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J Biomed Lab Sci 2010 Vol 22 No 2

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DNA 定序技術之演進與發展

李思元 1 莊以光 2

1財團法人國家實驗研究院科技政策研究與資訊中心 2永揚生醫科技股份有限公司

西元2000年首次完成了人類基因體草圖解碼的工作，為了加速基因資訊的充份利用，進而達成個

人化醫療的目標，DNA定序技術的發展將持續朝向低成本與高通量的方向前進。1990年代發展出

第一代定序方法，歷經30多年的演進，融合化學、生物化學、光學、自動化機械技術、微製程技

術與奈米技術等，開發出第二代高通量定序技術與第三代單一分子即時定序技術。本文彙整介紹

各世代定序技術的原理與特點，並加以分析比較，期望在瞭解DNA定序技術發展演進的過程後，

對未來新技術的發展創新有所助益。

關鍵詞：DNA定序、下一代定序技術、基因體、個人化醫療

前言

1984 年所提出的人類基因體計畫(Human Genome Project, HGP)，預計於 1990~2005 年間，花費 30 億美

元完成整個人類基因體定序的工作。令人驚訝的是

2000 年時，由私人企業團隊花費近 10 億美元，於 9個月內完成了人類史上第一次的基因體草圖解碼工

作。爾後，隨著許多技術的發展與改良，解讀出一個

人類基因組序列的花費減低至約 2 千萬美元，然而，

如此昂貴的費用無法讓基因資訊被充份利用，進而擴

展到個人化醫療的目標[1]。因此，為了加速突破此項

價格障礙，美國國家衛生研究院設立「革命性基因組

定序技術」計畫，號召全世界科學家共同挑戰於 2014年以 1 千美元的價格，完成讀取一個個人的基因組序

列[2]。此外，美國「X Prize」基金會舉辦了總獎金達

1 千萬美元的人類基因體定序競賽，台灣工研院資助

的「Cracker」團隊，發展互補性氧化金屬半導體(CMOS)感測技術，以快速、低成本的定序方式，成為全世界

入圍的 8 個團隊中唯一的亞洲隊伍，挑戰「以每人 1萬美元預算，10 天完成 1 百個人基因解碼」的目標[3]。

對任何 DNA 定序方法來說，充分瞭解 DNA 的組

成結構是一件極為重要的事。自 1953 年 Watson 與

Crick 由分子密度及 X 光繞射的結果得知，DNA 分子

是以雙股的去氧核醣核苷酸鏈所構成。目前已知人類

的基因組約由 60 億個核苷酸分子組成，每個核苷酸

都含有下列四個鹼基中的一種，而 DNA 的雙股結構

藉由核苷酸的鹼基，以腺嘌呤(adenine, A)配對胸腺嘧

啶(thymine, T)；胞嘧啶(cytosine, C)配對鳥糞嘌呤

(guanine, G)，並透過氫鍵的鍵結方式所構成，往後各

式 DNA 定序技術的蓬勃發展皆植基於此，並融合跨

領域的工程技術而擴展出來[4]。此外，核酸定序策略

的擬定，考量構成基因組的核苷酸數目龐大，且受限

於定序技術讀取長度的限制，無法一次完成所有的核

苷酸定序，因而採用「分進合擊」的方式，先解讀各

片段的基因序列，再運用資訊科技協助進行片段接

合，達成整個基因組定序的目標[5]。本文將依序介紹

DNA 定序技術的演進歷程與各階段主要技術平台之

運作原理。

第一代 DNA 定序策略與技術

如圖 1 之概念圖所示，現行主要之 DNA 定序策略多

為透過基因工程的方法，將待定序的基因序列切成小

片段以接入細菌質體，利用細菌生長繁殖快速的特性，

大量複製待測質體片段，爾後再以分離(Sequencing by

收稿日期：99 年 3 月 22 日通訊作者：李思元財團法人國家實驗研究院科技政策研究與資訊中心 10636台北市和平東路二段106號14樓

電話：02-2737-7643 傳真：02-2737-7838 電子郵件：[email protected]

