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Die Rolle der Apoptose in in vitro Modellen neuronaler Degeneration
Dissertation zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie der Ruhr Universität Bochum
angefertigt am Lehrstuhl für Zellphysiologie (Leiter: Prof. Dr. Dr. Dr. H. Hatt)
vorgelegt von Jürgen Doppke
Bochum 2001
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1. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Dr. H. Hatt
2. Gutachter: Prof. Dr. Hermann Lübbert
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Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich bei der Durchführung dieser Arbeit unterstützt haben. Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Dr. Dr. H. Hatt für die Übernahme der Betreuung dieser Arbeit, für sein Interesse an deren Fortgang und für die vielen hilfreichen Kommentare. Herrn Dr. Adrian Carter danke ich für die großzügige Aufnahme in seinem Labor, sowie für gute Ideen, anregende Diskussionen und für die kritische Dursicht des Manuskripts. Weiterhin danke ich Prof. Dr. Hermann Lübbert für die Übernahme des Zweitgutachtens Bei den Mitarbeitern der Arbeitsgruppe möchte ich mich für das ausgesprochen freundschaftliche und kollegiale Arbeitsklima bedanken. Besonderer Dank geht an Rosi Ewen, Sandra Reichert, Ruth Jostock, Steffanie Otto, Christina Bartmann-Lindholm, Hermann Dechent und allen anderen, die ich hier aus Platzgründen nicht aufführen kann. Ein ganz spezieller Dank geht an Tine. Und nicht zuletzt möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, ohne die mein Studium so nicht möglich gewesen wäre.
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................................. 1
EINLEITUNG............................................................................................................................ 5
Apoptose................................................................................................................................. 5 Geschichte .......................................................................................................................... 5 Grundsätzliches .................................................................................................................. 5 Apoptose in der Entwicklung............................................................................................. 7 Apoptose bei Zellschäden .................................................................................................. 8 Apoptose im Immunsystem des Körpers ........................................................................... 9
Induktionsphase...................................................................................................................... 9 Rezeptorinduzierte Apoptose ............................................................................................. 9 Entzug von trophischen Faktoren..................................................................................... 12 Proapoptotische Faktoren aus Mitochondrien.................................................................. 14 P53, Apoptose und Krebsinduktion ................................................................................. 15
Degradationsphase ............................................................................................................... 18 Caspasen........................................................................................................................... 18 Biochemie der Bcl-2 Proteine .......................................................................................... 20 Zelluläre Inhibitoren der Apoptose .................................................................................. 23 Abbau der DNA und des Nucleus .................................................................................... 24 Aufnahme der Zellreste und apoptotischer Körperchen .................................................. 25
Apoptose bei neurodegenerativen Erkrankungen ................................................................ 26 Amyotrophe Lateralsklerose ............................................................................................ 26 Huntington´s Disease ....................................................................................................... 27 Alzheimer´s Disease......................................................................................................... 28 Parkinson´s Disease.......................................................................................................... 29 Schlaganfall ...................................................................................................................... 30 Krebs ................................................................................................................................ 31
Nachweismethoden für Apoptose ........................................................................................ 32 Nachweis der DNA-Fragmentation.................................................................................. 32 Nachweis von Caspase-Aktivität ..................................................................................... 33 Nachweis der Exposition von Phosphatidylserin ............................................................. 34 Sonstige Färbemethoden .................................................................................................. 34 Morphologische Hinweise................................................................................................ 34
Apoptose induzierende und hemmende Substanzen ............................................................ 35 Staurosporin ..................................................................................................................... 35 Malonat / Methylmalonat ................................................................................................. 36 Deprenyl ........................................................................................................................... 36 Dipyridamol ..................................................................................................................... 37 Pramipexol ....................................................................................................................... 37 FK506............................................................................................................................... 37 ZVAD-fmk ....................................................................................................................... 39
Zielsetzung ........................................................................................................................... 40 MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................ 41
Material ................................................................................................................................ 41 Chemikalien ..................................................................................................................... 41 Zellkultur.......................................................................................................................... 41 Verbrauchsmaterial .......................................................................................................... 42 Kits ................................................................................................................................... 42 Geräte ............................................................................................................................... 43 Software ........................................................................................................................... 43
Methoden.............................................................................................................................. 44
INHALTSVERZEICHNIS
Zellkultur.......................................................................................................................... 44 Astrozytenkonditioniertes Medium.................................................................................. 44 Beschichtung der Wachstumsfläche für Kortexneuronen und Striatumneuronen ........... 45 Präparation und Kultivierung von Kortex- und Striatumneuronen.................................. 45 Kultivierung und Differenzierung von PC12-Zellen ...................................................... 47 Neurodegenerationsmodelle............................................................................................. 47 MTT-Test ......................................................................................................................... 48 Laktat-Dehydrogenase-Test ............................................................................................. 48 DNA-Fragmentation (ELISA).......................................................................................... 49 Caspase-3 Test.................................................................................................................. 49 Proteinbestimmung........................................................................................................... 50 Annexin-Phosphatidylserin Färbung................................................................................ 50 Statistische Berechnungen................................................................................................ 51
ERGEBNISSE.......................................................................................................................... 52
Staurosporin-Modell............................................................................................................. 52 Glutamat-Modell .................................................................................................................. 57 Entzug von trophischen Faktoren......................................................................................... 59 H2O2/Radikalstreß-Modell ................................................................................................... 59 AraC-Modell ........................................................................................................................ 60 Ischaemie-Modell................................................................................................................. 61 Methylmalonat/ Malonat- Modell ........................................................................................ 61 Kortexneuronen im Methylmalonat-Modell ........................................................................ 62 Striatumneuronen im Methylmalonat-Modell...................................................................... 64 Kortex-Neuronen im Malonat-Modell ................................................................................. 65 Striatum-Neurone im Malonat-Modell................................................................................. 67 Einfluß des pH-Wertes im Methylmalonat-Modell ............................................................. 69
ZVAD-fmk im Staurosporin-Modell ............................................................................... 70 ZVAD-fmk im Methylmalonat-Modell ........................................................................... 72 ZVAD-fmk im Malonat-Modell....................................................................................... 73
Weitere Inhibitoren im Methylmalonat / Malonat-Modell oder im Staurosporin-Modell... 75 Caspase-3 Inhibitor im Staurosporin-Modell ................................................................... 75 Pramipexol im Staurosporin-Modell ................................................................................ 76 Deprenyl im Staurosporin-Modell ................................................................................... 77 Dipyridamol im Staurosporin-Modell .............................................................................. 78 FK506 im Staurosporin-Modell ....................................................................................... 79 FK506 im Malonat-Modell mit Kortexneuronen ............................................................. 80 FK506 im Malonat-Modell mit Striatumneuronen .......................................................... 81 FK506 im Methylmalonat-Modell mit Kortexneuronen.................................................. 82 FK506 im Methylmalonat-Modell mit Striatumneuronen ............................................... 83
DISKUSSION .......................................................................................................................... 85
Nachweismethoden für Apoptose / Zelltod.......................................................................... 86 Apoptose- / Neurodegenerationsmodelle ............................................................................. 88
Staurosporin als Apoptose-Induktor................................................................................. 88 Glutamat als Apoptosemodell .......................................................................................... 90 Entzug trophischer Faktoren als Apoptosemodell ........................................................... 91 Wasserstoffperoxid als Apoptosemodell.......................................................................... 92 AraC als Apoptosemodell ................................................................................................ 94 Entzug von Sauerstoff und Glukose als Apoptosemodell ................................................ 95 Methylmalonat / Malonat ................................................................................................. 96 Einfluss des pH-Wertes auf die Fragmentation.............................................................. 100
INHALTSVERZEICHNIS
Substanzen in Apoptosemodellen ...................................................................................... 101 ZVAD-fmk im Staurosporin-Modell ............................................................................. 101 ZVAD-fmk im Malonat-Modell..................................................................................... 102 Caspase-3 Inhibitor ........................................................................................................ 103 Pramipexol ..................................................................................................................... 103 Deprenyl ......................................................................................................................... 104 Dipyridamol ................................................................................................................... 105 Immunophilin-Ligand FK506 ........................................................................................ 106
ZUSAMMENFASSUNG....................................................................................................... 110
LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................... 113
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 1
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
µg Mikrogramm µl Mikroliter µmol Mikromol 3-NP 3-Nitropropionic acid 6-OHDA 6-Hydroxydopamin
A ABTS 2,2´-Azino-bis(3-Ethylbenzthiazoline-6-Sulfonic Acid)
AIDS Aquired immune deficiency syndrome AIF Apoptosis inducing factor ALS Amyotrophe Lateralsklerose AMP Adenosin Monophosphat Apaf apoptotic protease activating factor Apo2L (auch TRAIL) Apoptosis Ligand 2 Apo3L (auch TWEAK) Apoptosis Ligand 3 APP Amyloid precursor protein ARC apoptosis repressor with Caspase-
recruitment domain AS Aminosäure ATM Ataxia talangiectasia Mutation ATP Adenosin Trisphosphat Aβ β-amyloid Protein
B B27 Brewers Medium Supplement 27 bcl-2 Gen bzw. Protein aus B-cell lymphoma BDNF Brain derived neurotrophic factor bFGF Basic fibroblast growth factor BH4-Domäne Bcl-2 homology domain 4 BSA Bovines Serum Albumin; Rinder Serum
Albumin bzw. beziehungsweise
C ca. circa C. elegans Caenorhabditis elegans Ca2+ Kalzium-Ionen CaCl2 Kalziumchlorid CAD (auch DFF40) Caspase activated DNAse CaM-Kinase II Calmodulin-Kinase II CARD Caspase recruitment domain Casp- Caspase- Caspase Cystein aspartatic acid protease CD 95 (auch Apo-1, Fas). Cell death receptor 95 Cdk Cyclin dependent kinase cdk-Kinase Cyclin dependent kinase kinase ced C. elegans death CED-4 C. elegans death Protein 4 c-Flip cellular FLICE inhibitory protein cGMP Cyclic Guanosin Monophosphat CHAPS 3-([3-
Cholamidopropyl]dimethylammonio)-1-
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propane sulfonate cIAP cellular Inhibitor of Apoptosis protein cm Zentimeter CO2 Kohlendioxid CoA Coenzym A CREB cAMP-response element-binding-protein CsA Cyclosporin A CSS Canale-Smith Syndrom
D d Tag(e) d.h. das heißt DABCO DcR1 (auch TRID oder TRAIL-R3 oder
LIT) Decoy-receptor 1
DcR2 Decoy- receptor 2 DD death domain, Todesdomäne DED death effector domain DEVD-CHO Ac-Asp-Glu-Val-Asp-CHO (Casp-3
Peptid-Inhibitor) DIABLO (auch Smac) direct IAP-binding protein with low pI DISC Death inducing signalling complex DMEM Dulbecco´s minimal essential medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleic acid DNA-PK DNA-abhängige Protein-Kinase DPBS Dulbecco´s phosphate buffered saline dUTP dUridintriphosphat
E EC50-Wert Exciting concentration 50% EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzyme linked Immunosorbent assay Erk extracellular signal regulated protein
kinase F FACS Fluorescence assisted cell sorting FADD (Mort1) Fas-associated death domain protein FADD-DN FADD dominant-negative Mutante FAK focal adhesion kinase FAP48 FKBP-associated protein 48 FCS fetal calf serum; fötales Kälberserum FeSO4 Eisensulfat FITC Fluorescein-isothiocyanat FKBP FK506 binding Protein FKBP12 FK506 binding Protein 12 Flip FLICE inhibitory protein
G G Glutamin GABA Gamma aminobutyric acid GAP43 growth associated protein 43 GDNF Glial cell line-derived neurotrophic factor GM-CSF granulocyte-makrophage colony
stimulating factor H h Stunden H2O2 Wasserstoffperoxid HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N´-(2-
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ethanesulfonic acid) HPV Human papilloma virus HSP-70 heat schock protein 70 I IAP inhibitors of apoptosis proteins IC50-Wert Inhibitory concentration 50% ICAD (auch DFF45) Inhibitor of Caspase activated DNAse ICAM-3 intercellular adhesion molecule-3 IGF insulin like growth-factor IGF-BP IGF-binding protein IGF-I-receptor insulin like growth-factor-I-receptor IKK inhibitor of κB Kinase IL Interleukin IP3 Inositol(1,4,5) Trisphosphat ISEL In situ end labeling ISNT in situ nick translation I-κB inhibitor of κB J JNK c-Jun NH2-terminale Kinase JNKK JNK Kinase
K K Kontrolle kD kilo Dalton
L L Liter LDH Laktatdehydrogenase
M MAO Monoaminoxidase MAO-B Monoamin Oxidase -B MAP Mitogen aktiviertes Protein MCAO Middel cerebral artery occlusion MCM Methylmalonyl-CoA Mutase MEK Map Kinase/Erk Kinase MEKK1 MAP Erk Kinase-Kinase-1 Met Methionin MgCl2 Magnesiumchlorid min Minute(n) ml Mililiter MPP+ MPTP-Ion MPT mitochondrial permeability Transition MPTP 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-
tetrahydropyridin MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide mut mutiert MW Mittelwert
N n number (Anzahl der Versuche) Nr. Nummer NaCl Natriumchlorid NAD+ Nicotinamidadenindinucleotid (oxidiert) NADH Nicotinamidadenindinucleotid (reduziert) NaOH Natriumhydroxid NB Neurobasal Medium NF-AT nuclear factor AT NFT neurofibrilläre tangles NF-κB Nuclear factor kappa B
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NGF Nerve growth factor NIK NFκB-inducing Kinase nm Nanometer NMDA N-methyl-D-aspartat nNOS neuronal nitric oxide synthase
O O2 Sauerstoff P PAK2 p21-activated Kinase PARP Poly-ADP-Ribose Polymerase PBS Phosphate buffered saline PC12-Zellen Phaeocromocytoma 12 Zellen PDE 5 cGMP phosphodiesterase PDK 3´-phosphoinositid-abhängige Kina PDL Poly-D-Lysin PI 3-K Phosphoinositid-3-Kinase PKA Protein Kinase A PKC Protein Kinase C PLADS pre-ligand binding assembly domains pNA para Nitroanillin PPIase Peptidyl-Prolyl-Isomerase (Rotamase) PTP permeability transition pore
R Rb retinoblastoma protein RIP receptor interacting protein ROS Reactive oxygen species Rsk pp90 ribosomal S6 kinase RT Raumtemperatur
S SE Standard error of the mean Smac (auch DIABLO) second mitochondria derived activator of
Caspases SOD-1 Superoxide dismutase 1 Stauro Staurosporin SV40 Simian virus 40
T TdT terminale Desoxynukleotidyl-Transferase TGF-β1 transforming growth factor β1 TNF Tumor-Nekrose-Faktor TNF-alpha Tumor-Nekrose-Faktor-alpha TNF-R1 (auch p55 oder CD120a) Tumor necrosis factor receptor 1 TRADD TNFR associated death domain TRAF2 TNFR associated factor-2 TrKA, TrKB oder TrKC Tropomyosin receptor-kinase A, B, C TrKA-R Tropomyosin receptor-kinase A receptor TUNEL TdT mediated dUTP Nick-End Labelling
U U/ml Units/ml UV ultraviolett
V VDAC voltage-dependent anion channel, V-FLIP´s (auch Casper, I-FLICE, FLAME,
CASH) viral FLICE inhibiting proteins
W willk. willkürlich Z z.B. Zum Beispiel ZNS Zentrales Nervensystem ZVAD-fmk benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (O-
methyl) fluoromethylketone
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EINLEITUNG
NLEITUNG 5
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Apoptose
Geschichte Lange bevor Apoptose ihre heutige Bedeutung in der biologischen Forschung erhalten hat,
wurde sie von verschiedenen Wissenschaftlern beschrieben und mit verschiedenen Begriffen
belegt. Der Begriff Apoptose (griechisch:apo von weg, von ab, ptosis: u.a. herabfallen oder
sinken; frei übersetzt Herabfallen der Blätter im Herbst) wurde dann von A.R. Currie und
seinen Kollegen J.F. Kerr und A.H. Wyllie 1972 geprägt (Kerr, J. F. et al., 1972). Zuvor war
der „spontane Zelltod“ schon von Walther Flemming 1885 als „Chromatolyse“ beschrieben
worden. Die typischen DNA-Leitern, die durch gezielten Abbau der DNA bei Apoptose
entstehen, wurden von Wyllie et al. in den 80er Jahren in Glucokortikoid-behandelten T-
Zellen entdeckt (Wyllie, A. H., 1980). Dann entdeckten Horvitz et al. nicht nur, daß bei der
Nematode Caenorhabditis elegans während der Entwicklung genau 131 der ursprünglichen
1090 Zellen durch Apoptose zugrunde gehen, sondern auch die regulierenden Gene und
Genprodukte, die sie ced-Gene nannten (C. elegans death) (Horvitz, H. R. und Sulston, J. E.,
1980). Ab 1990 wurden dann auch die ersten Familienmitglieder der pro- und
antiapoptotischen Bcl-2 Proteine entdeckt (von B-cell lymphoma). Die Forschung auf dem
Gebiet der Apoptose ist ab 1995 immer mehr intensiviert worden.
Grundsätzliches Beim Übergang des Lebens vom einzelligen Organismus zum Mehrzeller mußten
Mechanismen gefunden werden, um die Zellzahl und darüber auch die Form und die
Proportionen der einzelnen Organe zu steuern. Dabei kristallisierte sich heraus, daß die
Produktion einer Überzahl von Zellen und der anschließende geordnete Abbau dieser Zellen
einer der praktikablen Wege ist. Dieser Prozeß erwies sich auch beim ausgewachsenen
Organismus als geeignet, um die Homeostase zwischen Zellproliferation und Zellabbau zu
gewährleisten, sowie falsch lokalisierte aber auch infizierte oder geschädigte Zellen aus dem
Zellverband zu eliminieren. Ein Spezialfall ist das Immunsystem, in dem zum einen eine
Vielzahl von Antigenen abgefangen werden muß und zum anderen vermieden werden muß,
daß eigene Proteine angegriffen werden. Zudem müssen die bei einer Infektion stark
vermehrten Lymphozyten wieder auf die normale Anzahl reduziert werden, wobei jedoch
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einige Zellen als Gedächtniszellen erhalten bleiben sollen. Diese Aufgaben im Immunsystem
werden größtenteils ebenfalls durch Apoptose gelöst (Steller, H., 1995).
Apoptose wird auch programmierter Zelltod genannt, weil die einzelnen
molekularbiologischen Schritte genetisch festgelegt sind und nach einem festen Muster
ablaufen. Dieses Programm wird entweder von äußeren oder inneren Faktoren gestartet,
jedoch von der Zelle selbst durchgeführt. Da die Durchführung der Apoptose eine sehr
weitreichende Konsequenz für die Zelle –nämlich den Tod der Zelle– zur Folge hat, sind
zahlreiche Sicherungsmechanismen vorhanden. Beim Start der Apoptose kann die Zelle das
Programm oft noch abbrechen oder überprüfen, wenn Signale oder innere Faktoren gegen die
Durchführung sprechen. Ist die Überprüfung positiv, wird durch Abbau den von
lebenswichtigen Proteinen und den Start oder die Verstärkung weiterer Programmschritte der
irreversible Teil des Apoptose-Programms gestartet. Dadurch beginnt der geordnete Abbau
der betroffenen Zelle, der meist in der Aufnahme der in kleinen Membranpaketen (apoptotic
bodies) verpackten Reste der Zelle durch andere Zellen endet. Der Vorgang, bei dem zunächst
Bläschen der Zellmembran entstehen, die später abgeschnürt werden, wird auch Zeiose
genannt.
Der Apoptose kommt eine extrem wichtige Bedeutung bei der Homeostase der Zellzahl und
der Entsorgung geschädigter oder überflüssiger Zellen zu. Daher können Fehlfunktionen zu
schweren Erkrankungen führen. So kann eine Unterfunktion der Apoptose Krebs oder
Autoimmunkrankheiten zur Folge haben; bei einer Überfunktionen können nicht ersetzbare
Zellen zerstört oder das Gleichgewicht von Zellpopulationen gestört werden. Beispiele für
Überfunktion sind AIDS (CD4 T-Lymphozyten), akutes Leberversagen, Wilson´s disease,
multiple Sklerose, neurodegenerative Erkrankungen, aplastische Anämie, chronische
Neutropenie, Diabetes mellitus Typ-1 und Hashimoto´s Thyroiditis. Eine Deregulation der
Apoptose, bei der zu wenig programmierter Zelltod stattfindet, kann zu Canale-Smith
Syndrom (CSS, ALPS), Lymphomen, Leukämie, soliden Tumoren, Autoimmunkrankheiten
(Hypereosinophilie, Lupus erythematosus, rheumatoide Arthritis, Graves´ Disease) führen
(Eguchi, K., 2001; Strand, S. et al., 1998; Ameisen, J. C. et al., 1995; Sathasivam, S. et al.,
2001; Muschen, M. et al., 1999; Zornig, M. et al., 2001).
Im Gegensatz zu Apoptose steht Nekrose: sie ist gekennzeichnet durch einen pathologischen
Prozeß, bei dem akute unphysiologische Bedingungen oder physikalische Einwirkungen die
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Zellen zerstören. Resultat ist letztlich eine zerstörte Zellmembran, die es erlaubt, Zellinhalte
in die Umgebung freizusetzen. Dadurch können Immunzellen angelockt werden, die dann
durch Zytokin-Produktion einen entzündlichen Prozeß induzieren (Kroemer, G. et al., 1998).
Offensichtlich gibt es auch zahlreiche Zwischenformen und Kombinationen des Zelltodes:
Epithelzellen der Haut und des Darms, die durch hohe Schadbelastungen besonders
mutations- und krebsgefährdet sind, werden durch postmitotische Differenzierung und
Abschilfern entfernt. Ob danach Apoptose oder Nekrose eintritt, ist unbekannt. Eine
Überexpression der antiapoptotischen Proteine Bcl-2 oder Bcl-xL hat jedenfalls keinen
Einfluss auf Regenerationsvorgänge in äußeren oder inneren Epithelien (Meier, P. et al.,
2000a). Auch ist es möglich, daß zur kompletten Durchführung der Apoptose die
Energiereserven fehlen. Schließlich können Einflüsse auf die Zelle das apoptotische
Programm starten, das dann aber von (meist schnelleren) nekrotischen Vorgängen überlagert
wird .
Apoptose in der Entwicklung Während der Ontogenese eines vielzelligen Organismus werden sehr viel mehr Zellen
produziert als später für die Funktion der Organe benötigt werden. Im Verlauf der
Entwicklung wird daher die Zellzahl durch Apoptose auf das richtige Maß korrigiert. Viele
Beispiele zeigen, daß sogar ganze Strukturen gebildet werden, nur um später ab- oder
umgebaut zu werden. Der Schwanz bei der Entwicklung von Kaulquappen zum adulten
Frosch oder die Bildung von Schwimmhäuten zwischen den Fingern vieler Landlebewesen
sind anschauliche Beispiele dafür. Weitere Beispiele sind der Müllersche und der Wolffsche
Gang, die sich zu den weiblichen respektive den männlichen Gonaden entwickeln. Bei der
Entwicklung zu männlichen oder weiblichen Tieren wird der jeweils nicht benötigte Teil
durch Apoptose entfernt (Meier, P. et al., 2000b).
Eines der hinsichtlich Apoptose am besten untersuchten Tiere ist C. elegans. Bei dieser
Nematode beträgt die maximale Zellzahl während der Ontogenese 1090 Zellen. Von diesen
werden 131 Zellen durch Apoptose entfernt, so daß ein adultes Tier 959 Zellen besitzt. Bei
diesem wichtigen Modellorganismus wurden erstmals für die Apoptose wichtige Gene
entdeckt. Zu jedem der an der Apoptose beteiligten Proteine aus C. elegans konnten analoge
Proteine in Insekten (Drosophila melanogaster) und Mammalia gefunden werden. Die
Komplexität und damit die Zahl der beteiligten Enzyme, Proteine und Rezeptoren ist aber bei
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den Mammalia am höchsten. Dennoch sind viele Proteine in höher als C.elegans organisierten
Metazoa konserviert. Ein Beispiel ist menschliches Bcl-2, das auch in C. elegans seine
Apoptose-inhibierende Wirkung ausübt, obwohl es nicht genau die gleiche Funktion in
Säugern hat (Meier, P. et al., 2000b) (Vaux, D. L. et al., 1992).
Während Apoptose in C. elegans und Drosophila vorwiegend auf frühe Entwicklungstadien
begrenzt ist, ist bei Säugern aufgrund der längeren Lebensspanne Apoptose auch in adultem
Stadium nötig. Je länger das Erwachsenenstadium andauert, desto wichtiger sind
Regeneration und Reaktionsmöglichkeiten auf Infektionen und andere schädliche Einflüsse.
Daraus ergibt sich auch die erhöhte Anforderung an die Steuerung der Apoptose. Außerdem
ist die Komplexität des Nervensystems und des Immunsystem so groß, daß sehr große
Mengen an Zellen gebildet werden müssen. Die Selektion erfolgt bei Neuronen größtenteils
über die positive Selektion durch aus der Umgebung stammende trophische Faktoren
(Hormone und Cytokine), physischen Kontakt zu benachbarten Zellen sowie richtiger
Verbindungen d. h. Synapsenbildung. Diese Mechanismen sorgen dafür, daß eine Nervenzelle
nur überlebt, wenn sie funktionsfähig d. h. richtig verschaltet und zusätzlich an der richtigen
Stelle ist. Nur so ist es möglich, ein so komplexes Gebilde wie das menschliche Gehirn zu
bilden. Daher zeigen sich Störungen des apoptotischen System am deutlichsten im
neuronalen- oder im Immunsystem. Z. B. zeigen Mäuse, denen Caspase-9, Caspase-3 oder
Apaf-1 fehlt, starke neuronale Hyperproliferation und Unordnung. Hingegen sterben die
Mäuse schon im Embryonalstadium, wenn antiapoptotische Proteine wie Bcl-xL deletiert sind.
(Meier, P. et al., 2000b). Aufgrund der starken Auswirkungen von Fehlfunktionen der
Apoptose sind die Mechansimen vor allem in Vertebraten meist stark redundant. Eine
einzelne Mutation hat oft keine sichtbaren oder nur begrenzte Auswirkungen in einzelnen
Organen.
Apoptose bei Zellschäden Intensiv untersucht ist Apoptose bei DNA-Schäden. Die Entstehung von Schäden am Erbgut
einer Zelle kann auf unterschiedliche Weise erfolgen: Einwirkung von ultravioletter oder
radioaktiver Strahlung, von genotoxischen Substanzen, von mutagenen Viren oder
physikalischer Krafteinwirkung. Zudem arbeiten die Enzyme der DNA-Replikation nie
vollkommen fehlerfrei. Entstandene Fehler werden normalerweise erkannt und die Zelle
versucht, diese zu reparieren. Erst wenn die Reparatur mißlingt, versucht die Zelle durch
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Selbstzerstörung eine Schädigung des Organismus zu vermeiden. Die Reparatur sowie die
Apoptose kann durch das Protein p53 (s.u.) eingeleitet werden.
Apoptose im Immunsystem des Körpers Wie wichtig die Entsorgung von infizierten Zellen ist, zeigt die Anpassung vieler Viren mit
Hilfe antiapoptotischer Proteine. V-FLIP´s (auch Casper, I-FLICE, FLAME, CASH genannt
(Ashkenazi, A. und Dixit, V. M., 1998) sind Proteine, die zwei DD (death domains,
Todesdomänen) besitzen, und damit mehrere Apoptose-induzierende Rezeptoren (CD 95,
TNF-R1, TRAMP/DR3, TRAIL-R1) auf der Ebene der Caspase-Ankoppelung inhibieren
können. Auch virale Proteine, die die Funktion des Bcl-2-Proteins nachahmen, sind bekannt.
Die Entsorgung von überflüssigen oder autoreaktiven Lymphozyten wird meist über
rezeptorvermittelte Apoptose durchgeführt.
Induktionsphase Während der Induktionsphase erhält die Zelle entweder exogen die Botschaft, Apoptose zu
begehen, oder interne Faktoren aktivieren die „Entscheidungsphase“. Externe Faktoren sind
oft von anderen Zellen abgegebene Liganden, die an spezielle Rezeptoren auf der Oberfläche
der betroffenen Zelle binden.
Rezeptorinduzierte Apoptose Auf der Zelloberfläche können unterschiedliche Rezeptoren sitzen, die eine Todesbotschaft
von außen direkt an das Zellinnere weiterleiten. Einer der bekanntesten Rezeptoren ist CD95
(auch Apo-1/Fas). Die Bindung des Fas-Liganden induziert eine Trimerisierung der
Rezeptoren, die einen DISC (Death inducing signalling complex) genannten Signalkomplex
bilden. Auf der Zytoplasmaseite kann daraufhin FADD (Fas-associated death domain protein;
oder Mort1) als Adaptermolekül an die DD (Death Domain) genannte Todesdomäne
andocken und mehrere Moleküle pro-Caspase-8 (auch FLICE oder MACH) rekrutieren. Wie
die Caspase daraufhin aktiviert wird, ist nicht genau bekannt. Eine Theorie ist, daß durch die
hohe Konzentration eine gegenseitige Aktivierung der Zymogene möglich ist. Wenn Caspase-
8 aktiviert ist und als Heterotetramer vorliegt, kann im nächsten Schritt Caspase-3 aktiviert
werden. Zusätzlich vermag aktive Caspase-8 Bid, ein Protein der bcl-2-Familie, zu spalten
und so die proapoptotische Wirkung von Bid zu steigern. Bid kann nach Spaltung zu
Mitochondrien translozieren und dort die Freisetzung von Cytochrom C und anderen
proapoptotischen Proteine wie Smac (auch DIABLO) verstärken. Dies ist jedoch nur in
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sogenannten Typ II-Zellen notwendig, die ohne diese Verstärkung viel zu wenig DISC
ausbilden und daher auch kaum Caspase-8 aktiviert wird. Typ I-Zellen können auch ohne
diesen Verstärkungsschritt Apoptose begehen. Die Unterschiede zwischen Typ I und Typ II
Zellen liegen wahrscheinlich in unterschiedlichen Funktionalitäten der Rezeptoren-Komplexe
In einem anderen postulierten Modell liegen die CD 95-Moleküle schon geclustert als
sogenannte PLADS (pre-ligand binding assembly domains) vor. Die Aktivierung würde in
diesem Fall von noch unbekannten antiapoptotischen Inhibitor-Proteinen verhindert. Wie die
Aktivierung der Rezeptoren in diesem Fall geschehen soll, ist bisher weitgehend unbekannt
(Hengartner, M. O., 2000; Krammer, P. H., 2000).
Rezeptoren wie CD95 sind besonders im Immunsystem wichtig: periphere Beseitigung von
aktivierten und reifen T-Zellen am Ende einer Immunantwort, Beseitigen von virusinfizierten
oder entarteten Zellen durch zytotoxische T-Zellen und natürliche Killerzellen und schließlich
das Abtöten von Immunzellen an immunprivilegierten Orten wie dem Auge. Diese
Rezeptoren gehören alle zur Superfamilie der TNF (Tumor-Nekrose-Faktor) Rezeptoren.
Definiert wird diese Gruppe durch ähnliche, cysteinreiche extrazelluläre Domänen. Zusätzlich
haben alle diese Rezeptoren intrazelluläre Todesdomänen. Die am besten charakterisieren
Rezeptoren sind CD95 (auch Fas oder Apo 1) und TNFR1 (auch p55 oder CD120a). Weitere
Todes-Rezeptoren sind CAR1 (Aves), Todes-Rezeptor 3 (auch DR3 oder Apo3 oder WSL-1
oder TRAMP oder LARD), DR4, DR5 (auch Apo2 oder TRAIL-R2 oder TRICK 2 oder
KILLER). Der NGF-Rezeptor (Nerve growth factor) p75 enthält ebenfalls eine Todesdomäne.
Die Liganden, die diese Rezeptoren aktivieren, gehören zur Superfamilie der TNF-Proteine.
CD 95-Ligand bindet an CD 95, TNF und Lymphotoxin binden an TNFR1, Apo3-Ligand
(auch TWEAK) bindet an DR3 und Apo2-Ligand (Apo2L, auch TRAIL) bindet an DR4 und
DR5. Der Ligand für CAR1 ist bislang unbekannt. An CD95 können neben FADD, c-FLIP
oder v-FLIP noch weitere Proteine binden: z.B. Daxx. Daxx bindet ebenfalls an die
Todesdomäne und kann einen alternativen apoptotischen Pfad einschalten, der die Stress-
aktivierte c-Jun NH2-terminale Kinase (JNK) involviert (Ashkenazi, A. und Dixit, V. M.,
1998).
TNF wird vor allem von aktivierten Makrophagen oder von T-Zellen produziert. Durch die
Bindung des Liganden an seinen Rezeptor werden die Transkriptions-Faktoren NF-κB und
AP-1 aktiviert. Diese wiederum können proinflammatorische und immunmodulatorische
Gene induzieren. Ob eine „apoptotische“ Antwort induziert wird, hängt wahrscheinlich von
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der Existenz zellulärer Faktoren ab, die einen solchen Stimulus unterdrücken können. Diese
Faktoren werden möglicherweise durch NF-κB oder /und JNK/AP-1 kontrolliert, da eine
Hemmung einer der beiden Pfade eineSensibilisierung der Zellen gegenüber Apoptose nach
sich zieht. Nach Bindung von TNF trimerisiert TNRF1 wie CD95 und bindet im Zellinneren
TRADD (TNFR associated death domain), an das wiederum entweder RIP (receptor
interacting protein), TRAF2 (TNFR associated factor-2) oder FADD binden kann. Bei
Bindung von FADD wird der gleiche Pfad -Aktivierung von Caspase-8- wie bei CD95
eingeschlagen Bei der Rekrutierung von RIP/TRAF2 hingegen wird zunächst NFκB-inducing
Kinase (NIK) aktiviert, die dann den Komplex I-κB-(inhibitor of κB) Kinase (IKK) aktiviert.
Dadurch wird IκB phosphoryliert und anschliesssend aus dem Komplex entfernt. Die
Transkription von Genen im Kern wird durch die Wanderung von NfκB in den Kern möglich.
Ein weiterer Pfad der von TRAF2/RIP eingeschlagen werden kann, ist die JNK (c-jun NH2-
terminal activated kinase) Kaskade: dazu phosphoryliert MEKK1 (MAP (Mitogen aktiviertes
Protein)/Erk Kinase-Kinase-1) JNKK (JNK Kinase). Diese wiederum phosphoryliert JNK.
MEKK1 kann allerdings nicht direkt an TRAF2 binden. Daher vermutet man ein weitere
Kinase, die entweder MEKK1 ersetzt oder phosphoryliert. Mäuse-Null-Mutanten zeigen, daß
einige Proteine nicht unersetzlich sind. So kann z. B. durch eine Ausschaltung von TRAF2
der NFκB-Pfad nur unwesentlich gehemmt werden. Hingegen wird der JNK-Pfad komplett
durch einen TRAF2 Knockout abgeschaltet. Hingegen wirkt eine Entfernung von RIP genau
entgegengesetzt: der NFκB-Pfad wird komplett blockiert, hingegen der JNK-Pfad kaum
gehemmt. Ein weiterer wichtiger Pfad wird beschritten durch die Proteine cIAP (cellular
Inhibitor of Apoptosis-1/-2 proteins) aus einer Familie von Proteinen viraler oder
Säugerherkunft: diese können direkt von TRAF2 gebunden werden. Schließlich kann TNFR1
auch Adapter namens RAIDD oder CRADD binden, die ebenfalls eine Todesdomäne
besitzen. An das enthaltene CARD-Motiv kann Caspase-2 binden und dort aktiviert werden
(Ashkenazi, A. und Dixit, V. M., 1998).
Der Rezeptor DR3 (Apo3/Wsl1) ist dem TNFR1 äußerst ähnlich. Auch hier können nach
Bindung des Liganden Apo3L über die gleichen Adaptermoleküle und Pfade NFκB und/oder
Caspase-8 aktiviert werden. Apo3L ist eng verwandt mit TNF. Der entscheidende Unterschied
liegt in der regionalen Expression der Liganden sowie der Rezeptoren: TNF wird
hauptsächlich in aktivierten Makrophagen und Lymphozyten produziert; Apo3L wird
hingegen konstitutiv in vielen Geweben exprimiert. Der Rezeptor TNFR1 wird in allen
Geweben exprimiert, Apo3 jedoch vorwiegend im Thymus, Blut, der Milz und in aktivierten
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T-Zellen. Daher nimmt man eine unterschiedliche biologische Rolle für die
Rezeptoren/Liganden-Systeme an.
An die Rezeptoren DR4 und DR5 schließlich kann der Ligand Apo2L (auch TRAIL) binden,
der eng mit CD95L verwandt ist. Auch diese Rezeptoren enthalten eine Todesdomäne im
Zellinneren. Die Art und Weise und welche Caspasen an diesen Domänen aktiviert werden,
ist noch unbekannt. Caspase-Aktivierung ist allerdings zwingend notwendig für die durch
Apo2L ausgelöste Apoptose. Die Expression von dominant negativen FADD-Mutanten
blockierte nicht die Apoptose, woraus auf einen unabhängigen Caspase-Aktivierungsweg
geschlossen werden kann. Die Ergebnisse in dieser Hinsicht sind allerdings nicht eindeutig:
Überexpression von DR4 oder DR5 löst Apoptose aus; diese wurde nur in einem Teil der
Experimente von FADD-DN (FADD dominant-negative Mutante) blockiert. Ebenso ist die
Bindung von Adapter-Molekülen (TRADD, FADD, TRAF2, RIP) umstritten: eine Bindung
könnte auch auf der starken Überexpression von Rezeptoren und Adaptern in Versuchen
beruhen und unphysiologisch sein. Ein völliges Fehlen von FADD konnte allerdings in Zellen
Apo2L-induzierte Apoptose nicht verhindern (Ashkenazi, A. und Dixit, V. M., 1998).
Sowohl Apo2L als auch DR4 und DR5 werden in verschiedenen Geweben exprimiert.
Apoptose in diesen Geweben kann durch Abfangmechanismen verhindert werden; es
existieren so genannte „Decoy-Rezeptoren“ DcR1 (auch TRID oder TRAIL-R3 oder LIT) und
DcR2 (auch TRAIL-R4), die auf der Außenseite der Zellmembran lokalisiert sind und
ebenfalls Apo2L binden können. Sie besitzen allerdings entweder, wie DcR1, gar keine
Domäne im Zellinneren, oder, -wie DcR2, eine verkümmerte und nicht funktionsfähige
intrazelluläre Todesdomäne. Ein homologes Protein, das sekretierte Osteoprotegerin, bindet
ebenfalls an Apo2L und verhindert Apoptose. Das Zusammenspiel der Rezeptoren DR4 und
DR5 sowie der Abfang-Rezeptoren DcR1 und DcR2 mit Apo2L ist noch nicht vollständig
verstanden (Ashkenazi, A. und Dixit, V. M., 1998).
Entzug von trophischen Faktoren Viele Zellen sind auf trophische Faktoren angewiesen; fehlen diese, kann Apoptose induziert
werden. Ein wichtiges Beispiel, bei dem dazu viel über die Signalpfade bekannt ist, stellt
NGF (nerve growth factor) dar. Generell binden Neurotrophine an die Zell-Oberflächen-
Rezeptoren TrKA, TrKB oder TrKC (tropomyosin receptor-kinase A, B, C). Nach Bindung
von NGF an TrKA kann dieser an mehreren Tyrosinen intrazellulär autophosphorylieren. An
den phosphorylierten Rezeptor können z.B. Phospholipase-Cγ, Phosphoinositid-3-Kinase (PI
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3-K) und das Adapter-Protein Shc binden. Aktivierte PI 3K kann über die Generierung von
3`phosphoryliertem Phosphoinositid die Serin/Threonin-Kinase Akt zur Membran
translozieren. Die Form c-Akt3/Rac-PKγ kommt in Neuronen von den drei möglichen
Formen am häufigsten vor. Nach der durch Bindung von 3´phosphoryliertem Phosphoinositid
induzierten Translokation zur zytoplasmatischen Seite der Zell-Membran kann Akt von den
3´-phosphoinositid-abhängigen Kinasen (PDK) phosphoryliert und damit aktiviert werden.
Akt wiederum kann verschiedenen Schlüssel-Enzyme phosphorylieren, darunter Apoptose-
Regulatoren und Transkriptionsfaktoren. Das proapoptotische Bad z. B. kann als
unphosphoryliertes Protein Bcl-xL binden und so dessen antiapoptotische Eigenschaften
blocken. Wird Bad durch Akt phosphoryliert, so kann dieses von 14-3-3 Proteinen im
Zytoplasma gebunden und inaktiviert werden. Akt beeinflußt auch drei verschiedene Familien
von Transkriptions-Faktoren: Forkhead, NFκB und CREB (cAMP-response element-binding-
protein). Die Phosphorylierung dieser Faktoren wirkt in jedem Falle positiv auf das Überleben
der Zelle: Forkhead-Proteinen, die proapoptotische Signale regulieren, werden durch Akt
negativ reguliert. Die Phosphorylierung von CREB und IκB steuert antiapoptotische Signal-
Pfade an (Franke, T. A., 1999; Yuan, J. und Yankner, B. A., 2000).
Durch die Bindung von NGF an den TrKA-R wird ebenfalls der MAP-Kinase-Pfad aktiviert:
zunächst kann das Adapter-Protein Shc an den TrKA-R binden. Dadurch wird letztendlich
Ras aktiviert, das wiederum Raf phosphoryliert. Die weitere Aktivierungs-Kaskade verläuft
über MEK (Map Kinase/Erk Kinase), Erk (extracellular signal regulated protein kinase), und
schließlich MAPK (Mitogen-activated protein kinase). Diese kann Proteine der Rsk-
(pp90ribosomal S6 kinase) Familie aktivieren, was ebenfalls in der Inaktivierung von Bad und
der Aktivierung von CREB resultiert. CREB kann die Transkription von Bcl-2 aktivieren und
so direkt das Überleben der Zelle beeinflussen.
Sind nicht genug trophische Faktoren für das Überleben der Zelle vorhanden, können neben
dem „ Abschalten “ der antiapoptotischen Signal-Ketten zusätzlich proapoptotische Faktoren
aktiviert werden. Beschrieben ist für verschiedene Zellarten die vermehrte Aktivität oder
Transkription von p38MAP Kinase und c-Jun N-terminaler Kinase oder deren Produkt c-Jun.
