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Dissémination viralede cellule à cellule
Igakura 2003
2 Voies d’infection virale
Voie « classique »
Voie « alternative »
Virions libres qui diffusent dans le milieu ext
Virions qui passent directement d’une celluleà une autre
2
Pourquoi le passage de cellule à cellule?
Echappement à la réponse immunitaire
Passage des barrières tissulaires « étanches »
Rapidité
muqueuses
Efficacité de transmission dans l’individu infecté
Ac neutralisants, complément
Multiplication dans les tissus où contacts cellulaires étroits
Système nerveux, organes lymphoïdes, surfaces épithéliales
Quelques exemples de virus enveloppés
•1ère partie: les Rétrovirus: HTLV-I et HIV-1
La notion de synapse virologique
• 2e partie: les Herpèsvirus:
HSV-1, PRV Passage de neurones à neurones ou de neurones à cellule épithéliale
MDV Un herpèsvirus atypique?
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1ère partie:HTLV-I et HIV
La synapse virologique
Rappels sur lesétapes tardives ducycle de réplication
des RétrovirusARNm env
épissé
Glycoprotéinesd’enveloppe
Ψ
ARNm génomiquenon épissé
Ψ+
PrécurseursGag et
Gag-Pol
Maturation
Golgi
Assemblage
Transportdes ARN
Transcription / épissage
Bourgeonnement
RE
Traduction
Noyau
_
SUgp120/gp46TMgp41/gp21
Prot d’enveloppe env
Prot de capside gag
MAp17/p19P6CAp24NCp7
PRp12
Prot enzymatiques pol
INp32RTp66
2 copies d ’ARNsimple-brin positif
?
HIV-1/HTLV-I
4
Exemple du virus HTLV-I
L’infection par le virus HTLV-I
- Leucémie T de l’adulte (ATL)1-2% des individus infectés HTLV-Iindividus agés 40-60 ans (incubation xs 10e d ’années)facteur de risque: infection périnatale, sexetumeur généralement monoclonale (provirus intégré dans un seul site)
- Myélopathie Associée à HTLV-I (HAM) ou Paraparésie Spastique Tropicale (TSP) 2-3% des individus infectées HTLV-ISyndrome inflammatoire
Isolé par R ". Gallo aux U.S.A. à partir des lymphocytes T du sang périphérique d ’unpatient atteint d ’un lymphome cutané (Poiesz 1980 PNAS vol77 P7415)
2 TYPES DE PATHOLOGIE
ENDEMIQUE Japon, Caraïbes, Amérique latine, Mélanésie, Afrique centrale
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Transmission du virus HTLV-I chez l’homme
Mode de transmission
- Périnatale par l’allaitement (lymphocytes du lait)- Sexuelle (lymphocytes du sperme)- Transfusion sanguine (lymphocytes du sang) Dépistage obligatoire depuis 1991- Aiguilles contaminées (lymphocytes du sang ) (toxicomanes++)
TOUJOURS ASSOCIE A DES CELLULES
==> PréventionEx: Transfusion sans cellules
Transmission du virus HTLV-I en culture cellulaire
Une transmission efficace du virus nécessite un contact cellulaireMécanisme?
Infection par co-culture
Production de particules virales libres
- Lymphocytes T naturellement infectées ne produisent pas de virions- Cellules productrices:
cellules transfectées et certaines lignées T chroniquement infectées 1 virion infectieux / 105-106 (Fan et al. 1992; Derse et al. 2001)
A partir de:- Lymphocytes T naturellement infectées- Certaines lignées T chroniquement infectées- cellules transfectées par le génome proviral
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Polarisation des protéines viralesdans la zone de contact cellulaire
Lymphocytes T i HTLV-ILymphocytes T non i
Contact40 min
en suspension
Attachement des cellules sur lamelle
Recherche de « Conjugés »et
Examen parMicroscopie confocale
(Env, Gag MAp19 ou NCp15, talin)
Igakura et al. Science 2003 , 299: 1713-1716
Gagp19 Env gp46
Au niveau de la jonction cellulaire:- Polarisation de Gag et Env- Gag et la taline s’accumulent dans des régions différentes
Cellules fraîches de patients HAM/TSP
Gagp15 Talin
Passage de matériel génétique viraldans la cellule initialement non infectée
Igakura et al. Science 2003 , 299: 1713-1716
Lymphocytes T i HTLV-ILymphocytes T non i
Contact40 min
Cellules fraiches de patients HAM/TSP Genome HTLV-I
