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Lettore di micropiastre multimodale

03/05/18

Erminio Trevisi, Annarita Ferrari Dipartimento di Scienze animali, della nutrizione e degli alimenti – DIANA

Facoltà di Scienze Agrarie, Alimentari e Ambientali Università Cattolica S. Cuore

[email protected]

Lettore di micropiastre multimodaleSynergy™ 2 Multi-Detection Microplate Reader

(BioTek, Winooski, VT, USA).

Il lettore Synergy 2 esegue analisi in:

• Assorbanza UV-visibileclassica (FI)

• Fluorescenza in tempo risolto (FP)polarizzata (TRF)

• Luminescenza

Il sistema è costituito da: Stazione di lavoro (computer+software) Unità analitica:

lettore di micropiastre (Fig.1) iniettori (Fig. 2) per la dispensazione di reagenti

(Volume da 5 a 1000 mcl) Incubatore e agitatore piastre Dispositivo per lavaggio piastre

Figura 1 lettore di micropiastre

Figura 2 Iniettori

Dipartimento di Scienze animali, della nutrizione e degli alimenti – DIANA, area Scienze Animali

Micropiastre utilizzabili:a 6, 12, 24, 48, 96, 384 e 1536 pozzetti, congeometria standard 128 x 86 mm (micropiastre da 1536pozzetti non sono supportate per le misure di luminescenza).

Synergy™ 2

Possibilità di agitare la micropiastra Velocità bassa, media, alta o variabile Tempo di scuotimento programmabile

(Fig.3)

T°di incubazione (Fig.4): tra +4º C oltreT°ambiente e fino 50ºC.

Figura 3

Figura 4


Misure spettrofotometricheUV - visibile

Spettrofotometro: legge assorbanze a specifiche lunghezza d’onda (λ) Componenti: sorgente luminosa che origina una radiazione policromatica in un certo intervallo di λ monocromatore che scinde luce policromatica in luce monocromatica a determinata I cuvetta contenente il campione da analizzare cellula fotoelettrica sulla quale incide il raggio emergente dalla soluzione in esame sistema di amplificazione della corrente emessa dalla fotocella galvanometro per la misura della corrente elettrica.


Molte analisi colorimetriche convenzionali sono miniaturizzabili inun lettore di micropiastre, ad es.:- test ELISA- quantificazione parametri biochimica clinica (es. proteine,

glucosio, acidi nucleici, ecc.)- endotossine

In un tipico test colorimetrico, una reazioneenzima / substrato provoca un cambiamento dicolore nei campioni contenuti nei pozzetti nellamicropiastra.La luce ad una specifica λ attraversa ilcampione ed è captata da un rivelatore. Laquantità di luce assorbita dal campione èindicata come densità ottica (OD) o assorbanza

Misure spettrofotometricheUV - visibile


Sorgente luminosa: lampada allo xeno (misura assorbanza in UV e visibile) Monocromatore ad alta precisione: λ da 200 a 999 nm; ampiezza di banda 2,4

nm; incrementi di 1 nm Range OD: da 0 a 4

https://www.tnuda.org.il/en/physics-radiation/infrared-visible-light-and-soft-ultraviolet-radiation-%E2%80%93-introduction

Tipo letture effettuabili: • End-point• Cinetica• Scansioni spettrali


Synergy: misure spettrofoto-metriche (UV – visibile)

La fluorimetria ha un’elevata sensibilità e serve per la determinazionequantitativa di sostanze presenti in concentrazioni troppo basse per laspettrofotometria. Comunemente usata per il dosaggio di ionimetallici, vitamine, ormoni.http://omero.farm.unipi.it/matdidFarm/9/Capitolo%208%20-%20Fluorimetria%20e%20spettrofluorimetria.pdf

Misure in fluorescenza

Componenti principali fluorimetro: Sorgente luminosa (lampada alogena emette

energia eccitante) Filtri per selezionare la λ della luce eccitante Cuvetta con la soluzione da esaminare Filtri per captare λ della luce emessa (posti a

90°rispetto provenienza luce eccitante) Specchi per dirigere i percorsi di luce di

eccitazione e emissione Fotomoltiplicatore Rilevatore


Misura dell’Intensità di Fluorescenza (FI)• Sostanza da monitorare legata

chimicamente col marcatorefluorescente

• Luce a specifica λ eccita ilcampione

• Campione eccitato emette lucea diversa λ

1. Fluorescenza classica

https://www.biotek.com/products/detection-fluorescence-intensity-technology.html

Le tecniche fluorimetriche convenzionali utilizzano fluorofori (es. fluoresceina) condurata molto breve (~ 5 - 10 nsec) (Deshpande, 2001).

