dmu rapport skabelon · web viewkunstigt havvand, 100‰: opløs 89,3 g natriumchlorid, nacl, 28,6...

Bilag 14.1

Titrimetrisk bestemmelse af opløst ilt (O2) i vand (Winkler titrering)Analysen er, bortset fra reduktion af prøvevolumen, identisk med Dansk Standard DS 277.

1.1 PrincipNår Winkler I og Winkler II (fældningsreagenserne) tilsættes vandprøven, dannes en hvid udfældning af mangan(II)hydroxyd:

Mn2+ + 2OH- Mn(OH)2 Eq. 1 (Winkler I) + (Winkler II)

Iltet i vandprøven vil hurtigt og kvantitativt oxidere det dannede mangan(II)hydroxyd til brun mangan(III)hydroxyd:

2Mn(OH)2 + ½O2 + H2O 2Mn(OH)3 Eq. 2

Når prøven forsures med fosforsyre, opløses udfældningerne, og Mn3+-ionerne oxiderer iodid (tilsat sammen med Winkler II reagenset) til jod:

2Mn(OH)3 + 2I- + 6H+ 2Mn2+ + I2 + 6H2O Eq. 3

Det dannede jod oxiderer thiosulfat til tetrathionat:

I2 + 2S2O32- 2I- + S4O6

2- Eq. 4

Ved thiosulfat-titreringen forbruger 1 mol O2 således 4 mol S2O3

2-.

Iltkoncentrationen angives i µM og omregnes til mg O2/ liter ved multiplikation med 0,032.

Teknisk anvisning for marin overvågning - Bentiske parametre14. Sediment - ilt og næringsstoffer/18-11-98

14-47

1.2 ReagenserTil fremstilling af reagenser, fortyndinger samt skylning af glasvarer og apparatur skal anvendes destilleret eller renset demineraliseret vand. f. eks. fra MILLI-Q eller Elgastat Maxima anlæg.

Alle reagenser skal være af analysekvalitet.

Winkler I reagens: Opløs 480 g mangan(II)sulfat, MnSO4,4H2O, i 1 liter vand. Filtrér opløsningen hvis den er uklar.

Winkler II reagens: Opløs under omrøring i små portioner 320 g natriumhydroxyd, NaOH, i ca. 500 ml vand. Afkøl lidt og opløs under fortsat omrøring 600 g natriumiodid, NaI, i den basiske opløsning. Fortynd til 1 liter. Dekanter opløsningen forsigtigt hvis der dannes bundfald. Opbevar opløsningen i polyethylenflaske.

85% fosforsyre: Koncentreret fosforsyre, H3PO4 (densitet = 1,71 g/ml).

Thiosulfat-opløsning, 10,0 mM: Fremstilles ved at fortynde 0,1 M S2O3

2- (Titrisol®, Merck) 10x med vand.

Stivelsesopløsning, 1%: 1 g stivelse opløses i 100 ml vand under langsom opvarmning (<90oC). Ved stuetemperatur konserveres stivelsesopløsningen med 0,1 g salicylsyre, 2-(OH)C6H4COOH.

1.3 Koncentrationsbestemmelse

1.3.1 Prøveudtagning og opbevaringAfhængig af vandprøvens volumen anvendes flasker med forskellig størrelse: a) 100 ml Winkler-flaske, b) 50 ml Winkler-flaske eller c) 12 ml glas vial m/glaskugle (Exetainer®, Labco, High Wycombe, UK). Det nøjagtige volumen bestemmes ud fra vægten af vandprøven.

1. Overfør vandprøven til Winkler-flasken gennem en gennemsigtig diffusionstæt slange (fx Tygon®). Ved små vandprøver udtages prøven først med glassprøjte og overføres derefter til glas vialen gennem slangen. Undgå luftbobler i vandprøven.

2. Før slangen ned i bunden af flasken, og overfør vandprøven med overløb svarende til det dobbelte af flaskens volumen. Fyld flasken helt op, samtidig med at slangen trækkes langsomt ud.

3. Tilsæt - nogle få cm under overfladen - Winkler I reagens efterfulgt af Winkler II reagens svarende til ca. 1% af


14-48

flaskens volumen for hver af reagenserne, dvs., a) 1 ml + 1 ml, b) ½ ml + ½ ml, c) 120 µl + 120 µl.

4. Luk flasken uden at fange luftbobler under proppen.

5. Bland reagenserne ved hurtigt at vende flasken et par gange.

6. Prøven anbringes mørkt ved vandprøvens in situ temperatur. Ved temperaturfald kan der suges luft ind i Winkler-flasken/ved temperaturstigning presses vand ud af flasken.

Gennemfør thiosulfat-titreringen indenfor 3 dage.

1.3.2 Thiosulfat-titrering af den konserverede prøve1. Udfældningen skal have sedimenteret så mindst 2/3 af

prøveopløsningen er klar.

2. Tilsæt (uden at opblande bundfaldet) fosforsyre svarende til ca. 2% af Winklerflaskens volumen, dvs., a) 2 ml, b) 1 ml, c) 240 µl.

3. Luk Winkler-flasken uden at fange luftbobler i flasken og ryst flasken til alt bundfaldet er opløst.

4. Udtag en delprøve (5,00 ml) til titrering.

5. Under omrøring titreres med 10,0 mM thiosulfat indtil den gule farve er næsten forsvundet. Herefter tilsættes en dråbe stivelsesopløsning. Opløsningen farves violet.

6. Titreringen med thiosulfat fortsættes, indtil den violette farve forsvinder første gang. Volumenet af S2O3

2- noteres.

Iltkoncentrationen, [O2] µM, i vandprøven beregnes ved følgende generelle formel:

Oax S O xV

xV V VR O xV

V VT R

R

R2

2 32

2

4

( ) (A)

hvor

a er forbruget af S2O32- ved titrationen (ml),

[S2O32-] er koncentrationen af thiosulfatet (µM),

V er volumenet at Winkler-flasken (ml),

VT er volumenet af den titrerede delprøve (ml),


14-49

VR er det totale volumen (ml) af de tilsatte fældningsreagenser (Winkler I + Winkler II)

R(O2) er “den fælles O2-koncentrationen” (µM) af fældningsreagenserne - bestemmes som beskrevet nedfor.

Bemærk også den forenklede beregningsformel (A*) nedenfor (1.3.3).


14-50

1.3.3 Bestemmelse af O2 koncentration, R(O2), i fældnings-

reagenserne1. Tre 100 ml Winkler-flasker fyldes med luftmættet vand

(ferskvand (vandhanevand) eller saltvand). Vær meget omhyggelig med at, O2-indholdet i alle tre Winkler-flasker er identisk.

2. Tilsæt til de tre Winkler-flasker - nogle få cm under overfladen - hhv. 1,0 ml, 2,0 ml og 3,0 ml Winkler I reagens og 1,0 ml, 2,0 ml og 3,0 ml Winkler II reagens.

3. Luk Winkler-flasken uden at fange luftbobler i flasken.

4. Bland reagenserne ved hurtigt at vende flasken et par gange.

5. Prøven anbringes mørkt ved vandprøvens in situ temperatur.

6. Når manganhydroxydudfældningerne er sedimenteret så mindst 2/3 af prøveopløsningen er klar, tilsættes hhv. 2 ml, 4 ml, og 6 ml fosforsyre til de tre Winkler-flasker (uden at opblande bundfaldet).

7. Følg derefter anvisningen 1.3.2: Thiosulfat-titrering af den konserverede prøve.

Den tilsyneladende O2 koncentration i vandprøven beregnes og udtrykkes som en funktion af VR, dvs.,

Oax S O xV

xV V VxVtilsyneladende

T RR2

2 32

4

hvor

er vandprøvens reelle O2 koncentration (µM),

er korrektionen for ilt overført til vandprøven med fældningsreagenserne (µM/ml),

VR er det totale volumen (ml) af de tilsatte reagenser (Winkler I + Winkler II).

Idet kan udtrykkes ved ligning (A) fås

R(O2) = x (V-VR)

Sædvanligvis er det sammenlagte indhold af O2 i fældningsreagenserne af størrelsesordenen 46 µM. Det betyder, at hvis 1) blandingsforholdet mellem vandprøve og fældningsreagenserne er 98:2, 2) der anvendes 10 mM Teknisk anvisning for marin overvågning - Bentiske parametre14. Sediment - ilt og næringsstoffer/18-11-98

14-51

thiosulfat til titreringen og 3) der titreres 5 ml fældet prøve, kan vandprøvens iltkoncentration (µM) udtykkes ved

[O2] = 510,20 x a - 0,94 (A*)

hvor

a er forbruget (ml) af 10 mM S2O32- ved titrationen.

1.4 InterferensIngen.

1.5 ReferencerDansk Standard DS 277, December 1974: Titrimetrisk bestemmelse af opløst oxygen i vand. 1.udg. pp. 6.

Grasshoff, K. ,1983: Determination of oxygen. In: Grasshoff, K., Ehrhardt, M. og Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Verlag Chemie, Weinheim, 61-72.