Auch kann DP5 (auch Hrk) –ein proapoptotisches Mitglied der bcl-2 Familie- z. B. in
sympathetischen Neuronen nach NGF-Entzug transkribiert werden. Die alleinige Aktivierung
von JNK scheint nicht für die Induktion der Apoptose auszureichen. Sympathetische
Neuronen können durch die Gabe eines Breitspektrum-Inhibitors von Caspasen vor der
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Apoptose bewahrt werden. Es wird vermutet, daß die Caspase-Aktivierung über die
Rekrutierung von Bax durch DP5 zu den Mitochondrien und Freisetzung von Cytochrom C
erfolgt.
Auch Neurotrophine können Apoptose induzieren (Chao, M. et al., 1998; Bredesen, D. E. und
Rabizadeh, S., 1997). Die Bindung von Neurotrophinen an den p75NTR (ein Mitglied der
TNF-Superfamilie) kann abhängig von dem Zustand und der Umgebung der Zelle Apoptose
auslösen. Dieser Aktivierungspfad scheint durch die Bindung von NGF an TrKR inhibiert zu
werden. Denkbar ist, daß eine Nervenzelle nicht nur durch fehlende trophische Faktoren,
sondern auch durch „falsche“ trophische Faktoren in einer unpassenden Umgebung untergeht
(Yuan, J. und Yankner, B. A., 2000; Encinas, M. et al., 1999).
Proapoptotische Faktoren aus Mitochondrien Einige Apoptose-induzierende Proteine befinden sich in den Mitochondrien und können aus
diesen in das Zytosol freigesetzt werden, um dort Apoptose auszulösen.
Diese proapoptotischen Faktoren sind neben Cytochrom C auch ein Flavoprotein namens AIF
(Apoptosis inducing factor) und Smac (second mitochondria derived activator of Caspases ,
auch DIABLO = direct IAP-binding protein with low pI) und die Procaspasen-2, -3 und -9.
Wie genau die Freisetzung der proapoptotischen Proteine bewirkt wird, ist nicht abschließend
geklärt. Folgende Hypothesen werden diskutiert: Basierend auf der strukturellen Ähnlichkeit
von Bcl-xL mit dem Diphterie-Toxin wird gemutmaßt, daß sich proapoptotische Bcl-2-
Proteine in die äußere Mitochondrienmembran einfügen und dort einen Kanal oder eine Pore
bilden. Tatsächlich können Bcl-2 Proteine in synthetischen Membranen Kanäle bilden.
Allerdings ist fraglich, ob durch diese Kanäle auch große Proteine passieren können. Diese
Frage stellt sich auch bei der zweiten Hypothese, nach der Bcl-2 Proteine zusammen mit
anderen Proteinen der äußeren Mitochondrien-Membran Kanäle bilden. Ein wahrscheinlicher
Kandidat wäre in diesem Fall der spannungsabhängige Anionen Kanal (voltage-dependent
anion channel, VDAC), weil mehrere Bcl-2 Proteine daran binden können. Auch hier reicht
die Porengrösse des Kanals ohne weitreichende Konformationsänderung nicht aus, um
Proteine hindurchzulassen. Die dritte Theorie weist den proapoptotischen Bcl-2 Proteinen
eine membranzerstörende Wirkung zu: durch Änderung der Physiologie der Mitochondrien
soll letztlich die Membran zerstört werden und die proapoptotischen Faktoren freigesetzt
werden. Hier ist wiederum der VDAC ein möglicher Kandidat, weil er ein Bestandteil der
MPTP (mitochondrial permeability transition pore) ist. Dieser Kanal ist verantwortlich für
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Potentialverluste an der Membran und Anschwellen der Mitochondrien, wenn er sich öffnet.
Substanzen, die das Öffnen des Kanals verhindern, können auch die Freisetzung von
Cytochrom C hemmen. Andererseits kann die Depolarisation der Mitochondrien die
Freisetzung von Cytochrom C bewirken. Auch hier muß wieder einschränkend hinzugesetzt
werden, daß Cytochrom C auch ohne Depolarisation von Mitochondrien freigesetzt werden
kann, so daß von weiteren Angriffspunkten für Bcl-2 Proteine ausgegangen werden muß.
Gerade die rezeptorinduzierte Apoptose führt oft zu sehr später oder sehr geringer Freisetzung
von Cytochrom C. Die Apoptose über diese Pfade ist dann auch relativ unempfindlich für eine
Blockade durch antiapoptotische Proteine der Bcl-2 Familie (Green, D. R. und Reed, J. C.,
1998; Kroemer, G. et al., 1997).
P53, Apoptose und Krebsinduktion Bei mehrzelligen Organismen besteht generell die Gefahr, daß durch Mutationen in den
Genen, die für Proliferation, für den Kontakt mit anderen Zellen oder für Apoptose zuständig
sind, eine Zelle zu stark oder an der falschen Stelle proliferiert. Daher werden diese
Mechanismen streng überwacht so daß bei einer Fehlfunktion die Zelle sich selbst durch
Apoptose beseitigen kann. Alternativ kann die Zelle versuchen, die DNA-Schädigung zu
reparieren. Dies ist natürlich nicht so sicher wie die Beseitigung. Bei postmitotischen Zellen
oder bei Zellen, die ständig entsorgt werden, wie zum Beispiel Hautzellen, ist die Gefahr einer
Neoplasie naturgemäß sehr gering. Grundsätzlich hängt die Entscheidung von der Schwere
der Schädigung, der Umgebung, der Zelle selbst und der Lokalisation ab.
Einer der Hauptpfade der zellulären Antwort auf DNA-Schädigung bei Säugern involviert
eine Reihe von Protein-Kinasen, die verwandt sind mit der Phosphatidylinositol-Kinase (PI-3-
Kinase). Die Prototypen sind ATM (benannt nach der menschlichen autosomalen rezessiven
Krankheit Ataxia talangiectasia) und die DNA-abhängige Protein-Kinase (DNA-PK). Sie sind
homolog zu den Kinase aus der Hefe Rad-3/MEC1, die ebenfalls nach einer DNA-
Schädigung aktiviert werden. Beide Kinasen der Mammalia wirken über das Protein p-53, das
auch „Wächter des Genoms“ genannt wird. P-53 wird normalerweise mittels Abbau durch
Mdm-2 auf einem sehr niedrigen Level gehalten. Durch die Phosphorylierung entweder von
p-53 oder Mdm-2 können die Bindungspartner nicht interagieren und die Aktivität von p-53
steigt an. Die wichtige Rolle von p-53 zeigt sich daran, daß in vielen menschlichen Tumoren
p-53 nicht funktionsfähig ist. Die Folge einer Aktivierung von funktionsfähigem p-53 kann
ein Arrest in der G-1 oder G-2-Phase des Zellzyklus sein oder die Induktion von Apoptose.
Der Arrest des Zellzyklus scheint irreversibel zu sein, so daß die betroffene Zelle keine
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weitere Gefahr darstellt. Ob Apoptose oder Zellzyklus-Arrest induziert wird, hängt wiederum
von mehreren Faktoren ab: neben dem Zelltyp, der Zellumgebung und der Art der Schädigung
spielt die Expression von Onkogenen eine wichtige Rolle.
Der Zellzyklus scheint durch einen Inhibitor der Cyclin-abhängigen-Kinasen -das p-21-
angehalten zu werden. Die Induktion von Apoptose scheint unter anderem durch
Beeinflussung des bcl-2-Proteins Bax, des IGF-I-Rezeptors (insulin like growth-factor-I-
receptor), des IGF-BP (IGF-binding protein), Komponenten des Renin-Angiotensin-Systems
und Proteinen, welche die Angiogenese regulieren, beeinflußt zu werden. Auch die
Repression antiapoptotischer Proteine und Mechanismen ohne Transkription werden
diskutiert.
Die Bereitschaft der Zelle, Apoptose auszulösen, scheint durch die Phase des Zellzyklus bzw.
durch Proteine, welche die Proliferation zu induzieren vermögen, zu steigen. Dies konnte
z. B. bei dem Protein Myc gezeigt werden: Myc gehört zur Familie der bHLH-zip-
Transkriptions-Faktoren. Eine Deregulation des zugehörigen Gens c-myc ist oft bei Krebs zu
beobachten und bewirkt Zellproliferation. Myc ist bisher nur in sich teilenden Zellen
nachgewiesen worden, nicht jedoch in ruhenden Zellen. Eine ektopische Expression von Myc
reicht in vielen Zellen aus, um die Zellen in einen weiteren Zellzyklus zu zwingen.
Interessanterweise kann Myc ebenfalls proapoptotische wirken. Dabei sind die mitogenen
Eigenschaften nicht von den proapoptotische zu trennen. Als Effektor-Proteine werden vor
allem Cyclin-abhängige-Kinasen gehandelt, aber auch Ornithin-Decarboxylase, Cdc-25 sowie
Lactat-Dehydrogenase A. Die durch Myc induzierte Apoptose kann nicht nur durch Bcl-2
inhibiert werden, sondern auch durch verschiedene antiapoptotische Proteine wie IGF-I in
Fibroblasten oder Interleukin-3 in Myeloidzellen. E1A, ein Onkoprotein aus einem
Adenovirus, wirkt ebenfalls wachstumsfördernd auf Zellen. Tatsächlich fördert E1A auch
Apoptose und muß durch Genprodukte von e1b daran gehindert werden. Auch ein
ungeregelter Eintritt in die S-Phase kann eine Zelle dazu veranlassen, Apoptose zu begehen.
Zum Beispiel kann E2F, ein Mitglied einer Familie von Transkriptionsfaktoren, bei einer
ektopischen Expression den Eintritt in die S-Phase induzieren -auch ohne den Einfluß
weiterer Mitogene. Normalerweise wird E2F von Rb (retinoblastoma protein) gebunden und
inaktiviert. Eine Mutation in einem der beiden Proteine, die eine Interaktion zwischen ihnen
unmöglich macht, führt zu einem ungeregelten, beschleunigten Übergang von der G1 zur S1
Phase. Eine Phosphorylierung von Rb verhindert ebenfalls die Unterdrückung der
Zellproliferation. Diese Phosphorylierung wird durch einen Pfad vermittelt, der Cyclin D,
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Cdk 4 sowie den Cdk-Inhibitor p16ink 4 beinhaltet. Eine Fehlfunktion innerhalb dieses Pfades
scheint bei Krebs weit verbreitet zu sein. Aber auch hier ist der Eintritt in die S1-Phase
normalerweise mit der Induktion von Apoptose verbunden. Daher ist es nicht verwunderlich,
daß Rb das Ziel von viralen Inhibitoren wie Adenovirus-Protein E1A, SV40 und HPV ist. Rb
wird in verschiedenen Geweben vor allem während der Entwicklung exprimiert, darunter im
Nervensystem, der Augenlinse, im Muskelgewebe und in der Leber. Knockout-Mäuse ohne
Rb sterben embryonal an Tag 12-13 und zeigen stark erhöhte Proliferations- und
Apoptoseraten. Rb kann auch durch Caspasen gespalten werden, was eine Voraussetzung für
TNF- und Fas- induzierte Apoptose zu sein scheint.
E1A induziert eine Akkumulation von p53, und die dadurch ausgelöste Apoptose kann durch
zwei weitere virale Proteine gehemmt werden: E1B-Proteine p19 -ein Bcl-2 homologes
Protein- und p55, das p53 inhibiert. Auch bei Myc induzierter Apoptose scheint p53 eine
wichtige Rolle zu spielen, obwohl auch eine von p53 unabhängig induzierte Apoptose duch
Myc dokumentiert wurde. Auch E2F induzierte Apoptose kann durch p53 vermittelt sein.
Allerdings scheint in diesem Fall ein Protein aus der Familie der auslösende Faktor zu sein:
nur E2F-1 löst Apoptose aus, während E2F-1,2,3 mitogen sind.
Proliferation scheint also eng mit Apoptose gekoppelt zu sein, wobei die Entscheidung
zugunsten einer der Möglichkeiten von dem Vorhandensein der entsprechenden
Überlebenssignale abhängt. Verkompliziert wird das System durch Hinweise, daß der Fas-
Signalweg durch z.B. Myc sensitiver wird oder auch durch autokrine Interaktionen induziert
werden kann. Zusätzlich können DNA-schädigende Substanzen und UV-Licht sogar direkt
den CD95-Rezeptor aktivieren (Evan, G. und Littlewood, T., 1998).
Interessanterweise hemmt Bcl-2 die Proliferation, wohingegen Bax die Proliferation fördert.
Bcl-2, das als Onkogen wirken kann, benötigt zur Tumorgenese noch weitere, mutierte
Proteine, die die Proliferationshemmung wieder aufheben: diesen Part kann z.B. Myc
übernehmen. Dies konnte in vitro sowie in entsprechenden transgenen Mäusen gezeigt
werden. Eine Mutation im Tyrosin 28 von Bcl-2 vermag ebenfalls die
proliferationshemmende Wirkung von Bcl-2 aufzuheben und konnte in vielen
fortgeschrittenen Lymphomen gezeigt werden. Genausogut kann jedoch eine Mutation in
einem antiapoptotischen Protein, welche die Funktion hemmt und damit Apoptose verhindert,
Krebs fördern. Bax zum Beispiel ist in einigen gastrointestinalen und in einigen Leukämien
mutiert nachgewiesen worden. Auch beruht der p53-Mechanismus zum Teil auf der
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18
Aktivierung von Bax. Ein Fehlen oder eine Fehlfunktion von Bax hemmt daher auch diesen
wichtigen Sicherheitsmechanismus (Adams, J. M. und Cory, S., 1998).
Eine Interaktion mit FADD, einem wichtigen Bestandteil des CD95-Signalweges, hemmt
ebenfalls die Zellproliferation. Auch das Onkoprotein Ras muß erwähnt werden: Ras kann
zum einen über die Aktivierung des Raf-Map Kinase Signalpfades mitogene Signale geben,
zum anderen sind Ras Proteine an der Weitergabe der Überlebenssignale vom IGF-I-Rezeptor
zu den weiter unten in der Kaskade stehenden Effektoren PI-3-Kinase, Akt und Bad beteiligt.
In nicht transformierten Zellen jedoch tritt genau das Gegenteil ein: Hemmung der
Zellproliferation begleitet von Apoptose. Es müssen also mehrere Mutationen
zusammenkommen, damit Apoptose unterdrückt und Zellproliferation gefördert wird.
Degradationsphase
Ist in einer Zelle die Entscheidung zugunsten von Apoptose gefallen, so steht ein ganzes
Arsenal von Proteinen bereit, diese Entscheidung auch umzusetzen. Die wichtigsten werden
im Folgenden beschrieben. Der gesamte Vorgang bis zur Auflösung der Zelle in apoptotische
Körperchen kann sehr schnell –in einigen Fällen in 30-60 min- erfolgen.
Caspasen Caspasen (Cystein aspartatic acid proteases) sind Proteasen, von denen bislang in Vertebraten
15 verschiedene identifiziert worden sind. Beim Menschen sind mehr als 12 verschiedene
Caspasen beschrieben. Die 15 Caspasen in Vertebraten werden in 4 Effektor-Caspasen und 11
Initiator-Caspasen mit der entsprechenden Prodomäne unterteilt. Viele wichtige Kriterien, die
eine Zelle als apoptotisch charakterisieren, sind durch die proteolytische Aktivität von
Caspasen verursacht. Die weiter oben beschriebene Desintegration der Kernmembran ist u.a.
Folge der Lamin-Spaltung und ist für die Schrumpfung des Kerns verantwortlich. Auch der
Verlust der äußeren Form der Zelle ist auf Proteolyse von Skelettelementen wie Fodrin oder
Gelsolin durch Caspasen zu erklären. Und die Bläschenbildung der äußeren Zellmembran
wird durch Caspase-aktiviertes PAK-2 (aus der Familie der p-21 aktivierten Kinasen)
vermittelt. Die Wichtigkeit der Caspasen wird auch durch die Vielzahl von Substraten
abgebildet: über 100 sind beschrieben. Oft ist das Substrat für überlebensnotwendige Prozesse
der Zelle wichtig oder die Caspase-Aktivität verstärkt proapoptotische Vorgänge und inhibiert
antiapoptotische Proteine.
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Der Aufbau der Caspasen ist während der Evolution konserviert worden, so daß sich
Caspasen aus Säugern kaum von denen aus Würmern unterscheiden. Die Caspasen liegen in
der Zelle zunächst als Zymogene vor, also als inaktive Proenzyme, und sind 30-50 kD groß.
Diese inaktiven Procaspasen bestehen aus drei Domänen: einer N-terminalen Prodomäne, und
den Domänen p20 und p10, die auch im aktiven Enzym vorliegen. Die Länge und die
Aminosäure-Sequenz der N-terminalen Domäne kann stark variieren. Alle bis jetzt
untersuchten aktiven Enzyme liegen als Heterotetramer vor, das jeweils zwei p10 und p20
Domänen enthält .
Die Aktivierung kann über verschiedene Mechanismen laufen. Caspase-8 (genau wie
Caspase-2 oder auch CED-3 aus C.elegans = Initiator-Caspasen) kann z.B. durch das Binden
an einer Todesdomäne der entsprechenden Rezeptoren wie Fas oder TNF-α und die damit
induzierte Nähe („induced proximity“) aktiviert werden. Dabei werden mehrere Zymogene zu
den Adaptermolekülen rekrutiert und die intrinsische, sehr geringe Protease-Aktivität reicht
aus, sich gegenseitig durch Spaltung zu aktivieren. Diese Spaltungsaktivierung bedeutet, daß
eine geringe Anzahl aktivierter Caspasen weitere Caspasen aktivieren kann, um so in einer
Verstärkungsschleife schnell und viel proteolytische Aktivität zu erreichen. Wahrscheinlich
existieren aber noch weitere Faktoren, die die Aktivierung in diesen Fällen steuern. Caspase-8
und Caspase-10 enthalten Todes-Effektor-Domänen (DED); Caspase-2 und Caspase-9
enthalten hingegen eine sog. CARD (Caspase recruitment domain). Beide Domänen haben
wenig Sequenzähnlichkeiten, falten sich jedoch in sehr ähnliche Strukturen, die auch von den
Todesdomänen widergespiegelt werden. Die sechs antiparallelen α-Helizes bilden Strukturen,
die Protein-Protein Wechselwirkungen ermöglichen. Die Oberfläche der Todes-Adapter-
Proteine ermöglicht insbesondere intrafamiliäre Bindungen wie z.B. DED/DED, aber auch
weitere Bindungen mit anderen Proteinen sind nicht ausgeschlossen.
Die Caspasen mit einer kurzen Prodomäne werden durch die Spaltung des Moleküls zwischen
P10 und p20 und teilweise auch zwischen p10 und der Prodomäne aktiviert. Die Spaltstellen
bestehen aus einem Aspartat und weiteren spezifischen Aminosäuren; zum Teil ist auch die
Tertiästruktur wichtig. Dies eröffnet die Möglichkeit der Aktivierung durch andere, schon
aktive Caspasen bzw. den sehr schwach aktiven Procaspasen. Diese Verstärkungskaskade
wird vor allem von den Effektor-Caspasen-3, -6 und -7 benutzt. Caspase-9 hingegen wird
durch Spaltung kaum aktiviert. Eine hohe proteolytische Aktivität kann hingegen durch die
Bindung an einen Kofaktor, nämlich Apaf-1 und einen weiteren Faktor, das Cytochrom-C
erreicht werden. Dabei ändert Procaspase-9 die Konformation und wird aktiviert. Der
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Komplex aus diesen drei Proteinen wird auch Apoptosom genannt. Es ist nicht
auszuschließen, daß noch weitere Proteine an dem Komplex beteiligt sind.
Die proteolytische Aktivität der Caspasen beruht auf einem Cysteinrest im aktiven Zentrum.
Die Substratschnittstelle wird von einem Aspartat gebildet, an das aminoterminal noch vier
wichtige Aminosäuren anschließen. Diese sind spezifisch für die jeweilige Caspase. Dazu
kommen zum Teil noch sekundäre und tertiäre Strukturen, welche die Spaltstelle zusätzlich
charakterisieren. Aus der hohen Spezifität resultiert, daß viele Zielproteine nur an einer oder
wenigen Stellen geschnitten werden und so ihrer Funktion beraubt werden. Dies ist bei dem
DNA-Reparaturenzym PARP (Poly-ADP-Ribose Polymerase) der Fall oder bei dem
Kernmembranprotein Lamin. Auch eine Aktivierung von Proteinen durch die Spaltung ist
möglich. Zum einen kann dies auf der Abspaltung eines Protein-Inhibitors beruhen; z.B. die
Abspaltung von ICAD von CAD (Inhibitor of Caspase activated DNAse, auch DFF45) durch
Caspase-3. Dieser Inhibitor verhindert die Aktivierung der DNAse und damit die
Kondensation der DNA. Zum anderen ist die Abtrennung einer inhibitorischen Domäne
möglich, wie dies bei der gegenseitigen Aktivierung der Caspasen der Fall ist. In einigen
Fällen kann das abgespaltene Teilstück sogar die Aktivität des Ursprungsproteins hemmen, so
z.B. bei Bcl-2 oder Bcl-XL.
Die Reorganisation der Zellstruktur wird durch Beeinflussung verschiedener Proteine
ermöglicht, die Regulationsfunktion oder strukturgebende Funktion beim Zytoskelett haben.
Beispiele sind hier Gelsolin, das einen regulierten Abbau von Aktin ermöglicht. Wird
Gelsolin durch Caspase gespalten, wird Gelsolin konstitutiv aktiv -spaltet also Aktin ständig.
Auch FAK (focal adhesion kinase) und PAK2 (p21-activated Kinase) können in diesem
Zusammenhang genannt werden. Diese werden ebenfalls in ihrer Funktion dereguliert.
Enzyme, die der DNA-Reparatur dienen, wie DNA-Fragmentation-PKcs, sind ebenfalls
Substrate von Caspasen. U1-70K, ein Enzym zum Spleißen von mRNA, wird ebenso von
Caspasen beeinflußt wie replication factor c, ein wichtiger Faktor für DNA-Replikation
(Hengartner, M. O., 2000) (Thornberry, N. A. und Lazebnik, Y., 1998; Kumar, S. und
Colussi, P. A., 1999; Nicholson, D. W. und Thornberry, N. A., 1997; Song, Z. und Steller, H.,
1999; Villa, P. et al., 1997; Thornberry, N. A. und Lazebnik, Y., 1998).
Biochemie der Bcl-2 Proteine Eine zweite wichtige Gruppe von Proteinen, die bei der Apoptose eine Rolle spielen, sind die
Mitglieder der Bcl-2-Familie.
EINLEITUNG 21
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In Vertebraten sind bislang 20 Bcl-2 Proteine in einer noch größeren Anzahl von
Spleißvarianten entdeckt worden. Zu diesen addieren sich noch eine Anzahl viraler Proteine
mit ähnlichen Eigenschaften. Die Mitglieder der Bcl-2 Familie werden in 3 Gruppen
unterteilt, wobei die Mitglieder der ersten Gruppe antiapoptotische Wirkung besitzen. Die
Proteine der Gruppe II und III hingegen fördern Apoptose. Aufgrund der Möglichkeit zur
Bildung von Homodimeren sowie Heterodimeren kann eine pro- oder antiapoptotische
Wirkung erreicht werden. Dabei scheint eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten
vorhanden zu sein. Wichtig für die Wirkung ist das Verhältnis von pro- zu antiapoptotischen
Proteinen: Bei einem Übergewicht von antiapoptotischen Proteinen ist die Zelle weitgehend
vor dem programmierten Zelltod geschützt. Sind hingegen proapoptotische Proteine im
Übergewicht, kann Apoptose eingeleitet werden. Dabei scheint auch die Verteilung innerhalb
der Zelle eine Rolle zu spielen: antiapoptotische Proteine können die Freisetzung von
proapoptotischen Faktoren aus den Mitochondrien zumindest in Säugern verhindern.
Alle Mitglieder der Bcl-2-Familie besitzen mindestens eine zu Bcl-2 homologe BH1,2,3- oder
BH4-Domäne (Bcl-2 homology domain). Die meisten Proteine, die antiapoptotisch wirken,
haben mindestens die Domänen BH1 und BH2, diejenigen, die Bcl-2 am ähnlichsten sind,
besitzen auch noch BH3 und BH4. Demgegenüber finden sich bei den proapoptotischen
Proteinen meistens weniger Gemeinsamkeiten zu Bcl-2. Die proapoptotischen Proteine der
Bax Unterfamilie Bax, Bak und Bok besitzen noch die Domänen BH1, BH2 und BH3.
Hingegen wurde bei der Unterfamilie BH 3, zu der die restlichen sieben proapoptotischen
Proteine bei Säugern gehören, nur die relativ kurze, 9-16 Aminosäuren lange BH 3 Domäne
gefunden. Diese BH 3 Proteine unterscheiden sich auch untereinander sehr stark und zeigen
keinerlei Ähnlichkeit zu anderen bekannten Proteinen.
Die Domänen BH1-3 sind wichtig für die Funktionsweise der Bcl-2-Proteine. Sowohl pro- als
auch antiapoptotische Mitglieder der Bcl-2-Familie können Homo- und Heterodimere bilden.
Die Interaktion findet in einer hydrophoben Spalte statt, die von den Domänen BH1, BH2 und
BH3 gebildet werden, in welche die amphipathische α-Helix der Domäne BH3 binden kann.
Diese bei Bcl-xL gefundene Konformation kann bei Proteinen der Bax-Unterfamilie auch
geändert sein. Eine Alternative ist die Konformation mit einer nach außen gedrehten BH3
α-Helix, eine Form, die das Binden in die Tasche antiapoptotischer Proteine erlaubt. Diese
Heterodimerisation ist für eine proapoptotische Funktion der Proteine der BH3-Unterfamilie
von Bedeutung. Familienmitglieder der Bax-Gruppe scheinen zusätzlich einen anderen
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apoptotischen Pfad einschlagen zu können. Welche pro- und antiapoptotischen Protein
aneinander binden ist nicht endgültig geklärt. Grundsätzlich läßt sich jedoch sagen, daß eine
Bindung von Gruppenmitgliedern der BH3- und der Bax-Unterfamilie an antiapoptotische
Proteine proapoptotisch wirkt.
Bcl-2 selbst ist an der Außenseite der Mitochondrienmembran, des endoplasmatischen
Reticulums sowie der Kernmembran lokalisiert. In den Membranen dienen wahrscheinlich
spezifische Proteine als Andockstelle. Allerdings ist die antiapoptotische Wirkung von Bcl-2
nicht auf das Vorhandensein des hydrophoben Membranankers gekoppelt. Ebenso scheinen
nicht alle Bcl-2-Proteine, obwohl sie einen Membrananker besitzen, ständig an Membranen
gebunden zu sein. Beispiele sind Bcl-xL und Bax, die zumindest teilweise zytoplasmatisch
lokalisiert sind.
An Mechanismen für die antiapoptotischen Proteine kommt z.B. die Blockade der
Aktivierung von Caspase-9 zusammen mit Apaf-1 in Frage: Bcl-xL kann mit seiner BH 4
Domäne an das C-terminale Ende von Apaf-1 binden. Vermutlich wird die Bindung von
Caspase-9 an die N-terminale CARD (Caspase recruitment domain) von Apaf-1 dadurch
unterbunden. Diese Blockade von Apaf-1 durch Bcl-2 könnte dann durch proapoptotische
Proteine wie Bik aufgehoben werden. Zudem ist die Unterstützung der Integrität von
Organellen -vor allem der Mitochondrien- eine wichtige Aufgabe von Βcl-2-Proteinen. Bcl-2
kann z.B. auf noch nicht völlig geklärte Weise die Freisetzung von proapoptotischem
Cytochrom C unterbinden. Zusätzlich kann Bcl-2 auch bei schon freigesetztem Cytochrom C
Apoptose verhindern. Wie weiter oben schon erwähnt, können Bcl-xL, Bcl-2 und Bax in
künstlichen Membranen Poren bilden, wobei die von Bcl-xL und Bcl-2 sogar bestimmte
Eigenschaften wie Ionen-Selektivität besitzen. Selbst in Hefe, wo normalerweise keine
Proteine der Bcl-2-Familie vorkommen, können Mitochondrien durch die überexprimierten
Proteine Bax und Bak zerstört werden; Bcl-2 hingegen kann diese Zerstörung verhindern.
Apoptose kann in Säugerzellen durch diesen Mechanismus sogar bei Anwesenheit eines
Caspase-Inhibitors stattfinden. Dabei finden sich dann auch typische Merkmale wie DNA-
Fragmentation oder Membranveränderungen. Wahrscheinlich wird die Apoptose durch
Einflußnahme auf die PTP (permeability transition pore) oder durch direkte Porenbildung
umgesetzt. Eine Regulation kann z. B. durch Cytokin-vermittelte Induktion antiapoptotischer
bcl-2-Gene erfolgen. Bax wird in einigen Zellarten durch p53 induziert. Bad kann
phosphoryliert werden und dann von 14-3-3-Proteinen im Zytosol gebunden und damit
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inaktiviert werden. Für Bcl-2 konnte gezeigt werden, daß eine Phosphorylierung einiger
Aminosäurereste das Protein inaktiviert. Dieses Signal wird vermutlich von JNK oder p38
vermittelt. Wichtig ist auch, daß Caspasen nicht nur antiapoptotische Bcl-2 Proteine
inaktivieren können, sondern daß die Spaltprodukte zudem proapoptotisch wirken können.
Der Schutz, den antiapoptotische Bcl-2-Proteine vermitteln können, erstreckt sich auf
Schädigungen durch UV-Licht, Gamma-Strahlung, Cytokin-Entzug und Exposition
gegenüber Dexamethason, Staurosporin und anderer toxischer Substanzen. Dagegen umgeht
der CD95-Signalweg größtenteils und nur mit wenigen Ausnahmen den durch Bcl-2
blockierbaren Schritt. Erschwert wird die Aufklärung der Funktion durch eine zeitlich sowie
örtlich unterschiedliche Expression der Bcl-2-Proteine. Beispielsweise. können sich Bcl-2
Knockout- Mäuse normal entwickeln, zeigen jedoch später in Neuronen erhöhte Apoptose.
Bcl-xL Knockout-Mäuse sterben sehr früh durch massive Apoptose neuronaler Zellen, die
wahrscheinlich von Bax vermittelt wird. Dies legen Kreuzungversuche mit Bax-Knockout-
Mäusen nahe (Adams, J. M. und Cory, S., 1998; Kroemer, G., 1997; Reed, J. C., 1997; Diaz,
J.-L. et al., 1997; Thornberry, N. A. und Lazebnik, Y., 1998; Meier, P. et al., 2000b;
Hengartner, M. O., 2000).
Zelluläre Inhibitoren der Apoptose In Säugern aber auch in Drosophila existieren zelluläre Inhibitoren der Apoptose (IAP;
inhibitors of apoptosis proteins). Diese dienen dazu, eine fälschlicherweise angestoßene
Apoptose zu stoppen. Aufgrund der starken Selbstamplifikation ist solch ein
Regelmechanismus erforderlich, da sonst schon nur. ein Molekül aktivierter Caspase zum
Zelluntergang führen könnte. Um einen vollständigen Zelluntergang zu sichern, sobald er
wirklich nötig ist, werden diese inhibitorischen Proteine z.B. durch Smac in ihrer Funktion
inhibiert. In Drosophila existieren weitere Beispiele für proapoptotische Proteine, die IAPs
hemmen: Reaper, Hid und Grim. Die Aktivierung von Caspase-8 kann wahrscheinlich durch
ein der Caspase-8 homologes Protein, dem c-Flip (cellular FLICE inhibitory protein) durch
Blockade von FADD gehemmt werden. FLIP kann an FADD binden, hat jedoch im
Gegensatz zu Procaspase-8 keine proteolytischen Fähigkeiten. Die Rolle von c-FLIP ist zur
Zeit noch unklar. Für ein virales Protein v-Flip sind antiapoptotische Wirkungen sicher
nachgewiesen; c-FLIP hat in einigen Modellen allerdings auch proapoptotische
Eigenschaften. Auch ARC (apoptosis repressor with Caspase-recruitment domain) konkurriert
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wahrscheinlich um die entsprechenden Bindestellen und verhindert so eine Aktivierung von
Caspasen.
An viralen Inhibitoren der Apoptose sind bisher drei bekannt: CrmA, p35 und die Familie der
IAP. CrmA aus dem Kuhpocken-Virus, ein Protein aus der Serpin-Familie, ist ein guter
Inhibitor verschiedener Initiator-Caspasen. Über p35 weiß man lediglich, daß bisher kein
homologes Protein entdeckt wurde. Inhibitoren der IAP-Familie sind die einzigen, die auch
bei Säugern bekannt sind. Bei der Wirkungsweise deuten erste Versuche auf die Hemmung
von Effektor-Caspasen wie Caspase-3 oder -7 hin -wahrscheinlich über die Inhibierung der
Aktivierung oder die Einschränkung des Feed-Back-Mechanismus (Hengartner, M. O., 2000;
Krammer, P. H., 2000; Thornberry, N. A. und Lazebnik, Y., 1998).
Abbau der DNA und des Nucleus Eines der wichtigsten Substrate, das bei Apoptose abgebaut wird, ist die DNA. Ohne DNA
kann keine Zelle langfristig überleben. Der Abbau des Kerns und der DNA ist nach Färbung
auch morphologisch zu erkennen. Ein wichtiges Phänomen ist Pyknosis, bei der DNA
kondensiert und mit Proteinen aggregiert. Ein weiteres Phänomen wird Karyorrhexis genannt
und beschreibt die Fragmentierung des Nucleus. Schließlich wird die DNA in verschieden
große Stücke fragmentiert. Letztlich dienen diese Ereignisse dazu, die Induktion des Zelltodes
unwiderruflich zu machen und die Aufnahme und Verwertung des Zellinhaltes durch andere
Zellen zu vereinfachen.
Inzwischen sind einige der Enzyme identifiziert, die Karyorrhexis und Pyknosis umsetzen.
Ein Beispiel ist CAD (Caspase activated DNAse, auch DFF40), die durch die Caspase-3 oder
-7 vermittelte Spaltung ihres Inhibitors ICAD aktiviert wird. CAD kann dann in den Nucleus
translozieren und dort DNA in die typischen 200 Basenpaar langen (oder ein mehrfaches
davon) Stücke schneiden. Weitere Beispiele sind L-DNAse II, die ebenfalls nach Aktivierung
in den Nucleus wandert und dort die DNA in Nucleosomen schneidet. L-DNAse II scheint
durch Ansäuerung des Zytosols aktiviert zu werden und entsteht aus einem Serpin ähnlichen
Protease-Inhibitor (Leukozyten Elastase Inhibitor) durch eine posttranslationale Modifikation.
Weitere Faktoren, die Einfluß auf die DNA-Integrität nehmen, sind AIF (Apoptosis inducing
factor), der aus Mitochondrien freigesetzt wird und DNA-Fragmente >50kD in der Peripherie
des Nucleus erzeugt, Cathepsin B und DNAse I, die Nucleosomen produzieren, DNAse II, die
DNA-Fragmente ≥50 kb produziert und evtl. Cyclophiline, die allerdings keine direkte DNA-
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Fragmentation umsetzen. Karyorrhexie wird u.a. von prozessiertem Acinus durchgeführt,
einem Protein, das von Caspase-3 und einem noch unbekannten Protein durch Proteolyse
aktiviert wird. Das entstehende Proteinfragment kann zusammen mit anderen, noch nicht
identifizierten Faktoren Chromatin-Kondensation bewirken, und zwar auch ohne gleichzeitige
DNAse-Aktivität anderer Enzyme (Zamzami, N. und Kroemer, G., 1999; Enari, M. et al.,
1998; Wyllie, A., 1998; Sahara, S. et al., 1999).
Aufnahme der Zellreste und apoptotischer Körperchen Letztendlich werden die Reste der Zellen, die Apoptose begangen haben, von anderen Zellen
aufgenommen. Dies können umliegende, gleichartige Zellen oder aber Phagozyten sein. Dazu
versehen sich die apoptotischen Zellen oder die inzwischen gebildeten kleineren
membranumhüllten Vesikel mit Signalmolekülen auf der Außenseite der Membran. Das
bekannteste Signalmolekül dieser Art ist Phosphatidylserin. Dieser Membranbestandteil ist im
Normalfall nur auf der Membraninnenseite lokalisiert, wird jedoch im Verlauf der Apoptose
sehr früh auf der Membranaußenseite präsentiert. Dazu muß zum einen eine Mg2+-abhängige
Aminophospholipid-Translokase gehemmt werden, zum anderen muß dazu eine Scramblase
durch Phosphorylierung und hohe Kalzium-Konzentrationen aktiviert werden. Auch
Veränderungen bei Zelloberflächen-Zuckern, die durch Lektine von Phagozyten erkannt
werden, sind relativ gut bekannte Marker. Weitere „friß mich“-Signale, die allerdings nicht so
gut wie Phosphatidylserin untersucht sind, sind z. B. C1q, einer von drei Bestandteilen (neben
C1r und C1s) des ersten Strukturkomplexes des Komplements. Weitere Kandidaten, die eine
Brückenfunktion bei der Attraktion und Bindung von Phagozyten spielen können, sind iC3b,
β2 Glycoprotein I, Thrombospondin und ICAM-3 (intercellular adhesion molecule-3). Auf
Seiten der phagozytierenden Zelle, sei es ein Makrophage oder eine „normale“ Zelle, sind
z.B. bei C.elegans CED-2, -5, -10 bei dem erforderlichen Umbau des Zytoskeletts zum
Umschließen der apoptotischen Zelle beteiligt. Bei Säugern sind es die homologen Proteine
CrKII, DOCK180 und Rac. Sowohl in der aufnehmenden als auch in der apoptotischen Zelle
sind bei C. elegans CED-7 und bei Mammalia ABC1 bei der Reorganisation der Membran
involviert. Als Erkennungssignal exponiert auch die aufnehmende Zelle Phosphatidylserin.
Normalerweise sekretieren Makrophagen nach Aufnahme von Partikeln in der Größe von
Bakterien Stoffe, die eine proinflammatorische Wirkung haben. Nicht so jedoch bei der
Aufnahme von apoptotischen Zellen. Im Gegenteil: die Sekretion von proinflammatorischen
Proteinen wie TNF-α wird sogar aktiv gehemmt. Dabei kann das antiinflammatorische und
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immunsupressive Cytokin TGF-β1 (transforming growth factor β1) sekretiert werden. Sobald
jedoch apoptotische Zellen zu sekundärer Nekrose übergehen, induzieren sie bei Aufnahme
durch Makrophagen wieder die proinflammatorische Antwort. Eine Fehlfunktion dieser
Inflammationssteuerung kann in Krankheiten münden: bei der Krankheit „Systemische Lupus
Erythematosus“ wird der apoptotische Marker Phosphatidylserin mit anti-Phospholipid
Autoantikörpern „getarnt“. Dadurch wird die Zelle von Makrophagen nicht als apoptotisch
erkannt, und durch Bindung an den Fc-Rezeptor wird eine inflammatorische Antwort mit
Ausschüttung von TNF-alpha ausgelöst. Allerdings kann in Geweben, die umgebaut werden,
von Makrophagen auch das Apoptose auslösende Zytokin CD95 (Apo-1, Fas) abgesondert
werden (Savill, J. und Fadok, V., 2000) (Fadok, V. A. et al., 1992).
Apoptose bei neurodegenerativen Erkrankungen Bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen vermutet man eine Beteiligung des Arsenals
von apoptotischen Proteinen. Ob Apoptose den Zelltod verursacht oder ob nur „parallel“ zu
der eigentlichen Todesursache der Zellen Teile des apoptotischen Programms durchgeführt
werden, ist relativ unklar. Im Folgenden werden einige wichtige neurodegenerative
Erkrankungen kurz charakterisiert, bei denen möglicherweise Apoptose eine Rolle spielt.
Amyotrophe Lateralsklerose Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine Krankheit, bei der fortschreitend Motoneurone im
Spinaltrakt und im Hirn degenerieren. In familiären Formen konnten Mutationen im Gen für
SOD-1 (Superoxide dismutase) detektiert werden. Im Mausmodell kann durch Expression
entsprechend mutierter Formen ebenfalls die Degeneration von Motoneuronen induziert
werden. Warum die veränderte Form der SOD-1 toxisch für Neurone ist, ist nicht genau
geklärt. Es bilden sich jedoch aus SOD-1mut intrazelluläre Aggregate, die an entsprechende
Formen bei Alzheimer und Huntington erinnern. Zudem induziert die mutierte Form
oxidativen Streß.
Apoptose wird auch mit ALS in Verbindung gebracht: SOD-1mut induziert in neuronalen
Zellinien Apoptose, was von der zusätzlichen Überexpression von Bcl-2 gehemmt wird.
Sowohl bei Patienten als auch bei SOD-1mut transgenen Mäusen konnte aktivierte Caspase-1
und Caspase-3 in den Spinalganglien nachgewiesen werden. Zudem verlangsamte in den
transgenen Mäusen ein Caspase-1 Inhibitor den Krankheitsverlauf. Caspase-1 kann vor allem
inflammatorische Antworten über die Aktivierung von Interleukin-1 hervorrufen; jedoch ist
auch die proteolytische Aktivierung von Caspase-3 möglich (Yuan, J. und Yankner, B. A.,
2000; Sathasivam, S. et al., 2001).
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Huntington´s Disease Chorea Huntington, eine Krankheit die beim adulten Menschen auftritt, ist durch selektiven
Verlust bestimmter neuronaler Populationen gekennzeichnet. Dabei ist insbesondere das
Striatum betroffen und zwar besonders GABA- und Enekephalin-haltige mittelgroße
Pyramidenzellen; Afferenzen zum Striatum und durchlaufende Fasern bleiben größtenteils
ausgespart (Petersen, A. et al., 2000). Ursache ist eine Mutation im Gen von Huntingtin, die
zu einer erhöhten Anzahl von aufeinanderfolgenden Glutamin-Wiederholungen in diesem
Protein führt. Eine Anzahl von über 40 Glutamin-Wiederholungen -bis 35 Wiederholungen
sind normal- führt unweigerlich zu der auch Veitstanz genannten Krankheit. Die Anzahl der
Wiederholungen bestimmt den Zeitpunkt des Krankheitsbeginns und die Schwere des
Verlaufs. Charakterisiert ist die Krankheit durch schnelle, unwillkürliche Kontraktion
einzelner, wechselnder Muskeln oder Muskelgruppen, durch Sprachstörungen und schließlich
zunehmende Demenz und Tod.
Auch bei dieser Krankheit können sich aus dem mutierten Protein Ablagerungen bilden, die in
diesem Fall jedoch im Zellkern als ubiquitinierte Form vorliegen. Je länger die
Polyglutaminkette ist, desto mehr Huntingtin wird im Kern abgelagert. Man vermutet, daß ein
unzureichender Abbau durch das Proteasom mit verantwortlich für das abgelagerte Protein ist.
