Identificación inequívoca de variedades comerciales de cítricos
Dra. Victoria Ibáñez GonzálezTécnico Producción y Desarrollo- ANECOOPE-mail: [email protected]
8 de Septiembre de 2020
Identificación inequívoca de variedades comerciales de cítricos.
1. Identificación varietal actual y futura.
2. Objetivo 1 proyecto GOCITRUS
3. Protocolo de identificación generalizado por GOCITRUS.
4. Marcadores moleculares: tipos y usos.
5. Ejemplos aplicados:
- Nules-Arrufatina-Nero.
- 3 Clones comerciales
- W.Murcott-Tango
6. Coste de obtención y uso de marcadores.
7. Validez del protocolo
8. Review: antes y después de GOCITRUS.
9. Conclusiones
Bioquímico (sustancia medible: brix, acidez)
Morfológico (forma hoja, fruto…)
Molecular (secuencia de ADN)
1. Identificación varietal
Identificación(marcadores)
MOLECULARMENTE(ADN)
Cambios en la secuencia de ADN
AMBIENTE
Actual
AMBIENTE
Corto plazo
AGRONÓMICAMENTE(DHE)
Brix, Acidez, forma hoja, fruto…
AGRONÓMICAMENTE(DHE)
Brix, Acidez, forma hoja, fruto…
CreaciónUnidad Identificación
Varietal Molecular
Sub-objetivo GOCITRUS
Determinan Si un material vegetal puede registrarse como variedad comercial
CPVO-TP/201/2 (Pomelo-pummelo)CPVO-TP/201/1 (Mandarinas)CPVO-TP/202/1 (Naranjas)CPVO-TP/203/1 (Limas-limones)
2. Objetivo 1 proyecto GOCITRUS
Objetivo 1 proyecto GOCITRUS: Generalización sistema identificación apoyado en base de datos Citruseq. R3: Secuenciación de variedades no incluidas en la base de datos Citruseq/Citrusgenn.
> 25% mandarinas comerciales españolas.
> 10% naranjas comerciales españolas.
R4 Obtención de marcadores moleculares de nuevas variedades seleccionadas
Al menos 1 marcador inequívoco de:
25% variedades de mandarinas
10% de naranjas dulces
3. Protocolo de identificación generalizado por GOCITRUS.
ENFOCADO PRINCIPALMENTE A IDENTIFICAR VARIEDADES
PROCEDENTES DE MUTACIÓN
• MANDARINASClementinas Híbridos
Satsumas
• NARANJAS
ADMIXTURE, HIBRIDOS MUTACION
Images from López-García, Antonio
2018-Genomics of the origin and evolution of citrus. Nature. 554,311-316.
• LIMONES
291 Variedades Comerciales España
https://www.mapa.gob.es/app/regVar/default.aspxhttps://cpvo.europa.eu/en/applications-and-
examinations/cpvo-varieties-database
MANDARINO52%
NARANJO24%
LIMONERO8%
POMELO3%
PUMMELO2%
PATRONES11%
> 50% son mutación !!!
4. Marcador molecular.
❑Marcador Molecular = Biomarcador Genético = Marcador Genético
FRAGMENTO DE ADN LOCALIZADO
❑ ADN
A T C G
El orden de las bases determina el mensaje.
Un cambio en una letra o un orden de palabras cambia el mensaje
4. Marcador molecular. USOS.
✓ EL ADN ES EL MISMO EN TODAS LAS CÉLULAS DE CADA SER VIVO
✓ EL ADN NO CAMBIA ENTRE TEJIDOS O EDAD. AMBIENTE
✓ Cualquier material vegetal: hoja, raíz, pulpa, zumo…
✓ Cualquier especie, variedad…
✓ Cualquier momento de desarrollo de la planta: plántula, adulto
❑Utilidad de los marcadores moleculares
Plantón Árbol Fruto Hoja
• Selección Asistida por Marcadores (SAM)• Identificación ➔ CERTIFICACIÓN VARIETAL, trazabilidad
