dottorato in medicina materno-infantile, pediatria dello sviluppo e delleducazione, perinatologia...
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Dottorato inMedicina materno-infantile, pediatria dello sviluppo e dell’educazione, perinatologia
(XXI ciclo, 3° anno)
Università degli Studi di Trieste
BURLO GAROFOLOIstituto di ricovero e cura a carattere scientificoDipartimento di Scienze della Riproduzione edello Sviluppo
Dott. Vecchiet Monica
GLUTINE E CELIACHIAGLUTINE E CELIACHIA
LA MALATTIA CELIACALA MALATTIA CELIACA
autoimmunitàautoimmunitàtTgtTg
CDCD
0.5-1% della 0.5-1% della popolazionepopolazione
dietadietaglutineglutine
geneticageneticaHLA-DQ2 HLA-DQ2 HLA-DQ8HLA-DQ8
cellule Tcellule T
agenti infettiviagenti infettivi
PROTEINE DEI CEREALIPROTEINE DEI CEREALI
ALBUMINE acqua
GLOBULINE sali
PROLAMINE alcol
GLUTENINE acidi
SOLUBILITÀ
FUNZIONE
Riserva
Strutturali e metaboliche
Protettive
ANTICORPI : ANTICORPI : phage displayphage display
DNA da linfociti B intestinali
VH VH
VL VLCH1
CH2
CH3
CH2
CH3
CH1
CLCL
costruzione dell’Ab in forma di scFv
display sulla superficie del fago
selezione su Ag di interesserecupero degli Ab specificicontro l’Ag di interesse
È possibile ricreare l’intero repertorio anticorpale di un individuo mediante il trasferimento di alcuni geni del suo sistema immunitario in un batterio e la successiva espressione degli Ab in fusione con proteine fagiche
ANTIGENE - GLUTINEANTIGENE - GLUTINE
METODO di SILANO
115.5
64.2
48.8
37.1
25.919.4
82.2
Glut’Glia G
T
GlutGlut’a
lch
Glut alch
Glia FGlia’
MWKDa
(The Journal of Biological Chemistry, 1967, 242(3), 445-50)(Nahrung Food, 1999, 43(3), 175-84)
(Ferrante, Masci et al., 2006, 6(6), 1908-14)
Anticorpo - scFv 1Anticorpo - scFv 1
GlutGlut a
lch
Glia FGlia G
T
MW
64.248.8
37.1
82.2
115.5
KDa
Le condizioni denaturantiLe condizioni denaturantidell’SDS-PAGEdell’SDS-PAGE
modificano l’epitopo riconosciutomodificano l’epitopo riconosciutodal frammento anticorpaledal frammento anticorpale??
Glia FGlia G
T
L’epitopo si trovaL’epitopo si trovasu aggregati di gliadine?su aggregati di gliadine?
Anticorpo - scFv 2Anticorpo - scFv 2
GlutGlut a
lch
Glia FGlia G
T
35.2
22.4
KDa
pH 10 pH 3
MW + Glut
KDa
181.8
155.5
64.2
37.1
25.919.4
82.2
48.8
115.5
82.2
64.2 48.8 37.1
MW + Glut
pH 10 pH 3
25.9 19.4
KDa
I dimensione
II d
ime
nsi
on
e
SEQUENZIAMENTO PROTEICOSEQUENZIAMENTO PROTEICO
Centro di Spettrometria di Massa Proteomica e Biomolecolaredell’Istituto di Scienze dell’Alimentazione-CNR di Avellino
Start – End
Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss
Sequence
68 – 74 846.4600 845.4527 845.4395 0.0132
0 R.TPFPQTR.G
75 – 90 2001.8300
2000.8227
2000.8000
0.0228
0 R.GEQHSSCQTVQHQCCR.Q
91 – 100
1181.6700
1180.6627
1180.6564
0.0063
0 R.QLVQIPEaAR.C
103 – 130
3298.5600
3297.5527
3297.6378
-0.085
0
0 K.AIQSVEEAIIQQQPQQQWNEPQQEAHLK.S
134 – 159
3107.5100
3106.5027
3106.4820
0.0207
0 R.MSLQTLPSMCNIYVPVQCQQQQQLGR.Q
Start
- End
Observed
Mr(expt)
Mr(calc) Delta Miss
Sequence
2 - 10 1128.5400
1127.5327
1127.5507
-0.018
0
2 L.WLATMKTMF.I
16 - 26 1029.5800
1028.5727
1028.5866
