diseño de oligonucleótidos
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Pasos a seguir para la construcción de oligosTRANSCRIPT
Diapositiva 1
Reaccin en Cadena de la PolimerasaMtodo de amplificacin in vitro que permite la generacin de una gran cantidad de copias (105 copias).Kary Mullis, 1985. Componentes de la Reaccin:
NobelPrize Chemistry (1993).OligonucletidosSolucin Amortiguadora (Mg2+)DNA Polimerasa TermoestabledNTPs DNA Templado1Reaccin en Cadena de la PolimerasaProtocolo General:
DesnaturalizacinDesnaturalizacinAlineamientoAmplificacinMeltingEnfriamiento1 Ciclo2
Reaccin en Cadena de la PolimerasaOligonucletidosSecuencias que flanquean el fragmento a amplificar.Actan como cebadoresTamao de 18-27 nucletidosDiseo 3-OH.Producto Amplificado: 100-300 pbContenido de GC 40-45%
3Diseo de OligonucletidosArabidopsis thalianaEscherichia coliPneumocystis cariniiBos taurusHepatitis C virusRattus norvegicusCaenorhabditis elegansHomo sapiensSaccharomyces cerevisiaeChlamydomonas reinhardtiiMus musculusSchizosaccharomyces pombeDanio rerio (zebrafish)Mycoplasma pneumoniaeTakifugu rubripesDictyostelium discoideumOryza sativaXenopus laevisDrosophila melanogasterPlasmodium falciparumZea mays
Seleccionar organismo.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/4
En dnde puedo buscar?http://www.genecards.org/5
Buscar la secuencia de nucletidos. NCBI Reference SequenceNombre mRNAOrganismo
NM_013693.2tumor necrosis factor (Tnf), mRNAMus musculushttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
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Seleccionar formato FASTA7
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OligonucletidosTamao de 18-27 nucletidosDiseo 3-OH.Producto Amplificado: 100-300 pbContenido de GC 40-45%
http://frodo.wi.mit.edu/9
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/Database: Refseq (Refseq_rna)Oligonucletidos11
Verificar Complementariedad12
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/Database: Refseq (Refseq_rna)NM_013693.2Oligonucletidos13Diseo de Oligonucletidos
14http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
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Verificar Especificidad17