- Distancia genética- Biomarcadores genéticos
- AFLPS, RAPDS…- SSR (microsatélites)- Variaciones estructurales- Indels- SNP
• Dos especies remotas• Híbridos inter e intraespecíficos.• Padre/Hijo
Requiere Secuenciación
POR CRUCE POR MUTACIÓN
• Espontánea• InducidaEjemplo: Clementina Fina y Clemenules
- Distancia genética- Biomarcadores genéticos
- AFLPS, RAPIDS…- SSR (microsatélites).- Variaciones estructurales- Indels- SNP
4. Marcador molecular. Tipos.
✓ VARIACIONES ESTRUCTURALES
Original T A A T T C T A C G A T G G T T T T C T T C A C C A A G
Delecion 5 pb T A A T T C T A C T T T T C T T C A C C A A G
Insercion 2 pb T A A T T C T A C G A G G T G G T T T T C T T C A C C A
Duplicacion 3 pb T A A T T C T A C G A T G G T A C G A T G G T T T T C T
✓ SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ✓ INDEL (INserción, DELeción)
Elegante
Elefante
La comida del perro se la comió el abuelo
El perro se comió la comida de la abuela
El perro se comió a la abuela
El perro se comió la comida del abuelo
4. Marcadores usados en el protocolo generalizado por GOCITRUS.
Cambia una letra Pérdida o ganancia de unas pocas letras.
Pérdida, Ganancia o reoganizaciones (Inversion, translocación) de fragmentos de cientos, miles o millones de letras.
1. Secuenciar genoma (variedad)
2. Alinear con referencia.
3. Comparar genomas
Base datos: CITRUSEQ-CITRUSGENN
ADN Fragmentos pair-end fragmentos
✓ SNPs: .vcf
✓ INDELs: .vcf
✓ VE (Dup/Del), (Trans/Inv):
Scripts; .bam, .tdf, LOH…etc
4. Selección, Interpretación y reconstrucción in
silico secuencia variedad A.
5. Verificación variantes en bancada por PCR.
Diseño oligonucleótidos. Sec Pto.
CATTCTGTAATGTTTATGTGTAGATTCTAGCTCAAAGGGTTTCGCTGTTTGATTATGAGCTTGTTGAGGGAAACCAAGGGAAGAGAAGGTTGATTGCTTTTGGAAAGTTTGCTGGTAGAGCTGCCATAATTGACTTGTTGAAAGGATTAGGCCAGCGTATTGTCACGGGATGAGTGTTTTGCGCAGCTAACCCGTGCGGCACTTAGACAACTTTGCCGAATGTTGCTAAGTAAGCCTAGAGATTCTCGGAATAGAGAAGAGAGCAATTGAGCCAAAGAAGAAACTTGTATTGCACAAAGAGAGATTACAATGCTTGTTGTAGTGTTTGTTGGATACAAATGCCTAATGCCATCCCATATTTATAGGGGAGGCTTGCCAAGCTCTAGAGATTCTAGAGAATTCTACCATGTTCCTAGAATTCTAGATATT
6. Verificación con muestras ciegas.
PERMITEN DISCRIMINAR ENTREEspecies Híbridos Mutaciones
SET DE MARCADORES MOLECULARES
4. Protocolo de identificación generalizado por GOCITRUS.
5. Ejemplo IDENTIFICACIÓNvariedades procedentes de mutación
W.Murcott
Arrufatina Nero
Clemenules
TANGO
1 Cambio estructural = 1 Marcador de Identificación
Identificación
inequívoca
Clon 1 Clon 2 Clon 3
Parental
• > 95% genomas procedentes de mutación tienen variaciones estructurales.
Cromosomas clementina
1 2 3 4 5 6 7 8 9
5. Ejemplo Arrufatina y NeroIDENTIFICACIÓN variedades procedentes de mutación
Parental(Clemenules)
Natural (Arrufatina)
Inducida (NERO)
Cromosoma 3
Cromosomas clementina
1 2 3 4 5 6 7 8 9
5. Ejemplo Arrufatina y NeroIDENTIFICACIÓN variedades procedentes de mutación
Parental(Clemenules)
Natural (Arrufatina)
Inducida (NERO)
Cromosoma 3
5. Ejemplo IDENTIFICACIÓNvariedades procedentes de mutación. CLONES VARIETALES
W.Murcott
Arrufatina Nero
Clemenules
TANGO
1 Cambio estructural = 1 Marcador de Identificación
Identificación
inequívoca
• > 95% genomas procedentes de mutación tienen variaciones estructurales.
Clon 1 Clon 2 Clon 3
Parental
Cromosoma 1 Cromosoma 6
Cromosoma 2 Cromosoma 7
Cromosoma 3 Cromosoma 8
Cromosoma 4 Cromosoma 9
Cromosoma 5
5. Ejemplo IDENTIFICACIÓNCLONES VARIETALES: CLON 1
BAJADA DE COBERTURA EN CROMOSOMA 6
• CROMOPLEXIA entre los cromosomas 2 y el cromosoma 3.
