HUET Julia

Diversité des communautés microbiennes des

eaux souterraines des aquifères fracturés

Encadrement : Alexis Dufresne et Philippe Vandenkoornhuyse

Université de Rennes 1

UMR 6558 EcoBio et UMR 6118 Géosciences

Equipe Rôle de la Biodiversité dans les Processus Écologiques

Master 2 Écologie Fonctionnelle, Comportementale et Évolutive

Université de Rennes 1

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Remerciements :

Je tiens tout d‟abord à remercier mes deux maitres de stage, Alexis Dufresne et Philippe

Vandenkoornhuyse, sans qui cette étude n‟aurait pas été possible, et parce que je n‟aurais

probablement pas autant aimé mon stage, sans leurs conseils, leurs idées et leur manière de

supporter avec le sourire mes angoisses et mes bavardages. Cette opportunité que vous m‟avez

donnée m‟est vraiment importante et votre encadrement m‟a soutenu tout au long de mon stage.

Je souhaite également remercier, du fond du cœur, Sophie Coudouel et Flavia Nuñez, qui

ont cadré mes manipulations, de leurs conseils techniques avisés, de leur bienveillance et de leur

bonne humeur à (presque) toute épreuve. Merci pour le temps que vous m‟avez consacré, merci

pour les discussions que nous avons eu et qui m‟ont faite avancer. Une mention spéciale aussi, pour

Stéphane et ses conseils joyeux, sa musique et son rire.

Je tiens aussi à remercier mes camarades de promotions, pour leur bonne humeur, leur

présence et pour tous les moments de détente passés ensemble. Un petit mot particulier pour Pauline

(ma Symbiotique, quand tu te réveilles à 6h00, de l‟autre côté de Rennes, je me réveille aussi. La

vie ne serait aussi drôle sans toi), Camille (ma petite Belette angoissée… Toi et tes pauses cafés

m‟avaient bien souvent remontée), Solène (ma Sauterelle, toi la magnifique complice de mes fous

rires), Quentin (pour le vrai plaisir de discussion construites et des moments d‟échanges, pour la

découverte de toi), et bien sûr tous les autres, Michel, Guillaume, Amaury, Natacha, Pauline,

Thiago et Nico (notre pièce rapportée préférée) avec qui je passe du bon temps et qui sont

importants.

Une pensée, aussi, pour mes amis, particulièrement mes Trois Mousquetaires et mes Colocs,

pour leur soutien, leur patience face à mes sautes d‟humeur et mes doutes. Heureusement que vous

étiez là… Dans le cas contraire, il eut fallu vous inventer (« C‟est pas Faux » me direz-vous, mais

non irons à Montargis, en passant par la forêt de Malcombes).

Enfin, je tiens à remercier ma mère pour son indéfectible soutien, pour sa patience et son

amour, pour tout ce qu‟elle est, pour tout ce qui nous lie, et qui fait que je suis, jour après jour.

Pour finir, une pensée pour une étoile. À toi qui nous a quitté, toi qui aimait énergiquement,

toi qui débordait de vie, toi qui courait, chantait, dansait, toi qui avait cette place particulière dans

notre cœur à tous. À toi ma Mio, toi qui a tant marqué ma vie, tu n‟es plus des nôtres, mais tu es

tellement plus. Vole, Marion, mon Ange, et toujours voyage.

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SOMMAIRE

Introduction ......................................................................................................... 3

Matériel et Méthodes ........................................................................................... 6

Échantillonnage ...................................................................................................................... 6

Préparation des amplicons ...................................................................................................... 7

Préparation des banques d‟amplicons et pyroséquençage ...................................................... 9

Traitement et analyse des données ....................................................................................... 10

Résultats ............................................................................................................. 12

Analyses préliminaires et filtrage des données ..................................................................... 12

Structure des communautés microbiennes ............................................................................ 15

Composition des communautés microbiennes ...................................................................... 16

Analyse de la composition taxonomique des communautés ................................................ 18

Discussion ........................................................................................................... 20

Annexes ............................................................................................................... 25

Annexe I : Référence des protocoles .................................................................................... 25

Annexe II : Correspondances Amorces fusionnées et échantillons ...................................... 26

Bibliographie ...................................................................................................... 27

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INTRODUCTION

Les systèmes aquatiques souterrains, quelque soit leur nature (poreux, fracturés, ou

karstiques), sont des écosystèmes présentant un ensemble de caractéristiques fonctionnelles

originales. Particulièrement, l‟absence de lumière dans les aquifères rend impossible la

production primaire par le biais de la photosynthèse et provoque l‟émergence d‟une

allotrophie obligatoire (EC2CO Projet Aquadiv). Ainsi, la matière organique, produite en

surface puis apportée dans les hydrosystèmes par lessivage des sols, présente deux

caractéristiques : sa faible concentration et sa réfractibilité à la biodégradation (Goldscheider

et al., 2006). D‟autre part, le temps de résidence des eaux dans les aquifères varie de manière

importante au sein des hydrosystèmes souterrains, ce qui a pour effet de créer une

hétérogénéité des conditions physico-chimiques au sein d‟un même système. (Goldscheider et

al., 2006). En effet, une augmentation du temps de résidence des eaux dans un aquifère

entraîne une diminution des ressources disponibles, en terme de nutriments et d‟oxygène. Il y

a donc un effet de contrôle des ressources disponibles par la vitesse de renouvellement et le

temps de résidence des eaux dans les aquifères (Griebler & Lueder, 2009).

Par ailleurs, les écosystèmes souterrains hébergent une large gamme d‟organismes.

Particulièrement, la distribution des micro-organismes dans les écosystèmes n‟étant limitée

que par un très petit nombre de facteurs (pH, température, disponibilité en eau) (Griebler &

Lueder, 2009), ils sont présents dans tous les écosystèmes (Ward, 2002) et notamment dans

les aquifères souterrains. De plus, du fait de leur grande quantité (5x1030

individus à échelle

planétaire), ainsi que de leur ubiquité (Fuhrman, 2009), ils représentent un impressionnant

panel d‟activités métaboliques qui leur sont propres. Ces caractéristiques les placent au cœur

des cycles biogéochimiques et font de ce compartiment non visible à l‟œil nu, un important

facteur de régulation des cycles de matières (Johnson, 2004a, Ward, 2002). Or, les micro-

organismes des aquifères, qui représenteraient jusqu‟à 40% de la biomasse procaryotique

totale (Griebler & Lueder, 2009), sont méconnus (Goldscheider et al., 2006). Cette

méconnaissance des communautés microbiennes des aquifères constitue un manque

d‟information pour la compréhension de leur fonctionnement et pour l‟établissement de

critères permettant de déterminer leur état de santé (Griebler & Lueder, 2009). Même si les

biocénoses microbiennes ont été plus étudiées pour leur rôle dans la dépollution des aquifères

contaminés (Johnson et al., 2004a, Wang et al., 2009), la diversité des micro-organismes des

4

écosystèmes aquatiques souterrains reste étudiée de manière très marginale (Balkwill et al.,

1997).