綜論


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separation)的電泳分析或合成(Sequencing by synthe-sis)之定序方法，解讀 DNA 序列[6]。

1977 年，Sanger 等提出的分離定序法，其原理即

在於反應試劑中，依 4 種鹼基分類，分別加入一定比

例而以放射性同位素標記的雙去氧核苷酸(ddNTP)材料，由於此材料移除了羥基，而於合成過程中隨機中

止聚合反應，造成不同大小的 DNA 片段，再透過膠

體電泳分析和顯影後，可依據電泳帶的位置讀出待測

DNA 序列[7]。同年，Gilbert 等提出與 Sanger 法概念

類似的定序方法，不同之處僅在於 Gilbert 法使用特定

化學試劑標記，並以化學方法切斷待測 DNA 片段，

以便於後續進行電泳分析[8]。爾後，在 Sanger 法的基礎之上，80 年代出現了以

螢光標記代替放射性同位素的標記方法與自動定序

儀器[9]。而於 90 年代更發展出毛細管電泳技術，使

得單位時間內的定序能力的大幅提高[10]，目前運用

此方法的單次序列讀取長度，可達近 1 千個鹼基，而

解讀每個鹼基的準確度達 99.999%，其讀取 1 千個鹼

基的成本約為 0.5 美金[11]。此外，同時期還發展出其

他的定序方法，如接合酶定序法(sequencing by liga-tion)[12]、雜交定序法(sequencing by hybridization) [13]、焦磷酸定序法(Pyrosequencing)[14]等。

圖 1 第一代 DNA 定序策略與技術概念圖資料來源：Shendure J, Ji H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol 2008;26 (10):1135–1145. 本文繪製與整理

第二代 DNA 定序策略與技術

為了加快 DNA 定序的速度，由定序化學方法的改良

與自動化工程技術的突破著手，可大幅減少試劑用

量、同步進行多樣本定序反應，以有效縮短並減少定

序反應所需時間與成本。如圖 2 之概念圖所示，第二

代之 DNA 定序策略亦為先解讀各小片段的基因序

列，再運用資訊科技協助進行片段接合，達成整個基

因組定序的目標。因此，首先透過基因工程的方法，

將待定序的基因序列切成小片段，並接上轉接序列

(adaptor)，可選擇加入微磁珠(micro-bead)並配合乳液

聚合酶鏈鎖反應(emulsion PCR)或直接採用橋式聚合

酶鏈鎖反應(bridge PCR)，以快速增幅待測基因片段，

爾後結合微製程、光學偵測與自動控制技術以不同定

序原理的方法，迅速解讀大量的 DNA 序列[11]。但是

由於第二代定序技術的讀取長度較短，比較適合用於

對已知序列的基因組進行重新定序，因此，對全新的

基因組進行定序時，還需結合第一代的定序技術輔

助。下列即針對三種第二代主要定序技術平台分別說

明與介紹。


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圖 2 第二代 DNA 定序策略與技術概念圖資料來源：Shendure J, Ji H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol 2008;26 (10):1135–1145. 本文繪製與整理