14-52


14-53

Bilag 14.2

Fotometrisk bestemmelse af svovlbrinte (H2S) i vand hvor [H2S] = [H2S] + [HS-] + [S2-]

Afviger på flere punker fra Dansk Standard DS 278, bl.a.

prøvevolumen er reduceret til 1 - 2 ml,

farve-reagenset (Diamin-reagenset) er fremstillet som beskrevet af Cline (1969),

den fotometriske bestemmelse foretages ved 670 nm,

sulfid-stamopløsningen (ZnS) fremstilles ved at opløse natriumsulfid direkte i en zinkacetat-opløsning.

2.1 PrincipMetoden baserer sig på, at svovlbrinte sammen med N,N-dimethyl-1,4-phenylendiamin danner methylenblåt ved tilstedeværelsen af jern(III). Kompleksets absorbans ved 670 nm er proportional med svovlbrinte-koncentrationen.

Svovlbrinte-koncentrationen angives i µM og omregnes til mg S/ liter ved multiplikation med 0,032. Metoden kan anvendes direkte inden for standard-kurvens lineære område op til ca. 30 µM.

2.2 ReagenserTil fremstilling af reagenser, fortyndinger samt skylning af glasvarer og apparatur skal anvendes destilleret eller renset demineraliseret vand. f. eks. fra MILLI-Q eller Elgastat Maxima anlæg.


Diamin-reagens: 500 ml koncentreret saltsyre, HCl (densitet = 1,19 g/ml) blandes i 500 ml vand. Efter afkøling til stuetemperatur tilsættes 4,0 g N,N-dimethyl-1,4-phenylendiamin sulfat (det samme som: 4-amino-N,N-dimethylanilin sulfat), (CH3)2NC6H4NH2,H2SO4, og 6,0 g jern(III)klorid, FeCl3,6H2O.

Thiosulfat-opløsning, 25 mM: Fremstilles ved at fortynde 0,1 M S2O3

2- (Titrisol®, Merck) 4x med vand.

Stivelses-opløsning, 1%: 1 g stivelse opløses i 100 ml vand under langsom opvarmning (<90oC). Ved stuetemperatur Teknisk anvisning for marin overvågning - Bentiske parametre14. Sediment - ilt og næringsstoffer/18-11-98

14-54

konserveres stivelsesopløsningen med 0,1 g salicylsyre, 2-(OH)C6H4COOH.

Jod-opløsning: 1,98 g jod, I2, blandes med 15,0 g kaliumiodid, KI, i 1 liter vand.

Saltsyre, ca. 1 M: Tilsæt 80 ml koncentreret saltsyre, HCl (densitet = 1,19 g/ml), til 920 ml vand.

Jod/syre-opløsning: Umiddelbart før brug blandes 2 vol. jod-opløsning med 1 vol. 1 M saltsyre. Opbevares mørkt og tillukket.

Zinkacetat-opløsning, 1%: Tilsæt 10 g zinkacetat, Zn(C2H3O2)2,2H2O, til 1 liter vand tilsat 1 ml koncentreret eddikesyre, CH3COOH (100% densitet = 1,05 g/ml).

Iltfrit vand: Gennembobl ca. 1 liter vand med kvælstof, N2, > ½ time, hvorefter al ilten er drevet ud.

Zinksulfid-stamopløsning, ca. 0,8 mmol/l: En samlet vægt på 0,20 g krystaller af natriumsulfid, N2S,xH2O, renses i O2-frit vand og aftørres forsigtigt, før de(t) opløses i 1 liter 1% zinkacetat-opløsning under udfældning af zinksulfid, ZnS. Zinksulfid-stamopløsningens nøjagtige koncentration indstilles ved titrering med 25 mM thiosulfat (se neden for).

2.2.1 Koncentrationsbestemmelse af zinksulfid-stamopløs-

ningen2.2.2.1 PrincipNår en sur opløsning af jod tilsættes i overskud til zinksulfid, kan den overskydende jod titreres med thiosulfat. Efter denne såkaldte “tilbage-titrering” kan koncentrationen af ZnS i zinksulfid-stamopløsningen beregnes.

Jod oxiderer øjeblikkeligt zinksulfid til frit svovl:

ZnS + I2 Zn2+ + 2I- + So Eq. 1

og den overskydende jod titreres derefter med thiosulfat:

I2 + 2S2O32- 2I- + S4O6

2- Eq. 2

1) Først bestemmes koncentrationen af jod i jod/syre-opløsningen ved titrering med 25,0 mM thiosulfat-opløsning. Jodkoncentrationen, A, i mM udtrykkes

A = [I2] = 12.5 x V1/V2 (A)

hvor,


14-55

V1 er volumenet (ml) af 25,0 mM thiosulfat-opløsningen brugt til titreringen

V2 er volumenet (ml) af jod/syre-opløsningen

2) Herefter kan koncentrationen af ZnS i zinksulfid-stamopløsningen bestemmes :

y ml zinksulfid-stamopløsning (Y mmol/l) tilsættes et overskud af a ml jod/syre-opløsning (A mM). Herved forbruges y x Y µmol jod. Overskuddet af jod, som kan “tilbage-titreres” med 25,0 M thiosulfat-opløsningen, udgør derfor

(a x A - y x Y) µmol.

Når jodoverskudet “tilbage-titreres” med b ml, 25 mM thiosulfat-opløsning, gælder følgende sammenhæng:

12,5 x b = a x A - y xY

Zinksulfid koncentrationen, Y, kan derfor udtrykkes i mmol/l ved

Y = [ZnS] = (a x A - 12,5 x b)/y (B)

2.2.2.2FremgangsmådeJod-koncentrationen i jod/syre-opløsningen

Jod-koncentrationen beregnes som et gennemsnit af 5 titreringer eller flere!

1. 1,00 ml jod/syre-opløsning fortyndes med vand til ca. 5 ml.

2. Under omrøring titreres med 25,0 mM thiosulfat, indtil den gule farve er næsten forsvundet. Herefter tilsættes en dråbe stivelsesopløsning. Opløsningen farves violet.

3. Titreringen med thiosulfat fortsættes, indtil den violette farve forsvinder første gang. Volumenet (ml) af forbrugt thiosulfat, V1, noteres.

Jod-koncentrationen (mM) beregnes som

A = [I2] = 12,.5 x V1 (A*)

hvor

V1 er forbruget (ml) af 25,0 mM thiosulfat-opløsningen.

Koncentrationen af ZnS i zinksulfid-stamopløsningen bestemmes ved “tilbage-titrering”

Zinksulfid-koncentrationen beregnes som et gennemsnit af 5 titreringer eller flere!


14-56

1. 5,0 ml zinksulfid-stamopløsning (udtaget under omrøring) blandes med 2,0 ml jod/syre opløsning.

2. Under omrøring titreres med 25,0 mM thiosulfat indtil den gule farve er næsten forsvundet. Herefter tilsættes en dråbe stivelsesopløsning. Opløsningen farves violet.

3. Titreringen med thiosulfat fortsættes, indtil den violette farve forsvinder første gang. Volumenet (ml) af thiosulfat-forbruget, b,noteres.

Zinksulfid-koncentrationen (mmol/l) i zinksulfid-stamopløsningen beregnes som

Y = [ZnS] = (2 x A - 12,5 x b)/5 (B*)

hvor

A er iodkoncentrationen i mM beregnet ved (A*)

b er forbruget (ml) af 25,0 mM thiosulfat-opløsningen.

2.3 Koncentrationsbestemmelse af H2S - absorbansmåling

2.3.1 Bestemmelse af farve-reagensets absorptionskoefficient,

H2S standardkurve1. 4,0 ml af zinksulfid-stamopløsning (ca. 0,8 mmol ZnS/

liter, den nøjagtige koncentration bestemt ved “tilbage-titrering”) udtages under omrøring og fortyndes til 100 ml med vand.

2. 0,0 ml (dvs. blank-prøven), 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml, 5,0 ml, 6,0 ml, 7,0 ml, 8,0 ml, 9,0 ml og 10,0 ml af den fortyndede zinksulfid-stamopløsning udtages under omrøring og overføres til hver sin volumetriske flaske og fortyndes med vand til 10 ml. Efter denne overførsel er zinksulfid-stamopløsningen blevet fortyndet op til 500 x (dvs. ca. 1,5 µM ved at overføre og fortynde 0,5 ml af den 25 gange fortyndede stamopløsning til 10 ml).

3. 800 µl diamin-reagens tilsættes, og den volumetriske flaske lukkes hurtigt for at undgå tab af den udviklede H2S-gas. Det tilsatte diamin-regens blandes ved en kraftig omrystning af opløsningen, der stilles mørkt.

4. Farvereaktionen er fuldstændig efter ½ time, og absorptionen af den blå farve måles ved 670 nm i en 1 cm plastic- eller glaskuvette efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af blank-prøven.