Die Aggregation von Proteinen mit verlängerten Polyglutaminketten ist auch in vitro zu
beobachten und führt zu Fibrillen ähnlich den von β-Amyloid gebildeten. In vivo wurde bei
transgenen Mäusen, die Huntingtin mit verlängerter Glutamin-Kette exprimieren,
neurologische Schäden zur gleichen Zeit beobachtet, zu der Ablagerungen in den Zellen
auftraten. Allerdings wurde auch beobachtet, daß die Verhinderung der Ablagerungen
neuronale Apoptose verstärkt. Weitere Untersuchungen zeigen jedoch, daß offensichtlich vor
allem die kleinen Aggregate des mutierten Proteins Apoptose-induzierend sind. Die Apoptose
wird in diesem Fall durch FADD und Caspase-8 vermittelt. Eine Theorie geht von der
Bildung toxischer Fragmente aus Huntingtin durch proteolytische Caspasen-Aktivität aus. Die
Bildung von Huntingtin-Abbauprodukten wird verhindert und Beginn und Fortschreiten der
Krankheit verzögert, wenn ein Breitspektrum-Caspase-Inhibitor verabreicht oder eine
dominant negative Mutante der Caspase-1 vorhanden ist. Obwohl also einige Fakten für eine
Mitwirkung von Apoptose sprechen, ist dies nicht sicher. Die Beobachtung, daß motorische
Störungen bereits bei Patienten auftreten, bei denen noch keine Anzeichen einer Atrophie des
Striatums zu entdecken ist, spricht dagegen. Zudem existieren Mausmodelle, die Symptome
motorischer Störungen zeigen, obwohl keine Apoptose im Hirn nachzuweisen ist. Auch führte
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das Beenden der Expression von mutiertem Huntingtin im Mäuse-Modell zu einer
Verbesserung der Symptome.
Der pathogene Mechanismus von Huntington ist zur Zeit noch ungeklärt. Es werden mehrere
Mechanismen diskutiert: Toxizität durch exzitatorische Übererregung mit Glutamat,
oxidativer Streß durch erhöhte Produktion von Radikalen oder/und erniedrigte antioxidative
Kapazität der Zelle, eine Fehlfunktion der Mitochondrien und schließlich Apoptose. Natürlich
können diese Mechanismen auch zusammenhängen oder sich gegenseitig bedingen (Petersen,
A. et al., 2000; Yuan, J. und Yankner, B. A., 2000; Reddy, P. H. et al., 1999).
Alzheimer´s Disease Alzheimer ist eine neurodegenerative Erkrankung, in deren Verlauf Neurone in bestimmten
Hirnarealen absterben. Dieser Verlust ist mit Gedächtnisstörungen verbunden. Meist tritt die
Krankheit im Alter und sporadisch, d.h. ohne eine genetische Korrelation auf. Ein geringer
Anteil der Patienten ist jedoch genetisch vorbelastet. Mutationen in den Genen für Presenilin-
1 oder -2 oder APP (Amyloid precursor protein) können dann meist früh einsetzende Formen
von Alzheimer verursachen.
Gekennzeichnet ist die Krankheit durch den Verlust von Synapsen, die Anwesenheit von
Neurofibrillen (NFT, neurofibrilläre tangles) und die Ablagerung von sogenannten senilen
Plaques. Die NFTs bestehen u.a. aus hyperphosphoryliertem mikrotubulärem Tau. Die
Plaques hingegen bestehen aus einem Komplex, der im Kern β-amyloid Protein (Aβ) enthält.
Plaques sind umgeben von aktivierten Mikroglia und Astrozyten. Die Ablagerung von
Plaques erfolgt vor der Formationen von Tau-positiven Filamenten in NFT´s. β-amyloid
entsteht aus dem Protein APP. Dieses wird in zwei Schritten zu A-β prozessiert: zunächst
wird das Amyloid-Vorläufer-Protein durch die β-Sekretase bei Met671 geschnitten, der zweite
Schnitt erfolgt durch die γ-Sekretase am C-terminalen Ende. Dabei entstehen die 40-43 AS
großen Bruchstücke, die dann sekretiert werden und die Plaques bilden. Dabei überwiegt der
Anteil von Aβ-42, welches auch schneller Aggregate ausbildet. Aβ kann oxidativen Streß
induzieren: die Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen (IL-1, IL-6) durch Mikroglia
wird angeregt und deren Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen
species) oder TNF-α kann verstärkt werden. Zusätzlich wird die Bildung von
Wasserstoffperoxid in einer SOD- (super oxide dismutase) bzw. Cu2+/Zn2+- abhängigen
Weise erhöht. Durch die Oxidation von Lipiden kann die Membran der Zelle geschädigt
werden.
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Die Bildung von hyperphosphoryliertem Tau ist eng verbunden mit oxidativem Stress, der
auch durch die Toxizität von Aβ entsteht. Vermittelt wird er durch den MAP-Kinase-Weg und
durch die Aktivierung von NFκB. In vitro wird Tau durch eine Vielzahl von Kinasen
phosphoryliert: CaM-KinaseII, Kasein-Kinase, PKA, ERK2 und GSK3. Ein weiterer
Mechanismus ist die Phosphorylierung von Tau durch die cdk5-Kinase und ihren
neuronenspezifischen Aktivator p35. Zusätzlich kann Calpain, eine Kalzium-aktivierte
Protease, p35 spalten und bewirkt damit die Anreicherung des entstehenden p25. Dieser
Mechanismus ist in kortikalen Neuronen durch Aβ induzierbar. Die Konsequenz aus der
Hyperphosphorylierung von Tau ist die Reduzierung der Fähigkeit, Mikrotubuli zu binden
und beim Zusammenbau zu unterstützen. Daraus resultiert ein destabilisiertes Netzwerk aus
Mikrotubuli, behinderter axonaler Transport und die Bildung von NFT. Der Abbau von
hyperphosphoryliertem Tau durch z.B. Calpain ist ebenfalls gestört. Eine oxidierende
Umgebung trägt neben der Hyperphosphorylierung ebenfalls zur gesteigerten
Selbstaggregation von Tau bei. Aggregiertes Tau wird jedoch schlechter abgebaut als nicht
aggregiertes Tau. Eine oxidierende Umgebung fördert auch die nichtenzymatische
Glykosilierung von Tau, die wiederum negativen Einfluß auf die Mikrotubuli-Bindefähigkeit
von Tau hat. Schließlich wird auch der Abbau von Proteinen durch das Proteasom durch
oxidatives cross-linking behindert. Für viele neurodegenerative Erkrankungen ist eine
Anreicherung von Ubiquitin, dem Abbau-Marker für das Proteasom, beschrieben worden.
In primären neuronalen Kulturen vermag Aβ (25-35) Apoptose auszulösen und Caspase-3 zu
aktivieren (Harada, J. und Sugimoto, M., 1999). In drei verschiedenen Zellkultursystemen –
hippocampale Neurone, Neurone des sympathischen Systems und in PC12-Zellen-
verursachte die Inkubation mit Aβ(1-42) Apoptose, die Caspase-2 vermittelt war. Inhibierung
von Caspase-2 durch den Breitspektrum Caspase-Inhibitor ZVAD-fmk oder durch Antisense-
Oligonukleotide verhinderte den Zelltod. Zellen, in denen Caspase-2 deletiert war, waren
völlig resistent gegen Aβ-induzierten Zelltod (Troy, C. M. et al., 2000; Barinaga, M., 1998a;
Cassarino, D. S. und Bennett, J. P. J., 1999).
Parkinson´s Disease
Parkinson´s Krankheit ist eine der häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen des mittleren
und späten Lebensalters. Dabei tritt eine Degeneration von dopaminergen Neuronen in der
pars compacta in der substantia nigra auf. Diese Neuronen projizieren u.a. auf das Striatum
(Neostriatum = nucleus caudatus und putamen). Der Spiegel von Dopamin fällt in den
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betroffenen zwei Kernen der Basalganglien. Neben Muskel-Rigidität sind Tremor und
Bradykinesien die wichtigsten Symptome. Während die Krankheit zuerst von James
Parkinson 1817 entdeckt wurde, beschrieb Lewy 1912 zum ersten mal die typischen
pathologischen Ablagerungen in Gehirnen erkrankter Patienten. Diese werden als Lewy-
bodies bezeichnet und bestehen zu großen Teilen aus α-Synuclein. Neben dem Vorkommen in
Lewy-Körperchen sind auch Mutationen in dem entsprechenden Gen entdeckt worden, die
den Träger für eine familiäre, vererbbare Form der Krankheit prädisponieren. Auch das
Protein Parkin kann bei einer Mutationen oder Deletion eine familiär vererbbare, juvenile und
autosomal-rezessive Parkinson-Krankheit auslösen; allerdings treten bei dieser Variante keine
Lewy-bodies auf. Wenngleich ein Einfluß der genannten Mutationen nicht bestreitbar ist,
scheint der Großteil der Patienten sporadisch zu erkranken. In diesen Fällen werden neben
genetischen vor allem Umwelteinflüsse verantwortlich gemacht. Die Entdeckung des Toxins
MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin), das ein von der idiopathischen
Krankheit nicht unterscheidbares Parkinson-Syndrom hervorruft, hat diese Theorie an Einfluß
gewinnen lassen.
Es gibt auch bei Parkinson einige Hinweise, nach denen Apoptose beim Zelluntergang eine
Rolle spielt. Färbungen mit einer kombinierten Methode zeigten DNA-Fragmentation und
Chromatin-Kondensation in Zellen der betroffenen Areale. In einigen Parkinson-Modellen in
Tieren mit MPTP oder 6-OHDA haben zudem antiapoptotische Substanzen wie neurotrophe
Faktoren (BDNF, bFGF, neurotrophin-3, GDNF) den Verlust von dopaminergen Neuronen
verhindern können (Dunnett, S. B. und Bjorklund, A., 1999). Zudem können Immunophiline
wie FK506 in solchen Tiermodellen ebenfalls neuroprotektiv wirken (Steiner, J. P. et al.,
1997a). Schließlich besteht die Möglichkeit, daß proapoptotische Faktoren aus den
Mitochondrien freigesetzt werden, weil diese bei Parkinson oder zumindest in Parkinson-
Modellen besonders geschädigt werden (Snyder, S. H. et al., 1998a; Gu, W. J. et al., 2000;
Dunnett, S. B. und Bjorklund, A., 1999).
Schlaganfall
Als Schlaganfall bezeichnet man die Unterversorgung von Neuronen mit Blut und damit
Sauerstoff und Glukose im Gehirn. Dabei unterscheidet man zwischen der Verstopfung einer
Arterie, der Ruptur einer Arterie und einer globalen Ischaemie, die z.B. durch einen
Herzstillstand verursacht werden kann. Ungeachtet der Ursache ist die Folge zunächst ein
Funktionsausfall und nach wenigen Minuten das Absterben der betroffenen Zellen. Werden
Zellen nur kurze Zeit unterversorgt oder liegen sie in einem Areal, welches noch teilweise mit
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Blut versorgt wird, so überleben sie zunächst. Das nur teilweise versorgte Gewebe um den
völlig unterversorgten Kern heißt Penumbra. In diesen Zellen tritt Zelltod beim Menschen
noch mehrere Tage lang auf. Inzwischen gibt es Hinweise, daß diese Zellen durch Apoptose
oder eine Mischform aus Apoptose und Nekrose untergehen. Aufgrund des Energiemangels
ist auch nicht mit einer vollständigen Apoptose, die naturgemäß Energie benötigt, zu rechnen.
Daher sprechen einige Autoren auch von Caspase-bedingtem Zelltod. Tatsächlich wurde
festgestellt, daß die DNA-Fragmentationen bei ischaemischen Zellen ein anderes Muster
ergeben als bei normaler Apoptose. Die DNA-Enden zeigen statt glatter Schnitte ein
unregelmäßiges Schnittbild mit zum Teil überstehenden Einzelsträngen. Caspase-Aktivität
konnte jedoch zunächst für Caspase-1 mit Hilfe von Caspase-Inhibitoren gezeigt werden. Da
Caspase-1 jedoch vor allem Entzündungsreaktionen durch Spaltung von Interleukin-1β
induziert, ist dies allein noch kein befriedigender Beweis. Weitere Hinweise kamen durch den
Einsatz von spezifischen Antikörpern gegen aktivierte Caspase-3. Mit diesen Antikörpern
konnte im Tiermodell nachgewiesen werden, daß Caspase-3 nach einer Ischaemie stärker
aktiviert ist als in den Kontrolltieren. Caspase-3 könnte direkt von Caspase-11 aktiviert
werden, da diese Caspase nur bei ischämischen Schädigungen induziert wird (Yuan, J. und
Yankner, B. A., 2000; Charriaut-Marlangue, C. et al., 1996; Johnson Jr., E. M. et al., 1995;
Barinaga, M., 1998b).
Krebs Die oft erhöhte Lebensdauer von Vertebraten und die Regenerationsfähigkeit der Zellen wird
bezahlt mit der größeren Gefahr von Mutationen und damit einer Fehlfunktion der Apoptose.
Durch enges Zusammenspiel von Zellproliferation und Apoptose wird der Gefahr von
Neoplasien vorgebeugt. Proliferierende Zellen, die ein besonderes Krebsrisiko darstellen, sind
auch besonders anfällig für Apoptose. Hier greifen drei unterschiedliche Mechanismen:
Erstens können Onkoproteine wie Myc oder E2FG1 Cytochrom C aus Mitochondrien
freisetzen, das wie oben erwähnt über Aktivierung von Apaf-1/Caspase-9 die apoptotische
Kaskade in Gang setzen kann. Diese Freisetzung von Cytochrom-C wird von
Überlebenssignalen gehemmt, wenn die Zelle sich in der richtigen Umgebung befindet.
Zweitens wird durch wachstumsfördernde Onkoproteine p53 exprimiert, welches einen Status
extremer Sensitivität gegenüber DNA-Schädigung oder zellulärem Streß induziert. Drittens
werden durch die Expression von vielen Onkoproteinen Cadherine herunterreguliert. Dadurch
wird ein Status wie bei Anoikis (Ablösungs-Apoptose) erreicht, bis die betroffene Zelle die
benötigten externen Berührungssignale bekommt (Meier, P. et al., 2000b).
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Nachweismethoden für Apoptose Um Apoptose sicher nachweisen zu können, sollten mehrere Verfahren kombiniert werden,
weil keines alleine sicher zwischen programmiertem Zelltod und Nekrose unterscheiden kann.
Da bei Apoptose verschiedene Pfade eingeschlagen werden können, die zum Teil unabhängig
voneinander den Zelltod verursachen können, gibt es „die“ Apoptose nicht, so daß die
einzelnen Verfahren nur Aussagekraft für das jeweils untersuchte Merkmal haben. Die
Verfahren können in verschiedene Bereiche eingeteilt werden:
Nachweis der DNA-Fragmentation Dies ist eine der ältesten Methoden zur Identifizierung von Apoptose. Der Nachweis kann
durch eine Auftrennung der durch Nukleasen in etwa. 180 Basepaare oder ein Vielfaches
davon geschnittenen DNA auf einem Agarose-Gel erfolgen. Die spezifisch nur bei Apoptose
induzierten DNAsen schneiden nur zwischen den Histonkomplexen, also im sog. „Linker-
Bereich“. Wurde in den Zellen „reine“ Apoptose induziert, so kann man auf dem angefärbten
Gel leiterförmig angeordnete Banden erkennen. War hingegen Nekrose die Todesursache der
Zellen, dann erkennt man auf dem Gel einen „Schmier“, d.h. die Größe der DNA-Stücke ist
zufällig, weil die bei Nekrose aktivierten DNAsen an jeder Stelle der DNA schneiden können.
Der Nachteil der Methode ist, daß eine Quantifizierung nicht möglich ist, ebensowenig die
Zuordnung zu einzelnen Zellen. Zudem benötigt man eine recht hohe Menge an Zellmaterial.
Ein relativ neu entwickelter Test umgeht diese Mängel: dabei werden Zellen auf einem
Objektträger in Agarose eingebettet, lysiert und die DNA denaturiert. Danach wird die DNA
direkt auf dem Objektträger elektrophoretisch aufgetrennt und angefärbt. Unter dem
Mikroskop erkennt man Zellen mit geschädigter DNA an einem von der Zelle ausgehenden
„Schweif“. Bei dieser Methode stellt sich die Frage der sicheren Unterscheidung zwischen
Apoptose und Nekrose.
Der Nachweis von geschnittener DNA ist auch durch den Einbau von markiertem dUTP
möglich: Dabei wird an das 3´OH Ende mittels der terminalen Desoxynukleotidyl-Transferase
(TdT) dUTP ansynthetisiert. Das dUTP ist meist mit Fluorescein markiert und erlaubt über
anti-Fluorescein Antikörper, die enzymgekoppelt sind (z.B. Peroxidase), auch die Detektion
über eine sichtbare Farbreaktion. Dieses Verfahren wird TUNEL-Nachweis (TdT mediated
dUTP Nick-End Labelling) oder ISEL (In situ end labeling) genannt {38}. Ein ähnliches
Verfahren ist ISNT (in situ nick translation). Hier werden allerdings die markierten
Nukleotide durch DNA-Polymerase I in Einzelstrangbrüche eingebaut. Die Detektion erfolgt
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in beiden Fällen unter dem Mikroskop oder durch ein FACS-Gerät (Fluorescence assisted cell
sorting). Der Vorteil dieser Methoden ist die Möglichkeit der Apoptose-Bestimmung in
Einzelzellen und damit die Quantifizierung in Kulturen oder Gewebeschnitten. Nachteil ist
die Spezifität: Untersuchungen haben gezeigt, daß auch nekrotische Zellen durch diese
Methoden falsch positiv getestet werden können.
Schließlich ist der Nachweis der zerschnittenen DNA auch durch einen ELISA (Enzyme
Linked Immunosorbent Assay) möglich: Die Fragmente, die bei Apoptose auch noch
Histonkomplexe enthalten und als Nucleosomen bezeichnet werden, werden mit Hilfe von
anti-DNA- und anti-Histon-Antikörpern, die mit Biotin bzw. Peroxidase markiert sind,
nachgewiesen. Der Vorteil ist die Möglichkeit der Quantifizierung und des hohen
Durchsatzes.
Nachweis von Caspase-Aktivität Caspase-Aktivität in Zellysaten kann über die Spaltung eines künstlichen fluorogenen oder
chromogenen Caspase-Substrates nachgewiesen werden: die Zellen werden lysiert und das
Lysat mit dem Substrat versetzt. Das Substrat besteht aus der Erkennungssequenz der
nachzuweisenden Caspase und einem Teil, der bei Abspaltung entweder fluoresziert (z.B.
AFC) oder das Absorptionsspektrum ändert (z.B. pNA). Nachteil ist, daß eine relativ große
Zahl von Zellen benötigt wird und die Substrate teilweise. hoch spezifisch sind. DerVorteil
liegt in der Möglichkeit einer Quantifizierung.
Der Nachweis von Caspaseaktivität ist auch über die Spaltung natürlicher Substrate der
Caspasen möglich: Oft benutzt wird hier die Spaltung von PARP, das z.B. von Caspase-3 zu
Bruchstücken bestimmter Größe geschnitten wird. Die zu untersuchenden Zellen werden
lysiert und der Zellextrakt elektrophoretisch aufgetrennt. Mit spezifischen Antikörpern kann
das Protein -z.B. PARP- auf einem Western-Blot nachgewiesen werden. Nachteil ist hier, daß
viel Zellmaterial benötigt wird und manche Proteine auch von anderen Proteasen (z.B.
Spektrin von Calpain) oder verschiedenen Caspasen geschnitten werden. Zudem ist ein
Western-Blot relativ aufwendig. Alternativ können Caspasen mit spezifischen Antikörpern,
die nur die aktivierten Proteasen erkennen und nicht die Zymogene, direkt in der Zelle oder
mittels Western-Blot nachgewiesen werden. Schließlich existieren irreversibel bindende,
fluoreszenzmarkierte Inhibitoren. Damit lassen sich in der lebenden Zelle aktive Caspasen
unter dem Mikroskop oder mit einem FACS-Gerät nachweisen.
EINLEITUNG 34
34
Nachweis der Exposition von Phosphatidylserin Ein sehr frühes Merkmal für Apoptose ist die Lokalisation von Phosphatidylserin an der
Membranaußenseite von Zellen. Dieses läßt sich mit markiertem Annexin V nachweisen, da
Annexin V an Phosphatidylserin bindet. Je nach Markierung des Annexin V können die
Zellen unter dem Mikroskop oder in einem FACS-Gerät analysiert werden. Eine
Gegenfärbung mit Propidiumiodid verhindert falsch positive Detektion, da Annexin auch an
tote, nekrotische Zellen bindet. Dieser Nachweis ist an lebenden Zellen möglich und kann
Apoptose in einem sehr frühen Stadium erkennen.
Sonstige Färbemethoden Wenn Depolarisation und die Freisetzung von proapoptotischen Faktoren aus den
Mitochondrien eine Rolle spielen, kann auch dies zum Nachweis der Apoptose verwendet
werden. Die Detektion der Depolarisation von Mitochondrien mit Hilfe von Farbstoffen ist
eine Möglichkeit der extrem frühen Erkennung von Apoptose. Es gibt allerdings einige
Hinweise auf Artefakte, die durch die Verwendung der Farbstoffe entstehen. Eine Färbung
der Zellen mit Propidiumiodid, Acridin-Orange, DAPI oder anderen DNA-Farbstoffen wie
dem Farbstoff Hoechst 33342 läßt die Kondensation des Kerns gut unter dem Mikroskop
erkennnen -ebenfalls ein Hinweis auf Apoptose.
Morphologische Hinweise Elektronenmikroskopisch kann man ebenfalls wichtige Marker für Apoptose erkennen: Die
Bildung apoptotischer Körperchen oder der Zustand von Organellen geben wichtige Hinweise
auf Apoptose oder Nekrose.
In dieser Arbeit wurden zur sicheren Identifizierung von Apoptose folgende Verfahren
angewandt:
Nachweis der DNA-Fragmentation mit einem ELISA-Test
Nachweis von aktivierter Caspase-3
Nachweis von exponiertem Phosphatidylserin mit markiertem Annexin
Das Überleben der Zellen bzw. die Quantifizierung des Zelltodes wurde mit Hilfe folgender
Verfahren bestimmt:
Die Stoffwechselaktivität und damit die Vitalität der Zellen mit einem MTT-Test
EINLEITUNG 35
35
Da das in einigen Versuchen eingesetzte Malonat bzw. Methylmalonat mit der Succinat-
Dehydrogenase genau das Enzym hemmt, welches für die Umsetzung des MTT-Salzes
verantwortlich ist, wurde zusätzlich der LDH-Test eingesetzt:
DieBestimmung der von toten Zellen freigesetzten Laktatdehydrogenase
Apoptose induzierende und hemmende Substanzen
Staurosporin In dieser Arbeit wurden sowohl Substanzen verwandt, die Apoptose induzieren können als
auch Substanzen, die in Modellen Apoptose blockieren können.
Staurosporin ist ein nicht-selektiver, Breitspektrum-Kinaseinhibitor, der unter anderem PKC
hemmt (Wiesner, D. A. und Dawson, G., 1996) aber auch andere Tyrosinkinasen und Serin-
Threonin Kinasen. Es ist ein Alkaloid aus dem Pilz Streptomyces Staurospores (Rasouly, D.
und Lazarovici, P., 1994). Staurosporin wurde in Zellkulturmodellen kortikaler Neuronen der
Maus eingesetzt, um Apoptose zu induzieren (Koh, J. Y. et al., 1995). Daneben hat
Staurosporin auch in sehr vielen anderen Zellen und Zellinien das Potential, programmierten
Zelltod auszulösen, so in MOLT-4, HL-60 (beides humane Leukämie-Zellinien), SUDHL16
und CA46 (Lymphom-Zellinien) , HT-29 (Kolon Karzinom Zellinien), sowie in reifen
Lymphozyten, Linsen-Epithelzellen, mutierten Fibroblasten und Chondrozyten (Bertrand, R.
et al., 1994; Falcieri, E. et al., 1993; Jarvis, W. D. et al., 1994; Lucas, M. et al., 1994; Raff, M.
C. et al., 1994). Ebenso wurde in MCF-7 Zellen, die Caspase-3 defizient sind, Zelltod durch
Staurosporin ausgelöst -interessanterweise ohne die typischen Kennzeichen wie DNA-
Fragmentation. Wurde ein funktionelles Caspase-3 Gen in die Zellen eingeführt, so waren
deutliche Zeichen für einen apoptotischen Zelltod zu entdecken (Janicke, R. U. et al., 1998).
Keane et al. (Keane, R. W. et al., 1997) konnten zeigen, daß Staurosporin in gemischten
Neuronenkulturen sowie in Astrozytenkulturen der Maus Caspase-3-Aktivierung und
Apoptose induziert. Chakravarthy und Walker et al. (chakravarthy, B. R. et al., 1999) konnten
nach der Behandlung von humanen Neuroblastomzellen SH-SY5Y mit Staurosporin ebenfalls
Apoptose und einen Anstieg in Caspase-3-Aktivität beobachten, was auch von McManus und
Posmantur (Posmantur, R. et al., 1997) beobachtet wurde. Apoptose wurde auch in Kulturen
von cerebralen Neuronen aus Hühnern durch Staurosporin ausgelöst (Wiesner, D. A. und
Dawson, G., 1996).
EINLEITUNG 36
36
Malonat / Methylmalonat Malonat ist ein reversibler Inhibitor der Succinat-Dehydrogenase im Komplex II der
Atmungskette in Mitochondrien. In vivo erzeugt eine Malonat-Injektion in das Striatum
Zelltod, dessen Muster zum Teil an den Zelluntergang bei Chorea Huntington und transienter
Ischaemie erinnert (Beal, M. F. et al., 1993; Dutra, J. C. et al., 1993; Greene, J. G. et al., 1993;
Maragos, W. F. et al., 1999; Malcon, C. et al., 2000). Ein anderer Inhibitor der Succinat-
Dehydrogenase, der irreversibel bindet, ist 3-NP (3-Nitropropionic acid). Wird dieser
natürlich vorkommende Inhibitor versehentlich vom Menschen aufgenommen, so läßt sich
ebenfalls eine Degeneration des Striatums und Dystonie beobachten. Im Tiermodell
verursacht eine systemische Gabe die selektive Zerstörung striataler GABAerger Projektionen
in Ratten (Brewer, G. J. et al., 1993) sowie in Primaten Dystonie, Dyskinesie und kognitive
Defekte (Brouillet, E. et al., 1995; Palfi, S. et al., 1996). In transgenen Mäusen, die eine
dominant-negative Mutante von Caspase-1 exprimieren, ist die durch Malonat und 3-NP
induzierte Neurotoxizität im Striatum stark abgeschwächt (Andreassen, O. A. et al., 2000).
Werden retinale oder mesencephale Neuronenkulturen mit Malonat behandelt, tritt ebenfalls
Zelltod ein, der ebenfalls apoptotische Züge trägt (Zeevalk, G. D. et al., 1998a; Zeevalk, G. D.
et al., 1998b).
Methylmalonat wird intrazellulär zu Malonat umgesetzt (McLaughlin, B. A. et al., 1998a). In
vitro konnte man mit Methylmalonat in striatalen sowie kortikalen Neuronen Zelltod mit
überwiegend apoptotischen Charakteristika induzieren. Das Überleben der Zellen konnte mit
Antioxidantien verbessert werden (McLaughlin, B. A. et al., 1998a). Wird Methylmalonat in
die Basalganglien injiziert, ergeben sich die gleichen Läsionen wie mit anderen Succinat-
Dehydrogenase Inhibitoren (Narasimhan, P. et al., 1996). Auch 3-NP kann in vitro Apoptose
induzieren (McLaughlin, B. A. et al., 1998b). Interessant ist auch, daß MCM (Methylmalonyl-
CoA Mutase) Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA umsetzt. Ist diese Umsetzung durch eine
Mutation gestört, so reichert sich Methylmalonat im Körper an; mit der Folge schwerer
metabolischer und neurologischer Abnormalitäten und schnellem Tod der betroffenen
Patienten. MCM wird nach transienter Ischaemie vermehrt exprimiert (Narasimhan, P. et al.,
1996).
Deprenyl Deprenyl (Selegilin) ist ein MAO-B (Monoamin Oxidase) Inhibitor. MAO katalysiert die
Oxidation von Dopamin zu Dihydroxyphenylacetat und H2O2 und ist damit eine Quelle von
Radikalstreß. Tatsächlich konnte gezeigt werden, daß eine Reduktion der Dopaminexposition
EINLEITUNG 37
37
in vivo und vitro auch die Schäden begrenzt, die striatale Neuronen erleiden, wenn sie mit
Glutamat-Agonisten, Succinat-Dehydrogenase Inhibitoren oder Hypoxie/Glukoseentzug
behandelt werden (Maragos, W. F. et al., 1999). Deprenyl könnte also zellulären Radikalstreß
verringern.
Dipyridamol Dipyridamol ist ein Inhibitor von PDE 5 (cGMP phosphodiesterase), hat aufgrund der
Hemmung des Adenosin-Transports in Epithelien vasodilatorische Eigenschaften (Hanson, K.
A. et al., 1998; Denis, D. und Riendeau, D., 1999; Sundaram, M. et al., 1998; Hogan, Y. H. et
al., 1998). Dipyridamol erwies sich beim Entzug von trophischen Faktoren in Kulturen von
hippocampalen oder kortikalen primären Neuronen als neuroprotektiv. Dieser Effekt ist
allerdings eher auf die antioxidativen Eigenschaften von Dipyridamol zurückzuführen. Dies
wurde in Versuchen bestätigt, bei denen die Neuronen entweder mit H2O2 oder FeSO4
inkubiert wurden (Farinelli, S. E. et al., 1998).
Pramipexol Pramipexol ist ein Dopamin-Agonist (mit hoher Affinität und Spezifität zu D2-Rezeptoren
und in dieser Familie vor allem zu D3), der schon zur Behandlung von Parkinson eingesetzt
wird (Mierau, J. et al., 1995). Darüber hinaus hat Pramipexol antioxidative Eigenschaften:
Sowohl in SH-SY5Y-Zellkulturen, die mit dem Komplex I Inhibitor MPP+ (MPTP) behandelt
wurden verhinderte Pramipexol die Bildung von reaktiven Sauerstoff-Spezies, als auch in in
vivo Modellen mit der Applikation von MPP+ über Mikrodialysesonden in das Striatum.
Zudem verhindert Pramipexol die Öffnung der MPT (Cassarino, D. S. et al., 1998a).
FK506 FK506 (auch Tacrolimus, Prograf (Butcher, S. P. et al., 1997)) ist ein immumsuppressives
Makrolid-Antibiotikum aus dem Pilz Streptomyces tsukabaesis (Kino, T. et al., 1987), das bei
der Immunsuppression etwa 10fach effektiver als CsA (Cyclosporin A) ist (Gold, B. G.,
1997).
Die Wirkung der Immunsuppression beruht auf der Hemmung von frühen, Kalzium-
abhängigen Schritten in der Immunantwort. FK506 kann an die Immunophiline FKBP
(FK506 binding Protein) binden, die eine Familie (12-52 kD) zytosolischer Proteine bilden.
EINLEITUNG 38
38
Eins dieser Proteine, das FKBP12, ist 108 Aminosäuren lang, hoch konserviert und kommt im
Hirn vor allem neuronal vor (Gothel, S. F. und Marahiel, M. A., 1999; Snyder, S. H. et al.,
1998b). Besonders hohe Konzentrationen von FKBP12 wurden im Hippocampus und in
striatonigralen Bahnen gefunden. Allgemein sind die Immunophiline 10-50fach höher in
neuronalem Gewebe als in Zellen des Immunsystems exprimiert sind (Steiner, J. P. et al.,
1997b). FKBP-Proteine besitzen die Eigenschaft einer Rotamase-Aktivität, d.h. einer
Peptidyl-Prolyl-Isomerase Aktivität. Diese scheint jedoch nicht für die immunsuppressive
Wirkung verantwortlich zu sein, da einige Liganden von Immunophilinen, die die Rotamase-
Enzymaktivität unterdrücken, nicht die Immunsuppression verhindern. Die immunsuppressive
Wirkung scheint vielmehr von der Interaktion der Immunophiline, den Inhibitoren und der
Kalzium/Calmodulin aktivierten Phosphoserin/ Phosphothreonin Protein-Phosphatase
Calcineurin abhängig zu sein. Die Bindung des FK506/FKBP-Komplexes an Calcineurin
führt zur verstärkten Phosphorylierung von nNOS (neuronal nitric oxide synthase) und
GAP-43 (Growth associated protein), einem Protein das bei dem Auswachsen von Neuriten
eine Rolle spielt. Da die Phosphorylierung von nNOS die Aktivität von nNOS deutlich
verringert, ist es nicht verwunderlich, daß FK506 ähnlich neuroprotektive Wirkungen hat wie
nNOS-Inhibitoren. FK506 kann beispielsweise neuronale Schäden in Zusammenhang mit
vaskularem Schlaganfall lindern (Sharkey, J. und Butcher, S. P., 1994).
FKBP12 kann auch an den TypI-Rezeptor für TGF-β und FAP48 (FKBP-associated protein)
binden. TGF-β kann durch Bindung an TGF-β-Rezeptor TypII den TGF-β-Rezeptor TypI
aktivieren. Die Bindung von FKBP an den TypI-Rezeptor unterbricht diese TGF-β
Signalkette (Snyder, S. H. et al., 1998b). FKBP12 kann auch mit Ryanodin- oder
Inositol(1,4,5)-Trisphosphat (IP3)-Rezeptoren Komplexe bilden und so die intrazelluläre
Freisetzung von Ca2+ verstärken. FKBP12 wird in Läsionsbereichen, z.B. des Nervus
Sciaticus oder des Nervus facialis, zusammen mit GAP43 (growth associated protein 43kD)
hochreguliert. Behandlung von PC-12 Zellen und sensorischen Ganglienzellen der Ratte oder
des Huhns mit FK506 und einigen FK506 Derivaten führte zu deutlich verstärktem
Auswachsen von Neuriten. Auch die Behandlung von Ratten mit FK506, bei denen der
Nervus Sciaticus verletzt wurde, führte zu einer deutlichen Verbesserung der funktionellen
und morphologischen Symptome (Steiner, J. P. et al., 1997b). FK506 bindet auch an FKBP-
52, das als Hitzeschock-Protein erkannt wurde; zusammen mit HSP-70 (heat schock protein)
und HSP-90 stellt es einen Teil eines Glukokortikoid-Rezeptors dar (Tai, P. K. et al., 1992;
Sanchez, E. R., 1990; Owens-Grillo, J. K. et al., 1995; Perdew, G. H. und Whitelaw, M. L.,
EINLEITUNG 39
39
1991; Lebeau, M. C. et al., 1992). Subkutane Injektion von FK506 erhöht den Level von
HSP-70 im Hirn (Goto, S. und Singer, W., 1994).
Die immunsuppressive Wirkung von FK506 wird über die Hemmung der Phosphatase-
Aktivität von Calcineurin, das normalerweise NF-AT (nuclear factor AT) dephosphoryliert,
erreicht. Dephosphoryliertes NF-AT kann in den Kern gelangen und dort die Expression von
Interleukin-2 (und auch IL-4, gamma Interferon und GM-CSF (granulocyte-makrophage
colony stimulating factor) stimulieren.
FK506 ist interessant, weil die neurotrophen Eigenschaften nicht auf ein bestimmtes
neuronales System wirken wie normale trophische Faktoren, sondern in bisher allen
untersuchten Systemen wirken, vorausgesetzt es handelt sich um geschädigte Neuronen
(Steiner, J. P. et al., 1997c). FK506 kann dazu die Expression der Protoonkogene c-myc und
c-fos hemmen. Zudem kann FK506 die Wirkung von Steroidhormonen verstärken (Gold, B.
G., 1997).
ZVAD-fmk ZVAD-fmk (benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp (O-methyl) fluoromethylketone) ist ein nicht-
selektiver Peptid-Inhibitor von Caspase-1 und -3 ähnlichen Proteasen.
ZVAD-fmk vermag in einem MCAO-Modell (middle cerebral artery occlusion) in Mäusen
das Infarkt-Volumen um 40-50% zu senken. Zudem wird das in diesem Modell vorhandene
Schwellen des Hirns unterdrückt. Z-DEVD-fmk unterdrückt das Infarktvolumen im Hirn um
27%. In einem Modell , bei dem cerebelläre Körnerzellen mit Staurosporin behandelt wurden
und daraufhin Apoptose begingen, konnte ZVAD-fmk den Zelltod von ca. 65% auf ca. 20%
nach 48h senken. Über 100µM trat eine toxische Wirkung des Inhibitors ein (Taylor, J. et al.,
1997). Auch in Ratten-Fibroblasten, in denen durch Expression des Adenovirusproteins E1A
oder des proapoptotischen Proteins Bak oder durch Behandlung mit Etoposid Apoptose
ausgelöst werden konnte, unterdrückte Z-VAD-fmk den Zelltod stark (McCarthy, N. J. et al.,
1997).
EINLEITUNG 40
40
Zielsetzung Ziel der Arbeit war es, die Rolle der Apoptose in vitro Modellen neuronaler Degeneration zu
untersuchen.
In vitro Modelle haben den Vorteil, daß im Gegensatz zum Gehirn keine Blut-Hirn-Schranke
existiert und somit eingesetzte Substanzen freien Zugang zu den Zellen haben. Zudem können
Faktoren wie die Wechselwirkung zwischen Astrozyten und Neuronen eliminiert werden.
Aufgrund der einfacheren Verhältnisse lassen sich auch besser Aussagen treffen. Ein weiterer
Vorteil ist die Möglichkeit der Verwendung von Neuronen bestimmter Hirnareale, da
chronische neurodegenerative Erkrankungen oft in bestimmten Hirnarealen auftreten.
Gegenüber akuten Einflüßen wie beim Schlaganfall sind verschiedene Neuronenpopulationen
unterschiedlich empfindlich. Oft basieren in vitro Modelle neuronaler Degeneration auf einer
toxischen Substanz und einer Zellpopulation. In verschiedenen Modellen getestete, potentiell
neuroprotektive oder antiapoptotische Substanzen lassen sich daher in ihrer Wirkung nur
schwer vergleichen.
Daher sollten verschiedene in vitro Modelle für Apoptose und Neurodegeneration etabliert
werden. Nachweismethoden für Apoptose sollten an die Modelle adaptiert und schließlich
potentiell antiapoptotische Substanzen getestet werden.
Ein reines Apoptose-Modell sollte mit dem Toxin Staurosporin aufgebaut werden. Im
Vergleich dazu sollte ein Modell untersucht werden, das eine Mischform von Apoptose und
Nekrose darstellt. In beiden Modellen sollten dann Neurone unterschiedlich empfindlicher
Hirnareale eingesetzt werden. In diesen Modellen sollten dann vergleichend potentiell
neuroprotektive oder antiapoptotische Substanzen getestet werden, die an unterschiedlichen
Stellen in die apoptotische Kaskade eingreifen können. Durch diesen Vergleich sollten
weitere Aussagen auf die involvierten Prozesse beim Zelltod in den Modellen getroffen
werden.
MATERIAL UND ME
MATERIAL UND METHODEN
THODEN 41
41
Material
Chemikalien BSA (Bovines Serum Albumin; Rinder Serum Albumin)
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Caspase- Inhibitor Z-Val-Ala-Asp (Ome)-FMK (260-039-M005) (Breitband Caspase-Inhibitor)
Alexis Deutschland GmbH, Grünberg
Caspase-3 Inhibitor I, cell permeable (Ac-Ala-Ala-Val-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala- Val-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Pro-Asp-Glu-Val-Asp-CHO) (235423)
Calbiochem-Novabiochem GmbH, Bad Soden
DABCO Sigma-Aldrich, Deisenhofen Dipyridamol (D9766) Sigma-Aldrich, Steinheim DMSO; Dimethylsulfoxid (34943) Riedel de Haen AG, Seelze Essigsäure, Eisessig Sigma-Aldrich, Deisenhofen Ethanol 70%, technisch Boehringer Ingelheim, Ingelheim Ethanol, absolut Sigma-Aldrich, Deisenhofen Ethrane (Enfluran; 2-Chlor-1,1,2-trifluorethyl(difluormethyl)ether) (122-268-00)
Abbott GmbH, Wiesbaden
Glutamat Serva, Heidelberg Glutamin Serva, Heidelberg Malonat, diNatrium Salz (M-4795) Sigma-Aldrich; Deisenhofen Methylmalonat, freie Säure (151661) ICN Aurora, Ohio, USA Natronlauge, 1 mol/L (22915) Grüssing GmbH, Filsum NGF (Nerve growth factor) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Pramipexol (S)-2-Amino-4,5,6,7-tetrahydro-6-propyl-a benzothiazol-dihydrochlorid monohydrat
Boehringer Ingelheim, chemische Abteilung
Propidiumiodid Riedel de Haen AG, Seelze R(-)Deprenyl Hydrochlorid / Selegiline (M-003) (R(-)-N-alpha-Dimethyl-N-2-propynylbenzeneethanamine hydrochlorid)
Research Biochemicals International, Natick, MA, USA
Staurosporin, Streptomyces sp. (569397) Calbiochem-Novabiochem, Bad Soden Trichloressigsäure, reinst (27242) Riedel de Haen AG, Seelze Wasserstoffperoxid, 30% (21,676-3) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Alle Chemikalien waren, wenn nicht anders angegeben, von der höchsten erhältlichen Reinheitsstufe.