Limitazioni: elevati segnali di fondo (provenienti da effetto Rayleigh, Raman,Tyndall dall'ottica dello strumento, dalle cuvette o micropiastre e dalla matricestessa del campione)In diagnostica clinica segnali di fluorescenza di fondo da campioni biologici di solito sipresentano tra 300 e 600 nm e si sovrappongono con gli spettri di emissione di moltifluorofori convenzionali (Deshpande, 2001).


2. Fluorescenza a tempo risolto (TRF)https://www.biotek.com/products/detection-time-resolved-fluorescence-technology.html

TRF: supera molte limitazioni della fluorimetria convenzionale. Si differenziaper la tempistica del processo di eccitazione/misurazione.

FI: luce emessa dal campione è misurata mentre ancora presentel'eccitazione, per cui misurazioni presentano sempre background elevati.

TRF: background ridotto per uso di fluorofori (LANTANIDI) che emettonofluorescenza per periodi di tempo più lunghi (micro-sec.) ed esaurital'eccitazione provocata da lampada allo xeno


https://www.amedeolucente.it/pdf/Fluorescenza.pdf

Fluorescenza a tempo risolto (TRF)

https://www.amedeolucente.it/pdf/Fluorescenza.pdf


Figura 5FI FTR

TRF: Il ritardo nell’emissione luminosa, ha il vantaggio di evitare la sovrapposizione traeccitazione ed emissione di luce, con eliminazione dei segnali di fondo (Fig. 5).Applicazioni: screening dei farmaci.

FP utilizza un sistema ottico che include filtri polarizzanti.I campioni, addizionati del fluoroforo, sono eccitati con luce polarizzata (lampadaalogena). A seconda della mobilità del complesso proteina-fluoroforo, la luce emessasarà polarizzata o depolarizzata.• Grandi molecole (es. proteine; Fig. 6), ruotano lentamente: emettono luce polarizzata• Piccole molecole, ruotano rapidamente e depolarizzano il segnale.

Il lettore analizza la polarità della luce emessa dal campione, con filtri di emissionepolarizzatori parallelo e perpendicolare (https://www.biotek.com/products/detection-fluorescence-polarization-technology.html)

3. Polarizzazione di fluorescenza (FP)

http://www.activemotif.com/images/products/FP_diagram_animated.gif

Misure di polarizzazione della fluorescenzasono usate per studi su:• mobilità lipidica della membrana• Ri-orientamento della miosina• interazioni proteina-proteina a livello

molecolare.

https://www.thermofisher.com/it/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/technical-notes-and-product-highlights/fluorescence-polarization-fp.html


Figura 6

Micropiastre nere: per evitare interferenze tra pozzetti viciniSorgenti luminose:• Lampada alogena al tungsteno per i moduli: - FI (Fluorescence Intensity)

- FP (Fluorescence Polarization)• Lampada allo xeno per il modulo: - TRF (Time-Resolved Fluorescence)

Synergy 2: Determinazioni in fluorescenza

Filtri:

Letture in fluorescenza FI e TRF: necessari filtri di eccitazione ed emissione.

La configurazione dei filtri disponibili è riportata in figura 7, ma può essere implementata.

Letture FP: dotazione minima (ma mai utilizzata)Figura 7. Filtri eccitazione/emissione disponibili su Synergy2

DIANA (Department of animal science, food and nutrition) area Scienze Animali

Reazione chimica o biochimica che non richiede una sorgenteluminosa per l’eccitazione del campione.La luce emessa viene misurata dal rilevatore PMT (photomultipliertube PMT detector)

Campione nel pozzo prima della reazione chimica o biochimica

La reazione induce il campione a emettere luce che può essere misurata da un rilevatore.

https://www.biotek.com/products/detection-luminescence-technology.html

Luminescenza

Applicazioni: saggi di espressione genica

basati sulla luciferasi test vitalità cellulare,

citotossicità test bioritmici basati sul

rilevamento luminescente diATP.