Ud fra hældningen af standardkurven beregnes diaminreagensets absorptionskoefficient, , µM pr. abs. enhed. Kontrollér kalibreringskurven regelmæssigt.


14-57

2.3.2 Bestemmelse af H2S koncentration i zinkacetat-konserverede

prøverSvovlbrinte opløst i vand konserveres i zinkacetat, Zn(C2H3O2)2, som partikulært zinksulfid, ZnS. Frosne tøes op og rystes meget kraftigt, så bundfaldet fordeles homogent, før delprøver udtages.

1. Det udfældede ZnS resuspenderes omhyggeligt, og et kendt volumen overføres med pipette til en 10 ml volumetrisk flaske, hvor ZnS-opløsningen om nødvendigt fortyndes med vand til et totalt volumen af 10 ml. Denne fortynding skal foretages, før diamin-reagenset tilsættes.

2. 800 µl diaminreagens tilsættes, og den volumetriske flaske lukkes hurtigt for at undgå tab af den udviklede H2S-gas. Det tilsatte diamin-regens blandes ved en kraftig omrystning af opløsningen, der stilles mørkt.

3. En blank-prøve fremstilles med samme zinkacetat-koncentration som ZnS-prøven.

4. Farvereaktionen er fuldstændig efter ½ time, men kan opbevares i mørke op til 24 h. Absorbansen, A, af den blå farve måles ved 670 nm i en 1 cm plastic- eller glaskuvette efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af blank-prøven. Absorbansen bør ikke overstige 0,8 abs. enheder, svarende til en H2S koncentration på ca. 30 µM.

Koncentrationen af H2S (µM) i den konserverede prøve beregnes ved:

[H2S] = x A x F

hvor

er diamin-reagensets absorptionskoefficient, µM pr. abs. enhed,

A er absorbansen målt med blank-prøven som referenceopløsning,

F er fortyndingen af den konserverede prøve.

2.4 InterferensIngen.


14-58

2.5 ReferencerDansk Standard DS 278 (1. udg. februar 1976): Vandundersøgelse. Bestemmelse af sulfid i recipient- og drikkevand. pp. 5.

Cline, J. D., 1969: Spectrophotometric determination of hydrogen sulfide in natural waters. Limnology and Oceanography 14, 454-458.

Nusbaum, I., 1965: Determining sulfides in water and wastewater. Water and Sewage Works 112, p. 113 & 150.


14-59


14-60

Bilag 14.3

Fotometrisk bestemmelse af ferro-jern (Fe2+) i vandDer findes ingen Dansk Standard analyseforskrift.

3.1 PrincipI området pH 4 til pH 9 danner ferro-jern, Fe2+, et stabilt magentafarvet kompleks med Ferrozin. Kompleksets absorbans ved 562 nm er proportionalt med Fe2+-indholdet.

Ferro-jern koncentrationen angives i µM og omregnes til µg Fe/liter ved multiplikation med 55,85. Metoden kan anvendes direkte indenfor standard-kurvens lineære område op til ca. 1500 µM.

3.2 ReagenserTil fremstilling af reagenser og fortyndinger samt ved skylning af apparatur skal anvendes destilleret eller demineraliseret vand. Om nødvendigt skal vandets reducerede jernindhold, Fe2+, kontrolleres som beskrevet neden for.


HEPES-buffer, 50 mM: Opløs 1,2 g HEPES-buffer, N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsyre, i 100 ml vand.

Natriumhydroxid-opløsning, ca. 2M: Opløs 8 g natriumhydroxyd, NaOH, i 100 ml vand under omrøring. Anvendes til pH-justering af Ferrozin-reagens.

Ferrozin-reagens (1 g/l), bufferet ved pH 7: Opløs 0,1 g Ferrozine®, 3-(2-pyridyl)-5,6-bis(4-phenylsulfonsyre)-1,2,4-triazine, i 100 ml 50 mM HEPES-buffer og justér til pH 7 med 2 M NaOH. Opløsningen opbevares i køleskab, i mørke og er stabil i ubegrænset tid.

Ferrozin-reagens m/hydroxylammoniumklorid (10 g/l): Umiddelbart før brug opløses 10 g hydroxylammoniumklorid, NH2OH.HCl, per liter Ferrozin-reagens. Denne blanding bruges efter dithionit-ekstraktionen til at reducere Fe(III)-citrat til Fe2+. Skal anvendes samme dag.

Saltsyre, 0,5 M: Tilsæt 42 ml koncentreret saltsyre, HCl (densitet = 1,19 g/ml), til ca. 500 ml vand under omrøring og fortynd til 1 liter.


14-61

Fe2+-stamopløsning, 10 mM: Opløs 0,392 g jernammoniumsulfat, (NH4)2Fe(SO4)2,6H2O (Mohr’s salt), i ca. 80 ml 0,5 N HCl og efterfyld til 100 ml. Opløsningen opbevares i køleskab.

3.3 Koncentrationsbestemmelse af Fe2+ - absorbansmåling


Fe2+-standardkurve1. Overfør 0 µl, 25 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 800 µl,

1000 µl og 1500 µl af Fe2+-stamopløsningen til 10 ml målekolbe og fortynd prøverne med 0,5 N HCl til et total volumen på 10 ml. Herved fås flg. Fe2+ koncentrationer: 0,0 µM (dvs., blank-prøven), 25 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM, 400 µM, 800 µM, 1000 µM og 1500 µM.

2. Overfør 50 µl standard direkte til 1 cm kuvette.

3. Tilsæt 2,5 ml ferrozin-reagens, hvorved prøven blandes. Herved fås flg. Fe2+-indhold i kuvetten: 0,00 nmol, 1,25 nmol, 2,50 nmol, 5,00 nmol, 10,00 nmol, 20,00 nmol, 40,00 nmol, 50,00 nmol og 75,00 nmol.

4. Opløsningens absorbans, A, måles ved 562 nm, efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af blank-prøven. Ferrozin-komplekset er stabilt og kan i mørke holde sig op til 1 døgn.

Ud fra hældningen af standardkurven beregnes Ferrozin-reagensets absorptionskoefficient, , nmol per abs. enhed. Kontroller kalibreringskurven regelmæssigt.

3.3.2 Bestemmelse af Fe2+-koncentration i vandige prøver1. 50 µl prøve blandes med 2,5 ml Ferrozin-reagens direkte

i 1 cm kuvette. Hvis absorbansen er for høj, “fortyndes” prøven ved at tilsætte mindre prøvemængde til 2,5 ml Ferrozin-reagenset. Den oprindelig standardkurve (50 µl prøve / 2,5 ml ferrozin-reagens) kan anvendes, idet standardkurven er fremstillet som absolut Fe2+ indhold per 2,5 ml Ferrozin-reagens.

Dithionit ekstraherede prøver kan ikke måles før dithionit er fordampet. Lad derfor ekstraktet stå nogle dage eller udtag 50 µl prøve, hvorfra dithionit vil forsvinde i løbet af nogle timer. Prøven må ikke tørre ind! Da prøven udover dithionit også indeholder citrat, skal der tilsættes ferrozin-reagens m/ hydroxylammoniumklorid for at reducere evt. Fe(III)-citrat kompleks til Fe2+. Bland derfor 50 µl dithionit-fri prøve med 2,5 ml ferrozin-reagens m/ hydroxylammoniumklorid og lad blandingen hvile i mørke mindst 3 timer inden absorbansen måles. Tilsætningen af hydroxylammoniumklorid påvirker ikke standardkurven.


14-62

2. Opløsningens absorbans, A, måles ved 562 nm i 1 cm kuvette, efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af en blank-prøve: 2,5 ml Ferrozin og 50 µl ekstraktionsmiddel (0,5 M HCl eller dithionitopløsning) “fortyndet” og behandlet på samme måde som prøveopløsningen. Ferrozin-komplekset er stabilt og kan holde sig op til 1 døgn.

Koncentrationen af Fe2+ (µM) i den målte prøve beregnes ved:

FeV

z

A 1000

hvor

er Ferrozin-reagensopløsningens absorptionskoefficient, nmol per abs. enhed,


V er volumen (µl) af den tilsatte prøve, sædvanligvis 50 µl.

3.4 InterferensKobber, kobolt, kalcium, magnesium, bly, sølv, molybden, aluminium, nikkel, zink, arsenik, mangan, hexavalent krom, trivalent krom, divalent kobolt og monovalent kobber danner alle farvede komplekser med ferrozin; men kun ved koncentrationer > 1000 mg/l interfererer denne kompleksdannelse med Fe2+ koncentrationsbestemmelsen. De eneste anioner, der interfererer, er oxalat, (CO2)2

2-, > 500 mg/l foruden cyanid, CN-, og nitrit, NO2

-. I praksis betyder dette derfor at Fe2+ kan måles uden interferens fra andre kemiske forbindelser.

3.5 ReferencerStookey, L. L., 1970: Ferrozine - a new spectrophotometric reagent for iron. Analytical Chemistry 42, 779-781.