S‟il existe une diversité particulière liée aux caractéristiques fonctionnelles des

aquifères, les variations de flux de nutriments et d'O2 peuvent avoir un impact fort sur la

dynamique des populations de micro-organismes. De plus, dans le contexte actuel de

changement global, il devient nécessaire de pouvoir établir l‟état de santé des écosystèmes, en

particulier dans le cas des aquifères souterrains qui représentent la deuxième plus grande

réserve d‟eau potable planétaire après les glaciers. Par exemple, dans le cas particulier de

contamination des aquifères, il est difficile d‟envisager le rôle de la biodiversité locale sur les

processus de dépollution (Johnson et al., 2004a). Il paraît donc nécessaire d‟étudier et

d‟identifier les communautés de micro-organismes présentes, afin de pouvoir envisager le

fonctionnement des systèmes aquatiques souterrains de manière globale.

L‟émergence de nouvelles approches culture-indépendantes (ciPCR et séquençage en

masse d'amplicons) permet d‟avoir accès à l'ensemble des micro-organismes connus ou

inconnus, cultivables ou non cultivables à partir d'un échantillon d'eau ou de sol. L'application

de ces méthodes moléculaires permet ainsi de caractériser finement les communautés

microbiennes et révolutionne notre vision de la diversité des micro-organismes (e. g. Sogin et

al., 2006) en permettant un accès à l‟ensemble des organismes, connus ou inconnus,

cultivables ou non cultivables. Elles permettent, donc, d‟avoir une vision exhaustive de la

diversité microbienne.

Le projet AQUADIV est un programme de recherche à l‟interface entre écologie

fonctionnelle, hydrologie et géochimie, visant à étudier les relations entre le fonctionnement

des écosystèmes aquatiques souterrains et leur biodiversité. Un des axes d‟études concerne la

relation entre hydrodynamisme (temps de résidence des eaux) et variabilité faunistique

(communautés microbiennes et stygobies). Le projet porte sur deux types d‟écosystèmes

aquatiques souterrains (système granitique fissuré en Bretagne et système karstique de

l‟arrière pays montpelliérain) qui présentent des variations importantes en termes de temps de

résidence de l'eau et de ressources. De plus, le fait qu‟ils appartiennent à deux aires

biogéographiques différentes peut permettre d‟envisager si les liaisons mises en évidence

revêtent un caractère général ou particulier. Le projet vise donc à approcher de manière

5

intégrée les cycles biogéochimiques dans leur ensemble ainsi que les processus liés aux

communautés faunistiques et à leur structure. De même, il permet d‟envisager le rôle des

organismes dans le fonctionnement trophique de ces écosystèmes particuliers. Enfin, il vise à

compléter les connaissances pouvant être utiles à l‟établissement de diagnostiques sur l‟état

de santé des écosystèmes aquatiques souterrains.

C‟est dans ce projet que s‟inscrit cette étude. L‟objectif est, ici, d‟apporter des

connaissances sur les communautés microbiennes des écosystèmes aquatiques souterrains

fissurés. Dans le cadre de ce stage, l‟attention a été portée sur les communautés microbiennes

de la partie superficielle d'un aquifère soumis à de forte contraintes anthropiques (agriculture

et exploitation de la ressource en eau). Les hypothèses de travail testées au cours de cette

étude sont :

(i) une homogénéité de la diversité locale (diversité alpha) entre réplicats

d‟échantillonnage,

(ii) une structuration de la diversité spatiale liée au fait que les puits analysés distant

de quelque dizaines de mètres ne sont pas nécessairement soumis aux mêmes flux

hydrologiques.

Pour tester ces hypothèses, l'amplification et le séquençage massif d'amplicons d‟une région

du gène codant l'ARN de la petite sous-unité ribosomale (ARNr 16S) sont utilisés. Compte

tenu de l'importance de ce gène pour l'activité métabolique de tous les micro-organismes

(synthèse des protéines), la séquence de ce dernier est particulièrement bien conservée. Ainsi,

les mutations de cette séquence renseignent sur l'histoire évolutive des organismes et donc de

la diversité biologique.

6

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Échantillonnage :

Cette étude a été conduite sur l‟aquifère fracturé de Betton (Ille-et-Vilaine,

01°39‟18‟‟O, 48°11‟41‟‟N). Ce site fait l'objet d'un suivi régulier par l'équipe EAU de l'UMR

Géosciences Rennes (Luc Aquilina). Il est

ainsi très bien caractérisé d'un point de vue

hydrologique (vitesse de circulation,

datation des eaux) et hydrochimique. Trois

piézomètres de surface Pz2, Pz3 et Pz4 ont

été échantillonnés (profondeur : 12m +/-

5m, temps de recharge inférieur à 10 ans).

Les trois piézomètres (Figure 1) présentent

des caractéristiques physico-chimiques

différentes : des eaux fortement

minéralisées (200 mg/L) et à forte

concentration en nitrates (supérieure à 50

mg/L) pour le piézomètre 3, des eaux

faiblement minéralisées (100 mg/L) et à

faible concentration en nitrates (inférieure à

10 mg/L) pour les autres piézomètres (suivi effectué par l‟équipe de Luc Aquilina).

- Plan d’échantillonnage :

Pour chaque piézomètre, trois échantillons ont été prélevés, soit un total de neuf échantillons,

nommés comme indiqué dans le Tableau 1.

- Filtration :

Les échantillons d‟eau souterraine ont été

prélevés avec une pompe immergée Grundfos MP1.

Pour chaque échantillon, deux litres d'eau ont été

récupérés après stabilisation des paramètres physico-

Figure 1: Carte du site de prélèvement. Les piézomètres 2, 3 et 4

ont été échantillonnés. Les eaux sont fortement minéralisées

(200mg/L) et présentent une concentration en nitrate forte

(50mg/L) pour le piézomètre 3. Les eaux sont faiblement

minéralisées (100mg/L) et faiblement nitratées pour les

piézomètres 2 et 4.

Tableau 1 : Dénomination des neuf

échantillons prélevés. Pour chaque piézomètre,

trois échantillons ont été prélevés.

7

chimiques (pH, température, conductivité) mesuré dans l'eau à la sortie de la pompe. Les

échantillons d'eau ont été stockés dans des bidons nettoyés à l'acide sulfurique 0,5 M et rincés

10 fois avec de l'eau MilliQ. Les échantillons ont ensuite été filtrés avec un dispositif de

filtration en série : préfiltration sur un filtre isoporeTM

10µm (Millipore), dans le but

d‟éliminer les particules grossières, puis filtration sur un filtre StérivexTM

0,22µm (Millipore)

pour récupérer les communautés microbiennes. Les filtrations ont été réalisées

immédiatement après l'échantillonnage (piézomètres 2 et 4) ou après conservation à 4°C

pendant 12 heures (piézomètre 3). Les filtres ont été immédiatement congelés dans l'azote

liquide et conservés à -80°C.

