die rolle von hmmr -...
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Die Rolle von hmmr während Neurulation und Hirnentwicklung
im Afrikanischen Krallenfrosch Xenopus laevis
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
Fakultät Naturwissenschaften
Universität Hohenheim
Institut für Zoologie
vorgelegt von
Dipl. Biol. Cathrin Michaela Hagenlocher
aus Magstadt
2016
Dekan: Prof. Dr. Heinz Breer
1. berichtende Person: apl. Prof. Dr. Axel Schweickert
2. berichtende Person: Prof. Dr. Heinz Breer
Eingereicht am: 12. Januar 2016
Mündliche Prüfung am: 18. April 2016
Die vorliegende Arbeit wurde am 7. März 2016 von der Fakultät Naturwissenschaften
der Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der
Naturwissenschaften“ angenommen.
Danksagungen An erster Stelle danke ich ganz besonders meiner Betreuerin Dr. Kerstin Feistel. Die
Chance meine Doktorarbeit in Deiner Arbeitsgruppe anzufertigen war das Beste, was
mir passieren konnte. Ich danke Dir für die freie Hand, die Du mir in der Bearbeitung
unserer Projekte gelassen hast und für die großartige Unterstützung bei allen Fragen
und in allen Lebenslagen.
Ein großer Dank gilt ebenfalls meinem „neuen“ Doktorvater Prof. Dr. Axel Schweickert
für die kurzfristige Übernahme dieser Rolle. Deine Denkanstöße und Beratung haben
dieser Arbeit sehr geholfen.
Dann danke ich meinem „alten“ Doktorvater Prof. Dr. Martin Blum für die Unterstützung
während meiner Zeit in der Zoologie und das Vertrauen in mich und meine Arbeit.
Besonders aber für Deine Begeisterung für die Entwicklungsbiologie, durch die es mich
in dieses Institut gezogen hat.
Ebenfalls danke ich Herrn Prof. Dr. Heinz Breer für das Interesse an dieser Arbeit und
die Bereitschaft diese zu begutachten.
Die wichtigste Person im Labor war über die Jahre Anna Iwanska, vielen Dank für die
großartige Unterstützung bei unseren Projekten und für die tolle Atmosphäre im Labor.
Auch allen temporären Mitgliedern der AG Neurale Stammzellen danke ich für die
Mitarbeit und ihre Beiträge zu unseren Projekten. Allen voran meinen Bachelor-
Studenten Elias Roller und Pascal Hauser.
Ein ganz besonderer Dank geht an meinen Mitdoktoranden Tim Ott. In Dir habe ich
nicht nur einen sehr guten Freund gefunden, mit dem der Laboralltag viel mehr Spaß
gemacht hat. Deine Beratung in allen wissenschaftlichen und abbildungstechnischen
Fragen war großartig! Danke!
Bedanken möchte ich mich auch bei allen Mitdoktoranden in den Jahren für die schöne
Zeit und den wissenschaftlichen Austausch. Ein besonderer Dank gilt dabei Thomas
Thumberger für die viele, geduldige Unterstützung mit R und der Statistik, Isabell
Schneider für die Einarbeitung ins Raster, Janos Töszer für die lustige Laborzeit, Philipp
Vick, Tina Beyer, Bärbel Ulmer und Peter Walentek für all die Unterstützung bei den
ersten Schritten im Labor und ein extra Dank der guten Seele des Labors, Susanne
Bogusch.
Den Master-Studenten in unserem neuen Doktoranden-/Masterbüro danke ich herzlich
für ihre Rücksicht auf mich. Jetzt gehört es euch!
Allen, die zu meinen Publikationen beigetragen haben, danke ich für ihre Mitarbeit.
I acknowledge the generous gifts of Hmmr antibody and hmmr in pFastBac HTc by
Aaron Groen and Tim Mitchison and Fibronectin antibody by Douglas DeSimone. The
Sox3 probe was kindly provided by Thomas Hollemann.
Ebenso ein großes Dankeschön an alle, welche beim Korrekturlesen der Arbeit
geholfen haben.
Auch wenn an letzter Stelle, geht der größte Dank an meine Familie insbesondere an
meine Mama und meinen Mann Jörg. Ihr hattet immer Verständnis, habt mir den
Rücken freigehalten, mich immer wieder motiviert und ihr glaubt an mich. Und an Tom,
der meine größte Motivation ist und mich jeden Tag glücklich macht. Ohne euch wäre
diese Arbeit nicht möglich gewesen, Danke!
Für meine Eltern
Zusammenfassung
VI
Zusammenfassung Die Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) füllt das komplette Ventrikelsystem des Hirns, den
Spinalkanal und den subarachnoidalen Raum aus. Die CSF dient der mechanischen
Pufferung des Hirns, transportiert Signalmoleküle und eliminiert Abfallprodukte des
Ependyms. Der Plexus choroideus (PC) sekretiert die CSF welche mittels motiler Cilien
innerhalb der Ventrikelräume transportiert werden. Eine übermäßige Bildung,
verminderter Transport sowie verringerte Absorption der CSF können zu Hydrocephalus
führen, einer pathologischen Erweiterung der Hirnventrikel. Durch Mutationen in
Mensch und Maus ist bekannt, dass dysfunktionale und immotile Cilien ebenfalls zum
Krankheitsbild des Hydrocephalus führen. Auf welche Weise die Beeinträchtigung von
Cilienmotilität zur Ausbildung eines Hydrocpehalus führt ist bislang nicht geklärt.
In der vorliegenden Arbeit wurde der embryologische Modellorganismus Xenopus laevis
verwendet, um die Entstehung von Cilienmotilitäts-basiertem Hydrocephalus zu
analysieren. Die Entwicklung von Cilien im Hirn von Xenopus laevis wurde bis hin zur
Metamorphose beschrieben. Dabei korrelierte die Genexpression von foxj1, dem
übergeordneten Regulator der Biogenese motiler Cilien, mit der Ausbildung elongierter
Monocilien und dem Übergang zu Multicilien-tragenden, ependymalen Zellen. Die Cilien
foxj1-positiver Zellen waren motil und erzeugten eine gerichtete CSF-Strömung. Der
Funktionsverlust von foxj1 beeinträchtigte und ablatierte motile Cilien und erzeugte eine
hydrocephalische Aufweitung des vierten Ventrikels. Dabei korrelierte die Entstehung
von Hydrocephalus mit einer Verlangsamung der ciliengetriebenen CSF-
Fließgeschwindigkeit auf unter 300 µm/s. Für Atemwegscilien ist eine Regulation des
Cilienschlags durch HMMR beschrieben, wobei ein Funktionsverlust von HMMR die
Cilienschlagfrequenz verlangsamt. Passend dazu führte der Funktionsverlust von hmmr
in Xenopus laevis zu verlangsamter CSF-Strömung und resultierte in einem
Hydrocephalus des vierten Ventrikels. Dies legt nahe, dass insbesondere im vierten
Ventrikel eine CSF-Fließgeschwindigkeit von über 300 μm/s nötig ist, um einen
homöostatischen Flüssigkeitsdruck im gesamten Ventrikelsystem aufrechtzuerhalten.
Darüber hinaus induzierte der Funktionsverlust sowohl von foxj1 als auch von hmmr
Fehlbildungen im Bereich der dorsalen Mittellinie des Vorder- und Mittelhirns. Dies
betraf vor allem den PC sowie das subkommissurale Organ und somit cilienbesetzte
Strukturen, welche bereits mit der Entstehung von Hydrocephalus verknüpft wurden.
Die Hirndefekte nach Funktionsverlust von hmmr entsprachen dem Krankheitsbild der
Zusammenfassung
VII
Holoprosencephalie (HPE). Diese kongenitale Fehlbildung wird meist durch Mutationen
im Shh-Signalweg ausgelöst und geht mit Hydrocephalus einher. Überraschenderweise
war HPE nach Funktionsverlust von hmmr unabhängig vom Shh-Signalweg. Vielmehr
war die Entwicklung des Vorderhirns gestört, da hmmr für Mikrotubuli-vermittelte
Zelladhäsion während der morphogenetischen Bewegungen der Neurulation notwendig
war.
Diese Arbeit zeigte zum ersten Mal, dass die CSF in Xenopus laevis durch motile Cilien
transportiert wird und bestätigte, dass fehlende und dysfunktionale, motile Cilien zu
kongenitalem Hydrocephalus führen. Neu ist, dass motile Cilien eine Rolle für die
Morphogenese des Vorder- und Mittelhirns spielen. Die Enstehung eines
Hydrocephalus im Zusammenhang mit Vorderhirndefekten in foxj1- und hmmr-
Morphanten legt nahe, dass ein cilienabhängiger Hydrocephalus durch die Fehlbildung
dorsaler Mittellinienstrukturen entstehen kann. Die vorliegende Arbeit hat somit die
Grundlage geschaffen, um Xenopus laevis als Modellsystem für die Entstehung von
Hydrocephalus bei ciliärer Dyskinesie und Vorderhirndefekten zu etablieren.
Abstract
VIII
Abstract The cerebrospinal fluid (CSF) fills the entire ventricular system of the brain, the spinal
cavity and the subarachnoid space. CSF mechanically buffers the brain, transports
signaling molecules and eliminates waste products. It is produced by the choroid plexus
(CP) and transported throughout the ventricular system via motile cilia. Excessive
production, diminished transport or reduced absorption of CSF lead to hydrocephalus, a
pathological dilatation of the brain ventricles.
Mutations in humans and mice showed that dysfunctional and immotile cilia also induce
hydrocephalus. The underlying mechanism through which disturbed ciliary motility leads
to formation of hydrocephalus is not resolved.
In the present thesis the model organism Xenopus laevis was used to analyze the
occurrence of hydrocephalus upon on ciliary dysmotility. Biogenesis of motile cilia was
described in the Xenopus laevis brain up to metamorphosis. Gene expression of foxj1,
the superior regulator of the biogenesis of motile cilia, correlated with development of
elongated monocilia and the switch to multiciliated ependymal cells. Cilia on foxj1-
positive cells were motile and produced a directional flow of CSF. foxj1 loss-of-function
led to impaired or absent motile cilia and resulted in hydrocephalus. The development of
the hydrocephalic dilatation correlated with reduced velocity of the cilia-driven CSF-flow
below 300 µm/s. In cilia of the airway epithelium regulation of ciliary beat frequency via
HMMR has been described with HMMR loss-of-function resulting in reduced ciliary beat
frequency. In line with these results, hmmr loss-of-function in Xenopus laevis resulted in
reduced velocity of CSF-flow and hydrocephalus. This suggests that especially in the
fourth ventricle CSF-flow velocities above 300 µm/s are necessary to maintain a
homeostatic fluid pressure in the entire ventricular system.
The loss-of-function of foxj1 as well as hmmr further led to severe malformations in the
dorsal midline of the brain, especially of the CP and the subcommissural organ. These
ciliated structures have already been connected to development of hydrocephalus.
Brain defects after loss-of-function of hmmr reflected the human disorder of
holoprosencephaly (HPE) which often results from mutations in the Shh-signaling
pathway and leads to hydrocephalus. Interestingly after hmmr loss-of-function induced
HPE was independent of the Shh-signaling pathway. Forebrain development was
disturbed because hmmr was necessary for microtubule-mediated cell adhesion during
the morphogenetic movements of neurulation.
Abstact
IX
This study shows for the first time, that CSF in Xenopus laevis is transported via motile
cilia and confirmes that dysfunction or absent motile cilia lead to congenital
hydrocephalus. Furthermore a novel role for motile cilia during fore- and midbrain
morphogenesis was demonstrated. Development of hydrocephalus together with
forebrain defects in foxj1 and hmmr morphants implies that cilia-dependent
hydrocephalus can result from malformed dorsal midline structures. This study thus
provides a basis to establish Xenopus laevis as a model organism to study the
development of hydrocephalus caused by primary cilia dyskinesia and by forebrain
defects.
Inhaltsverzeichnis
X
Inhaltsverzeichnis I Einleitung ............................................................................................ 1
I.1 Xenopus laevis als embryologischer Modellorganismus .................................................. 1
I.2 Befruchtung und erste Zellteilungen ................................................................................ 2
I.3 Anlage der Keimblätter und Etablierung der Körperachsen ............................................. 3
I.4 Gastrulation und Neuordnung der Keimblätter ................................................................ 4
I.5 Zelluläre Grundlagen morphologischer Veränderungen während der Neurulation ........... 5
I.6 Musterbildung im Hirn ..................................................................................................... 7
I.7 Zentrale Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit ........................................................ 10
II Ergebnisse ........................................................................................ 13
II.1 Xenopus-Embryonen exprimieren foxj1 in abgrenzbaren Regionen des sich entwickelnden zentralen Nervensystems ...................................................................... 13
II.2 Die Expression von foxj1 korreliert mit der Elongation von Monocilien und dem ...............
Auftreten von Multicilien ................................................................................................ 16
II.3 Zusätzliche Expressionsdomänen von foxj1 markieren weitere Regionen mit
elongierten Cilien .......................................................................................................... 18
II.4 Die Expression von foxj1 und Ciliogenese im prämetamorphischen und adulten Hirn
von Xenopus ................................................................................................................. 21
II.5 Der Funktionsverlust von foxj1 resultiert in Hydrocephalus ........................................... 24
II.6 Analyse der Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung .......................................................... 26
II.7 Die Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung wird durch motile Cilien generiert ................... 27
II.8 Der Funktionsverlust von foxj1 verlangsamt die Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung ........ im vierten Ventrikel ..................................................................................................... 27
II.9 Die reduzierte Strömungsgeschwindigkeit der Cerebrospinalflüssigkeit korreliert
mit Defekten in der Ciliogenese .................................................................................... 30
II.10 hmmr ist im sich entwickelnden Hirn von Xenopus und Maus exprimiert ....................... 32
II.11 Der Funktionsverlust von hmmr führt zu Hydrocephalus ............................................... 35
II.12 Der Funktionsverlust von hmmr führt zu Holoprosencephalie und dem Verlust des
Cilien-tragenden Plexus choroideus .............................................................................. 38
II.13 hmmr wird für die Augenentwicklung benötigt ............................................................... 40
II.14 Die Spezifizierung von Neuroektoderm und Augenanlagen ist nach Funktionsverlust
von hmmr nicht verändert ............................................................................................. 43
II.15 Verzögerung des anterioren Neuralrohrschlusses nach Funktionsverlust von hmmr ..... 45
Inhaltsverzeichnis
XI
II.16 hmmr lokalisiert in der tiefen Zellschicht des Neuroektoderms mit Mikrotubuli und
F-Aktin .......................................................................................................................... 46
II.17 hmmr wird für den zeitlich korrekten anterioren Neuralrohrschluss benötigt .................. 49
II.18 Der Sonic-hedgehog-Signalweg und primäre Cilien sind nach hmmr Funktionsverlust unverändert ................................................................................................................... 52
II.19 hmmr wird für Zellpolarisation und Elongation benötigt ................................................. 53
II.20 hmmr wird für die Zell-Matrix-Adhäsion benötigt ........................................................... 55
II.21 hmmr wird für die Zell-Zell-Adhäsion benötigt ............................................................... 58
II.22 Anoikis nach Funktionsverlust von hmmr ...................................................................... 60
II.23 Der Funktionsverlust von hmmr in späten Entwicklungsstadien .................................... 61
II.23.1 Radiäre Glia in der proliferativen Zone des Hirns von Xenopus ....................... 61
II.23.2 Radiäre Glia sind nach Funktionsverlust von hmmr reduziert .......................... 63
II.24 Legenden der Filme ...................................................................................................... 65
III Diskussion ........................................................................................ 67
III.1 Die Expression von foxj1 korreliert zeitlich und räumlich mit der Ausbildung elongierter Cilien ............................................................................................................................. 67
III.2 Die Bewegung der Cerebrospinalflüssigkeit wird durch motile Cilien generiert .............. 68
III.3 Wie kann ciliäre Dysfunktion Hydrocephalus induzieren? ............................................. 68
III.4 Rufen Fehlbildungen des Vorder- und Mittelhirns Hydrocephalus hervor? .................... 70
III.5 Wie kommt es zum Verlust dorsaler Mittellinienstrukturen nach Funktionsverlust von hmmr? .......................................................................................................................... 73
III.6 Abschließende Bemerkungen ....................................................................................... 77
IV Material und Methoden ..................................................................... 79 V Literaturverzeichnis ....................................................................... 110
Abbildungsverzeichnis
XII
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 01 Musterbildung im Hirn ......................................................................................... 8
Abbildung 02 Xenopus-Embryonen exprimieren foxj1 in abgrenzbaren Regionen des
sich entwickelnden zentralen Nervensystems .................................................... 15
Abbildung 03 Die Expression von foxj1 korreliert mit der Elongation von Monocilien und
dem Auftreten von Multicilien ............................................................................. 17
Abbildung 04 Cilierung und Expression von foxj1 im weiteren Verlauf
der Hirnmorphogenese ...................................................................................... 18
Abbildung 05 Zusätzliche Expressionsdomänen von foxj1 markieren weitere
Regionen mit elongierten Cilien ......................................................................... 20
Abbildung 06 Die Expression von foxj1 und Ciliogenese im prämetamorphischen
Hirn von Xenopus .............................................................................................. 22
Abbildung 07 Die Expression von foxj1 im Infundibulum korreliert mit dem Auftreten
von Multicilien-tragenden Zellen ........................................................................ 23
Abbildung 08 Der Funktionsverlust von foxj1 führt zu einem verkürzten Vorderhirn ................ 25
Abbildung 09 Der Funktionsverlust von foxj1 im zentralen Nervensystem resultiert
in Hydrocephalus ............................................................................................... 29
Abbildung 10 Die reduzierte Strömungsgeschwindigkeit der Cerebrospinalflüssigkeit
korreliert mit Defekten in der Ciliogenese .......................................................... 31
Abbildung 11 hmmr ist im sich entwickelnden Hirn von Xenopus und Maus exprimiert ........... 34
Abbildung 12 Der Funktionsverlust von hmmr führt zu Hydrocephalus ................................... 37
Abbildung 13 Der Funktionsverlust von hmmr führt zu Holoprosencephalie
und dem Verlust des Cilien-tragenden Plexus choroideus ............................... 39
Abbildung 14 hmmr wird für die Augenentwicklung benötigt ................................................... 42
Abbildung 15 Die Spezifizierung von Neuroektoderm und Augenanlagen ist
unverändert nach Funktionsverlust von hmmr ................................................. 44
Abbildung 16 Verzögerung des anterioren Neuralrohrschlusses nach
Funktionsverlust von hmmr ............................................................................. 46
Abbildung 17 Hmmr lokalisiert in der tiefen Zellschicht des Neuroektoderms
mit Mikrotubuli und F-Aktin .............................................................................. 48
Abbildung 18 hmmr wird für den zeitlich korrekten anterioren Neuralrohrschluss
benötigt ........................................................................................................... 51
Abbildung 19 Der Sonic-hedgehog-Signalweg und primäre Cilien sind nach hmmr
Funktionsverlust unverändert .......................................................................... 53
Abbildung 20 hmmr wird für Zellpolarisation und Elongation benötigt ..................................... 55
Abbildungsverzeichnis
XIII
Abbildung 21 hmmr wird für die Zell-Matrix-Adhäsion benötigt ............................................... 57
Abbildung 22 Der Funktionsverlust von hmmr resultiert in verringerter
Zell-Zell-Adhäsion ........................................................................................... 59
Abbildung 23 Anoikis nach Funktionsverlust von hmmr .......................................................... 60
Abbildung 24 Radiäre Glia in der proliferativen Zone des Hirns von Xenopus ........................ 62
Abbildung 25 Radiäre Glia sind nach Funktionsverlust von hmmr reduziert ............................ 64
Abbildung 26 Modell der hmmr-vermittelten Zelladhäsion und
Holoprosencephalie-Bildung ............................................................................ 77
Filme
XIV
Filme
In vorliegender Arbeit wird auf fünf Filme verwiesen, welche auf beiliegender DVD zu
finden sind. Die Legenden zu diesen Filmen sind auf folgenden Seiten zu finden:
Film 1 Die Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung im vierten Ventrikel ......................................... 65
Film 2 Die Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung wird durch motile Cilien generiert ................... 65
Film 3 Der Funktionsverlust von foxj1 verlangsamt die Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung
im vierten Ventrikel ....................................................................................................... 65
Film 4 Verzögerter, anteriorer Neuralrohrschluss nach Funktionsverlust von hmmr ................. 66
Film 5 Adhäsion und Migration sind in Neuralleisten aus hmmr Morphanten reduziert ............. 66
Einleitung
1
I Einleitung Alle bilateralen Metazoen besitzen ein Gehirn, welches im weitesten Sinne als die
zentrale Schaltstelle des Nervensystems gilt. Selbst Cnidaria - als basale Gruppe -
besitzen komplexe, Organ-ähnliche Strukturen für die sensorische Wahrnehmung. Auch
Schwämme exprimieren Gene, welche in Bilateria für sensorische und neurale
Funktionen von Bedeutung sind (Jacobs et al., 2007).
Die relative Lage des Gehirns sowie die der anderen Organe und Gewebe wird als
anatomischer Bauplan bezeichnet. Er erstreckt sich entlang der Körperachsen, welche
embryonal festgelegt werden. Wirbeltiere sind durch eine anteroposteriore Achse vom
Kopf zum Schwanz sowie durch eine dorsoventrale Achse vom Rücken zum Bauch
charakterisiert. Der Mund kommt dabei definitionsgemäß auf der ventralen Seite zu
liegen. Das Gehirn befindet sich anterior, woraufhin posterior das Rückenmark und die
segmentierte Wirbelsäule folgt. Zusätzlich zeigen Wirbeltiere eine Links-Rechts-
Asymmetrie, welche durch die Anordnung der inneren Organe deutlich wird. Die
Festlegung der Körperachsen beginnt mit der Befruchtung und setzt sich während
Gastrulation, Neurulation und Organogenese fort (Gilbert, 2006; Wolpert et al., 2007).
Im Folgenden sollen die Prozesse von Befruchtung, Gastrulation und Neurulation für
den in vorliegender Arbeit verwendeten Modellorganismus Xenopus laevis näher
betrachtet werden.
I.1 Xenopus laevis als embryologischer Modellorganismus Der Afrikanische Krallenfrosch Xenopus laevis (im Folgenden Xenopus genannt),
welcher in Süd- und Zentralafrika endemisch ist, stellt einen klassischen
Modellorganismus der Entwicklungsbiologie dar. Dieser wurde während und nach dem
zweiten Weltkrieg vermehrt in entwicklungsbiologischen Laboren Europas und der USA
eingeführt, nachdem zuvor unterschiedliche Urodelenarten verwendet worden waren.
Durch die komparative endokrinologische Forschung von Lacelot Hogben konnte
gezeigt werden, dass die Injektion des Urins schwangerer Frauen in den dorsalen
Lymphsack von Xenopus-Weibchen die Ovulation dieser stimulieren kann. Somit war
der erste Schwangerschaftstest beschrieben. Durch die kommerzielle Präparation und
Injektion gonadotroper Hormone konnte auch der bislang saisonale Rhythmus der
embryologischen Forschung an Amphibien überwunden werden. Durch den „Normal
Einleitung
2
table of Xenopus laevis (Daudin)“ von Pieter Nieuwkoop und Job Faber wurde
zusätzlich ein Standardwerk geschaffen (Nieuwkoop und Faber, 1994), welches die
Normalentwicklung detailliert beschreibt und Xenopus zu einem effektiven „Werkzeug“
in der Embryologie machte.
Heutzutage zählen der für Amphibien kurze Lebenszyklus, die Resistenz gegenüber
Krankheiten sowie insbesondere die hohe Zahl und Größe der Eier zu den
Hauptgründen für die Beliebtheit von Xenopus als Modellorganismus. Eine große
Bandbreite mikrochirurgischer Eingriffe wie Transplantationen, Ablationen oder die
Kultivierung separierter Gewebe sind etabliert. Molekularbiologisch ist durch die
Injektion von antisinn-Morpholino-Oligomeren (MO), DNA-Konstrukten und
synthetischer mRNA eine Vielzahl von Manipulationen sowie deren detaillierte Analyse
möglich (Gurdon und Hopwood, 2000). Insbesondere aber können bereits im Vier-Zell-
Stadium die drei Hauptkörperachsen identifiziert werden.
I.2 Befruchtung und erste Zellteilungen Bereits die unbefruchtete Eizelle weist eine Polarität entlang der animalvegetalen Achse
auf. Diese ist durch einen pigmentierten und dadurch dunkleren animalen Pol, welcher
den Nukleus und maternale mRNAs enthält sowie durch den dotterreichen vegetalen
Pol gekennzeichnet. Der animale Pol entspricht dabei der späteren anterioren Region
des Embryos. Spermienrezeptoren befinden sich lediglich auf der animalen Hemisphäre
der Eizelle (Gerhart et al., 1989). Durch das Eindringen eines Spermiums hebt sich die
Vitellinmembran als Befruchtungsmembran von der Eizelle ab. Der Spermieneintritt legt
gleichzeitig die zukünftige ventrale Seite des Embryos fest (Gerhart et al., 1989) und
etabliert somit die dorsoventrale Achse. Durch die vom Spermium eingebrachte
Zentriole werden die vegetalen Mikrotubuli zu parallelen Strängen umgeordnet. Dies
resultiert schließlich in der kortikalen Rotation, wobei das kortikale Cytoplasma um 30°
zum Spermieneintrittspunkt rotiert.
Die folgenden ersten Zellteilungen sind radial symmetrisch und verlaufen ohne
Zellwachstum. Bereits während der ersten Zellteilung wird in der animalen Hälfte ein
kleiner, interzellulärer Hohlraum gebildet, welcher sich vergrößert und in der Blastula
das Blastcoel bildet (Kalt, 1971). Dieser Hohlraum isoliert zum einen vegetale von
animalen Zellen in der Blastula und schafft zum anderen den Raum für Zellmigration
während der Gastrulation (Gilbert, 2006; Wolpert et al., 2007).
Einleitung
3
Während in den frühen Teilungsstadien nur sehr wenige Gene transkribiert werden,
findet in den späten Blastulastadien eine Demethylierung von Promotoren statt
(Stancheva et al., 2002). Die daraus resultierende Aktivierung des Genoms
kennzeichnet den Mittblastula-Übergang. Des Weiteren erlangen die Zellen die
Fähigkeit, ihre Form und Lage innerhalb des Embryos zu verändern.
I.3 Anlage der Keimblätter und Etablierung der Körperachsen Bereits durch den Spermieneintritt und die anschließende kortikale Rotation findet zum
einen eine Translokation von vegetal eingelagertem Dishevelled-Protein (Dvl) nach
dorsal statt, zum anderen kann Dvl zusammen mit Glykogen-Sythase-Kinase-3
Bindeprotein (GBP) aktiv auf den sich ausrichtenden Mikrotubuli durch Kinesine
transportiert werden. Zusätzlich wird maternales Wnt5a und Wnt11 bevorzugt dorsal
translatiert. Diese Liganden des Frizzled-Rezeptors aktivieren den kanonischen Wnt-
Signalweg, welcher zur Phosphorylierung von Dvl führt (Wolpert et al., 2007).
Phosphoryliertes Dvl unterbindet den Abbau von Ctnnb1 durch die Glykogen-Synthase-
Kinase-3 (GSK3). Dieser ubiquitäre Transkriptionsfaktor wird somit dorsal angereichert,
während er ventral abgebaut wird. Durch stabilisiertes Ctnnb1 erfolgt dorsal eine
Aktivierung von Zielgenen. Die darauf folgende Markergenexpression definiert ein
dorsales Zentrum - das Nieuwkoop-Zentrum - und legt somit die dorsoventrale Achse
fest.
Zwei weitere maternale Faktoren, welche entscheidenden Einfluss auf die frühe
Musterbildung haben, sind das Morphogen „growth differentiation factor 1“ (Gdf1) sowie
der T-Box Transkriptionsfaktor Vegt-Protein (Vegt). Über eine Induktion von Nodal
spezifizieren diese endodermales Gewebe. Gleichzeitig wird durch stabilisiertes Ctnnb1
auf der prospektiven dorsalen Seite ebenfalls Nodal induziert, wodurch ein Gradient von
dorsal nach ventral entsteht, welcher das darüber liegende Mesoderm spezifiziert. Die
animal gelegenen Zellen des Ektoderms werden aufgrund der beschriebenen
räumlichen Isolierung durch das Blastocoel vor einer Induktion geschützt.
Einleitung
4
I.4 Gastrulation und Neuordnung der Keimblätter Die Faktoren des Nieuwkoop-Zentrums sind entscheidend für die Ausbildung eines
zweiten Signalzentrums - dem Spemann-Mangold-Organisator - und für die Expression
wichtiger Gene wie goosecoid (gsc), cerberus 1 (cer1) und frizzled-related protein (frzb).
Der Spemann-Mangold-Organisator ist gleichzeitig Ausgangspunkt der Gastrulation, bei
welcher eine Neuordnung der drei Keimblätter Meso-, Endo- und Ektoderm erfolgt.
Die Gastrulation beginnt mit der Bildung der dorsalen Urmundlippe gegenüber dem
Spermieneintrittspunkt. Durch Ausbildung einer Flaschenhalsstruktur bilden die ersten
invaginierenden Zellen den Startpunkt für das Einwandern meso- und endodermaler
Zellen. Nachfolgend wandern immer mehr Zellen auch lateral und ventral ein, so dass
sich ein Blastoporusring ausbildet. Abhängig vom Entwicklungsgrad sekretiert der
Spemann-Mangold-Organisator eine Reihe von Inhibitoren, wodurch Kopf und Rumpf
induziert werden (Mangold, 1933). Der Kopforganisator exprimiert die Wnt-Inhibitoren
cer1, frzb und dickkopf, wodurch im neuralen Ektoderm die Ausbildung anteriorer
Kopfstrukturen eingeleitet wird. Die vom Rumpforganisator exprimierten BMP-
Inhibitoren noggin, chordin und follistatin verhindern die Induktion von Epidermis.
Dadurch entsteht neurales Ektoderm und dorsales Mesoderm. Bereits eingewanderte
Zellen bewegen sich entlang des Blastocoeldachs und elongieren durch konvergente
Extensionsbewegungen entlang der mediolateralen Achse in craniale Richtung (Keller
und Jansa, 1992; Rozario et al., 2009). Dadurch wird schließlich das Blastocoel
verdrängt und es bildet sich ein neuer Hohlraum - das Archenteron. Währenddessen
umschließt das außen liegende Ektoderm den Embryo mittels Epibolie.
Am Ende der Gastrulation ist das endodermale Gewebe vollständig eingewandert und
der Blastoporus hat sich geschlossen. Das Ektoderm umschließt den Embryo und das
Mesoderm ist zwischen die beiden anderen Keimblätter gewandert (Gilbert, 2006).
Bereits während der Gastrulation wird durch Gradienten verschiedener Morphogene
sowohl die anteroposteriore Musterbildung (durch FGF, Retinsäure und sekretierte
Signalproteine des Wnt-Signalwegs) als auch die dorsoventrale Polarität (durch BMPs
und Komponenten des Hedgehog-Signalwegs) festgelegt. Die regionalen Identitäten
werden durch transkriptionelles Feedback stabilisiert. Durch Festlegung dieser beiden
Achsen ist somit automatisch auch eine morphologische Links-Rechts-Achse definiert
(Gilbert, 2006).
Einleitung
5
I.5 Zelluläre Grundlagen morphologischer Veränderungen während der Neurulation
Die Neurulation beschreibt die aufeinander folgenden Prozesse von neuraler Induktion,
Ausbildung der Neuralplatte, Aufwölbung der Neuralfalten und Neuralrohrschluss (Colas
und Schoenwolf, 2001). Als initialer Schritt wird dabei die durch Ctnnb1 induzierte
Expression der BMP-Inhibitoren chordin und noggin kurz nach dem Mittblastula-
Übergang im BCNE („blastula chordin noggin expression center“) angesehen. Durch
diese wird ein epidermales Zellschicksal inhibiert und somit Neuroektoderm induziert
(De Robertis und Kuroda, 2004). Die darauf folgende Elongation neuroektodermaler
Zellen in apicobasaler Richtung führt zur Bildung eines Säulenepithels, der neuralen
Plakode, welche sich deutlich von flachen, präepidermalen Zellen unterscheidet
(Gilbert, 2006).
Im Xenopus-Embryo findet sich dabei der besondere Zustand, dass die Neuralplatte
eine bilaminare Struktur mit einer superfiziellen, apicobasal polarisierten und einer
tiefen, nicht-polaren Schicht ist (Colas und Schoenwolf, 2001; Sabherwal et al., 2009).
Somit wird während der Neurulation aus einem kurzen und breiten, zweischichtigen
Neuroektoderm das lange und schmale, einschichtige Neuralrohr gebildet (Edlund et
al., 2013). Über ein induktives Sonic-hedgehog (Shh)-Signal aus dem Notochord wird
die prospektive Bodenplatte des Neuralrohrs spezifiziert. Die medialen superfiziellen
Zellen bilden durch apikale Konstriktion und basale Dilatation einen sogenannten
Angelpunkt aus, welcher die Bildung einer medialen Furche initiiert (Colas und
Schoenwolf, 2001). Gleichzeitig wölben sich die Neuralfalten durch apicobasale
Elongation von lateralen Zellen der tiefen Schicht auf (Burnside, 1973; Colas und
Schoenwolf, 2001; Karfunkel, 1971). Wie diese Zellelongation zustande kommt, ist noch
nicht genau beschrieben. Allerdings beruhen morphologische Veränderungen von
Zellen auf der Regulation des Cytoskeletts.