Sørensen, J., 1982: Reduction of ferric iron in anaerobic, marine sediment and interaction with reduction of nitrate and sulfate. Applied and Environmental Microbiology 43, 319-324.

Phillips, E. J. P. & Lovley, D. R., 1987: Determination of Fe(III) and Fe(II) in oxalate extracts of sediments. Soil Science Society of America Journal 51 , 938-941.


14-63


14-64

Bilag 14.4

Fotometrisk bestemmelse af orthofosfat (PO4

3-) i vandVæsentligste afvigelser fra Dansk Standard DS 291:

prøvevolumen er reduceret fra 25 ml til 2,5 ml,

i stedet for vand som referenceopløsning ved absorbansmålingen anvendes en opløsning bestående af fosfat-frit kunstigt havvand (behandlet på samme måde som prøven og med samme salinitet 5‰).

4.1 PrincipI svovlsur opløsning (ca. 0,2 M) danner orthofosfat med molybdat og antimon(III), antimon-12-fosformolybdensyre, som reduceres med ascorbinsyre til et heteropolykompleks (molybdenblåt). Kompleksets absorbans ved 880 nm (eller eventuelt ved 700 nm) er proportionalt med orthofosfat-indholdet.

Ortho-fosfat koncentrationen angives i µM og omregnes til µg P/ liter ved multiplikation med 30,97. Metoden kan anvendes direkte indenfor standard-kurvens lineære område op til ca. 25 µM.

4.2 ReagenserTil fremstilling af reagenser, fortyndinger samt skylning af glasvarer og apparatur skal anvendes destilleret eller renset demineraliseret vand, f. eks. fra MILLI-Q eller Elgastat Maxima anlæg. Om nødvendigt skal vandets og reagensernes fosfor-indhold kontrolleres som beskrevet neden for.


Rengør udstyret med varm 2 M saltsyre eller lad det ligge i syren i ét døgn og skyl grundigt med vand. Kolber som anvendes ved farvereaktionen skal desuden skylles med natriumhydroxid-opløsning for at fjerne molybdenblåt, der kan være adsorberet på væggene. Skyl derefter grundigt med vand. Beskyt udstyret mod støv og skyl påny før anvendelse. Udstyret bør ikke anvendes til andre analyser. Fosforholdige rengøringsmidler må ikke anvendes.

Anvend flasker af borsilicat eller polyethylen. En grundig rengøring af flaskerne er nødvendig, da fosfor let adsorberes på væggene.Teknisk anvisning for marin overvågning - Bentiske parametre14. Sediment - ilt og næringsstoffer/18-11-98

14-65

Filtre skal ligge i vand mindst et døgn før anvendelsen. De skal opbevares i vand, som skal skiftes hver dag.

Svovlsyre, 4 M: Tilsæt forsigtigt og under omrøring 110 ml koncentreret svovlsyre, H2SO4 (densitet = 1,84 g/ml), til ca. 350 ml vand. Afkøl til stuetemperatur og fortynd til 500 ml.

Svovlsyre, 40 mM: Fortynd 10 ml 4 M svovlsyre til 1 liter med vand.

Saltsyre, ca. 2 M: Tilsæt 160 ml koncentreret saltsyre, HCl (densitet = 1,19 g/ml), til 840 ml vand. Anvendes til rengøring.

Natriumhydroxid-opløsning, ca. 4 M: Opløs 160 g natriumhydroxid, NaOH, i ca. 800 ml vand under omrøring og køling og fortynd til 1 liter. Anvendes til rengøring.

Ascorbinsyre-opløsning, 50 g/l: Opløs 5 g ascorbinsyre, C6H8O6, i 100 ml vand. Opbevar opløsningen i en mørk flaske i køleskab (4 oC). Opløsningen er da holdbar i flere uger og kan anvendes, så længe den er farveløs.

Molybdat-reagens: Fremstilles af følgende opløsninger:

Svovlsyre: Tilsæt i et 600 ml bægerglas forsigtigt og under omrøring 120 ml koncentreret svovlsyre, H2SO4

(densitet = 1,84 g/ml), til 170 ml vand. Afkøl til stuetemperatur.

Molybdat-opløsning: Opløs 13 g ammoniumheptamolybdat, (NH4)6Mo7O24,4H2O i 100 ml vand.

Antimon-opløsning: Opløs 0,35 g kaliumantimon(III)oxidtartrat, K(SbO)C4H4O6, i 100 ml vand.

Fremstil molybdat-reagenset ved under omrøring først at tilsætte molybdat-opløsningen og derefter antimon-opløsningen til svovlsyren. Bland grundigt og hæld opløsningen i en 500 ml målekolbe og fortynd til mærket. Opbevar opløsningen i en mørk glasflaske af resistent glas. Opløsningen er holdbar i mindst to måneder.

Kunstigt havvand, 100‰: Opløs 89,3 g natriumchlorid, NaCl, 28,6 g magnesiumsulfat heptahydrat, MgSO4,7H2O, og 0,13 g natriumhydrogencarbonat, NaHCO3, i 800 ml vand og fortynd til 1000 ml. Opløsningen opbevares i køleskab og er holdbar i ca. 1 måned.

Kunstigt havvand, x‰: Fortynd (10x) ml 100‰ kunstigt havvand med vand til 1 liter.

Svovlsurt kunstigt havvand, x‰: Tilsæt 10 µl 4 M svovlsyre per ml x‰ kunstigt havvand. Bruges til fortynding.


14-66

Fosfat-stamopløsning, 2,0 mM: Tør kaliumdihydrogenfosfat, KH2PO4, i 1 time ved 105 oC. Opløs 0,273 g i vand i en 1000 ml målekolbe, tilsæt 10 ml 4 M H2SO4 og fortynd til mærket. Opbevar opløsningen i en glasflaske i køleskab (4oC). Opløsningen er holdbar i mindst tre måneder.

Fosfat-standardopløsning, 40 µM: Overfør 10,0 ml 2,0 mM fosfat-stamopløsning til en 500 ml målekolbe og fortynd til mærket med kunstigt havvand af samme saltholdighed som prøven 5‰. Opløsningen skal fremstilles samme dag, som den skal anvendes.

4.3 Koncentrationsbestemmelse af PO43- -

absorbansmåling


PO43--standardkurve

1. Overfør 0 µl, 250 µl, 500 µl, 1250 µl, 2500 µl, 5000 µl, 10000 µl og 15000 µl af fosfat-standardopløsningen (40 µM PO4

3-) til 25 ml målekolbe og fortynd prøverne til 25 ml med kunstigt havvand af samme saltholdighed som prøven 5‰. Herved fås flg. PO4

3—koncentrationer: 0,0 µM (dvs., blank-prøven), 0,4 µM, 0,8 µM, 2,0 µM, 4,0 µM, 8,0 µM, 16,0 µM og 24,0 µM.

2. Tilsæt 250 µl 4M svovlsyre og bland.

3. 2,5 ml af den forsurede standard-opløsningen overføres til reagensglas.

4. Tilsæt 100 µl ascorbinsyre-opløsning, bland og vent 30 sek.

5. Tilsæt 100 µl molybdat-reagens og bland igen.

6. Mellem 10 til 30 minutter efter sidste reagenstilsætning måles opløsningens absorbans ved 880 nm i 1 cm kuvette, efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af blank-prøven.

Ud fra hældningen af standardkurven beregnes molybdat-reagensets absorptionskoefficient, , µM per abs. enhed. Kontrollér kalibreringskurven regelmæssigt.

4.3.2 Bestemmelse af PO43- koncentration i vandige

prøver1. Den konserverede prøve rystes omhyggeligt og 2,5 ml af

den forsurede, homogene vandprøve (10 µl 4 M svovlsyre/ ml prøve) overføres til reagensglas. Eventuel fortynding foretages med svovlsur kunstigt havvand af samme saltholdighed som prøven 5‰.


14-67

2. Tilsæt 100 µl ascorbinsyreopløsning, bland og vent 30 sek.

3. Tilsæt 100 µl molybdat-reagensopløsning og bland igen.

4. Mellem 10 til 30 minutter efter sidste reagenstilsætning måles opløsningens absorbans, A, ved 880 nm i 1 cm kuvette, efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af en blank-prøve bestående af fosfat-frit kunstigt havvand (behandlet på samme måde som vandprøven og med samme salinitet 5‰.

Koncentrationen af PO43- (µM) i den målte prøve beregnes

ved:

[PO43-] = x (A - Ab) x F

hvor

er molybdat-reagensopløsningens absorptionskoefficient, µM pr. abs. enhed, ved den aktuelle salinitet,

A er absorbansen målt med blank-prøven som referenceopløsning

Ab er absorbansen af blind-prøven målt med blank-prøven som referenceopløsning (se nedenfor)

F er fortyndingen af prøven.

4.3.3 Interferens fra farvede prøver: blind-prøveHvis prøvens turbiditet eller farve er så stærk, at den kan tænkes at bidrage til absorbansen, udføres en blindprøve:

1. 2,5 ml af prøven overføres til reagensglas. Husk evt. at fortynde.