Zellkultur B-27 serumfreies Supplement (50x) (17504-044)
Life Technologies, Eggenstein
MATERIAL UND METHODEN 42
42
Collagen Typ IV (C5533) Sigma-Aldrich, Deisenhofen DMEM Flüssigmedium, 1g/L Glukose (31885-023)
Life Technologies, Eggenstein
DMEM, Flüssigmedium, 4,5 g/L Glukose Life Technologies, Eggenstein DPBS, Fertiglösung, steril, ohne Succinat-Dehydrogenase, Magnesium
Bio-Whittaker, Verviers, Belgien
FCS (fetal calf serum; fötales Kälberserum) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Laminin (Lösung 1mg/ml) (aus Membranen von Maus-Sarkoma-Zellen)
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
Neurobasal-MediumTM, 4,5 mg Glukose (21103-049)
Life Technologies, Eggenstein
Pferdeserum Roche Diagnostics GmbH, Mannheim Poly-D-Lysin, (Lösung 2mg/ml) Sigma-Aldrich, Deisenhofen RPMI 1640 (31870025) Life Technologies, Eggenstein Trypsin 0,05 % , EDTA 0,02%, Fertiglösung Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Verbrauchsmaterial 24 Loch Zellkulturplatten, Poly-D-Lysin beschichtet (Biocoat PDL) (35 6414)
Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg
24 Loch Zellkulturplatten, Primaria (35 3872) Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg 96 Loch Zellkulturplatten, Poly-D-Lysin beschichtet (Biocoat PDL) (356461)
Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg
96 Loch Zellkulturplatten, Primaria (353872) Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg Deckgläschen, 12mm (DKR1) Gesellschaft f. Laborbedarf mbH, Würzburg Einwegpipetten 1,5 und 10 ml Saarstedt, Heidelberg Einwegpipetten 25 ml Greiner-Labortechnik, Frickenhausen Einwegspritzen Ecoject 10ml Dispomed Witt OHG, Gelnhausen Einwegspritzenfilter, 0,2 µm Schleicher&Schüll, Dassel Objektträger, geschliffen (H870.1) Carl Roth GmbH&Co KG, Karlsruhe Pasteurpipetten, Glas (E-1097) neoLab Migge Laborbedarfs-Vertriebs
GmbH, Heidelberg Zellkulturflaschen, 75 cm2 Saarstedt, Heidelberg Zentrifugenröhrchen, 15 und 50 ml Greiner Labortechnik, Frickenhausen
Kits Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (PF 032)
Calbiochem (Oncogene)
Caspase-3 Cellular Activity Assay Kit (235419)
Calbiochem
Cell Death Detection ELISA plus Kit (1 774 425)
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Cell Titer 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (G4100)
Promega, Madison, WI, USA
LDH Cytotoxicity Detection Kit (MK401) Takara Shuzo Co., Ltd, Japan
MATERIAL UND METHODEN 43
43
Geräte Mikroskop, inverses Forschungsmikroskop IMT-2
Olympus Optical Co.Hamburg
Fluoreszenzlampe/Zubehör IMT-2-RFL Olympus Optical Co.Hamburg Fluoreszenzfilter Olympus Optical Co.Hamburg Farb-Videokamera Sony DXC-9100P Olympus Optical Co.Hamburg Adapter CMA-D2 Olympus Optical Co.Hamburg Remote control unit RM C950 Olympus Optical Co.Hamburg Software AnalySIS 3.0 Soft Imaging Systems GmbH, Münster,
Deutschland Mikroskop, invers, CK40 Olympus Optical Co.Hamburg Fluoreszenzmodul Blau (32067) Olympus Optical Co.Hamburg Fluoreszenzmodul Grün (32068) Olympus Optical Co.Hamburg Zentrifuge, BHG Hermle Z320 Berthold Hermle Labortechnik GmbH,
Gosheim Rotor 220.72 V01 (Röhrchen) Berthold Hermle Labortechnik GmbH,
Gosheim Rotor 220.50 V01 (Platten) Berthold Hermle Labortechnik GmbH,
Gosheim pH-Meter 761 Calimatic Knick elektronische Messgeräte GmbH & Co,
Berlin Eppendorf Thermomixer 5436 (E-5095) Merck Eurolab GmbH, Frankfurt Horizontal-Gelkammer BioMax (MP1015) Sigma-Aldrich, Deisenhofen Tischzentrifuge B Braun Melsungen, Melsungen Schüttler, Certomat U (886312/1) B Braun Melsungen, Melsungen Wärmegerät, Certomat H (886342) B Braun Melsungen, Melsungen Tischzentrifuge Biofuge A Zählkammer „Neubauer improved“(631F1120)
Merck Eurolab GmbH, Frankfurt
Reinraumwerkbank horizontal, HF-48 (83 851 48)
Gelair Flow Laboratories, Meckenheim
Reinraumwerkbank vertikal, Herasafe HS18 (51012285)
Heraeus, Hanau (Kendro)
Wasserbad 3047 Köttermann, Uetze-Hänigsen Plattenphotometer, Uvmax kinetic microplate reader
Gesellschaft für angewandte Biotechnologie, Ebersberg
Plattenwascher, microplate washer Gesellschaft für angewandte Biotechnologie, Ebersberg
Software Das Plattenphotometer wurde mit der Software Softmax für Windows 2.3 (Gesellschaft für
angewandte Biotechnologie, Ebersberg ) betrieben. Auswertungen wurden mit Excel 97 SR-2
(Microsoft) durchgeführt. Die Graphiken und der t-Test wurden mit Sigmaplot 5.0 (Jandel
Scientific) angefertigt bzw. berechnet. Die Software AnalySIS 3.0 (Soft Imaging Systems
MATERIAL UND METHODEN 44
44
GmbH, Münster) wurde benutzt, um die Fluoreszenzbilder aufzunehmen, zu bearbeiten und
zu verwalten.
Methoden
Zellkultur Um den Neuronenkulturen ein optimales Wachstum zu ermöglichen, wurde das Medium für
die Neuronen mit Astrozytenkulturen konditioniert. Diese Methode ermöglicht eine serum-
und nahezu gliazellenfreie Neuronenkultur. Die Präparation und Kultivierung erfolgte im
wesentlichen wie von Stichel und Müller (1991) (Stichel, C. C. und Muller, H. W., 1991)
beschrieben. Ein bis drei Tage alte Rattenjungtiere wurden in einem Glasgefäß mit einer
Überdosis Ethrane® (Wirkstoff Enfluran) betäubt und anschließend in einem Glasgefäß mit 70
%igem technischen Ethanol desinfiziert. Der Kopf wurde dekapitiert und die Haut nach
Durchtrennung der Anwachspunkte der Ohren entfernt. Vom Rückenmarkskanal aus wurden
mit einer spitzen Schere drei Schnitte in die Hirnschale gesetzt: medial bis kurz vor den
Augen; lateral ca. 1 cm auf Maulhöhe. Die Kapsel wurde entfernt und das Hirn in eine flache
Petrischale zur weiteren Präparation befördert. Durch beträufeln mit DMEM wurde das Hirn
feucht gehalten. Die Innenseite des Kortex wurde von Hirnhaut befreit. Die beiden
Kortexhälften wurden abgetrennt und gedreht. Nach dem Entfernen der Haut auf der nun oben
liegenden Seite konnten die Hirnhälften in DMEM gesammelt werden. Nach Präparation aller
Hirne (maximal 1h) wurde das DMEM abdekantiert und die Hirne in ca. 3 ml DMEM mit
sukzessiv enger geschmolzenen Pipetten trituiert. Die Suspension wurde mit DMEM auf 50
ml aufgefüllt und für 5 min zentrifugiert (350 g; RT). Der Überstand wurde verworfen und
das Pellet in ca. 1 ml DMEM + 10 % FCS pro Hirn resuspendiert. Jeweils 1 ml Suspension
und ca. 15 - 18 ml DMEM + 10 % FCS wurden in 75 cm2 Kulturflaschen bei 37°C und 10 %
CO2 kultiviert. Das Medium wurde alle 3-4 Tage ausgetauscht.
Astrozytenkonditioniertes Medium
Nachdem die Zellen zu einem konfluenten Zellrasen gewachsen waren, was normalerweise
am Tag 14 nach der Präparation der Fall war, wurden die Astrozytenkulturflaschen über
Nacht bei 37°C geschüttelt (120 x min-1 ). Die Astrozyten wurden am nächsten Tag drei mal
mit ca. 20 ml DPBS kurz gewaschen, um das restliche Serum zu entfernen. Anschließend
wurden sie mit 35 ml B27/NB mit 0,5 mmol/l Glutamin (200 mM Stammlösung;
MATERIAL UND METHODEN 45
45
Aufbewahrung –20°C) beschickt. Das durch die Astrozyten konditionierte Medium wurde
nach drei Tagen abgenommen und entweder kurzzeitig (bis max. 1 Woche) bei 5°C
aufbewahrt oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C aufbewahrt. Die Zellen
wurden für maximal 5 weitere Konditionierungen benutzt.
Beschichtung der Wachstumsfläche für Kortexneuronen und Striatumneuronen
Zur besseren Anheftung der Zellen wurden die Löcher der Kulturplatten mit oder ohne
Deckgläschen wie folgt beschichtet: die Platten wurden mit 0,2 mg/ml Poly-D-Lysin in
destilliertem Wasser 15 min bei RT inkubiert (96 Loch-Platten: 50 µl/Loch; 24 Loch-Platten:
500 µl/Loch) und anschließend drei mal mit destilliertem Wasser gewaschen (100 µl/Loch
bzw. 1 ml/Loch). Nach dem Trocknen der Platten konnten sie bis zu 7 Tage bei 4°C
aufbewahrt werden. Für die Versuche mit Methylmalonat und Malonat wurden mit Poly-D-
Lysin vorbeschichtete, kommerziell erhältliche Platten benutzt. Ein Vergleich der Anheftung,
Vitalität und Morphologie ergab keine Unterschiede zu selbstbeschichteten Platten.
Selbstbeschichtete und fertig beschichtete Platten wurden am Präparationstag mit 2 µg/ml
Laminin in PBS für 1h bei 37°C (96 Loch-Platten 50 µl/Loch; 24 Loch-Platten 500 µl/Loch)
beschichtet. Die Platten wurden danach zweimal mit DMEM gewaschen. Um ein
Austrocknen der Beschichtung zu verhindern, wurden pro Loch 60 µl (96 Loch-Platte) oder
500 µl (24 Loch-Platte) konditioniertes NB (Neurobasal-Medium) eingefüllt und die Platten
bis zur Aussat der Zellen bei 37°C im Brutschrank aufbewahrt.
Präparation und Kultivierung von Kortex- und Striatumneuronen
Die Präparation der Kortexhälften erfolgte im wesentlichen wie von Banker und Cowan
(1977) beschrieben. Die Kultivierung erfolgte in Anlehnung an die Veröffentlichung von
Stichel und Müller (1991). Wichtige Unterschiede waren zum einen die Benutzung von Ara-C
als Mitosehemmer für Gliazellen und zum anderen der Austausch von konditioniertem N2-
Medium mit DMEM als Grundmedium gegen konditioniertes B27-Medium mit Neurobasal
als Grundmedium (Brewer, G. J. et al., 1993). Eine 16-17 Tage vorher gedeckte Ratte (Stamm
Wistar, 12 h Hell-Dunkel Rhythmus, Futter und Wasser ad libitum, Quelle Dr. Karl Thomae
GmbH, Biberach) wurde mit einer Überdosis Ethrane® (Wirkstoff: Enfluran) getötet und die
MATERIAL UND METHODEN 46
46
Bauchdecke mit 70 %igem technischen Ethanol desinfiziert. Das Bauchfell wurde mit einer
Schere medial aufgeschnitten und zur Seite geklappt. Anschließend wurde die freigelegte
Bauchdecke mit 70 %igem technischen Ethanol desinfiziert und ebenfalls geöffnet. Die
Fruchtblase wurde entnommen und in einer Petrischale aufbewahrt. Alle weiteren Schritte der
Präparation erfolgten in der Sterilbank. Das in 70 %igem technischen Ethanol stehende
Präparationsbesteck wurde vor der Benutzung jeweils 2 x in PBS und 1 x in DMEM getaucht.
Die Embryonen wurden einzeln der Fruchtblase entnommen, der Kopf dekapitiert und in einer
Petrischale der Kortex herauspräpariert. Dazu wurde die Kopfhaut und die Schädelkapsel mit
zwei spitzen Pinzetten entfernt. Dann wurde das Hirn mit einem flachen Spatel entnommen.
Mit der dorsalen Seite oben liegend wurde das Hirn im Kortex-Bereich medial durchtrennt
und die Kortexhälften aufgeklappt. Die Hirnhaut über den Kortexhälften wurde mit spitzen
Pinzetten entfernt. Anschließend wurden die Kortexhälften abgetrennt und die Hirnhaut auch
auf der anderen Seite entfernt. Für Striatum-Kulturen wurde der Bereich des Striatums
entnommen. Die Hirnhälften bzw. das Striatum-Gewebe wurden in DMEM (4°C) gesammelt.
Nach Präparationende (max. 1 h) wurden die gesammelten Hirnstücke zentrifugiert (5 min;
350 g; RT). Das Pellet wurde für 8 min mit 10 ml Trypsin/EDTA-Lösung (die Originallösung
mit ca. 5 U/ml wurde 1:250 in DPBS verdünnt) bei 37°C inkubiert und die Reaktion durch
Absaugen der Trypsinlösung und Zugabe von 10 ml DMEM mit 10% FCS abgestoppt.
Anschließend wurde zentrifugiert (5 min; 350 g; RT) und das Pellet durch zweimaliges kurzes
Waschen mit 10 ml DMEM von Serumresten befreit. In 1-2 ml NB/B27 (49 : 1) mit 2 mmol/l
Glutamin wurden das Gewebe mit sukzessiv enger geschmolzenen Pipetten trituiert. Die
Zellzahl der Suspension wurde in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Suspension
wurde dann für Toxizitätsversuche in einer Aussaatdichte von 110.000 Zellen/cm2
(Kortexneuronen) oder 160.000 Zellen/cm2 auf die 96-Loch-Kulturplatten in ein Endvolumen
von 120µl ausgesät. Die Einsaat für 24-Loch-Platten war für Caspase-3 Bestimmungen
entsprechend: Kortexneuronen 220.000 Zellen/cm2 und Striatumneuronen 310.000
Zellen/cm2. Für Immunfluoreszenzfärbungen wurden 30.000 Kortexneuronen/cm2 oder
60.000 Striatumneuronen/cm2 in 24-Loch-Platten mit Deckgläschen eingesät. Das
Endvolumen für 24-Loch-Platten war 900µl/Loch. Bei 96-Loch-Platten wurden die äußeren
Löcher mit 200µl destilliertem sterilen Wasser als Verdunstungsschutz befüllt. Die
Kultivierung erfolgte bei 37°C und 10 % CO2 . Am nächsten Tag wurde Ara-C (in NB) in
einer Endkonzentration von 5 µM dazugeben (96 Loch-Platten: 13µl/Loch; 24 Loch-Platten:
95µl/Loch). Nach drei Tagen wurde das Medium durch konditioniertes B27/NB-Medium
ersetzt (96 Loch-Platten: 80 µl/Loch; 24 Loch-Platten: 500 µl/Loch). Die Neuronen wurden
MATERIAL UND METHODEN 47
47
alle 3-4 Tage durch Austausch von 2/3 des Mediums gefüttert. Am Tag 13 oder 14 nach der
Präparation wurden Versuche oder Immunfluoreszenzfärbungen durchgeführt.
Kultivierung und Differenzierung von PC12-Zellen PC12-Zellen (Phaeochromocytoma-Zellen) wurden in einer Mischung aus 85% RPMI-
Medium, 10% Pferdeserum und 5% FCS (fetales Kälberserum) kultiviert. Die Aussaat betrug
nach der wöchentlich durchgeführten Subkultivierung 2-5x104 Zellen/cm2. Jeweils 2/3 des
Mediums wurde 3x wöchentlich gegen frisches Medium ausgetauscht. Die Kultivierung
erfolgte in mit Collagen beschichteten Schalen oder Kulturflaschen. Dazu wurden Flaschen
oder Schalen bei 37°C für mindestens 4h mit einer Lösung von Collagen in 0,25%iger
Essigsäure (5mg Collagen in 10ml 0,25%iger Essigsäure) inkubiert und der Rest der Lösung
abgesaugt. Die Beschichtung erfolgte mit 10µg/cm2 Collagen.
Die Differenzierung erfolgte in 96-Loch-Platten, die mit Collagenlösung (10µg/cm2)
beschichtet wurden. Die undifferenzierten Zellen wurden vom Flaschenboden abgeschabt,
Zellklumpen durch Trituieren aufgelöst und die Zellsuspension auf 50ml aufgefüllt und für
10 min bei 350g zentrifugiert. Von der resuspendierten Suspension wurden 5000 Zellen /Loch
in ein Endvolumen von 120 µl ausgesät (15600 Zellen/cm2). Das Differenzierungsmedium
bestand aus RPMI mit 1% Pferdeserum und 50 ng/ml (2 nM) NGF. Die Zellen wurden unter
dreimaligem Mediumwechsel (2/3) für 13-14d weiterkultiviert und differenziert.
Neurodegenerationsmodelle
Bei allen Neurodegenerationsmodellen wurde zunächst das gesamte Medium abgenommen
und anschließend jeweils 100 µl (96-Loch Platten) oder 500 µl (24-Loch Platten)
konditioniertes Medium (37°C) auf die Zellen pipettiert. Dieses Medium enthielt die
entsprechenden toxischen Substanzen und Inhibitoren, entweder direkt im Medium gelöst und
sterilfiltriert, oder als Stammlösung in DMSO gelöst und direkt zum Medium zugegeben. Die
Platten wurden dann für weitere 24h im Brutschrank belassen. Bei Substanzen, die weniger
als 24h auf den Zellen belassen wurden, wurde nach dem entsprechenden Zeitpunkt das
Medium abgenommen und 100µl (96-Loch Platten) oder 500µl (24-Loch Platten)
konditioniertes Medium zugegeben.
MATERIAL UND METHODEN 48
48
MTT-Test
Um das Überleben der Neuronen quantifizieren zu können, wurde ein kolorimetrischer Test
benutzt, wie er von Mosmann (1983) beschrieben wurde. Dazu wird ein gelbes
Tetrazoliumsalz (MTT) zu den Zellen gegeben, welches durch die Dehydrogenase der
Mitochondrien lebender Zellen in ein blaues Formazan-Derivat umgewandelt wird. Die
Menge des gebildeten blauen Farbstoffes kann dann photometrisch bestimmt werden.
4h vor Versuchsende (d.h. Inkubation mit Noxen/Inhibitoren) wurden 15µl MTT-Lösung
(CellTiter 96TM Testkit) / 100 µl Medium hinzugegeben. Nach weiteren 4 h Kultivierung
wurde dem Medium pro Loch 100 µl einer sauren Isopropanol/Detergenz-Mischung
(CellTiter 96TM Testkit) zugegeben, um Zellen und wasserunlösliche Formazan-Kristalle
aufzulösen. Die Platten wurden dann für 24 h im Dunkeln bei RT aufbewahrt. Danach konnte
die Menge des gebildeten Farbstoffes bei 570 nm photometrisch im Plattenleser bestimmt
werden. Jeweils mindestens drei gleich behandelte Löcher wurden zu einem Wert gemittelt.
Der Wert der Reihe ohne Zelleinsaat wurde als Blindwert von den anderen Werten
abgezogen. Die Werte der äußeren Löcher wurden wegen stärkerer Schwankungen nicht
berücksichtigt.
Laktat-Dehydrogenase-Test Da das in einigen Versuchen eingesetzte Malonat bzw. Methylmalonat mit der Succinat-
Dehydrogenase genau das Enzym hemmt, welches für die Umsetzung des MTT-Salzes
verantwortlich ist, wurde zusätzlich der LDH-Test eingesetzt. Die Aktivität von
Laktatdehydrogenase, die von geschädigten/toten Zellen freigesetzt wird, wird anhand der
Umsetzung von Laktat zu Pyruvat gemessen. Bei dieser Reaktion wird NAD+ reduziert.
Diaphorase wiederum kann ein gelbes Tetrazoliumsalz unter Verbrauch des NADH+H+ zu
einem roten Formazansalz reduzieren, dessen gebildete Menge dann schließlich quantifiziert
wird.
Zur Bestimmung des Zelltodes anhand der Membranpermeabilität wurde der „LDH-activity-
assay“-Kit von Takara benutzt.
Direkt nach Versuchsende wurde von den auf 96 Loch-Platten eingesäten Zellen jeweils
100µl Zellkulturüberstand abgenommen, zusammengehörige Überstände gepoolt und 100µl
in einer Mikrotiterplatte mit 100µl einer Lösung die NAD+, Diaphorase und
Iodtetrazoliumchlorid (INT) enthielt, versetzt. Nach 30 und 60 min lichtgeschützter
MATERIAL UND METHODEN 49
49
Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Absorption bei 490-690 nm im Plattenlesegerät
gemessen. Als Positivkontrolle diente das Medium von Zellen, die 4h vor Versuchsende mit
Triton X-100 (Endkonzentration 1% Triton im Medium) behandelt wurden. Triton X-100
bewirkt eine nahezu 100%ige Freisetzung der gesamten LDH der Zellen.
DNA-Fragmentation (ELISA)
Zur Bestimmung der DNA-Fragmentation wurde das „Cell Death Detection ELISA Plus Kit“
von Roche benutzt.
Dazu wurde das Medium vorsichtig von den Zellen abgehoben, 100 µl Lysepuffer/Loch auf
die Zellen pipettiert, die Zellen im Lysepuffer resuspendiert und durch auf- und abpipettieren
lysiert. Die Mikrotiter-Platte wurde zentrifugiert (10 min; 200 x g) und 20µl des Überstandes
zusammen mit 80 µl Immuno-Mix (4µl Anti-Histon biotinmarkiert; 4 µl Anti-DNA
Peroxidase konjugiert; 78 µl Inkubationspuffer) in ein Loch der Streptavidin-beschichteten
Testplatte pipettiert. Nach 2h Inkubation in einem Schüttler (100 x min-1) wurde jedes Loch
der Platte 3 mal mit 250 µl Inkubationspuffer gespült und dann für 20 min mit 100 µl
Peroxidase-Substrat inkubiert. Die Messung der Absorption erfolgte bei 405 nm.
Caspase-3 Test
Benutzt wurde hierfür der „Caspase-3 Cellular Activity Assay Kit“ von Calbiochem.
Zur Bestimmung der Caspase-3 Aktivität wurden die Zellen behandelt wie bei den anderen
Tests, allerdings wurden die Neuronen in 24-Loch Platten ausgesät. Nach dem
entsprechenden Zeitpukt der Einwirkung von Neurotoxinen/Inhibitoren wurde das Medium
abgenommen und 200µl eiskalten PBS auf die Zellen pipettiert. Die folgenden Schritte
wurden bei 0°C durchgeführt. Die Zellen wurden mit einem Zellschaber vorsichtig
abgeschabt und die Zellsuspension aus sechs Löchern gepoolt. Nach einem
Zentrifugationssschritt (5min; 4°C; 13.000/min = 12500g) wurde das Zellpellet in 30µl
Lysepuffer (50mM Hepes; 1mM Dithiotreitol; 100 µM EDTA; 0,1%CHAPS; pH 7,4)
aufgenommen und die Zellen durch auf- und abpipettieren gelöst. Nach 30 min Inkubation auf
Eis wurden eventuell vorhandene Zelltrümmer abzentrifugiert (10min; 4°C; 11.000/min =
1000 x g). 10µl des Überstandes wurden mit 80 µl Testpuffer (100 mm NaCl; 50mM Hepes;
MATERIAL UND METHODEN 50
50
10 mM Dithiotreitol; 1 mM EDTA; 10% Glycerin ; 0,1% CHAPS; pH 7,4) in einer
½ Volumen-Mikrotiterplatte (96 Löcher) gemischt, auf 37°C erwärmt und die Reaktion durch
Zugabe von 10µl Substrat (Caspase Substrat I; Ac-DEVD-pNA) gestartet. Die weitere
Inkubation erfolgte bei 37°C; nach den angegebenen Zeiten wurde die Absorption bei 405 nm
gemessen. Als Positivkontrolle diente rekombinante humane Caspase-3 (30 Units/Loch), und
die Spezifität der Spaltung wurde durch Zugabe von Caspase-3 Inhibitor I (Ac-DEVD-CHO;
0,1µmol/L Endkonzentration; Stammlösung 100 µmol/L in DMSO) bestätigt.
Proteinbestimmung
Der Überstand, der im Caspase-3 Test verwendet wurde, wurde turbidometrisch auf seinen
Proteingehalt untersucht, um die Caspase-Aktivitätswerte auf den Proteingehalt der Proben
beziehen zu können: 10µl der Probe wurden mit 140µl destilliertem Wasser in einer
Mikrotiterplatte gemischt, auf 4°C gekühlt und mit 100µl Trichloressigsäure versetzt. Nach
10-30 min wurde die Absorption bei 570 nm gemessen und die Werte anhand einer mit BSA
(Bovine Serum Albumin) erstellten Eichskala rechnerisch ermittelt (Karlsson, J. O. et al.,
1994).
Annexin-Phosphatidylserin Färbung
Zur Annexin-Färbung wurde ein Kit von Calbiochem (Annexin V-FITC Apoptosis Detection
Kit) benutzt.
Zur Anfärbung mit Annexin wurde zum entsprechenden Zeitpunkt (meist 16h) direkt in das
Kulturmedium (auf 300µl reduziert) eine Mischung aus 100 µl Bindepuffer (10mM Hepes pH
7,4; 150 mM NaCl; 2,5 mM CaCl2 , 1mM MgCl2; 4% BSA), 100µl Propidiumiodidlösung
(30µg/ml in PBS) und 20µl Annexin-V-FITC Lösung (200µg/ml rekombinanates AnnexinV
in 50mM Tris pH 7,4; 0,1 M NaCl; 1% BSA; 0,02%NaN3) gegeben. Nach einer
Inkubationszeit von 15 min wurden die Deckgläschen mit den Zellen dem Medium
entnommen, in Bindepuffer gespült und direkt auf einem Objektträger in 3µl DABCO-Lösung
(1g/50ml PBS) eingebettet. Die Aufnahmen erfolgten unmittelbar danach mit Phasenkontrast
bzw. unter UV-Anregung mit Filtersets für Grünanregung.
MATERIAL UND METHODEN 51
51
Statistische Berechnungen Für sämtliche Versuche, bei denen quantitative Bestimmungen durchgeführt wurden (MTT-
Test, DNA-Fragmentations-Test, LDH-Test), wurde die Signifikanz der Ergebnisse mit Hilfe
des Computerprogramms Sigmaplot 5.0 (Jandel Scientific) berechnet. Benutzt wurde der
ungepaarte Student´s t-Test. Die Signifikanz-Grenzen wurden bei P-Werten <0,05 (**) sowie
P<0,01 (**) festgelegt. Berechnet wurden immer die Signifikanz zwischen Kontrollwerten
und Werten die die Behandlung mit Noxen darstellen. Zudem wurde die Signifikanz zwischen
Werten noxenbehandelter Zellen und Werten von Zellen, die mit Noxen plus potentiell
neuroprotektiven/antiapoptotischen Substanzen behandelt wurden, berechnet.
ERGEBNISSE 52
ERGEBNISSE
Staurosporin-Modell
Zunächst wurde ein sicher Apoptose-auslösendes Modell auf die benutzten Zellkultursysteme
übertragen. Anhand dieses Modells konnten die verschiedenen Verfahren zum Nachweis von
Apoptose auf ihre Tauglichkeit bewertet und angepaßt werden.
Benutzt wurden in dieser Phase der Arbeit zwei Zellkultursysteme: zum einen PC12 Zellen,
einer Tumor-Zellinie aus dem Mark der Nebenniere von Ratten, die nach Inkubation mit NGF
neuronenähnliche Eigenschaften, z.B. Ausbildung von Ausläufern, zeigt. Zum anderen
wurden primäre Neuronenkulturen aus dem Kortex der Ratte benutzt, die den Vorteil haben,
daß anders als bei vielen immortalisierten Zellinien die Apoptose-Mechanismen intakt sind.
Der Nachteil ergibt sich aus der Präparation der Primärkulturen, die viele Apoptose- und
Nekrose-induzierende Reize beinhaltet und daher sehr sorgfältig ausgeführt werden muß, um
diese Reize klein zu halten.
Staurosporin wird häufig zur Auslösung von Apoptose in in vitro- und in vivo-Modellen
benutzt. Auch bei verschiedenen neuronalen Zellen induziert Staurosporin programmierten
Zelltod; unter anderem konnte dies auch bei Kortexneuronen gezeigt werden. Die Ergebnisse
der Versuche mit Kortexneuronen dieser Arbeit bestätigen solche Literaturangaben: die
Zellen zeigen sowohl eine deutliche Zunahme der DNA-Fragmentation als auch eine
Abnahme der MTT-Reduktion. Beide Effekte treten dosisabhängig auf. Der EC50-Wert für
Staurosporin beim MTT-Test beträgt ca. 50 nmol/L (Abbildung Nr. 1).
52
ERGEBNISSE 53
Abzei∗P
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
Auch bei
Aktivität.
den folgen
Nr. 2).
AbSta
Schließlic
sich Phos
von Apop
Merkmal
A
bildung 1: 14d alte Kortexneuronen nach Behandgt die Fähigkeit der Zellen zur MTT-Reduktion; b)< 0,05
Staurosporin[µmol/L]
Kontro
lle 0,01 0,1 1
n = 6SE
*
*
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
250
300
der Bestimmung der Caspase-3 Aktivität ze
Aufgrund von Literaturangaben und der Best
den Versuchen die Konzentration von 1µmol/
bildung 2: 14d alte Kortexneuronen der Ratteurosporin behandelt und die Caspase-3 Aktivität b
Kontrolle Stauro 1µM
Cas
p-3
Aktiv
ität [
willk
. Ein
heite
n]
0
1
2
3
n = 5SEM
**
h wurden die Staurosporin-behandelten Korte
phatidylserin in der Außenseite der Zellmembr
tose gilt. Als eines der ersten bestimmbaren
schon nach ca. 6h beobachtet werden (Abbildu
53
B
lung mit Staurosporin für 24h. a) stellt die DNA-Fragmentation dar
Staurosporin[µmol/L]
Kontro
lle 0,01 0,1 1
n = 5SE
*
*
igt sich eine deutliche Zunahme der
ätigung durch Vorversuche wurde in
L Staurosporin verwandt (Abbildung
wurden für 20h mit 1µmol/L estimmt. ∗∗P< 0,01
xneuronen daraufhin untersucht, ob
an befindet, was als sicheres Zeichen
Zeichen von Apoptose konnte dieses
ng Nr. 3).
ERGEBNISSE 54
A B
Abbildung 3: 14d alte Kortexneuronen, die 6h mit 1µmol/L Staurosporin behandelt wurden. Anschließend erfolgte die Detektion von Phosphatidylserin mit FITC-markiertem Annexin V. a) Kontrolle b) Staurosporin 1µM; Pfeile: apoptotische Zellen. Jeweils links Fluoreszenzanregung mit 375-495 nm und rechts Phasenkontrast-darstellung
In weiteren Versuchen wurden auch 7d alte Kortexneuronen untersucht, da in der Literatur
auf eine erhöhte Apoptose-Neigung jüngerer Neuronen hingewiesen wurde. Dies konnte in
dem benutzten Zellkultursystem ebenfalls beobachtet werden (Abbildung Nr. 4).
Abbildung 4: 7d alte Kortexneuronen nach BehandluFähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentat
Staurosporin[µmol/L]
Kontro
lle 0,01
0,10
1,00
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
140n = 5SE
0,0006*
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
250
300
350
n =MW
A
Schließlich wurde untersucht, ob eine längere Behan
Konzentrationen von Staurosporin die Induktion von Ap
eine Dosis von 0,01µM Staurosporin auch nach 48h kein
54
B
ng über 24h mit Stausosporin. a) ion. ∗P< 0,05
Staurosporin[µmol/L]
Kontro
lle 0.01
0.10
1.00
1-2
dlung über 48h mit verschiedenen
optose verstärkt. Hier zeigt sich, daß
e nennenswerte DNA-Fragmentation
ERGEBNISSE 55
hervorruft. Andererseits reduziert sich der meßbare Anteil an fragmentierter DNA bei hohen
Konzentrationen von Staurosporin (Abbildung Nr. 5).
Abbildung 5: 14d alte Kortexneuronen, die 48h mit verschiedenen Konzentrationen von Staurosporin behandelt wurden. a) Fähigkeit zur MTT-Reduktion b) DNA-Fragmentation. ∗∗P< 0,01
A
Staurosporin[µmol/L]
Kontrolle 0.010.10
1.0010.00
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
n = 2-6MW **
**
Staurosporin [µmol/L]Kontrolle 0,01 0,1 1 10
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
n = 3-7SE
**
**** **
B
Da die Benutzung von 7d alten Kortexneuronen oder eine Behandlung mit Staurosporin
länger als 24h keine Vorteile für ein Apoptose-Modell aufwies, wurde als Standardalter für
Kulturen 14d und als Standardkonzentration 1µmol/L Staurosporin für zukünftige MTT- und
DNA-Fragmentationsversuche festgelegt.
Unter den gleichen Bedingungen wurden PC12-Zellen untersucht. Eine Behandlung mit
Staurosporin erzeugt auch bei diesen Zellen eine erhöhte DNA-Fragmentation und ein
verringertes Vermögen, MTT zu reduzieren. Der EC50 für den MTT-Versuch liegt bei ca. 70
nmol/L Staurosporin. PC-12 Zellen zeigen eine höhere Empfindlichkeit gegenüber
Staurosporin als Kortexneuronen. Deutlich erhöhte DNA-Fragmentation zeigen PC12-Zellen
schon bei Konzentrationen von 0,01 µmol/L Staurosporin (Abbildung Nr. 6).
55
ERGEBNISSE 56
Avv
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
Alle Er
Kortexn
in vitro-
Eigensc
Striatum
Striatum
eine sig
gleiche
Fragmen
Kortexn
A
bbildung 6: 14d alte, mit NGF differenzierte PCerschiedenen Konzentrationen 24h lang behandelton MTT b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
200
400
600
800
Staurosporin[µmol/L]
Kontrolle 0,01 0,1 1 10
n = 4SE
** **
**
**
gebnisse zeigen, daß durch 1µmol/L Stauros
euronen oder PC12-Zellen induziert wird. Ein
Modell für die neurodegenerative Erkrank
haften dieser Erkrankung ist die Beschränk
. Daher wurden ebenfalls arealtypische Kultur
neurone zeigen schon bei Konzentrationen vo
nifikante Fragmentation der DNA. Bei 10µm
Effekt auf wie bei Kortexneuronen nach
tation geht zurück. Im MTT-Test sind Stri
eurone: der EC50 beträgt ca. 0,2 µmol/L Stauro
56
B
12-Zellen, die mit Staurosporin in wurden. a) Fähigkeit zur Reduktion ,01
Staurosporin[µmol/L]
Kontrolle 0,01 0,1 1 10
n =4SE
*
** *
porin für 24h Apoptose in 14d alten
Großteil dieser Arbeit beschreibt ein
ung Chorea Huntington. Eine der
ung des Zelltodes vor allem auf das
en aus Zellen des Striatum untersucht.
n 0,01 µmol/L Staurosporin nach 24h
ol/L Staurosporin allerdings tritt der
48h: das Testsignal bzw. die DNA-
atumneurone weniger empfindlich als
sporin (Abbildung Nr. 7).
ERGEBNISSE 57
AKD
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
Glutam Es wurd
auf Anz
den and
als Stan
Möglich
Method
nicht mö
Ein wic
Konzen
beschrie
für die Z
Es zeigt
wird (A
A
bbildung 7: 14d alte Striatumneuronen der Ratte wuonzentrationen von Staurosporin behandelt. a) FähNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
Staurosporin[µmol/L]
Kontrolle 0,01 0,1 1 10
n = 3SE
**
**
**
** DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
250
nS
at-Modell
en nun verschiedene in vitro-Modelle degenerat
eichen von Apoptose untersucht. Da die DNA-F
eren Markern von Apoptose korreliert, wurde d
dard ausgewählt. Ein weiterer Vorteil des D
keit der quantitativen Bestimmung der DNA
en wie Immunfluoreszenz-Färbungen oder de
glich ist.
htiger Mechanismus bei vielen degenerativen E
tration von Glutamat im betroffenen Bereich. In
ben worden, in denen Glutamat Apoptose induz
ellen tödliche Dosis von 10 µmol/L Glutamat n
e sich jedoch, daß bei keiner der verwendeten
bbildung Nr. 8).
57
B
rden 24h lang mit verschiedenen igkeit zur Reduktion von MTT b)
Staurosporin[µmol/L]
Kontrolle 0,01 0,1 1 10
= 3E
*
***
**
iver ZNS-Erkrankungen etabliert und
ragmentation in dieser Arbeit gut mit
iese auf ELISA basierende Methode
NA-Fragmentations-ELISAs ist die
-Fragmentation, was mit anderen
m gelelektrophoretischen Nachweis
rkrankungen des ZNS ist die erhöhte
der Literatur sind mehrere Modelle
iert hat. In Vorversuchen wurde eine
ach Einwirkung von 24 h beobachtet.
Konzentrationen DNA fragmentiert
ERGEBNISSE 58
A B
Abbildung 8: 14d alte Kortexneuronen wurden 24h lang mit verschiedenen Konzentrationen von Glutamat behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
Glutamat[µmol/L]
Kontrolle 0,1 1 10 100
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
20
40
60
80
100
120
140
n = 4SE
*
*
**
Glutamat[µmol/L]
Kontrolle 0,1 1 10 100
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
n = 4SE
**
****
Aus der Literatur ist bekannt, daß schon nach kurzer Einwirkzeit von Glutamat die
intrazelluläre Kalziumkonzentration in Zellen stark erhöht sein kann. Daher wurden ebenfalls
Versuche mit kurzer Inkubationszeit durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß schon eine
10minütige Einwirkung von Glutamat (10µmol/L) Zelltod nach 24h verursacht. Der EC50-
Wert im MTT-Test beträgt ca. 4µmol/L Glutamat. Die Meßergebnisse der DNA-
Fragmentation sind allerdings auch hier nicht signifikant unterschiedlich gegenüber der
Kontrolle. Bei höheren Konzentrationen von Glutamat wurden wie bei den 24h-Versuchen
sogar niedrigere Werte gemessen (Abbildung Nr. 9).
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
140
A
Abbildung 9: 14d alte Kortexneuronen wurdeKonzentrationen Glutamat behandelt und nach 2MTT b) DNA-Fragmentation untersucht. ∗∗P< 0
Glutamat [µMol/L]
Kontrolle 0,1 1 10 100
n = 5SE
**
**** D
NA-
Frag
men
tatio
n [K
=100
%]
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
58
B
n für 10 min mit verschiedenen 4h auf a) Fähigkeit zur Reduktion von ,01
Glutamat[µMol/L]
Kontrolle 0,1 1 10 1000
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
n = 5SE
ERGEBNISSE 59
Demnach scheint das Neurotoxizitätsmodell mit Glutamat unter den gegebenen Bedingungen ein reines Nekrose-Modell zu sein.
Entzug von trophischen Faktoren Ein Modell, das vor allem die Verhältnisse im sich entwickelnden Gehirn widerspiegelt, ist
der Entzug von trophischen Faktoren. Während der Entwicklung kann eine fehlende
Exposition der Neuronen gegenüber den richtigen Faktoren zu Apoptose führen. Da die
Neuronen auf die von den Astrozyten abgegebenen trophischen Faktoren im konditionierten
Medium angewiesen sind, ist der Entzug durch Austausch des konditionierten Mediums
gegen nichtkonditioniertes einfach zu bewerkstelligen. Allerdings konnte auch in diesem
Modell keine signifikant erhöhte DNA-Fragmentation gegenüber der Kontrolle nachgewiesen
werden, obwohl ein Trend zu erhöhter DNA-Fragmentation vorhanden war (Abbildung Nr.
10).
A B
Abbildung 10: zeigt 14d alte Kortexneuronen, die für 24h mit unkonditioniertem Medium (Neurobasalmedium mit oder ohne B27-Zusatz und Glutamin) kultiviert wurden. a) Fähigkeit nach 24h zur MTT-Reduktion b) DNA-Fragmentation nach 24h. ∗∗P< 0,01
Medium für 24 h
Kontrolle NB+B27+G NB + G
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
250
300
350
400
n = 5SE
Medium für 24h
Kontrolle NB+ G NB+B27+G
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
n = 5SE
****
H2O2/Radikalstreß-Modell Ein auf Radikalstreß ausgerichtetes Neurodegenerations-Modell ist die Behandlung von
Zellen mit H2O2. Kortexneurone wurden über 24h mit Medium kultiviert, welches
verschiedene Konzentrationen von H2O2 enthielt. Auch hier konnte keine Apoptose in Form
von DNA-Fragmentation festgestellt werden. Dies kann daran gelegen haben, daß
Wasserstoffperoxid kein geeignetes Radikal war, oder daran, daß die Einwirkung von außen
59
ERGEBNISSE 60
zunächst die Zellmembran zerstört hat. Der IC50 für Wasserstoffperoxid im MTT-Test lag
zwischen 10 und 100µmol/L H2O2 (Abbildung Nr. 11).
A B
Abbildung 11: zeigt 14d alte Kortexneuronen, die für 24h mit H2O2 in verschiedenen Konzentrationen kultiviert wurden. a) Fähigkeit nach 24h zur MTT-Reduktion b) DNA-Fragmentation nach 24h. ∗∗P< 0,01
H2O2[mmol/L]
Kontrolle0,0001
0,0010,01 0,1 1,0 10,0
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
140
160n = 6SE
**** **
H2O2[mmol/L]
Kontrolle 0,01 0,1 1,0
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
20
40
60
80
100
120
140
n = 3SE
**
AraC-Modell In der Literatur werden auch Apoptose-Modelle beschrieben, die auf DNA-Schädigung und
dem p53 basierten Mechanismus aufbauen. Durch AraC, einen auf Einbau in DNA
basierenden Mitosehemmer, werden jedoch vor allem sich teilende Zellen wie Astrozyten
getroffen. Die Wahrscheinlichkeit, daß dadurch in postmitotische Zellen Apoptose induziert
wird, ist eher gering. Die Versuche bestätigen das. Bei keiner Konzentration von AraC wurde
ein erhöhter Zelltod beobachtet. Auf Messungen der DNA Fragmentation wurde daher
verzichtet (Abbildung Nr. 12).
60
AraC[µMol/L]
Kontro
lle 0,01 0,1 1,0 10
,0
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
50
100
150
200
250
n = 6SE
*
ERGEBNISSE 61
Abbildung 12: zeigt 14d alte Kortexneuronen, die für 24h mit verschiedenen Konzentrationen AraC behandelt wurden. Fähigkeit der Zellen nach 24h zur MTT-Reduktion. ∗P< 0,05
Ischaemie-Modell Häufig basiert akute Neurodegeneration auf der Unterbrechung von Sauerstoff- und Glukose-
Zufuhr betroffener Hirnareale. Bei diesem Schlaganfall genannten Vorgang wird der Zell-
Untergang größtenteils durch nekrotische Vorgänge bestimmt. Neben der Nekrose beschreibt
die Literatur jedoch auch apoptotische Vorgänge. Diese finden besonders in der Penumbra
genannten Zone statt, die nicht völlig von der Sauerstoff- und Glukosezufuhr abgeschnitten
ist. Apoptose und Nekrose können zeitlich versetzt stattfinden. Beim Menschen kann diese
Phase mehrere Tage andauern.
Bei eigenen in vitro-Versuchen konnte jedoch mit den vorhandenen Mitteln keine ausreichend
feine Justierung der Parameter Sauerstoff- und Glukosegehalt des Mediums über die benötigte
Dauer erreicht werden. Dies zeigte sich in stark schwankenden Ergebnissen. Sowohl der
DNA-Fragmentations-Test als auch der MTT- Test waren davon betroffen. Aus diesem Grund
wurde das Ischaemie-Modell nicht weiterverfolgt.