Die Rolle des Aktin-Cytoskeletts bei der Neurulation wurde bereits detailliert
beschrieben (Haigo et al., 2003; Hildebrand, 2005; Kinoshita et al., 2008), während dem
Mikrotubuli-Cytoskelett noch keine eindeutige Funktion zugeschrieben werden konnte
(Suzuki et al., 2010). Aufschlussreich war die Entdeckung von parallel zur
Elongationsachse angeordneten Mikrotubuli in Neuralplattenzellen des Salamanders
(Burnside, 1973). Daraufhin wurden drei mögliche Prozesse vorgeschlagen wie
Mikrotubuli zur Zellelongation beitragen können. So ist es zum einen möglich, dass
Einleitung
6
Mikrotubuli verlängert werden und dadurch apikal und basal gegen die Zelle drücken,
was zur Elongation dieser führt. Als zweite Möglichkeit wurde vorgeschlagen, dass sich
Mikrotubuli aktiv aneinander entlang bewegen und dadurch die Kraft zur Zellelongation
erzeugen. Die dritte Hypothese geht von einer nach basal gerichteten
Cytoplasmaströmung entlang der Mikrotubuli aus (Burnside, 1973). Es ist daher
anzunehmen, dass die Zellelongation auch in Xenopus durch die parallele Anordnung
von Mikrotubuli entlang der apicobasalen Achse der Zelle bewirkt wird und in der
Aufwölbung der Neuralfalten resultiert.
Bereits mit der Formierung der Neuralfalten beginnen Neuralleistenzellen von der
Neuralplatte und der umgebenden Epidermis zu segregieren (Nieuwkoop und Faber,
1994). Diese Zellen wandern aus der prospektiven dorsalen Region des Neuralrohrs
aus, migrieren zu spezifischen Regionen des Embryos und bilden dort bedeutende
Strukturen, wie Gesichtsknorpel, Melanozyten und das periphere Nervensystem.
Im weiteren Verlauf der Neurulation zeigen die Zellen der tiefen Neuralplattenschicht
eine zur Mittellinie gerichtete Migration und konvergente Extension. Dies bewirkt eine
mediolaterale Verschmälerung bei gleichzeitiger rostrocaudaler Verlängerung der
Neuralplatte. Ein Prozess welcher ebenfalls ein polarisiertes Mikrotubuli-Cytoskelett
erfordert (Davidson und Keller, 1999; Keller et al., 1992). Zusätzlich dazu findet eine
sogenannte orientierte Teilung von Zellen der superfiziellen Schicht statt. Das bedeutet,
dass ein Teil aller Teilungsebenen so orientiert ist, dass Tochterzellen in rostrocaudaler
Ebene plaziert werden. Dies trägt zu einer weiteren Verlängerung der Neuralplatte bei
(Sausedo et al., 1997). Zum Kontakt der beiden Neuralfalten kommt es schließlich
durch die mediale Bewegung der aufgewölbten Neuralfalten, die mediale konvergente
Extension sowie die apikale Konstriktion superfizieller Zellen (Wallingford und Harland,
2002). Zusätzlich wird dies durch eine mediale Migration der tiefen Zellschicht des
nicht-neuralen Ektoderms unterstützt (Morita et al., 2012). Mit dem Neuralrohrschluss
interkalieren die tiefen, nicht-polaren Zellen radial in die superfizielle Schicht. Auch
radiale Interkalation basiert wiederum auf polarisierten Mikrotubuli (Werner et al., 2014).
Durch die Interkalation bildet sich schließlich ein pseudostratifiziertes, einschichtiges
Neuralrohrepithel (Edlund et al., 2013), worüber sich die Epidermis schließt (Colas und
Schoenwolf, 2001).
Durch die komplexen morphologischen Umgestaltungen während der Neurulation ist die
Mittellinie des zentralen Nervensystems entstanden. Die Dachplatte repräsentiert dabei
die dorsale Mittellinie, während die Bodenplatte die ventrale Mittellinie darstellt. Die
Einleitung
7
dorsoventrale Musterbildung im Neuralrohr wird von diesen beiden Signalzentren
festgelegt. Von besonderer Bedeutung ist dabei die Dachplatte, welche sich während
der Neurulation aus den lateralen Aspekten der Neuralplatte gebildet hat. Diese dorsale
Mittellinienstruktur sekretiert BMPs sowie Wnts und spezifiziert damit die verschiedenen
Klassen dorsaler Neuronen (O’Leary et al., 2007). Eine fehlerhafte Bildung der
Dachplatte im Vorderhirn führt zu gestörter Mittellinieninduktion und resultiert in
schweren Fehlbildungen wie der Holoprosencephalie (HPE, Cheng et al., 2006; Roy et
al., 2014). Die HPE ist die häufigste kongenitale Fehlbildung des sich entwickelnden
humanen Hirns und durch eine fehlende Unterteilung des Vorderhirns in linke und
rechte Hemisphäre charakterisiert (Muenke und Beachy, 2001). Begleitet wird die HPE
durch ein breites Spektrum an Fehlbildungen des Hirns, wie zum Beispiel einem
Hydrocephalus, und des Gesichts, wie zum Beispiel Lippen-Kiefer-Gaumen-Spalten.
Als mögliche Ursachen kommen zahlreiche Genmutationen sowie Umwelteinflüsse in
Betracht (Dupé et al., 2011).
I.6 Musterbildung im Hirn Bereits während des Neuralrohrschlusses kann in Xenopus-Embryonen eine
Segregation des anterioren Neuralrohrs in die drei primären Vesikel Pros-, Mes- und
Rhombencephalon erkannt werden (Gilbert, 2006; Nieuwkoop und Faber, 1994). In der
weiteren Entwicklung unterteilt sich das Prosencephalon in das anterior gelegene
Telencephalon, welches die olfaktorischen Bulben bildet und das Diencephalon, aus
welchem sich die optischen Vesikel ausstülpen. Weiterhin entwickelt das Diencephalon
die thalamischen und hypothalamischen Regionen. Das Mesencephalon unterliegt
keiner weiteren Teilung, entwickelt aber mit seinem Lumen den Aquaeductus
mesencephali. Im Rhombencephalon wird ein Segmentierungsmuster, die sogenannten
Rhombomeren, ausgebildet (Gilbert, 2006).
Einleitung
8
Abbildung 1 Musterbildung im Hirn
Dorsale Aufsicht auf einen Embryo im Stadium 46,
rostral ist oben. Durch den transparenten Schädel ist
das Hirn als Ganzes sowie die einzelnen Hirnregionen
zu erkennen (weiß umrandet). Das Ventrikelsystem ist
durch die Injektion eines fluoreszenten Farbstoffes (rot)
sichtbar gemacht.
Mit zunehmender Differenzierung des Hirns übernehmen auch neu gebildete Strukturen
die Induktion regionaler Identitäten. Im sich entwickelnden Kortex des Vorderhirns hat
beispielsweise der Plexus choroideus (PC) eine zentrale Position an der Dachplatte und
wird durch den kortikalen Saum („cortical hem“) flankiert (Roy et al., 2014). Beide
stellen durch die Sekretion von BMPs und Wnts wichtige regionale Signalzentren für die
dorsoventrale Musterbildung dar (O’Leary et al., 2007).
In Xenopus wird der PC des Vorderhirns an der Grenze zwischen Tel- und
Diencephalon um das Stadium 43 differenziert und beginnt kurz darauf in den Ventrikel
zu invaginieren (Nieuwkoop und Faber, 1994). Neben der Expression von BMPs sind
die ependymalen Zellen des PC Hauptproduzent der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF)
(Barkho und Monuki, 2015), deren Sekretion essentiell für die Vergrößerung der
angelegten Hirnbläschen ist. Die CSF stellt den Hauptanteil der extrazellulären
Flüssigkeit des zentralen Nervensystems dar. Diese klare Flüssigkeit mit hohem Ionen-
und niedrigem Proteingehalt füllt das komplette Ventrikelsystem, den Spinalkanal und
den subarachnoidalen Raum aus. Sie dient der mechanischen Pufferung des Hirns,
transportiert Signalmoleküle und eliminiert Abfallprodukte des Ependyms (Brown et al.,
2004). Dafür wird die CSF aktiv durch das Ventrikelsystem bis in den
Subarachnoidalraum transportiert, wo eine Aufnahme in das venöse System erfolgt
(Kapoor et al., 2008). Ist dieser Prozess gestört, entstehen durch aufgestaute CSF eine
Ventrikelerweiterung und ein erhöhter intrakranieller Druck, was als Hydrocephalus
bezeichnet wird. Dabei kann sowohl die Überproduktion der CSF, eine gestörte
Resorption als auch eine Obstruktion des Ventrikelsystems ursächlich sein (Del Bigio,
Einleitung
9
2010). Auch Defekte in der Bildung des PC werden mit einem kongenitalen
Hydrocephalus in Verbindung gebracht (Lee et al., 2012).
Für den aktiven Transport der CSF sind motile Cilien auf ependymalen Zellen
verantwortlich. Cilien sind zelluläre Fortsätze welche auf fast allen Zellen bei
Säugetieren vorkommen und in sensorische und motile Cilien aufgeteilt werden.
Das von der Zellmembran umgebene Axonem (das ciliäre Gerüst) besteht aus neun
peripheren Mikrotubuli-Dubletts welche um ein Zentrum aus keinem (9+0 Anordnung),
zwei (9+2) oder vier (9+4) einzelnen Mikrotubuli angeordnet sind (Feistel und Blum,
2006). Sensorische oder primäre Cilien spielen eine wichtige Rolle in der Transduktion
chemischer oder mechanischer Stimuli. Ebenso halten sie die Zelle in einem
differenzierten Zustand und verhindern Zellteilung. Für den Wiedereintritt der Zelle in
den Zellzyklus wird das primäre Cilium abgebaut und nach der erfolgten Zellteilung auf
beiden Tochterzellen wieder ausgebildet (Satir et al., 2010). Primäre Cilien besitzen
keine axonemalen Dyneine, weshalb sie unbeweglich sind. Motile Cilien sind auf allen
Geweben zu finden, auf denen Flüssigkeitsbewegung eine wichtige physiologische
Rolle spielt. Sie sind im Vergleich zu primären Cilien deutlich länger, besitzen meist ein
zentrales Paar Mikrotubuli (9+2) sowie äußere Dyneinarme (Yu et al., 2008). Eine
ATPase-Aktivität liefert die Energie für die gleitende Bewegung der Mikrotubuli
aneinander, was im Cilienschlag resultiert (Ibañez-Tallon et al., 2003). Mutationen,
welche zu immotilen Cilien führen, resultieren ebenfalls im Krankheitsbild des
Hydrocephalus. Dabei können Strukturproteine wie SPAG6 betroffen sein, welche für
die Stabilität des axonemalen Zentralapparates und damit auch für die Cilienmotilität
von Bedeutung sind (Sapiro et al., 2002). Aber auch Mutationen in axonemalen
Motorproteinen wie DNAH5 führten zu einer ciliären Immotilität und resultieren in einem
Hydrocephalus (Ibañez-Tallon et al., 2002).
Die Ausdifferenzierung einer Cilien-tragenden Zelle wird auf der regulatorischen Ebene
von Transkriptionsfaktoren der Regulatory Factor X (RFX)- und Winged-Helix
(Forkhead, Fox)-Familien gesteuert. FOXJ1, ein Transkriptionsfaktor mit Winged-Helix
Domäne, gilt dabei als übergeordneter Regulator für Gene, welche die Ausbildung
motiler Cilien induzieren. Die Expression von Foxj1 ist auf Zellen mit motilen Cilien
beschränkt und Foxj1 Knock-out Mäuse zeigen ausschließlich einen Verlust von motilen
Cilien (Yu et al., 2008).
Einleitung
10
I.7 Zentrale Fragestellung und Zielsetzung der Arbeit Die primäre ciliäre Dyskinesie (PCD) stellt die humane Erkrankung dar, welche aus
ciliärer Dysfunktion resultiert. Die PCD ist charakterisiert durch wiederkehrende
respiratorische Infektionen, aleatorischer Links-Rechts-Asymmetrie und Unfruchtbarkeit
(Ibañez-Tallon et al., 2002). Auch wurde bei einigen Patienten ein PCD-assoziierter
Hydrocephalus beschrieben (De Santi et al., 1990; Greenstone et al., 1984). Das
Mausmodell zeigte klar, dass ciliäre Immotilität in den allermeisten Fällen von einem
Hydrocephalus begleitet wird (Banizs et al., 2005; Chen et al., 1998; Ibañez-Tallon et
al., 2002; Sapiro et al., 2002; Vogel et al., 2012). Durch welche Mechanismen dieser
allerdings genau entsteht, ist nicht klar.
Auch weitere Fehlbildungen während der Hirnentwicklung - wie die HPE - werden in
vielen Fällen von einem Hydrocephalus begleitet. (Dupé et al., 2011; Levey et al.,
2010). Bei der HPE kommt es während des Neuralrohrschlusses zu einer fehlenden
Mittellinieninduktion welche zu massiven Vorderhirndefekten, wie zum Beispiel einem
fehlenden PC, führt. Ob dabei die Vorderhirndefekte oder der fehlende PC ursächlich
für den resultierenden Hydrocephalus sind, ist ebenfalls nicht klar. Zusätzlich wird HPE
unter anderem durch Mutationen im SHH-Signalweg verursacht - einem Cilien-
abhängigen Signalweg (Roessler et al., 1996).
Zusammengefasst lassen diese Beobachtungen vermuten, dass ein Hydrocephalus im
Zusammenhang mit immotilen Cilien und morphologischen Fehlbildungen des Hirns
auftritt. Ob der Hydrocephalus dabei ursächlich oder ein begleitendes Krankheitsbild ist,
ist aber weiterhin unklar.
Aus diesen Beobachtungen ergab sich deshalb die zentrale Fragestellung für
vorliegende Arbeit:
Welche pathologischen Ursachen unterliegen der Entstehung eines Hydrocephalus und
in wie weit sind motile Cilien und/oder Cilien-tragende Strukturen beteiligt?
Bisherige Studien ließen vermuten, dass motile Cilien im Hirn von Xenopus existieren
(Mogi et al., 2012). Daher soll als Grundlage die Lokalisation Cilien-tragenden
Strukturen im Hirn von Xenopus und die Ciliogenese in diesen Strukturen bis hin zur
Metamorphose beschrieben werden. Es ist zu klären, zu welchem Zeitpunkt der
Entwicklung und an welcher Stelle Cilien entstehen sowie um welche Art der Cilierung
es sich handelt. Darauf aufbauend ist eine detaillierte Analyse der CSF-Strömung
notwendig.
Einleitung
11
Die Frage nach dem Beitrag gestörter Cilienmotilität zur Entstehung eines
Hydrocephalus soll durch einen gewebespezifischen Funktionsverlust von foxj1, dem
übergeordneten Regulator der Biogenese motiler Cilien, weiter beantwortet werden.
Dieser sollte zum Verlust der Biogenese motiler Cilien führen, wodurch die CSF-
Strömung zu Stillstand kommt.
Darüber hinaus kann aber auch eine Modulation der CSF-Strömung physiologische
Auswirkungen haben. So wird beispielsweise die Schlagfrequenz von Atemwegscilien
bei einer Infektion erhöht (Manzanares et al., 2007). Im Rahmen der Studie von
Manzanares und Kollegen wurde der Hyaluronsäurerezeptor HMMR („hyaluronan-
mediated motility receptor“) identifiziert, ein multifunktionales Protein, welches mit
Ciliogenese und der Regulation von Cilienschlagfrequenz in Zusammenhang gebracht
wird. HMMR assoziiert mit Mikrotubuli („microtubule associated protein“, MAP) und
wurde erstmals von Turley und Kollegen beschrieben (Turley et al., 1987). Ursprünglich
galt HMMR als extrazellulärer Rezeptor für das Glycosaminoglycan Hyaluronsäure (HS)
im Menschen und in der Maus. Eine Funktion welche kontrovers diskutiert wird
(Hofmann et al., 1998). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass HS über HMMR die
Beweglichkeit und Migration mesenchymaler Zellen beeinflusst (Hall et al., 1995).
Zusätzlich können Abbauprodukte der HS über HMMR die Schlagfrequenz von Cilien
der Atemwegsepithelien stimulieren (Manzanares et al., 2007). Der Funktionsverlust
von HMMR beeinträchtigt die Ciliogenese in humanen Atemwegsepithelzellen (Huang
et al., 2010). Die Hmmr Knock-out Maus zeigt zudem Fertilitätsdefekte (Tolg et al.,
2003), was an gestörter Cilienmotilität liegen könnte.
Das Xenopus-Ortholog von HMMR wurde als MAP150 in einem Screen nach MAPs
während der Spindelassemblierung identifiziert (Groen et al., 2004). Eine
Genexpressionsanalyse zeigte, dass hmmr in Xenopus während der gesamten
Entwicklung neural und in späteren Stadien im Hirn exprimiert ist (Casini et al., 2010).
Aus diesem Grund scheint hmmr besonders geeignet, um Aufschluss über Ciliogenese
und Regulation von Cilienmotilität während der Hirnmorphogenese in Xenopus zu
erhalten. Dafür wird zunächst die Expression von hmmr im Hirn von Xenopus verifiziert.
Anschließend soll analysiert werden, ob hmmr über eine Beeinflussung von
Cilienmotilität beziehungsweise -schlagfrequenz die Strömung der CSF verändert und
ob dies eine Rolle bei der Morphogenese des Hirns spielt. Sollte der Funktionsverlust
ebenfalls in einem Hydrocephalus resultieren, können die Cilienschlagfrequenz und die
aus dem Funktionsverlust folgenden Fehlbildungen mit den Ergebnissen des foxj1
Einleitung
12
Funktionsverlusts verglichen werden. Aus diesen Beobachtungen sollen Rückschlüsse
auf die pathologischen Ursachen gezogen werden, welche zur Entstehung eines
Hydrocephalus führen.
Ergebnisse
13
II Ergebnisse Bisherige Untersuchungen zur Hirnentwicklung von Xenopus laevis (im Folgenden
Xenopus genannt) geben keinen genauen Überblick über die Biogenese und
Lokalisation motiler Cilien im sich entwickelnden Hirn. Als Grundlage für manipulative
Experimente wurde deshalb mittels in situ Hybridisierung die Expression des
übergeordneten Regulators der Biogenese motiler Cilien, foxj1, analysiert. Zusammen
mit rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen gab dies einen Überblick über die
Lokalisation motiler Cilien.
II.1 Xenopus-Embryonen exprimieren foxj1 in abgrenzbaren Regionen des sich entwickelnden zentralen Nervensystems
Bereits kurz nach der Gastrulation war foxj1 in der Mittellinie der Neuralplatte exprimiert
(Abb. 2A). Diese Expression blieb auch während und nach dem Neuralrohrschluss in
der Bodenplatte des Deuteroencephalons, dem Teil des zentralen Nervensystems mit
direktem Kontakt zum Notochord, bestehen (Abb. 2B, C). Im Archencephalon, dem
Vorläufer des Vorderhirns, war foxj1 nicht exprimiert (Abb. 2B, C).
Weiterhin wurden während der gesamten Embryonalentwicklung Transkripte von foxj1
in der Bodenplatte des Neuralrohrs und im späteren Rückenmark (Abb. 2D-G, Pfeile in
D‘-F‘) mit einer deutlich stärkeren Expression im caudalsten Teil (ausgefüllte Pfeile in
Abb. 2D-F) detektiert. Dieser Teil des Rückenmarks entspricht der Ampulla terminalis,
einer Cilien-tragenden, vesikulären Erweiterung des Zentralkanals des Rückenmarks
(Gaete et al., 2012).
Während der Hirnbläschenerweiterung und Krümmung des Hirns (Stadium 25) wurde
eine bilaterale foxj1-Domäne in der kleinen Kurvatur der Hirnkrümmung sichtbar
(ausgefüllte Pfeile in Abb. 2D‘‘). Diese Domäne stellte die rostrale Fortführung der foxj1-
Expression in der Bodenplatte des Rhombencephalons dar und blieb auch im Stadium
36 bestehen (ausgefüllte Pfeile in Abb. 2E‘‘, F‘‘). In Hirnexplantaten im Stadium 36
konnte durch die überlagernde Expression von foxj1 (Abb. 2G) und sonic hedgehog
(shh) (Abb. 2H) die foxj1-positive Region im zukünftigen Diencephalon als Zona limitans
intrathalamica (ZLI; Domínguez et al., 2010) identifiziert werden, welche in der weiteren
Ergebnisse
14
Morphogenese ein bedeutendes Signalzentrum für die Diencephalon-Entwicklung
darstellt (Mattes et al., 2012).
Eine zweite auffallende Expressionsdomäne von foxj1 befand sich im
subkommissuralen Organ (SKO) an der dorsalen Grenze zwischen Di- und
Mesencephalon. Diese Region stellt den Eingang zum Aquaeductus mesencephali
(AM) dar (Wullimann et al., 2005). Eine erste Expression in dieser Domäne wurde im
Stadium 31 sichtbar (Abb. 2E, Sternchen in E‘‘) und blieb als runde Expressionsdomäne
während der gesamten Prämetamorphose bestehen (Sternchen in Abb. 2F‘‘, G, Pfeile
in Abb. 3A, Abb. 4, 5A, 6A). Ungefähr zur selben Zeit in der Entwicklung (Stadium 31)
waren erste foxj1-Signale in der ependymalen Zellschicht am Dach des
Rhombencephalons zu finden (ausgefüllter Pfeil in Abb. 2E‘). Diese Expression
verstärkte sich während der weiteren Entwicklung (ausgefüllter Pfeil in Abb. 2F‘) und
blieb auch im einschichtigen Ependym von Embryonen im Stadium 53, unterhalb des
voll entwickelten Plexus choroideus (PC) des vierten Ventrikels, bestehen (Abb. 5A‘‘‘,
A‘‘‘‘, Abb. 6A‘‘‘, A‘‘‘‘).
Ergebnisse
15
Abbildung 2 Xenopus-Embryonen exprimieren foxj1 in abgrenzbaren Regionen des sich entwickelnden zentralen Nervensystems In situ Hybridisierung ganzer Embryonen und explantierter Hirne im angegebenen Stadium (St.).
(A) Expression in einer frühen Neurula (dorsale (d) Ansicht). (B, C) Expression in der späten Neurula in
Epidermis und Bodenplatte des Neuralrohrs, dorsale (B) und frontale (C) Ansicht. (D) Färbung in der
Bodenplatte im St. 25. Die Ampulla terminalis weist ein stärkeres Expressionsniveau auf (ausgefüllter
Pfeil). (D‘, D‘‘) Transversalschnitte wie in (D) angedeutet, die Färbung in der ventralen (v) Mittellinie (Pfeil,
D‘) und in der Zona limitans intrathalamica (ZLI, ausgefüllte Pfeile, D‘‘) werden deutlich.
(E, F) Expression im St. 31 (E) und St. 36 (F) in den Nephrostomen, im Rückenmark und der Ampulla
terminalis (ausgefüllte Pfeile). (E‘, E‘‘, F‘, F‘‘) Histologische Schnitte wie in (E, F) angedeutet,
verdeutlichen die Expression im Dach des Rhombencephalons (ausgefüllte Pfeile in E‘, F‘), in der
ventralen Mittellinie (Pfeile in E‘, F‘), dem subkommissuralen Organ (SKO, Stern in E‘‘, F‘‘, G) und der ZLI
(ausgefüllte Pfeile in E‘‘, F‘‘). (G, H) Hirnexplantate im St. 36 nach in situ Hybridisierung mit einer antisinn-
Probe gegen foxj1 (G) und sonic hedgehog (shh) (H) in Seitenansicht. Die Kolokalisierung der mRNA
Expressionen in der ventralen Mittellinie und der ZLI wird deutlich.
A = anterior; Arch = Archencephalon; Deu = Deuteroencephalon; l = links, Mes = Mesencephalon; p =
posterior; Pros = Prosencephalon; Rhomb = Rhombencephalon; r = rechts
Ergebnisse
16
II.2 Die Expression von foxj1 korreliert mit der Elongation von Monocilien und dem Auftreten von Multicilien
Um zu untersuchen, ob die Expressionsorte von foxj1 auch mit der Biogenese von
Cilien korrelieren, wurden Hirnexplantate parallel im Rasterelektronenmikroskop (REM)
untersucht. Die erste Explantation eines Hirns gelang im Stadium 35. Aufgrund des
hohen Dottergehalts war eine Explantation in früheren Stadien nicht möglich. Auch im
Stadium 35 war foxj1 weiterhin in der Bodenplatte, der ZLI und dem SKO exprimiert
(Abb. 3A). Auf REM-Aufnahmen sagittal eröffneter Hirnexplantate war die
morphologische Abgrenzung von Pros-, Mes- und Rhombencephalon sichtbar (Abb.
3B). Das Prosencephalon, als rostralster Teil, war stark nach unten gebogen und das
gesamte Hirn maß 1 mm in der Länge (gemessen als gerade Linie vom rostralsten
Punkt des Prosencephalons bis zum Übergang des Rhombencephalons zum
Rückenmark). In der präoptischen Region konnte eine Furche ausgemacht werden,
welche die spätere Grenze zwischen Tel- und Diencephalon sowie den Sitz der
Epiphyse am Dach des posterioren Prosencephalons markierte (Abb. 3B). Die spätere
ZLI wurde als V-förmige Struktur im posterioren Prosencephalon deutlich (Abb. 3B).
Auch zeigte sich bereits die metamere Organisation des Rhombencephalons, da die
Grenzen zwischen den Rhombomeren durch vertikale Einkerbungen hervortraten (Abb.
3B).
Die Zellen des Ependyms im Stadium 35 trugen vorwiegend kurze Monocilien (1-2 µm,
Abb. 3C, D, ausgefüllte Pfeile in Abb. 3C‘, D‘). Zusätzlich konnten einzelne Zellen
ausgemacht werden, welche entweder ein elongiertes Monocilium (4-6 µm, Abb. 3C, D,
Pfeil in Abb. 3C‘‘, D‘‘, E) oder mehrere Cilien trugen (roter Pfeil in Abb. 3E). Die
Lokalisierung dieser Cilien entsprach dabei dem Expressionsmuster von foxj1, da
elongierte Monocilien auf Zellen der ZLI (Abb. 3C) und der ventralen Mittellinie des
Rhombencephalons auftraten (Abb. 3D). Das Rhombencephalondach wurde ebenfalls
von Zellen gebildet, welche elongierte Monocilien und vereinzelt auch bereits mehrere
Cilien trugen (Abb. 3E).
Ergebnisse
17
Abbildung 3 Die Expression von foxj1 korreliert mit der Elongation von Monocilien und dem Auftreten von Multicilien In situ Hybridisierung und rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen explantierter Hirne im
Stadium 35. (A) Explantat in dorsaler (d) und ventraler (v) Ansicht. Starke foxj1-Expression in der
ventralen Mittellinie und im subkommissuralen Organ (SKO, Pfeil). (B) REM-Aufnahme eines sagittal
eröffneten Hirnexplantats mit Aufsicht auf die Ventrikeloberfläche. Die Zona limitans intrathalamica (ZLI)
ist durch eine orange, gestrichelte Linie herausgehoben und die Grenzen der Hirnregionen werden durch
weiße, gestrichelte Linien verdeutlicht. Maßstab 200 µm. (C) Übersicht und Vergrößerungen zeigen erste
kurze, primäre Cilien auf Zellen in der prosencephalischen Region (ausgefüllter Pfeil in C‘), und elongierte
Monocilien auf Zellen der ZLI (Pfeil in C‘‘). (D) Nahaufnahme des ventralen Teils einer einzelnen
Nachhirn-Rhombomere mit eingezeichneten Grenzen und Mittellinie (Ml). Vergrößerungen zeigen kurze
Cilien auf der Rhombomere (ausgefüllter Pfeil in D‘) und elongierte Cilien in der ventralen Ml (Pfeil in D‘‘).
(E) Nahaufnahme des Rhombencephalon (Rhomb)-Dachs mit elongierten Monocilien (Pfeil) und ersten
Zellen mit mehreren Cilien (roter Pfeil).
A = anterior; E = Epiphyse; l = links; Mes = Mesencephalon; p = posterior; Po = präoptische Region;
Pros = Prosencephalon; r = rechts
Die Hirne im Stadium 40 zeigten eine im Wesentlichen unveränderte Morphologie sowie
foxj1-Expression (Abb. 4A, B). Die Streckung des Hirns hatte begonnen, ein Prozess,
welcher sich bis zum Stadium 43 fortsetzt. Die Länge des Hirns war jedoch vergleichbar
mit der in Stadium 35. Eine Unterteilung in Tel-, Di-, Mes- und Rhombencephalon war
nun leicht auszumachen (Abb. 4A, B). Die primären Cilien in den meisten Hirnregionen
waren weiterhin verhältnismäßig kurz (1-2 µm, Abb. 4C, D, ausgefüllte Pfeile in Abb.
4C‘, D‘), jedoch wurden zunehmend elongierte Monocilien sichtbar, welche eine Länge
von bis zu 9 µm erreichten (Abb. 4C, D, Pfeile in Abb. 4C‘‘, D‘‘). Das Dach des
Ergebnisse
18
Rhombencephalons zeigte Multicilien-tragende Zellen (MCZ) mit Cilien von 4-5 µm
Länge (roter Pfeil in Abb. 4E).
Abbildung 4 Cilierung und Expression von foxj1 im weiteren Verlauf der Hirnmorphogenese In situ Hybridisierung und rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen explantierter Hirne im
Stadium 40. (A) Explantat in dorsaler (d) und ventraler (v) Ansicht. Starke foxj1-Expression in der
ventralen Mittellinie und im subkommissuralen Organ (Pfeil). (B) REM-Aufnahme eines sagittal eröffneten
Hirnexplantats mit Aufsicht auf die Ventrikeloberfläche, die Zona limitans intrathalamica (ZLI) ist durch
eine orange, gestrichelte Linie herausgehoben und die Grenzen der Hirnregionen werden durch weiße,
gestrichelte Linien verdeutlicht. Maßstab 200 µm. (C) Übersicht und Vergrößerungen zeigen kurze,
primäre Cilien auf Zellen im Diencephalon (Di, ausgefüllter Pfeil in C‘), und elongierte Monocilien auf
Zellen der ZLI (Pfeil in C‘‘). (D) Nahaufnahme des ventralen Teils einer einzelnen Nachhirn-Rhombomere
mit eingezeichneten Grenzen und Mittellinie (Ml). Vergrößerungen zeigen kurze Cilien auf der
Rhombomere (ausgefüllter Pfeil in D‘) und elongierte Cilien in der ventralen Ml (Pfeil in D‘‘). (E)
Nahaufnahme des Rhombencephalon (Rhomb)-Dachs mit Multicilien-tragenden Zellen (roter Pfeil).
A = anterior; l = links; Mes = Mesencephalon; p = posterior; Po = präoptische Region; r = rechts; Tel =
Telencephalon
II.3 Zusätzliche Expressionsdomänen von foxj1 markieren weitere Regionen mit elongierten Cilien
Im Stadium 45 war foxj1 in zwei zusätzliche Domänen exprimiert: Eine Domäne direkt
rostral des SKOs im Telencephalon (Pfeil in Abb. 5A) und ein Streifenmuster im
Rhombencephalon (Abb. 5A). Das nun vollständig gestreckte Hirn maß immer noch 1
mm in der Länge und wurde vollständig von der Dura mater umkleidet. Der Ventrikel
Ergebnisse
19
unter dem optischen Tectum hatte sich geweitet und die Invagination des PC im dritten
Ventrikel hatte begonnen (Abb. 5B).
Um die Expression von foxj1 detaillierter mit den Cilierungsmustern korrelieren zu
können, wurden histologische Vibratomschnitte von Hirnen nach in situ Hybridisierung
angefertigt. Auf transversalen Schnitten durch die anteriore Domäne war foxj1 im sich
entwickelnden PC des dritten Ventrikels exprimiert (Abb. 5A‘). Der PC beginnt ab
Stadium 43 zu wachsen und in das Ventrikelsystem zu invaginieren (Nieuwkoop und
Faber, 1994). Dies wurde auf REM-Aufnahmen durch eine Vertiefung des Tel-
/Diencephalondachs deutlich, dessen Oberfläche dicht mit MCZ bedeckt war (Abb. 5C).
Auf Schnitten durch die Di-/Mesencephalongrenze konnte foxj1-Expression sowohl im
SKO als auch in der ZLI ausgemacht werde (Abb. 5A‘‘). REM-Aufnahmen zeigten
elongierte Cilien im SKO, an welchen nicht näher charakterisiertes, extrazelluläres
Material anhaftete (Abb. 5D). Die Zellen des SKOs bilden Glycoproteinen wie SCO-
Spondin, aus welchen sich der Reissner-Faden (RF) aggregiert. Dieser verläuft durch
das gesamte Ventrikelsystem und den Zentralkanal des Rückenmarks (Vio et al., 2008).
Das Material, welches an den Cilien des SKOs anhaftet, könnte deshalb Anzeichen für
die Produktion des RFs in Xenopus sein, welcher ab und zu im Ventrikellumen
identifiziert wurde (nicht gezeigt, vergleiche Abb. 6F). Auf der Ventrikeloberfläche der
ZLI, eine Region welche auf transversalen Schnitten foxj1-Expression zeigte,
lokalisierten elongierte Monocilien, die vergleichbar mit denen auf der ZLI im Stadium
35/40 waren (Abb. 5D).
Sowohl auf Nahaufnahmen der Ventrikeloberfläche von sagittal eröffneten Hirnen (Abb.
5A) als auch auf transversalen Schnitten (Abb. 5A‘‘‘, A‘‘‘‘) wurde ein Streifenmuster auf
der Seitenwand des vierten Ventrikels als metamere Organisation des
Rhombencephalons identifiziert. Während Zellen im Zentrum der Rhombomeren keine
foxj1-Expression zeigten (Rh, Abb. 5A‘‘‘), wurden Transkripte in Zellen der
Rhombomergrenzen gefunden (Rhg, Abb. 5A‘‘‘‘). Dieses Expressionsmuster spiegelte
sich in differenzieller Ciliogenese wider. Die Zellen der Rhombomeren trugen kurze
Monocilien (Abb. 5E und ausgefüllte Pfeile in E‘), wohingegen die foxj1-positiven Zellen
in den Rhombomergrenzen elongierte Monocilien trugen (9-10 µm, Abb. 5E, E‘‘).