Préparation des d’amplicons :

- Extraction des acides nucléiques :

Les acides nucléiques ont été extraits selon le protocole du Kit PowerSoil-DNA Isolation Kit

(Mobio) (Annexe I). Cette extraction repose sur la combinaison d'une double lyse cellulaire :

une lyse mécanique et une lyse chimique. De plus, le protocole intègre la purification des

extraits, ce qui permet de passer directement à l‟étape d‟amplification par Polymerase Chain

Reaction (PCR).

- Choix des amorces:

Les amorces ont été choisies, dans la littérature pour amplifier une région particulière de

l‟ADN ribosomal 16S, marqueur taxonomique des bactéries et des Archea. Elles ont aussi été

choisies de manière à obtenir une taille d‟amplicon comprise entre 400 et 500 nucléotides, ici

411 nucléotides sans les amorces, taille des molécules permettant d'envisager un

pyroséquençage avec le protocole Titanium (séquençage de molécule d'ADN de grande

taille). L‟amorce anti-sens, P_16_R : CCGTCAATTCCTTTGAGTTT, est identique à celle

du couple utilisé par Yu et Morrison, 2004. L‟amorce sens P_16_F :

GTGCCAGCMGCCGCGGTAATAC, est celle de Yu et Morrison (2004), modifiée par

l'ajout de 3 bases en 3‟ et d'une base dégénérée. Elles répondent à des critères précis

(Température Tm d‟hybridation inférieure à 75°C, séquences non complémentaires entre

elles, particulièrement en 3‟, séquences sans structure secondaire forte (ΔG<-3 kcal/mol).

8

Tableau 2 : Mélange réactionnel et cycle utilisés pour

l‟amplification par PCR. Les proportions du mélange réactionnel

ont été obtenues selon le protocole de InvitroGen Taq TM et le

nombre de cycles ainsi que la température d‟hybridation (64 °C)

ont été optimisés.

De plus, le pourcentage de la diversité procaryote couverte par les couples d‟amorces a

été testé avec le logiciel Primersearch (http://emboss.open-

bio.org/wiki/Appdoc:Primersearch) sur la base de séquences d‟ARN ribosomal 16S du site

Ribosomal Database Project (Cole et al., 2008).

- Choix des marqueurs de multiplexage et conception des amorces de fusion pour le

pyroséquençage

Les amorces de fusion (Figure 2) sont des amorces particulières utilisées pour la constitution

des librairies d‟amplicons destinées au pyroséquençage. Ce sont des amorces constituées des

amorces spécifiques de la séquence cible, d‟un marqueur de multiplexage (ou MIDs), d‟une

clé et d‟un adaptateur spécifique du protocole de pyroséquençage.

Le procédé de multiplexage permet de séquencer des mélanges d'amplicons issus

d'échantillons séparés en ajoutant aux amorces de fusion, des séquences de 5 à 10 nucléotides.

Ces marqueurs de multiplexage (ou MIDs) permettent de reconnaître les séquences obtenues

par pyroséquençage et de les trier en fonction de leur échantillon d‟origine. La sélection des

MIDs de 5 nucléotides s'est faite par l‟analyse de la stabilité des structures secondaires (seuil :

l‟enthalpie (∆G) doit être supérieure à -3 kcal/mole) au sein des amorces fusionnées, grâce au

programme mfold (Zuker M., 2003). Neuf couples de MIDs permettant de séquencer un

mélange d'amplicons issus des neuf échantillons ont été sélectionnées. La liste des neuf

couples d'amorces de fusion est donnée en Annexe II.

- Optimisation du cycle de PCR

L‟ADN ribosomal 16S a été amplifié par

PCR. La température optimale d‟hybridation

(64°C) a été obtenue en réalisant des gradients

de température successivement plus resserrés.

Le volume du mélange réactionnel (Tableau 2,

proportions de réactifs selon le protocole de

Figure 2 : Constitution des amorces fusionnées utilisées pour le pyroséquençage. Chaque amorce est

constitué de l‟amorce spécifique de la zone ciblée fusionnée à un marqueur de multiplexage (ou MID),

une clé de séquençage et un adaptateur spécifique pour le pyroséquençage.

9

InvitroGen TaqTM

) était de 25µL. Chaque échantillon a été amplifié quatre fois de manière

indépendante et les produits d‟amplification regroupés deux à deux, afin d‟avoir deux

réplicats de séquençage indépendants.

Préparation des banques d’amplicons et pyroséquençage

- Purification, dosage, dilution et regroupement des produits de PCR

Les amplicons d'un même échantillon issus de 2 PCR ont été purifiés selon les

recommandations de Roche (Annexe I : Amplicon Library Preparation Method Manual). La

concentration des amplicons a été mesurée par dosage fluorimétrique (Protocole en Annexe I).

Les concentrations ont été ajustées à 109 molécules par µL. Les amplicons issus des neuf

échantillons ont ensuite été regroupés de manière équimoléculaire dans un même tube. Il y a

finalement deux tubes (mélange équimolaire), qui constituent les librairies d‟amplicons

multiplexés soumises au séquençage, la seconde correspondant à un réplicat vrai

d'amplification et de séquençage.

- Réalisation des banques et Amplification clonale par PCR en émulsion

Chaque tube contenant le mélange d'amplicons multiplexés a été utilisé pour la fabrication

d'une banque d'ADN à séquencer. Les banques ont été réalisées et amplifiées par PCR en

émulsion en suivant le protocole du kit lib-A Medium Volume de Roche (Annexe I).

La PCR en émulsion permet l‟amplification clonale de molécules, isolées les unes des

autres dans une émulsion huile/eau. Chaque molécule isolée est amplifiée dans une micro-

goutte de mélange réactionnel. Cette technique permet d‟amplifier clonalement un très grand

nombre de molécules d‟ADN en parallèle Une seule modification a été apportée au protocole.

Dans le cadre de cette étude, il a été choisi de séquencer les amplicons dans un seul sens aussi

un seul type de bille de capture des séquences d'ADN a été utilisé au lieu de deux en raison

des réplicats de séquençage réalisés.

- Pyroséquençage des librairies d’amplicons.

Le pyroséquençage est une technique de séquençage par synthèse, qui se caractérise par la

détection en temps réel de l‟activité de synthèse d'ADN par l‟ADN polymérase. Au cours du

séquençage, les 4 nucléotides sont ajoutés séquentiellement les uns après les autres et de

manière cyclique au mélange réactionnel. Si le nucléotide ajouté correspond à celui attendu

10

Figure 3 : Démarche générale de traitement des séquences. Quatre étapes de

traitement préliminaires ont été nécessaires pour obtenir les OTUs : filtrage

(RDP, Cole et al., 2008), suivi d‟un tri par échantillon (RDP, Cole et al., 2008),

sélection des séquences communes aux deux réplicats (clusterisation par CD-

Hit, Li et al., 2006) et classement des séquences en OTUs).

par la polymérase, il est incorporé dans le brin néo-formé, déclenchant une réaction chimique

aboutissant à l'émission d'un signal lumineux capté par la caméra CCD du pyroséquenceur.

