Práctica No. 11

Hidrólisis de una proteína y ensayos para proteínas y aminoácidos

I- Hidrólisis de Grenetina (Solución A)

Colocar 1g de grenetina, 10 mL de ácido clorhídrico concentrado y 10 mL de agua destilada.

Añadir cuerpos de ebullición, ácido

clorhídrico altamente corrosivo

Adaptar un refrigerante en posición de reflujo, calentar suavemente por 35 minutos

Matraz balón 200 mL

Posteriormente 0.5g de carbón activado, continuar calentando por 2 minutos y filtrar

Añadir

II. Solución neutralizada de hidrolizado de grenetina (Solución B)

Tomar 5mL de solución A y neutralizarla con hidróxido de sodio al 10%, posteriormente filtrar

Emplear papel pH

Utilizar para efectuar la cromatografía,

prueba de ninhidrina y la acción reguladora

III. Solución de grenetina sin hidrolizar (Solución C)

Colocar 0.5g de grenetina, 20mL de agua destilada y agitar

Vaso de precipitados de 100mL

IV. Solución de Albúmina (Solución D)

Agitar por 10 segundos, para preparar la solución de Albúmina

Clara de huevo

Agregar 100mL de agua, agitar,

Manta de cielo

Filtrar solución Utilizar filtrado para efectuar las pruebas

siguientes

Identificación 1) Reacción Xantoproteíca

2 Tubo de ensayo, añadir

2mL de solución hidrolizada (Solución A)

2mL de solución de Albúmina (Solución D)

Tubo 1 Tubo 2

Agregar a cada tubo 5mL de ácido nítrico concentrado, de manera cuidadosa

Calentar suavemente a baño maría y observar coloración

Enfriar cada tubo de ensayo, agregando gota a gota NaOH al 10% hasta pH básico

Identificación 2) Reacción de precipitación

3 tubos de ensayo

Colocar en cada tubo 2mL de grenetina hidrolizada (Solución A), solución Albúmina (Solución D) y 2mL de agua destilada, respectivamente

Agregar a cada tubo 5mL de solución de NaOH al 10% y 1mL de acetato de plomo 10%

Calentar a ebullición con agitación y observar resultados

Acetato de Plomo

Hidróxido de Sodio

Ácido Clorhídrico

Ácido Nítrico

Fenolftaleina

Ninhidrina

Nitrito de Sodio

Rojo congo

Sulfato de cobre

Identificación 3) Reacción de Biuret

6 tubos de ensayo

Colocar las siguientes soluciones

1 .0.5mL de agua destilada, 0.5mL de sol. De hidróxido de sodio al 10% (testigo)

2. 0.5mL de solución de grenetina sin hidrolizar (Sol.C)

3. 0.5mL de solución de albúmina

4.0.5mL de solución de grenetina hidrolizada sin neutralizar (Sol. A), 0.5mL de NaOH al 10%

5. 0.5mL de solución de albúmina, 0.5mL de NaOH al 10%

6.0.5mL de grenetina hidrolizada sin neutralizar (Sol. A)

Agregar a cada tubo 2mL de solución de sulfato de cobre al 2%

Agitar, observar y concluir

Identificación 4) Reacción con Ninhidrina5 tubos de ensayo

Colocar las siguientes soluciones

1 .0.5mL de agua destilada

2. 0.5mL de solución de grenetina hidrolizada a pH neutro (Solución B)

3. 0.5mL de solución de grenetina sin hidrolizar (Solución C)

4. 0.5mL de solución de albúmina (Solución D)

5. 0.5mL de solución al 1% de un aminoácido patrón Agregar a cada tubo 0.5mL de solución de Ninhidrina al 3% y calentar a baño maría por 5 minutos, anotar observaciones

Identificación 5) Reacción con Ácido Nitroso

En cuatro tubos de ensayo, colocar 3mL de HCl concentrado y enseguida agregar

1 .2mL de hidrolizado de grenetina (Sol.A)

2. 2mL de grenetina sin hidrolizar (Sol C)

3. 2mL de solución de albúmina (Sol.D)

4. Tubo testigo sin proteína Enfriar y agregar 1mL de solución acuosa de nitrito de sodio al 5%, anotar observaciones.

Identificación 6) Acción reguladora de aminoácidos

En un tubo de ensaye colocar 2mL de grenetina hidrolizada (sol.B), y en otro 2mL de agua destilada

Agregar a cada tubo 0.3mL (6 gotas) de rojo congo y HCl gota a gota, hasta un cambio de coloración, observar y concluir.

Efectuar mismo ensayo empleando fenolftaleína 0.1% e hidróxido de sodio 0.1N hasta

cambio de coloración

Identificación 7) Cromatografía en placa fina

Aplicar una pequeña muestra de hidrolizado de grenetina neutra (Sol.B)

Cromatoplaca

Aplicar aminoácidos patrón

Dejar secar e introducir en una cámara cromatográfica con una mezcla de isopropanol-agua 7:3

Eluir el cromatograma, secar y revelar con atomizador que contenga ninhidrina

Identificar los aminoácidos presentes en el hidrolizado de grenetina, determinando Rf

Valina

Glicina

Alanina

Fenilalanina