Methylmalonat/ Malonat- Modell Ein ebenfalls auf Energiemangel der Zelle basierendes Modell, welches allerdings auf einem
chemischen Inhibitor beruht, war wesentlich feiner zu regulieren. Die Zellen wurden mit
einem Inhibitor der mitochondrialen Succinat-Dehydrogenase behandelt. Der Inhibitor
Malonat bzw. die leichter zellgängige Substanz Methylmalonat, sind kompetitive Inhibitoren,
die mit Succinat um die Bindestelle am Enzym konkurrieren. Da es sich um einen reversiblen
Inhibitor handelt, kann das Ausmaß der Hemmung gut gesteuert werden. In vivo ist Malonat
ein gutes Modell für die Krankheit Huntington´s. Dazu wird Malonat direkt ins Striatum
gespritzt. Dort werden dann Neurone des Striatums geschädigt, mit der Folge einer
Symptomatik wie bei Huntington´s. Hingegen kann der irreversible Inhibitor der Succinat-
Dehydrogenase, 3-NP, auch systemisch gegeben werden und schädigt dann ebenfalls vor
allem Zellen im Striatum.
61
ERGEBNISSE 62
Da der MTT-Test auf der Reduktion von MTT in den Mitochondrien durch die Succinat-
Dehydrogenase beruht, konnte der MTT-Test nicht zur Bestimmung der Überlebensfähigkeit
der Zellen benutzt werden. Daher wurde ein weiterer Test zur Darstellung der Vitalität der
Neuronen benutzt. Hierzu wurde der Lactat-Dehydrogenase-Test verwandt. Dieser mißt die
Menge der von den Zellen freigesetzten Lactat-Dehydrogenase. Da dieses Enzym nur bei
zerstörter Zellmembran freigesetzt wird, ist der Test ein direktes Maß für den Zelltod. Da mit
dem MTT-Test direkt die erfolgreiche Hemmung der Succinat-Dehydrogenase beobachtet
werden kann, wurde er zusätzlich durchgeführt.
Kortexneuronen im Methylmalonat-Modell
Zunächst wurden Malonat und Methylmalonat im bestehenden Zellkultursystem mit
Kortexneuronen charakterisiert. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurve ergab für
Methylmalonat im MTT-Test einen IC50-Wert von ca. 30 mmol/L Methylmalonat Die DNA-
Fragmentation stieg kontinuierlich ab 8 mmol/L an. Der maximale Wert der DNA-
Fragmentation konnte bei 20 mmol/L Methylmalonat festgestellt werden und betrug ca.
210 % der Kontrolle. Bei höheren Konzentrationen fällt die DNA-Fragmentation stark ab. Die
halbmaximale DNA-Fragmentation wurde bei einer Konzentration von ca. 8 mmol/L
Methylmalonat erreicht. Im LDH-Test zeigte sich eine Erhöhung der LDH-Freisetzung erst
bei Konzentrationen von 50 mmol/L (Abbildung Nr. 13).
A B
Abbildung 13: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 4-100 mmol/L Methylmalonat behandelt. Untersucht wurde nach 24h a ) die Fähigkeit zur MTT-Reduktion b) DNA-Fragmentation und c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase ins Medium. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
Methylmalonat[mmol/L]
Kontrolle 1 10 100
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
n > 7SE
*
****
Methylmalonat[mmol/L]
Kontrolle 1 10 100
DN
A Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
100
200
300
n > 4SE
*
**
** **
**
**
** **
62
ERGEBNISSE 63
C
Abbildung 13: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 4-100 mmol/L Methylmalonat behandelt. Untersucht wurde nach 24h a ) die Fähigkeit zur MTT-Reduktion b) DNA-Fragmentation und c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase ins Medium. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
Methylmalonat[mmol/L]
Kontrolle 1 10 100
LDH
-Fre
iset
zung
[Trit
on=1
00%
]
0
10
20
30
40
50
60
70
80
n = 6SE
Zusätzlich wurde in einer Kinetik untersucht, in welchem Zeitrahmen Veränderungen
auftraten. Bei der gewählten Konzentration von 20 mmol/L Methylmalonat konnte im MTT-
Test sowie im Lactat-Dehydrogenase-Test innerhalb 24h keine Veränderungen bei
Kortexneuronen festgestellt werden. DNA-Fragmentation konnte jedoch schon nach 4h
detektiert werden. Die höchste DNA-Fragmentation wurde nach 24h gemessen (Abbildung
Nr. 14).
%
]
=100
n [K
ktio
du
T-R
e
MT
0
20
40
60
80
100
120
140
A
Abbildung 14: 14d alte Kortexneuronen wurdebehandelt. Nach verschiedenen Zeiten wurde auf DNA-Fragmentation c) Freisetzung von L∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
MethylmalonatDauer [h]
Kontrolle 4 8 16 24
n = 6SE
****
* **
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
250
300
63
B
n mit Methylmalonat (20mmol/L) a) Fähigkeit zur MTT- Reduktion b) actat-Dehydrogenase untersucht.
MethylmalonatDauer [h]
Kontrolle 4 8 16 24
n = 6SE
**** **
**
ERGEBNISSE 64
Abbildung 14: 14d alte Kortexneuronen wurden mit Methylmalonat (20mmol/L) behandelt. Nach verschiedenen Zeiten wurde auf a) Fähigkeit zur MTT- Reduktion b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase untersucht. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
C
MethylmalonatDauer [h]
Kontrolle 4 8 16 24
LDH
Fre
iset
zung
[Trit
on=1
00%
]
-5
0
5
10
15
20
25
30
n = 6SE
*
Die Standard-Bedingungen wurden aufgrund der Ergebnisse auf 20 mmol/L Methylmalonat
für 24h festgelegt.
Striatumneuronen im Methylmalonat-Modell Striatumneuronen wurden ebenfalls mit dem Inhibitor Methylmalonat behandelt und
Überleben sowie DNA-Fragmentation untersucht. Dabei zeigte sich eine größere
Empfindlichkeit gegenüber dem Inhibitor, die sich in einer deutlichen Verringerung der
Fähigkeit MTT zu reduzieren, zeigte. Schon bei 16 mmol/L Methylmalonat sank diese
Fähigkeit. DerIC50 lag bei ca. 19 mmol/L Methylmalonat. Die DNA-Fragmentation war
ebenfalls bei 20 mmol/L Methylmalonat am größten und nahm wie bei Kortexneuronen bei
größeren Konzentrationen ab. Im Lactat-Dehydrogenase Test zeigte sich schon bei 12
mmol/L Methylmalonat ein stark erhöhter Zelltod von ca. 40 % (Abbildung Nr. 15).
64
ERGEBNISSE 65
C
Abbildung 15: 14d alte Striatumneuronen wurden über 24 h mit verschiedenen Konzentrationen von Methylmalonat behandelt. a) Fähigkeit zur Reduzierung von MTT b) DNA-Fragmentation c) Zelltod-Bestimmung mit dem Lactat-Dehydrogenase-Test. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
A B
Methylmalonat[mmol/L]
Kontrolle 1 10 100
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
n = 3SE
**
** **
Methylmalonat[mmol/L]
Kontrolle 1 10 100
DN
A Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
250
n > 3SE
****
*
**
****
Methylmalonat[mmol/L]
Kontrolle 1 10 100
LDH
-Fre
iset
zung
[Trit
on=1
00%
]
0
10
20
30
40
50
60
n = 5SE
** ***
** **
*
Kortex-Neuronen im Malonat-Modell Neben Methylmalonat wurde auch Malonat als Succinat-Dehydrogenase-Inhibitor benutzt.
Malonat war in kortikalen Kulturen toxischer als Methylmalonat, was sich in einem
niedrigeren IC50-Wert von ca. 12 mmol/L Malonat im MTT-Test darstellte. Die DNA-
Fragmentation war etwas geringer und lag im Maximum bei 160% der Kontrolle. Der
Konzentrations-Bereich, in dem die DNA-Fragmentation erhöht war, erstreckte sich von
5 mmol/L bis 25 mmol/L Malonat. Bei 30 mmol/L Malonat fiel der Wert der DNA-
Fragmentation unter den Kontrollwert ab. Die Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase war ab
10 mmol/L Malonat signifikant erhöht (Abbildung Nr. 16).
65
ERGEBNISSE 66
Abbildung 16: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit verschiedenen Konzentrationen von Malonat behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Lactat-Dehydrogenase-Freisetzung. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
A B
Malonat[mMol/L]
Kontro
lle 5 10 15 20 25 30 40 50
LDH
-Fre
iset
zung
[K=1
00%
]
0
5
10
15
20
25
30
35
40
n = 2MW *
** ** ** * ****
C
Malonat[mmol/L]
Kontrolle 5 10 15 20 25 30 35
DN
A-Fr
agm
enta
tion[
K=10
0%]
0
50
100
150
200
250
n > 3SE
**
Malonat[mmol/L]
Kontrolle 5 10 15 20 25 30 35 40 45
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120n >4SE
**
** **
****
**
Eine Kinetik wurde mit Malonat ebenfalls durchgeführt. Hierfür wurde eine Konzentration
von 15mmol/L Malonat eingesetzt. Im MTT-Test wurde eine Reduktion der Fähigkeit MTT
umzusetzen, zuerst nach 16h gemessen. Die Fähigkeit sank weiter nach 24h auf ca. 30% der
Kontrolle. Die DNA-Fragmentation war nach 4h signifikant erhöht und lag nach 4 bis 8h bei
ca. 160% der Kontrolle. Nach 16h sank dieser Wert etwa auf 140% und nach 24h wurde ein
Wert von ca. 120% gemessen (Abbildung Nr. 17).
66
ERGEBNISSE 67
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Stria Malon
bestäti
Wert
Konze
DNA-
Malon
Wert v
bis 10
Kontro
40% d
sehr h
A
Abbildung 17: 14d alte Kortexneuronen wurden mNach 4, 8, 16 und 24h wurden gemessen: a) FähigkFragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
MalonatDauer [h]
Kontrolle 4 8 16 24
n = 6SE
** **
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
250
300
350
tum-Neurone im Malonat-Modell
at wurde ebenfalls in Kulturen von primären S
gte sich die erhöhte Empfindlichkeit der Striatum
ca. 17 mmol/L Malonat. Die DNA-Fragmenta
ntration von 10 mmol/L Malonat einen Wert von
Fragmentation sank bei höheren Konzentratio
at lag dieser Wert schon unter dem Kontrollw
on 60 % zu erreichen. Der Lactat-Dehydrogena
mmol/L Malonat lagen die Werte unter d
lle). Höhere Konzentrationen (ab 15 mmol/L) M
er Triton-Kontrolle. Der Kontrollwert war alle
och (Abbildung Nr. 18).
67
B
it 15 mmol/L Malonat behandelt. eit zur Reduktion von MTT b) DNA-
MalonatDauer [h]
Kontrolle 4 8 16 24
n = 5SE
*
triatumneuronen eingesetzt. Auch hier
neuronen. Im MTT-Test war der IC50-
tion erreichte im Maximum bei einer
ca. 130 % der Kontrolle. Der Wert der
nen kontinuierlich ab. Bei 20mmol/L
ert um bei 30 mmol/L Malonat einen
se-Test ergab sehr hohe Werte: bei fünf
en Kontrollwerten (20% der Triton-
alonat resultierten in Werten von über
rdings bei diesen Versuchen ebenfalls
ERGEBNISSE 68
%
]
=100
n [K
ktio
Red
u
-
MTT
AbKoFra
Kontrolle0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Die durch
leichte Ab
nach 24h
ungefähr
Dehydrog
(Abbildun
A
bildung 18: 14d alte Striatumneuronen wurdennzentrationen von Malonat behandelt. a) Fähigkeit zgmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenas
Malonat[mMol/L]
Kontro
lle 5 10 15 20 25 30
LDH
-Fre
iset
zung
[Trit
on=1
00%
]
0
20
40
60
n = 2MW
Malonat[mmol/L]
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
n = 6SE
****
**** **
Kontrolle
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
geführte Kinetik zeigte nach 8h bei einer Behan
nahme der Reduktion von MTT auf 90%. Der W
auf knapp unter 50%. Die DNA-Fragmentati
120% (nicht signifikant). Eine Untersuchu
enase wurde bei diesen ergänzenden Un
g Nr. 19).
68
B
Malonat[mmol/L]
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
n = 6SE**
*
*
**
**
C
für 24h mit verschiedenen ur Reduktion von MTT b) DNA-e. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
40 50
dlung mit 15mmol/L Malonat eine
ert sank nach 16h auf ca. 50% und
on stieg erst nach 24h leicht auf
ng der Freisetzung von Lactat-
tersuchungen nicht durchgeführt
ERGEBNISSE 69
A B
MalonatDauer [h]
Kontrolle 4 8 16 24
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
50
100
150
n = 6SE
***
MalonatDauer [h]
Kontrolle 4 8 16 240
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
n = 5SE
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]Abbildung 19: Kinetik der Wirkung von Malonat (15mmol/L) bei 14d alten Striatumneuronen. a) Fähigkeit zur Reduzierung von MTT b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
Einfluß des pH-Wertes im Methylmalonat-Modell Die Fragmentation von DNA beruht auf der Wirkung verschiedener DNAsen. Diese
Endonukleasen haben zum Teil eine erhöhte Aktivität bei saurem pH-Wert in der Zelle. Um
diesen Aspekt darzustellen, wurde in einigen Versuchen darauf verzichtet, die verwendete
Methylmalonsäure mit NaOH zu neutralisieren. Dadurch ergab sich ein pH-Wert im Medium
von ungefähr 3 bis 4. Der IC50-Wert im MTT-Test lag bei 9mmol/L Methylmalonat. Die
Werte im DNA-Fragmentations-Test erreichten bei 12mmol/L Methylmalonat den maximalen
Wert von 600%. Offensichtlich induziert Methylmalonat in saurem Medium deutlich mehr
Apoptose. Im LDH-Test zeigten sich ab 10mmol/L Methylmalonat erhöhte Freisetzungen, die
dann bei 12mmol/L deutlich auf 35% gegenüber 10% der Kontrolle stiegen
(Abbildung Nr. 20).
0%]
n [K
=10
ktio
-
MTT
Red
u
0
20
40
60
80
100
120
A69
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
100
200
300
400
500
600
700
Methylmalonat[mmol/L]
Kontrolle 4 6 8 10 12 14 16
n = 3SE*
**
**
**
** ** **
B
Methylmalonat[mmol/L]
Kontrolle 8 10 12 14 16
n = 7 SE
**
**
**
ERGEBNISSE 70
Abbildung 20: 14d alte Konzentrationen MethylmaFähigkeit zur Reduktion ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
Kon
LDH
-Fre
iset
zung
[Trit
on=1
00%
]
0
5
10
15
20
25
30
35
40
n =SE
ZVAD-fmk im Staurospor Um die verschiedenen Modell
Breitspektrum-Inhibitor -ZVAD
Caspase-3 und Caspase-1 und
benutzten Konzentrationen um
Konzentrationen. Die Kortex-N
ZVAD-fmk zusammen inkubier
ZVAD-fmk eine deutlich verbe
10µmol/L ZVAD-fmk wurden
ZVAD-fmk war mit ca. 70%
Staurosporin behandelten Zelle
µmol/L ZVAD-fmk von 160% a
C
Kortexneuronen wurden für 24h mit verschiedenen lonat, das nicht mit NaOH neutralisiert war, behandelt. a) von MTT b) DNA-Fragmentation c) LDH-Freisetzung.
Methylmalonat[mmol/L]
trolle 4 6 8 10 12 14
3 ** **
*
in-Modell
e pharmakologisch zu charakterisieren, wurde ein Caspase
-fmk- benutzt. Dieser Inhibitor hemmt unter anderen
wurde zunächst im Staurosporin-Modell eingesetzt. Die
fassten die in der Literatur als wirksam dargestellten
euronen wurden gleichzeitig mit 1µmol/L Staurosporin und
t. Nach 24h zeigte sich im MTT-Test bei Vorhandensein von
sserte Fähigkeit, MTT zu reduzieren. Bei Anwesenheit von
schon 40% erreicht; der Wert bei Zugabe von 100µmol/L
signifikant unterschiedlich von dem Wert der nur mit
n. Parallel dazu wurde die DNA-Fragmentation durch 100
uf ca. 60% gesenkt (Abbildung Nr. 21).
70
ERGEBNISSE 71
Abbildung 21: 14d alte Kortexneuronen wurden 24h lang mit 1µM Straurosporin und ZVAD-fmk (1-100 µM) inkubiert. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT nach 24h b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
A
ZVAD-fmk[µmol/L]
Kontro
lle
Stauros
porin 1 10 100
DN
A Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
n = 5SE
**
*
ZVAD-fmk[µmol/L]
Kontro
lle
Stauros
porin 1 10 10
0
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
n = 4SE
**
*
B
Bei der Überprüfung der Eigenwirkung von ZVAD-fmk für 24h in Zellkulturen primärer
Kortexneuronen ergab sich eine leichte Eigenwirkung. Im MTT-Test zeigte sich bei keiner
untersuchten Konzentration eine toxische Wirkung. Im DNA-Fragmentations-Test zeigt sich
nur bei 1µmol/L ZVAD-fmk eine signifikante Steigerung der Fragmentation auf 120% und
ein nicht signifikanter Trend geringerer DNA-Fragmentation bei 100 µmol/L ZVAD-fmk
(Abbildung Nr. 22).
B
ZVAD-fmk[µmol/L]
Kontro
lle 0,01 0,1 1 10 10
0
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
20
40
60
80
100
120
140
160n = 4SE
*
A
ZVAD-fmk[µmol/L]
Kontro
lle 0,01 0,1 1 10 10
0
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
n = 4SE
Abbildung 22: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit ZVAD-fmk in verschiedenen Konzentrationen behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
71
ERGEBNISSE 72
ZVAD-fmk im Methylmalonat-Modell
Genau wie das Staurosporin-Modell wurde auch das Malonat-bzw. Methylmalonat-Modell
mit ZVAD-fmk weiter charakterisiert. Hierbei zeigte sich allerdings, daß ZVAD-fmk keinen
positiven Einfluß auf die Überlebensfähigkeit der Kortexneuronen im MTT-Test hat. Die
Fähigkeit zur Reduktion von MTT liegt mit 60-70% der Kontrolle noch etwas unterhalb der
Werte von Zellen, die mit Methylmalonat behandelt wurden. Der Unterschied ist allerdings
nicht signifikant. Bei der Untersuchung auf DNA-Fragmentation wurde eine Erhöhung auf
180% bei den mit 20 mmol/L Methylmalonat behandelten Zellen beobachtet. Diese
Fragmentation wurde nur durch 100µmol/L ZVAD-fmk signifikant auf ca. 125% gesenkt.
Jedoch zeigten auch die mit 1 und 10 µmol/L ZVAD-fmk behandelten Zellen eine leichte
Senkung der DNA-Fragmentation auf 150%, die jedoch nicht signifikant war. Im LDH-Test
zeigte sich durch Behandlung mit ZVAD-fmk keine signifikante Veränderung gegenüber den
Methylmalonat-behandelten Zellen (Abbildung Nr. 23).
%
]
=100
n [K
ktio
du
TT-R
e
M
A B
ZVAD[µmol/L]
Kontrolle
Methylmalonat 1 10 100
0
20
40
60
80
100
120
140
160
n = 10SE
ZVAD[µmol/L]
Kontrolle
Methylmalonat 1.0 10.0
100.0
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
250
n = 6SE
**
**
Abbildung 23: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 20 mmol/L Methylmalonat und verschiedenen Konzentrationen (1; 10; 100 µmol/L) ZVAD-fmk behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase. ∗∗P< 0,01
72
ERGEBNISSE 73
Abbildung 23: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 20 mmol/L Methylmalonat und verschiedenen Konzentrationen (1; 10; 100 µmol/L) ZVAD-fmk behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase. ∗∗P< 0,01
C
ZVAD[µmol/L]
Kontrolle
Methylmalonat 1 10 100
LDH
-Fre
iset
zung
[Trit
on=1
00%
]
0
20
40
60
n > 8SE
ZVAD-fmk im Malonat-Modell Mit Malonat behandelte Kortexneuronen zeigen ebenfalls eine leichte, nicht signifikante
Wirkung von ZVAD-fmk. Während im MTT-Test ebenfalls keine Wirkung zu sehen war,
wurde die DNA-Fragmentation bei Behandlung mit 100µmol/L ZVAD-fmk von ca. 180% auf
ca. 130% gesenkt. Auch im LDH-Test konnte ein leichter (nicht signifikanter) Trend zu
geringerer Freisetzung von LDH beobachtet werden (Abbildung Nr. 24).
A
ZVAD[µmol/L]
KontrolleMalonat 1 10 100
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
140n = 5SE
ZVAD-fmk[µmol/L]
KontrolleMalonat 1 10 100
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
250
300
350
n = 4SE
B
Abbildung 24: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 15 mmol/L Malonat und verschiedenen Konzentrationen (1; 10; 100µmol/L) ZVAD-fmk behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase.
73
ERGEBNISSE 74
Abbildung 24: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 15 mmol/L Malonat und verschiedenen Konzentrationen (1; 10; 100µmol/L) ZVAD-fmk behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase.
C
ZVAD-fmk[µmol/L]
KontrolleMalonat 1 10 100
LDH
-Fre
iset
zung
[Trit
on =
100
%]
0
5
10
15
20
25
30
n = 2MW
Deutlicher wirkte ZVAD-fmk in Kulturen von striatalen Neuronen. Auch hier konnte keine
Wirkung im MTT-Test beobachtet werden, jedoch wurde die DNA-Fragmentation bei Einsatz
von 100µmol/L ZVAD-fmk signifikant von ca. 185% auf ca.110% gesenkt. Im LDH-Test
konnte ebenfalls ein Trend gesehen werden, die Freisetzung von LDH zu unterdrücken, der
jedoch nicht signifikant war (Abbildung Nr. 25).
]
=100
ion
[K
Red
u
MTT
-
Abbildung 25
ZVAD-fmk[µmol/L]
Kontrolle Malonat 1 10 100
kt%
0
20
40
60
80
100
120
n = 3SE
B
ZVAD-fmk[µmol/L]
Kontrolle Malonat 1 10 100
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
250
n = 3SE
**
A
74
ERGEBNISSE 75
Abbildung 25: 14d alte Striatumneuronen wurden 24h mit15mmol/L Malonat behandelt. Zusätzlich enthielt das Medium 1-100 µmol/L ZVAD-fmk. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase. ∗∗P< 0,01
C
ZVAD-fmk[µmol/L]
Kontrolle Malonat 1 10 100
LDH
-Fre
iset
zung
[Trit
on =
100
%]
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
n = 2MW
Weitere Inhibitoren im Methylmalonat / Malonat-Modell oder im Staurosporin-Modell Eine Reihe weiterer Substanzen, die pharmakologisch bedeutsam bei der Beeinflussung der
Apoptose sein könnten, wurden ebenfalls im Malonat- sowie im Staurosporin-Modell getestet.
Darunter waren Substanzen, die schon in anderen Apoptose-Modellen eine Wirkung gezeigt
hatten.
Caspase-3 Inhibitor im Staurosporin-Modell Caspase-3 ist eine wichtigste Effektor-Caspase, die zudem am unteren Ende der Caspase-
Kaskade steht. Bis auf wenige, erst vor kurzem entdeckte Ausnahmen ist Caspase-3 beteiligt,
wenn eine Zelle Apoptose begeht. In vielen Experimenten konnte schon gezeigt werden, daß
eine Blockade von Caspase-3 die Unterdrückung der Apoptose bedeutet; zumindest für eine
bestimmte Zeit. Zum Teil konnte auch eine Verschiebung von Apoptose zu Nekrose
beobachtet werden. Aus diesem Grund wurde der relativ selektive Caspase-3-Inhibitor
DEVD-CHO sowohl im Staurosporin- als auch im Methylmalonatmodell auf protektive
Wirkung getestet.
Zunächst wurden mit 1 µmol/L Staurosporin behandelte Kortexneurone zusätzlich mit
Caspase-3 Inhibitor inkubiert. Im MTT-Test zeigte sich bei der Behandlung über 24h eine
konzentrationsabhängige, signifikanteVitalitätszunahme,d.h. Fähigkeit, MTT zu reduzieren.
Die durch Staurosporin auf ca. 40% abgesenkte Vitalität wurde durch 100 µmol/L DEVD-
75
ERGEBNISSE 76
CHO auf ca. 70% angehoben; bei 10 µmol/L DEVD-CHO waren es noch 60%. Nur ein sehr
leichter, nicht signifikanter Anstieg der Vitalität gegenüber den Staurosporin behandelten
Zellen ergab sich mit 1 µmol/L DEVD. Im DNA-Fragmentations-Test zeigte sich trotz der
höheren Vitalität im MTT-Test bei 1 und 10 µmol/L DEVD-CHO keine signifikante
Verringerung der DNA-Fragmentation. Bei 100 µmol/L stieg die Fragmentation sogar auf ca.
400% der Kontrolle und lag damit deutlich über der Steigerung durch Staurosporin-
Behandlung von ca. 250 % (Abbildung Nr. 26).
Abbildung 26: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 1µmol/L Staurosporin und verschiedenen Konzentrationen von Caspase-3-Inhibitor (1-100 µmol/L) behandelt. a) Fähigkeit MTT zu reduzieren b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
A B
DEVD-CHO[µmol/L]
Kontro
lle
Stauros
porin 1 10 10
0
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
n = 4SE
**
**
DEVD-CHO[µmol/L]
Kontro
lle
Stauros
porin 1 10 100
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
100
200
300
400
500
n = 4SE
*
Aufgrund der widersprüchlichen Ergebnisse bzw. toxischen Wirkung wurde Caspase-3-
Inhibitor (DEVD-CHO) in anderen Modellen nicht weiter untersucht.
Pramipexol im Staurosporin-Modell Der Dopamin-Agonist Pramipexol wird normalerweise bei Morbus Parkinson eingesetzt.
Über die Eigenschaft als Dopamin-Agonist hinaus wird spekuliert, ob Pramipexol die
Öffnung der mitochondrialen Transitions Pore (MPT) bzw. die Freisetzung von Cytochrom C
hemmt. Daher wurde die potentiell antiapoptotische Wirkung dieser Substanz in dieser Arbeit
untersucht. Tatsächlich konnte Pramipexol die durch Staurosporin gegenüber der Kontrolle
auf 40% herabgesetzte Vitalität der Zellen dosisabhängig auf bis zu 85% steigern. Bei
gleichzeitiger Inkubation mit 10µmol/L Pramipexol änderte sich an der Fähigkeit MTT zu
reduzieren nichts, aber bei 100µmol/L konnte eine (nicht signifikante) Steigerung der Vitalität
76
ERGEBNISSE 77
gegenüber der Kontrolle auf ca. 50% beobachtet werden. Interessanterweise lagen die Werte
für alle eingesetzten Konzentrationen (10-1000µmol/L) bei der Untersuchung auf DNA-
Fragmentation geringfügig und nicht signifikant über dem Wert für Staurosporin (ca.
260%).Dies bedeutet, daß die DNA-Fragmentation zumindest nach 24h nicht beeinflußt wird.
Da in der Literatur eine Freisetzung von Cytochrom C durch Staurosporin beschrieben ist,
könnte die gleichbleibende DNA-Fragmentation durch andere Mechanismen verursacht sein.
Eventuell verhindert Pramipexol zumindest kurzfristig innerhalb 24h die Zerstörung der
Mitochondrien (Abbildung Nr. 27).
Abbildung 27: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 1µmol/L Staurosporin behandelt. Zusätzlich erfolgte eine Inkubation mit 10 -1000 µmol/L Pramipexol. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT nach 24h b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
A B
Pramipexol[µmol/L]
Kontro
lle
Stauros
porin 10 10
010
00
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
n = 5SE
**
*
Pramipexol[µmol/L]
Kontro
lle
Stauros
porin 10 10
010
00
DN
A Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
100
200
300
400
n = 5SEM
**
Deprenyl im Staurosporin-Modell Es konnte gezeigt werden, daß beim Abbau von Dopamin in Zellen vermehrt O2-Radikale
gebildet werden. Eine Beschränkung der Dopamin-Exposition von Neuronen durch
verschiedene Massnahmen konnte auch die Radikalbilung und vermehrten Zelltod in einigen
Modellen verhindern. Auch eine Beschränkung des Dopamin-Abbaus kann die
Radikalbelastung senken. Da ein Grossteil des Abbaus von den Monoaminoxidasen (MAO)
durchgeführt wird, ist die Hemmung derselben ein Weg, den Radikalstress der Zellen zu
senken. Aus diesem Grund wurde der MAO-B Inhibitor Deprenyl im Staurosporin-Modell
angewandt und der Einfluß auf Überleben und DNA-Fragmentation untersucht.
77
ERGEBNISSE 78
Nach 24h Staurosporin-Inkubation war nur noch eine gegenüber der Kontrolle 20%ige
Reduktion von MTT durch die Kortexneuronen möglich. Eine signifikante Änderung dieses
Wertes konnte lediglich mit der Co-Inkubation von 1000 µmol/L Deprenyl erreicht werden.
Die Vitalität konnte auf 50% der Kontrolle gesteigert werden. Dieses Ergebnis spiegelt sich
allerdings nicht in den Untersuchungen zur DNA-Fragmentation wieder: die um 40%
gegenüber der Kontrolle gesteigerte DNA-Fragmentation wurde nicht signifikant durch
Deprenyl verändert (Abbildung Nr. 28).
Abbildung 28: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 1µmol/L Staurosporin behandelt. Zusätzlich wurden die Neuronen mit verschiedenen Konzentrationen Deprenyl behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT nach 24h b) DNA-Fragmentation. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
A B
Deprenyl[µmol/L]
Kontro
lle
Stauros
porin 0,0
1 0,1 1 10 100
1000
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
n > 6SE
**
*
Deprenyl[µmol/L]
Kontro
lle
Stauros
porin
0,001 0,0
1 0,1 1 10 100
1000
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
100
200
300
400
500
600
n = 6-8SE
**
Dipyridamol im Staurosporin-Modell Dipyridamol wurde getestet, weil Adenoside ebenfalls Apoptose auslösen können. Der
Adenosin Transport-Inhibitor Dipyridamol wurde in einigen Studien als neuroprotektiv
beschrieben. Aus der Literatur war bekannt, daß Dipyridamol in einer Konzentration von
100 µmol/L toxisch für Neuronen ist. Dies konnte im MTT-Test bestätigt werden: die durch
Staurosporin geschädigten Zellen, die MTT gegenüber der Kontrolle nur noch zu 40%
umsetzen konnten, wurden durch Dipyridamol zu ca. 90% beim Umsetzen von MTT inhibiert.
Konzentrationen von 1 oder 10µmol/L Dipyridamol hatten keinen Einfluß. Im DNA-
Fragmentations-Test konnte zwar eine konzentrationsabhängige Abnahme der DNA-
Fragmentation festgestellt werden, was jedoch aufgrund der Daten des MTT-Tests nicht als
Abnahme gewertet wurde. Vielmehr ist es wahrscheinlich, daß die DNA schon so weit
78
ERGEBNISSE 79
abgebaut worden war, daß sie nicht mehr als fragmentiert nachgewiesen werden konnte
(Abbildung Nr. 29).
Abbildung 29: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit 1µmol/L Staurosporin behandelt. Zusätzlich erfolgte eine Inkubation mit 1-100 µmol/L Dipyridamol. Nach 24h wurde auf a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT und b) DNA-Fragmentation untersucht. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
A B
Dipyridamol[µmol/L]
Kontro
lle
Stauros
porin 1 10 10
0
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
n = 6SE
**
**
Dipyridamol[µmol/L]
Kontro
lle
Stauros
porin 1 10 10
0
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
50
100
150
200
250
n = 5SE
**
**
FK506 im Staurosporin-Modell FK506 ist eine interessante Substanz, die eine klinisch wichtige Funktion als
Immunsuppressivum hat. Diese Eigenschaft beruht auf der Komplexierung von FK506 mit
dem Protein FKBP12 und anschliessender Hemmung von Calcineurin durch diesen Komplex
beruht. Darüber hinaus hemmt FK506 die Peptidyl-Prolyl-Isomerase Enzymtätigkeit (PPIase)
(Rotamase) von FKBP12. Zusätzlich konnte gezeigt werden, daß FK506 neuronale Zellen
sowohl gegen Ischaemie als auch gegen exzitatorische Toxizität und gegen apoptotische
Mechanismen nach einer Verletzung des nervus opticus schützt. Auch gegen einen Entzug
von NGF kann FK506 neuronale Zellkulturen schützen.
In den eigenen Versuchen konnte die neuroprotektive Wirkung von FK506 im Staurosporin-
Modell mit Kortexneuronen nicht beobachtet werden. FK506 zeigte in keinem der Tests
(MTT, DNA-Fragmentation, LDH) bei keiner der benutzten Konzentration eine signifikante
Wirkung (Abbildung Nr. 30).
79
ERGEBNISSE 80
Abbildung 30: 14d alte Kortex-Neurone wurden für 24h mit 1µmol/L Staurosporin behandelt. Zusätzlich wurden die Neuronen mit FK506 in verschiedenen Konzentrationen behandelt. a) Fähigkeit zur Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat Dehydrogenase. ∗∗P< 0,01
A B
C
FK506[µmol/L]
Kontrolle
Staurosporin 0,1 1 10
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
n = 4SE
**
FK 506[µmol/L]
Kontrolle
Staurosporin 0,1 1 10
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
K]
0
20
40
60
80
100
120
140
n = 2MW
FK 506[µmol/L]
Kontrolle
Staurosporin 0,1 1 10
LDH
-Fre
iset
zung
[% T
riton
]
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
n = 8SE
**
FK506 im Malonat-Modell mit Kortexneuronen
80
ERGEBNISSE 81
FK506 wurde ebenfalls im Malonat-Modell mit Kortexneuronen auf seine neuroprotektive
Wirkung hin untersucht. Auch in diesem Modell konnte keine signifikante Wirkung gegen
Zelltod oder DNA-Fragmentation detektiert werden: weder wurde im MTT-Test die Vitalität
der Zellen erhöht, noch wurde die DNA-Fragmentation unterdrückt. Auch die Freisetzung von
Lactat-Dehydrogenase wurde nicht unterbunden (Abbildung Nr. 31).
A B %
]
=100
n [K
ktio
Red
u
TT-
M
C
Abbildung 31: 14d alte Kortexneuronen wurden für 24h mit Malonat (15 mmol/L) behandelt. Zusätzlich wurden die Kulturen mit FK 506 in verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Nach 24h wurden die Zellen auf a) Fähigkeit zu Reduktion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von Lactat-Dehydrogenase hin untersucht. ∗P< 0,05 ∗∗P< 0,01
FK 506[µmol/L]
KontrolleMalonat 0,1 1 10
0
20
40
60
80
100
120
n = 3SE
** *
FK 506[µmol/L]
KontrolleMalonat 0,1 1 10
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
n > 3SE
**
FK 506[µmol/L]
KontrolleMalonat 0,1 1 10
LDH
-Fre
iset
zung
[% T
riton
]
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
n > 7SE
**
FK506 im Malonat-Modell mit Striatumneuronen
Ein ähnliches Ergebnis zeigte sich bei der Untersuchung von Striatumneuronen, die mit
Malonat behandelt wurden: weder konnte im MTT-Test die durch Malonatbehandlung auf
20% gesunkene Fähigkeit zur Reduktion von MTT signifikant verbessert werden, noch wurde
die Freisetzung von Lactat Dehydrogenase gehemmt. Die Ergebnisse des Tests zur DNA-
81
ERGEBNISSE 82
Fragmentation sind aufgrund der bei Malonatbehandlung niedrigeren Werte schlecht
auswertbar. Die normalerweise höhere Fragmentation von DNA-Fragmentation war in diesem
Versuch auf ca. 70% gesunken (Abbildung Nr. 32):
Abbildung 32: 14d alte StriT. mit FK506 in verschiedeauf a) Fähigkeit zu RedukLactat Dehydrogenase unte
FK 506[µmol/L]
Kontrolle Malonat 0,1 1 10
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
20
40
60
80
100
120
140
n = 9SE
**
FK 506[µmol/L]
Kontrolle Malonat 0,1 1 10
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
n > 6SE
**
LDH
-Fre
iset
zung
[% T
riton
]
0
20
40
60
FK506 im Methylmalonat- Im Methylmalonat-Modell kon
Änderung bei der Fähigkeit, MT
im DNA-Fragmentations-Test
konnte die auf 200% der Kontr
wurden ebenfalls keine Änderu
gefunden (Abbildung Nr. 33).
C
atumneuronen wurden für 24h mit15mmol/L Malonat und z. nen Konzentrationen inkubiert. Nach 24h wurden die Zellen tion von MTT b) DNA-Fragmentation c) Freisetzung von rsucht. ∗∗P< 0,01
FK 506[µmol/L]
Kontrolle Malonat 0,1 1 10
n = 9SE
**
Modell mit Kortexneuronen
nte bei den mit FK506 behandelten Kortexneuronen keine
T zu reduzieren beobachtet werden. Dieses Ergebnis wurde
bestätigt: keine der untersuchten FK506-Konzentrationen
olle gestiegenen DNA-Fragmentation senken. Im LDH-Test
ngen der LDH-Freisetzung durch Behandlung mit FK506
82
ERGEBNISSE 83
%]
100
n [K
=
dukt
io
-Re
MTT
A
FK 506[µmol/L]
Kontrolle
Methylmalonat 0,1 1 10
0
20
40
60
80
100
120
140
160
n = 12SE
Kontrolle
Methylmalonat 0,1
LDH
-Fre
iset
zung
[Trit
on=1
00%
]
0
20
40
60
80
100D
NA-
Frag
men
tatio
n [K
=100
%]
0
50
100
150
200
250
300
350
C
Abbildung 33: Zeigt 14d alte Kortexneuronen, dieund zum Teil zusätzlich mit 0,1–10 µmol/L FK506die Zellen auf a) Fähigkeit zur Reduktion vFreisetzung von LDH untersucht. ∗∗P< 0,01
FK506 im Methylmalonat-Modell mit Stria In den Striatum-Kulturen konnte im MTT-Test bei 1
der Fähigkeit, MTT zu reduzieren, beobachtet
behandelten Neuronen zeigten Werte von ca. 25% de
mit FK506 behandelten Neuronen einen Wert von c
Trend aufgrund der starken Streuung nicht si
Fragmentations-Test zeigten keine Reduktion der n
durch FK506. Auch die Freisetzung von Lactat De
gehemmt (Abbildung Nr. 34).
83
B
FK 506[µmol/L]
1 10
n = 11SE
FK 506[µmol/L]
Kontrolle
Methylmalonat 0,1 1 10
n = 10SE
**
für 24h mit 20 mmol/L Methylmalonat behandelt wurden. Nach 24h wurden on MTT b) DNA-Fragmentation c)
tumneuronen
0 mmol/L FK506 ein leichtes Ansteigen
werden. Die nur mit Methylmalonat
s Kontrollwertes, während die zusätzlich
a. 50% erreichten. Allerdings war dieser
gnifikant. Die Ergebnisse im DNA-
ur leicht erhöhten Fragmentationswerte
hydrogenase wurde nicht durch FK506
ERGEBNISSE 84
MTT
-Red
uktio
n [K
=100
%]
0
50
100
A
DN
A-Fr
agm
enta
tion
[K=1
00%
]
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
FK 506[µmol/L]
Kontrolle
Methylmalonat 0,1 1 10
n = 12SE
**
Kontrolle
Methylmalonat 0,1
LDH
-Fre
iset
zung
[Trit
on=1
00%
]
0
20
40
60
80
**
Abbildung 34: 14d alte Striatumneuronen wurde24h behandelten. Zusätzlich wurden die Neurowurden die Zellen auf a) Fähigkeit zu ReduktionFreisetzung von LDH untersucht. ∗∗P< 0,01
84
B
FK506[µmol/L]
Kontrolle
Methylmalonat p 0,1 1 10
n = 7SE
C
FK 506[µmol/L]
1 10
n = 12SE
n mit 20 mmol/L Methylmalonat über nen mit FK506 inkubiert. Nach 24h von MTT b) DNA-Fragmentation c)
DISKUSSION 85
DISKUSSION
Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Apoptose bei der neuronalen Degeneration zu
untersuchen. Dazu wurden in vitro Modelle für Apoptose und Neurodegeneration etabliert,
Nachweismethoden für Apoptose an diese Modelle adaptiert und schließlich potentiell
antiapoptotischen Substanzen in den Modellen getestet.
Zunächst wurde in reinen, serumfreien Neuronenkulturen aus dem Kortex oder Striatum der
Ratte sowie in PC12-Zellen Apoptose durch die Zugabe von Staurosporin induziert. Mit Hilfe
dieser Standard-Substanz wurden geeignete Nachweismethoden ausgewählt: Die Vitalität der
Zellkulturen wurde durch die Reduktion eines zugegebenen Tetrazoliumsalzes bestimmt
(MTT-Test). Apoptose wurde anhand der DNA-Fragmente, die sich bei Apoptose bilden, mit
Hilfe eines ELISA quantifiziert. Tatsächlich sinkt die Zahl der lebenden Neurone nach
Staurosporin-Behandlung konzentrationsabhängig ab. Die DNA-Fragmentation nimmt
hingegen stark zu. Zusätzlich wurde die Aktivität von Caspase-3 im Lysat Staurosporin-
behandelter Zellen bestimmt. Auch hier zeigt sich eine Aktivitätssteigerung von Caspase-3
durch die Behandlung der Kortex-Neuronen mit Staurosporin. Ebenso konnte ein weiterer
wichtiger Marker für Apoptose, die Exposition von Phosphatidylserin, bei Staurosporin-
behandelten Zellen fluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen werden. Neben Kortexneuronen
wurden auch Striatumneurone untersucht: auch hier induziert Staurosporin
konzentrationsabhängig Zelltod und DNA-Fragmentation. Durch Zugabe des Breitspektrum
Caspase-Inhibitors ZVAD-fmk kann sowohl Zelltod als auch DNA-Fragmentation in
Kortexneuronen gehemmt werden, während die Wirkung in Striatum-Neuronen weniger
ausgeprägt war. Die Substanzen Pramipexol, FK506 und Caspase-3-Inhibitor konnten den
durch Staurosporin induzierten Zelltod und die DNA-Fragmentation nicht signifikant
verhindern, jedoch vermochte eine Inkubation mit Deprenyl den Zelltod signifikant zu
verhindern.