L‟utilisation de cette technique a plusieurs avantages. Tout d‟abord, elle permet

d‟effectuer un séquençage plus rapide et à moindre coût par rapport à la technique de Sanger

utilisée classiquement. D‟autre part, elle permet d‟obtenir un très grand nombre de séquences

en parallèle (jusqu'à un million de séquences pour un „run‟ dans la version Titanium) avec des

séquences de taille relativement grande, dans le cas de cette étude, 450 bases. Pour toutes ces

raisons, le pyroséquençage est devenue aujourd'hui la technique de séquençage de référence

en écologie.

C‟est donc, ici, le protocole GS FLX Titanium Amplicon Sequencing (Roche, Annexe I)

qui a été adopté. Les amplicons ont été séquencés dans un seul sens à partir d'un primer de

séquençage reconnaissant l'adapteur B du kit Lib-A MV de Roche (Plateforme de Génomique

Environnementale, UMR 6553 EcoBio).

Un quart de plaque de séquençage à été utilisé pour chacune des deux banques réalisées à

partir du mélange d'amplicons. Ainsi, une demi-plaque de séquençage a été utilisée pour le

séquençage des deux réplicats dans le cadre de cette étude.

Traitement et analyse des données

- Traitement des données

Avant d‟être analysées, les

séquences ont été soumises à

quatre étapes de traitement

(Figure 3).

Étape 1 : Les séquences ont été

soumises à trois étapes

successives de filtrage : (i) par

les filtres des logiciels Roche

(filtres lors du traitement du

signal), (ii) par les filtres

développés par la plate-forme de

11

Génomique Environnementale du CAREN (élimination des séquences trop courtes, contenant

des nucléotides indéterminés, ayant une composition en nucléotides anormale) et (iii) par les

filtres implémentés dans les outils de la base RDP (pas de nucléotides qui diffèrent dans les

amorces, pas de nucléotides indéterminés dans les séquences, taille minimale de la séquence

de 150 nucléotides, score Q de qualité supérieur ou égal à 20 (Cole et al., 2008).

Étape 2 : Les séquences ont été triées en fonction des échantillons grâce à la reconnaissance

des marqueurs de multiplexage (Outils de RDP, Cole et al., 2008).

Étape 3 : Les séquences, classées par échantillons, ont été clusterisées (100% de

ressemblance, CD-Hit, Li et al., 2006) et les séquences appartenant à des clusters présents

dans les deux réplicats ont été sélectionnées..

Étape 4 : Les séquences retenues ont été classées en unités taxonomiques opérationnelles (ou

OTUs), par clusterisation à 98% de ressemblance et élimination de certaines séquences trop

courtes (programme Mothur (Schloss et al., 2009)).

- Analyse des OTUs

Les données ont été analysées sur deux axes distincts.

Tout d‟abord, pour étudier la diversité et de la structure des communautés

microbiennes, les indices de diversité de Shannon et de similarité de Sorensen (prenant en

compte la redondance d‟organismes entre les échantillons ; diversité β) et ont été calculés

(Mothur, Schloss et al., 2009). De même, des courbes de raréfaction ont pu être tracées grâce

aux nombres d‟OTUs obtenus en fonction du nombre de séquences obtenues (Mothur, Schloss

et al, 2009). Enfin, une Analyse en Composante Principale sur la répartition des OTUs en

fonction des échantillons a permis d‟étudier la structure des communautés microbiennes

échantillonnées (R, Thioulouse et Dray, 2007).

D‟autre part, la composition taxonomique des communautés microbiennes a été

étudiée grâce à l‟assignation taxonomique des séquences représentatives des OTUs dans la

classification taxonomique de la base de séquences d'ARNr 16S RDP (Cole et al., 2008).

Enfin, un arbre phylogénétique (méthode du Neighbor Joining, programme MEGA4 (Tamura

et al., 2007)) a été reconstruit à partir de ces séquences pour faire le lien entre la diversité des

OTUs et la composition taxonomique observée.

12

Tableau 3 : Répartition du nombre de séquences avant et après filtrage et tri par échantillon en fonction du MID. . Les

séquences classées en « No Tag » sont celles qui n‟ont pas pu être attribuées à un échantillon en raison d‟un MID non

reconnaissable.

RÉSULTATS

Analyses préliminaires et filtrage des résultats

235 818 séquences ont été récupérées au total et avant filtrage (135 079 pour le

réplicat 1 et 100 739 pour le réplicat 2). Après les trois étapes de filtrage, 127 431 séquences

ont été récupérées (78 488 pour le réplicat 1 et 48 943 pour le réplicat 2).

- Assignation des séquences par échantillon

L‟utilisation d‟identifiants de multiplexage permet d‟attribuer chacune des séquences

obtenues à l‟échantillon auquel elle appartient. Le nombre de séquences obtenues par

échantillons pour chacun des réplicats est donné dans le Tableau 3. Les séquences ont été

filtrées selon quatre critères (pas de nucléotides qui diffèrent dans les amorces, pas de

nucléotides indéterminés dans les séquences, taille minimale de la séquence de 150

nucléotides, score Q de qualité supérieur ou égal à 20, Outils de Ribosomal Database Project

(Cole et al., 2008)).

Le nombre de séquences varie entre les échantillons et donc en fonction du marqueur

utilisé pour le multiplexage (MID) Certains MIDs n'ont pas permis pour permettre aux

séquences d‟être de récupérer des séquences d'ARNr 16S. C‟est le cas des MIDs utilisés pour

les échantillons Pz32 et Pz43. Cependant, les répartitions du nombre de séquences en fonction

des échantillons présentent des tendances similaires entre les deux réplicats, sauf pour Pz41,

13

Figure 4 : Nombre de singletons (séquences spécifiques d'un

réplicat, présentes en copie unique) de clusters et séquences

spécifiques de chaque réplicat (un cluster spécifique contient au

moins deux séquences) et de clusters et de séquences communes aux

deux réplicats (un cluster commun au moins deux séquences). Seuls

les séquences regroupées dans des clusters communs aux deux

réplicats ont été retenus pour la suite des analyses.

dont le nombre de séquences obtenues pour le réplicat 2 est beaucoup plus faible que pour le

réplicat 1 (1 432 contre 9 632 séquences).

- Sélection des séquences par clusterisation.

La comparaison des séquences des deux réplicats permet d'éliminer les erreurs potentielles

dues aux étapes de PCR, de PCR en émulsion et de séquençage (substitutions, insertions ou

délétions de nucléotides, formation de chimères). L‟analyse des articles publiés à ce jour

utilisant le séquençage de masse d'amplicons indique que la stratégie choisie ici est novatrice.

