Download - 12 Gonzalo Alvarez - u. Catolica Del Noerte
Dr. Gonzalo Álvarez Vergara Laboratorio de Producción Primaria y Fitoplancton
Universidad Católica del Norte
Gira de la Inocuidad Alimentaria - INOFOOD 2010 La Serena - 8 de noviembre 2010
Sistemas de detección de biotoxinas marinas, el cambio a la aplicación de técnicas de alta
sensibilidad
Biotoxinas marinas
• Son productos naturales de origen algal que actúan como metabolitos tóxicos.
• Sintetizadas principalmente por:– Dinoflagelados
– Diatomeas
– Cianobacterias
– Bacterias.
• Pueden ser transferidas a traves de la cadena trófica.
NH
NH
N
N
NH2
H2N
CH2
H
OHOH
R3
R1
+
+
R2
R4
Pyrodinium bahamense
AlexandriumGymnodinium
catenatum
Saxitoxina y análogos (VPM)
Principales biotoxinas marinas
Acido domoico (VAM)
Pseudo-nitzschia
Interrupción de la transmisión neuromuscular → Parálisis
Despolarización neuronal y daños en tejidos del hipocampo→ Amnesia temporal
Principales biotoxinas marinas
Acido okadaico y análogos (VDM) Pectenotoxinas
Dinophysis
Actúan sobre fosfatasas PP1 yPP2A → inflamación tractointestinal → diarreas
No actúan sobre fosfatasas PP1y PP2A → no producen diarreasSon hepatotóxicas para el ratón
Principales biotoxinas marinas
Azadinium spinosum
Azaspirácidos (AZP)
Afecta interacción célula - célula delos tejidos intestinales → afectabarrera intestinal → diarreas
Lingulodinium polyedrum
Protoceratium reticulatum
Yesotoxinas
Gonyaulax spinifera
No actúan sobre fosfatasas PP1 yPP2A → no producen diarreasSon cardiotóxicas para el ratón
Alexandrium ostenfeldii - peruvianum
Kareniaselliformis
Principales biotoxinas marinas
Gymnodimina Espirólidos
Neurotoxina Daño tejidos cerebrales
Marco legislativo para el control de toxinas en la UE
Reglamento (CE) Nº 853/2004: Establece los límites regulatorios
• Toxinas PSP (saxitoxina y análogos) → 800 µg STX eq kg-1
• Toxinas ASP (ácido domoico) → 20 mg DA kg-1
• Toxinas lipofílicas:• Ácido okadaico y análogos; pectenotoxinas: 160 µg OA eq kg-1
• Azaspirácidos: 160 µg AZA eq kg -1
• Yesotoxinas: 1 mg YTX eq kg-1
Reglamento (CE) Nº 2074/2005: Establece los métodos oficiales de análisis
•Toxinas VAMHPLC-UV ó Test ELISA
•Toxinas VPM:Bioensayo ó HPLC-RP - FLD (Método Lawrence)
•Lipofílicas:Bioensayo
Últimos años se han generado discusiones, especialmente en estos
dos reglamentos
Control de toxinas – Método biológico
El bioensayo es una herramientaeficaz para la protección delconsumidor.
En UE existen conflictos éticos por la utilización de animales delaboratorio
Directiva UE 86/609/EEC (1986): Artículo 7.2: “No deberá realizarse un experimento si sedispone de otro método científicamente satisfactorio, razonable y factible para obtener elresultado perseguido, y que no implique la utilización de un animal”.
Poca especificidad debido a que no discrimina los diferentesgrupos de toxinas en una muestra. ej. toxinas lipofílicas yparalizantes.
Recomendación de EFSA para disminuir los limites regulatorios
Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food Chain on a request from the European Commission on MarineBiotoxins in Shellfish – Summary on regulated marine biotoxins. The EFSA Journal (2009) 1306: 1-23.
Dosis aguda de referencia (ARfD): cantidad de toxina por unidad de peso que puedeser ingerida en un periodo de 24 h sin producir daño al consumidor.
1. La Unión Europea exigirá la utilización de métodosquímicos para la determinación de toxinas lipofílicas →2 años.
2. EFSA sugiere la utilización de técnicas cromatográficaspara determinar toxinas paralizantes.
3. Es necesario preparar y automatizar los métodoscromatográficos para disminuir el tiempo y los costosde los análisis.
4. Se debe considerar una posible modificación a loslimites regulatorios.
¿Cuál es el nuevo escenario?