Ad oggi mai utilizzata.


Il lettore di micropiastre è controllato da computer tramite il software Gen5 di BioTek per tutte le operazioni.Restituisce: assorbanze, intensità luminescenza e florescenza Consente: elaborazione dati (curva calibrazione, calcolo concentrazioni)

Software


Analisi spettrofotometriche ELISAEs. Determinazione Siero Amiloide A

(SAA)Analisi SAA in plasma: metodo ELISA sandwich.Eseguita con kit Phase Serum Amyloid A (TP 802, Tridelta Dev. Lim., Maynooth, Ireland)

Thermo shakerPHMP (Grant-bio,Cambridgeshire, UK)

INCUBATORE-AGITATORE Thermo shaker PHMP• Range regolazione temp.: 25 – 60 °C• Velocità agitazione: 250 – 1200 RPM

(incremento di 10 RPM)• Timer indipendente con segnale acustico:

0 – 96 h (incremento di 1 min.)


Lavatura piastre con Microplate Washer ELx405 TM

(BioTek, Winooski, VT, USA) (Fig. 12)

Lo strumento permette di impostare diversiprogrammi di lavaggio/aspirazione del campione(quantità del detergente da erogare, tempo di incubazionedel detergente con il campione, numero di lavaggi) infunzione delle esigenze dell’operatore


Figura 12

Analisi spettrofotometriche ELISADeterminazione Siero Amiloide A (SAA)

Analisi SAA: Synergy 2 utilizzato per:• Miscelare i campioni addizionati della

soluzione bloccante e del substratocromogeno (con pipetta multicanale)

• leggere piastra a 450 e 630 nm• Calcolare concentrazione SAA (µg/ml).



Concentrazione SAA: curva di calibrazione (ad ogni

serie di analisi; Fig. 13): lettura standard a concentrazioni note e crescenti di SAA

in base assorbanza campione si calcola concentrazione

Curva standard calcolata dal programma GEN.5utilizzando una regressione, in questo caso nonlineare a 4 punti (Fig. 14)


Figura 13

Figura 14


L’emolisi libera emoglobina (hb) nel plasma ed è visibile come colorazione rossa (in plasma o siero)dopo la centrifugazione del campione di sangue intero. La colorazione rossa assume un grado diverso diintensità in funzione del quantitativo di Hb liberata.Abbiamo usato lo spettro per studiare interferenze su varie analisi

L‘hb assorbe fortemente la lucea 415 nm. L'emolisi aumentapertanto l'assorbimento aquesta λ e provoca un aumentodella concentrazione di analitimisurati in questo intervallo.(eJIFCC: www.ifcc.org/ejifcc)Nella figura 15 si osserval’aumento di assorbanza a 415nm

Spettro campioni emolitici

Figura 15 Spettro campioni emoliticiDipartimento di Scienze animali, della nutrizione e degli alimenti – DIANA, area Scienze Animali

Hb (415 nm)

Analisi fluorimetricheEs. ORAC (Oxigen Radical Absorbance

Capacity)

Principio del metodo: decadimento dell’intensità di fluorescenza della fluoresceina (reag.1), inseguito alla formazione di radicali liberi, prodotti a seguito della decomposizione dell’azocomposto2,2’-azobis[2- methylpropionamidine]dihydrocloride (Reag.2) durante incubazione a 37°C

Le molecole di antiossidante nel campioneneutralizzano i radicali liberi. Esauriti gliantiossidanti, i radicali liberi attaccano lafluoresceina, causando una riduzionedell’intensità di emissione.

1°step analisi (piastre nere):Aggiunta di 35 µl di campione, standard (Trolox), bianco nei pozzetti della micropiastra

Fasi successive (Fig. 16) sono eseguite dalSynergy2.

Dipartimento di Scienze animali, della nutrizione e degli alimenti – DIANA, area Scienze AnimaliFigura 16

CURVA di taratura: costruita con letture di standard (Trolox) a concentrazionicrescenti.La concentrazione di ORAC nei campioni è espressa in mcmol/L di Trolox Equivalenti .

