 16S
Verdonk, 2009
Diederen, 2007 Taqman
true posfalse neg
Diagnostik Legionella-Infektionen
• Kultur
• Antigennachweis im Urin
• Antigennachweis im respiratorischen Material
• Nachweis von DNA
• Nachweis von Antikörpern im Patientenserum
C Lück IMMH TU Dresden
Methode: Indirekter Immunfluoreszenztest
(ELISA, Agglutination nur als Screening )
Antigen-Auswahl:
Antigene: L. pneumophla Sg 1 - 15
L. micdadei, L. bozemanii, L. dumoffii,
L. jordanis, L. longbeachae Sg1-2
keine IgG / IgM spezifischen Teste
keine Typisierung des ätiologischen Agens möglich
Kreuzrektionen zu anderen Gram-negativen Erregern möglich
Persistenz von Ak-Titern
Antikörpernachweis bei Legionellose
C Lück IMMH TU Dresden
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Pseudocluster von Legionellose
• August 2008: • 6 Erkrankungen nach Rückkehr von Kreuzfahrtschiff• 3 „ Paare“ • alle >50 Jahren• bei einer Patientin hoher Titer gegen L. pneumophila Sg 1-14)
• Alle Patienten Urin –Antigen negativ, PCR negativ
• Kein Ausbruch
• Keine Wasseruntersuchungen auf Schiff
Praktikable Verfahren zum Nachweis von Amöben ?
• Nein• Kultur
– Sensitivität ??– Spezifität
• PCR– Unterscheidung lebend – tot
• Welche Amöben sind mit welchem Stamm infiziert?
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Keine Differenzierung aufgrund der KlinikDaran Denken Diagnostik – ist besser als ihr Ruf„ Feedback“
Suchet, so werdet ihr finden.
Matthäus 7,7
Legionella- Infektionen
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Infektionsquellen Legionella-PneumonienHäufig Warmwassersysteme in der häuslichen Umgebung,
in Hotels, Bädern, im Krankenhaus, etc. nur dies „verhindert“ TWVoRückkühlwerke mit „feuchter Kühlung“Whirl Pools
Selten ThermalbäderBefeuchter (Lebensmittel)InhalatorenZimmer/ ZierspringbrunnenGeburtswannenMagenspülsonde/ Transoesophageale Echo-Sonde , kontaminiert mit LeitungswasserWundinfektionenDentaleinheiten
(noch) nicht: Autowaschanlagen, ScheibenwischernanlageGewächshäuser, Strassenbefeuchtungsmaschinen
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Suche der Infektionsquelle
2- 3 Kolonien mind. 10 Kolonien
Patientenmaterial Wasserproben
1. Serologische Typisierung bei L. pneumophila:Serogruppe, MAb Subtyp
bzw. Speziesbestimmung: MALDI-TOF, DNA-Sequenz (mip, 16S rRNA)
2. Genomisches Fingerprint:, SBT, PFGE, AFLP, RAPD-PCR
Identität > Übertragung aus dem Wassersystem
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Was ist eine monoklonaler (MAb) Subtyp ?
• Reaktivität mit einem Panel monoklonaler Antikörper• Bezeichnung eines Typs nach eine Stamm mit diesem Muster z. B.
– 1,2,3 für Knoxville– 1, 2, 5, 7 für Benidorm
Dresden 8/5 3/1 10/6 8/4 20/1Standard panel 1 2 3 4 5 6 7
Type strain (ATCC)Philadelphia 1 (33152) +++ +++ 0 0 +++ +++ 0Allentown 1 (43016) +++ +++ 0 0 +++ 0 0Benidorm 030E (43108) +++ +++ 0 0 +++ 0 +++Knoxville 1 (33153) +++ +++ +++ 0 0 ++ 0France 5811 (43112) +++ +++ 0 0 0 0 0OLDA (43109) +++ 0 0 0 0 +++ ++Oxford 4032E (43110) +++ 0 0 0 0 +++ 0Heysham 1 (43107) +++ 0 +++ 0 0 0 0Camperdown 1 (43113) +++ 0 0 0 0 0 0Bellingham 1 (43111) +++ 0 0 +++ 0 0 ++Denver (Stout ,1988) +++ 0 +++ 0 0 +++ 0
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Serologische Typisierung - Legionella-Isolate (nach Ursprung) 1986-2011
• Mab 3-1 positive Stämme sind virulenter
• Molekulare Basis nicht komplett verstanden
• Hydrophobes LPS = bessere Übertragung
• Ausbruchs-Stämme sind MAb2 (3-1) positiv
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Ausbrüche Legionnaires´ disease in Europa
In all outbreaks
SG1 MAb2 (3-1) positive
Sarpsborg56 cases,
10 deaths, 2005Air scrubber Lp1 ? ?
