DNA-Chips

Analytikseminar07.01.2009

Waldemar Röhrig

Inhalt

1. Begriffsklärung und Geschichtsstunde2. Grundlegendes zur Methode3. Herstellung von DNA-Chips4. Durchführung5. Anwendungsgebiete6. Zusammenfassende Bewertung7. Quellen

1.Was ist ein DNA-Chip?

Festkörperoberfläche, auf der DNA-Sonden (Oligonucleotide mit 10-1000 Basen) mit bekannter Sequenz rasterförmig (Array) durch kovalenteBindung immobilisiert sind

Einordnung in die Gruppe der Biosensoren, mit denen ausschließlich Nucleinsäure-Sequenzen parallel analysiert werden können

Durch extreme Miniaturisierung ( > 200.000 Spots/cm2 ) auch als DNA-Microarray bezeichnet.

1.Was ist ein DNA-Chip?

1.1 Warum Microarrays?Der Anschub wurde, wie auch bei vielen anderen molekular-biologischen Methoden, durch das Humane Genom Projekt vollzogenSequenzierung lieferte mit einem Mal sehr große DatenmengenMit dem neu gewonnenen Wissen um SNPs (Single NucleotidePolymorphisms) und der dynamischen Genexpression konnten „klassische Methoden“ wie

Southern-BlottingPCRin situ-HybridisierungenRFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) Untersuchungen

nicht mit der notwendigen Komplexität mithaltenEs mussten Screening-Methoden zur schnellen und billigen Analyse von sehr vielen Molekülen entwickelt werdenIn den 90er Jahren wurden erstmals Microarrays zur klinischen Analyse von SNPs verwendet

2.Grundprinzip

Hochspezifische komplementäre Hybridisierung der bekannten immobili-sierten Sonden mit der zu untersuchenden komplementären Analyt-DNAWobei isolierte mRNA oder DNA durch molekularbiologische Methoden mit einem Reporter (Radioaktivität, Fluoreszenz) markiert wird

Dies ermöglicht Identifizierung von Genen oder Quantifizierung der relativen Veränderung der Genexpression zu Vergleichsproben

Microarray Designtypen

cDNA-Arrays zur Erstellung von Expressionsprofilen (quantitativer Ansatz)

Untersuchung verschiedener Transkriptmuster unterschiedlicher Gewebe, Zellstadien oder als Antwort auf einen WirkstoffWobei RNA als Informationsträger dient

Vergleich von Informationen

Oligonucleotidarrays zur Genotypanalyse (vorwiegend qualitativer Ansatz)

Untersuchung der Unterschiede auf genomischen EbeneWobei DNA als Informationsträger dient

Genotypisierung

3. Herstellung von DNA-Chips3.1 Verwendete Festkörperoberflächen

GlaschipsSilanisierung mit AlkylsilanenBildung von selbstorganisierenden Monoschichten (SAMs)Linkermoleküle für die Immobilisierung von DNA oder synthetischen Oligonucleotiden

3.1 Verwendete Festkörperoberflächen

GoldfilmeBildung von funktionalisierten Alkanthiol-SAMsAu/S-Bindung sehr stabil (ca. 170 kJ/mol)

Verschieden funktionalisierte Alkanthiol-Monoschichten(SAMs = self assembledmonolayers) auf Gold-oberflächen:1 biotin2 N-oxysuccinimidester3 epoxy4 maleimid5 amino,6 oligo(ethylenglycol)

3.1 Verwendete FestkörperoberflächenPolymeroberflächen

Polyacrylsäure, PolyacrylnitrilLinkermoleküle für die Immobilisierung von DNA oder synthetischen Oligonucleotiden

*

N

*

nCOOHCOOH COOH

* *

n

Polyacrylnitril Polyacrylsäure

PDI=1,4-phenylene-diisothiocyanateMUA=11-sulfanylundecanoic acid11-MUAM=mercaptoundecylamine

3.2 Synthese der DNA-Sonden auf dem Chip

on-chip-Methode (Affymetrix, Agilent)

direkte Synthese der Oligonukleotide an der Oberflächedabei wird schrittweise der DNA-Strang direkt an der Oberfläche synthetisiertphotolithographischer Prozess, bei dem die verwendeten Nukleotide mit photosensitiven Schutzgruppen versehen sind