2. Tilsæt 100 µl ascorbinsyreopløsning, bland og vent 30 sek.

3. Tilsæt 100 µl 40 mM svovlsyre (til erstatning for molybdat-reagenset) og bland igen.

4. Mellem 10 til 30 minutter efter sidste reagenstilsætning måles blindprøveopløsningens absorbans, Ab, ved 880 nm i 1 cm kuvette efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af en blank-prøve bestående af fosfat-frit kunstigt havvand (behandlet på samme måde som vandprøven og med samme salinitet 5‰).

4.3.4 Bestemmelse af PO43- koncentration i

reagenserneFremstil følgende to opløsninger:


14-68

Opløsning 1 (blank-prøven): Bland 2,5 ml 40 mM svovlsyre, 100 µl ascorbinsyre og efter 30 sek. 100 µl molybdat-reagensopløsning.

Opløsning 2: Bland 2,3 ml 40 mM svovlsyre, 200 µl ascorbinsyre og efter 30 sek. 200 µl molybdat-reagensopløsning.

Mål som angivet ovenfor opløsning 1’s absorbans (A1) og opløsning 2’s absorbans (A2) med vand som referenceopløsning.

Beregn følgende værdier:

Ar = A2 - A1

Av = A1 - Ar = 2A1 - A2

hvor det tilnærmelsesvis gælder, at:

Ar er absorbansbidrag fra farvefremkaldende reagenser,

Av er absorbansbidrag fra vand og svovlsyre.

4.4 InterferensArsenat (AsO4

3- ) reagerer med molybdat-reagensopløsningen på samme måde som PO4

3-, hvilket resulterer i en lignende farve. Havvands naturlige AsO4

3--indhold på 10-30 nM interfererer ikke med fosfatmålingen. Ved højere koncentrationer forhindres arsenat reaktionen ved reduktion til arsenit (se DS 291: 5.5.1)

Nitrit (NO2- ) interfererer ved koncentrationer >20 µM NO2

-. Interferensen kan forhindres ved tilsætning af sulfamidsyre (se DS 291: 5.5.3)

Svovlbrinte (H2S) interfererer ved koncentrationer >60 µM H2S, men kan fjernes ved at gennemboble den konserverede, sure prøve med N2.

Silicium(Si) danner også et blåfarvet kompleks med molybdat. Under de givne reaktionsbetingelser sker farvedannelsen så langsomt, at indhold under 180 µM Si (5 mg Si/ liter) ikke interfererer.

4.5 ReferencerDansk Standard DS 291, Marts 1995: Vandundersøgelse. Orthophosphat-phosphor. Fotometrisk metode. 2. udg. pp. 11.

Koroleff, F., 1983: Determination of phosphorus. In: Grasshoff, K., Ehrhardt, M. og Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Verlag Chemie, Weinheim, 125-139.


14-69


14-70

Bilag 14.5

Fotometrisk bestemmelse af nitrit (NO2-) og nitrat (NO3-) i saltvandAfviger på flere punker fra Dansk Standard DS223, bl.a.

prøvevolumen er reduceret til 200 µl,

reduktor volumen reduceret til ca. 300 µl 100 mm x 2 mm (ID),

reduktor består af kobberbelagt cadmium,

absorbansen måles ved 540 nm,

reduktion af nitrat og tilsætning af farvereagens foretages med Flow Injection Analysator får at opnå præcis elueringstid af det lille prøvevolumen gennem cadmiumsøjlen.

5.1 PrincipNitrat reduceres af kobberbelagt cadmium til nitrit med et udbytte på mindst 90 %. Reduktionen sker i en imidasol buffer-opløsning ved pH = 8,0 - 8,5.

Nitrit reagerer i sur opløsning (pH = 1,5 - 2) med sulfanilamid, hvorved der dannes en diazo-forbindelse, som videre kobles til N-(1-naphtyl)-etylendiamin og danner et azo-farvestof. Farvens intensitet er proportional med nitritkoncentrationen. Absorbansen måles ved 540 nm.

Nitrit- og nitrat-koncentrationen angives i µM. Omregnes til µg N/l ved multiplikation med 14,01.

Metoden kan anvendes direkte indenfor standardkurvens lineære område (se 5.3.1)

5.2 ReagenserTil fremstilling af reagenser, fortyndinger samt skylning af glasvarer og apparatur skal anvendes destilleret eller renset demineraliseret vand. f. eks. fra MILLI-Q eller Elgastat Maxima anlæg. Om nødvendigt skal vandets nitrit-, NO2

-, og nitrat-indhold, NO3

-, kontrolleres.


Saltsyre, 3 M: Tilsæt 248 ml koncentreret saltsyre, HCl (densitet = 1,19 g/ml), til ca. 800 ml vand og fortynd til 1 liter.


14-71

Saltsyre, 0,5 M: Fortynd 167 ml 3 M saltsyre, HCl, med vand til 1 liter.

Kobbersulfat-opløsning, 1 mM: Opløs 0,249 g kobbersulfat, CuSO4,5H2O i ca. 500 ml vand og fortynd til 1 liter.

Kobbersulfat-opløsning, 1% w/v: Opløs 1 g kobbersulfat, CuSO4,5H2O, i 100 ml vand.

Brij-35-opløsning, 30% w/v: Kommerciel opløsning (Sigma catalog no. 430AG-6) af 30% 23-laurylæter. Anvendes i imidasol-bufferopløsning til indvendig smøring af pumpeslanger.

Cadmium, Cd: Granulat af cadmium, Cd, med kornstørrelse ca. 0,5 mm. Anvendes til reduktorkolonne. Bemærk at cadmium er et meget giftigt metal, der kun langsomt udskilles af organismen, således at risiko for kronisk forgiftning er stor.

Imidazol-buffer: Opløs under omrøring 27,2 g imidazol, C2H4N2 (Merck no. 1.04716) i 1000 ml vand. Tilsæt dernæst 20 ml 1 mM kobbersulfat-opløsning og 2 ml 30% Brij-35-opløsning. Fortynd med vand til 1990 ml. Når reagenserne er opløst indstilles til pH 8,0 med ca. 10 ml 3 M saltsyre. Holdbar i flere måneder.

Farvereagens: Tilsæt 100 ml 85% fosforsyre, H3PO4

(densitet = 1,71 g/ml) til 600 ml vand. Tilsæt dernæst 40 g sulfanilamid, NH2C6H4SO2NH4, og 2 g N-(1-naphtyl)-ethylenediamin dihydrochlorid, C10H7NHCH2CH2NH2,2HCl. Opløses under omrøring med varme. Efter afkøling fortyndes med vand til 1 liter. Opbevares i mørk flaske. Hvis væsken bliver rødlig, skal den kasseres.

Bærevæske, 100‰ stamopløsning: Opløs 89,3 g natriumchlorid, NaCl, 28,6 g magnesiumsulfat heptahydrat, MgSO4,7H2O, og 0,13 g natriumhydrogencarbonat, NaHCO3, i 800 ml vand og fortynd til 1 liter. Den bærevæske, der skal anvendes ved analysen, fremstilles ved fortynding af stamopløsningen med vand, sådan at bærevæsken får samme salinitet som prøverne. Fortynding af prøver samt fremstilling af standarder skal altid foretages med en bærevæske af samme salinitet som prøverne.

Nitrat-stamopløsning, 30 mM: Afvej 3,033 g tørret kaliumnitrat, KNO3, der i forvejen er tørret ved 105°C i 2 timer og afkølet i eksikator. Opløses i ca. 500 ml vand og fortyndes med vand til 1 liter i målekolbe. Tilsæt en dråbe chloroform, CHCl3, som konserveringsmiddel. Opbevares i glasflaske i køleskab. Holdbar i flere måneder.

Nitrit-stamopløsning, 30 mM: Afvej 2,070 g tørret natriumnitrit NaNO2, der i forvejen er tørret ved 105°C i 2 timer og afkølet i eksikator. Opløses i ca. 500 ml vand og fortyndes med vand til 1 liter i målekolbe. Tilsæt en dråbe Teknisk anvisning for marin overvågning - Bentiske parametre14. Sediment - ilt og næringsstoffer/18-11-98

14-72

chloroform, CHCl3, som konserveringsmiddel. Opbevares i glasflaske i køleskab. Holdbar i flere måneder.

5.2.1 Aktivering af cadmiumVask ca. 20 g cadmiumkorn i et bægerglas, først med vand og derefter med 0,5 M saltsyre. Skyl derefter igen metalkornene godt med vand. Påfyld 100 ml af 1% kobbersulfat-opløsningen til cadmiumkornene og omrør 1 min. Skyl med vand indtil opløsningen er farveløs. Cadmiumkornene skylles igen i 1 min. i 1% kobbersulfat-op-løsningen, herefter skylles der 6-8 gange med vand. Den aktiverede cadmium opbevares under vand, så den ikke kommer i kontakt med luft. Aktivering af cadmium skal foregå i stinkskab.