NetAUC = rappresenta il valoredi ORAC per ciascuncampione/standard

Area (NetAUC) è data dalladifferenza fra la curvaottenuta dalla lettura dellafluorescenza dello standard(o campione) e del bianco(solo reagenti) per 80 min.(lettura ogni 40 sec.)


Analisi fluorimetricheProcedura per la determinazione degli ORAC

(Oxigen Radical Absorbance Capacity)

Analisi eseguite dal Dipartimento DIANA area Scienze Animali

Parametro Kit/Metodo MatriceFluorometria: Oxygen Radical Absorbance Capacity ORAC determinati con il metodo descritto

da Cao e Prior (1999). Plasma

Spettrofotometria: Kit Colorimetrici: Superoxide Dismutase (SOD) Colorimetric Activitykit

Cod. K028-H1 Arbor Assays; Ann Arbor,Michigan USA

Plasma

Kit ELISA: "PHASE"TM Serum Amyloid A Assay (SAA) –Multispecies

Cod. TP-802; Tridelta D.L., Maynoot, Ireland Plasma

Insulin ELISA Mouse Cod.10-1247-01 Mercodia, Uppsala, Sweden Plasma

Insulin ELISA Bovine Cod. 10-1201-01 Mercodia, Uppsala, Sweden Plasma

Insulin ELISA Porcine Cod. 10-1200-01 Mercodia, Uppsala, Sweden Plasma

Bovine IL-6 Cod. ESS0029; Thermo Scientific, Frederick,MD, USA

Plasma

Bovine IL-1β Cod. ESS0027; Thermo Scientific, Frederick,MD, USA

Plasma

Cortisol Enzyme Immunoassay kit - 5 Strip plates Cod. K003-H5 Arbor Assays; Ann Arbor,Michigan USA

Plasma

General Vitamin B12 ELISA Kit Cod. CEA924Ge Cloud-Clone Corp.; Houston,TX 77082, USA

Plasma

Bovine IgG ELISA Quantitation Set Cod. E10-118 Bethyl, Montgomery, TX77356, USA

Plasma e latte

25-OH-Vitamin-D ELISA (Enzyme Immuno Assayfor the Quantitative Determination of 25-OH-Vitamin-D in human Serum or Plasma

Cod. EA 300/96 DLD Diagnostika GMBH;Adlerhorst, 22459 Hamburg, Germany

Plasma

Spettro: Spettro di campioni di plasma con diverso gradodi emolisi

Plasma

Tipo di analisi


Analisi eseguite dai dipartimenti DI.PRO.VE.S e DiSTAS

Protocollo utilizzato Note MatriceDipartimento di Scienze delle produzioni vegetalisostenibili (DI.PRO.VE.S) Organic P Determinazione del fosforo organico e inorganico

estraibile dal suolo ed assimilabile dalle pianteSuolo

Agronomia FOLIN Olio

ActiveC Determinazione del carbonio attivo utilizzabiledalla comunità microbica del suolo

Suolo

Microresp CO2Stima dell'utilizzo del substrato (da 0 a 6 ore) daparte della comunità microbica in funzione dellaproduzione di CO2

Suolo

UV Spectrum Determinazione dello spettro per valutare laqualità di sostanza organica disciolta nel suolo

Vegetali

NO2 e NO3 Determinazione di Nitriti e Nitrati Suolo

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari peruna filiera agro-alimentare Sostenibile (DiSTAS) FOLIN Determinazione del contenuto fenolico totale

(metodo di Folin-Ciocalteau) Estratti di alimenti,

estratti vegetali

Chimica Agraria, Alimentare e Ambientale FRAP (Ferric Reducing AntioxidantPower)

Estratti di alimenti, estratti vegetali

ORAC (Oxygen Radical AbsorbanceCapacity)

Estratti di alimenti, estratti vegetali

Proteine Determinazione proteine con metodo Bradford Proteine

Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari peruna filiera agro-alimentare Sostenibile (DiSTAS) Muffe A570 Colture cellulari