In weiteren Modellen für Neurodegeneration wurde die Zellen mit Glutamat, H2O2, AraC
sowie Medium ohne trophische Faktoren inkubiert oder einer Hypoxie/Hypoglykämie
unterzogen. In diesen Modellen konnte jedoch keine Apoptose beobachtet werden. Durch
Inkubation der Neurone mit Malonat oder Methylmalonat wird hingegen sowohl Zelltod als
85
DISKUSSION 86
auch DNA-Fragmentation ausgelöst. Die Bestimmung des Zelltods im Malonat-Modell und
Methylmalonat-Modell erfolgte über die Quantifizierung der freigesetzten Lactat-
Dehydrogenase. Im Gegensatz zum Staurosporin-Modell hatte ZVAD-fmk im
Methylmalonat-Modell mit Kortex-Neuronen nur Einfluß auf die DNA-Fragmentation. Im
Malonat-Modell mit Kortex-Neuronen ergab sich kein signifikanter Unterschied durch die
Behandlung mit ZVAD-fmk. Dagegen konnte bei der Verwendung von Striatum-Neuronen
die durch Malonat induzierte DNA-Fragmentation signifikant reduziert werden. FK506
konnte weder im Malonat-Modell noch im Methylmalonat-Modell Zelltod oder DNA-
Fragmentation in Kortex- oder Striatum-Neuronen verhindern.
Nachweismethoden für Apoptose / Zelltod In dieser Arbeit wurden verschiedene Methoden zum Nachweis von Apoptose verwendet.
Letztlich kann man die einzelnen Methoden immer nur anwenden, um ein bestimmtes,
spezifisches Ereignis (z.B. Fragmentation von DNA) nachzuweisen, das Teil des gesamten
apoptotischen Vorgangs ist. Die TUNEL-Reaktion, die vor einigen Jahren noch eine der
Standard-Nachweisreaktionen für Apoptose darstellte, kann nach neueren Erkenntnissen auch
durch Nekrose verursachten DNA-Abbau markieren (Grasl-Kraupp, B. et al., 1995).Grasl-
Kraupp et al. haben festgestellt, daß in Leberzellen sowohl sicher Nekrose induzierende
Substanzen als auch Apoptose induzierende Substanzen eine positive TUNEL-Testung
ermöglichen. Außerdem ergaben Astrogliazellen, die in der Kultur abgetötet werden, bei der
TUNEL-Methode ebenfalls ein positives Ergebnis. Ein weiterer Nachteil ist die schlechte
Automatisierbarkeit, da die gefärbten Zellen jeweils unter einem Fluoreszenzmikroskop
ausgezählt werden müssen.
Der Nachweis der DNA-Fragmente mit Hilfe von Antikörpern in einem ELISA beruht auf der
Tatsache, daß die bei Apoptose aktivierten DNAsen nur zwischen den Nukleosomen
schneiden und die DNA-Fragmente durch die noch intakte Zellmembran im Zytoplasma
zurückgehalten werden. Die Histon-DNA-Komplexe bleiben bei Apoptose also zunächst
intakt; die bei Nekrose aktivierten DNAsen schneiden jedoch auch die mit Histon assoziierte
DNA und zerstören damit diese Bindung (Burgoyne, L. A. et al., 1974; Stach, R. W. et al.,
1979). Mehrere Autoren haben in den letzten Jahren mit diesem Test-Prinzip gearbeitet und
damit Apoptose auch bei neuronalen oder Neuronen-ähnlichen Zellen zeigen können (Maroto,
R. und Perez-Polo, J. R., 1997; Ray, A. M. et al., 2000; Ohgoh, M. et al., 2000; Bonfoco, E. et
al., 1995). Weitere Vorteile sind die Quantifizierbarkeit und die einfache Handhabung.
86
DISKUSSION 87
In den meisten Fällen ist Caspase-3 beim apoptotischen Zelltod aktiviert. Daher wird eine
Zunahme von Caspase-3 Aktivität von den meisten Autoren mit apoptotischem Zelltod
gleichgesetzt. Allerdings sind auch einige Beispiele bekannt, wo Caspase-3 deletierte Zellen
trotzdem apoptotisch zugrunde gehen oder wo der Einsatz von Caspase-3 Inhibitoren den
Zelltod nicht verhindern kann.
Der Nachweis von exponiertem Phosphatidylserin mit Annexin-Färbungen scheint sehr
spezifisch als Nachweis für Apoptose zu sein. Im allgemeinen ist diese Exposition auch einer
der frühesten Marker für Apoptose. Allerdings ist dieser Test vor allem bei nicht-neuronalen
Zellen angewandt worden. Adayev et al. berichten, daß in einer neuronalen Zellinie
hippocampalen Ursprungs, HN2-5-Zellen, die Exposition von Phosphatidylserin nach
Induktion von Apoptose erst in einem späten Stadium auftreten kann. In diesem Stadium ist
auch schon Caspase-3 aktiviert, die DNA fragmentiert und zum Teil die Zellmembran
zerstört. Dies steht im Gegensatz zu der Meinung, daß Phosphatidylserin in einem sehr frühen
Stadium der Apoptose auf der Außenseite der Zellen nachgewiesen werden kann (Adayev, T.
et al., 1998).
87
DISKUSSION 88
Apoptose- / Neurodegenerationsmodelle
Staurosporin als Apoptose-Induktor
Der Kinase-Inhibitor Staurosporin wurde und wird in sehr vielen Modellen als Apoptose-
auslösende Substanz benutzt. Auch in vielen neuronalen Zellen vermag Staurosporin
Apoptose zu induzieren (Koh, J. Y. et al., 1995; Ahlemeyer, B. et al., 2000; Small, D. L. et
al., 1999). Ein Angriffsziel bei Neuronen sind die Rezeptoren für neurotrophe Faktoren wie
NGF oder BDNF, die das Signal durch Phosphorylierung weitergeben (Ohmichi, M. et al.,
1992). Staurosporin inhibiert auch bei PC12-Zellen die NGF-abhängige Protein-
Phosphorylierung, ebenso wird die Induktion von c-fos gehemmt. Auch wird die trk-Onkogen
abhängige Phosphorylierung in der Zellinie NIH3T3 gehemmt (Miyasaka, T. et al., 1991;
Ohmichi, M. et al., 1992). In Neuronenkulturen des Huhns konnte Staurosporin auch die
Hydrolyse von Sphingomyelin zu Ceramid bewirken, was ebenfalls proapoptotisch wirkt
(Wiesner, D. A. und Dawson, G., 1996). Staurosporin kann Caspase-3 in Zellen aktivieren
(chakravarthy, B. R. et al., 1999; Keane, R. W. et al., 1997), jedoch auch in Caspase-3
deletierten Zellen Apoptose auslösen –hier allerdings ohne die typische DNA-Fragmentation
oder Blebbing (Janicke, R. U. et al., 1998). Die Wirkung von Staurosporin kann z.B. von
mutiertem Presenilin noch verstärkt werden (Kovacs, D. M. et al., 1999). In sehr geringen
Konzentrationen vermag Staurosporin allerdings auch das Auswachsen von Neuriten in
PC12-Zellen auszulösen (Rasouly, D. und Lazarovici, P., 1994; Rasouly, D. et al., 1993;
Rasouly, D. et al., 1992).
Die gewählten Staurosporin-Konzentrationen lagen meist zwischen 0,1 und 1µmol/L; die
Zeiten der Inkubation wurden je nach Apoptose-Nachweis zwischen 4h und 48h festgelegt.
Natürlich hängt die Inkubationszeit auch von der verwendeten Staurosporin-Konzentration
sowie von den Zellen und den Kulturbedingungen ab.
In eigenen Versuchen zunächst mit Kortexneuronen konnte ebenfalls DNA-Fragmentation
nachgewiesen werden. Dabei erwies sich die Konzentration von 1µmol/L Staurosporin und
die Einwirkzeit von 24h als geeignet, um Apoptose sicher zu induzieren. Die DNA-
Fragmentation erreicht bei dieser Kombination Werte von über 200% der Kontrolle, während
simultan die Fähigkeit, MTT zu reduzieren, auf ca. 20% der Kontrolle abnimmt. Eine längere
88
DISKUSSION 89
Inkubation über 48h läßt die Werte der DNA-Fragmentation wahrscheinlich aufgrund
weiterer Degradation der DNA-Histon-Komplexe bei Konzentrationen über 0,1 µmol/L
Staurosporin wieder kleiner werden. Die beschriebene größere Empfindlichkeit jüngerer
Neurone gegenüber Apoptose konnte in eigenen Versuchen bestätigt werden: 7d alte
Kortexneurone zeigen DNA-Fragmentationswerte von 250% der Kontrolle. Das Überleben
der jüngeren Neuronen ist allerdings besser. In diesem Alter sind jedoch NMDA-Rezeptoren,
die ebenfalls eine wichtige Rolle bei Neurodegeneration spielen können, noch nicht voll
entwickelt. Da in vitro Modelle für neurodegenerative Erkrankungen entwickelt werden
sollten, und diese hauptsächlich im Alter auftreten, wo Neurone im Gehirn voll entwickelte
Glutamat-Rezeptoren besitzen, wurden für weitere Untersuchungen 14tägige Kulturen
benutzt.
Der selbst bestimmte EC50-Wert für DNA-Fragmentation von ca. 70 nmol/L Staurosporin bei
24stündiger Exposition und von ca. 40 nmol/L Staurosporin bei 48stündiger Behandlung liegt
im Bereich der Werte, die andere Autoren bestimmt haben. Nach 48h Inkubation von Kortex-
Glia-Mischkulturen aus der Maus mit Staurosporin bestimmten sie einen EC50-Wert von
30 nmol/L (Koh, J. Y. et al., 1995). Andere Autoren konnten durch Staurosporin-Behandlung
mit 0,5 µmol/L in neuronalen Misch Kulturen aus Mäusen nach 16 Stunden eine Wirkung auf
die Vitalität der Neuronen erkennen (Keane, R. W. et al., 1997).
Die mit Staurosporin behandelten PC12-Zellen zeigen deutlich höhere DNA-Fragmentations-
Werte bei Staurosporin-Behandlung als Kortex-Neuronen. Allerdings überleben bei ca. 0,7
µmol/L Staurosporin 50% der Zellen. Die Abhängigkeit der Zellen von nur einem trophischen
Faktor im Medium, dessen Wirkung duch Staurosporin beeinflusst wird, könnte dafür der
Grund sein.
Striatale Kulturen zeigen einen ähnlichen EC50-Wert, was die DNA-Fragmentation betrifft:
ca. 20 nmol/L Staurosporin. Im MTT-Test zeigen sich die striatalen Neuronen sogar weniger
empfindlich gegenüber Staurosporin: der IC50-Wert liegt bei ca. 200 nmol/L Staurosporin.
Die um das ca. 2,5fache erhöhte Aktivität von Caspase-3 und die Exposition von
Phosphatidylserin zeigen ebenfalls Apoptoseinduktion durch Staurosporin in den
Kortexneuronen an. Da DNA-Fragmentation und andere Marker übereinstimmend auftraten,
89
DISKUSSION 90
wurde der Apoptose-Nachweis in weiteren Versuchen mittels Bestimmung der DNA-
Fragmentation per ELISA vorgenommen.
Glutamat als Apoptosemodell Obwohl die Aminosäure Glutamat einer der wichtigsten Botenstoffe im Säugerhirn ist, kann
Glutamat auf Neurone auch toxisch wirken (Rothman, S. M., 1983; Choi, D. W. et al., 1987;
Benveniste, H. et al., 1984). Bei einer zu hohen Konzentration kann es zur sogenannten
exzitatorischen Toxizität kommen, bei der die Zellen vor allem durch die Überaktivierung von
Glutamatrezeptoren geschädigt werden können. Obwohl man ursprünglich von einer rein
nekrotischen Schädigung ausging, gibt es seit einiger Zeit auch Hinweise auf einen
apoptotischen Beitrag zum Zelluntergang (Gwag, B. J. et al., 1995; Grilli, M. und Memo, M.,
1999; Liu, X. und Zhu, X. Z., 1999; Tenneti, L. und Lipton, S. A., 2000). Dabei wurde z.B. in
vivo in striatalen Zellen durch einen metabotropen Glutamat-Agonisten DNA-Fragmentation
ausgelöst (Wang, Y. et al., 1997). In PC12-Zellen wurde eine Schädigung durch Glutamat
(500 µmol/L; 2h) induziert, die durch Überexpression (ca. 100fach) des antiapoptotischen
Proteins Bcl-2 das Überleben der Zellen verbesserte (Tyurin, V. A. et al., 1998). In
cerebrokortikalen Neuronen bewirkte eine Inkubation mit 300 µmol/L NMDA für 20 min in
vitro die Kondensation von Chromatin. Der Inhibitor ZVAD-fmk senkt in diesem Modell die
Anzahl apoptotischer Zellen von ca. 35% auf ca. 15% (Tenneti, L. et al., 1998).
Eigene Versuche mit zunächst 24stündiger Behandlung der Zellen mit Glutamat bewirkte
zwar Zelltod mit einem EC50-Wert von ca. 1,5 µmol/L Glutamat im MTT-Test, jedoch keine
DNA-Fragmentation. Die Werte der DNA-Fragmentation sanken bei steigenden
Konzentrationen von Glutamat, was auf nekrotische Degradation von DNA hinweist.
Bestätigt werden diese Ergebnisse durch andere Studien: kortikale Zellen wurden nach 14d in
Kultur mit 100µM Glutamat behandelt. Nach 6h zeigte sich daß ca. 43% der Zellen eine
nekrotische Morphologie hatten. Staurosporin vermittelte in den gleichen Kulturen jedoch
Apoptose (Small, D. L. et al., 1999). Körnerzellen der Ratte zeigten weder DEVD-spaltende
Aktivitätserhöhung nach Glutamatexposition (0,1; 1mmol/L für 24h) noch wurden die Zellen
durch Apoptose-Inhibitoren geschützt (Simons, M. et al., 1999).
90
DISKUSSION 91
Da viele Autoren sehr kurze Einwirkzeiten für Glutamat wählen (Jiang, Q. et al., 2000; Grilli,
M. und Memo, M., 1999), wurden weitere Versuche mit nur 10minütiger Einwirkzeit von
Glutamat gemacht. Tatsächlich ist die Toxizität nach 24h mit derjenigen vergleichbar, bei der
die Neuronen 24h lang behandelt wurden: der EC50-Wert ist ähnlich. Die DNA-Fragmentation
ist auch hier nicht signifikant stärker als in der Kontrolle; wird bei hohen
Glutamatkonzentrationen aber auch nicht schwächer. Ein Grund für den nekrotischen Zelltod
könnte sein, daß die benutzten Kulturen sehr reine Neuronenkulturen sind, in denen keine
Astrozyten Glutamat abbauen oder Radikalstress abpuffern können. Bei vielen anderen
Autoren kommen Mischkulturen zum Einsatz (Ahlemeyer, B. et al., 2000; Hirashima, Y. et
al., 1999). Auch die Möglichkeit der Maskierung von Apoptose durch Nekrose ist beschrieben
worden. Eine pharmakologische Blockade der Glutamat-Toxizität bei Hypoxie bewirkte eine
klare Ausprägung apoptotischer Marker (Gwag, B. J. et al., 1995). Eine weitere Erklärung für
die unterschiedlichen Ergebnisse könnte die Verwendung unterschiedlich alter Neuronen sein.
Viele Autoren benutzen jüngere, ungefähr 7d alte Neuronenkulturen (Hirashima, Y. et al.,
1999). Chihab et al. haben 6 und 13d alte Kulturen aus dem Vorderhirn der Ratte auf die
Wirkung von Glutamat und Hypoxie untersucht. 6d alte Neuronen zeigten keine Schädigung
durch Glutamat (jedoch Apoptose durch Hypoxie). 13d alte Kulturen hingegen zeigten nach
Behandlung mit Glutamat Schädigung durch Nekrose. Eine Hypoxie bewirkte in 13d alten
Kulturen eine Mischform aus Nekrose und Apoptose (Chihab, R. et al., 1998).
Entzug trophischer Faktoren als Apoptosemodell Der Entzug von trophischen Faktoren ist einer der als erstes benutzten Induktoren um
Apoptose zu induzieren. Dabei kann sowohl auf den Zusatz von Serum mit z.T. undefinierten
Inhaltsstoffen als auch auf definierte Faktoren wie NGF bei PC12-Zellen verzichtet werden.
Je nach Kulturbedingungen sind diese Zusätze für das Überleben von neuronalen Zellen
zwingend notwendig, wenn nicht Gliazellen in Kultur vorhanden sind um die Faktoren zu
produzieren. Unter vielen Kulturbedingungen und in vielen Zellarten zeigt sich auch eine
Induktion proapoptotischer Faktoren durch den Entzug trophischer Faktoren (Solovyan, V. et
al., 1998; Owada, K. et al., 1999; Maroto, R. und Perez-Polo, J. R., 1997; Przywara, D. A. et
al., 1998; Ahlemeyer, B. und Krieglstein, J., 1997).
In eigenen Kortexkulturen wird durch den Entzug konditionierten Mediums nach 24h
tatsächlich ein Rückgang der MTT-Reduktion beobachtet. Es besteht auch ein Trend zu
91
DISKUSSION 92
erhöhter DNA-Fragmentation (bis 200% der Kontrolle), der allerdings nicht signifikant ist.
Ebenfalls nicht signifikant ist der Unterschied zwischen Neurobasal-Medium und Neurobasal-
Medium mit dem Zusatz von B27. Da B27 einige neuroprotektive Substanzen enthält, wäre es
durchaus möglich, daß dessen Zusatz die DNA-Fragmentation senkt. Da Apoptose aufgrund
von Faktor-Entzug vor allem im reifenden Hirn vorkommt, ist es möglich , daß die eigenen,
14d alten Kulturen weniger anfällig für diese Art der Induktion waren.
Da keine signifikanten Änderungen bei der DNA-Fragmentation durch den Entzug
konditionierten Mediums bedingt wurden, scheint es als Modell zur Induktion von Apoptose
unter den gegebenen Bedingungen nicht geeignet zu sein.
Wasserstoffperoxid als Apoptosemodell
Verstärkter Radikalstress kann ebenfalls in einer Vielzahl von Zellarten zum apoptotischen
Tod führen. Die Zugabe von H2O2 zu Zellkulturen wird oft als Modell für oxidativen Stress
benutzt (Maroto, R. und Perez-Polo, J. R., 1997; Uberti, D. et al., 1999; Mielke, K. et al.,
2000; Lee, M. S. et al., 2000). H2O2 gehört nicht zu den Sauerstoff-Spezies, die Radikale sind.
Es wird beim normalen Metabolismus der Neuronen durch die Superoxid-Dismutase beim
Abbau von Superoxid-Radikalen gebildet. Zudem entsteht es bei der Oxidation von
Katecholaminen durch die Monoamin-Oxidase (Halliwell, B., 1992). Die per Mikrodialyse
gemessene Konzentration von H2O2 kann in pathologischen Zuständen (Ischämie-
Reperfusion) durchaus über 100µM erreichen. In einzelnen Kompartimenten (direkt im
Mitochondrium) kann daher die Konzentration durchaus noch höher liegen (Hyslop, P. A. et
al., 1995). Neben den toxischen Wirkungen der Radikale, die aus H2O2 gebildet werden
können, kann H2O2 auch Spaltung des Neuronen-spezifischen Aktivators von CDK5 (cyclin
dependent kinase 5; zuständig unter anderem für das Auswachsen von Neuriten) p35 zu p25
bewirken. Dies führt zu einer Hyperphosphorylierung von Tau, zerstört das Zytoskelett und
fördert den apoptotischen Tod der Neuronen. Die Spaltung von p35 zu p25 wird
offensichtlich von Calpain durchgeführt und ist damit Kalzium-abhängig (Lee, M. S. et al.,
2000). Auch können die Proteine BAK, BAX und BCL-XL durch H2O2 Inkubation
hochreguliert werden (Maroto, R. und Perez-Polo, J. R., 1997). Schließlich kann H2O2 JNK
(Mielke, K. et al., 2000; Bhat, N. R. und Zhang, P., 1999), ERK und p38 MAPK
phosphorylieren und aktivieren (Bhat, N. R. und Zhang, P., 1999) oder die Produktion von
NADH im Zitronensäurezyklus verringern und damit die respiratorische Kapazität in Zellen
92
DISKUSSION 93
limitieren (Chinopoulos, C. et al., 1999) und in Folge davon auch den ATP-Gehalt (Tretter, L.
et al., 1997; Chinopoulos, C. et al., 2000; Sims, N. R. et al., 2000).
Wird H2O2 zu kultivierten Neuronen oder Gliazellen gegeben, erfolgt der Abbau relativ
schnell. Dringen et al. haben die Halbwertszeit von H2O2 und organischen Hydroperoxiden in
astrogliareichen Neuronenkulturen bestimmt. 100 µM H2O2 hat eine Halbwertszeit von
3,1 ± 0,5 min, tBHP (tertiary butylhydroperoxide) 3,5 ± 0,2 min und CHP (Cumene
Hydroperoxide) 4,2 ± 0,2 min. H2O2 und CHP sind im Medium ohne Zellen über 30 min
stabil, während tBHP bei 37°C schon nach 24,5 min zur Hälfte abgebaut ist (Dringen, R. et
al., 1998). In relativ reinen Neuronenkulturen wurde H2O2 (Anfangskonzentration 100µM)
nach 15,1 ± 1,4min zur Hälfte abgebaut. Der Gesamt-Proteingehalt der ausgesäten Neuronen
war allerdings geringer als in den astrogliareichen Kulturen. Bei entsprechender Korrektur
war die Abbaurate in beiden Kulturtypen vergleichbar. Unterschiedlich war allerdings die
Fähigkeit des Glutathion-Systems zum Abbau von H2O2, das bei Neuronen nicht so
ausgeprägt ist (Dringen, R. et al., 1999). Will man einen permanenten oxidativen Stress in
Zellkulturen induzieren, so empfiehlt sich die Benutzung eines Systems, das die Umsetzung
von Hypoxanthin durch Xanthin-Oxidase und Superoxid-Dismutase zu H2O2 nutzt
(Hirrlinger, J. et al., 1999).
Die in eigenen Versuchen verwendete H2O2-Inkubationszeit von 24h relativiert sich durch den
oben beschriebenen schnellen Abbau in Kultur. Damit sollten die Versuche vergleichbar mit
denen anderer Autoren sein, die kürzere Einwirkzeiten für H2O2 nutzen. Teilweise wird in der
Literatur ein apoptotischer Tod der Zellen beschrieben (Maroto, R. und Perez-Polo, J. R.,
1997; Uberti, D. et al., 1999); teilweise überwiegend Nekrose oder Mischformen (Bastianetto,
S. et al., 1999; Bhat, N. R. und Zhang, P., 1999; Duffy, S. et al., 1998; Sagara, Y. et al.,
1999). Die eingesetzten Konzentrationen, die Zelltod auslösten, lagen im Bereich 20µmol/L
bis 1mmol/L. In relativ reinen Kulturen mit Kortex-Neuronen der Ratte verursachte eine
30minütige H2O2 Inkubation nach 6h einen toxischen Effekt, der nach 24h maximal war (ca.
45% überlebende Zellen). Der LC50 betrug 41,8 ± 1,9µM (Fernández-Tomé, P. et al., 1999).
Der in eigenen Versuchen bestimmte Wert liegt im gleichen Bereich. Offensichtlich wurde
aber bei den eigenen Versuchen lediglich Nekrose induzierte. Vielleicht waren auch die
Konzentrationen von H2O2 nicht fein genug abgestuft. Die späteren Experimente mit Malonat
zeigen, daß Apoptose nur in einem engen Konzentrationsbereich von Malonat auftritt. Eine
ständige Inkubation mit geringen Konzentrationen von H2O2 statt einer einmaligen Gabe
93
DISKUSSION 94
hoher Konzentrationen hätte evtl. auch DNA-Fragmentation ausgelöst. Da keine erhöhte
DNA-Fragmentation durch Behandlung der Kortexneuronen mit H2O2 festgestellt werden
konnte, wurde das H2O2-Modell nicht weiterverfolgt.
AraC als Apoptosemodell Cytosin Arabinosid (AraC) ist ein kompetitiver Inhibitor des Einbaus von 2´Deoxycytidin in
DNA. Diese Substanz kann allerdings auch in postmitotischen Neuronen Zelltod auslösen. In
Kulturen des Sympathikus aus Ratten konnte mit AraC Apoptose induziert werden. Dazu war
es nicht nötig, den Neuronen NGF zu entziehen. Es konnte DNA-Fragmentation und auch
eine apoptotische Morphologie der Kerne nach Bisbenzimid-Färbung gezeigt werden
(Deckwerth, T. L. und Johnson Jr., E. M., 1993; Martin, D. P. et al., 1990). Neurone des
parasympathischen Systems benötigen für ihr Überleben in Kultur u.a. Insulin. AraC blockiert
konzentrationsabhängig diese trophische Wirkung des Insulin. Auch in DRG-Neuronen wird
die trophische Wirkung von NGF blockiert. Diese Inhibierung scheint nicht-kompetitiv zu
sein; der toxische Effekt kann jedoch von 2´Deoxycytidin blockiert werden. Der toxische
Effekt von AraC wurde bei anderen Mitose-Inhibitoren nicht beobachtet. Der IC50 für das
Überleben nach 4d betrug für beide Versuche 2 x 10-8M (Wallace, T. L. und Johnson Jr., E.
M., 1989). Im Gegensatz dazu kann AraC auch neurotroph wirken bzw. den Zelltod
verhindern: in nanomolaren Konzentrationen verhindert AraC den sonst in Zellkultur spontan
auftretenden apoptotischen Zelltod bei dopaminergen Neuronen des Mesencephalons. Die
Autoren gehen von einem indirekten trophischen Effekt aus, der über die Gliazellen in den
Kulturen vermittelt wird. Bei hohen Konzentrationen (>10µmol/L) sterben alle Neuronen in
den Kulturen. Einen Schutz gegen MPTP vermittelt AraC hingegen nicht (Michel, P. P. et al.,
1998).
Da in eigenen Versuchen selbst hohe Konzentrationen bis zu 10µmol/L AraC keine toxische
Wirkung in kortikalen Kulturen zeigten und zudem die Kulturen am Tag 2 mit AraC zur
Unterdrückung glialen Zellwachstums behandelt werden, wurde auf die Bestimmung der
DNA-Fragmentation verzichtet und das Modell nicht weiterverfolgt. Eine Ursache könnte
darin begründet sein, daß die eigenen neuronalen Kulturen kaum Gliazellen enthalten, die
eventuell für eine erhöhte DNA-Fragmentation verantwortlich sein könnten. Auch der Verlust
trophischer Aktivität durch den Tod von Gliazellen kann in der eigenen Zellkultur nicht
stattfinden.
94
DISKUSSION 95
Entzug von Sauerstoff und Glukose als Apoptosemodell In der Literatur finden sich auch Hinweise auf durch Sauerstoff-Glukose-Entzug verursachten
apoptotischen Zelltod. So konnten Gwag et al. zeigen, daß in kortikalen Neuronenkulturen der
Maus Sauerstoff-Glukose-Entzug nekrotischen Zelltod verursacht. Dieser Zelltod ist
wahrscheinlich durch Toxizität von ausgeschüttetem Glutamat verursacht, da diese Toxizität
durch Glutamat-Antagonisten gehemmt werden kann. Wurde die Hypoxie-Hypoglykämie
weiter verlängert, so trat Apoptose auf (Gwag, B. J. et al., 1995). In 4d alten kortikalen
Neuronen der Maus konnte der nekrotische Zelltod -induziert durch Sauerstoffentzug- durch
Behandlung mit DNQX (6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione; ein Kainat-Antagonist) und Trolox
(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid; ein Inhibitor von Lipid-Oxidation)
inhibiert werden. Trotzdem konnten die Neuronen Apoptose begehen. Besonders in DNQX-
behandelten Zellen war die apoptotische Tätigkeit hoch (TUNEL-Färbung). Bei der DNQX-
behandelten Gruppe wurde auch ein erhöhter Anteil von fragmentierten Zellkernen
festgestellt. Ebenfalls bei den DNQX-behandelten Zellen wurde ein erhöhter Wert von H2O2
gemessen. Offensichtlich wird durch die Blockade des nekrotischen Zelltods die Apoptose
ermöglicht bzw. deutlich gesehen (Copin, J.-C. et al., 1998). In einem in vivo-Modell
transienter globaler Ischämie im Hund konnte gezeigt werden, daß Apoptose und Nekrose
jeweils in bestimmten Neuronenpopulationen auftreten: CA1-Pyramidenzellen und Purkinje-
Zellen waren nekrotisch; degenerierte Körnerzellen jedoch apoptotisch. DNA-Extrakte des
Hippocampus und des Kortex zeigten sowohl apoptotische DNA-Fragmentation als auch
nekrotischen Zufalls-Abbau der DNA (Martin, L. J. et al., 2000). In Kulturen kortikaler
Neuronen der Maus konnte apoptotische DNA-Fragmentation durch den Entzug von
Sauerstoff festgestellt werden, jedoch nicht wenn den Neuronen Serum, Sauerstoff und
Glukose entzogen wurde (Copin, J. C. et al., 1996).
Obwohl in eigenen Versuchen zum Teil deutliche DNA-Fragmentation bei kortikalen
Kulturen festgestellt wurde, fehlte dieser Marker für Apoptose bei annähernd gleich
durchgeführtem Sauerstoff-Glukose-Entzug in anderen Kulturen völlig. Offensichtlich war
eine feine Justierung der Noxe mit den vorhandenen Mitteln nicht möglich, so daß die
Neuronen oft auch nekrotisch starben oder überlebten. Bei einer Induktion von Apoptose muß
die Zelle genügend Energie haben, die Apoptose auch durchzuführen (Nicotera, P. und
Lipton, S. A., 1999), was in eigenen Versuchen wohl nicht der Fall war. Dieses Modell wurde
daher nicht weiterverfolgt.
95
DISKUSSION 96
Methylmalonat / Malonat Die Verhältnisse bei neurodegenerativen Erkrankungen wurden in weiteren Versuchen durch
Inkubation der Zellen mit Malonat simuliert. Malonat hemmt reversibel Komplex II der
Atmungskette und verursacht auf diese Weise Energiemangel und Radiaklstress.
Methylmalonat wird besser von den Zellen aufgenommen und intern in Malonat
umgewandelt. NP-3 ist ein irreversibler Inhibitor von Komplex II der Mitochondrien und
verursacht bei systemischer Gabe in vivo ebenfalls vor allem Defekte im Striatum (Beal, F. M.
et al., 1993).
Komplex II Inhibitoren stellen gute Modelle für Chorea Huntington dar; Energiemangel und
Radikalstress sind jedoch Phänomene, die bei allen neurodegenerativen Erkrankungen
vorkommen (Malcon, C. et al., 2000). Daher verwundert es nicht, daß Methylmalonat auch als
Toxin für ein ALS-Modell in vitro benutzt wird. Behandlung von Motoneuronen mit Malonat
führt zu (wahrscheinlich apoptotischem) Zelltod, der mit Caspase-Inhibitoren verhindert
werden kann (Kaal, E. C. et al., 2000). Weitere Studien zeigen, daß Methylmalonat oder
Malonat die potentiell toxische Wirkung von Dopamin verstärkt, und zwar sowohl in
kortikalen als auch in striatalen Kulturen oder in vivo (McLaughlin, B. A. et al., 1998b; Moy,
L. Y. et al., 2000). Daß oxidativer Stress an der Toxizität von Malonat oder Dopamin beteiligt
ist, wird durch die Tatsache unterstützt, dass ein verringerter Glutathionlevel die Toxizität in
Kulturen des Mesenzephalons verstärkt. BSO (Buthionin sulfoximin) verhindert die Bildung
von Glutathion durch Blockade des ersten Glutathion Synthese-Enzyms (gamma-
Glutamylcystein-Synthetase). Eine Behandlung der Kulturen mit 10 µmol/L BSO für 24h
ergab einen um 68 % erniedrigten Level von Glutathion, der nach 24h alleine nicht toxisch
war. Eine Inkubation der Zellen für 24 mit Malonat (25 mmol/L) war ebenfalls nicht toxisch,
50 mmol/L zeigten einen ersten Trend zur Toxizität, jedoch nicht signifikant. Eine Inkubation
von zunächst mit BSO behandelten Zellen mit Malonat ergab eine signifikante Toxizität von
25 mmol/L Malonat (Zeevalk, G. D. et al., 1997). In einem ähnlichen Zellkultursystem konnte
die Behandlung mit Radikalfängern ebenfalls die Zellen vor dem Zelltod durch Behandlung
mit Malonat oder der Kombination aus BSO/Malonat schützen. Obwohl in dieser Studie
vermutet wird, daß Malonat seine toxische Wirkung auch über den NMDA-Rezeptor entfaltet,
und danach erst der oxidative Stress entsteht, wird auch gezeigt, daß gegen Glutamat selbst
nur ein Teilschutz durch radikalfangende Substanzen besteht. Zusätzliche Versuche zeigten,
daß die GABA-Population von Neuronen in Kultur zwar weniger sensitiv gegenüber Malonat
ist, daß dies jedoch durch BSO aufgehoben wird. Tatsächlich scheinen GABA-Neuronen
96
DISKUSSION 97
lediglich einen höheren Glutathion-Gehalt zu besitzen, der die Zellen vor Malonat bedingtem
Zelltod schützt (Zeevalk, G. D. et al., 1998b).
Einige Hinweise zu der Induktion von apoptotischem Zelltod wurden in folgenden Studien
erhalten: bei intrastriataler Injektion von Malonat in Mäusen wird Caspase-1 aktiviert. Eine
Bestimmung von Interleukin-1-beta ergab sowohl für Wildtypmäuse (125,2 ± 19,6 pg/g
Gewebe), als auch für die Caspase-1-Mutanten (53,2 ± 15,1pg/g) eine erhöhte Konzentration
von Interleukin-1beta gegenüber der Kontrolle (39,6 ± 1,7 pg/g). Die Injektion von Malonat
in Caspase-1 deletierte Mäuse allerdings ergibt einen um 65% kleineren Schaden im Striatum.
Bei der Gabe von 3-NP reduzierte sich der Schaden in den Mutanten sogar um 91,2% . In
anderen Arbeiten konnte gezeigt werden, daß intrastriatale Injektionen von Malonat in einer
Anzahl von TUNEL-positiven Neuronen zu einer Aktivierung von Caspase-2 führt. Läsionen
konnten durch ZVAD-fmk verringert werden (Schulz, J. B. et al., 1998). 3-NP verursacht bei
Applikation auch TUNEL-positive Neuronen und DNA-Fragmentation im Striatum (Sato, S.
et al., 1998; Andreassen, O. A. et al., 2000).
Methylmalonyl-CoA Mutationen (Methylmalonazidurie) sowie ein Mangel an B12 haben
erhöhte Serumkonzentrationen von Methylmalonat zur Folge, die ebenfalls neurotoxisch
wirken können. Untersuchungen dazu wurden u.a. von (de Mattos-Dutra, A. et al., 2000) und
(Narasimhan, P. et al., 1996) durchgeführt.
Die Wirkung von Malonat und Methylmalonat in striatalen und kortikalen Neuronenkulturen
haben McLaughlin et al. verglichen: Die benutzten Kulturen wurden nach 2 Tagen serumfrei
in NB-Medium mit B-27 Zusatz gehalten und enthielten dann maximal 25% Astrozyten. Die
Zellen wurden nach 6-8 Tagen in Kultur untersucht. Im Gegensatz dazu wurden die in der
vorliegenden Arbeit verwendeten Zellen ständig in B-27-haltigem, Astrozytenkonditioniertem
Medium kultiviert. Zudem wurden die Neuronen erst nach 14 Tagen in Kultur den Versuchen
unterzogen.
Bei Mc Laughlin et al. ergab eine Inkubation mit Medium ohne B-27 für 24h einen Zelltod
von 24 % für Kortexneuronen und 17 % für striatale Neuronen gegenüber den Kulturen vor
der Inkubation. Der Einfluß von B27 scheint in diesen Kulturen trotz der angegebenen 25%
Astrozyten stark zu sein.
97
DISKUSSION 98
Eine Behandlung mit 1mmol/L Methylmalonat resultierte bei Kortexkulturen in 50 % und bei
Striatumkulturen in 79 % Zelltod. Wurde mit einer höheren Konzentration von 10 mmol/L
Methylmalonat inkubiert, erreichte die Zahl toter Kortexneuronen 89 % und 95 % toter
striataler Neuronen. Ein Zusatz von B-27 zum Medium kortikaler Kulturen während der
Dauer der Methylmalonatinkubation senkte den Zelltod nicht signifikant. In striatalen
Kulturen hingegen ergab ein Zusatz von B-27 bei einer Inkubation mit 1mmol/L
Methylmalonat einen viel geringeren Anteil toter Zellen von 29 %.
Ein Vergleich von Malonat mit Methylmalonat in Striatumkulturen ergab eine deutlich höhere
Toxizität für Methylmalonat: nach 24h starben bei 1mmol/L Methylmalonat 48 % der Zellen
gegenüber 31 % bei 1mmol/L Malonat. Bei der höheren Konzentration von 10 mmol/L ergab
sich für Methylmalonat ein Wert von 88 % Zelltod gegenüber 39 % bei Malonat. Eine DNA-
Fragmentation wurde in striatalen Kulturen nach Inkubation mit 1 mmol/L Methylmalonat
schon nach 3h beobachtet;, am stärksten ausgeprägt war sie nach 6h. Nach 8h beobachteten
MCLaughlin et al. zusätzlich zum „Laddering“ eine unspezifische Degradation von DNA.
Beides wurde in Kontrollkulturen nicht beobachtet. Apoptose wurde in dieser Studie weiter
bestätigt durch Videoaufnahmen der Zellen: 46% der striatalen Neuronen, die mit 1mmol/L
Methylmalonat behandelt wurden, zeigten das typische „Blebbing“ apoptotischer Zellen; 31%
der Zellen starben jedoch nekrotisch mit typischem Schwellen des Zellkörpers und Platzen
der Zelle. Das Verhältnis ATP/ADP wurde ebenfalls untersucht und zeigte in kortikalen
Kulturen schon nach 20 min einen Rückgang von ca. 10-15%. Nach 3h zeigte sich in
kortikalen sowie striatalen Kulturen bei 1mmol/L Methylmalonat keine signifikante
Auswirkung auf das Verhältnis ATP/ADP, jedoch bei 10 mmol/L ein signifikant geringeres
Verhältnis. Dies war unabhängig von dem Zusatz von B-27. 10 mmol/L Methylmalonat
konnten in den Kortexneuronen in Kultur nach 3h den normalen Kalzium-Ionengehalt
vervierfachen, den K+-Gehalt in der Zelle erniedrigen und den Na+-Gehalt erhöhen. Das
Membranpotential sank schon nach ca. 20 min signifikant ab und erreicht nach 3h Werte von
-20 mV (Kontrollwert: 80mV). Allgemein nimmt die Empfindlichkeit von striatalen
Neuronen in vivo gegenüber Malonat mit dem Alter der Neuronen zu (Beal, F. M. et al.,
1993). Das gilt auch für Glutamat in kortikalen und striatalen Kulturen (Choi, D. W. et al.,
1987; Choi, D. W. et al., 1987).
In Kulturen von Kortex und Striatum treten bei eigenen Versuchen mit Methylmalonat und
Malonat ebenfalls konzentrationsabhängig Zelltod und DNA-Fragmentation auf. Mit dem
98
DISKUSSION 99
MTT-Test wird in diesem Modell nur die Hemmung der Succinat-Dehydrogenase durch
Malonat gemessen, daher wurde der Zelltod mit Hilfe des LDH-Tests bestimmt. Die
halbmaximale Inhibition der Succinat-Dehydrogenase in Kortexneuronen wird durch ca.
30 mM Methylmalonat erreicht; in Striatumkulturen durch ca. 20 mm. Bei 30 mmol/L setzt
auch im LDH-Test bei Kortexneuronen ein Trend zu erhöhtem Zelltod ein, der allerdings bis
100 mM nicht signifikant ist. Striatale Zellen hingegen zeigen schon bei 12 mmol/L
Methylmalonat deutliche LDH-Freisetzung (EC50 ca. 12 mmol/L). Die von McLaughlin et al.
beschriebene höhere Empfindlichkeit von striatalen Kulturen gegenüber Methylmalonat kann
also bestätigt werden. Eine DNA-Fragmentation wird schon bei Konzentrationen von
4 mmol/L Methylmalonat beobachtet, während die maximale (200% der Kontrolle) DNA-
Fragmentation in Kortexkulturen bei 20 mmol/L Methylmalonat auftritt. Diese DNA-
Fragmentation tritt schon nach 4h ein und wird noch stärker bis 24h nach Versuchsbeginn. In
striatalen Kulturen sehen die Werte für DNA-Fragmentation ähnlich aus: die maximalen
Werte werden bei 20 mmol/L Methylmalonat erreicht. Die Unterschiede zu der Studie von
McLaughlin et al. liegen u.a. in der Nutzung von sehr reinen, 14d alten Neuronenkulturen
gegenüber jüngeren Mischkulturen bei McLaughlin et al..
Die Verwendung von Malonat als Succinat-Dehydrogenase-Inhibitor ergab
überraschenderweise bei Kortex-Neuronen sowie bei Striatum-Neuronen eine höhere
Empfindlichkeit sowohl im MTT-Test, bei der DNA-Fragmentation als auch (zumindest für
Kortex-Neuronen) beim LDH-Test. Eine Erklärungs-Möglichkeit wäre, daß Malonat direkt
als Inhibitor vorliegt und sofort wirken kann. Interessant ist, daß Striatumneuronen gegenüber
Malonat bzw. Methylmalonat empfindlicher sind als Kortex-Neuronen, daß jedoch gegenüber
Staurosporin Kortexneuronen zumindest im MTT-Test empfindlicher sind. Die höhere
Empfindlichkeit der Striatumneuronen gegenüber Malonat ist auch in in vivo-Experimenten
gegeben (Beal, F. M. et al., 1993).