Murcia800 cases,
449 confirmed,4 deaths, 2001Lp1 Phil, ST 36
Bovenkarpsel188 cases, 133 confirmed,
21 deaths, 1999Lp1 Phil ST 46
Kapellen93 cases,
43 confirmed5 deaths, 1999 Lp1 ??
Gloucester15 cases,
3 deaths, 1986Lp1 Phil/Alle ST 47
Lens86 cases
18 deaths, 2003-04Lp1, Beni ST 15
Stafford101 cases,
28 deaths, 1985Lp1 Knox ST 27
Barrow-in-Furness87 cases,
7 deaths, 2002Lp1 Beni ST 78
NRW-Berlin7 cases,
1 deaths, 1981Lp1 Beni ST 184
Armavircases,
confirmed,3 deaths, 1988Lp1 Phil, ST 36
Kreuzfahrtschiff8 cases,
1 deaths, 20051 case 2008
Lp1 Knox ST 35
ULM64 cases,
5 deaths, 2010Lp1 Knox ST 62
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Was ist ein Sequenztyp ?
DNA-Sequenz DNA-Sequenz DNA-Sequenz DNA-Sequenz DNA-SequenzGen A Gen B Gen C Gen D Gen E
SequenzA--SequenzB--SequenzC--SequenzD--SequenzE
GCTATCAGT 1GCTATAAGT 2GCGATCAGT 3GCGATCAGT 3
GTCCGTATG 1GTCGGTATG 2GTCCGTATG 1GTCCGTATG 1
GATCGTATGC 1GATAGTATGC 2GATAGTATGC 2GATAGTATGC 2
CAGTCCGTA 1CAGTCCGTA 1CAGTCCCTA 2CAGTCCCTA 2
GGCCGTATG 1GTCCGTATG 2GTCCGTATG 2GTCCGTATG 2
Strain 1 1 1 1 1 1 ST 1Strain 2 2 2 2 1 2 ST 2Strain 3 3 1 2 2 2 ST 3Strain 4 3 1 2 2 5 ST 4
Manche Klone (ST) sind häufigEWGLI Database
(Stand 23.04.2012)
2250 klinische / 3827 Wasserisolate6149 Stämme mit 1211ST
45% der ‘unrelated’ klinischen Fälle durch 6 Klone:
Lokale Klone z.B. ST182, 332, 334
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
371
169
102
10
69 80
388
12 22
9273
124
415
39
185
3
6530
6824 8
82 229
21
32 6
36
35
24
14
33
5
40
11
78
3
0
3
134
0
100
200
300
400
500
600
ST1
ST1
…
ST1
…
ST8
ST9
ST20
ST23
ST27
ST36
ST37
ST40
ST42
ST47
ST59
ST62
ST79
ST82
ST94
ST14
6
ST18
2
ST33
2
Water Clin
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Infektionsquellen Legionella-PneumonienHäufig Warmwassersysteme in der häuslichen Umgebung,
in Hotels, Bädern, im Krankenhaus, etc. >> TWVoRückkühlwerke mit „feuchter Kühlung“
Whirl Pools
Selten Thermalbäder
Befeuchter (Lebensmittel), Inhalatoren
Zimmer/ Zierspringbrunnen
Sehr selten Geburtswannen
Magenspülsonde/ Transoesophageale Echo-Sonde , kontaminiert mit LeitungswasserWundinfektionen
Dentaleinheiten
StrassenbearbeitungsmaschinenScheibenwischernanlage
(noch) nicht: Gewächshäuser, Autowaschanlagen,
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
• Infektionsquelle– Epidemiologisch keine
gemeinsame „Quelle“• Schwimmbad• Feier• Reisen/ Hotel
– diffus über die Stadt verteilt– >>Rückkühlwerk– 9/30 Kultur Legionella pos– 5x Lp1– 1x Mabtyp Knoxville, ST 62
• Intermittierender Betrieb seit Sommer 2009
• Wetterlage: – Relativ warm– Dichte Wolkenschicht
Von Baum et al. Euro Surveill. 2010;15(4):1-2
2010 Ausbruch Ulm
Outbreak Lens, France Nov.2003- Jan.04
• 86 Fälle
• Letalität 21%
• Winterzeit
• Transmission > 6km
• Strains Lens einmalig: MAb 3-1 positiv, ST 15
– >2000 Stämme in Frankreich
– >150 lokal Stämme