Quand une séquence donnée est retrouvée dans les deux réplicats, il peut en être déduit que

cette séquence existe vraiment, la

probabilité que deux erreurs produites

aléatoirement dans les deux réplicats

soient identiques étant très faible

(P=0,00000567). Pour identifier les

séquences retrouvées dans les deux

réplicats, une stratégie automatisée a été

mise en place consistant à comparer

l'ensemble des séquences obtenues

contre elles-même pour identifier les

groupes de séquences identiques. 29104

séquences appartenant à 3252 groupes

communs aux deux réplicats (Figure 4)

ont été retenues pour la suite de

l‟analyse (Scripts développés par

A.Dufresne). Ainsi, 35 % (17119,

réplicat 2) à 70 % (55227, réplicat 1)

des séquences produites sont en copie

unique dans les deux réplicats et ne

peuvent être utilisées pour la suite de

l'analyse. Le nombre de séquences par

groupe varie de 1152 à 2. La majorité

des groupes ne contiennent que deux

séquences (une séquence de chaque réplicat) (Figure 5). Sans cette stratégie innovante, ces

Figure 5 : Distribution du nombre de séquences par cluster.

Quelques clusters regroupent un grand nombre de séquences mais

la majorité n‟en contient que 2, une de chaque réplicat.

14

séquences présentes en copie unique dans chacun des réplicats n‟auraient pas été prises en

compte dans la suite de l‟analyse des communautés microbiennes.

- Classement des séquences en Unités Taxonomiques Opérationnelles (OTU).

A partir des séquences sélectionnées par l‟étape précédente, une deuxième clusterisation a été

réalisée en utilisant un seuil d‟identité moins strict. Les séquences ayant au minimum un seuil

d‟identité de 98% (Shabarova et Pernthaler, 2010), ont été regroupées en 706 Unités

Taxonomiques Opérationnelles (ou OTU). Le seuil de 98% est celui classiquement utilisé

pour définir, sur le plan moléculaire, les espèces en microbiologie ; on ne parle ici, toutefois,

pas d‟espèces, ce seuil étant relativement laxe.

- Qualité d’échantillonnage de la diversité

Les courbes de raréfaction (Figure 6) montrent une saturation forte de la diversité en termes

d‟OTU (le nombre d'OTU augmente de 100 unités quand le nombre de séquences passent de

15000 à environ 30000), ce qui signifie que l‟effort de séquençage appliqué est suffisant pour

envisager la diversité des communautés microbiennes globale présente dans les différents

échantillons analysés.

Figure 6 : Courbe de raréfaction montrant le nombre total d‟OTUs en fonction du

nombre de séquences obtenues à partir de l'ensemble des échantillons. Les OTUs

sont définis avec un seuil de 98% d'identité entre les séquences.

15

Structure des communautés microbiennes

- Diversité des communautés :

Les diversités observées pour chacun des piézomètres (échantillon par échantillon) sont

faiblement mais significativement différentes les unes des autres (Kruskal-Wallis chi-squared

= 7.2, df = 2, p=0,02732). La diversité

observée sur la totalité des séquences

(Figure 7) est plus importante que les

diversités de chacun des échantillons (H‟

Tot : 4,59 ; Diversité α selon Shannon :

3,80) et la communauté microbienne du

piézomètre 3 présente une plus forte

diversité que les deux autres piézomètres

(H‟ Pz3 : 3,97 ; H‟ Pz2 : 3,80 ; H‟ Pz4 :

3,65). La proportion de diversité des

séquences au sein des piézomètres par

rapport à la diversité totale des séquences

du site varie faiblement (de 79 à 86%).

Cependant, c'est le piézomètre 3 qui présent

la plus forte diversité par rapport à la

diversité totale des séquences (H‟ PzX/H‟ Tot : Pour Pz3 : 0,86 contre Pz2 : 0,83 et Pz4 :

0,79 ; calculs selon Johnson et al., 2004b). Enfin, la proportion de diversité entre les

piézomètres est relativement faible ((H‟Tot-Diversité α)/H‟Tot : 0,17 ; Calculs selon Johnson

et al., 2004b).

- Similarité des communautés

microbiennes :

Les indices de similarité (Tableau 4)

montrent un regroupement des

échantillons issus du même piézomètre

(indice de similarité au sein du

piézomètre : supérieur à 0,5 pour les trois)

malgré un nombre de séquences par

Figure 7 : Indices de diversité de Shannon. La diversité α

représente la diversité moyenne des séquences des

piézomètres. Grâce à ces indices de diversité, il est possible

de calculer la proportion de diversité de chacune des

communautés (Diversité des séquences du

piézomètre/Diversité totale), de même que la proportion de

diversité entre les communautés ((Diversité totale-Diversité

α)/diversité totale) par rapport à la diversité totale des

séquences.

Tableau 4 : Similarité entre les échantillons séquencés

(indice de Sorensen). Le code couleur correspond à la

similarité globale (vert : similarité globale supérieure à 0,5 ;

saumon : similarité globale comprise entre 0,38 et 0,5 ;

jaune : similarité globale inférieure à 0,38.).

16

piézomètre pouvant être assez différent. Néanmoins, comme le nombre de séquences

produites est suffisant pour décrire la diversité dans tous les échantillons (courbes de

raréfaction) la différence du nombre de séquences par échantillon a un effet limité. D‟autre

part, la communauté microbienne du piézomètre 3 se différencie des deux autres (indice de

similarité globale : entre 0,25 et 0,35 alors que compris entre 0,35 et 0,5 pour l‟indice de

similarité global entre les deux autres types de communautés).

Composition des communautés microbiennes

Les séquences représentatives des OTU ont été assignées aux taxons définis dans la

taxonomie RDP à l‟échelle du phylum, afin, dans un premier temps, d‟analyser la

composition des communautés microbiennes. Les différences structurelles des communautés

sont également présentes sur le plan de la composition entre les échantillons. En effet, deux

ACP successives montrent des résultats venant confirmer l‟existence de différences profondes

entre les communautés microbiennes des trois piézomètres.

Tout d‟abord, les résultats de l‟ACP effectuée sur les échantillons en fonction des

phyla montrent une différenciation importante entre les piézomètres en termes de composition

(Figure 8).

Figure 8 : Résultats principaux de l‟ACP : projection des OTU en fonctions des échantillons. Les axes du cercle de corrélation (a)

sont déterminés par les échantillons contribuant au moins à 50% (Axe 1 : Beta-Proteobacteries, Bactéries non classées, Chloroflexi,

Actinobacteria, Verrucommicrobia, Acidobacteria, Nitrospira ; Axe 2 : Firmicutes, Bacteroidetes, Lentisphaerae, Gamma-

Proteobacteria, Alpha-Proteobacteries, Proteobacteria non classées, Planctomyces). Les échantillons forment 3 groupes distincts

lorsqu‟ils sont projetés dans ce plan calculé (b).