3.2 Synthese der DNA-Sonden auf dem Chip

off-chip-Methode

bei dieser Synthesestrategie werden die Sonden zur Analyse zunächst in Lösung synthetisiert und können nach der Aufreinigung an die Oberfläche gebunden werdendie Bindung erfolgt durch Kopplung der Sonden an reaktive Gruppen (X) auf der Oberfläche

3.2 Synthese der DNA-Sonden auf dem Chip

Verschiedene Verfahren der off-chip-Methode

Contact-tip-printing VerfahrenDas Volumen der Sonden-Lösung, das an einer Nadel hängen bleibt, wird durch Aufsetzen dieser auf die Chip-Oberfläche übertragen =>Spotgröße: ca. 100 µm

Ring-and-pin VerfahrenDas Volumen der Sonden-Lösung wird mit einem Ring aufgenommen und durch einen Anstoß mit einer Nadel wieder abgegeben =>Spotgröße: ca. 100 µm

Top-spot-printing VerfahrenDie Sondenlösung wird durch Kapillaren mittels Druck auf die Chip-Oberfläche aufgebracht =>Spotgröße: ca. 200 - 300 µm

Ink-jet VerfahrenPrinzip des Nadeldruckers, wobei die Sondenlösung tropfenweise auf den Chip aufgebracht wird =>Spotgröße: 50 µm

3.2 Synthese der DNA-Sonden auf dem Chip

Vergleich der on-chip- und off-chip-Methode

off-chip-Methode

+ Sonden sind zu 100% in ihrer Struktur bekannt =>längere Sonden können ohne Ausbeuteverlust gekoppelt werden

+ PCR-Produkte können an die Chip-Oberfläche gebunden werden+ billig- max. Spotdichte von 1000 Sonden/ cm2

- geringere Oligomerdichte im Spot

on-chip-Methode

+ höhere Spotdichte, da nur kurze Oligomere, die direkt auf dem Chip synthetisiert werden, Verwendung finden; 200000 Sonden/ cm2

+ Dichte der Oligomere im Spot selbst ist ebenfalls größer- Oliomere nur bis zu 25 Basen unproblematisch, darüber wird der

Fehler zu groß- teuer

3.3 Markierung der Analyt-DNA

Fluoreszenz Die gängigste Methode basiert auf der Verwendung von Fluoreszenz-sonden, da Fluoreszenzfarbstoffe in sehr geringer Konzentration – bis hin zu Einzelmolekülen - nachgewiesen werden können. Die ermittelte Intensität ist direkt proportional zur Analytmenge

Verwendete FluorophoreCyanine, z.B. Cy3 und Cy5, die an Cytidin-triphosphat (dCTP) gekoppeltsind.

3.4 Bsp.: GeneChip® der Firma Affymetrix

Problem: Normalisierung der Intensitäten und ausschließen von Fehlpaarungen erfordern extrem Umfangreiche statistische Analysen

Bioinformatik

V.a. Abhängigkeit der Software, die vom Chip-hersteller mitgeliefert wird

Ein bekanntes Gen wird durch 15-20 verschiedene 25mer-Oligonukleotidsequenzen repräsentiert, die als sequenzspezifische Detektoren dienen

Zusätzliche Kontrollelemente: Mismatch (MM) Control Oligos; bis auf eine Basenposition identische Sequenz zu den Perfect Match (PM) Referenzproben

Reduzierte Spezifität der MMsidentifiziert unspezifische Hybridisierung (Hintergrund)

Korrigierte Intensität: Signal (PM)-Signal (MM)

4. Durchführung4.1 Überblick

Datenbankrecherche (cDNABanken z.B. NCBI) und Bestellung eines ChipsBeschaffung der zu Untersuchenden ProbenIsolierung/Extraktion der mRNA(Transkriptom) aus mind. zwei unterschiedlichen ZellzuständenEvtl. prä-Amplifikation der mRNA(ca. 30-100 µg RNA nötig)Reverse Transkription zur Herstellung von floureszenzmarkierter cDNAMixen der verschiedenfarbig markierten cDNAInkubieren des Chips mit der cDNA => HybridisierungWaschen, um nicht gebundene cDNA zu entfernen