¿Cuáles son las técnicas de alta sensibilidad disponibles?
Toxinas lipofílicas:
Acido okadaico y análogos
Ensayos con fosfatasas (color y fluorimétrico)
HPLC-FLD
Acido okadaico y análogos
Azaspirácidos
Pectenotoxinas
Yesotoxinas
Iminas cíclicas
Toxinas paralizantes
HPLC-RP-FLD
LC-MS
Toxinas amnésicas
HPLC-UV
LC-MS
ELISA
→ LC-MS - multidetección
Mejores perspectivas
técnicas cromatográficas
Toxinas paralizantes (HPLC – RP – FLD)
NH
NH
N
N
NH2
H2N
CH2
H
OHOH
R3
R1
+
+
R2
R4
1. Toxinas no se retienen en fase reversa →apareador iónico
2. No tienen cromóforos3. Oxidación alcalina → productos fluorescentes
• Oxidación post-columna• Oxidación pre-columnaSaxitoxina y análogos
Post-columna:Oshima, Y., Machida, M., Sasaki, K., Tamaoki, Y., Yasumoto, T., 1984. Liquid chromatographic-fluorometric analysis of paralytic shellfish toxins. Agric. Biol. Chem. 48, 1707-1711.
Franco, J.M., Fernández-Vila, P., 1993. Separation of paralytic shelfish toxins by reversed phase highperformance liquid chromatography, with postcolumn reaction and fluorimetric detection.Chromatographia 35, 613-620
Pre-columna (técnica oficial AOAC):Lawrence, J.F., Niedzwiadek, B., Menard, C., 2004. Quantitative determination of paralytic shellfish poisoningtoxins in shellfish using prechromatographic oxidation and liquid chromatography with fluorescence detection:Interlaboratory study. Journal of AOAC International 87, 83-100.
Falta de automatización y poco especifica → no separa epímeros
Autosampler inyector
Bomba
Reactor
DetectorFluorescencia
ColumnaFase reversa
Acido- acético- nítrico
Oxidante-periodato
Toxinas paralizantes (HPLC – RP – FLD)
Fase móvilA: heptano sulfónico y acido fosfórico en aguaB: heptano sulfónico y acido fosfórico en MeCN
Toxinas paralizantes – Método post-columna
Isocrático 1 Isocrático 2 Isocrático 3
M. referencia M. referencia M. referencia
A. p
urp
ura
tus
A. p
urp
ura
tus
A. p
urp
ura
tus
Álvarez, G., Uribe, E., Vidal, A., Ávalos, P., González, F., Mariño, C., Blanco, J., 2009. Paralytic shellfish toxins in Argopecten purpuratusand Semimytilus algosus from northern Chile. Aquatic Living Resources 22:341-47.
1. Identifica todas las toxinas presentes en la muestra
2. Se necesitan 3 análisis por muestra →Isocráticos
3. Pueden ser 2 análisis con una hidrólisis previa
4. ¡¡Demasiado tiempo por análisis!!
¿Cuál es la solución?
Ostión Bahía Guanaqueros
Toxinas paralizantes – Método Rourke
Rourke, W. A., Murphy, C. J., Pitcher, G., van de Riet, J. M., Burns, B. G., Thomas K.M., et al. (2008). Rapid Postcolumn Methodologyfor Determination of Paralytic Shellfish Toxins in Shellfish Tissue. Journal AOAC, 91(3), 589–597.