1

2

3

a b

17

Les piézomètres se différencient fortement sur le plan de la composition en phyla. Les

échantillons sont, en effet, répartis selon trois groupes :

- Groupe 1 : Les ß-Proteobacteria dominent largement (contribution de 97% à l‟axe),

avec une composition de communauté microbienne associée aux échantillons du

piézomètre 2 et à un des échantillons du piézomètre 4.

- Groupe 2 : La présence de Firmicutes et de Bacteroidetes est déterminante dans les

communautés microbiennes des échantillons du piézomètre 3

- Groupe 3 : La communauté microbienne de l‟échantillon Pz41 présente une

composition taxonomique particulière et se détache nettement des autres échantillons.

D‟autre part, l‟étude de la composition des communautés en termes d‟OTU montre des

résultats intéressants. En effet, l‟ACP effectuée fait émerger une différenciation des OTU en

quatre groupes distincts, dépendants des piézomètres (Figure 9).

Figure 9 : Résultats principaux de l‟ACP : projection des OTU en fonctions des échantillons. Les axes du cercle de corrélation (a)

sont déterminés par les échantillons contribuant au moins à 55% (Axe 1 : Pz21, Pz22, Pz23, Pz42 ; Axe2 : Pz31, Pz33). Les OTU

forment 4 groupes distincts lorsqu‟ils sont projetés dans ce plan calculé (b).

a b

1

2

3

4

18

D‟autre part, les OTU forment quatre groupes distincts en fonction des échantillons :

- Groupe 1 : OTU présents dans les échantillons des piézomètres 2 et 4, très peu

présentes dans les échantillons du piézomètre 3.

- Groupe 2 : OTU présents dans les échantillons du piézomètre 3, très peu présentes

dans les échantillons des piézomètres 2 et 4.

- Groupe 3 : OTU rares mais présentes dans les échantillons des piézomètres 2 et 4 et

quasiment absents des échantillons du piézomètre 3.

- Groupe 4 : OTU très peu présents dans tous les échantillons.

Analyse de la composition taxonomique

Les séquences représentatives des OTU ont été assignées aux taxons définis dans la

taxonomie RDP afin d‟étudier la composition taxonomique des échantillons prélevés (Figure

10). Le domaine des Archaea est

complètement absent des échantillons, alors

même que les amorces couvraient

théoriquement une partie de la diversité de ce

domaine. Sur un total de 20 phyla, un phylum

ressort nettement et domine les échantillons,

celui des β-Proteobacteria (qui représente

quasiment 70% de la totalité des séquences.).

D‟autres phyla sont également retrouvés, dans

d‟importantes proportions : Bacteroidetes

(11% des séquences), Firmicutes (5,5% des

séquences) et Acidobactéries (2,7% des

séquences). Enfin, 5,5% des séquences

obtenues ne peuvent être assignée à aucun des

phyla connus aujourd'hui.

Acidobacteria

Actinobacteria

Bacteroidetes

Chloroflexi

Cyanobacteria

Firmicutes

Gemmatimonadetes

Lentisphaerae

Nitrospira

OP10

OP11

Planctomycetes

Proteobacteria Unclassified

Proteobacteria-alpha

Proteobacteria-beta

Proteobacteria-delta

Proteobacteria-gamma

Unclassified Bacteria

Verrucomicrobia

WS3

0 5 1015202530354045

pz21 (rep1+2)

pz22 (rep1+2)

pz23 (rep1+2)

pz31 (rep1+2)

pz33 (rep1+2)

pz41 (rep1+2)

pz42 (rep1+2)

Figure 10 : Distribution taxonomique des OTUs. Les phyla sont

représentés en pourcentage par échantillon. Le signal taxonomique

semble bien conservé au sein des piézomètres.

19

L‟arbre phylogénétique (Figure 12) construit à partir des séquences représentatives des

OTU montre l'existence d'une très grande diversité entre les OTU. Les séquences assignées à

un même phylum bactérie se regroupent ensemble dans l'arbre et la majorité des phyla de

bactéries détectés dans ces séquences semblent monophylétique, à l‟exception des Firmicutes,

des Bacteroidetes, et des α- et δ-Proteobacteria.

Les séquences non assignées apparaissent fortement distantes de celles assignées à des phyla

connus. D‟autre part, et de manière intéressante, une partie de ces séquences forment

également des groupes monophylétiques au sein de l‟arbre phylogénétique.

Figure 11 : Arbre phylogénétique (méthode : Neighbor Joining) représentant la diversité des OTUs de l‟ensemble des

échantillons. Chaque couleur représente un phylum. La couleur grise représente les OTUs non assignées.

20

DISCUSSION

Les connaissances liées à la composition des communautés microbiennes prennent de

plus en plus d‟importance en s‟intégrant aux problématiques liées au contexte de changement

global. De plus, les nappes phréatiques représentent 97% du potentiel d‟eau potable sur Terre

et abriteraient 40% de la biomasse procaryotique (Griebler & Lueders, 2009). Par ailleurs,

l‟implication des communautés microbiennes dans tous les processus biogéochimiques rend

leur connaissance nécessaire à la compréhension du fonctionnement des écosystèmes

(Fuhrman, 2009) et, notamment, des écosystèmes aquatiques souterrains (Porter, 2009). C‟est

dans ce cadre que s‟inscrit cette étude, dont le but était de décrire le mieux possible la

diversité des communautés microbiennes d'un aquifère modèle (Betton, France). Plusieurs

innovations importantes sont associées aux résultats présentés ici. En effet, il s‟agit de :

(i) La première analyse exhaustive de la diversité microbienne d’un aquifère, par une

approche de séquençage massif d’amplicons

(ii) La première analyse d'amplicons de longue taille des fragments (450 nucléotides)

par séquençage de masse (GS FLX 454)

(iii) La première étude ayant choisi comme stratégie l'usage de réplicats vrais de

séquençage.

Conformément aux hypothèses de travail, il existe une structuration spatiale des

communautés microbiennes, bien que les puits d'où aient été prélevés les échantillons d'eau ne

soient distants que de quelques dizaines de mètres les uns des autres. En effet, les indices de

similarité de Sorensen montrent une différenciation forte des communautés microbiennes

d‟un des puits (le piézomètre 3, situé au sud du site). Les résultats de l‟ACP concernant la

répartition des OTU dans les piézomètres sont en accord avec ces observations. Ainsi, les

OTU forment quatre groupes distincts, dont deux sont fortement affiliés au piézomètre

d‟origine de la communauté ainsi qu'un groupe d'OTU spécifique au piézomètre 3. La

distribution taxonomique montre également une forte variabilité au niveau du site. En effet,

les résultats de l‟ACP effectuée sur les échantillons en fonctions des phyla indiquent un

détachement des communautés microbiennes du piézomètre 3. Cette structuration correspond

aux observations déjà faites sur les indices de similarité de Sorensen et de diversité. Ainsi, les

21

échantillons du piézomètre 3 se singularisent d‟un point de vue structurel et taxonomique.