3.1 Roche/454 定序技術

2005 年 Roche 公司與 CuraGen 公司旗下的 454 生命科

學公司(454 Life Sciences)合併，共同推出了首部商業

化營運的 DNA 定序儀器(Roche/454 Genome Sequencer 20 System)。其運作原理如下[6][11][15](圖 3)：首先

將待測 DNA 打斷成 300-800 bp 的小片段，並於兩端

接上轉接序列。接著加入表面帶有互補轉接序列的微

磁珠，此微磁珠的直徑約 28 µm，並以乳液聚合酶鏈

鎖反應進行增幅，預計每一個小片段將被增幅約 1 百

萬倍。再將此表面帶有大量 DNA 增幅產物的微磁

珠，置入底部可感光偵測的微孔盤中，每個小孔直徑

約 44 µm，僅能容納一個微磁珠。爾後，進行焦磷酸

定序法[16]，此檢測流程將依序置入帶有四個不同鹼

基的去氧核苷酸(dNTP)材料，利用聚合酶進行核苷酸

接合時，釋放出焦磷酸根離子(pyrophosphate)，藉由

ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase)轉換產生 ATP，冷光酶

(Luciferase)接收 ATP 提供的能量，氧化冷光素

(Luciferin)而產生等比例之可見光，因此可透過光感測

器測得訊號，其餘未反應的去氧核苷酸材料，再以雙

磷酸酶(apyrase)分解，故透過反覆的試劑置換與偵

測，快速讀取大量之定序結果，後輔以資訊軟體系

統，分析配對出完整之核酸序列[17][18]。

圖 3 Roche/454 定序技術與流程資料來源：Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008;9:387-402. 本文整理


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爾後，Roche 公司於 2007 年發表新型儀器(GS FLX)，加快定序的速度。2008 年更推出了新一代的

定序試劑、儀器(GS FLX Titanium)與軟體，大幅提升

序列讀取長度與單位時間定序能力，使其平均讀取長

度由早期約 100 bp 提升至 400 bp，每次反應能產生

400-600 Mb 的序列，耗時約 10 小時。此技術平台擁

有的優勢在於具有較長的讀取長度，使得後續的分

析、比對工作更快速、準確，而其主要缺點則在於無

法準確量測單一鹼基重複序列的長度[19]。

3.2 Illumina 定序技術

2007年 Illumina公司併購 Solexa公司，並整合其DNA定序平台，推出 DNA 定序儀器(Illumina Genome Ana-

lyzer)。其運作原理簡述如下[6][11][15][17][18][20](圖4)，首先，將待測 DNA 打斷成 200-500 bp 的小片段，

並於兩端接上轉接序列。將已接上轉接序列的待定序

基因小片段，置入表面帶有互補轉接序列的晶片，透

過橋式聚合酶鏈鎖反應進行增幅，接著置入依不同鹼

基而標記特定且可移除螢光分子的去氧核苷酸材料

與反應試劑，如此反覆進行螢光標記移除、試劑置換

與偵測，以快速讀取大量之定序結果，後輔以資訊

軟體系統，即可分析配對出完整之 DNA 序列。此外，

在 2009 年，該公司推出了新型的儀器(GAⅡx)與對讀

定序方法(paired-end)[21]，使得此技術平台的定序讀

取長度可達 2×76 bp，每次反應能產生 20 Gb 的定序

結果，耗時約 8 天，錯誤率僅約 1%。

圖 4 Illumina 定序技術與流程資料來源：Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008;9:387-402. 本文整理

3.3 Applied Biosystems 定序技術

2006 年 Applied Biosystems 公司併購 Agencourt Per-sonal Genomics 公司，取得使用接合酶(Ligase)定序的

技術平台，並於 2007 年推出新一代的 DNA 定序儀器

(Applied Biosystems SOLiDTM)。其運作原理簡述如下

[6][11][15][17][18][20](圖 5)，首先，將待測 DNA 打

斷成小片段，並於兩端接上轉接序列。將已接合轉接

序列的待定序基因小片段，黏合至直徑 1 µm 的微珠

表面上，透過乳液聚合酶鏈鎖反應進行增幅，並於 3’末端接上修飾微粒，接著將表面帶有大量核酸增幅產

物的微珠，置入偵測用的微孔晶片上，此時修飾微粒

與微孔晶片表面形成鍵結，使得待測核酸序列被展開。

爾後，注入接合酶定序法所需之反應試劑與特殊探

針，反覆進行試劑、探針置換與偵測，使得每個鹼基


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位置均被測定兩次，並可快速讀取大量之定序結果，

後輔以資訊軟體系統，分析配對出完整之核酸序列。

目前，此技術平台結合對讀定序方法(mate-paired)，

定序讀取長度已可達 2×50 bp，每個循環能產生 10-15 Gb 的定序結果，耗時約 6-7 天，目前其準確率可達

99.94%以上[22]。

圖 5 Applied Biosystems 定序技術與流程資料來源：Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008;9:387-402. 本文整理