99
DISKUSSION 100
Einfluss des pH-Wertes auf die Fragmentation Die Behandlung von Kulturen kortikaler und striataler Neurone mit Methylmalonat in saurem
Medium ergab deutlich höhere Werte bezüglich der DNA-Fragmentation. Tatsächlich hat der
pH-Wert Einfluß auf die Apoptose: In Kulturen kortikaler Neuronen der Maus wurde die
Interaktion zwischen pH-Wert und oxidativen Streß untersucht: bei einem pH-Wert von 6,2
war die Toxizität (Nachweis durch Propidiumiodidfärbung, LDH-Freisetzung) von H2O2 nach
18 Stunden (Inkubation mit H2O2 für eine Stunde) deutlich größer als bei normalem pH-Wert.
Bei 150 µmol/L H2O2 starben ca. 70 Prozent der Neuronen bei einem pH-Wert von 6,2;
dagegen waren es bei einem neutralen pH-Wert von 7,2 nur ca. 20 %. Bei der Messung der
Freisetzung von LDH war die Freisetzung induziert durch 150 µM Wasserstoffperoxid bei
einem pH-Wert von 6,2 ungefähr 4 x so groß wie bei einem pH-Wert von 7,2. Im Gegensatz
zu H2O2 wurde der durch AAPH (2,2´-azobis(zwei-amidopropane) dihydrochlorid; ein
hydrophiler Peroxyl-Generator) induzierte Zelltod nicht durch den pH-Wert beeinflußt. Eine
Möglichkeit der Wirkung von niedrigem pH-Wert auf die Toxizität von Wasserstoffperoxid
könnte die damit verbundene Freisetzung von Eisenionen in der Zelle sein. Ist Eisen nicht
komplexiert, so können durch die Fenton-Reaktion toxische Hydroxyl-Radikale entstehen.
Eine weitere Möglichkeit wurde von den Autoren untersucht: sowohl die Aktivität von
Glutathion-Peroxidase als auch Glutathion-S-Transferase wurden durch den niedrigen pH-
Wert von 6,2 um 50-60% gesenkt. Die Aktivität von Glutathion-Reduktase war bei einem pH-
Wert von 6,2 um 20% kleiner als bei einem pH-Wert von 7,2. Eine Absenkung des pH-
Wertes verringert also deutlich die Aktivität von wichtigen antioxidativen Enzymen (Ying,
W. et al., 1999). Noch wichtiger in diesem Zusammenhang ist die Arbeit von Shigemi
Matsuyama et al., die zeigen konnten, daß ein saurer pH-Wert im Cytosol die Freisetzung von
proapoptotischen Faktoren aus den Mitochondrien triggert und die Aktivierung von Caspase-9
und damit auch Caspase-3 ermöglicht (Matsuyama, S. et al., 2000).
100
DISKUSSION 101
Substanzen in Apoptosemodellen
ZVAD-fmk im Staurosporin-Modell ZVAD-fmk als Breitspektrum-Inhibitor von Caspasen kann in einer Vielzahl von Zellarten
und apoptotischen Induktoren Apoptose unterdrücken oder verzögern. Es tritt als Methylester
in die Zelle ein und wird von Esterasen zum aktiven Peptid gespalten (Tenneti, L. et al.,
1998). Da Staurosporin-induzierte Apoptose ebenfalls die Aktivierung von Caspasen
beinhaltet (Krohn, A. J. et al., 1998), sollte dieser Inhibitor die Apoptose blockieren können.
Tatsächlich konnte Kim et al zeigen, daß Zellen einer dopaminergen Zellinie, MN9D, eine
Behandlung mit 1µmol/L Staurosporin für 24h nur zu 8,6% überleben. Die Quantifizierung
erfolgte mit Hilfe des MTT-Tests. Ungefähr 50% der Zellen waren schon nach 10-12h tot.
Nach dieser Zeit war auch eine PARP-Spaltung zu beobachten. Zusätzlich untersuchte PC12-
Zellen starben nach der Behandlung mit 1µmol/L Staurosporin zu 80%. In MN9D-Zellen
wird durch die Staurosporinbehandlung auch ein kleines Bax-reaktives Spalt-Produkt (18 kD)
erzeugt. Der Caspase-Inhibitor Z-VAD-fmk sowie die Überexpression des Proteins Bcl-XL
konnten den Zelltod durch Staurosporin verhindern (ZVAD-fmk: 64,3%; Bcl-XL: ca. 100%
Überlebensrate). Ebenso wird die PARP-Spaltung und die Generation des Bax-reaktiven
Spaltproduktes verhindert (Kim, J. E. et al., 1999). In der Monozytenzellinie THP1 löst
Staurosporin (0,5 µmol/L) nach 4h Apoptose aber auch Nekrose aus. Die nekrotischen Zellen
gehen dabei nicht von apoptotischen Zellen aus; stellen mithin keine sekundäre Nekrose dar.
Z-VAD-fmk senkt die Zahl der apoptotischen Zellen von 18,1 ± 4 auf 3,2 ± 2,4%. Dabei
verhindert Z-VAD-fmk auch die DNA-Fragmentation sowie die für Apoptose typische
Spaltung von PARP. Die Anzahl der nekrotischen Zellen wird in diesem Zellsystem
allerdings nicht beeinflußt (Zhu, H. et al., 1995). ZVAD-fmk kann auch Apoptose, die durch
die Injektion von Cytrochrom-C in den Zellkörper von adrenokortikalen Y-1 Tumor-Zellen,
normalen Rattennierenzellen epithelialen Ursprungs (NRK), 3T3 Fibroblasten der Maus
sowie promyelozytären IPC81 Leukämie-Zellen der Ratte verhindern: 90 min nach Injektion
von Cytochrom-C waren je nach Zellart zwischen 28,3 ±4,3 und 52,6 ± 7,2% apoptotisch.
Eine Vorinkubation mit Z-VAD-fmk senkt diesen Wert auf unter 9% (NRK-Zellen; ohne Z-
VAD-fmk: 46,7 ±4,7%) (Zhivotovsky, B. et al., 1998).
Auch im eigenen Staurosporin-Modell zeigt ZVAD-fmk neuroprotektive Wirkung. Zelltod
sowie DNA-Fragmentation wurden konzentrationsabhängig von ZVAD-fmk verhindert.
Dabei stimmen die beobachteten Konzentrationen (100 µmol/L ZVAD-fmk zeigt gute
101
DISKUSSION 102
Wirksamkeit) gut mit den in der Literatur gefundenen Werten überein. Dies bestätigt noch
einmal, daß Staurosporin in den eigenen Modellen Apoptose auslöst.
ZVAD-fmk im Malonat-Modell Aufgrund der Wirksamkeit von ZVAD-fmk im Staurosporin-Modell wurde ZVAD-fmk auch
im Malonat-Modell auf neuroprotektive Wirkung getestet. Tatsächlich konnte die höchste
Konzentration von ZVAD-fmk -100µmol/L- die durch Methylmalonat induzierte DNA-
Fragmentation in Kortex-Neuronen signifikant verringern. Obwohl ein Trend zur
neuroprotektiven Wirkung im LDH-Test zu sehen war, konnte kein signifikanter Unterschied
zu den mit Methylmalonat behandelten Zellen entdeckt werden. Auch in Striatum-Neuronen
war der Effekt von ZVAD-fmk ähnlich.
ZVAD-fmk wurde auch von anderen Autoren getestet: ZVAD-fmk zeigt in einem ähnlichen
Modell, in dem Kortexneuronen in Kultur mit einem mitochondrialen Inhibitor behandelt
wurden, keine Wirkung auf das Ausmaß des Zelltodes. Dabei wurden die 6-7 Tage
kultivierten Zellen mit dem irreversiblen Succinat-Dehydrogenase Inhibitor NP-3 (bis
4mmol/L) behandelt; entweder in Cokultur mit Astrogliazellen oder alleine. Nur bei Cokultur
mit Astrozyten wurde ein apoptotischer Zelltod innerhalb 4d detektiert (DNA-Fragmentation
mit ELISA, Casp-3 Aktivität); in Abwesenheit von Gliazellen starben die Neuronen innerhalb
24h ohne Anzeichen von Apoptose. Weder ZVAD-fmk (3µmol/L) noch Ac-DEVD-CHO
(100 µmol/L) konnten den NP-3 induzierten Zelltod verhindern. Die Cokultur der Neuronen
mit Gliazellen konnte den Zelltod ebenso verzögern wie die Inkubation mit konditioniertem
Medium verzögern. Dieser Effekt ließ sich nicht mit neurotrophen Faktoren wie BDNF,
GDNF, NT-3, bFGF oder einer Kombination dieser Faktoren imitieren. Wichtig ist, daß in
dem hier dargestellten System MK-801 und NBQX ständig im Medium vorhanden waren -
und somit ein Zelltod via Glutamat-Rezeptoren ausscheidet (Ohgoh, M. et al., 2000). Die
Theorie, daß Fragmente von mutiertem (verlängertem) polyGlutamin-Ende toxisch für Zellen
sind (indem sie den Metabolismus stören), haben Wellington et al. untersucht: in Hek 293T
Zellen, in immortalisierten striatalen Zellen und in einer hippocampalen Zellinie HN33 wurde
ein Vektor exprimiert, der entweder 15 oder 138 Glutaminreste des Huntingtins bedingt.
Zusätzlich wurden die Zellen mit Tamoxifen, einem PKC-Inhibitor behandelt. Tamoxifen
kann abhängig von der Länge der Glutaminkette des Huntingtin in den behandelten Zellen
Apoptose-auslösen. Huntingtin wurde in den apoptotischen Zellen an Caspase-3 spezifischen
Schnittstellen gespalten und ergab auf Western-Blots spezifische Banden distinkter Größe.
Die Behandlung mit ZVAD-fmk oder Z-DEVD-fmk, die auch die Spaltung des Huntingtin
102
DISKUSSION 103
verhindert, blockiert auch die Toxizität fast völlig. Auch die Mutation der Caspase-3
Schnittstellen im Huntingtin verhindert eine Spaltung nach Tamoxifen-Behandlung;
allerdings wurden auch weitere Schnittstellen für z.B. Caspase-6 gefunden. Interessanterweise
senkt die Mutation von Caspase-Schnittstellen die Aktivierung von Caspase-3 oder ähnlichen
DEVD-spaltenden Proteasen, die ansonsten in Tamoxifen behandelten Huntingtin
transfizierten Zellen gefunden wird. Caspase-resistentes (mutiertes) Huntingtin verhindert
ebenfalls die Bildung von Aggregaten, die in vielen in vitro-Modellen auch als Indikator für
Toxizität dargestellt werden (Wellington, C. L. et al., 2000).
Caspase-3 Inhibitor Im Staurosporin-Modell wurde ebenfalls der Caspase-3 Inhibitor DEVD-CHO getestet.
Interessanterweise wirkt DEVD-CHO zwar neuroprotektiv, jedoch wird die DNA-
Fragmentation nicht verhindert. Bei 100µmol/L DEVD-CHO wird die DNA-Fragmentation
sogar deutlich erhöht. Eine Erklärung für dieses Phänomen könnte der verwendete Inhibitor
geben: dieser enthält n-terminal eine hydrophobe Sequenz aus dem Signal-Peptid des Kaposi
Fibroblasten-Wachstumsfaktors, das die Zellgängigkeit verbessern soll. Eventuell kann diese
Sequenz Apoptose auslösen oder toxisch wirken.
Pramipexol Im Staurosporin-Modell wurden weitere Substanzen auf antiapoptotische Wirkung getestet:
Pramipexol, ein Dopamin-Agonist mit antioxidativen Eigenschaften und Hinweisen auf die
Verhinderung der Apoptose durch Hemmung der Freisetzung von proapotpotischen Faktoren
aus Mitochondrien.
MPP+ hemmt Komplex I der mitochondrialen Atmungskette und erzeugt Radikal-Streß über
die Generierung von Hydroperoxiden und Hydroxyl-Radikalen (Cassarino, D. S. et al.,
1998a). Bei niedriger Dosierung von MPTP werden vor allem dopaminerge Neuronen
betroffen (Akaneya, Y. et al., 1995; Kitayama, S. et al., 1993). Pramipexol verhindert die
Entstehung von Radikalstreß sowohl in Zellkulturen, als auch in Mikrodialyse-Experimenten
mit MPTP-Infusionen in das Striatum. Zudem kann Pramipexol in Präparationen von
Mitochondrien das Öffnen der MPT verhindern (Cassarino, D. S. et al., 1998a). Zhao Dung
Ling spekulieren auf einen autotrophen Faktor in der Größe von 35kD, der durch Pramipexol
induziert wird, und/oder die Verhinderung der Expression von neuroinhibitorischen Faktoren
in der Größe von 31kD und 55kkD. Takata et al. (Takata, K. et al., 2000) konnten zeigen, daß
eine Behandlung über vier Tage zu einer deutlichen Steigerung von Bcl-2 Immunoreaktivität
103
DISKUSSION 104
in Ratten führt. Dabei waren die erhöhten Konzentrationen von Bcl-2 vor allem in
dendritischen Prozessen des zerebralen Kortex und des Hippocampus sowie in zerebralem
Kortex (Soma) zu finden.
Pramipexol ist ein synthetischer Dopamin-Agonist mit hoher Affinität und Selektivität für die
D2-Familie der Dopamin-Reezptoren (Mierau, J. et al., 1995; Piercey, M. F. et al., 1996;
Piercey, M. F. et al., 1997). Pramipexol kann zudem in vitro die Oxidation von Lipiden und
den Verlust der ATPase-Ionen-Transport-Aktivität verhindern. Die Substanz wirkt auch als
Sauerstoff-Radikal-Fänger (Cassarino, D. S. und Bennett, J. P. J., 1999). In vivo hat
Pramipexol neuroprotektive Eigenschaften: es reduziert die verzögerte Toxizität nach einer
Ischämie in dopaminergen Neuronen in Wüstenspringmäusen. Außerdem reduziert
Pramipexol den Verlust von dopaminergen Neuronen der Substantia Nigra in Mäusen nach
einer Behandlung mit Metamphetamin (Hall, E. D. et al., 1996). Pramipexol inhibiert auch die
Öffnung der MTP nach Induktion durch MPP+ , Ca2+ oder Pi und reduziert die Konzentration
von freien Radikalen nach MPP+-Behandlung von Zellen (Cassarino, D. S. et al., 1998b).
Tatsächlich konnte in eigenen Versuchen die neuroprotektive Eigenschaft von Pramipexol
bestätigt werden: die toxischen Eigenschaften von Staurosporin werden durch 1000µmol/L
Pramipexol blockiert. Dabei wird allerdings die DNA-Fragmentation nicht beeinflußt.
Wahrscheinlich werden durch Pramipexol die mitochondrialen Reduktionseigenschaften
geschützt, so das MTT nach 24h noch reduziert werden kann, während die DNA-
Fragmentation unbeeinflußt ist.
Deprenyl Ein weiterer Inhibitor der im Staurosporin-Modell getestet wurde, ist Deprenyl. Diese
Substanz ist ein MAO-Inhibitor, der den Radiaklstress durch den Abbau von Dopamin
verhindern kann. Bei Patienten mit Alzheimer-Krankheit konnte L-Deprenyl die klinische
Situation verbessern (Martignoni, E. et al., 1991). Deprenyl wurde ebenfalls in einer Studie
zusammen mit Tocopherol für die Behandlung von Parkinson in einem frühen Stadium
getestet. Dabei zeigte sich ein signifikant verlangsamtes Fortschreiten der Krankheit;
allerdings war der therapeutische Effekt nicht von Dauer (Shoulson, I., 1998). Die in dieser
Studie gezeigten Ergebnisse könnten allerdings auch auf einem Mechansimus beruhen, der
nicht MAO-B -Inhibierung beinhaltet, sondern durch antiapoptotische Effekte des
Metaboliten Desmethyl-Deprenyl hervorgerufen sein. Dieser Metabolit beeinflußt die Protein-
Transkription (Marsden, C. D. und Olanow, C. W., 1998; Koller, W. C., 1998).
104
DISKUSSION 105
Auch Deprenyl zeigt in hohen Konzentrationen (1000µmol/L) im Staurosporin-Modell
signifikant neuroprotektive Wirkung. Auch in diesem Fall wird allerdings die DNA-
Fragmentation -ähnlich wie bei Pramipexol- nicht unterdrückt.
Dipyridamol Dipyridamol ist eine Substanz die den ATP-Kanal in Mitochondrien eventuell zu hemmen
vermag und dadurch vielleicht die Freisetzung von proapoptotischen Faktoren blockieren
kann.
Farinelli et al. zeigten, daß Dipyridamol in Hippocampus-Neuronen der Ratte, die in nicht
supplementiertem Medium nach 24h größtenteils tot waren, die Zellen
konzentrationsabhängig zu schützen vermag. Konzentrationen < 1µmol/L waren wirkungslos;
Konzentrationen > 20µmol/L toxisch für die Neuronen. Eine Überprüfung von Zellen anderer
Hirnregionen ergab ähnliche Überlebensraten wie bei hippocampalen Zellen (ca.70-80%),
wobei Neurone des Hippocampus und des Kortex am besten auf Dipyridamol ansprachen.
Allerdings wurde mit Dipyridamol kein Langzeit-Überleben gesichert: nach 7d in Kultur
waren nur noch weniger als 10% der Zellen am Leben. Dipyridamol hat folgende
pharmakologische Wirkungen: Hemmung von Phosphodiesterasen, Hemmung der Aufnahme
von Nukleosiden, Hemmung des Multi-Drug-Resistance Proteins, Blockade des
Chloridtransports und eine verstärkte Prostacyclin-Synthese. Der neuroprotektive
Mechanismus von Dipyridamol könnte auf allen diesen Eigenschaften beruhen. Andere
pharmakologische Substanzen, die ebenfalls diese Eigenschaften haben, zeigten allerdings
keine Schutzwirkung. Dipyridamol hat daneben auch antioxidative Eigenschaften. Tatsächlich
konnten N-acetylcystein (NAC) und Vitamin E, beide ebenfalls Antioxidativa, die Neuronen
ebenfalls zu 80% schützen. Der protektive Effekt der drei Substanzen war zudem nicht
additiv. Neurone, die oxidativem Stress (10µM FeSO4 oder 30µM H2O2) ausgesetzt waren,
konnten ebenfalls komplett mit Dipyridamol geschützt werden; zu 75-80% durch NAC oder
Vitamin E. Ein Langzeit-Überleben unter dem nicht supplementierten Medium konnte durch
die Gabe von Dipyridamol plus Insulin erreicht werden (Farinelli, S. E. et al., 1998).
In eigenen Versuchen, bei denen Dipyridamol im Staurosporin-Modell eingesetzt wurde,
wurde jedoch im MTT-Test keine neuroprotektive Wirkung gefunden. Eine Konzentration
von 100µmol/L Dipyridamol war toxisch. Hingegen wurden mit 100µmol/L Dipyridamol
105
DISKUSSION 106
kleinere DNA-Fragmentations-Werte gemessen. Aufgrund der Ergebnisse im MTT-Test kann
aber von einem sekundär-nekrotischem Abbau der DNA-Fragmente ausgegangen werden.
Immunophilin-Ligand FK506
FK506 ist ein Immunosuppressivum, das aber auch TGF-β induzieren kann und in der
Literatur in einigen Neurodegenerations-Modellen als neuroprotektiv beschrieben wurde. Eine
weitere wichtige Eigenschaft ist die Blockade der Rotamase-Aktivität der FKBP, vor allem
FKBP12. Viele neuroprotektive Wirkungen von FK506 lassen sich wahrscheinlich darauf
zurückführen. Die höchsten Konzentrationen an FKBP12 Transkripten wurden im Hirn durch
in situ- Hybridisation im Corpus Striatum gefunden {1056:Dawson et al 1994}; ähnlich hohe
Konzentrationen wurden in der Substantia nigra gefunden. Ebenfalls hohe Transkriptionsraten
sind im Hippocampus beobachtet wobei in der CA1 Zone die Rate am höchsten ist. Die
Verteilung von Calcineurin spiegelt die FKBP12 Verhältnisse wieder (Snyder, S. H. et al.,
1998a). Der Komplex FK506 / FKBP12 hemmt die Aktivität von NOS über die Bindung von
Calcineurin, welches NOS dephosphoryliert und damit aktiviert. Damit wird die Produktion
von NO, das in größeren Mengen toxisch wirken kann und zudem die Freisetzung von
Neurotransmittern bewirket, was ebenfalls toxisch sein kann, wenn z.B. zuviel Glutamat
ausgeschüttet wird, gehemmt. FKBP12 funktioniert als Binde-Protein für Calcineurin in dem
Komplex mit dem IP3-Rezeptor, an dem auch PKC (protein kinase C) beteiligt ist. Der IP3R
wird durch mehrere Kinasen phosphoryliert: u.a. PKC, PKA und die Kalzium-Calmodulin
abhängige Kinase II (CaM-K II); zudem kann sich der Rezeptor selbst phosphorylieren.
Während eine Phyosphorylierung durch PKA den Rezeptor nach Bindung von IP3 weniger
durchlässig für Kalzium macht, wird er durch die Phosphorylierung von PKC oder CaM-K II
anfälliger für Kalzium-Freisetzung nach IP3 Bindung (Snyder, S. H. et al., 1998a).
Inhibierung von Calcineurin durch FK506 führt also zu verstärkter Phosphorylierung durch
PKC; dies wiederum bedeutet erhöhte Wahrscheinlichkeit für Kalzium -Ausstrom.
TGF-beta Rezeptor II kann den TGF-beta Rezeptor I phosphorylieren; dadurch wird eine
Vielzahl von Ereignissen ausgelöst. Im Gehirn sind dies u.a.: LTP (Zhang, F. et al., 1997),
Schutz von Hippocampusneuronen vor ischämischer Schädigung und beta-amyloid-Toxizität
(Henrich-Noack, P. et al., 1996; Prehn, J. H. et al., 1996) und verstärkte axonale Regeneration
(Abe, K. et al., 1996). Einige Autoren beschreiben eine Verstärkung des TGF-beta Signals
106
DISKUSSION 107
durch die Aufhebung der Assoziation mit FKBP12 durch FK506 (Wang, T. et al., 1996; Chen,
Y. G. et al., 1997).
In der Literatur sind einige Untersuchungen über die neuroprotektiven Eigenschaften mit
FK506 gemacht worden: In einem MCAO-Modell (30 min) in hyperglykämischen Ratten
haben Cyclosporin und FK506 bei Gabe 30min vor dem Eingriff das Infarkt-Volumen von
35,7 mm3 auf 6,8 mm3 (FK506) und 9,9 mm3 (Cyclosporin) an Tag 3 nach der Operation
gesenkt (Kuroda, S. et al., 1999). Beim Vergleich von MCAO mit Toxizität durch Injektionen
von exzitatorischen Substanzen (Quinolinat, NMDA, AMPA) in Kortex, Hippocampus oder
Striatum zeigte sich nach 3d folgendes: bei intraperitonealer Gabe von FK506 (10 mg/kg) im
MCAO-Modell wurde eine 50 %ige Reduktion der Läsion beobachtet. In Modellen
exzitatorischer Toxizität sowohl in Hippocampus, Kortex oder Striatum hatte FK506 jedoch
keine Wirkung. Bei intravenöser Gabe von FK506 (1mg/kg) wurde sogar 120 min nach
Beginn der MCAO eine Reduktion von ca. 48-57 % des Läsionsvolumens im Kortex
(allerdings nicht im Striatum) detektiert. Es werden auch antiapoptotische Mechanismen für
den beobachteten Schutz der Neurone vorgeschlagen (Fruman, D. A. et al., 1992; Genestier,
L. et al., 1994; Shibasaki, F. und McKeon, F., 1995; Estevez, A. G. et al., 1995; Li, Y. et al.,
1995a; Li, Y. et al., 1995b; Bonfoco, E. et al., 1995; Linnik, M. D. et al., 1995). FK506
reduziert auch dosisabhängig in einem transienten MCAO-Modell in Ratten das
Infarktvolumen. Diese Eigenschaft korrelierte mit der Fähigkeit, Calcineurin zu hemmen und
war durch Rapamycin zu blocken (Bochelen, D. et al., 1999). FK506 kann in einem MCAO-
Modell (2h, danach 48h Reperfusion) das Infarktvolumen um 40-50% senken. Dabei wurde
FK506 zunächst 30min vor der Rezirkulation oder 1h nach Rezrkulation i.v. gegeben. Bei i.c.
(intrakarotider) Injektion (5min oder 1h nach Rezirkulation) wurde das Infarktvolumen
ähnlich beeinflußt. Cyclosporin A (10mg/kg) i.c. konnte das Infarkvolumen sogar um 90%
der Kontrolle (nach 5min Reperfusion) oder 35% nach 1h Reperfusion senken (Yoshimoto, T.
und Siesjö, B. K., 1999).
FK506 (10-6 M) aber nicht Cyclosporin blockierte die durch Entzug von Serum
hervorgerufene Apoptose in neuronalen Kulturen der Ratte. Zusätzlich wurde c-jun weniger
exprimiert(Yardin, C. et al., 1998). FK506 konnte in einem Modell, in dem Kainat
exzitatorisch-toxischen Zelltod auslöst (vor allem im Hippocampus in der CA1-Region), die
Neuronen schützen {Moriwaka A et al. Neuroscience 1998 Oct 86:3 855-65} Die Produktion
von Superoxid wird in Neutrophilen durch FK506 unterdrückt (Nishinaka, Y. et al., 1993).
107
DISKUSSION 108
FK506 hemmt Calcineurin und bewirkt damit eine verstärkte Phosphorylierung von NOS,
was einer verminderten Aktivität gleichkommt. Daher wirkt FK506 in Situationen, in denen
eine verstärkte NOS-Aktivität eine Rolle spielt, neuroprotektiv. Dies ist z.B. der Fall in
Glutamat-Toxizität und tatsächlich kann FK506 die NMDA Toxizität in kortikalen Kulturen
blocken (Dawson, T. M. et al., 1993). Auch wird Neurotoxizität durch beta-amyloid-Peptid
{1056: Pasinetti and Aisen, 1997 Soc Neurosci Abstract} oder Serum Entzug in kortikalen
Kulturen {1056: Hugon et al. 1997 Abstract} durch FK506 gehemmt. Weiterentwickelte
Substanzen, die nur die Rotamase-Aktivität von Immunophilinen hemmen, jedoch nicht
immunosuppressiv sind, können z.B. die zu 60-70% zerstörten Nervenendigungen
dopaminerger Zellen des nigrostriatalen Systems in einem MPTP-Modell in Ratten zum Teil
wieder herstellen. Die FKBP12 Liganden wurden dabei zeitgleich mit MPTP gegeben. Eine
weiterentwickelte Substanz konnte sogar die Läsionen zu mehr als 95% verhindern. In einem
zweiten Modell, in dem die FKBP 12-Liganden erst 3 Tage nach Gabe von MPTP verabreicht
wurden, konnte ebenfalls eine Verbesserung der Innervation des Striatum mit dopaminergen
Nervenenden gezeigt werden: bis zu 90% der Kontrollwerte wurden mit GPI 1046 erreicht
(Hamilton, G. S. und Steiner, J. P., 1997).
Zusätzlich zu den beschriebenen neuroprotektiven Eigenschaften kommen auch noch
neuroregenerative Eigenschaften: FK506 kann die neurotrophe Wirkung von relativ geringen
Dosen NGF bei PC-12 Zellen verstärken. Wird FK506 zu 0,5 ng/ml NGF zugegeben, kann
die Wirkung von hoch dosiertem NGF (50ng/ml) zu 75% erreicht werden. Der EC50-Wert ist
ungefähr 0,5 nM. Eine Quetschung des N. sciaticus bei Ratten konnte mit FK506 sowohl
morphologisch verbessert werden, als auch funktionell: im Gegensatz zu Ratten die nur eine
Kontrollsubstanz erhielten, konnten mit FK506 behandelte Ratten schon nach 18d wieder
ihre betroffenen Pfoten belasten – im Gegensatz dazu die nichtbehandelten Ratten erst am Tag
25 (Steiner, J. P. et al., 1997b). Die Konzentration des Immunophilins FKBP12 steigt
zusammen mit GAP43 in sich regenerierenden Neuronen an. Sowohl immunsuppressierende
als auch nichtimmun-suppressierende Immunophilin-Liganden können die Regeneration
geschädigter dopaminerger, serotonerger und cholinerger Neurone in vivo stimulieren
(Sabatini, D. M. et al., 1997). GAP43 ist selektiv in sich entwickelnden oder regenerierenden
Neuronen lokalisiert und ein Substrat von Calcineurin. Eine Phosphorylierung von GAP43 ist
mit einer verstärkten Funktion verbunden, und die Phosphorylierung wird durch FK506
verstärkt (Steiner, J. P. et al., 1992). Eine Regeneration von Neuronen durch FK506 konnte in
folgenden Modellen demonstriert werden: nach Läsion des Ischias-Nervs bei Ratten (Steiner,
108
DISKUSSION 109
J. P. et al., 1997c), dies auch durch nicht-immunosuppressive Substanzen: (Steiner, J. P. et al.,
1997a; Gold, B. G., 1997; Steiner, J. P. et al., 1997c). Im MPTP oder 6-OHDA Modell in
Ratten konnte ein nicht-immunosuppressives FK506 Derivat die geschädigten dopaminergen
Neurone z.T. schützen oder regenerieren (Steiner, J. P. et al., 1997a). In dopaminergen
Neuronen ist NGF allerdings nicht neurotroph, daher muss für diesen Fall ein anderer
Mechanismus als Verstärkung der Wirkung von NGF-Wirkung angenommen werden
(Snyder, S. H. et al., 1998a).
Trotz der von vielen Autoren beschriebenen neuroprotektiven Eigenschaften von FK506
konnte in eigenen Versuchen weder im Staurosporin-Modell mit Kortex-Neuronen noch im
Methylmalonat- oder Malonat-Modell mit Kortex- oder Striatum-Neuronen eine
neuroprotektive oder antiapoptotische Wirkung von FK506 beobachtet werden. Offensichtlich
werden in allen untersuchten Modellen nicht oder nicht ausschließlich die von FK506
beeinflußbaren apoptotischen Pfade beschritten. Im Staurosporin-Modell reicht offenbar die
bei PC12-Zellen beobachtete Eigenschaften von FK506, die Wirkung von NGF zu verstärken,
nicht aus, um die Zellen zu retten. Auch die in MCAO-Modellen erreichte neuroprotektive
Eigenschaften von FK506 scheint sich nicht auf die Situation der chemischen Blockade des
Metabolismus in Zellen übertragen zu lassen.
109
ZU
ZUSAMMENFASSUNG
SAMMENFASSUNG 110
110
Apoptose ist ein Programm von Zellen aus Metazoae, um überflüssige oder geschädigte
Zellen fast ohne Nebenwirkungen für umliegende Zellen zu beseitigen. Zum Teil wird dieser
auch “programmierter Zelltod“ genannte Vorgang zielgerichtet eingesetzt, um während der
Entwicklung und im ausgewachsenen Organsimus Organen ihre Gestalt zu geben oder
autoreaktive Zellen des Immunsystems unschädlich zu machen. Es gibt jedoch auch
zahlreiche Hinweise darauf, daß in vielen akuten oder chronischen, neurodegenerativen
Erkrankungen wie bei Schlaganfall, Morbus Parkinsons, Chorea Huntington, Amyotropher
Lateralsklerose und der Alzheimer Krankheit Apoptose oder Teile dieses Programms am
Zelltod in den betroffenen Hirnarealen beteiligt sind.
Apoptose kann durch unterschiedliche Ereignisse ausgelöst werden. Die wichtigsten sind
äußere Faktoren d.h. Proteine die an Rezeptoren binden, ein Mangel an antiapoptotischen
Faktoren d.h. lösliche oder zellständige trophische Faktoren und innere Faktoren wie
irreparable Schädigung der Erbinformation oder Infektionen. Mit Substanzen, die solche
Schäden auslösen oder das Gleichgewicht zwischen pro- und antiapoptotischen Proteinen der
Bcl-2-Familie beeinflussen, läßt sich ebenfalls Apoptose auslösen. Umgesetzt wird Apoptose
vor allem durch sich gegenseitig kaskadenartig aktivierende Proteasen der Caspase-Familie.
Ziel der Arbeit war es, die Rolle der Apoptose in in vitro Modellen neuronaler Degeneration
zu untersuchen. Dazu wurden in vitro Modelle für Apoptose und Neurodegeneration etabliert,
Nachweismethoden für Apoptose an die Modelle adaptiert und schließlich potentiell
antiapoptotische Substanzen in den Modellen getestet. Zunächst wurde in serumfreien, reinen
Neuronenkulturen aus dem Kortex oder Striatum der Ratte Apoptose durch die Zugabe von
Staurosporin induziert. Dieser Breitspektrum-Kinase Inhibitor vermag in vielen Zellarten
Apoptose zu induzieren. Anhand dieses Standard-Modells wurden geeignete
Nachweismethoden ausgewählt: Zelltod wurde mit zwei photometrischen Test bestimmt, bei
dem die Reduktion eines Tetrazoliumsalzes in Mitochondrien lebender Zellen oder die
Freisetzung von Laktatdehydrogenase Maß für das Überleben von Zellen ist. Apoptose wurde
anhand der DNA-Fragmente, die bei Apoptose gebildet werden, quantifiziert.
Die Verhältnisse bei neurodegenerativen Erkrankungen oder Ischämie wurden dann durch
Inkubation der Zellen mit Malonat simuliert. Malonat hemmt reversibel Komplex II der
Atmungskette und verursacht auf diese Weise Energiemangel und Radiaklstress. Komplex II
ZUSAMMENFASSUNG 111
111
Inhibitoren stellen gute Modelle für Chorea Huntington dar; Energiemangel und Radiaklstreß
sind jedoch Phänomene, die bei allen neurodegenerativen Erkrankungen vorkommen.
Staurosporin induziert in Striatum- und Kortexneuronen konzentrationsabhängig Zelltod und
DNA-Fragmentation. Zwei weitere Indikatoren für Apoptose, die Exposition von
Phosphatidylserin auf der Zellmembran sowie erhöhte intrazelluläre Caspase-3-Aktivität
lassen sich ebenfalls nachweisen. Durch Zugabe des Breitspektrum-Caspase-Inhibitors
ZVAD-fmk kann sowohl Zelltod als auch DNA-Fragmentation gehemmt werden. Auch im
Malonat-Modell tritt konzentrationsabhängig Zelltod und DNA-Fragmentation auf. Im
Gegensatz zum Staurosporin-Modell ist die Hemmung des Zelltods mit ZVAD-fmk nicht
signifikant und eine Inhibition der DNA-Fragmentation nur teilweise zu beobachten.
Weitere Substanzen, die oberhalb der Aktivierung terminaler Caspasen in die Ereigniskette
eingreifen können, wurden auf ihre antiapoptotische Wirkung getestet: 1) Pramipexol, ein
Dopamin-Agonist mit antioxidativen Eigenschaften und Hinweisen auf die Hemmung der
Freisetzung von proapotpotischen Faktoren aus Mitochondrien. 2) Deprenyl, ein
Monoaminoxidase-Inhibitor, der den durch Abbau von Dopamin verursachten Radiaklstress
verhindern kann 3) Dipyridamol, eine Substanz die den ATP-Kanal in Mitochondrien
blockieren kann und dadurch eventuell die Freisetzung von proapoptotischen Faktoren hemmt
und 4) FK506, ein Immunsuppressivum, das auch TGF-β induzieren kann und in der Literatur
als in einigen Degenerations-Modellen neuroprotektiv beschrieben wurde. Deprenyl kann in
hohen Konzentrationen den durch Staurosporin induzierten Zelltod signifikant verhindern,
jedoch nicht DNA-Fragmentation. FK506 hat weder im Staurosporin-Modell noch im
Malonat-Modell eine antiapoptotische oder neuroprotektive Wirkung. Da Zelltod und DNA-
Fragmentation mit ZVAD-fmk gehemmt werden können, scheint im Staurosporin-Modell nur
Apoptose aufzutreten. Die durch FK506 beeinflußbaren Schritte scheinen entweder im
Stauroporin-Modell und im Malonat-Modell keine Rolle zu spielen, oder es werden zusätzlich
andere Pfade beschritten. Da ZVAD-fmk im Malonat-Modell den Zelltod nicht verhindert,
sondern nur die DNA-Fragmentation inhibiert, scheint Malonat neben Apoptose auch Nekrose
zu induzieren.
Insgesamt ist in in vitro Modellen neuronaler Degeneration Apoptose nachgewiesen worden.
Durch den Einsatz verschiedener Zellpopulationen konnte deren unterschiedliches
Empfindlichkeitsprofil gegenüber Staurosporin und Malonat festgestellt werden. Es konnte
ZUSAMMENFASSUNG 112
112
auch gezeigt werden, daß die in vivo neuroprotektive Substanz FK506 in den benutzten in
vitro-Modellen nicht neuroprotektiv wirkten.
LITERATURVERZEICHNIS 113
LITERATURVERZEICHNIS
Abe, K., Chu, P. J., Ishihara, A., und Saito, H. (1996): Transforming growth factor-beta 1 promotes re-elongation of injured axons of cultured rat hippocampal neurons. Brain Res 723: 206-209.
Adams, J. M.und Cory, S. (1998): The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 281: 1322-1326.
Adayev, T., Estephan, R., Meserole, S., Mazza, B., Yurkow, E. J., und Banerjee, P. (1998): Externalization of phosphatidylserine may not be an early signal of apoptosis in neuronal cells, but only the phosphatidylserine-displaying apoptotic cells are phagocytosed by microglia [published erratum appears in J Neurochem 1999 Feb;72(2):886]. J Neurochem 71: 1854-1864.
Ahlemeyer, B., Beier, H., Semkova, I., Schaper, C., und Krieglstein, J. (2000): S-100beta protects cultured neurons against glutamate- and staurosporine-induced damage and is involved in the antiapoptotic action of the 5 HT(1A)-receptor agonist, Bay x 3702. Brain Res 858: 121-128.
Ahlemeyer, B.und Krieglstein, J. (1997): Stimulation of 5-HT 1A receptor inhibits apoptosis induced by serum deprivation in cultured neurons from chick embryo. Brain Research 777: 179-186.
Akaneya, Y., Takahashi, M., und Hatanaka, H. (1995): Survival of and 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) neurotoxicity against dopaminergic neurons in coculture of rat mesencephalon with their target on non-target regions. Neurosci Res 23: 55-63.
Ameisen, J. C., Estaquier, J., Idziorek, T., und De Bels, F. (1995): Programmed cell death and AIDS pathogenesis: significance and potential mechanisms. Curr Top Microbiol Immunol 200: 195-211.
Andreassen, O. A., Ferrante, R. J., Hughes, D. B., Klivenyi, P., Dedeoglu, A., Ona, V. O., Friedlander, R. M., und Beal, M. F. (2000): Malonate and 3-nitropropionic acid neurotoxicity are reduced in transgenic mice expressing a caspase-1 dominant-negative mutant. J Neurochem 75: 847-852.
Ashkenazi, A.und Dixit, V. M. (1998): Death receptors: signaling and modulation. Science 281: 1305-1308.
Barinaga, M. (1998a): Is apoptosis key in Alzheimer's disease? [news] [see comments]. Science 281: 1303-1304.
Barinaga, M. (1998b): Stroke-damaged neurons may commit cellular suicide [news]. Science 281: 1302-1303.
Bastianetto, S., Ramassamy, C., Poirier, J., und Quirion, R. (1999): Dehydroepiandrosterone (DHEA) protects hippocampal cells from oxidative stress-induced damage. Brain Res Mol Brain Res 66: 35-41.
Beal, F. M., Brouillet, E., Jenkins, B. G., Ferrante, R. J., Kowall, N. W., Miller, J. M., Storey, E., Strivastava, R., Rosen, B. R., und Hyman, B. T. (1993): Neurochemical and Histologic Characterization of Striatal Excitotoxic Lesions Produced by the Mitochondrial Toxin 3-Nitropropionic Acid. The Journal of Neuroscience 13: 4181-4192.
Beal, M. F., Brouillet, E., Jenkins, B., Henshaw, R., Rosen, B., und Hyman, B. T. (1993): Age-dependent striatal excitotoxic lesions produced by the endogenous mitochondrial inhibitor malonate. J Neurochem 61: 1147-1150.
Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., und Diemer, N. H. (1984): Elevation of the extracellular concentrations of glutamate and aspartate in rat hippocampus during transient cerebral ischemia monitored by intracerebral microdialysis. J Neurochem 43: 1369-1374.
Bertrand, R., Solary, E., O'Connor, P., Kohn, K. W., und Pommier, Y. (1994): Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Exp Cell Res 211: 314-321.
113
LITERATURVERZEICHNIS 114
Bhat, N. R.und Zhang, P. (1999): Hydrogen peroxide activation of multiple mitogen-activated protein kinases in an oligodendrocyte cell line: role of extracellular signal-regulated kinase in hydrogen peroxide-induced cell death. J Neurochem 72: 112-119.
Bochelen, D., Rudin, M., und Sauter, A. (1999): Calcineurin inhibitors FK506 and SDZ ASM 981 alleviate the outcome of focal cerebral ischemic/reperfusion injury. J Pharmacol Exp Ther 288: 653-659.
Bonfoco, E., Krainc, D., Ankarcrona, M., Nicotera, P., und Lipton, S. L. (1995): Apoptosis and necrosis: Two distinct events induced, respectively, by mild and intense insults with N-methyl-D-aspartate or nitric oxide/superoxide in cortical cell cultures. Proceedings of the National Academy of Science USA 92: 7162-7166.
Bredesen, D. E.und Rabizadeh, S. (1997): p75NTR and apoptosis: Trk-dependent and Trk-independent effects. Trends in Neuroscience 20: 287-290.
Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., und Price, P. J. (1993): Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res 35: 567-576.
Brouillet, E., Hantraye, P., Ferrante, R. J., Dolan, R., Leroy-Willig, A., Kowall, N. W., und Beal, M. F. (1995): Chronic mitochondrial energy impairment produces selective striatal degeneration and abnormal choreiform movements in primates. Proc Natl Acad Sci U S A 92: 7105-7109.
Burgoyne, L. A., Hewish, D. R., und Mobbs, J. (1974): Mammalian chromatin substructure studies with the calcium-magnesium endonuclease and two-dimensional polyacrylamide-gel electrophoresis. Biochem J 143: 67-72.
Butcher, S. P., Henshall, D. C., Teramura, Y., Iwasaki, K., und Sharkey, J. (1997): Neuroprotective actions of FK506 in experimental stroke: in vivo evidence against an antiexcitotoxic mechanism. J Neurosci 17: 6939-6946.
Cassarino, D. S.und Bennett, J. P. J. (1999): An evaluation of the role of mitochondria in neurodegenerative diseases: mitochondrial mutations and oxidative pathology, protective nuclear responses, and cell death in neurodegeneration. Brain Res Brain Res Rev 29: 1-25.
Cassarino, D. S., Fall, C. P., Smith, T. S., und Bennett, J. P. (1998a): Pramipexole reduces reactive oxygen species production in vivo and in vitro and inhibits the mitochondrial permeability transition produced by the parkinsonian neurotoxin methylpyridinium ion. J Neurochem 71: 295-301.