5.2.2 CadmiumsøjleSøjle til påfyldning af det aktiverede cadmium er en 100 mm lang polypropylenslange (2 mm ID), som i stinkskab fyldes med cadmiumkornene, uden at disse kommer i kontakt med luft.

5.3 Koncentrationbestemmelse af NO3-

og/eller NO2

-, automatiseret Selve reduktionen af NO3

- til NO2- samt reagenstilsætning

og efterfølgende måling af farveudvikling på spektrofotometer kan foretages på både autoanalysator eller flow injection analysator (FIA). Et væld af forskellige apparater såvel som et utal af metoder, reagenser, tilsætningsforhold etc. findes på markedet. Her gennemgås én opsætning som fungerer på de fleste automatiserede analysatorer (Figur 1).

Der anvendes Tygon®-pumpeslanger i størrelser som i kombination med den valgte pumpe giver nedenstående flowrater. Den øvrige del af flowvejen i systemet udgøres af polyethylen slanger, 0,8 mm (ID). Debubbleren fjerner de mikrobobler, der måtte dannes og forhindrer disse i at interferere med absorbansmålingen i fotometeret. Flowraterne for de enkelte pumpeslanger er (ml/min): 1) Affald: 0,41, 2) farvereagens: 0,56, 3) affald: 0,71, 4) bærevæske: 0,41, 5) buffer: 1,57. Til måling af NO2

-

anvendes samme opsætning, blot uden cadmiumsøjlen. Tilførsel af prøve (vol. 200 µl) til injektionsventilen sker normalt med autosampler, men kan også foregå manuelt. Intervallet mellem to prøver afpasses, således at absorbansen af en enkelt prøve kan bestemmes uden interferes fra øvrige prøver. Husk at ryste optøede prøver meget kraftigt før delprøver udtages, så de udfrosne salte fordeles homogent i opløsningen.


14-73

5.3.1 Standardkurver og måleområdeStandard-prøver til fremstilling af standardkurve skal afpasses således, at alle prøver giver absorbanser, der ligger i et lineært område mellem absorbansen for hhv. højeste og laveste standard. Prøver, der ligger udenfor dette koncentrationsområde, skal fortyndes med bærevæske og re-analyseres. Udstrækningen af det lineære område afhænger af opsætningen og skal bestemmes eksperimentelt for både NO2

- og NO3-.

Absorbansen er salinitetsafhængig, og standarder blandes derfor i bærevæske med samme salinitet som prøverne.


14-74

Buffer

Bærevæske

Til affald

Til affald

Til affald

Pumpe

Cd

- søj

le

Injektionsventilmed 200 µl loop

Prøve

Farvereagens

Debubbler

T - stykke

540 nm

540 nmTygon slange

Polyethylen slange (0,8 mm ID)

1

2

3

4

5

Spektrofotometriskdetektor

Tygon Polyethylen forbindelse

Figur 1. Flowdiagram ved automatiseret nitrat/nitrit analyser. Flowrater de (ml/min): 1) Affald: 0,41, 2) farvereagens: 0,56, 3) affald: 0,71, 4) bærevæske: 0,41, 5) buffer: 1,57.

5.3.2 Kontrol af cadmiumsøjlens reduktionseffektivitetCadmiumsøjlens reduktionseffektivitet skal kontrolleres hver gang, der køres prøver og jævnligt under målingerne. Det foregår ved, at man sammenligner absorbansen af 30 µM NO2

-- og 30 µM NO3--stamopløsninger. Når

reduktionseffektiviteten bliver mindre end 90 % skal cadmium søjlen aktiveres eller udskiftes.

5.4 InterferensBestemmelsen af NO3

- og NO2- i havvand er uden

interferens, sålænge salinitet af prøve og standarder er ens. Dog kan prøver med højt sulfid indhold meget hurtigt ødelægge effektiviteten af cadmiumsøjlen.


14-75

5.5 ReferencerDansk Standard DS 223, December 1975: Vandundersøgelse. Bestemmelse af summen af nitrit- og nitratnitrogen. 1.udg. pp. 7.

Grasshoff, K., 1983: Determination of nitrite. In: Grasshoff, K., Ehrhardt, M. og Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Verlag Chemie, Weinheim, 139-142.

Grasshoff, K., 1983: Determination of nitrate. In: Grasshoff, K., Ehrhardt, M. og Kremling, K. Methods of Seawater Analysis. Verlag Chemie, Weinheim, 143-150.


14-76


14-77

Bilag 14.6

Fotometrisk bestemmelse af ammonium (NH4

+) i saltvandAfviger på flere punker fra Dansk Standard DS 224, bl.a.

phenol erstattes med natriumsalicylat i salicylat-katalysator opløsningen (Reagens I), hvorved eventuel dannelse af det flygtige og meget giftige o-chlorophenol undgås,

ved absorbansmåling anvendes bølgelængde 640 nm (saltvand) eller 680 nm (ferskvand),

prøver måles med reference til salinitetstro standardkurve og kræver derfor ingen korrektion for salteffekt.

6.1 PrincipI tilstedeværelse af natriumnitroprussid reagerer ammonium i svag alkalisk opløsning med salicylat og hypochlorit, hvorved der dannes indophenolblåt. Intensiteten af den blå farve måles spektrofotometrisk og er proportional med koncentrationen af ammonium.

Ammonium-koncentrationen angives i µM og omregnes til µg N/ liter ved multiplikation med 14,01. Metoden kan anvendes direkte indenfor standard-kurvens lineære område op til ca. 80 µM.

6.2 ReagenserTil fremstilling af reagenser, fortyndinger samt skylning af glasvarer og apparatur skal anvendes destilleret eller renset demineraliseret vand. f. eks. fra MILLI-Q eller Elgastat Maxima anlæg. Om nødvendigt skal vandets og reagensernes ammonium-indhold kontrolleres.

Alle reagenser skal være af analysekvalitet, hvor intet andet er anført.

Samtligt glasudstyr, der anvendes i fremstillingen og til opbevaring af reagenser, stamopløsninger, standarder og bestanddele deraf skylles grundigt - først i 10 % saltsyre og derefter i vand. Der anvendes handsker i alle analysens trin for at undgå ammonium-kontaminering fra hænder. Analysen bør udføres i et “ammoniumfrit” lokale.


14-78

For at minimere risikoen for optagelse af ammonium fra luften bør kemikalier, der anvendes til analysen efter åbning, opbevares tæt tillukket - f. eks. i plastposer. Kemikalier, der ønskes anvendt til ammonium analyse, bør ikke anvendes til andre formål end dette.

Reagensglas til opbevaring og analyse af prøver skal tilproppes før og efter hver enkelt overførsel. Når en ny pakning af reagensglas hhv. propper åbnes, tilproppes glassene hurtigst muligt. Brug handsker.

Vand optager let ammoniak fra luften. Prøver, reagenser og kalibreringsopløsninger bør derfor opbevares i godt tillukkede flasker eller kolber. Under analysen bør disse ikke stå åbne længere tid end højst nødvendigt. Der må ikke anvendes ammoniakopløsninger i laboratoriet eller tilstødende lokaler under analysen.

Salicylat-catalysator opløsning, Reagens I: Opløs 440 g natriumsalicylat, (C6H4)OHCOONa, og 0,28 g natriumnitroprussid, Na2Fe[(CN)5NO],2H2O i vand og fortynd til 1000 ml. Opløsningen opbevares i mørk glasflaske i køleskab. Reagenset bliver med tiden mørkere (absorbansen øges), men er stabil i mindst 3 måneder.

Alkali-citrat opløsning: Opløs 18,5 g natriumhydroxid, NaOH, og 100 g tri-natriumcitrat, Na3[COH(CH2COO)2COO],2H2O, i vand og fortynd til 1000 ml. Opløsningen opbevares i køleskab og er stabil i ubegrænset tid.

Natriumhypochlorit opløsning, 5%: Fremstilles ved 3x fortynding med vand af 15% natriumhypochlorit, NaClO, (fx Bie & Berntsen 15 vol %). Fortyndes umiddelbart inden brug. Den ufortyndede hypochlorit opløsning opbevares i mørk glasflaske i køleskab.

Alkali-hypochlorit opløsning, Reagens II: Fremstilles ved at fortynde 5% natriumhypochlorit-opløsningen med alkali-citrat opløsningen, 1:9. Reagenset skal anvendes inden for 1 time efter fremstilling.

Ammonium-stamopløsning, 25 mM: Opløs 1,337 g ammoniumchlorid, NH4Cl (der i forvejen er tørret ved 60°C i ca. 2 timer og afkølet i eksikator), i vand og fortynd til 1000 ml. Tilsæt 1 dråbe chloroform, CHCl3, som konserveringsmiddel. Stamopløsningen opbevares i glasflaske i køleskab. Holdbar i flere måneder.

Ammonium-standardopløsning, 100 µM: Overfør 400 µl 25mM ammonium-stamopløsning til en 100 ml målekolbe og fortynd til mærket med kunstigt havvand af samme saltholdighed som prøven 5‰.