1. Utilización de gradiente para la elución de las toxinas2. Disminuye el tiempo del análisis → automatización3. En validación para ser incluido como método oficial AOAC
GTX
4
GTX
1
dcG
TX3
GTX
5
GTX
3
dcG
TX2
GTX
2
ne
oST
X
dcS
TX
STX
Isocrático 1
Isocrático 2
Toxinas lipofílicas - HPLC y espectrometría de masas
Detector de masas triple cuadrupolo
Autosampler
Bomba UHPLC
Interfase HESI
Interfase HESI
Interfase HESI
Q1 Q2
Q3
Detector
1. Desolvatación de la muestra que genera iones moleculares2. Skimmer y Tube lens → permite enfocar los iones3. Primer cuadrupolo (Q1) → selecciona el ion molecular parental4. Segundo cuadrupolo (Q2) → es la celda de colisión que permite fragmentar
el ion parental, generando iones producto (hijos)5. Tercer cuadrupolo (Q3) → selecciona los iones producto (hijos)
1
2
43
5
Toxinas lipofílicas - HPLC y espectrometría de masas
RT: 0.00 - 6.50 SM: 3B
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
0
50
100
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un
da
nce
0
50
100
0
50
100
RT: 2.71
AA: 212890
RT: 2.89
AA: 20816
RT: 3.70
AA: 626763
RT: 5.11
AA: 75748956
RT: 5.52
AA: 18038281
RT: 5.55
AA: 2813287
NL: 6.90E4
TIC F: - c ESI SRM ms2
803.432
[255.149-255.151] MS
Genesis
MixDSPB2_SRM_Neg_01
NL: 6.82E3
TIC F: - c ESI SRM ms2
1141.449
[1061.499-1061.501] MS
Genesis
MixDSPB2_SRM_Neg_01
NL: 1.67E5
TIC F: + c ESI SRM ms2
842.457
[654.399-654.401] MS
Genesis
MixDSPB2_SRM_Neg_01
NL: 2.11E7
TIC F: + c ESI SRM ms2
508.329
[490.199-490.201] MS
Genesis
MixDSPB2_SRM_Neg_01
NL: 4.73E6
TIC F: + c ESI SRM ms2
692.414
[674.399-674.401] MS
Genesis
MixDSPB2_SRM_Neg_01
NL: 7.66E5
TIC F: + c ESI SRM ms2
876.458
[805.499-805.501] MS
Genesis
MixDSPB2_SRM_Neg_01
Acido okadaico: m/z 803 → 255
Toxinas lipofílicas - HPLC y espectrometría de masas (MRM)
Yesotoxina: m/z 1141 → 1061
Azaspirácido 1: m/z 842 → 654
Gymnodimina A: m/z 508 → 490
Espirólido (SPX1):m/z 692 → 674
Pectenotoxina: m/z 876 → 805
Toxinas lipofílicas - HPLC y espectrometría de masas
RT: 0.00 - 7.00 SM: 5B
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0
Time (min)
0
50
100
0
50
100
0
50
100
Re
lative
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un
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nce
0
50
100
RT: 2.79AA: 388
RT: 2.80AA: 3648
RT: 5.81AA: 25312
RT: 5.82AA: 53480
NL: 1.26E2
TIC F: - c ESI SRM ms2 875.400 [179.199-179.201] MS ICIS Macha_120509
NL: 1.10E3
TIC F: - c ESI SRM ms2 875.401 [137.199-137.201] MS ICIS Macha_120509
NL: 6.30E3
TIC F: + c ESI SRM ms2 876.458 [805.499-805.501] MS ICIS Macha_120509
NL: 1.18E4
TIC F: + c ESI SRM ms2 876.459 [823.499-823.501] MS ICIS Macha_120509
PTX2sa: 875 → 137 m/z
PTX2: 876 → 823 m/z
Machas Bahía Coquimbo
Azaspirácido - 1842 m/z
13- desmetil-C (SPX- 1) 692 m/z
Álvarez, G., Uribe, E., Ávalos, P., Mariño, C., Blanco, J., 2010. First identification of azaspiracid and spirolides in Mesodesma donacium and Mulinia edulis from northernChile. Toxicon 55:638-41.
Toxinas lipofílicas – HPLC y espectrometría de masasMachas y almejas Bahía Coquimbo
Toxinas lipofílicas – técnicas de multidetección
Mcnabb, P., Selwood, A.I., Holland, P.T., 2005. Multiresidue Method for Determination ofAlgal Toxins in Shellfish: Single-Laboratory Validation and Interlaboratory Study. Journal ofAOAC International 88, 761-772.
Stobo, L.A., Lacaze, J., Scott, A.C., Gallacher, S., Smith, E.A., Quilliam, M.A., 2005. Liquidchromatography with mass spectrometry - detection of lipophilic shellfish toxins. Journalof AOAC International 88, 1371-1382.