Vergleichbar mit dem Dach des dritten Ventrikels, beginnt auch das Dach des vierten
Ventrikels sich ab Stadium 43 zu verdicken und einen hoch vaskularisierten PC zu
bilden (Nieuwkoop und Faber, 1994). Transversale Schnitte durch den PC des vierten
Ventrikels im Stadium 45 zeigten eine starke foxj1-Expression (Abb. 5A‘‘‘, A‘‘‘‘) und
Ergebnisse
20
mittels REM-Aufnahmen konnten Cilienbüschel auf den Zellen des PC im vierten
Ventrikel ausgemacht werden (Abb. 5F, G).
Abbildung 5 Zusätzliche Expressionsdomänen von foxj1 markieren weitere Regionen mit elongierten Cilien In situ Hybridisierung und rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen explantierter Hirne im
Stadium 45. (A) Explantat in dorsaler (d) und ventraler (v) Ansicht. Expression in der ventralen Mittellinie
(Ml), den Rhombomergrenzen, im subkommissuralen Organ (SKO, ausgefüllter Pfeil) und dem Plexus
choroideus (PC, Pfeil). (B) REM-Aufnahme eines sagittal eröffneten Hirnexplantats mit Aufsicht auf die
Ventrikeloberfläche, die Zona limitans intrathalamica (ZLI) ist durch eine orange, gestrichelte Linie
herausgehoben und die Grenzen der Hirnregionen werden durch weiße, gestrichelte Linien verdeutlicht.
Maßstab 200 µm. (A‘-A‘‘‘‘) Histologische Transversalschnitte wie in (A) angedeutet, dorsal ist oben, und
REM-Aufnahmen (C-G) der entsprechenden Regionen, wie in den Schnitten jeweils angedeutet. (C)
Multicilien-tragende Zellen (MCZ) auf dem PC, welcher vom Dach des Diencephalons invaginiert. (D)
Nahaufnahme der ZLI, Vergrößerung zeigt die Cilien-tragende Struktur des SKOs. (E) Nahaufnahme
welche die metamere Organisation des Rhombencephalons (Rhomb) zeigt. Rhombomere (Rh) und rh-
Ergebnisse
21
Grenzen (Rhg) sind durch gestrichelte Linien angedeutet. (E‘) Vergrößerung der Rh-Region, ausgefüllte
Pfeile zeigen auf kurze, primäre Cilien.
(E‘‘) Vergrößerung der Rhg-Region mit Zellen, welche elongierte Cilien tragen. (F, G) Nahaufnahme des
PC im vierten Ventrikel mit MCZ.
A = anterior; Di = Diencephalon; Hy = Hypophyse; l = links; Mes = Mesencephalon; p = posterior; Po =
präoptische Region; r = rechts; Tel = Telencephalon
II.4 Die Expression von foxj1 und Ciliogenese im prämetamorphischen und adulten Hirn von Xenopus
Bis zum Stadium 53 verstärkte sich die foxj1-Expression weiter in allen Epithelien,
welche an den Ventrikel anschließen (Abb. 6A). Die Hirne mit einer Länge von 2 mm
zeigten nun eine deutliche Ausdifferenzierung (Abb. 6B). Parallel zum weiteren
Wachstum und der Ausdifferenzierung des PC, welcher nun tief in das Ventrikellumen
an der Grenze zwischen lateralen und dritten Ventrikel hineinragte, wurde die foxj1-
Färbung im Plexus- und Ventrikelepithel stärker (Abb. 6A‘). Auf REM-Aufnahmen zeigte
sich, dass der stark verzweigte PC mit MCZ bedeckt war (Abb. 6C).
Auf transversalen Schnitten durch die Grenzen zwischen Di- und Mesencephalon zeigte
sich die weiterhin starke Expression von foxj1 im SKO und der ZLI. Zusätzlich fand sich
eine beginnende Expression in der den Ventrikel begrenzenden Schicht der
vollentwickelten Hypophyse (Hy, Abb. 6A‘‘).
Die Expression von foxj1 im SKO und der ZLI führte zur weiteren morphologischen
Entwicklung von Cilien. Die Cilien des SKOs waren elongiert, jedoch konnte nicht
unterschieden werden, ob diese Zellen Mono- oder Multicilien trugen (Abb. 6D).
Sowohl in der ZLI als auch an der Grenze zwischen Di- und Mesencephalon wurden
erste Büschel von Multicilien auf den Zelloberflächen sichtbar (Abb. 6E).
Die Zellen im AM trugen elongierte Monocilien und des Öfteren wurde der RF
beobachtet welcher das Lumen des AM durchspannt (Abb. 6F). Alle ventralen Regionen
des Hirns in Stadium 53 trugen lange Mono- und Multicilien, was besonders in der
ventralen Mittellinie des Rhombencephalons deutlich wurde (Abb. 6G). Auch waren
sowohl die Expression von foxj1 als auch das entsprechende Cilierungsmuster
weiterhin vorhanden (Abb. 6A, A‘‘‘, A‘‘‘‘). Die Rhombomere wurden von kurzen
Monocilien bedeckt, während die Zellen der Rhombomergrenzen deutlich elongierte
Cilien trugen und die sich gesamte Rhombomergrenze verbreitert hatte (Abb. 6H). Der
PC des vierten Ventrikels war bedeckt von MCZ (Abb. 6I).
Ergebnisse
22
Abbildung 6 Die Expression von foxj1 und Ciliogenese im prämetamorphischen Hirn von Xenopus In situ Hybridisierung und rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen explantierter Hirne im
Stadium 53. (A) Explantat in dorsaler (d) und ventraler (v) Ansicht. Expression in der ventralen Mittellinie
(Ml), im subkommissuralen Organ (SKO, ausgefüllter Pfeil), dem Plexus choroideus (PC, Pfeil) und in
ventrikulären Regionen. Kleines Bild in (A) zeigt die Expression in den Rhombomergrenzen (Rhg) nach
Entfernung des pigmentierten Rhombencephalon- (Rhomb) Dachs. (B) REM-Aufnahme eines sagittal
eröffneten Hirnexplantats mit Aufsicht auf die Ventrikeloberfläche, die Zona limitans intrathalamica (ZLI)
ist durch eine orange, gestrichelte Linie herausgehoben und die Grenzen der Hirnregionen werden durch
weiße, gestrichelte Linien verdeutlicht. Maßstab 500 µm. (A‘-A‘‘‘‘) Histologische Transversalschnitte wie in
(A) angedeutet, dorsal ist oben. (C-I) REM-Aufnahmen der entsprechenden Regionen, wie in den
Schnitten (A‘-A‘‘‘‘) jeweils angedeutet. (C) Nahaufnahme des PC im dritten Ventrikel, kleines Bild zeigt
eine Vergrößerung der Multicilien-tragenden Zellen (MCZ). (D) Aufsicht auf die Ventrikeloberfläche des
SKOs in einem frontal eröffneten Hirnexplantat. (E) Übersicht über das Diencephalon (Di), kleines Bild
zeigt MCZ welche an der Di-/Mesencephalongrenze entstehen, vergleichbar mit denen der ZLI. (F-I)
Frontal eröffnete Hirnexplantate. (F) Sicht in das dorsale ventrikuläre Lumen des Mesencephalon (Mes)
mit dem Reissner-Faden (RF, ausgefüllter Pfeil), welcher den Ventrikel durchzieht. Linkes kleines Bild:
Ergebnisse
23
Vergrößerung der MCZ im Mes. Rechtes kleines Bild: Vergrößerung des RFs. (G) Aufsicht auf die
ventrale Ml. (H) Ventraler Teil des Rhomb mit Rhombomeren (Rh) und Rhg wie angedeutet. (I) PC des
Rhomb-Dachs mit MCZ.
A = anterior; Hy = Hypophyse; l = links; p = posterior; r = rechts
Die weiterhin präsente Expression von foxj1 in der Hypophyse (Abb. 7A, B) korrelierte
mit elongierten Monocilien auf Zellen des Neurohypophysenstiels sowie mit einigen
sichtbaren MCZ am Dach des Infundibulums (Abb. 7C-C‘).
Im adulten Hirn hatten sich schließlich die Zellen der Ventrikularzone in ein
einschichtiges, ependymales Epithel entwickelt, was insbesondere an Stellen deutlich
wurde, an denen das Ependym durch die Fixierung und Vorbereitung für das REM
zerstört wurde (rote Pfeile in Abb. 7D, E). Alle ependymalen Zellen trugen dabei
Multicilien (Abb. 7F).
Abbildung 7 Die Expression von foxj1 im Infundibulum korreliert mit dem Auftreten von Multicilien-tragenden Zellen In situ Hybridisierung und rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen explantierter Hirne im
Stadium 53 und REM-Aufnahmen adulter Hirne. (A) Rechte und linke Hemisphäre eines sagittal entlang
der Mittellinie eröffneten Hirnexplantats. Das Infundibulum ist umrandet. (B) Transversalschnitt wie in (A)
angedeutet, verdeutlicht die foxj1-Expression in der Zona limitans intrathalamica (ZLI) und der
Ergebnisse
24
Neurohypophyse (nHy). Die Adenohypophyse (aHy) zeigt hingegen keine Expression. (C) REM-
Aufnahme eines sagittal eröffneten Hirnexplantats. Maßstab 500 µm. (C‘) Nahaufnahme der Wand des
Infundibulums mit elongierten Cilien (ausgefüllte Pfeile) und einer Multicilien-tragenden Zelle (Pfeil) wie in
(C) angedeutet. (D-F) REM-Aufnahmen von sagittal eröffneten, adulten Hirnen in der Region des
Telencephalons (Tel, D) und Diencephalons (Di, E-F). (E, F) Multicilien-tragender ependymaler
Monolayer. Rote Pfeile deuten auf Stellen an denen das Ependym aufgrund mechanischen Stresses
während der Prozessierung abgelöst wurde.
A = anterior; d = dorsal; Mes = Mesencephalon; p = posterior; Rhomb = Rhombencephalon; v = ventral
Zusammengefasst kann also gesagt werden, dass die neurale Expression von foxj1 mit
der Biogenese von Cilien im Hirn von Xenopus-Kaulquappen korreliert. Die dauerhafte
Expression von foxj1 in distinkten Regionen markiert die Elongation kurzer Monocilien
und resultiert schließlich in einem Multicilien-tragenden Ependym.
II.5 Der Funktionsverlust von foxj1 resultiert in Hydrocephalus Die vorangegangene Korrelation von Ciliogenese und der Expression von foxj1
während der Hirnentwicklung zeigte Regionen mit putativ motilen Cilien auf. Daraufhin
stellte sich die Frage nach der Bedeutung dieser motilen Cilien für die CSF-Strömung
und eine korrekte Hirnmorphogenese. Aus diesem Grund wurde ein durch antisinn-
Morpholino-Oligomer (MO) vermittelter Funktionsverlust von foxj1 durchgeführt. Dieser
MO zielte auf die transkriptionelle Startstelle und wurde bereits charakterisiert (Stubbs
et al., 2008).
foxj1 MO oder ein Kontroll-MO (KoMO) wurden zusammen mit einem fluoreszenten
Farbstoff in die animale Region dorsaler Blastomeren von Embryonen im Vier- bis
Achtzellstadium injiziert (Abb. 9A). Die korrekte Injektion wurde im Neurulastadium
mittels des koinjizierten, fluoreszenten Farbstoffes überprüft und die Kultivierung bis
Stadium 46 fortgesetzt, in welchem entweder morphologische Analysen oder eine
Videographie der CSF-Strömung durchgeführt wurde (Abb. 9A). In allen Experimenten
wurden sowohl uninjizierte als auch mit KoMO injizierte Embryonen als Kontrollen
herangezogen. Mit foxj1 MO injizierte Embryonen zeigten häufig Ödeme und verkürzte
Körperachsen (nicht gezeigt). Auffallend war weiterhin, dass das Vorderhirn nach
Funktionsverlust von foxj1 deutlich reduziert war (Abb. 8A, Kontrolle vs. foxj1 MO: P =
3.444e-05, KoMO vs. foxj1 MO: P = 0.0003057, Kontrolle vs. KoMO: P = 0.9131; 8C-C‘‘,
D-D‘‘, vergleiche 8B-B‘‘, Abb. 9C, vergleiche 9B) und sich eine massive Erweiterung der
Ventrikel im Mes- und vor allem im Rhombencephalon zeigte (Abb. 8C‘‘‘-C‘‘‘‘, D‘‘‘-D‘‘‘‘,
Ergebnisse
25
vergleiche 8B‘‘‘-B‘‘‘‘, Abb. 9E,
vergleiche Abb. 9D). Dieser
Hydrocephalus konnte sowohl in vivo
als auch in explantierten Hirnen und
deren transversalen Schnitten
beobachtet werden.
Abbildung 8 Der Funktionsverlust von foxj1 führt zu einem verkürzten Vorderhirn
(A) Statistische Auswertung der Länge des
Vorderhirnventrikels und der Breite des Di-
/Mesencephalonventrikels, wie durch farbige
Pfeile angedeutet. (B-D) Dorsale Ansicht von
mit Kontrollmorpholino (KoMO) (B) und foxj1
Morpholino (foxj1 MO) (C, D) injizierten
Embryonen. (B‘-D‘‘‘‘) Transversalschnitte wie
in (B-D) angedeutet. Das Ventrikellumen ist
durch gelbe Färbung herausgehoben.
A = anterior; Ko = Kontrolle; Di =
Diencephalon; l = links; Mes =
Mesencephalon; N = Zahl der Embryonen; n =
Anzahl der unabhängigen Experimente; n.s. =
nicht signifikant; p = posterior; r = rechts;
Rhomb = Rhombencephalon
Ergebnisse
26
Um die Morphologie des Ventrikelsystems genauer untersuchen zu können, wurden der
fluoreszente Farbstoff und fluoreszente Latexmikrosphären (im Folgenden Beads
genannt) zusammen in den vierten Ventrikel injiziert. Die mikroskopische Analyse
dieser Injektion zeigte eine gleichmäßige Verteilung der Injektionslösung im
Ventrikelsystem von Kontrollembryonen (Abb. 9D). In Embryonen nach foxj1
Funktionsverlust konnte hingegen meist kein fluoreszentes Signal im Vorderhirn
detektiert werden (Abb. 9E). In einigen wenigen Fällen gelang ein Durchdringen der
Injektionslösung bin ins Vorderhirn, was deutlich fehlgebildete Ventrikel aufzeigte
(vergleiche Abb. 8). Die Nachhirnventrikel waren hingegen immer vollständig mit der
Injektionslösung gefüllt und nach Funktionsverlust von foxj1 deutlich erweitert (Abb.
8C‘‘‘‘, D‘‘‘‘, Abb. 9E). Diese hydrocephalische Erweiterung wurde durch Messung von
Breite und Länge des vierten Ventrikels, sowohl in Kontrollen als auch in mit foxj1 MO
injizierten Embryonen, statistisch ausgewertet. Das Verhältnis von Breite zu Länge
zeigt, dass mit foxj1 MO injizierte Embryonen einen eher runden vierten Ventrikel
hatten, im Gegensatz zu beiden Kontrolltypen, welche eine elliptische Form zeigten
(Abb. 9H, Kontrolle vs. KoMO: P = 0.6264, Kontrolle vs. foxj1 MO: P = 0.00191, KoMO
vs. foxj1 MO: P = 0.001541).
II.6 Analyse der Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung Mittels oben genannter Injektion wurde ebenfalls die Strömungsgeschwindigkeit der
CSF mittels Videographie untersucht. In Kontrollembryonen konnte so eine
durchgängige CSF-Strömung durch alle Ventrikel festgestellt werden. Die Beads
wurden in dorsalen Regionen des Hirns nach rostral bewegt, während in ventralen
Domänen eine caudale Bewegung stattfand. Die stärkste Strömung der CSF
beziehungsweise der Beads konnte dabei an den Epithelien des PC im dritten und
vierten Ventrikel beobachtet werden. Da in mit foxj1 MO injizierten Embryonen das
Vorderhirn oft kollabiert war, wurde die Strömungsgeschwindigkeit der CSF am PC des
vierten Ventrikels, also am Dach des Rhombencephalons, ausgewertet. Kontrollen
zeigten im vierten Ventrikel eine schnelle, laminare CSF-Strömung nahe der Oberfläche
des dorsalen Ventrikels (Abb. 9F, F‘, Film 1). Am rostralen Ende des Ventrikels wurden
die Beads nach ventral hin abgelenkt und gingen in eine langsamere nach caudal
gerichtete CSF-Strömung entlang der ventralen Mittellinie über. In den medialen
Regionen des Ventrikels wurden die Beads nach lateral und dorsal bewegt, was sie
Ergebnisse
27
wieder in den schnellen, nach rostral gerichteten Flüssigkeitsstrom am
Rhombencephalondach übergehen ließ (Film 1).
II.7 Die Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung wird durch motile Cilien generiert
Um den Flüssigkeitsstrom unabhängig von den MCZ am Rhombencephalondach
aufnehmen zu können, wurden zusätzlich Hirne explantiert und entlang der dorsalen
Mittellinie eröffnet. Die Explantate wurden flach in flüssigkeitsgefüllte Kammern
eingebracht, welche fluoreszente Beads enthielten. So konnte die CSF-Strömung an
der ventralen und lateralen Wand des vierten Ventrikels visualisiert werden.
Sowohl entlang als auch seitlich der ventralen Mittellinie konnte durch Cilien getriebene
CSF-Strömung beobachtet werden. Die laterale CSF-Strömung verlief linear von rostral
nach caudal, wurde aber durch die motilen Cilien in den Rhombomergrenzen
unterbrochen und anschließend wieder weitergeführt (Film 2). Diese Analyse der CSF-
Strömung zeigte somit, dass elongierte Cilien im Rhombencephalon motil sind und
einen gerichteten Flüssigkeitsstrom erzeugen. Die Monocilien der Rhombomergrenzen
können hierbei eingeschlossen werden. Auch wurde gezeigt, dass die MCZ des
Rhombencephalondachs die Hauptantriebskraft der CSF-Strömung darstellen. Diese
sind sowohl notwendig, als auch ausreichend dafür, den Strömungskreislauf der CSF
im vierten Ventrikel zu generieren.
II.8 Der Funktionsverlust von foxj1 verlangsamt die Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung im vierten Ventrikel
Um die Strömungsparameter der CSF detailliert zu analysieren wurde eine rechteckige
Region in der Mitte des Ventrikels standardmäßig ausgewählt (blaue Box in Abb. 9E)
und die Fokusebene so gewählt, dass die laminare CSF-Strömung, generiert durch
Cilienbüschel am Rhombencephalondach, aufgenommen wurde (vergleiche Abb. 5F,
G). Die schnelle Bewegung der Beads von caudal nach rostral wurde durch eine
Maximum Z-Projektion der Zeitreihe visualisiert und die Bewegungsbahnen mit dem
ImageJ Zusatzprogramm ParticleTracker berechnet (Abb. 9F‘, G‘, Film 3). Ein Vergleich
der Bewegungsbahnen zwischen Kontrollen und mit foxj1 MO injizierten Embryonen
zeigte zum einen, dass die CSF-Strömung nach Funktionsverlust von foxj1 deutlich
Ergebnisse
28
gestört war. Dabei war das Ausmaß des Verlusts an Cilien auf den Zellen des
Rhombencephalondachs unterschiedlich stark. In einigen Regionen wurden die Beads
nach wie vor gerichtet transportiert (roter Stern in Abb. 9G), während in anderen
Regionen keine bewegten Beads beobachtet werden konnten (gelber Stern in Abb. 9G).
Dies deutete daraufhin, dass die motilen Cilien in diesen Arealen vollständig fehlten.
Zum anderen zeigten mit foxj1 MO injizierte Embryonen eine deutlich langsamere
Geschwindigkeit der Beads (Abb. 9I). In uninjizierten Kontrollen betrug die
durchschnittliche Geschwindigkeit 401 ± 100 µm/s. Beads in mit KoMO injizierten
Embryonen bewegten sich mit 439 ± 86 µm/s. Diese Abweichung ist statistisch nicht
signifikant (P = 0.4557). Im Gegensatz dazu war die Strömungsgeschwindigkeit der
CSF nach Funktionsverlust von foxj1 mit 235 ± 96 µm/s signifikant reduziert (Kontrolle
vs. foxj1 MO: P = 0.001102; foxj1 MO vs. KoMO: P = 0.0002228). Eine graphische
Darstellung der Ventrikelform einzelner Embryonen gegen die
Strömungsgeschwindigkeit der CSF zeigte, dass die Ventrikelform der Kontrollgruppe
immer elliptisch war, trotz einer Varianz der CSF-Strömung zwischen 300 - 600 µm/s.
Nach Funktionsverlust von foxj1 reduzierte sich die Strömungsgeschwindigkeit der CSF
auf < 300 µm/s, was stark mit der Tendenz zu einer runderen Ventrikelform (einem
Hydrocephalus) korrelierte (Abb. 9J).
Ergebnisse
29
Abbildung 9 Der Funktionsverlust von foxj1 im zentralen Nervensystem resultiert in Hydrocephalus
(A) Zeitlicher Verlauf des experimentellen
Prozesses. (B, D, F, F‘) Mit Kontroll-Morpholino
(KoMO) injizierte Embryonen. (C, E, G, G‘) Mit
foxj1 Morpholino (foxj1 MO) injizierte
Embryonen. (B, C) Hirnexplantate im Stadium
(St.) 46, Seitenansicht. (D, E) Dorsale (d)
Ansicht von Embryonen im St. 46, das
Ventrikelsystem wurde durch die Injektion eines
fluoreszenten Farbstoffes visualisiert. Der
Verschluss im Ventrikelsystem und der
hydrocephalische Nachhirnventrikel in mit foxj1
MO injizierten Embryonen werden deutlich (E).
(F, G) Z-Projektion der videographierten
fluoreszenten Latexmikrosphären (Beads). (F‘,
G‘) Darstellung aller statistisch analysierten
Bead-Spuren. (H) Statistische Auswertung des
Verhältnisses von Breite zu Länge im vierten
Ventrikel, gemessen wie in (D) angedeutet. 0 =
linearer Ventrikel, 1 = absolut runder Ventrikel,
Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.
(I) Statistische Auswertung der Geschwindigkeit
der Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung im
vierten Ventrikel. Gemessener Bereich wird
durch blaue Box in (E) repräsentiert. (J)
Korrelation der statistischen Analysen in (H) und
(I).
a = anterior; ZNS = zentrales Nervensystem; Ko
= Kontrolle; CSF = Cerebrospinalflüssigkeit; Di =
Diencephalon; l = links; Mes = Mesencephalon;
N = Zahl der Embryonen; n = Anzahl der
unabhängigen Experimente; n.s. = nicht signifikant; p = posterior; r = rechts; Rhomb =
Rhombencephalon; Tel = Telencephalon; v = ventral
Zusammengefasst führt der Funktionsverlust von foxj1 in Xenopus zu einer signifikant
reduzierten Strömungsgeschwindigkeit der CSF und einem Hydrocephalus des vierten
Ventrikels.
Ergebnisse
30
II.9 Die reduzierte Strömungsgeschwindigkeit der Cerebrospinalflüssigkeit korreliert mit Defekten in der Ciliogenese
Weiterhin sollte geklärt werden, ob die Reduzierung der CSF-
Strömungsgeschwindigkeit durch einen Verlust von motilen Cilien verursacht wird.
Dafür wurden sowohl mit KoMO als auch mit foxj1 MO injizierte Embryonen mittels
REM untersucht.
Die Hirne von mit KoMO injizierten Embryonen zeigten eine normale Morphologie mit
einer Gesamtlänge von 1 mm und gut unterscheidbaren Hirnregionen (Abb. 10A). Wie
auch in wildtypischen Hirnen trugen die ZLI und das SKO elongierte Cilien (Abb. 10B,
C) und das Rhombencephalon wies ein charakteristisches Muster von kurzen Cilien in
den Rhombomeren und elongierten Cilien in der Rhombomergrenzen auf (Abb. 10D).
Das Dach des Rhombencephalons war bedeckt mit MCZ (Abb. 10E).
Im Gegensatz dazu waren die Hirne von mit foxj1 MO injizierten Embryonen mit 0.6 mm
deutlich kürzer, was an einer Reduktion des Di-/Mesencephalons lag. Die Grenze
zwischen Di- und Mesencephalon war nicht mehr zu unterscheiden (Abb. 10F). Das
Rhombencephalon blieb in seiner anteroposterioren Ausdehnung (Länge) zwar
unverändert, die dorsoventrale Ausdehnung (Höhe) hingegen vergrößerte sich um das
zweifache (gemessen zwischen ventraler Mittellinie und Dach, Abb. 10F). Während
Zellen der Ventrikularzone in der ZLI in mit KoMO injizierten Embryonen im Stadium 46
elongierte Monocilien trugen, zeigten mit foxj1 MO injizierte Embryonen nur kurze
Monocilien (Abb. 10G). Ebenso war auch die Oberfläche des SKOs nach
Funktionsverlust von foxj1 deutlich verändert. Einzelne Zellen konnten nicht mehr
identifiziert werden und extrazelluläres Material bedeckte das gesamte SKO (Abb. 10H).
Auch im Rhombencephalon war die Cilierung durch den Verlust von foxj1 betroffen. Die
kurzen Monocilien der Rhombomere waren unverändert, allerdings trugen die
Rhombomergrenzen nur noch einen Mikrovillisaum beziehungsweise primäre Cilien
(Abb. 10I). In mit KoMO injizierten Embryonen trugen die Zellen des
Rhombencephalondachs Multicilien, während in mit foxj1 injizierten Embryonen nur
noch vereinzelt Zellen mit Multicilienbüschel identifiziert werden konnten (Pfeile in Abb.
10J). Dies korrelierte mit dem veränderten Muster der CSF-Strömung in mit foxj1 MO
injizierten Embryonen (vergleiche Abb. 9G).
Ergebnisse
31
Abbildung 10 Die reduzierte Strömungsgeschwindigkeit der Cerebrospinalflüssigkeit korreliert mit Defekten in der Ciliogenese
Rasterelektronische (REM) Aufnahmen explantierter Hirne im Stadium 46. (A-E) Mit Kontroll-Morpholino
(KoMO) injizierte Embryonen. (F-J) Mit foxj1 Morpholino (foxj1 MO) injizierte Embryonen. (A, F) REM-
Aufnahme eines sagittal eröffneten Hirnexplantats mit Aufsicht auf die Ventrikeloberfläche, die Zona
limitans intrathalamica (ZLI) ist durch eine orange, gestrichelte Linie herausgehoben und die Grenzen der
Hirnregionen werden durch weiße, gestrichelte Linien verdeutlicht. Maßstab 200 µm. (B, G) Aufsicht auf
die ZLI im Diencephalon (Di), welche den Verlust von Cilien auf der ZLI in mit foxj1 MO injizierten
Embryonen verdeutlicht (G). (C, H) Nahaufnahme des subkommissuralen Organs (SKO) in frontal
eröffneten Hirnexplantaten. (D, I) Nahaufnahme des Rhombencephalons (Rhomb) in sagittal eröffneten
Embryonen, welche die Rhombomergrenzen (Rhg) zeigt. Pfeile in (D) weisen auf elongierte Monocilien
hin. In (I) sind hingegen keine Cilien vorhanden. (E, J) Nahaufnahme des Plexus choroideus (PC) auf
dem Rhomb-Dach. Ausgefüllte Pfeile in (J) zeigen wenige verbliebene Multicilien-tragende Zellen nach
Funktionsverlust von foxj1.
a = anterior; d = dorsal; Mes = Mesencephalon; p = posterior; Po = präoptische Region; Tel =
Telencephalon; v = ventral
Es kann somit festgehalten werden, dass die vorliegende Analyse eine wichtige Rolle
von motile Cilien und der CSF-Strömung im sich entwickelnden Xenopus-Hirn aufzeigt.
Die Daten verdeutlichen die Funktion der CSF-Strömung für die Hirnmorphogenese und
Ergebnisse
32
zeigen eine Korrelation zwischen gestörter Cilienmotilität und der Entstehung von
Hydrocephalus auf.
Auch wurde ein Zusammenhang zwischen CSF-Strömungsgeschwindigkeit und
Ventrikelmorphologie in der Enstehung von Hydrocephalus deutlich. Um dies näher zu
analysieren wurde als nächstes untersucht, inwieweit die Regulation der CSF-Strömung
durch den Hyaluronsäure-Rezeptors Hmmr Einfluss auf die Hirnmorphogenese nimmt.
Dafür wurde eine Expressionsanalyse von hmmr durchgeführt und anschließend der
Funktionsverlust von hmmr analysiert.
II.10 hmmr ist im sich entwickelnden Hirn von Xenopus und Maus exprimiert
Ein Überblick über die Expression von hmmr während der Embryogenese deutete auf
eine neurale Verteilung von Transkripten hin (Casini et al., 2010). Um diese Ergebnisse
zu verifizieren wurde mittels in situ Hybridisierung die Expression von hmmr erneut
analysiert und diese Analyse auch auf vergleichbare Stadien von Mausembryonen
ausgeweitet (Abb. 11). hmmr war bereits in frühen Stadien im animalen Pol exprimiert,
was auf maternale Transkripte schließen ließ (nicht gezeigt). Ab den frühen
Neurulastadien zeigte sich eine ausschließlich neurale Expression, vor allem am Rand
der Neuralplatte (Pfeile in Abb. 11A), welche sich während der Neurulation weiter
ausprägte und dann zusätzlich im Neuralrohr und dem Augenfeld (ausgefüllte Pfeile in
Abb. 11B, C) zu finden war. Nach der Neurulation wurden Transkripte auch in
migrierenden, cranialen Neuralleistenzellen (ausgefüllter Pfeil in Abb. 11D), in den
otischen Vesikeln und in den Nierenanlagen gefunden (Pfeil in Abb. 11D). Das
prämetamorphische Hirn zeigte ebenfalls ein distinktes Expressionsmuster von hmmr.
Im Stadium 45 war hmmr in abnehmender Intensität in Zellen der Ventrikularzone des
Tel-, Di- und Mesencephalons exprimiert (Abb. 11E, E‘, E‘‘, E‘‘‘). Auf transversalen
Vibratomschnitten wurde zum einen eine starke Expression im PC des dritten Ventrikels
deutlich (Abb. 11E‘, E‘‘‘‘, ausgefüllte Pfeile zeigen Cilien auf dem PC). Zum anderen
konnte eine schwache Expression in der Region der ZLI identifiziert werden (Abb.
11E‘‘). Auch die Zellen der Ventrikularzone im Tectum opticum des Mesencephalons
zeigten hmmr-Transkripte (Abb. 11E‘‘‘). Das SKO, die Hypophyse, die ventrale
Mittellinie und das gesamte Rhombencephalon wiesen im Gegensatz dazu keine
Expression auf (Abb. 11E‘‘, E‘‘‘‘‘). Bis Stadium 53 hatte sich die Expression weiter
Ergebnisse
33
verstärkt. Sie war noch immer in den dorsalen und lateralen Zellen der Ventrikularzone
im Tel-, Di- und Mesencephalons zu finden (Abb. 11F, F‘, F‘‘, F‘‘‘) und der Cilien-
tragende PC im lateralen Ventrikel zeigte nach wie vor eine deutliche Expression (Abb.
11F‘). Die Färbung in der Region der ZLI war stärker als noch im Stadium 45 und
zusätzlich konnte hmmr in der Hypophyse detektiert werden (Abb. 11F‘‘). Die
Expression im Tectum opticum des Mesencephalons war weiterhin zu identifizieren
(Abb. 11F‘‘‘). Im Rhombencephalon hatte sich ein metameres Muster von hmmr
Expression herausgebildet. So wechselte sich auf sukzessiven Schnitten eine deutliche
hmmr-Expression (Abb. 11F‘‘‘‘) mit einer schwachen Expression ab (Abb. 11F‘‘‘‘‘). Da in
diesem Fall keine Doppelfärbung mit dem Cilienmarker foxj1 durchgeführt wurde, kann
die Expression von hmmr nicht eindeutig den Rhombomeren beziehungsweise den
Rhombomergrenzen zugeordnet werden. Das Epithel des PC im Rhombencephalon
zeigte eine schwache Färbung während die ventrale Mittellinie und das SKO weiterhin
frei von Transkripten waren.
In der Maus zeigte sich bereits in frühen Stadien Hmmr-Expression in Zellen der
Ventrikularzone des sich bildenden Neuralrohrs (Abb. 11 G, G‘). Zudem wiesen die
Somiten eine leichte Expression auf (Abb. 11 G, G‘). Im Stadium E9.5 und E10.5 war,
vergleichbar zu Xenopus, eine starke Expression im Hirn sowie in den Augenanlagen
zu finden (ausgefüllte Pfeile in Abb. 11H, H‘, H‘‘, I). Ein transversaler Vibratomschnitt
verdeutlichte dies (Abb. 11H‘‘). Auch die otischen Vesikeln wiesen Transkripte auf
(Pfeile in Abb. 11H, I). Die sinn-Probe zeigte keine Färbung (Abb. 11J).
Ergebnisse
34
Abbildung 11 hmmr ist im sich entwickelnden Hirn von Xenopus und Maus exprimiert In situ Hybridisierung ganzer Embryonen und explantierter Hirne im angegebenen Stadium (St.).