第三代之 DNA 定序策略與技術

為了突破價格障礙，挑戰於 2014 年以 1 千美元的價

格，讀取一個個人的基因組序列計畫。第三代 DNA定序策略將朝向更為簡化的方式，融合奈米科技的發

展，針對單一分子進行即時定序，期望能以更低的檢

測成本，快速大量直接讀取 DNA 序列，使得將來個

人基因定序更為普及、應用更加廣泛[4][11][17](圖6)。目前有許多公司正投入研發第三代 DNA 定序技

術平台，本文僅介紹 Helicos 公司的 Heliscope 單分子

定序儀、Pacific Biosciences 公司的 SMRT 技術和

Oxford Nanolabs Ltd.公司正在研發的奈米孔單分子定

序技術。

圖 6 第三代 DNA 定序策略與技術概念圖資料來源：Shendure J, Ji H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol 2008;26 (10): 1135-1145. 本文繪製與整理


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4.1 Helicos 定序技術

Helicos 公司成立於 2003 年，目標在開發一種能針對

單一分子進行即時 DNA 定序的方法，已於 2009 年正

式銷售其商品化儀器設備。其 DNA 定序原理簡述如

下，為避免先前定序技術多需使用 PCR 增幅技術，此

技術採用雜交反應概念。隨機將待測 DNA 打斷成小

片段，於各小片段(約 200 bp)的基因序列末端加上多

個腺嘌呤去氧核苷酸(poly-A)，並於玻璃基材的檢測

晶片上，隨機固定許多胸腺嘧啶去氧核苷酸(poly-T)的寡核苷酸分子，其末端皆帶有螢光標記，以利於精

確定位。因此，首先使得小片段模板 DNA 以末段的

互補序列與檢測晶片上的寡核苷酸分子進行雜交並

精確定位，爾後逐一加入具有可移除螢光分子標記的

去氧核苷酸材料與試劑，反覆進行偵測、螢光分子移

除的步驟，即可進行大量序列即時讀取，唯各片段的

定序進度不同。後需輔以資訊軟體系統，即可分析

配對出完整之核酸序列[11][23]。此技術平台的定序讀

取長度約 30-35 bp，每個循環能產生 21-28 Gb 的定序

結果，其主要缺點類似 Roche 公司的技術平台，無法

準確量測單一鹼基重複序列的長度，目前已可透過第

二次定序的方法降低錯誤率。

4.2 Pacific Biosciences 定序技術

Pacific Biosciences 公司於 2004 年成立，亦為開發針

對單一分子進行即時 DNA 定序的方法，預計 2010 年

底推出商品化儀器設備。其 DNA 定序原理簡述如下

[24](圖 7)，該公司透過奈米製程技術，開發以玻璃為

基材且具有千餘個 ZMW (zero-mode waveguides)孔結

構的光波導式感測晶片，每個 ZMW 孔直徑僅有 10 nm，深度約 100 nm，於底部固定單一個聚合酶分子，

此外，配合使用依不同鹼基而標記特定且可移除螢光

分子(與磷酸根形成鍵結，而非鹼基)的去氧核苷酸材

料，使得模板 DNA 能持續進行聚合反應，且利用奈

米結構下之光波導光學特性，激發光源僅能穿透底部

20-30 nm 處，而達成即時偵測並延長讀取序列，且大

幅減低背景螢光訊號干擾之目的。因此，此方法不但

可同步進行大量序列讀取，其序列讀取長度的增加，

更簡化了後續資訊軟體系統的處理程序，降低配對錯

誤的發生率[25]。

圖 7 Pacific Biosciences 定序原理概念資料來源：http://www.pacificbiosciences.com/本文整理

4.3 Oxford Nanolabs 定序技術

Oxford Nanopore Technologies 公司核心技術來自於牛

津大學，於 2005 年正式獨立營運，並於 2008 年更名