Cassarino, D. S., Swerdlow, R. H., Parks, J. K., Parker, W. D. J., und Bennett, J. P. J. (1998b): Cyclosporin A increases resting mitochondrial membrane potential in SY5Y cells and reverses the depressed mitochondrial membrane potential of Alzheimer's disease cybrids. Biochem Biophys Res Commun 248: 168-173.
chakravarthy, B. R., Walker, T., Rasquinha, I., Hill, I. E., und MacManus, J. P. (1999): Activation of DNA-dependent protein kinase may play a role in apoptosis of human neuroblastoma cells. J Neurochem 72: 933-942.
Chao, M., Casaccia-Bonnefil, P., Carter, B., Chittka, A., Kong, H., und Yoon, S. O. (1998): Neurotrophin receptors: mediators of life and death. Brain Res Brain Res Rev 26: 295-301.
Charriaut-Marlangue, C., Margaill, I., Represa, A., Popovici, T., Plotkine, M., und Ben-Ari, Y. (1996): Apoptosis and Necrosis After Reversible Focal Ischemia: An In Situ DNA Fragmentation Analysis. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 16: 186-194.
Chen, Y. G., Liu, F., und Massague, J. (1997): Mechanism of TGFbeta receptor inhibition by FKBP12. EMBO J 16: 3866-3876.
Chihab, R., Bossenmeyer, C., Oillet, J., und Daval, J. L. (1998): Lack of correlation between the effects of transient exposure to glutamate and those of hypoxia/reoxygenation in immature neurons in vitro. J Neurochem 71: 1177-1186.
114
LITERATURVERZEICHNIS 115
Chinopoulos, C., Tretter, L., und Adam-Vizi, V. (1999): Depolarization of in situ mitochondria due to hydrogen peroxide-induced oxidative stress in nerve terminals: inhibition of alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurochem 73: 220-228.
Chinopoulos, C., Tretter, L., Rozsa, A., und Adam-Vizi, V. (2000): Exacerbated responses to oxidative stress by an Na(+) load in isolated nerve terminals: the role of ATP depletion and rise of [Ca(2+)](i). J Neurosci 20: 2094-2103.
Choi, D. W., Maulucci-Gedde, M., und Kriegstein, A. R. (1987): Glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. J Neurosci 7: 357-368.
Copin, J. C., Reola, L. F., Chan, T. Y., Li, Y., Epstein, C. J., und Chan, P. H. (1996): Oxygen deprivation but not a combination of oxygen, glucose, and serum deprivation induces DNA degradation in mouse cortical neurons in vitro: attenuation by transgenic overexpression of CuZn-superoxide dismutase. J Neurotrauma 13: 233-244.
Copin, J.-C., Li, Y., Reola, L., und Chan, P. H. (1998): Trolox and 6,7-dinitroquinoxaline-2,3-dione prevent necrosis but not apoptosis in cultured neurons subjected to oxygen deprivation. Brain Research 784: 25-36.
Dawson, T. M., Steiner, J. P., Dawson, V. L., Dinerman, J. L., Uhl, G. R., und Snyder, S. H. (1993): Immunosuppressant FK506 enhances phosphorylation of nitric oxide synthase and protects against glutamate neurotoxicity [see comments]. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 9808-9812.
de Mattos-Dutra, A., Meirelles, R., Bevilaqua, d. R., Kommers, T., Wofchuk, S. T., Wajner, M., und Pessoa-Pureur, R. (2000): Methylmalonic and propionic acids increase the in vitro incorporation of 32P into cytoskeletal proteins from cerebral cortex of young rats through NMDA glutamate receptors. Brain Res 856: 111-118.
Deckwerth, T. L.und Johnson Jr., E. M. (1993): Temporal Analysis of Events Associated with Programmed Cell Death (Apoptosis) of Sympathetic Neurons Deprived of Nerve Growth Factor. The Journal of Cell Biology 123: 1207-1222.
Denis, D.und Riendeau, D. (1999): Phosphodiesterase 4-dependent regulation of cyclic AMP levels and leukotriene B4 biosynthesis in human polymorphonuclear leukocytes. Eur J Pharmacol 367: 343-350.
Diaz, J.-L., Oltersdorf, T., Horne, W., McConnel, M., Wilson, G., Weeks, S., Garcia, T., und Fritz, L. C. (1997): A Common Binding Site Mediates Heterodimerization and Homodimerization of Bcl-2 Family Members. The Journal of Biological Chemistry 272: 11350-11355.
Dringen, R., Kussmaul, L., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J., und Hamprecht, B. (1999): The glutathione system of peroxide detoxification is less efficient in neurons than in astroglial cells. J Neurochem 72: 2523-2530.
Dringen, R., Kussmaul, L., und Hamprecht, B. (1998): Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay. Brain Res Brain Res Protoc 2: 223-228.
Duffy, S., So, A., und Murphy, T. H. (1998): Activation of endogenous antioxidant defenses in neuronal cells prevents free radical-mediated damage. J Neurochem 71: 69-77.
Dunnett, S. B.und Bjorklund, A. (1999): Prospects for new restorative and neuroprotective treatments in Parkinson's disease. Nature 399: A32-A39.
Dutra, J. C., Dutra-Filho, C. S., Cardozo, S. E., Wannmacher, C. M., Sarkis, J. J., und Wajner, M. (1993): Inhibition of succinate dehydrogenase and beta-hydroxybutyrate dehydrogenase activities by methylmalonate in brain and liver of developing rats. J Inherit Metab Dis 16: 147-153.
Eguchi, K. (2001): Apoptosis in autoimmune diseases. Intern Med 40: 275-284.
Enari, M., Sakahira, H., Yokoyama, H., Okawa, K., Iwamatsu, A., und Nagata, S. (1998): A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature 391: 43-50.
115
LITERATURVERZEICHNIS 116
Encinas, M., Iglesias, M., Llecha, N., und Comella, J. X. (1999): Extracellular-regulated kinases and phosphatidylinositol 3-kinase are involved in brain-derived neurotrophic factor-mediated survival and neuritogenesis of the neuroblastoma cell line SH-SY5Y. J Neurochem 73: 1409-1421.
Estevez, A. G., Radi, R., Barbeito, L., Shin, J. T., Thompson, J. A., und Beckman, J. S. (1995): Peroxynitrite-induced cytotoxicity in PC12 cells: evidence for an apoptotic mechanism differentially modulated by neurotrophic factors. J Neurochem 65: 1543-1550.
Evan, G.und Littlewood, T. (1998): A matter of life and cell death. Science 281: 1317-1322.
Fadok, V. A., Voelker, D. R., Campbell, P. A., Cohen, J. J., Bratton, D. L., und Henson, P. M. (1992): Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol 148: 2207-2216.
Falcieri, E., Martelli, A. M., Bareggi, R., Cataldi, A., und Cocco, L. (1993): The protein kinase inhibitor staurosporine induces morphological changes typical of apoptosis in MOLT-4 cells without concomitant DNA fragmentation. Biochem Biophys Res Commun 193: 19-25.
Farinelli, S. E., Greene, L. A., und Friedman, W. J. (1998): Neuroprotective actions of dipyridamole on cultured CNS neurons. J Neurosci 18: 5112-5123.
Fernández-Tomé, P., Lizasoain, I., Leza, J. C., Lorenzo, P., und Moro, M. A. (1999): Neuroprotective effects of DETA-NONOate, a nitric oxide donor, on hydrogen peroxide-induced neurotoxicity in cortical neurones. Neuropharmacology 38: 1307-1315.
Franke, T. A. (1999): A difficult Akt to follow. Promega Neural Notes 5:
Fruman, D. A., Klee, C. B., Bierer, B. E., und Burakoff, S. J. (1992): Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 3686-3690.
Genestier, L., Dearden-Badet, M. T., Bonnefoy-Berard, N., Lizard, G., und Revillard, J. P. (1994): Cyclosporin A and FK506 inhibit activation-induced cell death in the murine WEHI-231 B cell line. Cell Immunol 155: 283-291.
Gold, B. G. (1997): FK506 and the role of immunophilins in nerve regeneration. Mol Neurobiol 15: 285-306.
Gothel, S. F.und Marahiel, M. A. (1999): Peptidyl-prolyl cis-trans isomerases, a superfamily of ubiquitous folding catalysts. Cell Mol Life Sci 55: 423-436.
Goto, S.und Singer, W. (1994): Laminar and columnar organization of immunoreactivity for calcineurin, a calcium- and calmodulin-regulated protein phosphatase, in monkey striate cortex. Cereb Cortex 4: 636-645.
Grasl-Kraupp, B., Ruttkay-Nedecky, B., Koudelka, H., Bukowska, K., Bursch, W., und Schulte-Hermann, R. (1995): In situ detection of fragmented DNA (TUNEL assay) fails to discriminate among apoptosis, necrosis, and autolytic cell death: a cautionary note. Hepatology 21: 1465-1468.
Green, D. R.und Reed, J. C. (1998): Mitochondria and apoptosis. Science 281: 1309-1312.
Greene, J. G., Porter, R. H., Eller, R. V., und Greenamyre, J. T. (1993): Inhibition of succinate dehydrogenase by malonic acid produces an "excitotoxic" lesion in rat striatum. J Neurochem 61: 1151-1154.
Grilli, M.und Memo, M. (1999): Possible role of NF-kappaB and p53 in the glutamate-induced pro-apoptotic neuronal pathway. Cell Death Differ 6: 22-27.
Gu, W. J., Abbas, N., Lagunes, M. Z., Parent, A., Pradier, L., Bohme, G. A., Agid, Y., Hirsch, E. C., Raisman-Vozari, R., und Brice, A. (2000): Cloning of rat parkin cDNA and distribution of parkin in rat brain. J Neurochem 74: 1773-1776.
Gwag, B. J., Lobner, D., Koh, J. Y., Wie, M. B., und Choi, D. W. (1995): Blockade of glutamate receptors unmasks neuronal apoptosis after oxygen-glucose deprivation in vitro. Neuroscience 68: 615-619.
116
LITERATURVERZEICHNIS 117
Hall, E. D., Andrus, P. K., Oostveen, J. A., Althaus, J. S., und VonVoigtlander, P. F. (1996): Neuroprotective effects of the dopamine D2/D3 agonist pramipexole against postischemic or methamphetamine-induced degeneration of nigrostriatal neurons. Brain Res 742: 80-88.
Halliwell, B. (1992): Reactive oxygen species and the central nervous system. J Neurochem 59: 1609-1623.
Hamilton, G. S.und Steiner, J. P. (1997): Neuroimmunophilin Ligands as Novel Therapeutics for the Treatment of Degenerative Disorders of the Nervous System405-428.
Hanson, K. A., Ziegler, J. W., Rybalkin, S. D., Miller, J. W., Abman, S. H., und Clarke, W. R. (1998): Chronic pulmonary hypertension increases fetal lung cGMP phosphodiesterase activity. Am J Physiol 275: L931-L941.
Harada, J.und Sugimoto, M. (1999): Activation of caspase-3 in beta-amyloid-induced apoptosis of cultured rat cortical neurons. Brain Res 842: 311-323.
Hengartner, M. O. (2000): The biochemistry of apoptosis. Nature 407: 770-776.
Henrich-Noack, P., Prehn, J. H., und Krieglstein, J. (1996): TGF-beta 1 protects hippocampal neurons against degeneration caused by transient global ischemia. Dose-response relationship and potential neuroprotective mechanisms. Stroke 27: 1609-1614.
Hirashima, Y., Kurimoto, M., Nogami, K., Endo, S., Saitoh, M., Ohtani, O., Nagata, T., Muraguchi, A., und Takaku, A. (1999): Correlation of glutamate-induced apoptosis with caspase activities in cultured rat cerebral cortical neurons. Brain Res 849: 109-118.
Hirrlinger, J., Hamprecht, B., und Dringen, R. (1999): Application and modulation of a permanent hydrogen peroxide-induced oxidative stress to cultured astroglial cells. Brain Res Brain Res Protoc 4: 223-229.
Hogan, Y. H., Hawkins, R., und Alkadhi, K. A. (1998): Adenosine A1 receptor activation inhibits LTP in sympathetic ganglia. Brain Res 807: 19-28.
Horvitz, H. R.und Sulston, J. E. (1980): Isolation and genetic characterization of cell-lineage mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics 96: 435-454.
Hyslop, P. A., Zhang, Z., Pearson, D. V., und Phebus, L. A. (1995): Measurement of striatal H2O2 by microdialysis following global forebrain ischemia and reperfusion in the rat: correlation with the cytotoxic potential of H2O2 in vitro. Brain Res 671: 181-186.
Janicke, R. U., Sprengart, M. L., Wati, M. R., und Porter, A. G. (1998): Caspase-3 is required for DNA fragmentation and morphological changes associated with apoptosis. J Biol Chem 273: 9357-9360.
Jarvis, W. D., Turner, A. J., Povirk, L. F., Traylor, R. S., und Grant, S. (1994): Induction of apoptotic DNA fragmentation and cell death in HL-60 human promyelocytic leukemia cells by pharmacological inhibitors of protein kinase C. Cancer Res 54: 1707-1714.
Jiang, Q., Gu, Z., Zhang, G., und Jing, G. (2000): Diphosphorylation and involvement of extracellular signal-regulated kinases (ERK1/2) in glutamate-induced apoptotic-like death in cultured rat cortical neurons. Brain Res 857: 71-77.
Johnson Jr., E. M., Greenlund, L. J. S., Akins, P. T., und Hsu, C. Y. (1995): Neuronal Apoptosis: Current Understanding of Molecular Mechanisms and Potential Role in Ischemic Brain Injury. Journal of Neurotrauma 12: 843-852.
Kaal, E. C., Vlug, A. S., Versleijen, M. W., Kuilman, M., Joosten, E. A., und Bar, P. R. (2000): Chronic mitochondrial inhibition induces selective motoneuron death in vitro: a new model for amyotrophic lateral sclerosis. J Neurochem 74: 1158-1165.
Karlsson, J. O., Ostwald, K., Kabjorn, C., und Andersson, M. (1994): A method for protein assay in Laemmli buffer. Anal Biochem 219: 144-146.
117
LITERATURVERZEICHNIS 118
Keane, R. W., Srinivasan, A., Foster, L. M., Testa, M. P., Ord, T., Nonner, D., Wang, H. G., Reed, J. C., Bredesen, D. E., und Kayalar, C. (1997): Activation of CPP32 during apoptosis of neurons and astrocytes. J Neurosci Res 48: 168-180.
Kerr, J. F., Wyllie, A. H., und Currie, A. R. (1972): Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 26: 239-257.
Kim, J. E., Oh, J. H., Choi, W. S., Chang, I. I., Sohn, S., Krajewski, S., Reed, J. C., O'Malley, K. L., und Oh, Y. J. (1999): Sequential cleavage of poly(ADP-ribose)polymerase and appearance of a small Bax-immunoreactive protein are blocked by Bcl-X(L) and caspase inhibitors during staurosporine-induced dopaminergic neuronal apoptosis. J Neurochem 72: 2456-2463.
Kino, T., Hatanaka, H., Hashimoto, M., Nishiyama, M., Goto, T., Okuhara, M., Kohsaka, M., Aoki, H., und Imanaka, H. (1987): FK-506, a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces. I. Fermentation, isolation, and physico-chemical and biological characteristics. J Antibiot (Tokyo) 40: 1249-1255.
Kitayama, S., Wang, J. B., und Uhl, G. R. (1993): Dopamine transporter mutants selectively enhance MPP+ transport. Synapse 15: 58-62.
Koh, J. Y., Wie, M. B., Gwag, B. J., Sensi, S. L., Canzoniero, L. M., Demaro, J., Csernansky, C., und Choi, D. W. (1995): Staurosporine-induced neuronal apoptosis. Exp Neurol 135: 153-159.
Koller, W. C. (1998): Neuroprotection for Parkinson's disease. Ann Neurol 44: S155-S159.
Kovacs, D. M., Mancini, R., Henderson, J., Na, S. J., Schmidt, S. D., Kim, T. W., und Tanzi, R. E. (1999): Staurosporine-induced activation of caspase-3 is potentiated by presenilin 1 familial Alzheimer's disease mutations in human neuroglioma cells. J Neurochem 73: 2278-2285.
Krammer, P. H. (2000): CD95's deadly mission in the immune system. Nature 407: 789-795.
Kroemer, G., Dallaporta, B., und Resche-Rigon, M. (1998): The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu Rev Physiol 60: 619-642.
Kroemer, G., Zamzami, N., und Susin, S. A. (1997): Mitochondrial control of apoptosis. Immunol Today 18: 44-51.
Kroemer, G. (1997): The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis. Nature Medicine 3: 614-620.
Krohn, A. J., Preis, E., und Prehn, J. H. (1998): Staurosporine-induced apoptosis of cultured rat hippocampal neurons involves caspase-1-like proteases as upstream initiators and increased production of superoxide as a main downstream effector. J Neurosci 18: 8186-8197.
Kumar, S.und Colussi, P. A. (1999): Prodomains--adaptors--oligomerization: the pursuit of caspase activation in apoptosis. Trends Biochem Sci 24: 1-4.
Kuroda, S., Janelidze, S., und Siesjö, B. K. (1999): The immunosuppressants cyclosporin A and FK506 equally ameliorate brain damage due to 30-min middle cerebral artery occlusion in hyperglycemic rats. Brain Res 835: 148-153.
Lebeau, M. C., Massol, N., Herrick, J., Faber, L. E., Renoir, J. M., Radanyi, C., und Baulieu, E. E. (1992): P59, an hsp 90-binding protein. Cloning and sequencing of its cDNA and preparation of a peptide-directed polyclonal antibody. J Biol Chem 267: 4281-4284.
Lee, M. S., Kwon, Y. T., Li, M., Peng, J., Friedlander, R. M., und Tsai, L. H. (2000): Neurotoxicity induces cleavage of p35 to p25 by calpain. Nature 405: 360-364.
Li, Y., Chopp, M., Jiang, N., Zhang, Z. G., und Zaloga, C. (1995b): Induction of DNA fragmentation after 10 to 120 minutes of focal cerebral ischemia in rats. Stroke 26: 1252-1257.
118
LITERATURVERZEICHNIS 119
Li, Y., Sharov, V. G., Jiang, N., Zaloga, C., Sabbah, H. N., und Chopp, M. (1995a): Ultrastructural and light microscopic evidence of apoptosis after middle cerebral artery occlusion in the rat. Am J Pathol 146: 1045-1051.
Linnik, M. D., Miller, J. A., Sprinkle-Cavallo, J., Mason, P. J., Thompson, F. Y., Montgomery, L. R., und Schroeder, K. K. (1995): Apoptotic DNA fragmentation in the rat cerebral cortex induced by permanent middle cerebral artery occlusion. Brain Res Mol Brain Res 32: 116-124.
Liu, X.und Zhu, X. Z. (1999): Roles of p53, c-Myc, Bcl-2, Bax and caspases in glutamate-induced neuronal apoptosis and the possible neuroprotective mechanism of basic fibroblast growth factor. Brain Res Mol Brain Res 71: 210-216.
Lucas, M., Sanchez-Margalet, V., Sanz, A., und Solano, F. (1994): Protein kinase C activation promotes cell survival in mature lymphocytes prone to apoptosis. Biochem Pharmacol 47: 667-672.
Malcon, C., Kaddurah-Daouk, R., und Beal, M. F. (2000): Neuroprotective effects of creatine administration against NMDA and malonate toxicity. Brain Res 860: 195-198.
Maragos, W. F., Tillman, P. A., Chesnut, M. D., und Jakel, R. J. (1999): Clorgyline and deprenyl attenuate striatal malonate and 3-nitropropionic acid lesions. Brain Res 834: 168-172.
Maroto, R.und Perez-Polo, J. R. (1997): BCL-2-related Protein Expression in Apoptosis: Oxidative Stress Versus Serum Deprivation in PC12 Cells. Journal of Neurochemistry 69: 514-523.
Marsden, C. D.und Olanow, C. W. (1998): The causes of Parkinson's disease are being unraveled and rational neuroprotective therapy is close to reality. Ann Neurol 44: S189-S196.
Martignoni, E., Bono, G., Blandini, F., Sinforiani, E., Merlo, P., und Nappi, G. (1991): Monoamines and related metabolite levels in the cerebrospinal fluid of patients with dementia of Alzheimer type. Influence of treatment with L-deprenyl. J Neural Transm Park Dis Dement Sect 3: 15-25.
Martin, D. P., Wallace, T. L., und Johnson, E. M. J. (1990): Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons in a fashion resembling trophic factor deprivation: evidence that a deoxycytidine-dependent process may be required for nerve growth factor signal transduction. J Neurosci 10: 184-193.
Martin, L. J., Sieber, F. E., und Traystman, R. J. (2000): Apoptosis and necrosis occur in separate neuronal populations in hippocampus and cerebellum after ischemia and are associated with differential alterations in metabotropic glutamate receptor signaling pathways. J Cereb Blood Flow Metab 20: 153-167.
Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., und Reed, J. C. (2000): Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol 2: 318-325.
McCarthy, N. J., Whyte, M. K. B., Gilbert, C. S., und Evan, G. I. (1997): Inhibition of Ced-3/ICE-related Protease Does Not Prevent Cell Death Induced by Oncogenes, DNA Damage, or the Bcl-2 homologue Bak. The Journal of Cell Biology 136: 215-227.
McLaughlin, B. A., Nelson, D., Erecinska, M., und Chesselet, M. F. (1998b): Toxicity of dopamine to striatal neurons in vitro and potentiation of cell death by a mitochondrial inhibitor. J Neurochem 70: 2406-2415.
McLaughlin, B. A., Nelson, D., Silver, I. A., Erecinska, M., und Chesselet, M. F. (1998a): Methylmalonate toxicity in primary neuronal cultures. Neuroscience 86: 279-290.
Meier, P., Finch, A., und Evan, G. (2000a): Apoptosis in development. Nature 407: 796-801.
Meier, P., Finch, A., und Evan, G. (2000b): Apoptosis in development. Nature 407: 796-801.
Michel, P. P., Ruberg, M., und Agid, Y. (1998): Rescue of Mesencephalic Dopamine Neurons by Anticancer Drug Cytosine Arabinoside. Journal of Neurochemistry 69: 1499-1507.
119
LITERATURVERZEICHNIS 120
Mielke, K., Damm, A., Yang, D. D., und Herdegen, T. (2000): Selective expression of JNK isoforms and stress-specific JNK activity in different neural cell lines. Brain Res Mol Brain Res 75: 128-137.
Mierau, J., Schneider, F. J., Ensinger, H. A., Chio, C. L., Lajiness, M. E., und Huff, R. M. (1995): Pramipexole binding and activation of cloned and expressed dopamine D2, D3 and D4 receptors. Eur J Pharmacol 290: 29-36.
Miyasaka, T., Sternberg, D. W., Miyasaka, J., Sherline, P., und Saltiel, A. R. (1991): Nerve growth factor stimulates protein tyrosine phosphorylation in PC-12 pheochromocytoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A 88: 2653-2657.
Moy, L. Y., Zeevalk, G. D., und Sonsalla, P. K. (2000): Role for dopamine in malonate-induced damage in vivo in striatum and in vitro in mesencephalic cultures. J Neurochem 74: 1656-1665.
Muschen, M., Warskulat, U., Perniok, A., Even, J., Moers, C., Kismet, B., Temizkan, N., Simon, D., Schneider, M., und Haussinger, D. (1999): Involvement of soluble CD95 in Churg-Strauss syndrome. Am J Pathol 155: 915-925.
Narasimhan, P., Sklar, R., Murrell, M., Swanson, R. A., und Sharp, F. R. (1996): Methylmalonyl-CoA mutase induction by cerebral ischemia and neurotoxicity of the mitochondrial toxin methylmalonic acid. J Neurosci 16: 7336-7346.
Nicholson, D. W.und Thornberry, N. A. (1997): Caspases: killer proteases. Trends in Biochemical Science 22: 299-306.
Nicotera, P.und Lipton, S. A. (1999): Excitotoxins in neuronal apoptosis and necrosis. J Cereb Blood Flow Metab 19: 583-591.
Nishinaka, Y., Sugiyama, S., Yokota, M., Saito, H., und Ozawa, T. (1993): Protective effect of FK506 on ischemia/reperfusion-induced myocardial damage in canine heart. J Cardiovasc Pharmacol 21: 448-454.
Ohgoh, M., Shimizu, H., Ogura, H., und Nishizawa, Y. (2000): Astroglial trophic support and neuronal cell death: influence of cellular energy level on type of cell death induced by mitochondrial toxin in cultured rat cortical neurons. J Neurochem 75: 925-933.
Ohmichi, M., Decker, S. J., Pang, L., und Saltiel, A. R. (1992): Inhibition of the cellular actions of nerve growth factor by staurosporine and K252A results from the attenuation of the activity of the trk tyrosin kinase. Biochemistry 31: 4034-4039.
Owada, K., Sanjo, N., Kobayashi, T., Mizusawa, H., Muramatsu, H., Muramatsu, T., und Michikawa, M. (1999): Midkine inhibits caspase-dependent apoptosis via the activation of mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase in cultured neurons. J Neurochem 73: 2084-2092.
Owens-Grillo, J. K., Hoffmann, K., Hutchison, K. A., Yem, A. W., Deibel, M. R. J., Handschumacher, R. E., und Pratt, W. B. (1995): The cyclosporin A-binding immunophilin CyP-40 and the FK506-binding immunophilin hsp56 bind to a common site on hsp90 and exist in independent cytosolic heterocomplexes with the untransformed glucocorticoid receptor. J Biol Chem 270: 20479-20484.
Palfi, S., Ferrante, R. J., Brouillet, E., Beal, M. F., Dolan, R., Guyot, M. C., Peschanski, M., und Hantraye, P. (1996): Chronic 3-nitropropionic acid treatment in baboons replicates the cognitive and motor deficits of Huntington's disease. J Neurosci 16: 3019-3025.
Perdew, G. H.und Whitelaw, M. L. (1991): Evidence that the 90-kDa heat shock protein (HSP90) exists in cytosol in heteromeric complexes containing HSP70 and three other proteins with Mr of 63,000, 56,000, and 50,000. J Biol Chem 266: 6708-6713.
Petersen, A., Castilho, R. F., Hansson, O., Wieloch, T., und Brundin, P. (2000): Oxidative stress, mitochondrial permeability transition and activation of caspases in calcium ionophore A23187-induced death of cultured striatal neurons. Brain Res 857: 20-29.
120
LITERATURVERZEICHNIS 121
Piercey, M. F., Hoffmann, W. E., Smith, M. W., und Hyslop, D. K. (1996): Inhibition of dopamine neuron firing by pramipexole, a dopamine D3 receptor-preferring agonist: comparison to other dopamine receptor agonists. Eur J Pharmacol 312: 35-44.
Piercey, M. F., Hyslop, D. K., und Hoffmann, W. E. (1997): Excitation of type II anterior caudate neurons by stimulation of dopamine D3 receptors. Brain Res 762: 19-28.
Posmantur, R., McGinnis, K., Nadimpalli, R., Gilbertsen, R. B., und Wang, K. K. (1997): Characterization of CPP32-like protease activity following apoptotic challenge in SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurochem 68: 2328-2337.
Prehn, J. H., Bindokas, V. P., Jordan, J., Galindo, M. F., Ghadge, G. D., Roos, R. P., Boise, L. H., Thompson, C. B., Krajewski, S., Reed, J. C., und Miller, R. J. (1996): Protective effect of transforming growth factor-beta 1 on beta-amyloid neurotoxicity in rat hippocampal neurons. Mol Pharmacol 49: 319-328.
Przywara, D. A., Kulkarni, J. S., Wakade, T. D., Leontiev, D. V., und Wakade, A. R. (1998): Pituitary adenylyl cyclase-activating polypeptide and nerve growth factor use the proteasome to rescue nerve growth factor-deprived sympathetic neurons cultured from chick embryos. J Neurochem 71: 1889-1897.
Raff, M. C., Barres, B. A., Burne, J. F., Coles, H. S., Ishizaki, Y., und Jacobson, M. D. (1994): Programmed cell death and the control of cell survival. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 345: 265-268.
Rasouly, D.und Lazarovici, P. (1994): Staurosporine induces tyrosine phosphorylation of a 145 kDa protein but does not activate gp140trk in PC12 cells. Eur J Pharmacol 269: 255-264.
Rasouly, D., Rahamim, E., Lester, D., Matsuda, Y., und Lazarovici, P. (1992): Staurosporin-Induced Neurite Outgroth in PC12 Cells Is Independent of Protein Kinase C Inhibition. Molecular Pharmacology 42: 35-43.
Rasouly, D., Rahamim, E., Ringel, I., Ginzburg, I., Muarakata, C., Matsuda, Y., und Lazarovici, P. (1993): Neurites Induced by Staurosporine in PC12 Cells are Resistant to Colchizine and Express High Levels of Tau Proteins. Molecular Pharmacology 45: 29-35.
Ray, A. M., Owen, D. E., Evans, M. L., Davis, J. B., und Benham, C. D. (2000): Caspase inhibitors are functionally neuroprotective against oxygen glucose deprivation induced CA1 death in rat organotypic hippocampal slices. Brain Res 867: 62-69.
Reddy, P. H., Williams, M., und Tagle, D. A. (1999): Recent advances in understanding the pathogenesis of Huntington's disease. Trends Neurosci 22: 248-255.
Reed, J. C. (1997): Double Identity for proteins of the Bcl-2 family. Nature 387: 773-776.
Rothman, S. M. (1983): Synaptic activity mediates death of hypoxic neurons. Science 220: 536-537.
Sabatini, D. M., Lai, M. M., und Snyder, S. H. (1997): Neural roles of immunophilins and their ligands. Mol Neurobiol 15: 223-239.
Sagara, Y., Hendler, S., Khoh-Reiter, S., Gillenwater, G., Carlo, D., Schubert, D., und Chang, J. (1999): Propofol hemisuccinate protects neuronal cells from oxidative injury. J Neurochem 73: 2524-2530.
Sahara, S., Aoto, M., Eguchi, Y., Imamoto, N., Yoneda, Y., und Tsujimoto, Y. (1999): Acinus is a caspase-3-activated protein required for apoptotic chromatin condensation [see comments]. Nature 401: 168-173.
Sanchez, E. R. (1990): Hsp56: a novel heat shock protein associated with untransformed steroid receptor complexes. J Biol Chem 265: 22067-22070.
Sathasivam, S., Ince, P. G., und Shaw, P. J. (2001): Apoptosis in amyotrophic lateral sclerosis: a review of the evidence. Neuropathol Appl Neurobiol 27: 257-274.
121
LITERATURVERZEICHNIS 122
Sato, S., Gobbel, G. T., Honkaniemi, J., Li, Y., Kondo, T., Murakami, K., Sato, M., Copin, J. C., Sharp, F. R., und Chan, P. H. (1998): Decreased expression of bcl-2 and bcl-x mRNA coincides with apoptosis following intracerebral administration of 3-nitropropionic acid. Brain Res 808: 56-64.
Savill, J.und Fadok, V. (2000): Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature 407: 784-788.
Schulz, J. B., Weller, M., Matthews, R. T., Heneka, M. T., Groscurth, P., Martinou, J. C., Lommatzsch, J., von Coelln, R., Wullner, U., Loschmann, P. A., Beal, M. F., Dichgans, J., und Klockgether, T. (1998): Extended therapeutic window for caspase inhibition and synergy with MK-801 in the treatment of cerebral histotoxic hypoxia. Cell Death Differ 5: 847-857.
Sharkey, J.und Butcher, S. P. (1994): Immunophilins mediate the neuroprotective effects of FK506 in focal cerebral ischaemia. Nature 371: 336-339.
Shibasaki, F.und McKeon, F. (1995): Calcineurin functions in Ca(2+)-activated cell death in mammalian cells. J Cell Biol 131: 735-743.
Shoulson, I. (1998): Experimental therapeutics of neurodegenerative disorders: unmet needs. Science 282: 1072-1074.
Simons, M., Beinroth, S., Gleichmann, M., Liston, P., Korneluk, R. G., MacKenzie, A. E., Bähr, M., Klockgether, T., Robertson, G. S., Weller, M., und Schulz, J. B. (1999): Adenovirus-mediated gene transfer of inhibitors of apoptosis protein delays apoptosis in cerebellar granule neurons. J Neurochem 72: 292-301.
Sims, N. R., Anderson, M. F., Hobbs, L. M., Kong, J. Y., Phillips, S., Powell, J. A., und Zaidan, E. (2000): Impairment of brain mitochondrial function by hydrogen peroxide. Brain Res Mol Brain Res 77: 176-184.
Small, D. L., Monette, R., Comas, T., Fournier, M., und Morley, P. (1999): Loss of cyclin D1 in necrotic and apoptotic models of cortical neuronal degeneration. Brain Res 842: 376-383.
Snyder, S. H., Lai, M. M., und Burnett, P. E. (1998a): Immunophilins in the nervous system. Neuron 21: 283-294.
Snyder, S. H., Sabatini, D. M., Lai, M. M., Steiner, J. P., Hamilton, G. S., und Suzdak, P. D. (1998b): Neural actions of immunophilin ligands. Trends Pharmacol Sci 19: 21-26.
Solovyan, V., Bezvenyuk, Z., Huotari, V., Tapiola, T., Suuronen, T., und Salminen, A. (1998): Distinct mode of apoptosis induced by genotoxic agent etoposide and serum withdrawal in neuroblastoma cells. Brain Res Mol Brain Res 62: 43-55.
Song, Z.und Steller, H. (1999): Death by design: mechanism and control of apoptosis. Trends Cell Biol 9: M49-M52.
Stach, R. W., Garian, N., und Olender, E. J. (1979): Biological activity of the beta nerve growth factor: the effects of various added proteins. J Neurochem 33: 257-261.
Steiner, J. P., Connolly, M. A., Valentine, H. L., Hamilton, G. S., Dawson, T. M., Hester, L., und Snyder, S. H. (1997b): Neurotrophic actions of nonimmunosuppressive analogues of immunosuppressive drugs FK506, rapamycin and cyclosporin A. Nat Med 3: 421-428.
Steiner, J. P., Connolly, M. A., Valentine, H. L., Hamilton, G. S., Dawson, T. M., Hester, L., und Snyder, S. H. (1997c): Neurotrophic actions of nonimmunosuppressive analogues of immunosuppressive drugs FK506, rapamycin and cyclosporin A. Nat Med 3: 421-428.
Steiner, J. P., Dawson, T. M., Fotuhi, M., Glatt, C. E., Snowman, A. M., Cohen, N., und Snyder, S. H. (1992): High brain densities of the immunophilin FKBP colocalized with calcineurin. Nature 358: 584-587.
Steiner, J. P., Hamilton, G. S., Ross, D. T., Valentine, H. L., Guo, H., Connolly, M. A., Liang, S., Ramsey, C., Li, J. H., Huang, W., Howorth, P., Soni, R., Fuller, M., Sauer, H., Nowotnik, A. C., und Suzdak, P. D.
122
LITERATURVERZEICHNIS 123
(1997a): Neurotrophic immunophilin ligands stimulate structural and functional recovery in neurodegenerative animal models. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 2019-2024.
Steller, H. (1995): Mechanisms and genes of cellular suicide. Science 267: 1445-1449.
Stichel, C. C.und Muller, H. W. (1991): Dissociated cell culture of rat cerebral cortical neurons in serum-free, conditioned media: GABA-immunopositive neurons. Brain Res Dev Brain Res 64: 145-154.
Strand, S., Hofmann, W. J., Grambihler, A., Hug, H., Volkmann, M., Otto, G., Wesch, H., Mariani, S. M., Hack, V., Stremmel, W., Krammer, P. H., und Galle, P. R. (1998): Hepatic failure and liver cell damage in acute Wilson's disease involve CD95 (APO-1/Fas) mediated apoptosis. Nat Med 4: 588-593.
Sundaram, M., Yao, S. Y., Ng, A. M., Griffiths, M., Cass, C. E., Baldwin, S. A., und Young, J. D. (1998): Chimeric constructs between human and rat equilibrative nucleoside transporters (hENT1 and rENT1) reveal hENT1 structural domains interacting with coronary vasoactive drugs. J Biol Chem 273: 21519-21525.
Tai, P. K., Albers, M. W., Chang, H., Faber, L. E., und Schreiber, S. L. (1992): Association of a 59-kilodalton immunophilin with the glucocorticoid receptor complex. Science 256: 1315-1318.
Takata, K., Kitamura, Y., Kakimura, J., Kohno, Y., und Taniguchi, T. (2000): Increase of bcl-2 protein in neuronal dendritic processes of cerebral cortex and hippocampus by the antiparkinsonian drugs, talipexole and pramipexole. Brain Res 872: 236-241.
Taylor, J., Gatchalian, C. L., Keen, G., und Rubin, L. L. (1997): Apoptosis in Cerebellar Granule Neurons: Involvment of Interleukin-1β Converting Enzyme-Like Proteases. Journal of Neurochemistry 68: 1598-1605.
Tenneti, L., D'Emilia, D. M., Troy, C. M., und Lipton, S. A. (1998): Role of caspases in N-methyl-D-aspartate-induced apoptosis in cerebrocortical neurons. J Neurochem 71: 946-959.
Tenneti, L.und Lipton, S. A. (2000): Involvement of activated caspase-3-like proteases in N-methyl-D-aspartate-induced apoptosis in cerebrocortical neurons. J Neurochem 74: 134-142.
Thornberry, N. A.und Lazebnik, Y. (1998): Caspases: enemies within. Science 281: 1312-1316.
Tretter, L., Chinopoulos, C., und Adam-Vizi, V. (1997): Enhanced depolarization-evoked calcium signal and reduced [ATP]/[ADP] ratio are unrelated events induced by oxidative stress in synaptosomes. J Neurochem 69: 2529-2537.
Troy, C. M., Rabacchi, S. A., Friedman, W. J., Frappier, T. F., Brown, K., und Shelanski, M. L. (2000): Caspase-2 mediates neuronal cell death induced by beta-amyloid. J Neurosci 20: 1386-1392.
Tyurin, V. A., Tyurina, Y. Y., Quinn, P. J., Schor, N. F., Balachandran, R., Day, B. W., und Kagan, V. E. (1998): Glutamate-induced cytotoxicity in PC12 pheochromocytoma cells: role of oxidation of phospholipids, glutathione and protein sulfhydryls revealed by bcl-2 transfection. Brain Res Mol Brain Res 60: 270-281.
Uberti, D., Yavin, E., Gil, S., Ayasola, K. R., Goldfinger, N., und Rotter, V. (1999): Hydrogen peroxide induces nuclear translocation of p53 and apoptosis in cells of oligodendroglia origin. Brain Res Mol Brain Res 65: 167-175.
Vaux, D. L., Weissman, I. L., und Kim, S. K. (1992): Prevention of programmed cell death in Caenorhabditis elegans by human bcl-2. Science 258: 1955-1957.
Villa, P., Kaufmann, S. H., und Earnshaw, W. C. (1997): Caspases and caspase inhibitors. Trends in Biochemical Science 22: 388-393.
Wallace, T. L.und Johnson Jr., E. M. (1989): Cytosine Arabinoside Kills Postmitotic Neurons: Evidence That Deoxycytidine May Have a Role in Neuronal Survival That Is Independent of DNA Synthesis. The Journal of Neuroscience 9: 115-124.
123
LITERATURVERZEICHNIS 124
Wang, T., Li, B. Y., Danielson, P. D., Shah, P. C., Rockwell, S., Lechleider, R. J., Martin, J., Manganaro, T., und Donahoe, P. K. (1996): The immunophilin FKBP12 functions as a common inhibitor of the TGF beta family type I receptors. The Journal of Cell Biology 86: 435-444.
Wang, Y., Qin, Z.-H., Nakai, M., und Chase, T. N. (1997): Glutamate metabotropic receptor agonist 1S,3R-ACPD induces internucleosomal DNA fragmentation and cell death in rat striatum. Brain Research 772: 45-56.
Wellington, C. L., Singaraja, R., Ellerby, L., Savill, J., Roy, S., Leavitt, B., Cattaneo, E., Hackam, A., Sharp, A., Thornberry, N., Nicholson, D. W., Bredesen, D. E., und Hayden, M. R. (2000): Inhibiting caspase cleavage of huntingtin reduces toxicity and aggregate formation in neuronal and nonneuronal cells. J Biol Chem 275: 19831-19838.
Wiesner, D. A.und Dawson, G. (1996): Staurosporine induces programmed cell death in embryonic neurons and activation of the ceramide pathway. J Neurochem 66: 1418-1425.
Wyllie, A. H. (1980): Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. Nature 284: 555-556.
Wyllie, A. (1998): An endonuclease at last. Nature 391: 20-21.
Yardin, C., Terro, F., Lesort, M., Esclaire, F., und Hugon, J. (1998): FK506 antagonizes apoptosis and c-jun protein expression in neuronal cultures. Neuroreport 9: 2077-2080.
Ying, W., Han, S. K., Miller, J. W., und Swanson, R. A. (1999): Acidosis potentiates oxidative neuronal death by multiple mechanisms. J Neurochem 73: 1549-1556.
Yoshimoto, T.und Siesjö, B. K. (1999): Posttreatment with the immunosuppressant cyclosporin A in transient focal ischemia. Brain Res 839: 283-291.
Yuan, J.und Yankner, B. A. (2000): Apoptosis in the nervous system. Nature 407: 802-809.
Zamzami, N.und Kroemer, G. (1999): Condensed matter in cell death [news; comment]. Nature 401: 127-128.
Zeevalk, G. D., Bernard, L. P., Albers, D. S., Mirochnitchenko, O., Nicklas, W. J., und Sonsalla, P. K. (1997): Energy stress-induced dopamine loss in glutathione peroxidase-overexpressing transgenic mice and in glutathione-depleted mesencephalic cultures. J Neurochem 68: 426-429.
Zeevalk, G. D., Bernard, L. P., und Nicklas, W. J. (1998b): Role of oxidative stress and the glutathione system in loss of dopamine neurons due to impairment of energy metabolism. J Neurochem 70: 1421-1430.
Zeevalk, G. D., Bernard, L. P., Sinha, C., Ehrhart, J., und Nicklas, W. J. (1998a): Excitotoxicity and oxidative stress during inhibition of energy metabolism. Dev Neurosci 20: 444-453.
Zhang, F., Endo, S., Cleary, L. J., Eskin, A., und Byrne, J. H. (1997): Role of transforming growth factor-beta in long-term synaptic facilitation in Aplysia. Science 275: 1318-1320.
Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Brustugun, O. T., und D skeland??, S. O. (1998): Injected cytochrom c induces apoptosis. Nature 391: 449-450.
Zhu, H., Fearnhead, H. O., und Cohen, G. M. (1995): An ICE-like protease is a common mediator of apoptosis induced by diverse stimuli in human monocytic THP.1 cells. FEBS Letters 374: 303-308.
Zornig, M., Hueber, A., Baum, W., und Evan, G. (2001): Apoptosis regulators and their role in tumorigenesis. Biochim Biophys Acta 1551: F1-F37.
124