(A-C) Expression in der Neuralplatte einer frühen Neurula, frontale Ansicht. Pfeile zeigen Färbung am
Rand der Neuralplatte. (B, C) Expression in der späten Neurula im Neuralrohr und den Augenfeldern
(ausgefüllte Pfeile), frontale Ansicht. (D) Färbung in den Augen; cranialen, migrierenden
Neuralleistenzellen (ausgefüllter Pfeil); otischen Vesikeln und in den Nierenanlagen (Pfeil), laterale
Ansicht. (E, F) Hirnexplantate im St. 45 (E) und 53 (F) nach in situ Hybridisierung mit einer antisinn-Probe
gegen hmmr in dorsaler (d) Ansicht. (E‘, E‘‘, E‘‘‘, E‘‘‘‘‘) Transversale Vibratomschnitte wie in (E)
angedeutet, verdeutlichen die Expression in Zellen der Ventrikularzone und dem Plexus choroideus (PC)
des Diencephalons (Di, E‘), in der Region der Zona limitans intrathalamica (ZLI, E‘‘) und dem Tectum
opticum (To) im Mesencephalon (Mes, E‘‘‘). Das Rhombencephalon (Rhomb) ist frei von Expression
(E‘‘‘‘). (E‘‘‘‘) Vergrößerung des PC, wie in (E‘) angedeutet. (F‘, F‘‘, F‘‘‘, F‘‘‘‘, F‘‘‘‘‘‘) Transversale
Ergebnisse
35
Vibratomschnitte wie in (F) angedeutet, verdeutlichen die Expression in Zellen der Ventrikularzone und
des PC im Di (F‘), in der Region der ZLI und der Hypophyse (Hy, F‘‘) sowie des To im Mes (F‘‘‘). Das
Rhomb zeigt auf sukzessiven Schnitten abwechselnd eine starke (F‘‘‘‘) und eine schwache hmmr-
Expression (F‘‘‘‘‘). (G) Mausembryo des Stadiums E 8.5 in dorsaler Ansicht zeigt Expression von Hmmr
im Neuralrohr und den Somiten. (G‘) Transversaler Vibratomschnitt wie in (G) angedeutet. (H, H‘)
Mausembryo im Stadium E 9.5 in lateraler (H) und frontaler (H‘) Ansicht. Starke Expression im Hirn, in
den Augenanlagen (ausgefüllter Pfeil in H, H‘) sowie in den otischen Vesikeln (Pfeil in H). (H‘‘)
Transversaler Vibratomschnitt wie in (H) angedeutet. Expression in den Augenanlagen (ausgefüllter
Pfeil). (I‘) Mausembryo im Stadium E 10.5 in lateraler Ansicht. Starke Expression im Hirn, in den
Augenanlagen (ausgefüllter Pfeil) sowie in den otischen Vesikeln (Pfeil). (J) Kontrolle (sinn-Probe).
A = anterior; c = caudal; l = links; p = posterior; r = rechts; ro = rostral; v = ventral
Diese Ergebnisse zeigten, dass hmmr/Hmmr im sich entwickelnden Hirn/Embryo von
Xenopus und der Maus ein distinktes Expressionsmuster aufweist, was die Grundlage
für funktionelle Experimente bildete.
Im Hirn von Xenopus korrelierte die hmmr-Expression mit einigen bereits identifizierten,
Cilien-tragenden Regionen. Insbesondere waren hmmr-Transkripte in den Plexus-
Epithelien zu finden. Die Cilien auf Zellen dieser Epithelien stellen die
Hauptantriebskraft der CSF dar und daher liegt es nahe, dass hmmr eine Rolle in der
Regulation der Schlagfrequenz dieser einnimmt.
II.11 Der Funktionsverlust von hmmr führt zu Hydrocephalus Nachdem die Expression von hmmr im Hirn detailliert beschrieben war, sollte durch den
gezielten Funktionsverlust die Rolle von hmmr während der Hirnentwicklung in Xenopus
weiter analysiert werden. Dafür wurde ein durch antisinn-Morpholino-Oligomer (MO)
vermittelter Funktionsverlust gewählt. In Abbildung 12A sind beide verwendeten MOs
dargestellt, wobei MO 1 in der untranslatierten Region nahe des Translationsstarts
(ATG) liegt und MO 2 den Translationsstart überlagert. In Vorversuchen erzielten beide
MOs identische Ergebnisse im jeweils selben Gelege. In den meisten Experimenten
wurde MO 1 gewählt, insbesondere dann, wenn die Spezifität des MO bestätigt werden
sollte und dafür der Funktionsverlust mittels Koinjektion von hmmr gerettet wurde. Die
austitrierte Dosis von 0.5 – 0.75 pmol MO oder die entsprechende Menge Kontroll-MO
(KoMO) wurden in den animalen Pol der dorsalen Blastomeren von Embryonen im Vier-
bis Achtzellstadium injiziert, um neurales Gewebe zu treffen. Bei allen Injektionen wurde
zusätzlich ein fluoreszenter Farbstoff koinjiziert, um falsch getroffene Embryonen
aussortieren zu können.
Ergebnisse
36
Nach Funktionsverlust von hmmr zeigten Embryonen im Stadium 45 einen neuralen
Phänotyp. Der vierte Ventrikel im Rhombencephalon war deutlich erweitert im Vergleich
zu Kontrollembryonen (Abb. 12C, vergleiche 12B). Diese Beobachtung wurde durch die
Auswertung des Verhältnisses von Breite zu Länge unterstützt. Hierbei zeigte sich eine
signifikante Rundung des Ventrikellumens (Abb. 12D, P = 0.04556). Diese
morphologische Beobachtung deutete darauf hin, dass Embryonen einen
Hydrocephalus entwickelten. Wie bereits vorangegangen beschrieben, stellen motile
Cilien auf Zellen des PC am Dach des Rhombencephalons die Hauptantriebskraft für
die Strömung der CSF dar und eine Immotilität beziehungsweise ein Fehlen dieser kann
in Hydrocephalus resultieren. Deshalb stellte sich die Frage nach der Cilierung am
Rhombencephalondach. Wie auch bei Kontrollen waren jedoch das
Rhombencephalondach und auch die MCZ des PC in Embryonen im Stadium 45 nach
Funktionsverlust von hmmr vorhanden (Abb. 12E, F, Pfeile zeigen auf MCZ). Somit war
die dorsale Mittellinie im Nachhirn wildtypisch ausgeprägt. Bei einem Vergleich der
CSF-Strömung zwischen Kontrollen (Abb. 12B‘, G) und mit hmmr MO injizierten
Embryonen (Abb. 12C‘, G) zeigte sich jedoch deutlich, dass die CSF-Strömung
verändert und die Geschwindigkeit der CSF im vierten Ventrikel signifikant reduziert war
(Abb. 12G, P = 0.004601).
Zusammengefasst zeigen Embryonen nach Injektion von hmmr MO somit einen
Hydrocephalus, welcher nicht durch fehlende MCZ am Rhombencephalondach
verursacht wurde.
Ergebnisse
37
Abbildung 12 Der Funktionsverlust von hmmr führt zu Hydrocephalus (A) Darstellung der Bindestellen von hmmr Morpholino (MO) 1 und MO 2. Untranslatierte Region in grün,
Translationsstart (ATG) in rot, translatierte Region in blau. (B-C) Dorsale (d) Ansicht auf den Kopf von
Embryonen im Stadium 46, das Ventrikelsystem ist durch die Injektion eines fluoreszenten Farbstoffes
sichtbar gemacht. Deutlich werden das missgebildete Vorderhirn und der hydrocephalische
Nachhirnventrikel in mit hmmr MO injizierten Embryonen (C) im Vergleich zu Kontrollen (B). (B’-C’)
Dargestellt sind die Bewegungsspuren der in das Ventrikellumen injizierten fluoreszenten
Latexmikrosphären (Beads), welche statistisch analysiert wurden. Die gemessene Region ist durch eine
gelbe Box in (B) angedeutet. (D) Messung des Verhältnisses von Breite zu Länge im vierten Ventrikel,
wie in (C) durch rote Pfeile angedeutet, zeigt eine hydrocephalische Rundung des vierten Ventrikels nach
hmmr MO Injektion. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. (E-F) Immunfluoreszente Färbung
von acetyliertem α-Tubulin (ac. Tuba4a, rot) und fluoreszente Färbung der Nuklei (cyan) auf
transversalen Hirnschnitten von Kontroll- (Ko) (E) und mit hmmr MO injiziertem Embryo (F). Pfeile deuten
auf weiterhin vorhandenen Multicilien-tragende Zellen des Plexus choroideus im Rhombencephalon.
Schnittebene der transversal eröffneten Hirne wie in (B) und (C) angedeutet. (G) Statistische Analyse der
Strömungsgeschwindigkeit der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF-Flow) im vierten Ventrikel, zeigt eine
deutliche Verlangsamung nach Funktionsverlust von hmmr.
Ergebnisse
38
A = anterior; l = links, N = Zahl der Embryonen; n = Zahl der unabhängigen Experimente; p = posterior, r
= rechts; v = ventral
II.12 Der Funktionsverlust von hmmr führt zu Holoprosencephalie und dem Verlust des Cilien-tragenden Plexus choroideus
Neben dem beobachteten Hydrocephalus zeigte sich auch ein stark betroffenes
Vorderhirn in hmmr-Morphanten. Im Vergleich zu Kontrollen (Abb. 13A) zeigten injizierte
Embryonen (Abb. 13B) Dysmorphien der craniofacialen Strukturen. Neben schmaleren
Köpfen war der interokulare Abstand verringert (Hypotelorismus), die Augen waren
kleiner (Mikrophthalmie) und das Vorderhirn wirkte verkleinert (Abb. 13B). Um die
ersten Hinweise auf einen Vorderhirndefekt weiter zu untersuchen, wurden Hirne im
Stadium 45 explantiert. Mittels in situ Hybridisierung wurden diese auf die Expression
des übergeordneten Regulators für die Biogenese motiler Cilien, foxj1, untersucht, um
den PC des dritten Ventrikels darstellen zu können. Die Hirne von Kontrollembryonen
zeigten die typische Morphologie des Telencephalons mit den olfaktorischen Bulben am
rostralen Ende und einen foxj1-positiven PC, was auf eine intakte Mittellinie hinwies
(Pfeil, Abb. 13C). Nach Funktionsverlust von hmmr hingegen war das gesamte
Vorderhirn deutlich reduziert. In milden Fällen konnten die olfaktorischen Bulben und
damit die beiden Hirnhemisphären noch erkannt werden. Auch waren kleine
Expressionsstellen von foxj1 zu detektieren (Pfeil, Abb. 13D, mild). In stark betroffenen
Embryonen war keine Trennung der beiden Hemisphären des Telencephalons zu
erkennen. Stattdessen war das rostrale Vorderhirn abgerundet und foxj1-Expression
war nicht mehr vorhanden (Abb. 13D, schwer). Dies ließ darauf schließen, dass die
Trennung der Hemisphären entlang der Mittellinie des Telencephalons gestört und die
dorsale Mittellinie, aus welcher der PC sich einstülpt, nicht korrekt gebildet war.
Transversale Schnitte durch das Vorderhirn mit anschließender fluoreszenter Färbung
der Nuklei bestätigten diesen Eindruck (Abb. 13E, F). In Kontrollhirnen konnte eine
klare Trennung der beiden Hemisphären im Telencephalon beobachtet werden, wobei
jede Hemisphäre ein klar abgegrenztes Ventrikellumen hatte (umrandet in Abb. 13E).
Mit hmmr MO injizierte Hirne wiesen weder eine klare Trennung der Hemisphären auf,
noch konnte ein Ventrikellumen ausgemacht werden. Stattdessen war das
Telencephalon zu einer zentralen Zellmasse verschmolzen, in der sich mehrere kleine
Lumina gebildet hatten (Pfeile in Abb. 13F). Wie die reduzierte Expression von foxj1
bereits vermuten ließ, war auch der PC von Morphanten im Vergleich zu Kontrollen
Ergebnisse
39
stark missgebildet und nur noch halb so groß (Abb. 13H, vergleiche Abb. 13G). Eine
Immunfluoreszenzfärbung von acetyliertem α-Tubulin zeigte auf dem PC von Kontrollen
7 µm lange Cilien (Pfeile in Abb. 13G). Dieses fluoreszente Signal war nach
Funktionsverlust von hmmr stark verändert, was zeigte, dass wenigere und kürzere
Cilien (ca. 3-4 µm) vorhanden waren (Pfeile in Abb. 13H). Auf REM-Aufnahmen des PC
zeigte sich diese Missbildung noch deutlicher. Während in Kontrollembryonen ein
deutlich ausgeprägter PC mit hohem Cilienbesatz zu finden war (Abb. 13I), zeigten mit
hmmr MO injizierte Embryonen einen deutlich kleineren PC. Dieser trug nur noch
wenige, einzelne Cilien. Auch fiel auf, dass die gesamte Oberfläche des Ventrikels mit
einem nicht näher zu charakterisierendem Material bedeckt war (Abb. 13J). Diese
Beobachtung lässt den Schluss zu, dass die Funktionalität des PC in Bezug auf
Sekretion und Bewegung der CSF deutlich reduziert war.
Abbildung 13 Der Funktionsverlust von hmmr führt zu Holoprosencephalie und dem Verlust des Cilien-tragenden Plexus choroideus (A-B) Kontrollembryo (A) und mit hmmr Morpholino (MO) injizierter Embryo (B) im Stadium (St.) 45 in
dorsaler (d) Ansicht, rostral ist links. Die Hirne sind weiß umrandet. Die intraokulare Distanz ist in rot
eingezeichnet und in mit hmmr MO injizierten Embryonen reduziert wie auch die Augengröße. (C-D) In
situ Hybridisierung mit einer antisinn-Sonde gegen foxj1 auf explantierte Hirne von Kontrollembryo (C)
und mit hmmr MO injizierten Embryonen (D) in dorsaler Ansicht, Ausschnitt wie in (A-B) angedeutet.
Pfeile zeigen auf Expression von foxj1 im Plexus choroideus (PC). Diese ist reduziert in milden
Phänotypen und nicht vorhanden in schweren. (E-H) Fluoreszente Färbung der Nuklei (cyan) und
immunfluoreszente Färbung von acetyliertem α-Tubulin (ac. Tuba4a, rot) (G, H) auf transversalen
Hirnschnitten von Kontrollembryonen (E, G) und mit hmmr MO injizierten Embryonen (F, H), wie in (C-D)
angedeutet. Der Ventrikel ist weiß umrandet. Pfeile in (F) zeigen auf kleine Lumina. (G-H) Pfeile heben
Cilien auf dem PC hervor, welche in Morphanten stark reduziert sind. (I-J)
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen des PC eines Kontrollembryo (I) und mit hmmr MO
injiziertem Embryo (J). Pfeile zeigen auf wenige, verbleibende Cilien nach Funktionsverlust von hmmr (J).
L = links; r = rechts; v = ventral
Ergebnisse
40
II.13 hmmr wird für die Augenentwicklung benötigt Die Vorderhirndefekte, welche nach Funktionsverlust von hmmr beobachtet wurden,
können unter dem Krankheitsbild der Holoprosencephalie (HPE) zusammengefasst
werden. Die HPE ist genetisch und phänotypisch heterogen, allerdings sind
phänotypische Fehlbildungen wie Hypotelorismus und Mikrophthalmie charakteristisch
für HPE (Muenke, 1989; Pineda-Alvarez et al., 2011; Roessler und Muenke, 2010).
Auch wenn die Embryonen nach Funktionsverlust von hmmr keine Zyklopie
entwickelten, welche die schwerste Ausprägung der HPE im Gesicht darstellt (Roessler
und Muenke, 2010), konnte doch eine veränderte Augenmorphogenese beobachtet
werden. Die Expression von pax6 bestätigte, dass die Augenspezifizierung normal war
(Abb. 14A-C). Eine detaillierte Analyse der Augenmorphogenese zeigte jedoch, dass
sich die Augen nach unilateraler hmmr MO Injektion auf der injizierten Seite deutlich
von denen auf der uninjizierten Seite unterschieden. So war die Neuralplatte auf Höhe
der Augenanlagen auf der injizierten Seite im Stadium 19 deutlich breiter als auf der
Kontrollseite (Abb. 14A, injizierte Seite durch Stern markiert). Nach dem
Neuralrohrschluss (Stadium 22) hatte das optische Vesikel auf der Kontrollseite ein
distinktes Lumen gebildet, welches von einem hoch organisierten Epithel ausgekleidet
war. Auf der injizierten Seite war pax6 weiterhin exprimiert, jedoch bildete sich kein
vollständiges Lumen und auch das umgebende Epithel war weniger organisiert (Abb.
14B). Die Augenmorphogenese entwickelte sich darauffolgend auf der Kontrollseite
normal weiter, während auf der injizierten Seite die Ausstülpung und Ausbildung eines
Lumens deutlich verzögert war (Abb. 14C). Im Stadium 42 zeigten die Augen von
Kontrollembryonen eine vollständige Pigmentierung (Abb. 14D, D‘) und die
verschiedenen Schichten der Retina waren nach Färbung der Nuklei auf horizontalen
Schnitten durch das Auge gut zu erkennen (Abb. 14D‘‘). Nach Funktionsverlust von
hmmr zeigten die Augen weniger Pigmentierung und die gesamte Augenmorphologie
war verändert (Abb. 14E). Auf horizontalen Schnitten wurde die deutlich dünnere
Pigmentschicht sichtbar (Abb. 14E‘). Auch alle anderen retinalen Schichten zeigten kein
geordnetes Muster (Abb. 14E‘‘). Um die Spezifität des durch hmmr MO erzeugten
Phänotyps zu überprüfen, wurde hmmr in voller Länge koinjiziert. An diese mRNA
konnte der hmmr MO nicht binden, da die untranslatierte Sequenz vor dem
Translationsstart fehlte. Diese Koinjektion rettete den Augenphänotyp signifikant, da
sowohl die Augenmorphologie, als auch die retinale Lamination wieder hergestellt
wurde (Abb. 14F-F‘‘). Die statistische Auswertung des Effekts von hmmr MO Injektion
Ergebnisse
41
auf die Augenmorphogenese zeigte, dass die Augen in mehr als 80 % aller mit hmmr
MO injizierter Embryonen verändert waren (Abb. 14G, P = < 0.0001). Die Koinjektion
von hmmr reduzierte den Prozentsatz der veränderten Augen signifikant (Abb. 14G, P =
0.001). Der Augendurchmesser nach Funktionsverlust von hmmr wurde um 30 %
verkleinert (Abb. 14H, P = 2.2e-16). Die Koinjektion von hmmr konnte diesen wiederum
signifikant vergrößern (Abb. 14H, P = 0.009097).
Die Wiederherstellung der Augenmorphologie, der Augengröße und der retinalen
Lamination in koinjizierten Embryonen bestätigte somit die Spezifität des durch hmmr
MO erzeugten Phänotyps.
Ergebnisse
42
Abbildung 14 hmmr wird für die Augenentwicklung benötigt
(A-C) Transversale Vibratomschnitte auf Höhe des Diencephalons von Embryonen im angegebenen
Stadium (St.) nach unilateraler Injektion mit hmmr Morpholino (MO) und anschließender in situ
Hybridisierung mit antisinn-Sonde gegen pax6. Die injizierte Seite ist durch einen Stern gekennzeichnet.
Deutlich wird die aberrante Entwicklung des Augenbläschens auf der injizierten Seite. (D-F) Embryonen
im St. 42, laterale Ansicht. (D) Kontrollembryo mit normaler Augengröße und Pigmentierung. (E) Mit
hmmr MO injizierter Embryo mit kleinen, hypopigmentierten Augen. Wiederherstellung des Phänotyps
nach Koinjektion von hmmr MO und hmmr (F). (D‘-F‘) Hellfeldaufnahme horizontaler Schnitte durch das
Auge der Embryonen in (D-F), wie jeweils angedeutet. (D‘‘-F‘‘) Schnitte aus (D‘-F‘) nach fluoreszenter
Färbung der Nuklei mit DAPI. (G) Statistische Auswertung der Augenmorphologie. Anzahl der
Embryonen im Balken angegeben. (H) Statistische Auswertung des Augendurchmessers von mit hmmr
Ergebnisse
43
MO injizierten Embryonen im Vergleich zum durchschnittlichen Durchmesser der jeweiligen
Kontrollembryonen (Ko; N = Anzahl der Augen).
D = dorsal; l = links; n= Anzahl der unabhängigen Experimente; r = rechts; v = ventral; wt = wildtypische
Morphologie
Diese Daten zeigten, dass der Funktionsverlust das Vorderhirn differentiell stärker
betraf, obwohl hmmr entlang der gesamten anteroposterioren Achse des
Neuroektoderms exprimiert war. Das humane Krankheitsbild der HPE wurde durch den
Verlust des dorsalen Mittellinienorgans im Vorderhirn - des PC - widergespiegelt. Der
PC im Rhombencephalon war hingegen nicht strukturell betroffen, auch wenn sich ein
Hydrocephalus entwickelte.
Es stellte sich deshalb die Frage nach den zugrunde liegenden Mechanismen, die zu
den beobachteten Vorderhirndefekten und Hydrocephalus führten.
II.14 Die Spezifizierung von Neuroektoderm und Augenanlagen ist nach Funktionsverlust von hmmr nicht verändert
Um beobachtete Hirndefekte weiter zu analysieren, wurden Embryonen im
Neurulastadium auf korrekte neurale Spezifizierung und Neurulation hin untersucht.
Dafür wurde hmmr MO in die animale Region dorsaler Blastomeren in Embryonen im
Vier- und Achtzellstadium injiziert und eine Markergenanalyse mittels in situ
Hybridisierung durchgeführt. Der pan-neurale Marker sex-determining region Y-box 3
(sox3) war im Stadium 13 unverändert zwischen Kontrollen (Abb. 15A) und mit hmmr
MO injizierten Embryonen (Abb. 15B), was einen generellen Effekt von hmmr auf die
neurale Spezifizierung ausschließt. Aufgrund der beobachteten Mikrophthalmie wurde
zusätzlich die Expression des im Signalweg der Augenspezifizierung wirkenden
Transkriptionsfaktors retina and anterior neural fold homeobox (rax) analysiert. Auch
hier zeigten sich keine Unterschiede (Abb. 15C, D). Transkripte von paired-box 6 (pax6)
wurden im Vorderhirn, in den Augenanlagen und in den Rhombomeren 3 und 5 des
Nachhirns gefunden. Diese Expression unterschied sich ebenfalls nicht zwischen
Kontrollen (Abb. 15E) und mit hmmr MO injizierten Embryonen (Abb. 15F) und zeigte,
dass die Augen und das Nachhirn normal spezifiziert waren.
Die Trennung des zentralen Augenfeldes in zwei einzelne Augenanlagen ist abhängig
von einem Shh-Signal der unter dem Augenfeld liegenden Prächordalplatte (Gilbert,
2006). In Embryonen, in welchen die Prächordalplatte oder das Shh-Signal fehlt, wird
Ergebnisse
44
das Augenfeld nicht korrekt aufgetrennt und es entwickelt sich in der Folge eine
Zyklopie (Chiang et al., 1996; Kazanskaya et al., 2000). Kontrollen (Abb. 15G) wie auch
mit hmmr MO injizierte Embryonen zeigten wildtypische shh-Expression in der
Prächordalplatte (Abb. 15H), was mit den korrekt getrennten Augenfeldern in späteren
Stadien übereinstimmt.
Abbildung 15 Die Spezifizierung von Neuroektoderm und Augenanlagen ist unverändert nach Funktionsverlust von hmmr In situ Hybridisierung von ganzen Embryonen im angegebenen Stadium (St.) mit antisinn-Sonden gegen
den pan-neuralen Marker sox3 (A-B) in dorsaler (d) Ansicht, die Augenmarker rax (C-D) und pax6 (E-F)
in frontaler Ansicht. Die Expression zeigt keine Unterschiede in der Neuralplatte, den Augenanlagen und
den Rhombomeren (R) 3 und 5 zwischen Kontrollen und mit hmmr MO injizierten Embryonen. Pfeile
verdeutlichen den Abstand der Neuralfalten zueinander. (G) Expression von sonic hedgehog (shh),
Aufsicht auf die anteriore Innenseite eines transversal halbierten Embryos.
A = anterior; l = links; p = posterior; r = rechts; v = ventral
Aus dieser Markergenanalyse kann somit der Schluss gezogen werden, dass die frühe
neurale Spezifizierung sowie die Spezifizierung von Vorderhirn, Nachhirn und
Augenanlagen nicht durch den Funktionsverlust von hmmr betroffen sind. Allerdings
wurde während der frühen Markergenanalyse beobachtet, dass der Neuralrohrschluss
verzögert zu sein scheint, da die Neuralfalten in mit hmmr MO injizierten Embryonen
weiter voneinander entfernt waren (Abb. 15D, F) als bei Kontrollen im jeweils selben
Stadium (Abb. 15C, E).
Ergebnisse
45
II.15 Verzögerung des anterioren Neuralrohrschlusses nach Funktionsverlust von hmmr
Die Augenmorphogenese verläuft über eine bilaterale Ausstülpung des Augenvesikels
auf Höhe des Diencephalons. Wie bei der Analyse früher Markergene festgestellt
wurde, ist der Neuralrohrschluss in dieser Region nach Funktionsverlust von hmmr
verzögert. Die Neuralfalten waren in mit hmmr MO injizierten Embryonen weiter
voneinander entfernt (Abb. 15D, F) als bei Kontrollen im jeweils selben Stadium (Abb.
15C, E). Die Verzögerung im Neuralrohrschluss wurde daher mittels Zeitrafferfilmen
näher untersucht (Film 4). Dafür wurden Embryonen zeitgleich mit KoMO oder hmmr
MO injiziert und unter absolut identischen Bedingungen weiter kultiviert, um
Entwicklungsunterschiede aufgrund äußerer Bedingungen zu vermeiden. Einzelbilder
eines Films sind in Abbildung 16A-B dargestellt. Zu Beginn des Experiments befanden
sich alle Embryonen im Stadium 13 und zeigten keine Unterschiede in der beginnenden
Neurulation (Abb. 16At1, Bt1). In dorsaler Aufsicht auf die Embryonen im Stadium 15
traten die Neuralfalten als longitudinale Wülste seitlich der Mittellinie in Erscheinung.
Dies zeigte, dass sich die Neuralfalten von Kontrollembryonen (Abb. 16At2) bereits
näher zur Mittellinie hin bewegt hatten als die Neuralfalten in mit hmmr MO injizierten
Embryonen (Abb. 16Bt2). Nach Funktionsverlust von hmmr erschienen die Neuralfalten
flacher und auch die Grenze zwischen neuralem und nicht-neuralem, superfiziellen
Ektoderm war nur schwach zu erkennen. Im Stadium 19 wurde die Distanz zwischen
den anterioren Neuralfalten gemessen, wobei die Neuralfalten nach Injektion von hmmr
MO um den Faktor fünf weiter auseinander standen (Abb.16At3, C, P = 6.866e-7), als
bei Kontrollen (Abb. 16Bt3, C). Final schlossen sich auch bei mit hmmr MO injizierten
Embryonen die Neuralfalten, allerdings mit ein bis vier Stunden Verzögerung abhängig
von Gelege und Kultivationstemperatur.
Ergebnisse
46
Abbildung 16 Verzögerung des anterioren Neuralrohrschlusses nach Funktionsverlust von hmmr (A-B) Einzelbilder aus Film 4 während der Neurulation von Kontrollembryonen und mit hmmr Morpholino
(MO) injizierten Embryonen zu drei verschiedenen Zeitpunkten (t1 = Stadium (St.) 13, Start des Film; t2 =
St. 15; t3 = St. 19, Ende des Films). Dorsoanteriore Ansicht. Die gestrichelte, weiße Linie markiert die
Grenze zwischen superfiziellem, neuralen und nicht-neuralem Ektoderm, die gestrichelte, schwarze Linie
die Mittellinie. Pfeile verdeutlichen die Distanz der Neuralfalten am Ende der Neurulation. (C) Statistische
Auswertung der relativen Distanz der Neuralfalten im St. 19.
A = anterior; l = links; N = Zahl der Embryonen; n = Anzahl der unabhängigen Experimente; p = posterior;
r = rechts
II.16 hmmr lokalisiert in der tiefen Zellschicht des Neuroektoderms mit Mikrotubuli und F-Aktin
Um eine genauere Vorstellung von der Verteilung von hmmr-Transkripten während der
Neurulation zu erhalten, wurde mittels in situ Hybridisierung eine Expressionsanalyse
wiederholt und spezielles Augenmerk auf Neurulastadien gerichtet. Dies wurde ergänzt
durch die immunfluoreszente Detektion von Hmmr.
Dabei war hmmr während der gesamten Neurulation in den tiefen Zellen des
Neuroektoderms exprimiert (Abb. 17A-C, A‘-C‘, A‘‘). Eine besonders starke Expression
fand sich dabei in den intermediären, tiefen (IT) Zellen (Schroeder, 1970, Pfeile in
Abb.17A‘-C‘, A‘‘), welche nach dem Neuralrohrschluss in den dorsalen und lateralen
Bereichen des Neuralrohrs zu liegen kommen (Edlund et al., 2013).
Mittels eines Xenopus-spezifischen Antikörpers (gerichtet gegen den C-Terminus, Abb.
17D, Groen et al., 2004) konnte endogenes Hmmr an der mitotischen Spindel detektiert
werden (Abb. 17E), was die Spindellokalisierung von HMMR in anderen Geweben,
Ergebnisse
47
Zellen und Organismen widerspiegelt (Assmann et al., 1999). Auch die neurale
Überexpression eines Volle-Länge-Konstrukts von hmmr mit anschließender Detektion
durch den Xenopus-spezifischen Antikörpers bestätigte die generelle Assoziation von
Hmmr mit Mikrotubuli (Abb. 17F, G). Hmmr Protein lokalisierte dabei sowohl an der
mitotischen Spindel (Abb. 17F) als auch an cytoplasmatischen Mikrotubuli während der
Interphase (Abb. 17G).
In apicobasal polarisierten Interphasezellen des Neuralrohrs (vergleiche Model in
Abb.17H, H‘) lokalisierte endogenes Hmmr als kleine Punkte. Diese waren vor allem
entlang des apikalen und basalen Zellkortex zu finden (Abb. 17I1, 2) und akkumulierten
stark in basalen Fortsätzen, welche zur Basallamina hin gebildet wurden (Abb. 17I2).
Das Mikrotubuli Plus-Ende bindende Protein Mapre1 (EB1) zeigte ebenfalls eine
gepunktete Lokalisation, welche in unmittelbarer Nähe von Hmmr zu finden war
(Abb.17I1, 2). Die Ko-Detektion von Hmmr und F-Aktin mittels fluoreszent markiertem
Phalloidin zeigte, dass beide Proteine entlang des apikalen (Abb.17J1) und basalen
(Abb.17J2) Zellkortex lokalisierten. Somit stellt Hmmr in Xenopus ein Protein dar,
welches nahe der Plus-Enden cytoplasmatischer Mikrotubuli und zusammen mit F-Aktin
in polarisierten, neuralen Zellen lokalisiert.
Ergebnisse
48
Abbildung 17 Hmmr lokalisiert in der tiefen Zellschicht des Neuroektoderms mit Mikrotubuli und F-Aktin In situ Hybridisierung und immunfluoreszente Färbung in Neurulae. (A-C) Expression von hmmr im
angegebenen Stadium (St.) in frontaler Ansicht. (A‘-C‘, A‘‘) Transversalschnitte der Embryonen in (A-C),
wie angedeutet (A‘-C‘) und Vergrößerung (A‘‘), wie in (A‘) eingezeichnet. Pfeile zeigen auf die
intermediären, tiefen (IT) Zellen. (D) Struktur von Xenopus Hmmr mit Mikrotubuli (MT)-Bindedomäne (rot)
und den basischen Regionen (grün). Die Bindestelle des Antikörpers (AK) ist angedeutet. (E-G, I, J)
Immunfluoreszenzfärbung von Hmmr. Sicht auf die Schnittkante des Kopfstückes von transversal
aufgeschnittenen Embryonen im St. 21. (E-G) Fluoreszente Färbung der Nuklei/der DNA in blau/cyan (E)
Endogenes Hmmr (rot) lokalisiert an der mitotischen Spindel (E). Ebenso überexprimiertes Hmmr (weiß)
(F), welches zusätzlich an cytoplasmatischen MT zu finden ist (G). (H) Schema eines
Transversalschnittes durch das Neuralrohr im St. 21 mit einer vergrößerten, apicobasal polarisierten Zelle
(H‘), wie in (H) angedeutet. (I1, 2, J1, 2) Endogenes Hmmr (rot) lokalisiert nahe der Plus-Enden von MT,
Ergebnisse
49
wie die Ko-Detektion von Mapre1 (EB1, grün, I1, 2) zeigt. Es kolokalisiert ebenfalls mit F-Aktin (grün, J1, 2)
in apikalen (a, J1) und basalen (b, J2) Bereichen der Zelle. Ausschnitte, wie in (H‘) angedeutet.
D = dorsal; l = links , r = rechts, v = ventral
II.17 hmmr wird für den zeitlich korrekten anterioren Neuralrohrschluss benötigt
Um die Rolle von hmmr beim verzögerten Neuralrohrschluss genauer untersuchen zu
können, wurde Embryos unilateral mit hmmr MO injiziert und zusammen mit
uninjizierten Kontrollen kultiviert, um das Entwicklungsstadium korrekt bestimmen zu
können. Die injizierten Embryonen wurden transversal auf Höhe des Tel-
/Diencephalons aufgeschnitten und die Schnittkante visualisiert. In Stadium 16, in
welchem sich in Zeitrafferfilmen ein erster Phänotyp zeigte, konnte auch in unilateral
injizierten und aufgeschnittenen Embryonen ein verzögerter Neuralrohrschluss
beobachtet werden. Die Neuralfalte auf der mit hmmr MO injizierten Seite war generell
flacher als auf der uninjizierten Kontrollseite, was darauf hindeutete, dass sich die
Zellen der Neuralfalte nicht korrekt elongiert hatten (Karfunkel, 1971). Zusätzlich war die
äußere Grenze der tiefen Zellschicht der Neuralplatte weiter von der Mittellinie entfernt,
als auf der Kontrollseite (ausgefüllte Pfeile in Abb. 18A). Auf einer Vergrößerung zeigte
sich, dass die sogenannte intermediäre superfizielle (IS) Zelle, welche die Grenze
zwischen neuralem und nicht-neuralem superfiziellen Ektoderm markiert (Schroeder,
1970), auf der uninjizierten Kontrollseite deutlich näher an der Mittellinie war als auf der
mit hmmr MO injizierten Seite (Pfeile in Abb. 18A‘).
Auf Embryonen im Stadium 19 wurde eine in situ Hybridisierung gegen snai1
durchgeführt. snai1 markiert sowohl die laterale als auch die mediale Neuralleiste,
wobei die sogenannte mediale Neuralleiste äquivalent zur IS Zelle ist (Linker et al.,
2000; Schroeder, 1970). Auch hierbei zeigte sowohl die tiefe als auch die superfizielle
Zellschicht der mit hmmr MO injizierten Seite eine Verzögerung in ihrer Bewegung zur
Mittellinie hin (Abb. 18B, B‘).