5µm
Contact120 min
Cellules fraiches de patients HAM/TSP
+ CFDA-SE
Cellules T CD4+non i
Recherche de « Conjugés » et FISH et Examen parMicroscopie classique ou confocale (genome HTLV-I)
* *
*
Le génome HTLV-I s’accumule à la jonction cellulaire, puis est transféré dans la cellule cible
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Réorientation du MTOC dans les cellules infectéesHTLV-I vers la jonction cellulaire
Igakura et al. Science 2003 , 299: 1713-1716
Lymphocytes T i HTLV-I Lymphocytes T non i
Contact40-120min
en suspension
Attachement des cellules sur lamelle
Recherche de « Conjugés »et
Examen parMicroscopie confocale
(Gag p19 et tubulin)
Cellules fraiches de patients HAM/TSP
Gag p19 Tubuline
De plus…
Le Nocodazole inhibe l’accumulation de Gag à la jonction cellulaire. Le transport de Gag à la jonction cellulaire est donc dépendant des MTs. Igakura et al. Science 2003 , 299: 1713-1716
La réorientation du MTOC est associé à un contact cellule-celluleengageant ICAMI/LFA1 . Elle est associée à l’infection HTLV-I etpotentialisée à TaxNejmeddine et al. JBC 2005 , 280: 29653-29660
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La notion de synapse virologique (VS)
- Analogie avec la synapse immunologique
- Interaction cellulaire étroite entre lacellule infectée et la cellule cible
- Dépendante du cytosquelette (actine etMTs)
- Formée en réponse à l’infection virale
- Engage des molécules virales et desmolécules cellulaires (ex: protéinesvirales de surface et ligands cellulaires)-Réorganisation en « Microdomaines ».
- Permet un transfert rapide deséléments viraux de la cellule infectée à lacellule réceptrice
Résumé du passage trans-cellulaire de HTLV-IIgakura et al. Science 2003 , 299: 1713-1716
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Comment le génome viral HTLV-Iva-t-il être transféré? 2 hypothèses.
Dustin Nature Cell Biol. 2003 , 5: 271-72
Passage direct des cores nucléoprotéiques non enveloppé
Récepteur(s)
Molécules d’adhérence
EnvGag
Passage par bourgeonnement des particules enveloppées dans l’espace synaptique
HIV-1 et synapse virale
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Protéines virales et cellulaires impliquéesdans l’entrée du VIH-1
« T-tropic » « Dual-tropic » « M-tropic »
CD4+CXCR4+
CD4+CXCR4+CCR5
CD4+CCR5+
Lignée T Cellule T primaire Macrophage
SouchesHIV-1
CellulesciblesProtéines cellulaires
Protéines virales
HIV-1 se transmet également au seind’une synapse virologique
Jolly et al. J. Exp. Med. 2004, 199: 283-293
Polarisation des récepteurs (CD4 et CXCR4) et de Env Lymphocytes T Jurkatt LAI= cellules effectrices
Lymphocytes T CD4 primaires = cellules cibles
Contact30min
en suspension
CD4 Env gp41
Recrutement de Taline et de LFA-1 à la jonction cellulaire
Taline Env gp41 LFA-1 Env gp41
Concentration de Gag à la jonction cellulaire
10µm
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Pour HIV-1, la formation de lasynapse virologique nécessite Env
Env nécessaire pour la polarisation des récepteurs viraux
Ac; bloque interaction CD4-gp120Ac; bloque interaction gp120-CXCR4 (pas CD4)Petite mol; bloque interaction gp120-CXCR4
Jolly et al. J. Exp. Med. 2004, 199: 283-293
Pour HIV-1, la formation de lasynapse virologique est dépendante de l’actine
Le recrutement des récepteurs et des molécules d’adhésion dans la synapseimmunologique est un processus dépendant de l’actineDustin et Cooper Nature Immunology. 2000, vol1: 23-29
Jolly et al. J. Exp. Med. 2004, 199: 283-293
La polarisation de Env et de CD4 est dépendante du remodelage de l’actineCD4-Env
% conjugués polarisation Env-CD4
Cytochalasine
Latrunculine
Jasplakinolide
- (réduit); 0 (blocage); + (inchangé)
-
0
+
-
0
0
La polarisation de Env et de CD4 est un processus rapide (en 10min dans40% des conjugués).
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Le passage des éléments HIV-1 d’une cellule à l’autre.