Evtl. Sensitivitätssteigerung durch Dendrimertechnologie, TyramideSignal Amplification oder Quantum DotsDetektion der Floureszenz und computergestützte Auswertung der Ergebnisse

4. Durchführung

4.1 Überblick

Animation der Arbeitsschritte

http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/chip/chipQ.html

4.2 Detektion

Laser-Scannergrüner Laser für Cy3roter Laser für Cy5+ sehr sensitiv und hoch

auflösend- Photobleaching- teuer- laaangsam

CCD-Kamera mit Weißlichtlampe und Spektralfilter

+ sensitiv, schnell und hoch auflösend

+ geringes Photobleaching+ verschiedene Wellenlänge- teuer

4.3 Bildauswertung und Datenanalyse

Zuerst scannen mit grünem Laser, dann mit rotemNach Scannen des Chips erfolgt die Softwaregestützte Visualisierung durch Falschfarben !

4.3 Bildauswertung und Datenanalyse

Grün bedeutet in diesem Experiment unterexprimiertRot bedeutet überexprimiertBei Gelb ist Expression in beiden Proben gleichGelb wird oft als schwarz dargestellt, da diese Information meist unwichtig ist, aber: Verlust der Information ob das Gen überhaupt transkribiert wird

4.3 Bildauswertung und Datenanalyse

Analyse der Daten durch SoftwareSehr beliebt: Heatmapsund Clusteranalysen Dadurch schnelle Identifizierung von fuktionellen Genen

5. Anwendungsgebiete5.1 Molekularbiologische Grundlagenforschung

Genexpressionsmuster nach Hitze-oder Kälteschock

Unterschiedliche Kultivierungsbedingungen: bis zu 4fache Änderung in Genexpressionsraten

Zellzyklus: Ko-Regulation von Genen, potentielle Funktion bisher nicht bekannter Gene

Zellantwort auf DNA-Beschädigung (durch UV oder Chemikalien): bestimmte Gene (DNA-Reparaturenzyme) bis zu 25fach überexprimiert

Adaptive Evolution unter den Bedingungen eines Selektionsdrucks

=> Metabolisches Netzwerk

Bsp.: Hefegenom ist vollständig entschlüsselt und auf einen Chip aufgebracht worden

5.2 Medizin / TumorforschungBsp.: Chip, der 18.000 verschiedene TumorgenerepräsentiertZwei sehr ähnliche Varianten des B-Zell-Lymphoms, einer schweren Krebserkrankung, können aufgrund verschiedener Aktivitätsmuster der Onkogeneunterschieden werdeneine Form der Krankheit, die rund zwei Fünftel der Fälle ausmacht, spricht auf zytostatische Chemotherapie an, die andere nichtUnterscheidung zw. gutatrigenund bösartigen Tumoren=> keine unnötige Patientenbelastung

5.3 DNA-Analyse in der klinischen Diagnostik

Analyse von Mutationen (Punktmuationen, Deletionen, Insertionen) um Krankheiten wie Sichelzellanämie oder MucoviszidoseaufzudeckenPränatale Diagnostik

5.4 PharmakogenetikChipbeispiel

AmpliChip CYP450 Der Test analysiert die genetischen Variationen auf den Genen Cytochrom P450 2D6 und 2C19, die bei der Verstoffwechslung vieler häufig verschriebener Medikamente eine wichtige Rolle spielendefiniert entsprechenden Patientenphänotyp (langsamer, mittlerer, schneller oder ultraschneller Metabolisierer)=> Genotypisierung

zusammengesetzt aus Genomforschung, molekularer Diagnostik und pharmazeutischer ForschungSNPs bedingen individuelle Krankheitsanfälligkeit und Medikamentenverträglichkeit => „individualisierte Therapien“kommen in Abständen von 100–2.000 Basenpaaren im Genom vor

5.5 Lebensmittelanalytik

Notwendigkeit der Lebensmittelkontrolle

Qualitätssicherung (Produktqualität, Produktherkunft und undeklarierte Zusätze)gesundheitliche Aspekte (BSE-Problematik, Allergien, usw.)religiöse Gründe (bestimmte Tierarten dürfen nicht gegessen werden)gesetzlich vorgeschrieben