Um das Stadium 21 hatten sich die Neuralfalten in Kontrollen bereits geschlossen,
während mit hmmr MO injizierte Embryonen einen eindeutigen Phänotyp zeigten.
Dieser wurde bereits in der Hellfeldaufnahme, in welcher die pigmentierte, superfizielle
und die nicht-pigmentierte, tiefe Zellschicht des Neuroektoderms gut zu unterscheiden
waren, deutlich (Abb. 18C). Die Neuralfalte auf der Kontrollseite hatte sich aufgewölbt
und war zur Mittellinie hin invaginiert, während die mit hmmr MO injizierte Seite deutlich
Ergebnisse
50
weniger aufgewölbt war und keine Invagination zur Mittellinie zeigte (Abb. 18C).
Besonders deutlich zeigte dies ein Vergleich der IS Zellen (Pfeile in Abb. 18C). Die
laterale Grenze der tiefen Zellschicht der Neuralplatte zeigte zwar eine mediale
Bewegung, war aber auf der mit hmmr MO injizierten Seite immer noch breiter. Um die
Breite der Neuralplatte auf beiden Seiten zu quantifizieren, wurden die Nuklei in
unilateral injizierten Embryonen fluoreszent angefärbt und zusammen mit dem
koinjizierten Farbstoff visualisiert (Abb. 18C‘, D). Die Spitze des unter der Neuralplatte
liegenden Notochords diente als Referenz für die Mittellinie. Nach Messung der rechten
und linken Seite wurde das Verhältnis kalkuliert, was ergab, dass in unbehandelten
Embryonen beide Seiten gleich breit waren (Verhältnis circa 1, Abb. 18E). In unilateral
injizierten Embryonen hingegen wurde das Verhältnis auf 1.4 verschoben (Abb. 18E,
Kontrolle vs. hmmr MO: P = 2.17e-5). Eine Koinjektion von hmmr verschob das
Verhältnis wieder zurück auf 1.13 (Abb. 18D, E; hmmr MO vs. hmmr MO + hmmr: P =
0.001129, Kontrolle vs. hmmr MO + hmmr: P = 0.0043). Diese Koinjektion zeigte noch
einmal die Spezifität des hmmr MO, da ein Wiedereinbringen von hmmr den Phänotyp
signifikant retten konnte. Somit kam es durch den Funktionsverlust von hmmr zu einer
verringerten Aufwölbung der Neuralfalten und einer verringerten medialen Konvergenz
von superfiziellem als auch tiefem Ektoderm, was in einem verzögerten anterioren
Neuralrohrschluss resultierte.
Ergebnisse
51
Abbildung 18 hmmr wird für den zeitlich korrekten anterioren Neuralrohrschluss benötigt (A-D) Unilateral mit hmmr Morpholino (MO) injizierte Neurula-Embryos (injizierte Seite durch Stern
markiert) im angegebenen Stadium (St.). Sicht auf die Schnittkante nach transversalem Öffnen der
Embryonen im Vorder-/Mittelhirnbereich. Orange, gestrichelte Linie markiert die Mittellinie. Pfeilköpfe
deuten auf die intermediäre, superfizielle (IS) Zelle und die weißen, gestrichelten Linien verdeutlichen das
tiefe und superfizielle Neuroektoderm. (A, C‘, D) Pfeile und Linien verdeutlichen die breitere Neuralplatte
(NP) nach hmmr MO Injektion (A, C‘) und die wieder gleich breiten Seiten nach Koinjektion mit hmmr (D).
(A-A‘) Immunfluoreszente Färbung von acetyliertem α-Tubulin (ac. Tuba4a, rot) und γ-Tubulin (Tubg1,
grün) sowie fluoreszente Färbung der Nuklei (weiß) im St. 16. (A‘) Vergrößerung eines Ausschnittes wie
in (A) angedeutet. Deutlich wird die breitere, injizierte Seite. (B) in situ Hybridisierung im St. 19 mit
antisinn-Sonde gegen snai1 und transversaler Vibratomschnitt (B‘) wie in (B) angedeutet. (C)
Hellfeldaufnahme im St. 21. Die IS Zelle der injizierten Seite ist nicht korrekt invaginiert. (C‘, D) Aufnahme
der fluoreszent angefärbten Nuklei (weiß) und des koinjizierten Farbstoffes (lineage tracer, rot). (E)
Statistische Auswertung des Verhältnisses von rechter und linker Neuralplattenbreite.
D = dorsal, l = links; N = Zahl der Embryonen; n= Anzahl der unabhängigen Experimente; r = rechts; v =
ventral
Ergebnisse
52
II.18 Der Sonic-hedgehog-Signalweg und primäre Cilien sind nach hmmr Funktionsverlust unverändert
Anteriore Neuralrohrschlussdefekte sind oft mit Ciliendefekten assoziiert, insbesondere
wenn diese mit dem Cilien-basierten Sonic-hedgehog (Shh)-Signalweg
zusammenhängen (Chung et al., 2012; Park et al., 2006). Aus diesem Grund wurden
die direkten transkriptionellen Zielgene des Shh-Signalwegs shh und patched1
analysiert. Allerdings konnte keine veränderte Expression nach unilateraler hmmr MO
Injektion festgestellt werden (Abb. 19A, B). Die shh-Expression war weiterhin in der
ventralen Mittellinie des Vorder-/Mittelhirns lokalisiert, obwohl die Morphanten die
charakteristische Verzögerung der IS Zell-Invagination aufwiesen (Abb. 19A). Auch das
Shh-Zielgen patched1 war unverändert exprimiert (Abb. 19B). Morphanten des Cilien-
assoziierten Transkriptionsfaktors rfx2 zeigten in Studien kürzere primäre Cilien auf
neuroepithelialen Zellen, was zu einer gestörten Aktivierung von Shh-Zielgenen führt
(Chung et al., 2012). Deshalb wurden auch die primären Cilien auf dem Neuroepithel
während des Neuralrohrschlusses nach hmmr MO Injektion untersucht. Jedoch ergab
die Messung der Cilienlänge keinen Unterschied zwischen injizierter und uninjizierter
Seite (Abb. 19C, P = 0.1486). Da Hmmr ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein ist, könnte
es auch über eine Lokalisation an Cilien bestimmte Funktionen ausüben. Allerdings
lokalisierte Hmmr in Fluoreszenzfärbungen von Hmmr und acetyliertem α-Tubulin nicht
an Cilien (nicht gezeigt).
Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass der verzögerte, anteriore
Neuralrohrschluss und die HPE nach hmmr MO Injektion nicht aufgrund von
Ciliogenesedefekten oder einem gestörten Shh-Signalweg zustande kamen.
Ergebnisse
53
Abbildung 19 Der Sonic-hedgehog-Signalweg und primäre Cilien sind nach hmmr Funktionsverlust unverändert (A-B) Transversale Vibratomschnitte nach in situ Hybridisierung auf Embryonen im Stadium (St.) 20, die
mit hmmr MO injizierte Seite ist durch einen Stern markiert. Antisinn-Sonden gegen sonic hedgehog (shh,
A) und patched1 (ptch1, B) zeigen keine Unterschiede zwischen uninjizierter und injizierter Seite. Pfeile
deuten auf die intermediäre, superfizielle Zelle. (C) Statistische Auswertung der Länge primärer Cilien
des Neuroepithels auf uninjizierter und injizierter Seite.
A = anterior; l = links; N = Zahl der gemessenen Cilien; n = Anzahl der Embryonen; n.s. = nicht
signifikant; p = posterior; r = rechts
II.19 hmmr wird für Zellpolarisation und Elongation benötigt Bei vorangegangener Analyse war zu beobachten, dass die Lokalisation primärer Cilien
in mit hmmr MO injizierten Embryonen verändert ist. Üblicherweise lokalisieren primäre
Cilien in epithelialen Zellen an der apikalen Plasmamembran und anterior des Nukleus
in migrierenden Zellen. Somit kann die Lokalisation des Ciliums als Indikator für die
Polarisierung der Zelle herangezogen werden (Bornens, 2008). Um dies nach Injektion
mit hmmr MO auszuwerten, wurden aufeinanderfolgende Bilder eines konfokalen Z-
Stapels verwendet und in einzelnen Zellen Pfeile vom Mittelpunkt des Nukleus zur
Basis des Ciliums eingezeichnet (Abb. 20A, A‘). In neuroepithelialen Kontrollzellen
befand sich das primäre Cilium stets in einiger Entfernung zum Nukleus. Ein Vektor
welcher Nukleus und Cilienbasis verbindet zeigte in Richtung Mittellinie (Abb. 20A, B).
Somit wiesen die Kontrollzellen eine Elongation und Polarisierung in Richtung der
Mittellinie auf. Im Gegensatz dazu war in Zellen nach Funktionsverlust von hmmr die
Distanz zwischen Nukleus und primärem Cilium deutlich reduziert. Zusätzlich zeigten
Ergebnisse
54
die Vektoren zwischen Nukleus und Cilienbasis in unterschiedliche Richtungen (Abb.
20A‘, C), was auf eine reduzierte Elongation und Polarisierung hinwies.
Da Hmmr ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein ist, könnte die Reduktion neuroepithelialer
Zellpolarisierung auf Veränderungen im Mikrotubuli-Cytoskelett beruhen. Ein Vergleich
im Stadium 20 zeigte in Kontrollzellen ein geordnetes Netzwerk an Mikrotubuli, welche
hauptsächlich entlang der apicobasalen (ventrikulär-pialen) Achse der Zelle angeordnet
waren und in Bündeln entlang des lateralen Zellcortex verliefen. Zudem zeigte sich,
dass die Zellen entlang ihrer apicobasalen Achse elongiert waren (Abb. 20D). Im
Gegensatz dazu waren mit hmmr MO injizierte Zellen nicht elongiert, sondern blieben
kurz und rund. Das Mikrotubuli-Cytoskelett war desorganisiert mit gleichmäßig verteilten
Mikrotubuli im Cytoplasma (Abb. 20D‘).
Da die Plasmamembran, das Cytoskelett und der Nukleus mechanisch gekoppelt sind
(Mellad et al., 2011), kann die Form des Nukleus als zusätzliche Information für die
Zellform/Zellelongation verwendet werden. Dafür wurde der maximale Feret-
Durchmesser der Nuklei im Stadium 20 ermittelt (Abstand paralleler Tangente, welche
ein Objekt senkrecht zur Messrichtung begrenzen, Fmax, vergleiche Abb. 20E) und
durch den minimalen Feret-Durchmesser (Abstand paralleler Tangente welche ein
Objekt begrenzen, orthogonal zum Fmax, Fmin, vergleiche Abb. 20E) geteilt, wodurch das
Verhältnis beider zueinander ermittelt werden konnte. Die Nuklei uninjizierter Zellen
hatten die typische, entlang der apicobasalen Achse elongierte Form und waren
ungefähr doppelt so lang wie breit (Abb. 20E, F). In mit hmmr MO injizierten Zellen
hatten die meisten Nuklei eine runde Form und die wenigen, elongierten Nuklei waren,
wie auch die Zellen, nicht entlang der apicobasalen Achse ausgerichtet (Abb. 20E‘, F).
Entsprechend lag auch das Verhältnis von maximalem Feret- zu minimalem Feret-
Durchmesser näher bei 1 (absolut runde Form) (Abb. 20F, P = 2,817e-08). Damit
spiegelte die Form der Nuklei die Ausrichtung des Mikrotubulicytoskeletts in
Neuroepithelzellen wider, was erneut zeigte, dass die Zellen nach Funktionsverlust von
hmmr weniger polarisiert und elongiert waren.
Ergebnisse
55
Abbildung 20 hmmr wird für Zellpolarisation und Elongation benötigt (A, A‘, D, D‘, E, E‘) Sicht auf die Schnittkante des Kopfstückes von transversal aufgeschnittenen
Embryonen im Stadium (St.) 20. (A, A‘) Immunfluoreszente Färbung von acetyliertem α-Tubulin (ac.
Tuba4a, rot) und γ-Tubulin (Tubg1, grün) sowie fluoreszente Färbung der Nuklei (cyan) auf uninjizierter
Kontrollseite (A) und auf mit hmmr Morpholino (MO) injizierter Seite (A‘). Vektoren verbinden die Mitte
des Nukleus (weiß umrandet) mit der Basis des Ciliums und verdeutlichen den Polarisierungsgrad der
Zelle. (B, C) Auswertung der Zellpolarisation wie in (A) und (A‘) durch Vektoren angedeutet. (D, D‘)
Immunfluoreszente Färbung von Tuba4a (weiß). Mikrotubuli sind auf der Kontrollseite (D) entlang der
ventrikulär (v) - pialen (p) Achse ausgerichtet und ungeordnet auf der mit hmmr MO injizierten Seite (D‘).
(E-E‘) Fluoreszente Färbung der Nuklei (cyan) zeigt Elongation dieser auf der uninjizierten Kontrollseite
(E) und ihre runde Form auf der mit hmmr MO injizierten Seite (E‘, lineage tracer in rot). In (E) sind
exemplarisch der maximale Feret-Durchmesser (Fmax) und der minimale Feret-Durchmesser (Fmin) an
einem Nukleus eingezeichnet. (F) Statistische Auswertung des Verhältnisses von Fmax zu Fmin auf der
uninjizierten und injizierten Seite.
Inj. = injiziert; N = Zahl der Nuklei; n= Anzahl der Embryonen; uninj. = uninjiziert
II.20 hmmr wird für die Zell-Matrix-Adhäsion benötigt Die beobachtete Abrundung von Zellen nach Funktionsverlust von hmmr könnte ein
Hinweis auf eine gestörte Zelladhäsion sein. hmmr ist in Neuralleistenzellen (NLZ)
exprimiert (Casini et al., 2010) und diese stellen ein geeignetes Modellsystem dar, um
Ergebnisse
56
die Adhäsion an extrazellulärer Matrix, wie zum Beispiel Fibronectin (Fn1), zu testen.
Um die mögliche veränderte Adhäsion an der extrazellulären Matrix nach
Funktionsverlust von hmmr zu überprüfen, wurden craniale NLZ explantiert und auf mit
Fn1 beschichteten Oberflächen kultiviert. Über einen Zeitraum von mindestens vier
Stunden wurden Zeitrafferfilme von Kontroll- und mit hmmr MO injizierten NLZ-
Explantaten angefertigt. Kontrollzellen zeigten dabei die für Xenopus-NLZ typische
kollektive Zellmigration (Theveneau und Mayor, 2012a). Die Zellen emigrierten aus dem
Explantat, bildeten Zellfortsätze, stellten zeitweise Kontakt zu benachbarten Zellen her
und migrierten vom Explantat weg (Abb. 21A, A‘, At1-At4, Film 5). Mit hmmr MO injizierte
NLZ zeigten dieses charakteristische Migrationsmuster nicht. Bereits zu Beginn der
Aufnahme, 30 Minuten nach Explantation, hatten viele mit hmmr MO injizierte Zellen
den Kontakt zum Substrat verloren und rundeten sich ab (Abb. 21B). Die verbleibenden,
anhaftenden Zellen bedeckten eine um 40 % kleinere Fläche als Kontrollzellen (Abb.
21B‘, C, P = 8.156e-07). Auch bildeten diese Zellen weniger oft Zellfortsätze und Kontakt
mit Nachbarzellen aus (Abb. 21Bt1-Bt4, Film 5).
Aus diesen Ergebnissen kann somit geschlussfolgert werden, dass der Funktionsverlust
von hmmr die Adhäsion von NLZ an der extrazellulären Matrix verringert.
Auch in vivo wurde eine reduzierte Zell-Matrix-Adhäsion beobachtet. In
Kontrollembryonen bildete das Basalmembranprotein Fn1 ein dichtes Netz geordneter
Fibrillen um das basale und laterale Neuralrohr (Abb. 21D). Nach Injektion von hmmr
MO lösten sich die Zellen von der Basalmembran, was eine Lücke zwischen den Zellen
und der Basalmembran entstehen ließ (Stern in Abb. 21E). Auch bildete Fn1 nur noch
wenige, dicke Fibrillen anstatt des feinen Netzes.
Ergebnisse
57
Abbildung 21 hmmr wird für die Zell-Matrix-Adhäsion benötigt (A-A’, B-B’) Neuralleistenzell (NLZ)-Explantate von Kontrollen (A-A’) und mit hmmr Morpholino (MO)
injizierten Embryonen (B-B’) zum Zeitpunkt (t) 30 Minuten (min) nach Explantation (A-B) und nach 4
Stunden (h) Kultur (A’-B’). (At1-At4) Einzelne Zelle des NLZ-Explantats aus (A) zu vier verschiedenen
Zeitpunkten der Kultur. (Bt1-Bt4) Einzelne Zelle des NLZ-Explantats aus (B) zu vier verschiedenen
Zeitpunkten der Kultur. Deutlich werden die reduzierte Zellfläche und weniger Zellfortsätze im Vergleich
mit (At1-At4). (C) Statistische Analyse der Zellfläche von einzelnen Zellen in Kontroll- und mit hmmr MO
injizierten NLZ-Explantaten. (D-E) Sicht auf die Schnittkante des Kopfstückes von transversal
aufgeschnittenen Embryonen im Stadium (St.) 20. Immunfluoreszente Färbung von Fibronectin (Fn1,
grün) und fluoreszente Färbung der Nuklei (cyan). Das dichte Fn1-Netz von Kontrollen (D) ist stark
reduziert nach Injektion von hmmr MO (E); fluoreszenter Farbstoff (lineage tracer) markiert injizierte
Zellen (rot, E). Stern deutet auf Lücke zwischen Zellen und der Basalmembran.
N = Zahl der Embryonen; n = Anzahl der unabhängigen Experimente
Ergebnisse
58
II.21 hmmr wird für die Zell-Zell-Adhäsion benötigt Neben der reduzierten Zell-Matrix-Adhäsion zeigten mit hmmr MO injizierte Zellen
weniger Zell-Zell-Kontakte (Abrundung und Ablösung) und die für Xenopus-NLZ
charakteristische, kollektive Zellmigration konnte nicht beobachtet werden (Film 5). Der
Zell-Zell-Kontakt kollektiv migrierender Zellen wird durch N-Cadherin (Cdh2) vermittelt
(Theveneau und Mayor, 2012b). Dieses Calcium-abhängige Adhäsionsmolekül
lokalisiert an der Zellmembran, wie es in Kontrollzellen zu beobachten war (Abb. 22A,
A‘) und war stark reduziert in mit hmmr MO injizierten Zellen (Abb. 22A, A‘‘). Durch die
Lokalisierung von Hmmr an Mikrotubuli Plus-Enden am Zellkortex, wird die Annahme
unterstützt, dass Hmmr für eine durch Mikrotubuli-vermittelte Zelladhäsion benötigt
werden könnte.
Auch die nicht-migratorischen, neuroepithelialen Zellen sind positiv für Cdh2 und haben
Kontakt zu einem ausgedehnten Fn1-Netzwerk (Abb. 21D, E, Abb. 22A; Davidson et al.,
2004). Um nun den Effekt des Funktionsverlusts von hmmr auf die Zell-Zell-Adhäsion in
nicht-migrierenden neuroepithelialen Zellen zu testen, wurden Neuralplatten (NP)-
Explantate auf einer mit Fn1 beschichteten Oberfläche für mindestens drei Stunden
kultiviert (Abb. 22B-D). Im Gegensatz zu NLZ-Explantaten emigrierten die NP-Zellen
nicht aus dem Explantat, sondern bildeten ein rundes Konglomerat an Zellen (Abb. 22B,
B‘). Da sich die Zellen der superfiziellen Schicht apikal einschnürten, bildete sich eine
mediale Ansammlung von Pigment (Abb. 22B, B‘). Explantate von mit hmmr MO
injizierten NP resultierten hingegen in einem Phänotyp, welcher den NLZ-Explantaten
glich (Abb. 22C, C‘). In fünf von fünf Fällen lösten sich abgerundete Zellen aus dem
Explantat und sammelten sich in der Umgebung an. Da die Zellen der superfiziellen
Schicht keiner apikalen Konstriktion unterlagen, zeigte sich weder eine Akkumulierung
von Pigment noch eine Kegelform. Allerdings lösten sich diese superfiziellen Zellen
auch nicht vom Explantat, was der Beobachtung entsprach, dass der Funktionsverlust
von hmmr superfizielle Adhärenzverbindungen nicht beeinträchtigte (apikale
Lokalisation von Ctnnb1, nicht gezeigt). Durch die Koinjektion von hmmr MO und hmmr
konnte der Phänotyp in vier von fünf Fällen effizient gerettet werden, da sich nur noch
wenige Zellen vom Explantat ablösten (Abb. 22D, D‘). Dies zeigte zum wiederholten
Male die Spezifität des hmmr MOs. Die apikale Konstriktion konnte jedoch nicht
wiederhergestellt werden, was auf eine mögliche differentielle Rolle von hmmr im
superfiziellen und tiefen Neuroektoderm hindeutet.
Ergebnisse
59
Abbildung 22 Der Funktionsverlust von hmmr resultiert in verringerter Zell-Zell-Adhäsion
(A-A‘‘) Sicht auf die Schnittkante des Kopfstückes eines transversal aufgeschnittenen Embryos im
Stadium (St.) 20 mit immunfluoreszenter Färbung von N-Cadherin (Cdh2, rot). Der koinjizierte Farbstoff
(lineage tracer) fluoresziert grün, die Nuklei sind fluoreszent gefärbt (cyan). Injizierte Seite ist durch einen
Stern gekennzeichnet. (A‘-A‘‘) Cdh2 ist auf der injizierten Seite verringert (A‘‘) im Vergleich zur
Kontrollseite (A‘). Beide Bilder ohne grünen Kanal. (B-D) Neuralplatten-Explantate von Kontrollen (A), mit
hmmr MO (B) und mit hmmr MO + hmmr injizierten Embryonen zum Zeitpunkt (t) 30 Minuten (min) nach
der Präparation. (B‘-D‘) Die Explantate aus (B-D), nach drei Stunden (h) Kultur. Die Häufigkeit des
repräsentativen Phänotyps ist in jedem Bild angegeben (x / der Gesamtzahl an Explantaten).
Ergebnisse
60
II.22 Anoikis nach Funktionsverlust von hmmr Da sich sowohl aus kultivierten NLZ- und NP-Explantaten Zellen lösten, als auch
abgelöste Zellen basal vom Neuralrohr (Abb. 23A‘‘‘, A‘‘‘‘) und im Ventrikelsystem des
Hirns zu finden waren (Abb. 13K, 14B), sollte weiterhin deren Schicksal untersucht
werden. In getroffenen Zellen mit runder Morphologie (markiert durch den fluoreszenten
Farbstoff), welche begonnen hatten sich abzulösen, zeigte die Immunfärbung zur
Detektion des Apoptosemarkers cleaved Caspase 3 ein schwaches Signal (Abb. 23A,
A‘, A‘‘). Vollständig runde und abgelöste Zellen zeigten ein starkes cleaved Caspase 3-
Signal (Abb. 23A, A‘‘‘, A‘‘‘‘), was darauf hindeutet, dass die Zellen nach Injektion von
hmmr MO aufgrund des Anhaftungsverlusts in eine bestimmte Form der Apoptose
übergehen, der sogenannten Anoikis (Taddei et al., 2012).
Aus den Daten kann gefolgert werden, dass die Abstoßung neuroepithelialer Zellen aus
Explantaten, dem Neuralrohr und den Ependym im Hirn nach Funktionsverlust von
hmmr sowohl aufgrund verringerter Zell-Zell-Kontakte als auch aufgrund verringerter
Zell-Matrix-Adhäsion zustande kam. Zusammen führte dies zu einer Form des
programmierten Zelltods, der Anoikis.
Abbildung 23 Anoikis nach Funktionsverlust von hmmr
(A-A‘‘‘‘) Sicht auf die Schnittkante des Kopfstückes eines transversal aufgeschnittenen Embryos im
Stadium (St.) 25. Injizierte Seite ist durch einen Stern gekennzeichnet. Immunfluoreszenter Färbung von
cleaved Caspase 3 (cl. Casp3, grün) und fluoreszente Färbung der Nuklei (cyan), der koinjizierte
Farbstoff (lineage tracer) fluoresziert rot. Nicht injizierte Zellen zeigen kein cl. Casp3 Signal.
(A‘-A‘‘) Vergrößerungen der Region aus (A) wie durch Box angedeutet (A‘) und selber Ausschnitt ohne
den roten Kanal (A‘‘). Die leicht abgerundete Zelle (weiß umrandet) zeigt ein schwaches cl. Casp3 Signal.
Ergebnisse
61
(A‘‘‘-A‘‘‘‘) Vergrößerungen der Region aus (A) wie durch Box angedeutet (A‘‘‘) und selber Ausschnitt ohne
den roten Kanal (A‘‘‘‘). In abgelösten Zellen außerhalb des Neuralrohrs findet sich ein starkes cl. Casp3
Signal.
In Summe zeigten diese Daten, dass hmmr eine wichtige Rolle während der
Neurulation in Vertebraten spielt und der Funktionsverlust zu anomaler Neurulation und
einer Shh-unabhängigen Vorderhirnfehlbildung - der HPE - führt. Diese wurde von
einem Hydrocephalus begleitet. Nach dem Funktionsverlust von hmmr waren durch
Mikrotubuli-vermittelte Prozesse wie apicobasale Zellelongation, -polarisation und
-migration gestört. Dies resultierte in verringerter Zell-Matrix- sowie Zell-Zell-Adhäsion
neuroepithelialer Zellen und damit in Anoikis. Dies alles deutet auf eine Mikrotubuli-
assoziierte Funktion von hmmr während der anterioren Neuralrohrentwicklung hin.
II.23 Der Funktionsverlust von hmmr in späten Entwicklungsstadien Neben diesen frühen Effekten, welche zu HPE und Hydrocephalus führten, bestand
weiterhin die Möglichkeit, dass ein Hydrocephalus unabhängig von Effekten während
der Neurulation in späteren Entwicklungsstadien enstanden war. Zusätzlich wurde in
Hirnen im Stadium 45 die Ablösung von Zellen aus dem ventrikulären Epithel und die
Akkumulation dieser im Ventrikel beobachtet (Abb. 13K, 14B). Daher wurde
abschließend untersucht, welche Auswirkung der Funktionsverlust von hmmr auf Zellen
der Ventrikularzone hat.
II.23.1 Radiäre Glia in der proliferativen Zone des Hirns von Xenopus In der Maus bilden die Zellen der Ventrikularzone des lateralen Ventrikels, die
sogenannten radiären Glia, bereits während der Entwicklung des Hirns eine
Stammzellnische (Mirzadeh et al., 2008). Radiäre Glia durchspannen mit ihren
Fortsätzen die gesamte Wand des Hirns und dienen neu gebildeten Neuronen als
Migrationswege. Zusätzlich sind diese Zellen hochproliferativ und positiv für das Hirn-
spezifische Lipid-Bindeprotein (brain lipid binding protein, Fabp7), welches als essentiell
für die Ausbildung der Fortsätze von radiären Glia angesehen wird (Feng et al., 1994).
Da hmmr bereits in der proliferativen Zone des Neuralrohrs bei Xenopus
beschrieben/detektiert wurde (Casini et al., 2010, vergleiche Abb. 11), interessierte es
besonders, ob auch hier eine vergleichbare proliferative Zone mit radiären Glia existiert.
Um dies zu überprüfen, wurden transversale Cryotomschnitte von prämetamorphischen
Ergebnisse
62
und adulten Hirnen angefertigt und darauf eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt.
In Hirnen des Stadiums 45 konnte bereits durch das Anfärben der Nuklei eine
Verdichtung von Zellen um den Ventrikel im Diencephalon festgestellt werden (Abb.
24A, A‘). Der Antikörper gegen das nukleäre Antigen proliferierender Zellen
(proliferating cell nuclear antigen, Pcna) zeigte, dass sich in dieser ventrikulären Zone
eine Vielzahl proliferierender Zellen befand, es sich also um eine proliferative Zone
vergleichbar wie in der Maus handelt (Abb. 24A). Auch konnten über den Fabp7-
Antikörper die Zellkörper radiärer Glia in der proliferativen Zone detektiert werden,
deren Fortsätze durch das Hirn bis zu den Meningen zogen (Abb. 24A, A‘‘).
Ein Transversalschnitt durch das wesentlich größere Hirn adulter Frösche auf Höhe der
lateralen Ventrikel ist in Abbildung 24B schematisch dargestellt. Auch hier waren die
Zellkerne vergleichbar zu jüngeren Hirnen um den Ventrikel verdichtet, so dass auch
hier auf eine proliferative Zone geschlossen werden kann (Abb. 24C).
Abbildung 24 Radiäre Glia in der proliferativen Zone des Hirns von Xenopus
Immunfluoreszente Färbung von transversalen Cryotomschnitten des Hirns im Stadium (St.) 45 (A-A‘‘)
und im adulten Hirn (C). (A) Färbung des Hirn spezifischen Lipid-Bindeproteins/von radiären Glia (Fabp7,
grün), des nukleäre Antigens proliferierender Zellen (Pcna, rot) sowie fluoreszente Färbung der Nuklei
(blau) zeigen eine proliferative Zone um den Ventrikel im Diencephalon. Von dort ziehen die Fortsätze
der radiären Glia bis zu den Meningen. (A‘) Nur blauer Kanal aus (A). (A‘‘) Vergrößerung der pialen
Region des Hirns wie in (A) eingezeichnet, zeigt Fortsätze der radiären Glia. (B) Schema eines
transversalen Schnittes durch das adulte Xenopus-Hirn (abgeändert aus Monteforte et al., 2010). (C)
Linke Hemisphäre eines adulten Hirns mit fluoreszenter Färbung der Nuklei (blau) wie in (B)
eingezeichnet. Zu erkennen ist die Verdichtung der Nuklei um den Ventrikel.
D = dorsal; l = links; r = rechts; v = ventral
Ergebnisse
63
II.23.2 Radiäre Glia sind nach Funktionsverlust von hmmr reduziert Die generelle Auswirkung des Funktionsverlustes von hmmr auf das Vorderhirn mit
Verlust der ventrikulären Strukturen legte nahe, dass auch die proliferativen Zonen
betroffen sein könnten. Zur weiteren Analyse der radiären Glia wurden daher
transversale Cryotomschnitte auf Höhe der lateralen Ventrikel in unilateral injizierte
Embryonen im Stadium 45 angefertigt und erneut radiäre Glia und Nuklei angefärbt. Auf
der uninjizierten Kontrollseite lokalisierten radiäre Glia wie erwartet in der proliferativen
Zone um den lateralen Ventrikel (Abb. 25A, A‘). Auf der injizierten Seite wurden deutlich
weniger radiäre Glia detektiert (Abb. 25A, A‘). Auch die statistische Auswertung
spiegelte diese Tendenz wider. So waren die radiären Glia auf der mit hmmr MO
injizierten Seite des Embryos signifikant reduziert im Vergleich zur uninjizierten Seite
(Abb. 25B, P = 0.021, unkorrigiert). Auch im Vergleich mit einem uninjizierten
Kontrollembryo zeigte sich diese signifikante Veränderung (Abb. 25B, P = 0.021,
unkorrigiert).
Aus diesen präliminären Ergebnissen kann also der Schluss gezogen werden, dass
hmmr für den Erhalt embryonaler, neuraler Stammzellen - der radiären Glia - notwendig
ist.
Ergebnisse
64
Abbildung 25 Radiäre Glia sind nach Funktionsverlust von hmmr reduziert
Immunfluoreszente Färbung von transversalem Cryotomschnitt des Hirns im Stadium (St.) 45. (A)
Färbung des Hirn-spezifischen Lipid-Bindeproteins/von radiären Glia (Fabp7, grün) und fluoreszente
Färbung der Nuklei (blau). Die injizierte Seite, durch Stern gekennzeichnet, zeigt deutlich weniger radiäre
Glia in der proliferativen Zone. (A‘) Nur grüner Kanal aus (A). (B) Statistische Auswertung von mehreren
Cryotomschnitten pro Embryo (Zahl der Schnitte im Balkendiagramm).
D = dorsal; l = links; N = Anzahl der Embryonen; n = Anzahl der unabhängigen Experimente; n.s. = nicht
signifikant; r = rechts; uninj. = uninjiziert; v = ventral
Ergebnisse
65
II.24 Legenden der Filme Film 1 Die Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung im vierten Ventrikel
Der Film verdeutlicht die Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung im vierten Ventrikel eines unbehandelten
Kontrollembryos im Stadium 46 nach Injektion fluoreszenter Latexmikrosphären. Die Fokusebene bewegt
sich in fünf Schritten von dorsal (d) nach ventral (v). Dies wird durch die rote Linie im schematischen
Querschnitt durch den vierten Ventrikel, welcher im kleinen Bild gezeigt ist, verdeutlicht. Jedes Bild des
Films beinhaltet 20 aufeinander folgende Rohbilder, die von rot nach grün farblich kodiert und auf ein
einzelnes Bild projiziert wurden. Dafür wurde eine Nutzerabwandlung des „Temporal-Color Coder“ (Kota
Miura, EMBL, Heidelberg) Zusatzprogramms für Fiji verwendet. Die CSF bewegt sich direkt unterhalb des
dorsalen Dachs nach rostral, wechselt ihre Richtung in medialen Fokusebenen und strömt in den
ventralen Fokusebenen wieder nach caudal. Der Film läuft in Echtzeit.
A = anterior; p = posterior Film 2 Die Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung wird durch motile Cilien generiert
Der Film zeigt die nach caudal gerichtete Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung an der ventralen Mittellinie
(mediale Region des Films) und an den Rhombomeren (laterale Region des Films) im vierten Ventrikel.