Scripts SV…
CLON 1
PARENTAL
Chr2 Chr2 Chr3
3'
5'
5'
5'
3'
G F
D H
5'
C
2'-32-2'
3'
E 3'
5540 45 50
3'
30 3520 250 5 10 15
3-2'
5'
5'
5'
5'
50 5530 35 40 450 5 10 15
3'
3'
3'
3'C D
E F
20 25
G H
2'2
3'3
CL
ON
1P
ar
en
tal
5. Ejemplo IDENTIFICACIÓNCLONES VARIETALES: CLON 1
ESTRUCTURA
UNICA
Identificación
inequívoca
Cromosoma 1 Cromosoma 6
Cromosoma 2 Cromosoma 7
Cromosoma 3 Cromosoma 8
Cromosoma 4 Cromosoma 9
Cromosoma 5
6. Ejemplo IDENTIFICACIÓNCLONES VARIETALES: CLON 2
• DELECIÓN EN CROMOSOMA 3• DELECIÓN EN CROMOSOMA 8
• Deleción Cromosoma 3 (0,6 Mb) Deleción Cromosoma 8 (3,2 Mb)
6. Ejemplo IDENTIFICACIÓNCLONES VARIETALES: CLON 2
• Translocación recíproca en los cromosomas 9• Nuevos cromosomas: de 56,2 Mb y 6,4 Mb
3'
5'
5'
5'
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 55 60
F I 3'E G 5'
50
10
E F
G I
15 20
3'
3'
0 5 25 30 35 40 45 50 55
CL
ON
2P
ar
en
tal
ESTRUCTURAS
UNICAS
Identificación
inequívoca
5'
5'
5'
5'
C D 3'
3'
200 5 10 25
C D3'
3'
15
CLON 2
Parental
5'
5'
5'
5'
0 5 10 15 20
B
30 3525
3'
3'
5540
A
45 50
A B3'
3'
Cromosoma 1 Cromosoma 6
Cromosoma 2 Cromosoma 7
Cromosoma 3 Cromosoma 8
Cromosoma 4 Cromosoma 9
Cromosoma 5No Variaciones EstructuralesDELECION o DUPLICACION
6. Ejemplo IDENTIFICACIÓNCLONES VARIETALES: CLON 3
6. Ejemplo IDENTIFICACIÓNCLONES VARIETALES: CLON 3
Scripts SV…• CROMOPLEXIA entre los cromosomas 3, 4 y 5
• Chr 3/4 de 23.7 Mb• Chr 5/3 de 51.8 Mb• Chr 5/4 de 44.4 Mb
CLON 3
PARENTAL
5'
5'
3' BBBBBBBBBBBBBBBBBBBB 3'
5540
B F
45
3'
5030
E
35
D
20
5'
250 5
A C
10 15
4/5
3/5
3/4
5'
5'
5'
3'
55
3'
45 50
E
35
F
403025
3'C D
20
A B
10 150 5
4
5
3
ESTRUCTURAS
UNICAS
Identificación
inequívoca
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
3'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
BBBBBBBBBBBBBBBBBBBB
A
DE
F
C 5'
B
3'
3'
3'
3'
555040 4525 35300 5 10 15 20
9
4'4-5
5'3-5
3'3-4
7
8'8
9'
6'
7'
6
1'1
2'2
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
3'
5'
FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF
0 30
5'
F
3'
3'
2'2
3'
D
10 15 20 25
G
45 50 55
1'1
3'
3'
35 405
E
I
3
4'4
5'5
6'6
7'7
8'8
9'-99-9'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
C
3'
3'
3'
3'
3'
A B
5'
5'
3'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
3'
3'
3'
D
3'
B
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
5'
3'
C
3'
E
1
2'-32-2'
G
3'
3'
8
9'
6'
7'
6
1'
F
3'3-2'
7
A
H
8'
15 20
9
4'4
5'5
25 350 5 10 5030 40 45 55
CLON 1 CLON 2 CLON 3
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
3'
3'
55
3'
3'
45 5030
3'
3'
35
3'
3'
40
3'
3'
3'
3'
3'
20
3'
3'
25
3'
3'
3'
0 5 10 15
7'7
8'8
9'9
4'4
5'5
6'6
1'1
2'2
3'3
VARIEDAD
6. Ejemplo IDENTIFICACIÓNCLONES VARIETALES
6. Ejemplo IDENTIFICACIÓNvariedades procedentes de mutación
W.Murcott
Arrufatina Nero
Clemenules
TANGO
1 Cambio estructural = 1 Marcador de Identificación
Identificación
inequívoca
Clon 1 Clon 2 Clon 3
Parental
• > 95% genomas procedentes de mutación tienen variaciones estructurales.