為 Oxford Nanolabs Ltd.，其定序技術亦為針對單一分

子進行即時 DNA 定序的方法。目前該技術仍處於開

發階段，尚未有商品化之產品，其 DNA 定序原理簡

述如下[4][26]，此平台技術重點在於建立一個具有許

多奈米孔(Nanopore)的感測晶片，此奈米孔由經過修

飾的蛋白質與人工合成的脂質雙層組成，並於此蛋白

質上聯結核酸外切酶(exonuclease)，因此，待測的模

板 DNA 將會經過此酵素的作用，其每一個核苷酸將

依序被切下，當帶有不同鹼基的核苷酸通過此奈米孔

時，會引起不同強度的電流擾動(圖 8)，因而達成 DNA定序之目的，目前該公司宣稱此技術平台之準確度已

接近 99.8%。此技術之建立，提供了另一種直接針對

單一分子的定序方法，不再需要使用核酸增幅、化學

分子標定與精密光學量測儀器，此外，更可擴大應用

於蛋白質、聚合物或其他小分子物質的辨識。


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圖 8 Oxford Nanolabs 定序原理概念資料來源：http://www.nanoporetech.com/本文整理

結論與展望

綜觀三個世代的定序技術發展，朝向降低定序成本、

增加定序讀取長度與擴大單位時間定序數量的方向

發展(表 1)。隨著定序成本的降低與人類對基因功能

瞭解的提升，意味著基因檢測應用的可行性大幅提

高。1995 年自動定序儀的出現，檢測一個鹼基的成本

約 1 美元，後續更逐步下降到 0.1 美元，第二代高通

量定序技術平台的成本甚至更低，推測未來 5 年內，

定序成本將再下降 1 百倍。而單次定序反應能讀取之

鹼基長度越長，則更有利於後續的比對分析，大幅降

低片段接合的工作量與發生錯接的機率。此外，擴大

單位時間定序能力，亦能有效降低成本並提高效率。第二代定序技術如同第一代技術，採用合成方法

進行 DNA 定序，不需經由細菌進行質體複製，以降

低錯誤發生的機率，但仍無法避免使用 PCR 增幅反

應，而第二代定序技術成本大幅下降的主因，在於結

合微製程技術以達成高通量定序之目標，由以往多

同時進行 96 條毛細管定序反應，大幅進展至能夠同

時讀取上百萬條 DNA 的序列。此外，整合生物資訊

學的強大運算分析能力，協助完成後端基因比對工

作，適於進行基因重定序分析(Re-sequencing)、小RNA定序(microRNA)、DNA 甲基化分析(DNA methyla-tion)、核染色質免疫沉澱定序(ChIP-Seq)、末端配對

定序(Paired-ends sequencing)等研究，而受限於單一反

應定序讀取長度限制，則不利於對未知基因組進行定

序，目前多採用第一代與第二代定序法交互使用的方

式，截長補短，以快速完成準確的基因定序工作。第

三代定序技術則嘗試整合奈米科技，於不需要增幅的

情況下，針對組成 DNA 的單一分子，同步進行高通

量的直接定序，也因此更降低了錯誤率的問題。此

外，目前正在研發階段的奈米孔偵測技術，更是全新

的檢測架構，將以更低的檢測成本，達成基因直接定

序的目標，預計開發成功後，可大幅提升基因檢測的

應用潛力。


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表 1 各世代定序技術之特點與比較

第一代第二代第三代

公司 ABI Roche/454 Illumina /Solexa

ABI Helicos Pacific Biosci-

ences Oxford

Nanolabs Ltd.

技術平台 3730xl

(96 capillary)

Genome Se-quencer 20

System

Genome Ana-lyzer

SOLiD tSMS SMRT Nanopore

商品化時間 2002 2005 2006 2007 2009 預計 2010 N.A.