Explantierte Hirne wurden entlang der dorsalen Mittellinie eröffnet, das Dach wurde entfernt und das Hirn
flach in eine Latexmikrosphären-haltige Lösung eingebettet (vergleiche Material und Methoden). Der Film
startet mit einem Hellfeldbild der gefilmten Region, gefolgt von der Bewegung der fluoreszenten
Latexmikrosphären und endet in einer Z-Projektion aller aufgenommenen Bilder. Die Unterbrechung und
Wiederaufnahme der langsamen, seitlichen CSF-Strömung durch motile Cilien in den
Rhombomergrenzen (durch weiße, gestrichelte Linien angedeutet) wird im Film und besser in der finalen
Z-Projektion sichtbar. Der Film läuft in Echtzeit.
A = anterior; p = posterior
Film 3 Der Funktionsverlust von foxj1 verlangsamt die Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung im vierten Ventrikel Der Film zeigt einen Vergleich der Cerebrospinalflüssigkeits-Strömung am Dach des vierten Ventrikels
zwischen uninjizierten Kontrollen (co/Ko), mit Kontroll-Morpholino (coMO/KoMO) und mit foxj1 Morpholino
(foxj1 MO) injizierten Embryonen. Die mit KoMO und foxj1 MO injizierten Embryonen sind dieselben, wie
in Abbildung 9 D-G und F‘, G‘ abgebildet. Der Film startet und endet mit einer Maximum-Z-Projektion aller
Bilder. Jedes Bild des Films beinhaltet 20 aufeinander folgende Rohbilder, die von rot nach grün farblich
kodiert und auf ein einzelnes Bild projiziert wurden. Dafür wurde eine Nutzerabwandlung des „Temporal-
Color Coder“ (Kota Miura, EMBL, Heidelberg) Zusatzprogramms für Fiji verwendet. In Kontroll- und mit
KoMO injizierten Embryonen zeigt sich eine schnelle, anteriore Bewegung der Latexmikrosphären,
während mit foxj1 MO injizierte Embryonen nur eine langsame und aberrante Bewegung der
Latexmikrosphären zeigen. Der Film läuft zuerst in Echtzeit und wird anschließend mit einem Fünftel der
Originalgeschwindigkeit wiederholt.
A = anterior; p = posterior
Ergebnisse
66
Film 4 Verzögerter, anteriorer Neuralrohrschluss nach Funktionsverlust von hmmr Der Film zeigt einen Kontrollembryo (links) und einen mit hmmr Morpholino (MO) injizierten Embryo
(rechts) während der Neurulation. Er startet im Stadium 13, beide Embryonen sind im selben Stadium
und weisen keinerlei Unterschiede in der Entwicklung auf. Anschließend wurde ein Bild pro Minute
aufgenommen bis der Kontrollembryo das Stadium 20 erreicht hatte. Die Verzögerung des
Neuralrohrschlusses beim mit hmmr MO injizierten Embryo wird ab Stadium 16 deutlich.
Film 5 Adhäsion und Migration sind in Neuralleisten aus hmmr Morphanten reduziert Der Film zeigt Neuralleistenzell-Explantate einer Kontrolle (links) und eines mit hmmr Morpholino (MO)
injizierten Embryos (rechts). Die erste Aufnahme wurde 30 Minuten nach Explantation gemacht und die
Kultur dann für weitere vier Stunden mit je einem Bild pro Minute gefilmt.
Diskussion
67
III Diskussion In vorliegender Arbeit wurde die zentrale Frage nach den pathologischen Ursachen und
Mechanismen, welche der Entstehung eines Hydrocephalus unterliegen, untersucht.
Dafür wurde eine grundlegende, morphologische Analyse der Biogenese motiler Cilien
durchgeführt. Darüber hinaus wurde die durch Cilienbewegung getriebene Strömung
der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) charakterisiert. Die Analyse des Funktionsverlusts
von hmmr sollte Aufschluss darüber geben, inwiefern eine Regulation der
Cilienschlagfrequenz für die physiologischen Funktionen der CSF-Strömung notwendig
ist.
III.1 Die Expression von foxj1 korreliert zeitlich und räumlich mit der Ausbildung elongierter Cilien
foxj1 war bereits vor Ausbildung elongierter Cilien in einem distinkten Muster exprimiert.
Dies war äquivalent zum bereits beschriebenen Expressionsmuster in der Maus
(Jacquet et al., 2009; Lim et al., 1997). Zusammengefasst geht die Expression von
Foxj1/foxj1 somit der Bildung ependymaler Cilien sowohl in Maus als auch in Xenopus
voran. Wird davon ausgegangen, dass der Beginn der Metamorphose in Amphibien in
etwa der Geburt bei Säugetieren entspricht, korreliert auch die zeitliche Ausprägung der
Expression von Foxj1/foxj1 in Maus und Xenopus.
Die Multicilierung des Ependyms in Xenopus entwickelte sich erst spät in Regionen mit
andauernder Expression von foxj1. Diese Beobachtung stimmt damit überein, dass
niedrige Expressionslevel von foxj1 Zellen dazu induzieren, ein elongiertes, motiles
Monocilium auszubilden (Stubbs et al., 2008). Das Umschalten der Zelle von einem
elongierten, motilen Monocilium zu multiplen, motilen Cilien benötigt zusätzlich die
Expression des Zell-Zyklus-Regulators Mcidas (Stubbs et al., 2012).
Da in vorliegender Arbeit bereits die Regionen und das Auftreten erster Multicilien-
tragender Zellen (MCZ) identifiziert wurden, wäre es interessant, die mcidas Expression
im Xenopus-Hirn zu untersuchen.
Diskussion
68
III.2 Die Bewegung der Cerebrospinalflüssigkeit wird durch motile Cilien generiert
Eine Strömung der CSF im Hirn von Xenopus wurde bereits in zwei Studien
beschrieben (Miskevich, 2010; Mogi et al., 2012). Basierend auf Cilierungsanalysen der
Ventrikel anderer Anurenarten (Gona und Hauser, 1982; Nelson und Wright, 1974)
wurden motile Cilien als Ursache der CSF-Strömung vorgeschlagen.
Alternativ dazu wurde der Herzschlag als möglicher Regulator der CSF-Strömung
genannt. So hatte sich gezeigt, dass die Betäubung von Embryonen mit MS-222 in
verlangsamtem oder fehlendem Herzschlag resultierte und sich die
Strömungsgeschwindigkeit der CSF gleichzeitig von 77 µm/s auf 11 µm/s verlangsamte
(Miskevich, 2010). Jedoch lässt die Beobachtung des fehlenden Herzschlages darauf
schließen, dass in genannter Studie eine zu hohe Dosis von MS-222 eingesetzt wurde
und die Embryonen als Konzequenz einen Herzstillstand erlitten hatten. Cilienmotilität
bleibt jedoch auch noch einige Zeit nach dem Erliegen des Kreislaufsystems erhalten.
Allerdings ist MS-222 auch dafür bekannt, wässrige Lösungen anzusäuern. Ein
niedriger pH-Wert senkt wiederum die Cilienschlagfrequenz, was in einer
verlangsamten Strömungsgeschwindigkeit der CSF resultiert (Clary-Meinesz et al.,
1998). In vorliegender Arbeit wurde deshalb Benzocain als Anästhetikum eingesetzt.
Zusätzlich wurde die experimentelle Durchführung dahingehend optimiert, dass Dosis
(< 0,01 %) und Expositionszeit (< 5 min) minimal gehalten werden konnten. Die im
Vergleich zu den vorangegangenen Studien wesentlich höhere durchschnittlich
gemessene Strömungsgeschwindigkeit der CSF (450 µm/s) könnte also durch das
Vermeiden unspezifischer Effekte auf pH-Wert und Cilienschlagfrequenz erklärt werden.
Zusammen mit der Beobachtung einer signifikant verlangsamten
Strömungsgeschwindigkeit der CSF nach Funktionsverlust von foxj1 wird somit aus den
vorliegenden Daten der Schluss gezogen, dass die CSF-Strömung durch
Cilienbewegung als einzigen Antrieb generiert wird.
III.3 Wie kann ciliäre Dysfunktion Hydrocephalus induzieren? Der Funktionsverlust von foxj1 erzeugte eine deutlich verlangsamte CSF-Strömung im
vierten Ventrikel, begleitet von einem Hydrocephalus. Bereits gut untersucht ist, dass
Mutationen in Cilien-assoziierten Genen zu Hydrocephalus führen können (Olbrich et
Diskussion
69
al., 2012). Die Mechanismen, wodurch ein Verlust motiler Cilien eine hydrocephalische
Erweiterung der Ventrikel bewirkt, sind allerdings nicht bekannt.
In den foxj1-Funktionsverlustexperimenten der vorliegenden Arbeit fehlten die Cilien nie
vollständig, sondern einige wenige elongierte Cilien besetzten weiterhin die Zellen der
Ventrikularzone. Als Folge dessen war die Strömungsgeschwindigkeit der CSF deutlich
verlangsamt.
Die rostral gerichtete CSF-Strömung am Dach des Rhombencephalons stellt die
stärkste Bewegung im gesamten Ventrikelsystem dar (450 µm/s im Gegensatz zu 160
µm/s am Plexus choroideus (PC) des dritten Ventrikels). Die kritische Grenze scheint
eine Strömungsgeschwindigkeit der CSF von 300 µm/s zu sein. Langsamere
Geschwindigkeiten der CSF-Strömung einzelner Embryonen korrelierten mit der
Entstehung eines Hydrocephalus im vierten Ventrikel. Fällt die
Strömungsgeschwindigkeit unter eine kritische Grenze von 300 µm/s, könnte somit die
Kraft, welche die CSF durch den Aquaeductus mesencephali (AM) in das Vorderhirn
lenkt, zu gering sein. Somit würde es zu einer Aufstauung der CSF im vierten Ventrikel
und schließlich zur Ventrikelerweiterung kommen.
Auch der Funktionsverlust von hmmr senkte die Strömungsgeschwindigkeit der CSF
unter eine Geschwindigkeit von 300 µm/s und induzierte Hydrocephalus im vierten
Ventrikel. Die unveränderte Cilierung des Rhombencephalondachs zeigte jedoch, dass
die Verlangsamung im Gegensatz zum foxj1-Phänotyp nicht durch Ciliogenesedefekte
bedingt war. Stattdessen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass hmmr im vierten
Ventrikel von Xenopus tatsächlich die Cilienschlagfrequenz regulieren könnte. Für
HMMR wurde bereits gezeigt, dass es in Abhängigkeit von oligomerer Hyaluronsäure
die Schlagfrequenz von Atemwegscilien modulieren kann (Manzanares et al., 2007).
Der Funktionsverlust von hmmr lässt somit darauf schließen, dass Hmmr einen direkten
Einfluss auf die Strömungsgeschwindigkeit der CSF nehmen könnte und für
Fließgeschwindigkeiten oberhalb von 300 µm/s notwendig ist. Eine detaillierte Analyse
des Cilienschlages auf dem Rhombencephalondach wird diesen Zusammenhang im
Detail aufklären.
Eine weitere Möglichkeit, wie ein Hydrocephalus entstehen kann, ist die Überproduktion
der CSF durch Zellen mit dysfunktionalen Cilien. Der dadurch erhöhte Flüssigkeitsdruck
führt zu einer Erweiterung des Ventrikelsystems. In der Maus wurde bereits ein
Zusammenhang zwischen dysfunktionalen Cilien auf Zellen des PC und einer
fehlregulierten CSF-Produktion hergestellt (Banizs et al., 2005). Dabei führten
Diskussion
70
missgebildete Cilien zu einem unkoordinierten Cilienschlag und gestörter CSF-
Bewegung. In Xenopus besteht das gesamte Dach des vierten Ventrikels aus CSF-
sekretierenden PC-Zellen. Diese wurden durch den Funktionsverlust von foxj1 erheblich
in Mitleidenschaft gezogen. Daher liegt es nahe, dass eine veränderte Aktivität der PC-
Zellen nach Funktionsverlust von foxj1 zu einer Überproduktion der CSF geführt haben
könnte.
Auch wenn Cilien auf PC-Zellen des vierten Ventrikels nach Funktionsverlust von hmmr
noch vollständig oder teilweise vorhanden waren, können diese dysfunktional oder in
ihrer Schlagfrequenz verändert sein. Auch dies könnte zur Überproduktion der CSF
führen, was wiederum in einer hydrocephalischen Erweiterung des Ventrikelsystems
resultiert.
Zusammengenommen implizieren diese Daten, dass sowohl eine
reduzierte/dysfunktionale Cilierung als auch eine veränderte Cilienschlagfrequenz einen
Hydrocephalus hervorrufen können. Dies gilt sowohl für den Cilien-tragenden PC im
vierten Ventrikel als auch für Cilien-tragende Strukturen im gesamten Hirn. Jeder
einzelne Prozess, eine Kombination aus mehreren oder das Zusammentreffen all dieser
fehlregulierten Prozesse kann einen Hydrocephalus bewirken.
III.4 Rufen Fehlbildungen des Vorder- und Mittelhirns Hydrocephalus hervor?
Zusätzlich zu den offensichtlichen Defekten der Cilierung und der CSF-Strömung fielen
nach Funktionsverlust von sowohl foxj1 als auch hmmr morphologische Veränderungen
im Di- und Mesencephalon auf. So verkürzte sich die rostrocaudale Achse
beziehungsweise das Vorder- und Mittelhirn wurde deutlich reduziert. In beiden Fällen
kam es zusätzlich zu einer Reduktion oder zur Stenose der Vorderhirnventrikel.
Bedeutende Strukturen im Vorderhirn sind der PC und das subkommissurale Organ
(SKO). Eine Gemeinsamkeit von Zellen dieser Regionen ist ihre Lokalisation in der
dorsalen Mittellinie, die Expression von foxj1 und die Ausbildung elongierter, motiler
Cilien. So könnte eine Fehlbildung des PC im dritten Ventrikel nach Funktionsverlust
von foxj1 wie im vierten Ventrikel zu veränderter Aktivität der PC-Zellen in Bezug auf
Sekretion und Bewegung der CSF geführt haben. Eine Fehlproduktion könnte einen
Kollaps des Vorderhirns mit Stenose des AM hervorrufen. Bei gleichbleibender
Diskussion
71
Sekretion der CSF im vierten Ventrikel würde dies eine Aufstauung der CSF und einen
Hydrocephalus im vierten Ventrikel bedingen.
Der Funktionsverlust von hmmr resultierte im Krankheitsbild der Holoprosencephalie
(HPE), welche durch den Verlust dorsaler Mittellinienstrukturen zusammen mit nicht
getrennten Hemisphären und Aberrationen der craniofacialen Strukturen in Mensch und
Maus charakterisiert ist. Besonders betroffen war dabei ebenfalls der PC des dritten
Ventrikels.
Dabei ist zu bemerken, dass gerade die Zellen des PC ein ausgeprägtes Epithel mit
undurchlässigen Zellverbindungen („Tight junctions“) bilden müssen, da diese eine Blut-
Liquor-Schranke darstellen. Somit erfordert die Entwicklung des PC die Ausbildung von
Zellverbindungen, welche wiederum die Zellpolarität generieren und aufrechterhalten.
Die Rolle von Aktin für die dynamische Organisation von Tight junctions ist bereits gut
untersucht, aber auch Mikrotubuli tragen wesentlich zur Erhaltung epithelialer Tight
junctions bei (Glotfelty et al., 2014). Somit ist es möglich, dass das Mikrotubuli-
assoziierte Protein Hmmr in Xenopus eine Funktion bei der Aufrechterhaltung von
Zelladhäsion und -polarität innehat und die starke Fehlbildung des PC auf eine gestörte
Epithelialisierung durch Funktionsverlust von hmmr zurückzuführen ist.
Eine weitere Cilien-tragende Struktur in der dorsalen Mittellinie ist das SKO. Dieses
sezerniert Glycoproteine wie SCO-Spondin (die Reissner-Substanz), aus welchen sich
der Reissner-Faden (RF) aggregiert (Lichtenfeld et al., 1999). Durch den RF wird der
AM offen gehalten. Manipulation der Sekretion oder Aggregation der Glycoproteine des
RFs führen zu einem Kollaps des AM mit darauf folgendem Hydrocephalus in späteren
Stadien. Dies wurde bereits in der Ratte beschrieben (Vio et al., 2000). In dieser Studie
wurde die Bildung des RFs durch das SKO mittels immunologischer Blockade
manipuliert. Eine Analyse von Ratten mit morphologischen und funktionalen Defekten
des SKOs unterstützte die genannte Studie ebenfalls (Ortloff et al., 2013). In Xenopus
wird die Reissner-Substanz zuerst von Zellen der Bodenplatte und anschließend vom
sich entwickelnden SCO produziert. Sowohl die Bodenplatte als auch das SKO zeigten
eine starke foxj1-Expression und besonders die Cilierung des SKOs wurde durch den
Funktionsverlust von foxj1 stark verändert (Abb. 10).
Auch der Funktionsverlust von Rfx3 führte zu veränderter Cilierung im SKO und
verminderter Immunoreaktivität des vom SKO gebildeten RF, was in einem
kongenitalen Hydrocephalus ohne Stenose des AM resultierte (Baas et al., 2006). Von
Diskussion
72
besonderer Bedeutung ist dabei, dass die ependymalen Cilien noch immer motil waren,
obwohl die SKO-Cilierung in Rfx3-/- Mäusen verändert war.
Somit könnte eine veränderte Cilierung des SKO durch den Funktionsverlust von foxj1
die Bildung oder den Verlauf des RFs beeinträchtigen. In Folge könnte dies zu einer
aberranten Ventrikelmorphologie im Vorder- und Mittelhirn führen. Zusammen mit einer
möglichen Stenose des AM würde dies ebenfalls in einem Hydrocephalus des
Rhombencephalons resultieren. Inwieweit der Funktionsverlust von foxj1 das SKO
beziehungsweise die Bildung des RF beeinträchtigt, werden weiterführende Studien
zeigen.
Nach Funktionsverlust von hmmr war das SKO deutlich breiter (nicht gezeigt). Dies
lässt ebenfalls Rückschluss auf eine gestörte Sekretion der Glycoproteine zu, aus
welchen der RF aggregiert. Somit könnte eine gestörte Aggregation des RFs nach
Funktionsverlust von hmmr zum Kollaps des AM führen und ebenfalls einen
Hydrocephalus bedingen.
Neben dem PC des dritten Ventrikels und dem bereits beschriebenen SKO liegt im
Diencephalon die ZLI. Die ZLI stellt ein wichtiges Signalzentrum dar, welche den
Präthalamus vom Thalamus trennt. Innerhalb dieser Region wird ein komplexes Muster
aus regulatorischen Molekülen wie zum Beispiel Shh exprimiert, welche wiederum im
Thalamus zu neuroepithelialer Proliferation und Wachstum führen (Vieira et al., 2005).
Auch wenn eine funktionelle Korrelation bisher nicht vorliegt, tragen Cilien
höchstwahrscheinlich zur Funktionalität in Signalzentren bei. So können sie
Morphogengradienten generieren sowie Signalmoleküle detektieren und dadurch
Signalwege prozessieren. Der Verlust motiler Cilien durch Knock-down von foxj, wie
auch eine veränderte Cilienschlagfrequenz durch den Funktionsverlust von hmmr
könnten in jedem dieser Zentren Morphogengradienten unterbrechen.
Die resultierenden morphologischen Aberrationen im Diencephalon würden ebenfalls
zum Kollaps des Ventrikelsystems oder einer Stenose führen und damit zur
hydrocephalischen Erweiterung des vierten Ventrikels.
Für die korrekte Aufdehnung und Formbildung des Ventrikelsystems scheint somit ein
reguliertes Zusammenspiel von Cilienmotilität, RF-Bildung und postnataler SKO-
Funktion notwendig zu sein.
Zusammengefasst können der Verlust dorsaler Mittellinienstrukturen sowie der Verlust
motiler Cilien oder eine veränderte Schlagfrequenz von Cilien in bedeutenden
Diskussion
73
Vorderhirnstrukturen zu Kollaps oder Stenose der Ventrikel im Vorderhirn führen und
eine hydrocephalische Erweiterung des vierten Ventrikels im Rhombencephalon
bedingen.
III.5 Wie kommt es zum Verlust dorsaler Mittellinienstrukturen nach Funktionsverlust von hmmr?
Um besser verstehen zu können, wie durch die HPE nach Funktionsverlust von hmmr
ein Hydrocephalus bedingt werden kann, wurden in weiterreichenden Analysen die
zugrunde liegenden Mechanismen des Phänotyps näher untersucht werden. Dabei
zeigte sich, dass der HPE ein verzögerter anteriorer Neuralrohrschluss vorausgeht.
Die Mechanismen des posterioren Neuralrohrschlusses sind bereits relativ gut
untersucht (Wallingford, 2012; Wallingford und Harland, 2002), während die zellulären
und molekularen Mechanismen für den anterioren Neuralrohrschluss weitgehend
unbekannt sind. Cilien sowie der Cilien-basierte Shh-Signalweg stellen allerdings
wichtige Faktoren im anterioren Neuralrohrschluss und in der Vorderhirnentwicklung dar
(Chung et al., 2012; Park et al., 2006). Da jedoch weder die Biogenese primärer Cilien
noch Zielgene des Shh-Signalwegs nach Funktionsverlust von hmmr betroffen waren,
scheinen die anterioren Neuralrohrschlussdefekte weder auf Defekten in primären
Cilien noch auf einem veränderten Shh-Signalweg zu beruhen. Interessanterweise ist
die HPE in Cdc42 Mutanten auch Shh-unabhängig und Cdc42 konditionale Kock-out
Mäuse entwickeln ebenfalls einen Hydrocephalus (Peng et al., 2013).
Andere Signalwege - wie der Wnt/Ctnnb1-Signalweg - sind unterschiedlich aktiv entlang
der anteroposterioren Achse des Neuralrohrs und könnten dadurch rostrocaudale
Unterschiede im Neuralrohrschluss sowie in der Entwicklung des zentralen
Nervensystems generieren. Der Wnt/Ctnnb1-Signalweg determiniert posteriore
Zellschicksale, während er anterior für die Vorderhirnentwicklung inhibiert werden muss
(Kiecker und Niehrs, 2001). Somit könnten die Vorderhirndefekte nach Funktionsverlust
von hmmr durch Interaktion mit Signalwegen, welche differentiell entlang der
anteroposterioren Achse aktiviert sind, erklärt werden.
Neben seiner Rolle als transkriptioneller Kofaktor lokalisiert Ctnnb1 auch an
Adhärenzverbindungen, interagiert mit Cadherinen und Cateninen und vermittelt so
Zell-Zell-Verbindungen. Der Vorderhirn spezifische Funktionsverlust von ctnnb1 in
Mäusen führte zum Ablösen und Absterben neuroepithelialer Zellen und fehlenden
Diskussion
74
neuralen Mittellinienstrukturen, sprich zu einer HPE (Junghans et al., 2005). Zusammen
mit der Beobachtung, dass dem verzögerten Neuralrohrschluss eine gestörte Migration
und Interkalation neuroepithelialer Zellen zugrunde liegt, gab dies einen ersten Hinweis
auf die Bedeutung von Zelladhäsions-vermittelter Zellpolarität bei der Neurulation und
Vorderhirnentwicklung in Xenopus.
Für das Aufeinandertreffen der Neuralfalten und Ausbildung der Mittellinie müssen die
intermediären lateralen Zellen der tiefen Schicht nach medial migrieren und
interkalieren, um ihre Position in der dorsalen Mittellinie einzunehmen. Gleichzeitig
interkalieren die Zellen der ventralen, tiefen Schicht mit denen der superfiziellen. Dies
führt zu einem einschichtigen Neuroepithel und der Bildung des Neuralrohrs mit einem
Ventrikellumen (Davidson und Keller, 1999). Sowohl der Prozess der medialen
Migration als auch die Interkalation von Zellen setzt eine Polarisierung der Zelle entlang
der apikobasalen Achse voraus. Die Rolle von Aktin und Aktin-vermittelten Prozessen
bei der Generierung molekularer und morphologischer Zellpolarität ist bereits gut
beschrieben. Jedoch wird immer deutlicher, dass auch Mikrotubuli eine kortikale
Polarität generieren und/oder erhalten können. Dies wird durch einen positiven
Rückkopplungs-Mechanismus sichergestellt, bei welchem Mikrotubuli zuerst die
Polarität generieren. Anschließend werden diese kortikal verankert, was die Polarität
aufrecht erhält (Siegrist und Doe, 2007).
HMMR assoziiert sowohl mit Mikrotubuli als auch mit Aktin (Assmann et al., 1999) und
konnte in Xenopus zusammen mit F-Aktin nahe der Plus-Enden von Mikrotubuli am
Zellkortex detektiert werden (vergleiche Abb. 17). Zusätzlich dazu führte der
Funktionsverlust von hmmr zu desorganisierten Mikrotubuli sowie neuroepithelialen
Zellen, welche weniger elongiert und polarisiert waren. Die Elongation des
neuroepithelialen Zellverbandes benötigt wiederum ein intaktes und ausgerichtetes
Mikrotubuli-Cytoskelett (Karfunkel, 1971). Somit könnte Hmmr als ein verbindendes
Protein zwischen kortikalen Mikrotubuli und Aktin agieren und würde damit Ähnlichkeit
zu Proteinen der Spektraplakin-Familie von cytoskelettalen Cross-Linkern aufweisen
(Watanabe et al., 2005).
Die Polarität eines Neuroepithels wird insbesondere durch die Positionierung von
Adhärenzverbindungen nahe der apikalen Oberfläche (Chen et al., 2006) und durch
fokale Adhäsionen an der basalen Membran festgelegt. Auch ist bereits bekannt, dass
Mikrotubuli für Prozesse an Zell-Zell-Verbindungen benötigt werden (Etienne-
Manneville, 2013). Dabei müssen diese an entsprechende Stellen des Zellkortex
Diskussion
75
gebracht und die Plus-Enden über Cross-Linker oder andere verbindende Proteine an
kortikales Aktin gebunden werden (Watanabe et al., 2005).
Die Bedeutung der Zelladhäsion für die anteriore Neurulation wird weiterhin durch eine
Zebrabärbling Mutante klar, welche reduzierte Expression und Lokalisation von
cdh2/Cdh2 (N-Cadherin) aufweist (Aquilina-Beck et al., 2007). Die Dysregulation von
cdh2 wird gefolgt von gestörter Neurulation und resultiert in einer HPE. Dies unterstützt
die Beobachtung von reduziertem Cdh2 an der Zellmembran nach Funktionsverlust von
hmmr in vorliegender Arbeit. Die Verbindung von Mikrotubuli und kortikalem Aktin durch
Hmmr an Adhärenzverbindungen könnte somit die Stabilität des neuroepithelialen
Zellverbands erhöhen und zur Generierung der Zellpolarität beitragen.
Zusätzlich zur Interaktion mit Adhärenzverbindungen werden die Plus-Enden von
Mikrotubuli an fokale Adhäsionspunkte gebracht, was die Zell-Matrix-Interaktion
moduliert (Etienne-Manneville, 2013). Die Verankerung von Mikrotubuli in der Nähe
fokaler Adhäsionspunkte könnte ebenfalls durch Hmmr vermittelt werden. Hmmr
lokalisiert tatsächlich in der Nähe fokaler Adhäsionspunkte (Assmann et al., 1999 und
eigene Beobachtungen) und wurde für die Modulation fokaler
Adhäsionspunktdynamiken durch Ptk2 beschrieben (Hall et al., 1994). Somit könnte
Hmmr die Mikrotubuli-abhängige Regulation der Integrin-Adhäsion an Fibronectin
bewirken und damit die basale Anhaftung des Neuroepithels sicherstellen.
Nach Funktionsverlust von hmmr zeigte sich sowohl eine verringerte Zell-Zell-Adhäsion
als auch ein kleinerer Kontaktbereich von Neuralleistenzellen auf Fibronectin. Durch
den Verlust der basalen Anhaftung und des Kontakts zu Nachbarzellen verloren die
neuroepithelialen Zellen ihre Elongation und Polarisation. Zusammengefasst kann also
geschlussfolgert werden, dass eine Hauptursache der HPE eine gestörte Zellpolarität
durch Dysregulation von Vorderhirn-Zelladhäsionsdynamiken ist, welche wiederum von
Hmmr beeinflusst werden.
Auch in radiären Glia im Vorderhirn, welche starke hmmr-Expression zeigten, würde der
Verlust von Mikrotubuli-vermittelter Zelladhäsion zu einem Auflösen des Zellverbandes
führen. Wie in vorliegender Arbeit beobachtet werden konnte, löst sich ein Teil der
proliferativen Zellen aus dem Verband und stirbt durch Anoikis. Die durch
Adhäsionsverlust bedingte Reduzierung der Zellpolarität würde damit zur
Fehlentwicklung des Ependyms führen und schließlich in einer Stenose des AM und
einem Hydrocephalus resultieren.
Ein vereinfachtes Modell dazu ist in Abbildung 26 (A-B) dargestellt.
Diskussion
76
Vor und während des Neuralrohrschlusses sind die intermediären tiefen Zellen (ITZ),
welche später zur dorsalen Mittellinie beitragen, noch lateral positioniert. Dies ist sowohl
in Wildtypen als auch in hmmr-Morphanten der Fall (Abb. 26C Davidson und Keller,
1999; Schroeder, 1970). Mit Hilfe von Zell-Zell-Adhäsion interkalieren die Zellen radial
miteinander und ziehen die lateralen Grenzen der Neuralplatte damit nach medial und
dorsal. Die Neuralplatten nach Funktionsverlust von hmmr sind breiter, da sie diese
Zugkraft nicht aufbringen können (Abb. 26C). Nach dem Neuralrohrschluss kommen die
ITZ in der dorsalen Mittellinie des Neuralrohrs zu liegen, wie hier durch not-
exprimierende Zellen in der Dachplatte des Diencephalons gezeigt (Abb. 26D). Die mit
hmmr MO injizierten Zellen bleiben aufgrund des Verlusts von Migration und
Interkalation weiter lateral und können damit nicht zu einer funktionalen Dachplatte
beitragen.
Zusätzlich trägt die radiale Interkalation der superfiziellen und tiefen Schichten im
Anschluss an den Neuralrohrschluss zur Bildung eines einschichtigen Neuroepithels
bei. Dieser finale Interkalationsschritt ist für die Bildung und Aufweitung des
Neuralrohrlumens unablässig (Abb. 26C; Davidson und Keller, 1999). Da die
superfiziellen und tiefen Schichten nach Funktionsverlust von hmmr nicht vollständig
interkalieren, wird kein Ventrikellumen gebildet.
Somit ist der Verlust von Mikrotubuli-vermittelter Zelladhäsion sehr wahrscheinlich die
Ursache von zwei Merkmalen in der Entstehung einer HPE - dem Verlust dorsaler
Mittellinienstrukturen und der Fehlbildung eines Ventrikellumens.
Diskussion
77
Abbildung 26 Modell der hmmr-vermittelten Zelladhäsion und Holoprosencephalie-Bildung
(A) Elongierte und polarisierte Zelle eines Kontrollembryos mit intaktem Mikrotubuli-Cytoskelett. (A‘, A‘‘)
hmmr-vermittelte Stabilität und Regulation an Adhärenzverbindungen (A‘) und fokalen Adhäsionspunkten
(A‘‘), wie in (A) angedeutet. (B-B‘‘) Verlust von Zellelongation, -polarisation und hmmr-vermittelter
Stabilität und Regulation. (C) Model der medialen Konvergenz durch radiale Interkalation von
intermediären tiefen (IT) Zellen. Die reduzierte Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsion nach Funktionsverlust
von hmmr verhindert die korrekte radiale Interkalation und führt damit zu einer breiteren Neuralplatte. (D)
Die Bildung von Ventrikellumen und Dachplatte nach der Neurulation hängen von korrekter medialer
Konvergenz und radialer Interkalation der IT Zellen ab. Können diese IT Zellen nicht interkalieren, führt
dies zu einem Fehlen des Ventrikellumes und der Dachplatte.
III.6 Abschließende Bemerkungen Mit vorliegender Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass motile Cilien die
Ursache einer physiologischen CSF-Strömung sind. Ein Fehlen motiler Cilien führt zur
hydrocephalischen Erweiterung des Ventrikelsystems. Auch eine ciliäre Dysfunktion
(Immotilität oder veränderte Schlagfrequenz) korreliert mit der Entstehung von
Hydrocephalus. Ebenso korrelieren Vorder- und Mittelhirndefekte mit der Bildung eines
Hydrocephalus.
Die pathologischen Ursachen welche zur Entstehung des komplexen Krankheitsbildes
Hydrocephalus führen konnten bisher nicht vollständig aufgeklärt werden. Aber durch
die genaue räumlich-zeitliche Analyse der Entstehung Mono- und Multicilien-tragender
Zellen und der CSF-Strömung wurde eine wichtige Grundlage geschaffen. Auf
Diskussion
78
Grundlage dieser können weitere humanen Gene beziehungsweise der Verlust dieser,
auf ihre Funktion in der Entstehung von Hydrocephalus getestet werden.
Zusätzlich konnte für hmmr eine neue Rolle während der Neurulation beschrieben
werden. Dies bietet einen Einstiegspunkt zu weiteren Untersuchung humaner HPE, ein
Krankheitsbild das in vielen Fällen von Hydrocephalus begleitet wird.
Material und Methoden
79
IV Material und Methoden
IV.1 Beiträge zu gemeinschaftlichen Projekten Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Daten von mir generiert.