Parallèlement à cette différenciation des communautés, des différences de composition

chimique des eaux sont mises en évidence. En effet, le piézomètre 3 présente la particularité

d‟être situé à proximité d‟un pôle d‟activités anthropiques agricoles et domestiques et l'eau

échantillonnée dans ce puits contient de fortes teneurs en nitrates (suivi effectué par l‟équipe

de Luc Aquilina, données en cours d‟acquisition). Néanmoins, les travaux réalisés ne

permettent pas de définir si ces différences dans la chimie de l'eau sont la résultante de la

composition microbienne de la communauté ou inversement. Ces changements de diversité

des communautés microbiennes peuvent être également la conséquence de changements de

fonctionnement global de l‟environnement incluant plantes et sols (Griebler & Lueder, 2009)

puisque l'eau des aquifères résulte de la percolation.

La composition taxonomique trouvée dans les échantillons analysés est partiellement

en accord avec la littérature existante (Shabarova, 2010, Griebler et Lueders, 2009,

Goldscheider, 2006) avec notamment la dominance de séquences du phylum β-Proteobacteria

(environ 70% des séquences) et la présence de phyla caractéristiques des milieux aquatiques

souterrains tels que des Bactéroidetes (11% des séquences), Firmicutes (5,5% des séquences)

ou encore des Acidobactéries (2,7% des séquences). Compte tenu de la profondeur de

séquençage et de la stratégie d'usage de réplicats vrais nous mettons en évidence la présence

de micro-organismes associés à 'la biosphère rare'. Ainsi, environ 0,5% des OTU

appartiennent à des phyla tels que OP10, OP11, WS3 ou encore Gemmatimonadetes. L'un des

résultats les plus originaux du travail présenté ici est la mise en évidence

d‟approximativement 5,5% de séquences n‟ayant d'affinités phylogénétiques avec aucun des

phyla de bactéries connus à ce jour. Ces séquences non-assignées représentent 27% des OTU

et contribuent donc fortement à la diversité des communautés échantillonnées. Elles forment

des groupes inconnus dans les arbres phylogénétiques. Certain de ces groupes présentent des

distances phylogénétiques très élevées par rapport aux séquences présentes dans les bases de

données et forment des branches très profondes (anciennes d'un point de vue évolutif). Cette

présence d‟organismes formant des phyla nouveaux démontre la nécessité d‟étudier en

profondeur la diversité des communautés microbiennes selon des stratégies rigoureuses telles

qu'appliquées ici. Dans toutes les études d‟amplicons par séquençage de masse publiées

jusqu‟à présent, la saturation du nombre d‟OTU n‟est jamais observée. La diversité des micro-

22

organismes semble donc gigantesque (par exemple : Sogin et al., 2006). Les courbes de

raréfaction construites ici indiquent une forte saturation du nombre d‟OTU trouvés, ce qui est

en désaccord avec les travaux publiés jusqu'à présent. Une différence essentielle, qui doit être

soulignée entre ces travaux et l'étude conduite ici, est l'exclusion fiable des séquences

artificielles qui a été opérée ici au moyen de l'usage de réplicats vrais de séquençage de

masse. Il est vraisemblable que les études comme celle de Sogin et al. (2006) ont une diversité

apparente bien plus élevée que la diversité réelle contenue dans les échantillons. Ceci est

d'autant plus vrai que les algorithmes de clusterisation utilisent souvent la composition en

nucléotides pour produire les clusters. De fait, une erreur de séquençage dans un

homopolymère, une erreur d'incorporation de nucléotide dans la PCR, ou autre, implique une

inflation artificielle du nombre d'OTU (Kunin et al., 2010). Cette étude montre que

l'utilisation de réplicats d'analyse (amplification PCR et séquençage indépendants) permet

d'obtenir de manière simple des résultats de qualité supérieure. Il faut noter également que

l'utilisation de réplicats permet également de retenir dans le jeu de données des séquences

présentes en copies uniques dans chaque réplicat et ainsi d'augmenter la couverture de la

diversité. Un bémol peut toutefois être formulé, quand de grandes variations du nombre de

séquences produites dans les deux réplicats existent. Dans cette étude, il est probable que des

séquences uniquement présentes dans le réplicat 1 (70% des séquences) aient été éliminées à

tort de l'analyse à cause du plus petit nombre de séquences dans le réplicat 2. La variabilité du

nombre de séquences pourrait être liée à une différence d‟efficacité des amorces de fusion

utilisées lors de l‟amplification.

Cette étude amène de nombreuses perspectives de travail. Tout d‟abord, pour connaître

et comprendre le fonctionnement fin des aquifères, il serait pertinent d‟explorer en détails la

diversité sous plusieurs aspects. Dans un premier temps, il est nécessaire d‟étudier le lien

entre diversité et temps de renouvellement de l‟eau en échantillonnant des eaux d‟âges

différents et notamment plus anciennes. Ce type d‟étude peut apporter des informations sur le

fonctionnement et la dynamique des populations microbiennes des eaux souterraines et

d‟ouvrir de nouvelles perspectives sur le fonctionnement de ces écosystèmes aquatiques

souterrains. En effet, la circulation d‟eau, dans les écosystèmes aquatiques souterrains, se fait

en espace réduit, ce qui entraîne une variabilité importante des temps de résidence et des

apports de matière (Bougon et al., 2009). Dans le cas des puits étudiés dans cette étude, les

23

temps de résidence de l‟eau sont courts et similaires (inférieurs à 10 ans). Un autre

piézomètre, plus profond, présentant des temps de résidence beaucoup plus longs (eaux

fossiles de datation estimé à 10000 ans) a été échantillonné au cours de ce stage. Ces

échantillons permettront de tester l'hypothèse d'un effet 'Arche de Noé‟. En effet, l'isolement

dû à la circulation très lente des eaux pourrait impliquer des processus évolutifs originaux et

une conservation de la biodiversité microbienne dans le temps. Cette analyse sera également

appliquée à l‟étude d'autres types d‟hydrosystèmes, tels que les systèmes karstiques,

fonctionnant différemment sur le plan hydrobiogéochimique (percolation et infiltration

différentes, avec de nombreux échanges d‟ions et de matière avec la roche mère) et ne

possédant pas le même type de roche matrice (calcaire pour les hydrosystèmes karstiques

contre granit pour les hydrosystèmes fissurés) (Aquilina et al., 2003, Aquilina et al., 2006). Ce

type d‟étude permettra de tester l‟hypothèse de l‟existence d‟un lien entre le fonctionnement

hydrobiogéochimique d‟un système et le peuplement de ce dernier. De même, il sera possible

de déterminer si la diversité observée pour l‟hydrosystème fissuré modèle de Betton est une

caractéristique locale ou si le patron de diversité peut être élargi et prédit en relation avec la

chimie et le temps de renouvellement des eaux souterraines dans tous les aquifères.