Fux, E., Mcmillan, D., Bire, R., Hess, P., 2007. Development of an Ultra-Performance LiquidChromatography-Mass Spectrometry Method for the Detection of Lipophilic MarineToxins. Journal of Chromatography a 1157, 273-280.
Gerssen, A., Mulder, P.P.J., McElhinney, M., Boer, J., 2009. Liquid chromatography-tandemmass spectrometry method for the detection of marine lipophilic toxins under alkalineconditions Journal of Chromatography A 9, 1421 - 1430.
Toxinas amnésicas - HPLC y espectrometría de masas
Autosampler
Detector (PDA)
Bomba HPLC
Detector de masas de trampa iónica
Válvula 10 vías
C:\Xcalibur\...\australisC41Conc10x 4/27/2006 3:37:08 PM
RT: 6.00 - 15.00
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0
Time (min)
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
uA
U11.58
14.1913.5112.49 13.0810.478.08 8.757.02 9.676.49 9.216.06 7.63
NL:
4.09E4
nm=240.0-
245.0
PDA
australisC4
1Conc10x
RT: 6.00 - 15.00 SM: 7B
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 15.0
Time (min)
0
20
40
60
80
100
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nce
11.71
11.09
9.588.70 14.9510.92 12.766.44 9.28 9.907.02 7.67 13.567.90 13.3110.338.21
NL: 3.71E7
TIC F: + c ESI Full
ms2
85.00-320.00] MS
australisC41Conc10
x
australisC41Conc10x #466 RT: 11.70 AV: 1 NL: 1.57E7
F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 85.00-320.00]
240 245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295
m/z
10
20
30
40
Rela
tive A
bundance
266.0
294.0248.1
276.1
265.3249.1 295.0267.1
242 nm
312 m/z
Álvarez, G., Uribe, E., Quijano-Scheggia, S., López-Rivera, A., Mariño, C., Blanco, J. 2009. Domoic acid production by Pseudo-nitzschia australis and Pseudo-nitzschiacalliantha isolated from North Chile. Harmful Algae 8:938-945
Toxinas amnésicas - HPLC y espectrometría de masasMétodo NRC (Quilliam et al., 1989)
Pseudo-nitzschia australis Bahía Tongoy
C:\Xcalibur\...\SP02_liquido_02 4/9/2010 3:47:58 PM
RT: 2.81 - 5.50 SM: 7B
3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4
Time (min)
0
20
40
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4.26
4.61
3.953.60 3.823.653.21 3.26 3.375.365.19 5.28
NL: 3.14E7
TIC F: + c ESI Full
ms2
[150.00-312.00] MS
SP02_liquido_02
150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310
m/z
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265.98
294.03
248.08
202.96 229.99220.06175.12 198.15 275.95267.04249.23 294.98258.79189.92178.94151.95 160.80 283.92241.91165.06 215.01 292.85 311.74
150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310
m/z
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40
60
80
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265.96
293.96248.00202.98
220.98 276.00265.18193.04 230.01175.05 295.05292.98202.02 311.18184.21 213.06 266.87238.05 249.09160.95152.04 284.14204.08164.91 247.30
Acido domoico Acido Epi-domoico
Toxinas amnésicas - HPLC y espectrometría de masas
Utilización de nuevas técnicas cromatográficas permiten disminuir los tiempos de análisis
Machas Bahía Coquimbo
Conclusiones
• La aplicación de técnicas cromatográficas para determinar toxinaslipofílicas en la UE, conllevará la aplicación de estas técnicas enpaíses no comunitarios.
• Chile deberá actualizar su sistema de control de toxinas marinaspara cumplir con los futuros cambios en la regulación.
• Chile debe considerar la sugerencia de EFSA de disminuir loslimites regulatorios. Esto incrementará los cierres cautelaresdurante la presencia de toxinas.
• La presencia de toxinas lipofílicas en el norte de Chile hacenecesario disponer de técnicas de LC-MS.
• La presencia de toxinas paralizantes en el norte de Chile hacenecesario disponer de técnicas de HPLC-FLD.
• La utilización de estas técnicas incrementaran los costos de losanálisis.
Parte de la información relacionada con los análisis de toxinasmarinas ha sido generada en el Centro de Investigacións Mariñasen el marco de un convenio de cooperación entre la Consellería delMar de la Xunta de Galicia y la Universidad Católica del Norte,Chile.