Nachfolgend eine Auflistung der Beiträge bei gemeinschaftlich durchgeführten
Projekten:
IV.1.1 Hirnmorphologie / foxj1 Dieser Teil der Arbeit wurde veröffentlicht unter:
C. Hagenlocher, P. Walentek, C. Müller, T. Thumberger, K. Feistel, “Ciliogenesis and
cerebrospinal fluid flow in the developing Xenopus brain are regulated by foxj1”, Cilia
(2013)
Peter Walentek: Beitrag zum Aufbau des Projekts,
zu den foxj1 Funktionsverlustexperimenten und
Durchführung einiger in situ Hybridisierungen
Christina Müller: Beitrag zu in situ Hybridisierungen
Thomas Thumberger: Entwicklung des halbautomatischen Cerebrospinal-
flüssigkeits (CSF)-Strömungs-Analysewerkzeugs,
Anpassung an die Studie und
Unterstützung bei der Analyse und Auswertung
der CSF-Strömungs Daten
Kerstin Feistel: Aufbau und Betreuung der Studie sowie
der Datenauswertung, Erstellung des Manuskripts
IV.1.2 Holoprosencephalie / hmmr Dieser Teil der Arbeit befindet sich im Publikationsprozess unter folgendem Titel:
C. Hagenlocher, T. Ott, A. Prager, T. Thumberger, K. Feistel, “hmmr-mediated cell
adhesion regulates Xenopus forebrain development”
Tim Ott: Mithilfe bei zeitgleichen Injektionen für Zeitrafferfilme,
Beitrag zum Aufbau der Studie
Material und Methoden
80
Angela Prager: Beitrag zu einer in situ Hybridisierung und
Immunfluoreszenz
Thomas Thumberger: Entwicklung des halbautomatischen CSF-Strömungs-
Analysewerkzeugs, Anpassung an die Studie und
Unterstützung bei der Analyse und Auswertung der CSF-
Strömungs Daten sowie bei der Darstellung der Daten
Kerstin Feistel: Aufbau und Betreuung der Studie, Beitrag zu
Immunfluoreszenzfärbungen und konfokalen Aufnahmen,
Zellpolarisierung und Cilienlänge, Präparation
Neuralleistenzell- und Neuralplattenexplantate
Anna Iwanska: Beitrag zu Immunfluoreszenzfärbungen und in situ
Hybridisierungen inkl. Vibratomschnitte, Beitrag zu MO
Injektion
IV.2 Material Material nach Maike Getwan (Getwan, 2015) und Tim Ott (Ott, 2014), angepasst und
erweitert.
IV.2.1 Chemikalien Agaragar Roth
Agarose Standard (Froschexperimente) Roth
Agarose LE (Gelelektrophorese) Genaxxon
Albumin Fraktion V (BSA) AppliChem
Ammoniumacetat Roth
Ampicillin-Natriumsalz AppliChem
Anti-Digoxigenin alkalische Phosphatase Fab-Fragmente Roche
Argongas Westfalen
BM-Purple AP-Substrat Roche
Boehringer-Blocking-Reagenz Roche
BSA (bovine serum albumin; 100 x) Promega
Calciumchlorid (CaCl2) Roth
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2 . 2H2O) Roth
Calciumnitrat-Tetrahydrat (Ca(NO3)2 . 4H2O) Roth
Material und Methoden
81
CAS-Block ThermoFisher Sc.
CHAPS AppliChem
Chloroform Merck
Cystein AppliChem
Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) Promega
Digoxigenin-dNTP-Labeling Mix Roche
Dinatriumcarbonat Merck
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Roth
Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth
Dithiotreitol (DTT) Promega
DNase I ThermoFisher Sc.
Essigsäure AppliChem
Ethanol Roth
Ethidiumbromid Roth
Ethylendiamintetraessisäure (EDTA) Roth
Ethylenguanintetraessigsäure (EGTA) Roth
Ethyl-p-Aminobenzoat (Benzocain, E1501) Sigma-Aldrich
Fibronectin (human) Biochrom
Ficoll AppliChem
F8823, FluoSpheres® carboxylate-modified microspheres,
1 µm, yellow-green fluorescence (505/515), 2 % solids ThermoFisher Sc.
Formaldehyd Roth
Formamid Roth
Gelatine Merck
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich
Gentamycin Biochrome
Glucose AppliChem
Glutardialdehyd (25%) Roth
Glycerol Roth
Glycin AppliChem
Goldfolie Baltic Präparation
Hefeextrakt Roth
Hefe-RNA (Torula) Sigma-Aldrich
Heparin AppliChem
Material und Methoden
82
HEPES AppliChem
Humanes Choriongonadotropin (hCG) Sigma-Aldrich
Isopropyl-beta-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) Roth
Isopropanol (2-Propanol) Roth
Kälberserum, fötal (FBS) PPA
Kaliumacetat (C2H3KO2) Roth
Kaliumchlorid (KCl) AppliChem
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) AppliChem
Kaliumgluconat Merck
Kohlenstoffdioxid (CO2), flüssig Westfalen
Ladepuffer für DNA IV (10 x) AppliChem
Lambda-DNA Promega
Ligase (T4-Ligase) Promega
Liquid Blocker PAP Pen for Immunostaining Sigma-Aldrich
Magnesiumchlorid (MgCl2) Merck
Magnesiumsulfat (MgSO4) Roth
Maleinsäure Roth
Methanol Roth
MOPS AppliChem
Morpholino-Oligomere (MO) Gene Tools
Natriumchlorid (NaCl) AppliChem
Natriumcitrat Roth
Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 . H2O) Roth
Natriumdodecylsulfat (SDS) AppliChem
Natriumgluconat AppliChem
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) Merck
Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Roth
Natriumhydroxid (NaOH) Roth
Oligonukleotide (Primer) Eurofins
Osmiumtetroxid (OsO4) Chempur
Paraformaldehyd (PFA) AppliChem
PBS+ Gibco
Penstrep (Penicillin und Streptomycin) Gibco
Phenol/Chloroform (Rotiphenol) Roth
Material und Methoden
83
Phusion HF DNA Polymerase und 5 x Puffer NEB
Proteinase K Roth
Restriktionsenzyme und Puffer Promega
Roti®-Mount FluorCare DAPI Roth
RNase A Roth
RNase Inhibitor (RNasin) Promega
Saccharose AppliChem
Salzsäure (HCl, 37%) Merck
SP6-RNA-Polymerase Promega
Supercoiled DNA Ladder und Puffer NEB
T3-RNA-Polymerase Promega
T7-RNA-Polymerase Promega
Thymol Serva
Trifast PeqGold PEQLAB Biotech
Tris AppliChem
Tris-HCl AppliChem
TritonX-100 Serva
Trypsin Roth
Trypton AppliChem
Tween20 Roth
Vaseline Molyduval
Ziegenserum Sigma-Aldrich
IV.2.2 Kits AmpliCap SP6 High Yield Message Maker Kit Biozym
GoTaq DNA Polymerase System Promega
innuPREP Gel Extraction Kit Analytik Jena
pGEM-T Easy Vektor Promega
PureYield Plasmid Midiprep System Promega
Material und Methoden
84
IV.2.3 Antikörper und Fluoreszenzmarker Anti-Fabp7: Merck Millipore
(Anti-BLBP, rabbit polyclonal, 1:100)
Anti-acetyliertes Tuba4a: Sigma-Aldrich
(Anti-acetyliertes α-Tubulin, 6-11B-1, mouse IgG2b, 1:700)
Anti-cleaved Caspase 3 (D175) Cell Signaling Technology
(D3E9, rabbit IgG, 1:250)
Anti-Mapre1: BD Biosciences
(Anti-EB1, 5/EB1, mouse IgG1, 1:100)
Anti-Fn1: D. DeSimone
(Anti-Fibronectin, 4H2, mouse IgG1 1:500)
Anti-Hmmr Aaron Groen/
(rabbit polyclonal, 1:150) Labor T. Mitchison
Anti-HMMR: Volker Assmann
(rabbit polyclonal, 1:200)
Anti-Cdh2: DSHB
(Anti-n-Cadherin, MNCD2, rat IgG2a, 1:5; MNCD2 wurde bei der Developmental
Studies Hybridoma Bank (DSHB) durch Takeichi, M. / Matsunami, H. hinterlegt)
Anti-Pcna: Merck Millipore
(PC10, mouse IgG2a, 1:200)
Anti-Tubg1: Sigma-Aldrich
(Anti-γ-Tubulin, GTU-88, mouse IgG1, 1:1000)
AlexaFluor® 555 goat anti-mouse IgG2a (γ2a) (1:500) ThermoFisher Scientific
AlexaFluor® 555 goat anti-mouse IgG2b (γ2b) (1:200) ThermoFisher Scientific
AlexaFluor® 555 goat anti-mouse IgG1 (γ1) (1:1000) ThermoFisher Scientific
AlexaFluor® 488 goat anti-mouse IgG1 (γ1) (1:500) ThermoFisher Scientific
AlexaFluor® 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) (1:500) ThermoFisher Scientific
AlexaFluor® 488 goat anti-rat IgG (H+L) (1:500) ThermoFisher Scientific
Dextran, Tetramethylrhodamin (MW 70.000) ThermoFisher Scientific
Dextran, Alexa Fluor® 488 (MW 10.000) ThermoFisher Scientific
Alexa Fluor® 488 Phalloidin ThermoFisher Scientific
Hoechst 33342 Molecular Probes
Material und Methoden
85
IV.2.4 Laborutensilien Aluminium-Stiftprobenteller Plano
Bakterienschalen Greiner
Deckgläschen Roth
Einmal-Injektions-Kanülen, Sterican (Gr. 20) B. Braun
Einmalspritzen, Omnifix-F (1 mL) B. Braun
Glaskapillare Hilgenberg
Glaswaren Schott Duran
Leitfähige Haftaufkleber Plano
Mikromesser, ultrafein Fine Science Tools
Multiwell-Platten Greiner
Objektträger, geschnitten Knittel
Petrischalen (Plastik) Multimed
Pipetten (Einweg-Pasteurpipetten) Sarstedt
Pipettenspitzen Sarstedt/Eppendorf
Präparationsbesteck Fine Science Tools
Reaktionsgefäße Sarstedt/Eppendorf
Skalpelle Bayha
Sterilfilter Schleicher und Schuell
Deckglas-Zellkulturkammer Sarstedt
IV.2.5 Geräte Cryotom Leica, CM3050 S
Fluoreszenz-Stereomikroskop Leica, MZ FLIII
Fluoreszenzmikroskop Zeiss, Axio Imager M1
Gelkammern ThermoEC ClassicTM mit Consort
Elektrophoresis Power E844
Kaltlichtquellen Zeiss, KL1500LCD
Kameras Zeiss, AxioCam HRc
Zeiss, AxioCam HSm
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss, AxioObserver.Z
mit Zeiss, LSM 700
Kritischer-Punkt-Trockner Leica, EM CPD030
Material und Methoden
86
Micropipette Puller Sutter Instrument,
P-87Flaming/Brown
Mikroskop Zeiss, Axioskop2 mot plus
Mikromanipulator (Injektor) Harvard Apparatus Medical Systems,
Research Products PLI-100
beziehungsweise PLI-100A
dazu Zeiss, Stemi2000 und Stemi2000C
Photometer Eppendorf, Bio Photometer
Rasterelektronenmikroskop Joel, NeoScope JCM-5000
Stereomikroskop Zeiss, SteREO Discovery.V12
Sputter Leica, EM SCD005
Thermocycler Biozym, Peltier Thermal Cycler PTC-200
Transilluminator Vilber Lourmat, TCP 20M
Vibratom Leica, VT 1000
IV.3 Kulturmedien und Puffer
IV.3.1 Lösungen für Froschexperimente Cystein-Lösung (pH 7,99 - 8,00) 2 % Cystein in ddH2O; täglich frisch hergestellt
Dents-Lösung 80 % Methanol; 20 % DMSO
Ficoll-Lösung 2 % Ficoll in 1 x MBSH gelöst und kalt gelagert
Gurdons Puffer 88 mM NaCl; 15 mM HEPES; 15 mM Tris-HCl; 1 mM KCl
5 x MBSH (Modified Barths Saline mit HEPES; pH 7,4) 440 mM NaCl; 50 mM HEPES; 12 mM NaHCO3; 5 mM KCl; 4 mM MgSO4 . 7 H2O; 2
mM CaCl2; 1,7 mM Ca(NO3)2 . 4 H2O; 0,5 mg/mL Streptomycin; 500 U/ml Penicillin
10 x MEMFA (pH 7,4) 1 M MOPS; 20 mM EGTA; 10 mM MgSO4; 3,7 % (v/v) Formaldehyd
Material und Methoden
87
1 x MEMFA (für Fixierung) 10 % 10 x MEMFA; 10 % Formamid; 80 % ddH2O;
täglich frisch hergestellt und bei 4 °C gelagert
PFA 10 % 10 x PBS-; 4 % PFA
IV.3.2 Lösungen für Explantate DFA (Danilchiks for Amy) 53 mM NaCl; 5 mM Na2CO3; 4,5 mM Kaliumgluconat; 32 mM Natriumgluconat; 1 mM
CaCl2; 1 mM MgSO4 . 7 H2O; pH 8.3 einstellen mit 1 M Bicine oder alternativ HCl;
0,1 % BSA; steril filtrieren; aliquotieren; lagern bei -20°C
IV.3.3 Lösung für die Gelelektrophorese 50 x TAE-Puffer (Tris Acetate EDTA Electrophoresis Buffer; pH 8,5) 2 M Tris (pH 8,5); 1 M Essigsäure; 50 mM EDTA (pH 8,0)
IV.3.4 Lösungen für Klonierungen LB-Medium (Lysogeny Broth Medium; pH 7,0) 10 g/L Trypton; 10 mM NaCl; 5 g/L Hefeextrakt; vor Gebrauch wurde 0,1 % Ampicillin
(oder entsprechendes Antibiotikum) hinzugegeben und bei 4 °C gelagert
P1 (Resuspensions-Puffer) 50 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA (pH 8,0); 100 μg/mL RNAse A; wurde bei 4 °C gelagert
P2 (Lysis-Puffer) 0,2 M NaOH; 1 % (v/v) SDS
P3 (Neutralisations-Puffer; pH 5,1) 3 M Kaliumacetat
SOC-Medium (Super Optimal Catabolite Repression Medium) 20 g/L Trypton; 10 mM MgSO4; 10 mM MgCl2; 10 mM NaCl; 5 g/L Hefeextrakt; 2,5 mM
KCl; 3,6 g/L Glucose
Material und Methoden
88
IV.3.5 Lösungen für in situ Hybridisierung Alkalische Phosphatase Puffer (AP1 Puffer; pH 9,5) 100 mM TRIS (pH 9,5); 100 mM NaCl; 50 mM MgCl2
Blocking-Lösung 1 % Boehringer-Blocking-Reagenz; 10 % hitzeinaktiviertes Ziegenserum, steril filtriert;
1 mL Tween20; bei -20 °C gelagert
Hybridisierungslösung (HybMix; pH 7,0) 12,5 M Formamid; 10 g/L Boehringer-Blocking-Reagenz; 0,75 M NaCl; 75 mM
Natriumcitrat; 0,5 % (v/v) Tween20; 0,5 mM EDTA; 0,1 % CHAPS; 1 mg/mL Torula-
RNA (zuvor wurde 1 g/L in ddH2O unter Rühren für 2 h bei 65 °C gelöst; in 1 L HybMix
kamen davon 100 mL); 0,1 mg/mL Heparin; bei -20 °C gelagert
MAB (Maleic Acid Buffer; pH 7,5) 150 mM NaCl; 100 mM Maleinsäure
Mowiol 30 g Mowiol; 120 mL 1 x PBS- (pH 7,2 - 7,4); bei 50 - 60 °C 16 Stunden rühren; 75 mL
Glycin; unter Rühren wurden einige Thymolkristalle zugegeben; warme Lösung filtriert;
bei 4 °C gelagert
10 x PBS- (Phosphate Buffered Saline; pH 7,4) 1,37 M NaCl; 100 mM Na2HPO4; 2,7 mM KCl; 1,8 mM KH2PO4
1 x PBSw (pH 7,4) 10 % 10 x PBS-; 0,1 % (v/v) Tween20
20 x SSC (Sodium Citrate Buffer; pH 7,0) 3 M NaCl; 300 mM Natriumcitrat
Vibratom-Einbettmedium (Vib-Mix) 2,2 g Gelatine; 135 g Albumin Fraktion V (BSA); 90 g Saccharose; in 450 mL 1 x PBS-
gelöst; aliquotiert; bei -20 °C gelagert
IV.3.6 Lösungen für die Immunfluoreszenzfärbung Blockierungslösung 10 % 10 x PBS-; 10 % CAS-Block
1 x PBS- / 0,1 % Triton (pH 7,4) für Embryonen 10 % 10 x PBS-; 0,1 % (v/v) Triton-X-100
Material und Methoden
89
1x PBS- / 0,05 % Triton (pH 7,4) für Cryotomschnitte 10 % 10 x PBS-; 0,05 % (v/v) Triton-X-100
IV.3.7 Lösungen für die Rasterelektronenmikroskopie Sörensen Phosphat Puffer (PB) Stammlösung A 0,2 M NaH2PO4 . H2O
Stammlösung B 0,2 M Na2HPO4
0,1 M PB 9 mL Stammlösung A, 81 mL Stammlösung B, 100 mL H2O
0,2 M PB 19 mL Stammlösung A, 81 mL Stammlösung B
IV.4 Organismen
IV.4.1 Mus musculus Die Inzuchtmäuse der Linie C57BL/6J (Wildtyp) wurden artgerecht in den Tierställen
des Instituts für Zoologie oder im zentralen Versuchstierhaus der Universität
Hohenheim in einem 12-stündigen Lichtzyklus gehalten. Die Tiere hatten freie
Verfügung über Futter (Ssniff R/M H, extrudiert Ssniff, Soest) und Wasser.
IV.4.2 Afrikanischer Krallenfrosch (Xenopus laevis) Die verwendeten Xenopus laevis Frösche stammten von Guy Pluck, Xenopus express,
Ancienne Ecole de Vernassale, Le Bourg 43270, Vernassal, Haute-Loire, Frankreich;
Nasco, 901 Janesville Ave., Fort Atkinson, WI 53538, USA und vom IGB (Leibnitz-
Institut für Gewässerökologie und Binnenfischerei), Ökophysiologie und Aquakultur,
Müggelseedamm 310, Berlin, Deutschland.
Die adulten Frösche wurden artgerecht gehalten und einem zwölfstündigen Lichtzyklus
ausgesetzt. Entsprechend der Deutschen Richtlinien und des Gesetzes (§ 6, Artikel 1,
Satz 2, Nr. 4 des Tierschutzgesetzes) waren Pflege, Handhabung und experimentelle
Manipulationen von Xenopus laevis Embryonen durch das Regierungspräsidium
Material und Methoden
90
Stuttgart, Deutschland (Vorhaben A 379/12 ZO und A 365/10 ZO „Molekulare
Embryologie“) genehmigt.
IV.4.3 Bakterienstamm XL1 blue (E. coli) Genotyp: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F‘proAB lacIqZDM15
Tn10 (Tetr)].
Aus dem Bakterienvorrat des Instituts für Zoologie, Embryologie der Universität
Hohenheim.
IV.5 Methoden
IV.5.1 Arbeiten mit der Maus Es wurden weibliche und männliche Mäuse der entsprechenden Mauslinie miteinander
verpaart. Schwangere Mäuse wurden durch cervikale Dislokation getötet und medial an
der Peritonealhöhle aufgeschnitten. Der Uterus wurde entnommen und in kaltes PBS+
(auf Eis) überführt. Mit einer Schere wurde der Uterus zwischen den einzelnen
Implantationen durchtrennt und das Uterusgewebe mittels einer Uhrmacherpinzette
vorsichtig entfernt. Danach wurden die Embryonen ebenfalls mit einer
Uhrmacherpinzette von ihren embryonalen Hüllen (Dottersack und Amnion) befreit. Die
Stadien wurden nach Downs und Davies (Downs und Davies, 1993) bestimmt. Für die
in situ Hybridisierung (ISH) wurden die Embryonen anschließend in 4 % PFA in PBS- für
1 h bei RT oder bei 4 °C über Nacht fixiert. Nach dreimaligem Waschen in PBS- für 5
min wurden sie schrittweise in einer aufsteigenden Methanolreihe (25, 50, 75, 100 %)
dehydriert und in 100 % Methanol bei -20 °C gelagert.
IV.5.2 Handhabung von Xenopus laevis
IV.5.2.1. Stimulation der Ovulation von Xenopus-Weibchen Bei Weibchen von Xenopus laevis wurde durch die subkutane Injektion von humanem
Choriongonadotropin (hCG) gezielt Eireifung und Ovulation stimuliert. Dafür wurde eine
erste Injektion vier bis 14 Tage vor dem gewünschten Ovulationstermin mit einer
geringen Dosis (50 µL von 10 kU/10 mL) vorgenommen. Am Abend vor der geplanten
Eiablage wurden erneut 400 - 800 µL hCG injiziert, wodurch nach 12 h durch manuelles
Material und Methoden
91
Massieren des Unterleibs das Ablaichen angeregt werden konnte. Bis zur Befruchtung
wurden die Eier in einer befeuchteten Kulturschale bei ca. 14-18 °C gehalten.
IV.5.2.2. In vitro Fertilisation Aus Xenopus-Männchen wurden die Hoden entnommen und in 1 x MBSH bei 4 °C
gelagert. Die hohe Salzkonzentration des Puffers sorgte dafür, dass die Spermien
immotil blieben. Zur Gewinnung der Spermien für die Insemination wurde ein 1 mm3
großes Stück der Hoden abgetrennt und in 1 mL 1 x MBSH mazeriert. Mit dieser
Lösung wurden die zuvor vereinzelten Eier benetzt und anschließend mit H2O oder 0,1
x MBSH überdeckt. Durch Zugabe eines Niedrigsalzpuffers (0,1 x MBSH) wurde die
Beweglichkeit der Spermien induziert und der Befruchtungsvorgang aktiviert. Nach 30 -
45 min wurden die Zygoten mit Cysteinlösung für sieben Minuten inkubiert, was die
Zygoten von ihrer Gallerthülle befreite. Anschließend wurden die befruchteten Eier
mehrmals mit 0,1 x MBSH gewaschen, bis die Lösung klar blieb, und in 1 x MBSH
überführt.
IV.5.2.3. Mikroinjektionen Für die Injektionen wurden die Xenopus-Embryonen in 1 x MBSH-Agarschälchen (1 x
MBSH, 1 % Agar) mit Ficoll-Lösung überführt. Das Ficoll erhöht die Dichte des
Mediums und verhindert damit das Austreten des Cytoplasmas nach der Injektion. Die
zu injizierende mRNAs beziehungsweise antisinn-Morpholino-Oligomere (MO) wurden
in isotonischem Gurdons-Puffer verdünnt und zusammen mit Dextran
Tetramethylrhodamin (0.5 – 1 µg/µL) als Injektionskontrolle in die dorsale Region jeder
dorsalen Blastomeren von Vier- bis Achtzellern injiziert. Um die Injektion zu verfolgen,
konnte anstatt Dextran Tetramethylrhodamin auch Dextran, Alexa Fluor® 488
mitinjiziert werden. Dies war auch nach Immunfluoreszenzfärbung noch sichtbar.
Für die Injektion wurden Glaskapillare verwendet, welche mit einem Micropipette Puller
(P-87; heat 850; pull 80; velocity 29; time 0) hergestellt wurden. Zur Mikromanipulation
wurden sie an einen „Harvard Apparatus“ Injektor angeschlossen welcher durch einen
Druckluftanschluss einen einstellbaren und zeitlich auf eine Sekunde begrenzten Druck
auf die Nadel ausübte. Dieser wurde so eingestellt, dass pro Injektion ein Volumen von
4 nL injiziert wurde. Hierdurch konnte gewährleistet werden, dass bei jeder Injektion
dieselbe Menge verabreicht wurde. Circa 1 h nach der Injektion wurden die Embryonen
Material und Methoden
92
zur Kultivierung in 0,1 x MBSH-Agarschälchen (0,1 x MBSH, 1 % Agar) mit 0,1 x MBSH
überführt. Darin wurden die Embryonen bis zum gewünschten Alter bei 14 - 27 °C
gehalten. In allen Experimenten wurden nur Embryonen mit klarer dorsoventraler
Pigmentierung verwendet (Klein, 1987) und die korrekte Injektion zusätzlich über die
Fluoreszenz des koinjizierten Farbstoffes kontrolliert.
IV.5.2.4. Verwendete antisinn-Morpholino-Oligomere (MO) foxj1 MO (Stubbs et al., 2008) 5’ GCAGGTCAAACATTAATAAAGCCCT 3‘
hmmr MO 1 5’ GCTGGAGCCCGCGATGCTTTCTTTC 3’
hmmr MO 2 5’ AGCCTTGGGAAATGACATTTTGGCT 3’
Standard KoMO 5’ CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA 3‘
Random KoMO Mix aus zufälligen Oligomeren mit 25 bp
Die MOs wurden pulverförmig geliefert und in ddH2O gelöst (Stock-Konzentration von 1
mM). Hierfür wurden sie ca. 10 min bei 50 - 60 °C aufgewärmt, anschließend aliquotiert
und bei -20 °C gelagert oder in den mitgelieferten Glasflaschen bei Raumtemperatur
(RT) aufbewahrt. MOs welche eingefroren waren wurden vor der Injektion bei ca. 50 -
55 °C für 10 min erhitzt.
IV.5.2.5. Konzentrationen der injizierten Moleküle foxj1 MO 1 pmol
hmmr MO 1 0,5 – 0,75 pmol
hmmr MO 2 0,5 – 0,75 pmol
hmmr (mRNA) 200 ng/µL; für Neuralplattenexplantate 40 ng/µL.
IV.5.2.6. Fixierung der Embryonen Nach Erreichen des gewünschten Stadiums wurden die Embryonen in 5 mL
Schraubgläschen überführt und entweder durch PFA mit 3 % Glutardialdehyd (für
Rasterelektronenmikroskopie, REM), PFA (für Immunfluoreszenzfärbung, IF), PFA und
Dents-Lösung (Cryotomschnitte für IF) oder durch 1 x MEMFA (IF oder ISH) fixiert. Für
die REM verblieben die Embryonen bis zur Weiterverarbeitung im Fixanz bei 4 °C. Die
übrigen Ansätze wurden entweder für 15 min bei RT (Neuralleisten- und
Material und Methoden
93
Neuralplattenexplantate), 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Danach wurde
das Fixativ durch Ethanol (100 %; ISH) oder durch 1 x PBS- (IF) ersetzt und die
Embryonen bei -20 °C (ISH) beziehungsweise bei 4 °C (IF) aufbewahrt. Die
Behandlung der Embryonen für das Anfertigen von Cryotomschnitten ist unter IV.5.11
„Anfertigung von Cryotomschnitten“ zu finden.
IV.5.2.7. Präparation der Hirne Die Embryonen wurden im Stadium 45 für 2 h in 1 x MEMFA bei RT fixiert und
anschließend mit 1 x PBS- gewaschen. Die Präparation erfolgte in PBS--Schälchen mit
1 x PBS-. Für die Explantation wurde die Epidermis mit Hilfe von zwei Feinpinzetten im
Kopfbereich nach rostral abgezogen. Daraufhin wurden alle abgehenden
Nervenstränge vom Hirn sowie das Rückenmark caudal vom Nachhirn durchtrennt.
Schließlich konnte das Hirn aus dem Kopf herausgehoben werden und wurde
schrittweise in 100 % Ethanol überführt und bei -20 °C aufbewahrt.
IV.5.2.8. Neuralleistenzell (NLZ)-Explantate Für die NLZ-Explantate wurden die Embryonen bei RT ab Stadium 13 in 1 x MBSH
Schälchen mit 1 x MBSH + Penstrep und Gentamycin (1 mL/L) von der Vitellinmembran
befreit. Im Stadium 15 - 17 wurden die Explantate in 1 x MBSH Schälchen mit DFA
präpariert, wie durch Borchers und Kollegen (Borchers et al., 2000) beschrieben. Die
Explantate wurden in eine Fibronectin beschichtete 8-Well Deckglas-Zellkulturkammer
überführt und in 4 mL DFA pro Well kultiviert. Die Kultur wurde für acht Stunden unter
dem konfokalen Mikroskop mit Fluoreszenzbeleuchtung gefilmt. Dabei wurden die
verschiedenen Positionen der Explantate der Reihe nach abgefahren und an jeder
Position jeweils ein Z-Stapel an Bilder aufgenommen.
IV.5.2.9. Neuralplatten (NP)-Explantate Für die NP-Explantate wurden die Embryonen bei RT ab Stadium 13 in 1 x MBSH
Schälchen mit 1 x MBSH + Penstrep und Gentamycin (1 mL/L) von der Vitellinmembran
befreit. Im Stadium 13 - 15 wurden die Explantate in 1 x MBSH Schälchen mit DFA
präpariert. Dafür wurde ein rechteckiges Stück seitlich der Mittellinie, aber ohne
Neuralleistenzellen, ausgeschnitten welches sowohl die superfizielle als auch die tiefe
Schicht der Neuralplatte enthielt. Die Explantate wurden in eine Fibronectin
Material und Methoden
94
beschichtete 8-Well Deckglas-Zellkulturkammer überführt und in 4 mL DFA pro Well
kultiviert. Die Kultur wurde 30 min nach der Präparation und nach 3 h mit dem
konfokalen Mikroskop fotografiert.
IV.5.2.10. Messung und Auswertung von Strömungsgeschwindigkeit der Cerebrospinalflüssigkeit
Fluoreszente Latexmikrosphären (Beads) wurden 1/250 verdünnt und zusammen mit
0,5 - 1 µg/µL Dextran Tetramethylrhodamin in 1 x MBSH verdünnt. Ein Volumen von ca.
20 nL dieser Injektionslösung wurde mittels selbst hergestellter Glaspipetten in den
vierten Ventrikel der Embryonen injiziert. Für die Herstellung der Glaspipetten wurde
erneut der Micropipette puller verwendet (P-87; heat 720; pull 30; velocity 290; time 3),
um Pipetten mit kurzem Konus und Spitze zu erhalten welche mehr Stabilität hatten.
Die Embryonen wurden im Stadium 46 mit Benzocain betäubt. Mittels Vaseline wurde
auf einem Objektträger ein Rechteck zum Einbetten der Embryonen in 1 x MBSH
hergestellt. Das Deckglas konnte so flexibel an die Höhe angepasst werden. Durch
Fluoreszenzaufnahmen des koinjizierten Dextran Tetramethylrhodamins konnte ein
Überblick über die Hirnstruktur gewonnen werden.
Für die Dokumentation der Bead-Bewegungen wurden ein 1000 Bilder langer Film der
Embryonen mit 175 Bilder pro Sekunde (fps) unter einem Zeiss Axioskop 2 mot plus mit
einem Zeiss 20 x Plan-Neofluar Objektiv durch eine Zeiss AxioCam HSm (Größe
„region of interest“, ROI, 660 x 128 px) und der Zeiss Software AxioVision 4.7
zusammen mit dem „fast recorder“ Plug-in aufgenommen.
Um die Direktionalität der Bead-Bewegung zu visualisieren wurden 20 aufeinander
folgende Rohbilder von rot nach grün farblich codiert (grün repräsentierte dabei die
aktuelle Position des Partikels) und auf ein Einzelbild projiziert. Dafür wurde eine
Nutzerabwandlung des „Temporal-Color Coder“ (Kota Miura, EMBL, Heidelberg)
Zusatzprogramms für Fiji verwendet. Um die Geschwindigkeit der Bewegung einzelner
Beads zu berechnen wurde das ImageJ Zusatzprogramm ParticleTracker verwendet,
welches die Koordinaten der Bewegungsspuren speichert. Alle Bewegungsspuren,
welche den Analysekriterien entsprachen, wurden daraufhin mit der Hilfe eines
anwendungsbezogenen Skripts für Statistical R weiter prozessiert, wodurch die Länge
und Geschwindigkeit jeder Partikelspur berechnet wurde (Vick et al., 2009).
Material und Methoden
95
IV.5.2.11. Analyse der CSF-Strömung im vierten Ventrikel Für Film 2 wurden explantierte Hirne entlang der dorsalen Mittellinie mit einem
Mikromesser eröffnet und das Rhombencephalondach entfernt. Die so erhaltenen V-
förmigen Hirne wurden ebenfalls in ein Rechteck aus Vaseline auf einem Objektträger
eingebettet, worin sich die benötigten fluoreszenten Beads 1/250 in 1 x MBSH verdünnt
befanden. Anschließend wurde wie bei der Messung der CSF-Strömung ein Film
aufgenommen und die Bead-Bewegungen visualisiert.
IV.5.2.12. Zeitrafferfilme des Neuralrohrschlusses Die in vivo Visualisierung des Neuralrohrschlusses wurde nach der Injektion von hmmr
MO/KoMO ab Stadium 13 vorgenommen. Dafür wurden die injizierten Embryonen auf
einem Netz (Maschenbreite 1 mm) in einer Agarose-beschichteten Petrischale in 0,1 x
MBSH aufgereiht. Die Zeitrafferfilme wurden zwischen 0,125 und 1 fps mit dem Zeiss
Stereomikroskop SteREO Discovery.V12 und einer Zeiss AxioCam HRc sowie der
Zeiss Software AxioVision 4.8 aufgenommen.
IV.5.3 Allgemeine molekularbiologische Methoden
IV.5.3.1. PCR Das volle Länge Xenopus-Konstrukt von hmmr im pFastBac HTc Vektor wurde von
Aaron Groen zu Verfügung gestellt (Groen et al., 2004).
Um davon mRNA herstellen zu können wurde es zuerst mit der GoTaq Polymerase und
spezifischen Schnittstellenprimern in zwei Teilen (vorderer und hinterer Teil) vom
Plasmid amplifiziert. Als die Bedingungen für eine erfolgreiche PCR eingestellt waren,
wurde dieselbe Reaktion mit der Phusion-Polymerase wiederholt, da diese eine proof-
reading Funktion besitzt. Die Amplifikate wurde dann jeweils in den pGEM-T Easy
Vektor ligiert. Von dort wurden sie über die eingefügten Schnittstellen ausgeschnitten
und zusammen in den CS2+ Vektor ligiert, so dass wieder das gesamte Konstrukt
hergestellt wurde. Das volle Länge Konstrukt im CS2+ wurde mittels überlappender
Sequenzierungen genau geprüft, so dass sich keine Punktmutationen darin befanden.