-0.013
9
1 L.ALAASTAIAQL.E
35 - 43 1135.5200
1134.5127
1134.4989
0.0139
0 F.GQCQHHQQL.G
35 - 48 1689.7900
1688.7827
1688.7801
0.0026
1 F.GQCQHHQQLGQQQL.L
35 - 49 1802.8800
1801.8727
1801.8642
0.0085
2 F.GQCQHHQQLGQQQLL.D
121 - 129
1065.5200
1064.5127
1064.4887
0.0241
0 W.NEPQQEAHL.K
147 - 157
1355.6700
1354.6627
1354.6663
-0.003
6
0 Y.VPVQCQQQQQL.G
158 - 165
985.5200
984.5127
984.5101
0.0027
0 L.GRQQQQQL.Q
158 - 169
1483.7700
1482.7627
1482.7539
0.0088
1 L.GRQQQQQLQEQL.K
158 - 175
2188.0800
2187.0727
2187.0854
-0.012
7
2 L.GRQQQQQLQEQLKPCATF.L
166 - 175
1221.5700
1220.5627
1220.5859
-0.023
2
1 L.QEQLKPCATF.L
digestione con tripsina
digestione con chimotripsina
riduzione, alchilazione e digestione con endopeptidasi
spotspot ALTO (35.2 KDa) ALTO (35.2 KDa)
LWLATMKTMFWLATMKTMF ILALLALAASALAAS TAIAQLTAIAQLETIC SQGFGQCQHHGQCQHH QQLGQQQLLQQLGQQQLLD
51 QMKPCVAFVQ HQCSPVRTTPFTTPF PQTRGEQHSSPQTRGEQHSS CQTVQHQCCRCQTVQHQCCR QLVQIPEQARQLVQIPEQAR
101 CKAIQSVEEAAIQSVEEA IIQQQPQQQWIIQQQPQQQW NEPQQEAHLNEPQQEAHLKK SMRMSLQTLPMSLQTLP SMCNIYSMCNIYVPVQVPVQ
151 CQQQQQLGRCQQQQQLGRQQ QQQQLQEQLKQQQQLQEQLK PCATFPCATFLQHQC RPMTVPFPHT PVQKPTSCQN
201 VQSQCLAAS TDPRAIPLPS HS
aa identificati in seguito a digestione con tripsinaaa identificati in seguito a digestione con tripsina
aa identificati in seguito a digestione con chimotripsinaaa identificati in seguito a digestione con chimotripsina
aa sovrapponibili dalle due digestioniaa sovrapponibili dalle due digestioni
gi/32400760 LMW-GS del Triticum aestivum PM 25.9 KDa e P.I. 8.4
CARATTERISTICHE DI gi/32400760CARATTERISTICHE DI gi/32400760
LWLATMKTMFLWLATMKTMF ILALLALAASILALLALAAS TAIAQTAIAQLETLETIICC SQGFGQCCQHH QQLGQQQLLD
51 QMKPCCVAFVQ HQCCSPVRTTPF PQTRGEQHSS CCQTVQHQCCCCR QLVQIPEQAR
101 CCKAIQSVEEA IIQQQPQQQW NEPQQEAHLK SMRMSLQTLP SMCCNIYVPVQ
151 CCQQQQQLGRQ QQQQLQEQLK PCCATFLQHQCC RPMTVPFPHT PVQKPTSCCQN
201 VQSQCCLAAS TDPRAIPLPS HS
- propeptidepropeptide di 2525 aa, invece di 2020
- inizio della proteina con LETLET, invece di METMET
- no peptidi che attivano i linfociti T intestinali
Glia α-2 PQPQLPYPQ
Glia α-9 PFPQPQLPY
Glia α-20 FRPQQPYPQ
Glia α- QGSFQPSQQ
Glia γ2 FPQQPQQPF
Glia γ1 PQQSFPQQQ
Glia γ30 IIQPQQPAQ
Glt-156 FSQQQQSPF
Glt-17 FSQQQQQPL
Glt QGYYPTSPQ
Glu-5 QLPQQPQQF
- 14 cisteine14 cisteine invece di 88
CONCLUSIONICONCLUSIONI
In base alle informazioni ottenute dalle sequenze, In base alle informazioni ottenute dalle sequenze, si può iniziare a chiarire la tipologia delle proteinesi può iniziare a chiarire la tipologia delle proteineimplicate nella risposta immunogenica della CDimplicate nella risposta immunogenica della CD
Probabilmente dovremmo considerareProbabilmente dovremmo consideraretutto il gruppo delle prolamine tutto il gruppo delle prolamine
tra le proteine immunogene della CDtra le proteine immunogene della CDe non solo la gliadinae non solo la gliadina
Dai risultati di immunoblotting si evidenziail riconoscimento delle glutenine
LAVORO IN CORSOLAVORO IN CORSO
Clonazione della proteina gi/32400760Clonazione della proteina gi/32400760perper verificare il suo coinvolgimento nella CD