ChipbeispielDNA-Chip CarnoCheck®: Nachweis von bis zu acht Tierarten in geringsten Anteilen (>0,5 %); Artenspektrum umfasst Rind, Schaf, Schwein, Esel, Huhn, Pferd, Truthahn und ZiegeTest von Joghurt und Milchprodukten auf Mikroorganismen (sowohl gewünschte wie auch pathogene MO)GMO-Chip: Soja, Mais (Bt-Mais) und Raps, Viren

5.6 Lebensmittelanalytik

Nachweis gentechnisch veränderter Nahrungsmittel

z.B. Resistenzen

Gründeethische Gründegesetzlich verbotenAllergien

5.7 Umweltanalytik/-schutz

WasserkontrolleMikroorganismen im Abwasser (Kläranlagen)„Aqua-Chip“ hilft, Erreger in Bade- und Trinkwasser zu identifizieren (z.B. Salmonellen, Legionellen oder Cholera-Erreger)

Landwirtschaftspezifische Pestizidherstellung=> sinkende Umweltbelastung durch gezielten Spritzmitteleinsatz

ArbeitsschutzAnalyse grenzwertiger Gefahrstoffkonzentrationen am ArbeitsplatzNachweis von arbeitsplatzbedingten Erkrankungen

5.8 Zukunftsaussichten

GenotypisierungKlinische MikrobiologiePränatale DiagnostikKriminologieVaterschaftstests Uvm.

Pathogenarray z.B. für HIV-Infizierte, Leukämie Patienten und Transplantierte

Kriminologische Untersuchungen basierend auf RFLP können interessante Möglichkeiten bieten

6. Zusammenfassende Bewertung

Vorteile

Miniaturisierung; mehrere 100000 Sonden/ cm2

Analyse von mehreren 1000 Parametern auf einmal => ZeitersparnisMaterialersparnis durch geringe ProbenvoluminaAutomatisierbarkeit der Methodeuniverselle Chipanpassung auf eine FragestellungNach Abwaschen der Sonden kann DNA-Chip wiederverwendet werden

Nachteile

Kreuzhybridisierungen, d.h. Fehlpaarungen aufgrund sehr ähnlicher Sequenzen

Umfangreiche Nachbearbeitung der Daten mit HerstellersoftwareAbhängigkeit von ChipherstellernKeine standartisierten MethodenNoch viele Probleme wie Photobleaching oder zu geringe AnalytmengeNoch zu teuer für den täglichen Laborgebrauch (Aktuell ca. 350€ für 15000 Spots)

7. Quellen

Der Experimentator: Microarrays, Hans-Joachim Müller, Thomas Röder; Spektrum Akademischer Verlaghttp://www.biologie.uni-erlangen.de/genetik/teach_scripts.korpus-Dateien/Gentechnik_TW2.pdfSteffi Golze, Dissertation, „Oberflächengebundene Polymermonolagen für die Herstellung von DNA-Chips“Viola Podsadlowski, Dissertation, „Neue Fluorophore für die Bioanalytik – Verwendung in der Tierartendifferenzierung mittels DNA-Biosensor und DNA-Chiptechnologie“http://dbs.uni-leipzig.de/html/seminararbeiten/semWS0102/arbeit6/microarray_html.htmhttp://www-analytik.chemie.uni-regensburg.de/institut/lehre/downloads/downloads_biosensorik/Immobilisierung_0607.pdfhttp://www.roche.com/de/med-cor-2005-01-12http://www.gene-chips.com/http://www.innovations-report.de/html/berichte/biowissenschaften_chemie/bericht-74322.htmlhttp://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/chip/chip.htmlwww.affymetrix.com/ www.greinerbioone.com/de/row/news/pressreleases/ http://www.biotec.tu-dresden.de/schwille/group/teaching/lectures/lecturenotes/biosensors_dt.pdfhttp://www.uni-stuttgart.de/alumni/infoservice/newsletter_archiv/alumnius_2_01.pdfhttp://www.biospektrum.de/blatt/d_bs_pdf&_id=932803