Kunstigt havvand, 100‰: Opløs 89,3 g natriumchlorid, NaCl, 28,6 g magnesiumsulfat heptahydrat, MgSO4,7H2O, og 0,13 g natriumhydrogencarbonat, NaHCO3, i 800 ml


14-79

vand og fortynd til 1000 ml. Opløsningen opbevares i køleskab og er holdbar i ca. 1 måned.

6.3 Koncentrationsbestemmelse af NH4+ -

absorbansmålingVed måling af ammonium i saltvandsprøver skal evt. fortyndinger foretages med kunstigt havvand, og standarder skal ligeledes fremstilles i kunstigt havvand, alle med en saltholdighed, der svarer til prøvens 5‰.


NH4+-standardkurve

1. Overfør 0 µl, 100 µl, 200 µl, 500 µl, 1000 µl, 2000 µl, 4000 µl, 6000 µl og 8000 µl af ammonium-standardopløsningen (100 µM NH4

+) til 10 ml målekolbe og fortynd prøverne med kunstigt havvand til et total volumen på 10 ml. Herved fås flg. NH4

+ koncentrationer: 0 µM (dvs., blank-prøven), 1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 µM, 20 µM, 40 µM, 60 µM og 80 µM NH4

+.

2. Overfør 2,5 ml standard til et nyt plastreagensglas m/prop.

3. Tilsæt 300 µl Reagens I og bland (Whirley mixer).

4. Tilsæt 500 µl Reagens II, bland (Whirley mixer) og stil prøven i mørke.

5. Farvereaktionen er fuldstændig efter 1 time, og absorbansen af den blå farve måles ved 640 nm (saltvand) og 680 nm (ferskvand) i 1 cm kuvette efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af blank-prøven. Prøven er stabil i op til 3 timer

Ud fra hældningen af standardkurven beregnes indophenolblåt’s absorptionskoefficient, , µM per abs. enhed. Kontroller kalibreringskurven regelmæssigt.

6.3.2 Bestemmelse af NH4+ koncentration i fersk- og

saltvandFrosne tøes op og rystes meget kraftigt, så de udfrosne salte fordeles homogent i opløsningen, før delprøver udtages.

1. 2,5 ml (evt. fortyndet) prøve overføres til et nyt plastreagensglas m/prop.

2. Tilsæt 300 µl Reagens I og bland (Whirley mixer).

3. Tilsæt 500 µl Reagens II, bland (Whirley mixer) og stil prøven i mørke.


14-80

4. Farvereaktionen er fuldstændig efter 1 time, og absorbansen af den blå farve måles ved 640 nm (saltvand) og 680 nm (ferskvand) i 1 cm kuvette efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af blank-prøve (kunstigt havvand af samme saltholdighed som prøven 5‰ tilsat farvereagenser). Prøven er stabil i op til 3 time.

Koncentrationen af NH4+ (µM) i den målte prøve beregnes

ved:

[NH4+] = x A x F

hvor

er indophenolblåt’s absorptionskoefficient, µM per abs. enhed, ved den aktuelle salinitet


F er fortyndingen af prøven.

6.4 InterferensFe(III) koncentrationer over 90 µM interfererer pga. egenfarve. Koncentration af svovlbrinte > 60 µM interferer, men da NH4

+ koncentrationen i sulfidholdige prøver som regel er forholdsvis høj, kan interferens undgås ved at fortynde prøverne. For at hindre udfældninger af magnesium og calcium i form af hydroxider, særlig i havvandsprøver, kompleksbindes disse ved tilsætning af citrat.

6.5 ReferencerDansk Standard DS 224, December 1975: Vandundersøgelse. Bestemmelse af ammonium-nitrogen. 1. udg. pp. 6.

Bower, C.E. & Holm-Hansen, T., 1980: A salicylate-hypochlorit method for determining ammonia in seawater. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 37, 794-798.


14-81

1Bilag 14.7

Fotometrisk bestemmelse af urea (H2NCONH2) i saltvand Der findes ingen analyseforskrift fra Dansk Standard.

7.1 PrincipI et svovl-/fosforsurt miljø og med ferrichlorid som katalysator reagerer urea med diacetylmonoxim og danner et magentafarvet kompleks, der stabiliseres af thiosemicarbazid. Kompleksets absorbans ved 525 nm er proportionalt med urea-indholdet.

Urea koncentrationen angives i µM. Omregnes til µg N/liter ved multiplikation med 28,02. Metoden kan anvendes indenfor standardkurvens lineære område op til ca. 60 µM.

7.2 ReagenserTil fremstilling af reagenser, fortyndinger samt skylning af glasvarer og apparatur skal anvendes destilleret eller renset demineraliseret vand f. eks. fra MILLI-Q eller Elgastat Maxima anlæg. Om nødvendigt skal vandets urea-indhold kontrolleres.

I analysen indgår et meget giftigt stof - thiosemicarbazid, og alle trin, der involverer dette stof, skal derfor foregå i stinkskab og med brug af egnet beskyttelsesudstyr.

Der anvendes handsker i alle analysens trin for at undgå urea-kontaminering fra huden.

Reagensglas til opbevaring af prøver skal holdes tilproppet før og efter overførsel af prøver.

Når en ny pakning af reagensglas hhv. propper åbnes, tilproppes glassene hurtigst muligt. Brug handsker.

Ferrichlorid-katalysator-opløsning, Reagens I: Bland 300 ml koncentreret svovlsyre, H2SO4 (densitet = 1,84 g/ml) og 100 ml koncentreret fosforsyre, H3PO4 (densitet = 1,71 g/ml) i 600 ml vand. Vær opmærksom på en kraftig varmeudvikling. Tilsæt 50,0 mg ferrichlorid, FeCl3,6H2O, når blandingen er afkølet til stuetemperatur. Lang holdbarhed.

Diacetylmonoxim-opløsning, Reagens II: Opløs 5,0 g diacetylmonoxim, CH3COCN(OH)CH3, i 250 ml vand ved 80 °C. Tilsæt, når blandingen er afkølet til stuetemperatur,


14-82

50,0 mg thiosemicarbazid, H2NCSNHNH2 (meget giftigt). Holdbar i køleskab i ca. 3 måneder.

Urea-stamopløsning, 10 mM: Opløs 0.601 g urea, H2NCONH2, i ca. 800 ml vand og fortynd til 1000 ml. Opbevares i køleskab.

Urea-standardopløsning, 100 µM: Overfør 100 µl 10 mM urea-stamopløsning til en 10 ml målekolbe og fortynd til mærket med kunstigt havvand af samme saltholdighed som prøven 5‰.

Kunstigt havvand, 100‰: Opløs 89,3 g natriumchlorid, NaCl, 28,6 g magnesiumsulfat heptahydrat, MgSO4,7H2O, og 0,13 g natriumhydrogencarbonat, NaHCO3, i 800 ml vand og fortynd til 1000 ml. Opløsningen opbevares i køleskab og er holdbar i ca. 1 måned.

7.3 Koncentrationsbestemmelse af urea, H2NCONH2 - absorbansmåling

Ved måling af urea i saltvandsprøver skal standarder fremstilles i kunstigt havvand, alle med en saltholdighed der svarer til prøven 5‰.

7.3.1 Bestemmelse af farvereagensets absorptionskoefficent - urea

standardkurve1. Overfør 0 µl, 100 µl, 250 µl, 500 µl, 750 µl, 1000 µl, 1250

µl og 1500 µl af urea-standardopløsningen (100 µM H2NCONH2) til 10 ml målekolbe og fortynd prøverne med havvand til et total volumen på 10 ml. Herved fås flg. urea-koncentrationer: 0,0 µM (dvs. blank-prøven), 1,0 M, 2,5 M, 5,0 M, 7,5 M, 10,0 M, 12,5 M og 15,0 µM H2NCONH2.

2. Overfør 600 µl standard til 2 ml Eppendorf rør m/sikkerhedslåg.

3. Tilsæt 600 µl Reagens I, luk og bland prøven.

4. Tilsæt 160 µl Reagens II, luk og bland prøven igen.

5. Standarderne opvarmes i vandbad til 90oC i 30 minutter

6. Afkøles til stuetemperatur (ca. 5 min i 20oC varmt vand)

7. Absorbansen måles ved 525 nm i 1 cm kuvette efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af blank-prøven. Prøven er stabil i nogle få timer. Farvekomplekset er ustabilt i sollys og skal derfor opbevares mørkt.

Ud fra hældningen af standardkurven beregnes diacetylmonoxim’s absorptionskoefficent, , µM per abs.


14-83

enhed. Kurven er lineær for absorbans op til 0,6 ( ca. 60 µM urea). Kontrollér kalibreringskurven regelmæssigt.

7.3.2 Bestemmelse af urea koncentration i saltvandFrosne tøes op og rystes meget kraftigt, så de udfrosne salte fordeles homogent i opløsningen, før delprøver udtages.