• Ein Stamm mit gleichem ST aus Deutschland
• Seit 2008 weitere Fälle aus F
Ngyen et al. JID, 2006 40
17 cases of travel-associated Lazise, It, notified by ELDSNet as of 21.09.2011 (n=17)
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Lp1 ST 23 detected in 2 patients and 2 campsites
Rota et al. Eurosurv 2011
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IQ = (Warm)wasserversorgung – Legionella Menge initial bis 200/ml (20 000/100ml), – Danach bis 15 /ml– Warmwasserinstallation nah am Kaltwasser ( bis 28,7°C): >200/ml
• Epidemiestamm selten aber bis 2009 nachweisbar– Lp1 Knoxville ST182– Lp 1 Philadelphia/OLDA ST1– Lp 6– L. gormanis, L. anisa
• Ab August 2003 keine Erkrankungen mehr
Nosokomialer Ausbruch Frankfurt/O
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Ausbruch auf Kreuzfahrtschiff
2003 8 Patienten• 2x Kultur
– Lp1 Knoxville, ST35 – bisher nur je 1x in D, NL,
Can• Urin Ag positiv 5x• Antikörper positiv 3x
39 Personen ohne Symptome waren nach 6 Wochen Antikörper negativ
2008 erneuter Fall gleicher Stamm
K. BEYRER et al. Epidemiol. Infect. (2007), 135, 802–810.
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LD-Ausbruch Kreuzfahrtschiff
Kaltwasserproben: 46% positivWarmwasserproben: 36% positiv
2003L. Spezies
L. pneumophila Sg 1 (7x MAbtyp Oxford)
Sg 1 (2x MAbtyp Knoxville, ST35)Whirlpool
Dusche beim Friseur Sg 3, 5, 10 (54x)
20089/10 Wasserproben <100/100ml
Der „Verursacher“ kann selten sein
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Nosokomiale Legionellose Rückkühlwerk in Klinik, Deutschland, 2003
• Einzelfall im KH:• Ambulant übertragbar• L. pneumophila Sg1, Mabtyp Knoxville, ST 31 einmalig bisher• Abstand Balkon – RKW ca 70m• Die Übertragung vermutlich durch Inversionswetterlage gefördert• Im KH Wasser andere Stämme: Lp 2-14
Engelhart et al. IJHEM 2008
© Prof M. Exner
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor
Entstehung von Legionella-Infektionen
Legionellose
Stamm-spezifische Virulenz
L.pneumophila Sg 1
MAb 2 (3/1)-Typ
Anzahl der Bakterien
WirtsfaktorenTransplantation,Kortikosteroide,
TNF alpha AntagonistenSchluckstörungen
Alter, Raucher
Amöben
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Legionella Kontrolle
• Epidemiologie beginnt mit der Diagnose – 600-700 gemeldete versus 20 000 geschätzte Fälle
• Aufmerksamkeit • Legionellen im Wasser
– Infektion - Kann sein – muss aber nicht– Ist es wichtiger Infektionen zu detektieren als Legionellen im Wasser ?
• Routine Wasserkontrollen – Im KH ja– Sonstiges Umfeld ??
Nationales Konsiliarlabor für Legionellen
• Technische Universität Dresden• Institut f. Medizinische Mikrobiologie u. Hygiene• Dr. Christian Lück• Fiedlerstr. 42• 01307 Dresden
• Tel.: 0351- 458- 6580/ 6213 Fax: 0351- 458- 6310
• e-mail: [email protected]• http://www.konsiliarlabor-legionella.de
C Lück IMMH TUDLegionella-Labor