Par ailleurs, la diversité mise en évidence dans cette étude ouvre bien sur des questions

sur le plan fonctionnel. En effet, si l‟approche de séquençage d‟amplicons appliquée dans

cette étude permet d‟étudier la diversité dans son ensemble, elle ne permet pas d‟accéder aux

fonctions réalisées par les individus. Les approches de métagénomique (séquençage d'un

mélange de génomes) et de métatranscriptomique (séquençage des transcrits d'une

communauté microbienne) permettrait de faire le lien entre diversité et fonctions En effet,

une analyse métagénomique permet de prédire les fonctions potentiellement exercées par les

individus tandis que l'analyse de métatranscriptomique permet d‟accéder aux fonctions

exprimées à un moment donné. Cependant, la très grande majorité des OTU (~97%)

contiennent moins de 1% du nombre total de séquences (moins de 290 séquences) (Figure 6)

Ceci indique l'existence d'un très grand nombre d'organismes rares contribuant très peu à

l'ensemble des séquences obtenues. L‟origine et le rôle de cette diversité rare reste à définir.

C‟est d‟autant plus intéressant que de nombreux OTU rares contiennent des séquences non

assignées à des phyla bactériens. Étant donné la faible profondeur de prélèvement, il est

possible qu‟une partie de cette diversité rare provienne du sol. Néanmoins, la présence de

24

cette diversité rare pourrait poser problème pour des études de métagénomique. En effet, la

faible représentation de ces micro-organismes dans les communautés pourrait les rendre

difficilement détectables sur le plan fonctionnel par les approches de génomique

environnementale.

De notre capacité à établir le lien entre diversité et fonction dépend notre capacité à

prédire les réactions des patrons de diversité et des communautés microbiennes face aux

perturbations liées à l‟activité humaine. De plus, ce type de travail pourrait, à terme, permettre

d‟émettre des diagnostiques concernant l‟état des écosystèmes aquatiques souterrains et sur

leur fonctionnement biogéochimique. Enfin, ce type de travail pourrait ouvrir la voie à une

meilleure compréhension de l‟évolution des organismes, par la mise en évidence branches

profondes, notamment chez les bactéries (Theobald, 2010).

25

ANNEXE I : Référence des protocoles

Extraction de l’ADN :

PowerSoil®-DNA Isolation Kit, Mobio Laboratories Inc.,

http://www.mobio.com/images/custom/file/protocol/12888.pdf (dernière mise à jour: 2009)

Protocole de Roche Applied Science-454 Systems :

Design des amorces de fusion

Technical Bulletin-Amplicon Fusion Primer Design Guidelines GS FLX Titanium Series Lib-

A Chemistry (Août 2009).

Préparation des librairies d’amplicons

GS FLX Titanium Series, Amplicon Library Preparation Method Manual, Roche Applied

Science (Octobre 2009).

Amplification par PCR en emulsion

GS FLX Titanium Series- emPCR Method Manual Lib-A, MV, Roche Applied Science

(Octobre 2009, revu en Janvier 2010).

Pyroséquençage :

GS FLX Titanium Series Amplicon Sequencing, Roche Applied Science (Octobre 2009).

(Protocoles disponibles sur le site de 454-Roche Applied Science, diffusion restreinte :

http://454.com/my454/)

26

ANNEXE II : Correspondance entre amorces fusionnées et échantillons

Tableau 4 : Amorces fusionnées complètes, comportant Adaptateur, Clé, MID et amorce spécifique de la zone

amplifiée.

Tableau 5 : Correspondance entre la couple

d‟amorces utilisé et l‟échantillon amplifié

27

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30

Résumé :

Les écosystèmes aquatiques souterrains représentent 97% des ressources d‟eau douces sur

Terre. Cependant, leur fonctionnement reste très mal connu, notamment concernant les

organismes les peuplant et l‟impact que peut avoir le régime hydrologique sur les communautés

microbiennes. D‟autre part, le potentiel physiologique et l‟important panel d‟activités que

représente la biomasse procaryotique place les microorganismes au cœur de tous les processus

biogéochimiques. Il semble donc nécessaire d‟explorer la diversité et la structure des

communautés microbiennes de ces écosystèmes particuliers afin de mieux envisager leur

fonctionnement global. Grâce aux nouvelles approches de biologie moléculaire (pyroséquençage

d‟amplicons de grande taille) et à un traitement original des données (approche par réplicat de

séquençage), il a été possible d‟aborder de manière rigoureuses les hypothèses selon lesquelles (i)

il y aurait une structuration spatiale des communautés à l‟échelle du site, (ii) il y aurait une

homogénéité des communautés au sein d‟un point d‟échantillonnage. L‟étude a montré qu‟il

existait une variabilité spatiale des communautés microbiennes, pouvant être due à une variabilité

des régimes hydrauliques. De plus, les résultats de l‟étude montrent l‟existence d‟une incroyable

diversité. Une partie de la diversité reste non assignée et a le potentiel pour former de nouveaux

phylums. Cette étude amène des perspectives importantes de travail telles que l‟élargissement à

d‟autres types de systèmes aquatiques souterrains, à d‟autres temps de résidences ainsi que

l‟exploration fonctionnelle des communautés microbiennes en présence.

Mots Clés : Hydrosystème fissuré ; pyroséquençage d‟amplicons ; communauté microbienne ;

diversité ; structure.

Abstract :

Underground aquatic ecosystems are the second most important fresh water source in the

world. However, there are true holes in understanding their functioning, especially when it comes

to replacing the inhabiting communities in it and characterizing the link between

hydrobiogeochemical conditions and microbial communities. Furthermore, the physiological

potential and the large range of activities of the prokaryotic biomass places it in the core of all

biogeochemical processes. Therefore, it seems necessary to explore the diversity and the structure

of the fractured underground water system microbial communities, in order to enable a better

comprehension of their global functioning. With new molecular approaches (great size amplicons

pyrosequencing) and an innovative and original treatment of the data (replicate approach), it has

been possible to test hypothesis such as (i)communities are spatially structured within the aquifer,

(ii)microbial communities are homogenous within a sample point. On the one hand, study has

shown spatial variability of the microbial communities, possibly linked to hydrological variation

of the water circulation. On the other hand, results have shown the existence of an amazing

diversity within the aquifer. A part of this diversity remains unassigned and has the potential to

make new phyla emerge. However, this study points out major work perspectives, such as a

possible enlargement of the results into other types of underground water systems and into a large

scale of water residence time. Moreover, it seems necessary to functionally investigate these

microbial communities.

Key-words: fractured hydrosystem; amplicon pyrosequencing; microbial communities; diversity;

structure