6. Ejemplo TANGOIDENTIFICACIÓN variedades procedentes de mutación
NO SE APRECIAN CAMBIOS COBERTURA➔
NO DELECIÓN NI DUPLICACIÓN GRANDES FRAGMENTOS
Cromosoma 1 Cromosoma 6
Cromosoma 2 Cromosoma 7
Cromosoma 3 Cromosoma 8
Cromosoma 4 Cromosoma 9
Cromosoma 5
6. Ejemplo TANGOIDENTIFICACIÓN variedades procedentes de mutación
Script SV…
W.M
urc
ott
Tan
go
• DELECION cromosoma 2 (6 Mb)+
• INSERCIÓN TANDEM cromosoma 2 homólogo
• INVERSION en cromosoma 4 (3.97 Mb)
W.M
urc
ott
Tan
go
Pare
nta
lIn
du
cia
5'
5'
5'
5'
D
D3'
3'
A
A
B C
B C
4530
3'
35 40
3'
2510
B C
15
D
200
A
A
5
B C
D5'
5'
5'
5'
3'
3'
3'
3'
3015 20 255 100
B A
A B
A B
A BESTRUCTURA
UNICA
Identificación
inequívoca
6. Ejemplo TANGOIDENTIFICACIÓN variedades procedentes de mutación
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
A D
3'3
8
9'9
4'4
5'5
6'6
10
7'7
A
B A
0
8'
1'1
2'2
15 20
3'
5 35
3'
25
3'
B C B C D
3'
3'
3'
3'
3'
40
3'
3'
3'
3'
45 50
3'
3'
3'
55
3'A B
30
TANGOW.MURCOTT
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
5'
8
9'9
4'4
5'5
6'6
5 10
7'7
3'3
8'
1'1
2'2
3'
A D
A B C
15 20
3'
3'
3'
3'
25
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
3'
D
400 4535
3'
5550
3'
A B3'A B
B C
30
Usos:
Identificación de variantes estructurales presentes en la variedad de mandarina TANGO
certificación.cyberagropolis.com ➔ Certificación Variedad
Protegida Tang-Gold
6. Coste de OBTENCION y USO de marcadores moleculares
2. Coste de Uso de marcadores moleculares ➔ IDENTIFICACION.
1. COSTE de obtención de marcadores moleculares.
1. Extraer ADN: 2-6h
2. Realizar PCR: 2-4h
Aproximadamente:- 5-6 meses
- 1500-2000 € reactivos + personal =10 000 €/variedad
Aproximadamente:- 1-2 días
- 50-100 €/muestra
7. Validez del protocolo
• PREVIO A GOCITRUS
• Analizado más de 50 genomas procedentes de mutación
• > 95% genomas procedentes de mutación tienen variaciones estructurales.
Tipología de variantes estructurales
> 150Número de variantes
estructurales por genoma
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4 5 6 7
Nu
me
ro
de
ge
no
ma
s
(%)
Número de variaciones estructurales por genoma
8. Antes y Después de GOCITRUS
GOCITRUS. BASE DE DATOS CITUSEQ-CITRUSGENNContiene > 350 genomas de cítricos. Ancestrales, réplicas…• 324 Registros comerciales de cítricos en España (291 variedades + 33 patrones).
• 83 secuenciadas• 24 en proceso de secuenciación
• 1/3 registro secuenciado a finales de 2020• 1 marcador inequívoco de variedades procedentes de mutación a mitad de 2021:
• 25% de variedades de mandarinas• 10% de naranjas dulces.
• Polémicas derivadas de la incertidumbre en la identificación varietal.
• Marcadores existentes ínfimamente eficientes para variedades derivadas (procedentes de mutación)
CONCLUSIONES
- El objetivo 1 del proyecto es la generalización de un protocolo de obtención de marcadores moleculares de tipo variación estructural, indel e SNP validado previamente.
- Protocolo dirigido principalmente a la identificación de variedades procedentes de mutación (> 50% variedades comerciales) dado que los anteriores marcadores empleados no resultaban eficaces en este grupo.
- Los MM pueden ser empleados en cualquier especie, en cualquier tipo de tejido y en cualquier estado de desarrollo de una planta.
- Trazabilidad (evitar errores):- Vivero: garantizar identidad del material adquirido por agricultores.- Distribuidores: garantizar identidad material comercializado. MARCA.- Consumidores: garantiza la identidad del producto adquirido.
- A finales de 2020, 1/3 de las variedades comerciales españolas estarán secuenciadas.
- A mitad de 2021 25% mandarinas y un 10% naranja dulce tendrá 1 marcador inequívoco.
¿PREGUNTAS?Identificación inequívoca de variedades
comerciales de cítricos
Dra. Victoria Ibáñez GonzálezTécnico Producción y Desarrollo- ANECOOPE-mail: [email protected]
8 de Septiembre de 2020