1. Overfør 600 µl prøve til 2 ml Eppendorf rør m/sikkerhedslåg.

2. Tilsæt 600 µl Reagens I og bland prøven.

3. Tilsæt 160 µl Reagens II og bland prøven igen.

4. Standarderne opvarmes i vandbad til 90oC i 30 minutter

5. Afkøles til stuetemperatur (ca. 5 min i 20oC varmt vand)

6. Absorbansen af farvekomplekset måles ved 525 nm i 1 cm kuvette efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af blank-prøve (kunstigt havvand af samme satlholdighed som prøven 5‰, tilsat farvereagenser). Prøven er stabil i nogle få timer. Farvekomplekset er ustabilt i sollys og skal derfor opbevares mørkt.

Koncentrationen af urea (µM) i den målte prøve beregnes ved:

[H2NCONH2] = x A x F

hvor

er diacetylmonoxim’s absorptionskoefficient, µM per abs. enhed,


F er fortyndingsfaktor for prøven

7.4 Interferens Eneste angivne interfererende forbindelse er citrullin.

7.5 ReferencerPrice, N.M. and P.J. Harrison, 1987: Comparison of Methods for the Analysis of Dissolved Urea in Seawater. Marine Biology 94, 307-317.


14-84


14-85

Bilag 14.8

Fotometrisk bestemmelse af opløst silicium (Si) i vandDer findes ingen analyseforskrift fra Dansk Standard.

8.1 PrincipMetoden er baseret på dannelsen af et svagt gulfarvet silicomolybdat kompleks, der fremkommer ved reaktion af silicium med syre og molybdat. Ved tilsætning af ascorbinsyre, straks efter at førnævnte reaktion er forløbet, reduceres det gule kompleks, og der dannes et intenst blåfarvet kompleks, der er stabilt i flere timer. Umiddelbart inden tilsætning af ascorbinsyre, tilsættes oxalsyre med det formål, dels at undgå at overskydende molybdat reduceres og dels at eliminere eventuel interferens fra fosfationer. Intensiteten af det blåfarvede kompleks måles fotometrisk ved 810 nm og absorbansen er proportional med prøvens silicium koncentration.

Silicium koncentrationen angives i µM. Omregnes til µg Si/ liter ved multiplikation med 28.09. Metoden kan anvendes indenfor standardkurvens lineære område op til ca. 50 µM.

8.2 ReagenserTil fremstilling af reagenser, fortyndinger samt skylning af laboratorieudstyr skal anvendes destilleret eller renset demineraliseret vand f. eks. fra MILLI-Q eller Elgastat Maxima anlæg.


Da glas kan afgive silicium anvendes udelukkende plastvarer ved fremstilling af reagenser og opløsninger samt under hele analysen.

Svovlsyre, 4,5 M: Tilsæt forsigtigt og under omrøring 250 ml koncentreret svovlsyre, H2SO4 (densitet = 1,84 g/ml), til ca. 700 ml vand. Afkøl til stuetemperatur og fortynd til 1000 ml. Syren opbevares i polyethylenflaske.

Molybdat-reagens: Opløs 38 g ammonium heptamolybdat tetrahydrat, (NH4)6Mo7O24,4H2O, i 300 ml vand. Først derefter tilsættes 150 ml 4,5 M svovlsyre. Syren må ikke tilsættes til uopløst molybdat! Opbevares i polyethylenflaske beskyttet mod direkte sollys. Holdbar i mange måneder.


14-86

Oxalsyre-opløsning, 100 g/l: Opløs 10 g oxalsyre dihydrat, (COOH)2,2H2O, i 100 ml vand. Opbevares i plastflaske og er stabil i ubegrænset tid.

Ascorbinsyre-opløsning, 160 mM: Opløs 2,8 g ascorbinsyre, C6H8O6, i 100 ml vand. Opbevares mørkt i køleskab. Er virksom så længe opløsningen er ufarvet.

Silicium-stamopløsning, 10 mM: Opløs 1,881 g dinatriumhexafluorsilikat, Na2SiF6, (der i forvejen er tørret ved 105°C i 1-2 timer og afkølet i eksikator) i ca. 200 ml opvarmet vand. Efter afkøling til stuetemperatur fortyndes til 1000 ml. Hældes straks på (og opbevares i) polyethylenflaske og er stabil i ubegrænset tid.

Silicium-standardopløsning, 1000 µM: Overfør 1000 µl 10 mM silicium stamopløsning til en 10 ml målekolbe og fortynd til mærket med kunstigt havvand af samme saltholdighed som prøven 5‰.

Kunstigt havvand, 100‰: Opløs 89,3 g natriumchlorid, NaCl, 28,6 g magnesiumsulfat heptahydrat, MgSO4,7H2O, og 0,13 g natriumhydrogencarbonat, NaHCO3, i 800 ml vand og fortynd til 1000 ml. Opløsningen opbevares i køleskab og er holdbar i ca. 1 måned. Opbevares i plastflaske i køleskab og er holdbar ca. 1 måned.

8.3 Koncentrationsbestemmelse af Si - absorbansmåling

Ved måling af silicium i saltvandsprøver skal evt. fortyndinger foretages med kunstigt havvand, og standarder skal ligeledes fremstilles i kunstigt havvand, alle med en saltholdighed, der svarer til prøvens 5‰.


Si- standardkurve1. Overfør 0 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl og 500

µl af silicium-standardopløsningen (1000 µM Si) til 10 ml målekolbe og fortynd prøverne med havvand til et total volumen på 10 ml. Herved fås flg. Si koncentrationer: 0,0 µM (dvs., blank-prøven), 5 µM, 10 µM, 20 µM, 30 µM, 40 µM og 50 µM Si.

2. Overfør 2.5 ml standard til plastreagensglas.

3. Tilsæt 100 µl molybdat reagens og bland straks (Whirley mixer).

4. Lad blandingen reagere i 10-20 minutter (ferskvand) eller 5-10 minutter (saltvand).

5. Tilsæt 100 µl oxalsyre-opløsning og straks efter 50 µl ascorbinsyre-opløsning. Bland forsigtigt.


14-87

6. Efter 30-60 minutter måles absorbansen af den blå farve ved 810 nm i 1 cm kuvette efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af blank-prøven. Prøven er stabil i ubegrænset tid.

Ud fra hældningen af standardkurven beregnes absorptionskoefficenten, , µM per abs. enhed. Kontroller kalibreringskurven regelmæssigt.

8.3.2 Bestemmelse af Si koncentration vandige prøverFrosne tøes op og rystes meget kraftigt, så de udfrosne salte fordeles homogent i opløsningen, før delprøver udtages.

1. Overfør 2.5 ml (evt. fortyndet) prøve til plastreagensglas.

2. Tilsæt 100 µl molybdat reagens og bland straks (Whirley mixer).

3. Lad blandingen reagere i 10-20 minutter (ferskvand) eller 5-10 minutter (saltvand).

4. Tilsæt 100 µl oxalsyre opløsning og straks efter 50 µl ascorbinsyre opløsning. Bland forsigtigt.

5. Efter 30-60 minutter måles absorbansen af den blå farve ved 810 nm i 1 cm kuvette efter at spektrofotometeret er nul-stillet ved brug af blank-prøve (kunstigt havvand af samme satlholdighed som prøven 5‰ tilsat farvereagenser). Prøven er stabil i ubegrænset tid.

Koncentrationen af silicium (µM) i den målte prøve beregnes ved:

[Si] = x A x F

hvor

er absorptionskoefficienten, µM per abs. enhed, ved den aktuelle salinitet


F er fortyndingsfaktor for prøven

8.4 InterferensHydrogensulfid - H2S: Hvis H2S er tilstede i anoxisk vand kan det gule silicomolybdat kompleks reduceres delvist med grønfarvning til følge. Dette påvirker ikke det endelige blå farvekompleks, så længe dannelsen af kolloidt svovl undgås. Ved H2S-indhold på over 5 mg/l bør prøverne fortyndes inden analyse. Det er dog at foretrække, at sulfiden oxideres med brom.Teknisk anvisning for marin overvågning - Bentiske parametre14. Sediment - ilt og næringsstoffer/18-11-98

14-88

Fosfationer: I tilstedeværelse af oxalsyre og når reduktanten (ascorbinsyre) tilsættes separat påvirkes analysen ikke af fosfationer.

8.5 ReferencerGrasshoff, K., M. Ehrhardt and K. Kremling, 1983: Methods of Seawater Analysis. 2. ed. Verlag Chemie GmbH, Weinheim .

Strickland, J.D.H. and T.R. Parsons, 1972: A Practical Handbook of Seawater Analysis. Bulletin 167 (2. ed.) Fisheries Research Board of Canada, Ottawa.


14-89


14-90

Bilag 14.9

(består af 7 sider (skemaer); ligger separat som EXCEL-fil)


14-91

dmu rapport skabelon · web viewkunstigt havvand, 100‰: opløs 89,3 g natriumchlorid, nacl, 28,6...

Documents