Bourgeonnement dans l’espace « synaptique » ? Jolly et Sattentau Traffic 2004 , 5: 643-50
2ème partie:Les Herpèsvirus
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Herpèsviridae:Maladies et tropisme cellulaire
Gammaherpesvirus- Epstein-Barr virus (EBV)
Betaherpesvirus- Cytomegalovirus humain (hCMV)
Alphaherpesvirus
-Herpes simplex virus type 1 (HSV-1)
-Varicella-zoster virus (VZV)
- Virus de la pseudorage (PRV)
- Virus de la maladie de Marek (MDV)
Virus
Malformations congénitalesmaladie opportuniste chezles immuno-déprimés
Hô
Lymphocytes BMononucléose infectieuse,divers lymphomesHô
Cellules épithéliales,neuronesLeucocytes, neurones
Cellules épithéliales,neurones
Lymphocytes T, B
Lésions muqueuses(Peau, yeux),encéphaliteVaricelle (vésicules),encéphalite
Encéphalites (porcelet)
Lymphomes T
Hô
Hô
Porc
Poulet
TropismeMaladieHôte
Quelques évidences du passage privilégié desherpesvirus de cellule à cellule
- Virus très associés aux cellules (VZV, MDV > HSV-1, PRV)
- Accumulation de particules dans le cytoplasme et à la surface des cellules
- Réplication essentiellement dans des cellules fortement polarisées ou ayantde forts contacts cellulaires: épithéliums, neurones, lymphocytes.
- Faible efficacité des Ac vis-à-vis de la progression de l’infection (in vitro etin vivo )
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Physio-pathologie de l’infection naturelle
muqueuse
Primo-infection
Entréeen
latence
Réactivation
Ganglions nerveux
Neurones sensitifs
Primo-infection:InapparenteBénigneGrave
Système nerveux périphérique
Système nerveux central(encéphalite)
Rare (+++ porcelet à la mamelle)
ggl trigéminé et dans les ggl sensoriels
Ex: PRV chez le porc
Différentes voies de passage dans les conditionsnaturelles
« Principles of virology », Flint et al., 2nd ed.
- Passage de cellule épithéliale à cellule épithéliale
- Passage de cellule épithéliale à neurone (sensitif)
- Passage de neurone à neurone (SNP--> SNC)
- Passage de neurone (sensitif) à cellule épithéliale
ex: HSV1 et PRV
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Modèles d’étude du neurotropisme de PRV et HSV-1
Virus Hôte Naturel Tropisme d’Hôte ModèleHSV-1 Homme Etroit souris (intracérébral, œil)
PRV Porc Large (zoonose) œil de ratinfection IN de sourisflanc (peau)infection IN de porc
Nombreux systèmes d’étude pour le PRV
Exemple du modèle d’infection de la sourispar voie intranasale avec le PRV
(ganglion cervical supérieur)(EN: Sup cervical ggl neurons)Situé dans le cou
GG: Ganglion de GasserSSN: noyau salivaire supérieurSp5: noyau spinal trigéminalPG: ganglion ptérygopalatinIML: noyau inetrmédiolatéralSystème nerveux autonome: sympatique et parasympatique
Flamand et al. Virologie 1998 , vol2: 52-66
Présence du PRV dans les tissus nerveux(peu avant la mort); en 50h avec WT
Ggl de Gasser Ggl Cerv Sup
Coupe de cerveauau niveau Sp5 (flèche)
Coupe de la MEau niveau IML (flèche)
(flèche)
100µm
InfectionMassive12-18hpi
Infection Très localisée30hpiCulture primaires de neurones
périphériques à partir d’embryons derat ou de souris de 15 jours
PRV chez la souris: passage trans-neuronal
entre neurones connectés
INOCULATION
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Passage du PRV duneurone à la cellule épithéliale
Système in vitro permettant l’étude du passageneurone-cellule épithéliale
Chambre de Campenot:3 compartiments isolés Corps cellulaire axone Neurite / cellules réceptrices
non-neuronales
Methylcellulose
Soma M Neurite
INFECTION
antérograde
rétrograde
Ch’ng et Enquist JVI 2005 vol.79 p10875-89
Neurones primaires de rat du ganglion cervical supérieur
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Validation du système pour l’étude du passage decellule à cellule du PRV
S M NINFECTIONForte moiPRV Becker
Ch’ng et Enquist JVI 2005 vol.79 p10875-89
S M NINFECTIONJ2 Forte moi
+ CellulesRéceptrices
J1
Pas de relargage de particulesinfectieuses au niveau des axonestardivement après infection
Titrage du surnageant à ≠ t
Titrage du surnageant à ≠ t
Titrage du Surnageant48h pi
Titrage du Surnageant48h pi
Mise en évidence du passage du PRVde neurone à cellule non neuronale
Eléments essentiels et non essentiels pour le passagede PRV de neurones à cellules non neuronales (1)
Axone nécessaire au transport
gD non essentielle
Indirecte
directeINFECTIONavec virions gD nulproduit dans une lignéetranscomplémentante
RECHERCHE 24h pi:-virions libres (titrage)- PK15 infectées
PK15
Ch’ng et Enquist JVI 2005 vol.79 p10875-89
Les particules virales libres ne seraient pas nécessaire pour ce passage trans-cellulaire
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Le virus mutant Bartha, un mutant essentielpour l’étude des bases moléculaires
de la dissémination du PrV de cellule à cellule
- Réplication efficace dans les lignées cellulaires
- Vaccin vivant atténué, utilisé en médecine vétérinaire
- Délétion unique dans le génome (gE, gI et US9)
- Tue les animaux de laboratoire mais plus lentement que WT
- Ne se dissemine dans les neurones que dans le sens rétrograde
Sens de dissémination p/r à celui de l’influx nerveux:Antérograde: pré => post-synaptiqueRétrograde: post => pré-synaptique
- gE, gI et US9 affecte la dissémination dans les neurones et entre neurones, uniquement dans le sens antérograde en culture- Gènes viraux impliqués dans la dissémination dans le sens rétrograde ?