Material und Methoden
96
PCR-Standardansatz für Taq-Polymerase:
5 μL 5 x GoTaq Puffer
2,5 μL 2 mM dNTPs
10 pg Plasmid
1 μL 10 mM forward Primer
1 μL 10 mM reverse Primer
1 µL DMSO
0,2 μL GoTaq-Polymerase
mit ddH2O auf 25 μL auffüllen
PCR-Standardansatz für Phusion-Polymerase:
4 μL 5 x HF Puffer
0,4 μL 10 mM dNTPs
10 pg Plasmid
1 μL 10mM forward Primer
1 μL 10mM reverse Primer
0,2 μL Phusion DNA Polymerase
mit ddH2O auf 20 μL auffüllen
Die PCR wurde mit einem PCR-Thermocycler durchgeführt. Das PCR-Gemisch wurde
erst in das Gerät gestellt als dieses die PCR-Ausgangstemperatur von 95/98 °C erreicht
hatte. Ein PCR-Zyklus setzt sich folgendermaßen zusammen: Nach der Aufspaltung der
Sekundärstruktur beziehungsweise des DNA-Doppelstrangs kommt es zur Anlagerung
der Primer (variiert je nach Schmelztemperatur der Primer) gefolgt von der
Vervollständigung des DNA-Einzelstrangs zum Doppelstrang ausgehend von den
Primern.
Protokoll für die Taq-Polymerase
1: 95 °C 1 min
2: 95 °C 30 sek
3: 53,5/62 °C 1 min
4: 72 °C 1 min/1 kb
5: → 2. 36x
6: 72 °C 10 min
7: 8 °C für immer
Material und Methoden
97
Protokoll für die Phusion-Polymerase
1: 98 °C 30 sek
2: 98 °C 10 min
3: 53,5/62 °C 20 sek
4: 72 °C 30 sek/1 kb
5: → 2. 36x
6: 72 °C 10 min
7: 8 °C für immer
Nach der PCR mit der Phusion-Polymerase musste zusätzlich ein Adenin-Überhang
angehangen werden, da dieser nicht von der Polymerase selbst hergestellt wurde (wie
bei der Taq-Polymerase). Dafür wurde zum PCR Ansatz 0,5 µL GoTaq-Polymerase
hinzugefügt und für 15 min bei 72 °C inkubiert.
Ein Teil der gewonnenen, amplifizierten DNA wurde zur Analyse der PCR auf ein
Agarosegel mit Ethidiumbromid aufgetragen, bevor die restliche DNA in den Zielvektor
ligiert wurde.
IV.5.3.2. Verwendete Primer Vorderer Teil
hmmr1.1 for Cla I AATGTCATTTCCCAAGGCTC hmmr1.1 rev GCTCCTGCTCTAAACTTTCTC
Hinterer Teil
hmmr1.2 for AACTCGAGAAAGTTTAGAGCA hmmr1.2 rev Stu I AGTCAGTCATTGCCCAGTCAG
IV.5.3.3. Gelelektrophoretische Auftrennung Um die Mini-Präp/DNA/RNA zu überprüfen wurde, je nach Größe des Amplifikats ein 1 -
2 % Gel aus gelöster Agarose in 1 x TAE-Puffer und 4 µg/mL Ethidiumbromid
hergestellt. Die Amplifikate wurden mit 10 x Ladepuffer DNA IV (1 : 10)
beziehungsweise dem Ladepuffer der Supercoiled DNA Ladder versetzt und zusammen
mit einem Größenmarker (Lamda DNA PstI-Verdau beziehungsweise der Supercoiled
DNA Ladder) aufgetragen. Die Auftrennung erfolgte in einer, mit 1 x TAE-Puffer
gefüllten, Gelelektrophoresekammer bei 100 - 120 V. War die Nukleinsäuresequenz
Material und Methoden
98
weit genug gelaufen, wurde sie unter einem Transilluminator mittels UV-Licht mit einer
Wellenlänge von 312 nm detektiert.
IV.5.3.4. Ligation Für die Ligation der in dieser Arbeit verwendeten DNA-Konstrukte wurde zum einen der
pGEM-T Easy Vektor verwendet. Dieser wurde als offener Vektor, bereit für die
Ligation, geliefert und besitzt einen Thymidin-Überhang an welchen sich der Adenin-
Überhang von PCR-Produkten anlagern kann.
Ligationsansatz
2,5 μL 2 x Ligationspuffer
0,5 μL pGEM-T Easy Vektor
1 μL PCR Produkt
0,5 μL T4 DNA Ligase
Zum anderen wurden die Konstrukte in den pCS2+ Vektor umkloniert. Dafür wurden sie
aus dem pGEM-T Easy Vektor mittels Restriktionsverdaus ausgeschnitten (100 μL
Ansatz), auf ein Agarosegel aufgetragen und aus diesem extrahiert (innuPREP Gel
Extraction Kit, Standardprotokoll). Der pCS2+ Vektor wurde ebenfalls mit den
entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut und dadurch eröffnet. Durch eine
Ligation konnten somit die Konstrukte in den pCS2+ eingefügt werden.
Ligationsansatz
1 μL 2 x Ligationspuffer
1 μL geöffneter pCS2+
1 μL T4 DNA Ligase
Die Menge der einzusetzenden Konstrukt-DNA errechnete sich aus folgender Formel:
Größe Konstrukt in kb * 3 * Menge Vektor in ng Größe Vektor in kb
Material und Methoden
99
Damit die Ligase die zugegebene DNA effektiv mit dem Vektor ligieren konnte, wurde
der Ansatz über Nacht (oder bis zu 3 Tage) bei 4 °C inkubiert. Nach anschließender
Aufreinigung konnte er bei -20 °C gelagert oder transformiert werden.
IV.5.3.5. Restriktionsverdau Es wurde entweder 1 µg Plasmid-DNA in 20 µL Ansätzen (für Testverdau), oder 10 µg
Plasmid-DNA in 100 µL Ansätzen (für Linearisierungen beziehungsweise zum
Ausschneiden definierter Fragmente) mit dem passenden Restriktionsenzym-System
nach Herstellerangaben verdaut.
IV.5.3.6. Transformation von Plasmid-DNA in Escherichia coli Für die Aufnahme von Plasmid-DNA wurde ein durch Rubidium- und Calciumchlorid
kompetent gemachter Escherichia coli Stamm (XL1 blue) verwendet, welcher aliquotiert
bei -80 °C gelagert wurde. Es wurden 100 µL kompetenter Bakterien mit 1 µg Plasmid-
DNA für 30 min auf Eis inkubiert. Der anschließende Hitzeschock bei 42 °C für 90
Sekunden sorgte für die Aufnahme der DNA in die Zellen. Danach wurden die Zellen für
2 min auf Eis gehalten, so dass sie sich erholen konnten. Nach Zugabe von 400 µL
SOC-Medium sowie anschließender Kultivierung bei 37 C° für 60 min wurden die
Bakterien auf Selektionsplatten (LB-Medium, 15 g/L Agaragar, 0,5 mM IPTG, 80 µg/mL
X-Gal, 100 µg/mL Ampicillin oder 50 µg/mL Kanamycin) ausplattiert und über Nacht bei
37 C° vermehrt.
IV.5.3.7. DNA-Extraktion aus Bakterien („Mini-Präp“) Für die Extraktion geringer DNA-Mengen aus den Bakterienkolonien wurden einzelne
Kolonien mit einer Pipettenspitze aufgenommen und in 3 mL LB-Medium (LB-Medium,
100 µg/mL Ampicillin oder 50 µg/mL Kanamycin) über Nacht bei 37 °C inkubiert. Von
der gewachsenen Kultur wurden 1,5 mL bei 4 °C mit 14.000 rpm für 2 min
abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 200 µL P1-Puffer
resuspendiert. Es folgten 200 µL P2-Puffer zur Lyse und nach sechs-maliger
Invertierung 200 µL P3-Puffer zur Neutralisierung, ebenfalls gefolgt von sechs-maliger
Invertierung. Der Ansatz wurde darauf bei 4 °C mit 14.000 rpm für 10 min
abzentrifugiert. Dem Überstand wurde zum Fällen 500 µL Isopropanol (100 %)
zugegeben und das Gemisch anschließend bei 4 °C mit 14.000 rpm für 15 min
Material und Methoden
100
zentrifugiert. Das Isopropanol wurde verworfen und das Pellet mit 500 µL Ethanol (75
%) gereinigt und erneut bei 4 °C mit 14.000 rpm für 15 min zentrifugiert. Nachdem das
Ethanol verworfen wurde und das Pellet getrocknet war, wurde es in 50 µL ddH2O
aufgenommen.
IV.5.3.8. Gewinnung größerer DNA-Mengen („Midi-Präp“) Für die Gewinnung größerer DNA-Mengen wurden 100 mL LB-Selektionsmedium (LB-
Medium, 100 µg/mL Ampicillin oder 50 µg/mL Kanamycin) mit der entsprechenden
Bakterienkultur angeimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Präparation erfolgte
mit dem PureYield Plasmid Midiprep System in Kombination mit der Vakuum-Methode.
Dafür wurde die gewachsene Bakterienkultur in einem Beckman-Gefäß bei 4000 rpm
für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 3 mL
Resuspensionslösung gelöst. Zur Lyse wurden weitere 3 mL Zelllyselösung
hinzugegeben, leicht geschüttelt und für 3 min bei RT inkubiert. Letztlich wurde die
Lösung durch Zugabe von 5 mL Neutralisationslösung für 2 - 3 min bei RT auf einen
neutralen pH-Wert gebracht. Nun wurde für 10 min bei 12.000 rpm zentrifugiert.
Für das weitere Verfahren wurde ein Vakuumprotokoll verwendet. Mit diesem wurde die
DNA durch an ein Vakuum angelegte Säulen aufgereinigt. Jeglicher Schmutz wurde
durch eine erste Säule („Clearing Column“) abgefangen und die DNA durch eine sich
darunter befindende zweite Säule („Binding Column“) aufgenommen. Durch 5 mL
„Endotoxin Removal Wash“ und anschließende 20 mL „Column Wash Solution“ wurde
die DNA gereinigt. Anschließend wurde sie durch 500 μL warmes (50 - 60 °C) ddH2O
wieder aus der Säule gelöst und in ein Eppendorfgefäß gesaugt.
Zur Sicherstellung, dass die aufgereinigte DNA das gewünschte DNA Fragment enthielt
und es durch die Taq-PCR keine Lesefehler gab, wurde eine Sequenzierung durchge-
führt. Dies geschah extern durch die Firmen MWG-Biotech AG oder Microsynth
(beziehungsweise Seqlab).
IV.5.3.9. Linearisierung der Plasmid-DNA Für die RNA-Herstellung wurden linearisierte Plasmide verwendet um zu verhindern,
dass die RNA später Teile des Vektors enthielt. Der Verdau wurde mit Enzymen von
Promega durchgeführt und setzte sich wie folgt zusammen:
10 μg Plasmid
Material und Methoden
101
10 μL Restriktions-Puffer
3 μL Enzym
1 μL BSA
mit ddH2O auf 100 μL auffüllen
Dieser wurde bei 37 °C über Nacht verdaut.
Zur Aufreinigung linearisierte Plasmid-DNA wurden den 100 µL Ansätzen jeweils 10 µL
Ammoniumacetat (5 M) und 220 µL Ethanol (100 %) hinzugegeben. Nachdem die
Mischung gevortext und für mindestens 15 min bei -20 °C inkubiert wurde, pelletierte
die Zentrifugation bei 4 °C mit 14.000 rpm für 20 min die Plasmid-DNA. Der Überstand
wurde verworfen und das Pellet konnte nachdem es getrocknet war in 20 µL ddH2O
aufgenommen werden.
IV.5.3.10. In vitro Transkription von mRNA Für die Herstellung von mRNA mit Cap wurde mittels des AmpliCap SP6 High Yield
Message Maker Kits eine in vitro Transkription durchgeführt und die mRNA später
durch eine Phenol-Chloroform-Mischung aufgereinigt.
in vitro Transkriptionsansatz
1 μg (1 μL) linearisiertes Plasmid
2 μL 10 x Transkriptionspuffer
5 μL Cap/NTP PreMix
2 μL 100 mM DTT
0,5 μL RiboGuard RNase Inhibitor
mit ddH2O auf 20 μL auffüllen
Die Reaktion wurde für 2 h bei 37 °C durchgeführt. Danach wurden DNA-Reste durch 1
μL DNase1 für 15 min bei 37 °C verdaut. Mittels Phenol-Chloroform-Extraktion wurde
die mRNA anschließend aufgereinigt. Dazu wurden dem Ansatz 115 µL H2O, 15 µL
Ammoniumacetat (5 M) sowie 150 µL eines Phenol-Chloroform-Gemisches zugegeben.
Das Gemisch wurde gevortext und anschließend kurz bei 14.000 rpm abzentrifugiert.
Die obere, wässrige Phase wurde in ein neues Eppendorfgefäß abgenommen und 150
µL Chloroform zugegeben, der Ansatz wiederum gevortext sowie kurz bei 14.000 rpm
abzentrifugiert. Danach wurde die obere Phase erneut abgenommen, mit 150 µL
Material und Methoden
102
Isopropanol (100 %) versetzt und die darin enthaltene mRNA über Nacht bei -20 °C
gefällt. Durch Zentrifugation bei 4 °C mit 14.000 rpm für 5 min konnte die mRNA
pelletiert werden. Nachdem das Isopropanol verworfen wurde und das Pellet getrocknet
war, wurde es in 20 µL ddH2O aufgenommen. Aliquotiert zu je 1 µL, wurde die mRNA
bei -80 °C aufbewahrt.
Mit 2 μL der mRNA wurde ihre Konzentration gemessen. Außerdem wurde das
Vorhandensein der mRNA durch Auftragen auf ein Agarosegel überprüft. Dieses wurde
frisch hergestellt und in eine Gelkammer mit frischem 1 x TAE-Puffer an eine Spannung
von 135 V für 5 - 10 min angelegt.
IV.5.3.11. Photometrische Konzentrationsmessung von Nukleinsäuren Zur Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren wurde 2 µL der Probe mit 198 µL
ddH2O verdünnt und die Extinktionen von UV-Strahlung der Wellenlängen 230, 260,
280 und 340 nm beim Durchqueren der Nukleinsäurelösung in einem Biophotometer
gemessen. Als Leerprobe wurde das Lösungsmittel verwendet.
IV.5.4 In situ Hybridisierung (ISH) im Ganzpräparat und auf Hirnexplantate
Die ISH ermöglicht es, Stärke und Lokalisierung von Genexpression nachzuweisen und
wurde, wie bei Belo und Kollegen beschrieben (Belo et al., 1997), durchgeführt. Die
Detektion wird durch eine Digoxigenin-markierte RNA-Sonde erreicht welche
komplementär zur nachzuweisenden mRNA ist und mit dieser spezifisch hybridisieren
kann. Die Detektion der RNA-Hybride erfolgt durch Fab-Fragmente, welche gegen
Digoxigenin gerichtet sind und an welche eine alkalische Phosphatase konjugiert ist.
Durch Umsetzung ihres Substrats (BM Purple) entsteht eine Färbung deren Intensität
proportional zur Stärke der Genexpression ist und die Lokalisation der gesuchten
mRNA anzeigt.
Material und Methoden
103
IV.5.4.1. Sondenherstellung Für die Herstellung einer komplementären Digoxigenin-markierten RNA-Sonde
(antisinn) und einer Kontroll-Sonde (sinn) wurde die Vektor-DNA linearisiert und
aufgereinigt.
Der Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:
2 µg linearisierte, aufgereinigte Plasmid-DNA
(aus dem Plasmid-Bestand der AGs Neurale Stammzellen und Embryologie)
4 μL 5x Transkriptionspuffer
0,5 μL RNasin (40 U/ μL)
2 μL DIG RNA Labeling Mix (Digoxigenin-markierte dNTPs)
2 μL 100 mM DTT
2 μL RNA-Polymerase
(10 U/ μL; je nach Orientierung des DNA-Fragments T7, SP6 oder T3)
7,5 μL ddH2O (auf 20 μL Gesamtvolumen auffüllen)
Die in vitro Transkription fand bei 37 °C für 2 h statt.
Anschließend wurde die linearisierte Plasmid-DNA für 15 min durch DNase I bei 37 °C
verdaut. Nun wurde die transkribierte Sonde mittels Zugabe von 30 μL ddH2O, 5 μl 5 M
Ammoniumacetat und 165 μL Ethanol (100% reinst) für mindestens 30 min bei -20 °C
gefällt. Dann wurde das Gemisch bei 4 °C und 14.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und das Pellet in 50 μL eines Formamid-Wasser-Gemisches (1:2)
aufgenommen. 2 μL hiervon dienten zur gelelektrophoretischen Kontrolle, um die
Menge der synthetisierten RNA abschätzen zu können. Bis zur weiteren Verwendung
wurde die Sonde bei -80 °C gelagert.
IV.5.4.2. ISH Tag 1 - Vorbereitung und Sondenhybridisierung Der erste Tag der ISH wurde auf Eis durchgeführt, um den Abbau endogener RNA zu
verhindern. Die, in 5 mL Schraubdeckelgläschen mit Ethanol/Methanol aufbewahrten,
Embryonen mussten im ersten Schritt über eine Ethanol-/Methanolreihe (100, 75, 50,
25%) in wässriger Lösung (PBSw) rehydriert werden. Die ISH der Hirne wurden in
kleinen Gefäßen durchgeführt, welche aus einem aufgeschnittenen Eppendorfgefäß
und einem Netzstoff (Maschenweite 50 µm), welcher auf die Öffnung geklebt wurde,
Material und Methoden
104
bestanden. Diese wurden in eine 24-Wellplatte gesetzt und die Wells mit der
entsprechenden Lösung gefüllt. Dieses Verfahren sollte einen Verlust von Hirnen
während der ISH verhindern. Auch die in Ethanol gelagerten Hirne wurden im ersten
Schritt über eine Ethanolreihe (100, 75, 50, 25%) in wässriger Lösung (PBSw)
rehydriert. Die Waschschritte betrugen für jede Alkohollösung mindestens 5 min.
Anschließend wurde weitere drei Mal mit kaltem PBSw gewaschen. Embryonen mit
einem Hohlraum (Blastulae und Neurulae), in welchem sich die Sonde ansammeln
konnte, wurden aufpräpariert. Um die Infiltration der Embryonen durch die Sonde zu
erleichtern und das Auswaschen nicht gebundenen Sonde nach der Hybridisierung zu
ermöglichen, erfolgte ein partieller Verdau mit Proteinase K (1 mL einer zimmerwarmen
PBSw-Lösung mit 10 μg/mL Proteinase K) für 15 min (Hirne und Mäuse für 10 min) bei
RT. Durch eine Lösung bestehend aus PBSw und Glycin (2 mg/ml) wurde die Aktivität
des Enzyms anschließend inhibiert. Diese Abstopplösung und Reste der Proteinase K
wurden durch dreimaliges Waschen mit PBSw auf Eis entfernt. Zur Stabilisierung der
Embryonen wurden sie darauf folgend für 15 min in 4 % PFA-Lösung, welche zusätzlich
mit 0,2 % Glutaraldehyd versetzt wurde, refixiert. Zur Entfernung des Fixanz wurde ein
kurzer und darauffolgend drei, mindestens 5 min Waschschritte angeschlossen. Zur
Äquilibrierung in Hybridisierungslösung (Hyb-Mix) folgte ein 5 min langer
Inkubationsschritt in 1 mL 1:2 mit PBSw gemischtem Hyb-Mix. Hierauf folgte das
Überführen in 100 % Hyb-Mix (1 mL). Das anschließende Vorhybridisieren fand für 3
Stunden bei 65 °C in einem Wasserbad statt. Nach dieser Zeit wurde der Hyb-Mix
entfernt und durch 1 mL frische, mit antisinn-/sinn-Sonde versetzter Lösung ersetzt. Für
diese Lösung wurden 1 - 3 μL der synthetisierten Digoxigenin-markierten Sonde in 1 mL
Hyb-Mix, für 5 min bei 95 °C erhitzt, um Sekundärstrukturen aufzulösen. Danach wurde
sie auf Eis abgekühlt, um einem Sonden-Abbau vorzubeugen. Die darauffolgende
Hybridisierung der Sonde an die nachzuweisende mRNA fand bei 70 °C über Nacht
statt.
IV.5.4.3. ISH Tag 2 – Auswaschen unspezifisch gebundener Sonde und Antikörperbehandlung
Der zweite Tag der ISH bestand darin, ungebundene Sonde auszuwaschen
beziehungsweise falsch gebundene Sonde von ihrer Hybridisierungsstelle zu lösen.
Material und Methoden
105
Dies geschah durch Waschen mit Lösungen unterschiedlichen Salzgehalts und bei
unterschiedlichen Temperaturen (70 beziehungsweise 60 °C und RT).
Die ersten Schritte wurden bei 70 °C durchgeführt. Begonnen wurde damit die Sonden-
Hyb-Mix Lösung durch frischen Hyb-Mix zu ersetzen. Die Sondenlösung konnte
wiederverwertet werden, indem sie bei -80 °C aufbewahrt wurde. Der Waschschritt
wurde einmal wiederholt und der Hyb-Mix dann wiederum durch 800 μL Hyb-Mix
ausgetauscht. Diese Waschschritte wurden jeweils 30min durchgeführt. Daraufhin
wurde in 5 min Abständen drei Mal 400 μL 2 x SSC mit einem pH-Wert von 4,5 auf die
Lösung gegeben. Diese Mischung wurde wieder abgezogen und das Gläschen mit 2 x
SSC (pH-Wert 7,0) aufgefüllt. Nach 30 min wurde dieses durch frisches 2 x SSC (pH
7,0) ausgetauscht und wieder für 30 min gewaschen. Nun folgten zwei kurze (10 min)
Waschschritte mit MABw (Maleinsäure mit 0,1 % Tween) bei RT und zwei lange (30
min) bei 70 °C. MABw wurde nun bei RT durch PBSw ersetzt. Mit diesem wurde zwei
Mal für 10 min und einmal für 5 min bei RT gewaschen. Nun waren die Embryonen
bereit für den Antikörper-Blocking-Puffer. Von diesem wurde 1 mL zu den Embryonen
gegeben und dies für 2 Stunden bei 4 °C inkubiert, um unspezifische Bindestellen für
den, mit der alkalischen Phosphatase gekoppelten, Anti-Digoxigenin-Antikörper
unzugänglich zu machen. Der Antikörper wurde mit Blocking-Lösung verdünnt
(1:10.000) und auf die Embryonen gegeben. Der Antikörper konnte nun über Nacht bei
4 °C an die Digoxigenin markierte Sonde binden.
IV.5.4.4. ISH Tag 3 – Auswaschen von unspezifisch gebundenem Antikörper und Färbung
Am dritten Tag wurde falsch/nicht gebundener Anti-Digoxigenin-Antikörper entfernt, um
Fehlfärbungen zu vermeiden. Letztlich wurde eine Färbelösung zu den Embryonen
gegeben, welche ein Substrat der alkalischen Phosphatase enthält. Wird dieses durch
sie umgesetzt, entsteht dabei ein blauer Farbstoff.
Die Behandlung an Tag 3 begann mit sechsmaligem Auswaschen des Antikörpers
durch PBSw mit 0,1 % BSA auf einem Taumel-Rollenmischer. Zwischen den
Waschschritten wurde eine Inkubationszeit von 45 min gewährt. Danach folgten zwei
Waschschritte à 30 min mit 1 x PBS- oder PBSw und daraufhin wieder zwei à 30 min
mit AP1-Puffer (Puffer der Alkalischen Phosphatase mit einem pH-Wert von 9,5). Nun
wurde in jedes Well von 12er Wellplatten 1,5 mL eines 1:2 Gemisches aus AP1-Puffer
Material und Methoden
106
und BM-Purple Lösung gegeben. Die Farbreaktion fand auf Grund des
lichtempfindlichen Substrats im Dunkeln statt. Je nach Schnelligkeit der Färbung
konnten die Platten bei RT, 4 °C oder auch 37 °C gehalten werden.
War die Färbung wie gewünscht, wurde die Färbereaktion durch dreimaliges Waschen
mit 1 x PBS- abgestoppt. Zur Auswertung und zum Fotografieren wurden die
Embryonen in 1 x PBS- belassen oder zur Aufbewahrung in 100 % Ethanol/Methanol
überführt und bei -20 °C gelagert.
IV.5.5 Anfertigung von histologischen Vibratomschnitten Der zu schneidende Embryo beziehungsweise das Hirn wurde in 500 μL Gelatine-
Albumin-Mischung über Nacht äquilibriert. Zwischen zwei Metallwinkeln wurde ein
Sockel aus 1 mL Gelatine-Albumin-Mischung mit 70 μL Glutardialdehyd (25 %)
gegossen. Nach vollständiger Aushärtung des Sockels wurde der entsprechende
Embryo/das Hirn auf diesem platziert und durch Gelatine-Albumin-Mischung mit
Glutardialdehyd bedeckt. Der so erhaltene Würfel wurde getrimmt und auf dem
Probenhalter des Vibratoms mit Cyanacrylat-Klebstoff befestigt. In 1 x PBS- wurden 40
μm dicke Schnitte angefertigt, die auf einen Objektträger transferiert wurden. Mittels
Mowiol und einem Deckgläschen wurden die Schnitte fixiert, haltbar gemacht und
konnten anschließend unter dem Mikroskop ausgewertet beziehungsweise fotografiert
werden.
IV.5.6 Anfertigung von Cryotomschnitten Nach der Fixierung durch PFA und Dents wurden die Embryonen für 30 - 60 min in 100
mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,3 gewaschen und anschließend sukzessive erst in 15
% und anschließend in 25 % Fischgelatine gebracht. Jeder Schritt wurde dabei für 16 -
24 h auf dem Taumelrollmischer vollzogen. In einem Quadrat aus Aluminiumfolie
wurden die Embryonen in 20 % Fischgelatine eingebettet und mit flüssigem Stickstoff
daraus ein Block aus Gelatine und Präparat gefroren. Anschließend wurde der Block
getrimmt, auf dem Cryotomhalter aufgeklebt und in einem Winkel von 5 °, 12 µm dünne
Schnitte angefertigt. Diese wurden auf spezielle Objektträger aufgebracht und bei -20
°C bis zur Immunfluoreszenz gelagert.
Material und Methoden
107
IV.5.7 Immunfluoreszenzfärbung und fluoreszente Markierung Die Immunfluoreszenzfärbung (IF) dient dazu Proteine mit Hilfe eines gegen das
Protein selbst gerichteten primären Antikörpers (AK) und eines sekundären, mit einer
Fluophore gekoppelten und gegen den primären AK gerichteten, AKs nachzuweisen.
Die Embryonen wurden dafür transversal auf Höhe des Mittelhirns mit einem
Mikromesser geteilt, um Aufsicht auf das Hirn zu erlangen. Anschließend wurden sie in
24er Wellplatten mit 1 x PBS- überführt und dreimal für 15 min bei 4 °C mit PBS/0,1 %
Triton gewaschen, um die Zellen aufnahmefähig für den Antikörper zu machen. Der
Blockierungsschritt erfolgte für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C mit 300 μL einer
1:10 Mischung aus CAS-Block und 1 x PBS-/0,1 % Triton. Darauf folgte die Inkubation
in den primären Antikörpern, welche mit CAS-Block verdünnt wurde. Die Embryonen
wurden in 200 μL davon bei 4 °C über Nacht inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit
1 x PBS- für jeweils 15 min wurden die sekundären Antikörper ebenfalls in CAS-Block
verdünnt und 200 µL davon auf die Embryonen appliziert. Diese wurden darin 2 h bei
RT oder über Nacht bei 4 °C inkubiert und anschließend erneut viermal für 15 min mit 1
x PBS- gewaschen. Da der sekundäre Antikörper lichtempfindlich ist, fanden alle
Schritte ab der Inkubation mit dem sekundären Antikörper sowie die Aufbewahrung bis
zur Auswertung im Dunklen statt.
Sollte zusätzlich das F-Aktin-Cytoskelett markiert werden, wurden die Embryonen für 30
min bei RT oder über Nacht bei 4 °C mit 200 µL Phalloidin-Lösung (1 x PBS-, 1:40
Alexa Fluor® 488 Phalloidin) behandelt und anschließend viermal für 15 min mit 1 x
PBS- gewaschen.
Um die Injektion zu verfolgen, konnte anstatt Dextran Tetramethylrhodamin auch
Dextran, Alexa Fluor® 488 mitinjiziert werden. Dies war nach der IF noch sichtbar.
Für die Anfärbung der Zellkerne wurden die Embryonen für mindestens 10 min bei RT
in Hoechst 33342 (1:10.000-1:15.000 in PBS- verdünnt) inkubiert und anschließend
mehrmals in PBS- gewaschen.
IV.5.8 Immunfluoreszenzfärbung auf Cryotomschnitte Die gelagerten Schnitte wurden am Tag der IF in 1 x PBS-/0,05 % Triton inkubiert, so
dass sich die Gelatine von den Präparaten löste. Der Objektträger wurde mit einem
Papiertuch sorgfältig getrocknet und die Präparate mit einem hydrophoben Stift
umrandet, um so eine Inkubationskammer herzustellen. Anschließend erfolgte die
Material und Methoden
108
Rehydrierung der Schnitte in 1 x PBS-/0,05 % Triton. Der Blockierungsschritt fand für 1
h bei RT in 1 x PBS-/0,05 % Triton mit 5 % fötalem Kälberserum (FBS) statt. Der erste
Antikörper wurde in 1 x PBS-/0,05 % Triton verdünnt, für 1,5 h bei RT inkubiert und
ungebundene Antikörper anschließend durch dreimaliges Waschen für 10 min mit 1 x
PBS-/0,05 % Triton entfernt. Die Inkubation des zweiten Antikörpers, ebenfalls in 1 x
PBS-/0,05 % Triton verdünnt, erfolgte für 30 min bei RT. Nach dreimaligem Waschen
mit 1 x PBS-/0,05 % Triton wurden die Schnitte durch ein spezielles, Fluoreszenz
erhaltendes, Eindeckmedium mit DAPI haltbar gemacht und gleichzeitig die Nuklei
angefärbt.
IV.5.9 Probenvorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie Die Embryonen wurden aus dem Fixanz in 0,1 M PB überführt und anschließend
dreimal in 0,1 M PB für 10 min gewaschen. Anschließend wurden die Hirne in 1 %
Agaroseschälchen mit 0,1 M PB präpariert, ggf. sagittal oder transversal mit einem
Mikromesser geöffnet und in einer Osmiumtetroxid-Lösung (0,2 M PB-Puffer, 1 %
Osmiumtetroxid OsO4) für 1 h bei 4 °C nachfixiert.
Durch ausgiebiges Waschen in 0,1 M PB wurde freies OsO4 entfernt bevor die Hirne
durch eine aufsteigende Ethanolreihe (25, 50, 75, 2 x 100 %) entwässert wurden. Bis
zum Trocknungsprozess wurden sie bei -20 °C gelagert.
Durch eine Kritische-Punkt-Trocknung wurde das Ethanol bei 10 °C und hohem Druck
durch flüssiges CO2 ausgetauscht. Durch anschließendes Erhöhen der Temperatur auf
40 °C fand ein Übertritt des CO2 in die Gasphase statt und es konnte über ein Ventil
aus der Trocknungskammer ausgelassen werden.
Die nun getrockneten Hirne wurden mit einer Uhrmacherpinzette auf einen Aluminium-
Probenteller aufgebracht, welcher mit einem leitfähigen Haftaufkleber bezogen war.
Anschließend wurden sie in einem Sputtergerät mit einer dünnen Goldschicht
überzogen (100 sec; 40 mA; Arbeitsabstand 55 mm).
IV.5.10 Messungen der Ventrikel, Zellen und Cilienlänge Alle Messungen und die Kalkulation des Feret-Durchmessers wurden mit ImageJ
durchgeführt. Das Polardiagramm wurde in Statistical R erstellt.
Material und Methoden
109
IV.5.11 Photodokumentation und Bildbearbeitung Zur Auswertung und Dokumentation der Embryonen/Hirne wurden diese in 1 x PBS-
rehydriert und unter dem Stereomikroskop Zeiss SteREO Discovery.V12 fotografiert.
Die Schnitte wurden mit dem Zeiss Axioskop2 mot plus aufgenommen. Als
Digitalkamera kam jeweils die Zeiss AxioCam HRc zum Einsatz. Die
Fluoreszenzaufnahmen wurden mit dem konfokalen Mikroskop Zeiss Observer.Z1 in
Kombination mit der Laserscanningeinheit Zeiss LSM 700 angefertigt. Mit dem JEOL
JCM-5000 NeoScope wurden die REM-Aufnahmen erstellt.
Die so erhaltenen Bilder wurden im TIF-Format gespeichert, in Adobe Photoshop CS6
importiert und weiterverarbeitet. Die Bildbearbeitung bestand in der Ausrichtung der
Embryonen, Veränderung der Helligkeit und des Kontrasts sowie Vereinheitlichung des
Hintergrunds. Es wurde immer darauf geachtet, dass die Bilder keine Ergebnisse
suggerieren, welche nicht ohne Bildbearbeitung erzielt worden wären.
IV.5.12 Statistische Analysen Die P Werte wurden mittels des Mann-Whitney U-Tests in Statistical R kalkuliert, oder
durch den zweiseitigen, exakten Fisher-Test auf www.statpages.org.
Bei Analysen mit multiplen Tests sind die P Werte nach strikter Bonferroni-Korrektur
angegeben (außer es wurde extra darauf hingewiesen).
Nominal Levels * < 0.05, ** < 0.005, *** < 0.001.
IV.5.13 Internet-Datenbanken und Software Xenbase: http://www.xenbase.org/entry/; (James-Zorn et al., 2013)
GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/; (Benson et al., 2013)
Mendeley: https://www.mendeley.com/
ImageJ: http://imagej.nih.gov/ij/; (Schneider et al., 2012)
Fiji: http://fiji.sc/Fiji; (Schindelin et al., 2012)
Adobe Suite CS6: Photoshop und Illustrator
Statistical R: http://www.R-project.org/; (RCore Team 2014)
RStudio: http://www.rstudio.com/; (RStudio Team 2015)
Anwendungsbezogene Skripte und Makros für die Analyse in R wurden von Thomas
Thumberger erstellt, siehe (Hagenlocher et al., 2013).
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