Microbiologia Agraria, Alimentare e Ambientale Crescita batterica Batteri

Dipartimento



Analisi • spettrofotometriche• in fluorescenza • in luminescenza

Campioni • Plasma• Latte• Colture cellulari• Colture di batteri• Estratti di alimenti• Estratti vegetali• Acqua• Suolo

Test • ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) per dosaggio di citochine, ormoni, vitamine• Determinazione di antiossidanti• Valutazione della Crescita batterica• Determinazione del contenuto fenolico in estratti di alimenti e vegetali• Determinazione del Fosforo organico ed inorganico utilizzabile dalle piante• Stima dell'utilizzo del substrato da parte della comunità microbica del suolo in funzione della

produzione di CO2• Determinazione del carbonio attivo utilizzabile dalla comunità microbica del suolo• Screening di farmaci• Spettro

Potenzialità Synergy2

Synergy™ 2 Multi-Detection Microplate Reader strumento acquisito da PRONUTRIGEN

Responsabile dello strumento: Prof. Erminio Trevisi (Dipartimento DIANA areaScienze Animali)

Referente per la gestione operativa: Dr.ssa Annarita Ferrari (Dipartimento DIANAarea Scienze Animali)

Chi intendesse utilizzarlo deve fare richiesta al Responsabile e prenotarne l’uso in accordo con ilReferente per la gestione operativa.

Ogni utilizzo dovrà essere registrato riportando tutte le informazioni richieste nell’apposita Scheda.

N°analisi e tempi di utilizzo, che serviranno per organizzare la manutenzione e calcolare la quotad’uso dello strumento (a consuntivo ogni anno). Il materiale di consumo deve essere acquistato dagliutilizzatori.

Norme per l’utilizzo comune


Scheda utilizzatori lettore micropiastre


Utilizzo lettore micropiastre(2014-2017)



Cao G. and Prior R.L. (1999) Measurement of Oxigen-Radical-Adsorbance-Capacity in biological samples. Methods Enzymol., 299: 50-62.

Deshpande S. S. (2001) Principles and Applications of Luminescence Spectroscopy, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 41:3, 155-224, DOI: 10.1080/20014091091797

Gosling James P. (1990) A Decade of Development in Immunoassay Methodology CLIN. CHEM. 36/8, 1408-1427 (1990) http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/IntroductionToPracticalBiochemistry/ch04s07.html http://omero.farm.unipi.it/matdidFarm/9/Capitolo%208%20-20Fluorimetria%20e%20spettrofluorimetria.pdf http://www.activemotif.com/images/products/FP_diagram_animated.gif https://www.amedeolucente.it/pdf/Fluorescenza.pdf https://www.biotek.com/products/detection-absorbance-technology.html https://www.biotek.com/products/detection-fluorescence-intensity-technology.html https://www.biotek.com/products/detection-luminescence-technology.html https://www.biotek.com/products/detection-time-resolved-fluorescence-technology.html https://www.thermofisher.com/it/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/technical-notes-and-product-

highlights/fluorescence-polarization-fp.html https://www.tnuda.org.il/en/physics-radiation/infrared-visible-light-and-soft-ultraviolet-radiation-%E2%80%93-introduction Jahan N., Minuti A., Trevisi E., (2015) Assessment of immune response in periparturient dairy cows using ex vivo whole blood

stimulation assay with lipopolysaccharides and carrageenan skin test. Veterinary Immunology and Immunopathology 165: 119–126

Osorio J. S,Trevisi E., Ji P., Drackley J. K., Luchini D., Bertoni G., Loor J. J. (2014) Biomarkers of inflammation, metabolism,and oxidative stress in blood, liver, and milk reveal a better immunometabolic status in peripartal cows supplemented with Smartamine M or MetaSmart. J. Dairy Sci. 97 :7437–7450 http://dx.doi.org/ 10.3168/jds.2013-7679

Thomas L., Haemolysis as influence and interference factor, eJIFCC vol 13 no 4 eJIFCC: www.ifcc.org/ejifcc www.dbt.univr.it/documenti/OccorrenzaIns/matdid/matdid753773.pdf

Bibliografia

dipartimento di scienze animali, della nutrizione e degli ... · eccitazione e emissione ... le...

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