Eléments essentiels et non essentiels pour le passagede PRV de neurones à cellules non neuronales (2)
Sche Bartha (gE-gI-US9) vs délétion de gE, gI ou US9
- Les mutants gE, gI et US9 sont seulement partiellement défectif pour ce passage trans-cellulaire- Bartha (sche vaccinale) ne se dissémine pas des neurones aux cellules épithéliales
Réduction
Ch’ng et Enquist JVI 2005 vol.79 p10875-89
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Modèle de la dissémination antérogradedu PRV dans l’axone de neurones en culture
Enquist JID 2002 , vol186: S209-214
US9 gE et gI(partie terminale)
gE/ gI et US9 agiraient à différents niveaux dans la sortie des virions de l’axone
Secteur proximal de l’axone très riche en cytosquelette
Rôle US9: sorte d’adaptateurpour la sortie dans l’axone
US9
Sortie dans l’axone
US9-dépendant(stimulée par gE/gI)
Sortie dans le corps
du neurone
US9-indépendant(peut-être stimulée par gE/gI)
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Nature des particules qui passent du neurone auxcellules non neuronales
?
100nm
La jonction cellulaireCh’ng et Enquist JVI 2005 vol.79 p10875-89
Nature de la jonction
Visualisation
?
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Exemple du virus de la maladie de Marek
Un autre cas étonnant d’herpèsvirus,le virus de la maladie de Marek
« Virions libres extracellulaires » in vivo Follicules plumeux
Virions associés aux cellules in vivo Tout tissu sauf follicule plumeuxin vitro Tous les systèmes de culture
- Agent pathogène majeur du poulet- Maladie lympho-proliférative- Pertes économiques importantes malgré existence de vaccins- Virus très contagieux (transmission directe et indirecte)
Particularité
Question irrésolue:- Mécanisme de passage du virus d ’une cellule à une autre, hors follicule plumeux
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Principe d’identification d’un gène essentiel à ladissémination virale en culture cellulaire:
exemple du gène UL49 codant VP22Dorange et al. 2002 J.Virol, 76: 1959-70.
Bac20 Bac20ΔUL49
CESC
a bVP5
TRANSFECTIONbacmide BAC20delUL49
Recherche protéine de capside VP5par immunofluorescence
MDV est le seul herpèsvirus connu pour lequel VP22 est essentiel (avec VZV depuis 2007)
Clonage du génome viral dansun BACMIDE
(souche atténuée 584Ap80c)Génome complet US2-
Délétion du gène par recombinaisonhomologue dans E. coli
Gènes identifiés comme essentiels dans ladissémination virale en culture cellulaire
CESC; QM7
CEF, QM7
CEF, QM7
CEF, QM7
CEF, QM7
Systèmecellulaire
VP22
gE
gI
gM
gN
Protéine
UL49
US8
US7
UL10
UL49.5
gène
Dorange et al. 2002
Schumacher et al. 2001
Schumacher et al.2001
Tischer et al. 2002
Tischer et al. 2002
Bac20
Bac20
Bac20
Bac20
Bac20
RéférenceBac
Rq:- Pas de gène homologue de US9- Pas de gène gD exprimé
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Un très grand nombre de questions irrésoluespour ce virus….
Nature des particules transmises
Nature des jonctions cellule-cellule: synapse virologique?
Parcours du virus et types cellulaires infectés in vivo
Passage de cellule à cellule, le seul mode de transfert du virus?
Très peu de particules virales enveloppéesdans le cytoplasme
Cellules en culture cellulaire: fibroblastes, myoblastes …Projections cellulaires viro-induites?
CONCLUSIONS
- Virus profitent de voies de communications cellulaires naturelleset les détournent à leur profit.
- Tous ces mécanismes de dissémination de virus de cellulerestent mal connus. Domaine en pleine expansion. Grand essoravec les techniques nouvelles d’imagerie.
- La Virologie bénéficie des découvertes de la biologie cellulaireet inversement (découverte de nouvelles voies de communicationcellulaire).