定序方法 Sanger

(4 color- ter-minator)

Pyrosequenc-ing

4 color - re-versible termi-

nator

Oligonucleo-tide ligation

(4 color - labeled)

Single Mole-cule Sequenc-

ing

Single Mole-cule Sequenc-

ing

Nanopore Sequencing

增幅方法 PCR Emulsion PCR Bridge PCR Emulsion PCR - - -

單一反應讀取長度

1,000 bp ~230 bp

(400+ Tita-nium)

36 bp (2x76 bp)

35 bp (2x50 bp)

30 bp 1,500 bp N.A.

單次反應產生資料量(Gbp)

1 Mb/天 0.1

(0.4~0.6)* 1.5

(20.5~25)* 3~4

(10~15)* 7.5

(21~28)* N.A. N.A.

單次反應所需時

間(長序列讀取) 2 小時

7.5 小時 (10 小時)*

3 天 (9.5 天)*

7 天 (9 天)*

14 天 (8 天)*

N.A. N.A.

儀器成本 USD550,000 USD500,000 USD430,000 USD591,000 USD1,350,000 N.A. N.A. 錯誤率 ~0.001 ~1% >1% ~0.1% <1% N.A. N.A.

錯誤類型 N.A. Inser-

tion/deletion substitution substitution deletion N.A. N.A.

N.A.未取得相關資料 *採用對讀定序(paired-end / mate-paired)方式總成本計算尚需另外考慮解碼人類基因圖譜所需 20-30 倍的覆蓋範圍 Roche 公司目前已推出 Genome Sequencer FLX Titanium 系統 Illumina 公司目前已推出 Genome AnalyzerIIx 系統 ABI 公司目前已推出 SOLiD 3 plus 系統資料來源：Holt RA, Jones SJ. The new paradigm of flow cell sequencing. Genome research 2008;18 (6):839.；Tucker T, Marra M, Friedman JM. Massively parallel sequencing: the next big thing in genetic medicine. The American Journal of Human Genetics 2009;85(2):142–154.；http://www.pacificbiosciences.com/；http://www.nanoporetech.com/ 本文繪製與整理

未來一旦人類基因體定序能夠低成本且快速的進

行，則有機會像現今健康檢查一樣普及，有助於疾病

診斷、預防和新藥研發，而疾病的治療與用藥，可依

據患者的遺傳特質、年齡與身體狀況作調整，以量身

訂作佳的治療方式，並找出有效且毒性低的藥物

治療濃度，亦可避免無效的療法造成醫療資源的浪

費，進而達成個人化醫療(Personalized Medicine)的目

標。故期待更有效率的人類基因體定序方法的開發，

因人而異的為每位病患建立適合的治療方式，相信

個人化的基因醫學時代就在不遠處。

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The Evolution and Development of DNA Sequencing Technology

Szu-Yuan Lee1 and Yi-Kuang Chuang2 1Science and Technology Policy Research and Information Center,

National Applied Research Laboratories 2Yong-Yang Biomedical Corporation

Objective: As the first working draft of human genome is released in 2000, it empowers researchers to access critical genome information and accelerate the improvement of personalized medicine. The development of DNA sequencing method continually focuses on reducing cost and high-throughput reading. The first generation DNA sequencing method is found in the early 1990s. After three dec-ades of gradual improvement, including the incorporation of chemistry, biochemistry, optics, auto-mation, micro-fabrication and nanotechnology, the second-generation (massively parallel DNA sequencing) and the third-generation (single-molecule DNA sequencing) DNA sequencing plat-forms were developed. Here, we review the principles and characters of each DNA sequencing plat-form. Finally, we briefly discuss related developments and future perspectives in this field.

Key words: DNA sequencing, Next-generation sequencing, Genome, Personalized medicine

Received: March 3, 2010 Corresponding author : Dr. Szu-Yuan Lee, Science & Technology Policy Research and Information Center, National Applied Research Laboratories, 14F, No. 106, Sec. 2, Heping E. Rd., Taipei 10636, Taiwan Tel: +886-2-2737-7643 Fax: +886-3-2737-7838 E-mail: [email protected]

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