Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vírusok osztályozása
dr. Horváth, József
Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek dr. Horváth, József
Ez a könyv a Földművelésügyi és Vidékfejlesztési Minisztérium támogatásával, az Intézményközi
Tankönyvkiadási Szakmai Bizottsága jóváhagyásával készült. Szerzői jog © 1999 dr. Horváth József - dr. Gáborjányi Richard
Minden jog fenntartva. Bármilyen másolás, sokszorosítás, illetve adatfeldolgozó rendszerben való tárolás a kiadó előzetes írásbeli hozzájárulásához van kötve.
iii Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tartalom
1. Előszó ............................................................................................................................................. 1 2. Bevezetés a virológiába .................................................................................................................. 2
1. A vírusok jelentősége ............................................................................................................ 2 2. A vírusok morfológiája és felépítése ..................................................................................... 2 3. A vírusok replikációja ........................................................................................................... 2 4. A vírusos betegségek kialakulása és a tünetek (szimptómák) ............................................... 3 5. A vírusok átvitele, terjedése .................................................................................................. 3 6. A vírusok diagnosztikája ....................................................................................................... 4 7. A vírusok elleni védekezés .................................................................................................... 4 8. A vírusok eredete .................................................................................................................. 5
3. A vírusok osztályozása és rendszertana .......................................................................................... 6 1. .............................................................................................................................................. 8
1.1. .................................................................................................................................. 8 1.1.1. ..................................................................................................................... 8
2. A víruscsaládok és nemzetségeik általános jellemzése ......................................................... 9 3. A vírusnemzetségek általános jellemzése ........................................................................... 23 4. Új rendszertani javaslatok ................................................................................................... 35
4.1. Aktuális vírusrendszer: a növénypatogén vírusnemzetségek és típus vírusfajok fontosabb
tulajdonságai .................................................................................................................. 35 4.2. Rendszertanilag nem besorolható vírusok .............................................................. 45
4. A vírusok adatbázisa ..................................................................................................................... 46 1. Az adatbázis szerepe a vírusidentifikálásban ...................................................................... 46
1.1. Az adatbázis elvi szempontjai ................................................................................ 46 1.2. Az adatbázis gyakorlati szempontjai ...................................................................... 46 1.3. A vírusidentifikálás stratégiája ............................................................................... 47 1.4. Adatbázis-karakterek (jellemzők) ........................................................................... 47
5. A növényvírusok hivatalos elnevezése és akronímjai ................................................................... 52 6. A növényvirológiában használt fontosabb növények kódjai ........................................................ 66 7. A vírusátvitel módszerei ............................................................................................................... 68
1. Állatvektor nélküli vírusátvitel ............................................................................................ 68 1.1. Oltással történő átvitel ............................................................................................ 68 1.2. Mechanikai átvitel .................................................................................................. 69
1.2.1. ................................................................................................................... 70 1.3. Vegetatív szaporítószervekkel történő vírusátvitel ................................................. 71 1.4. Maggal és pollennel történő átvitel ......................................................................... 71 1.5. Vírusátvitel a talajban ............................................................................................. 72
1.5.1. Gyökérrel történő átvitel ............................................................................ 72 1.5.2. Alacsonyabb rendű gombákkal történő átvitel ........................................... 73
1.6. Vírusátvitel Cuscuta fajokkal ................................................................................. 73 1.7. Vízzel történő vírusátvitel ....................................................................................... 74
2. Állatvektorokkal történő vírusátvitel ................................................................................... 74 2.1. Levéltetvek ............................................................................................................. 75
2.1.1. ................................................................................................................... 75 2.2. Kabócák .................................................................................................................. 76 2.3. Nematódák (fonálférgek) ........................................................................................ 77 2.4. Atkák ...................................................................................................................... 77 2.5. Tripszek .................................................................................................................. 78 2.6. Poloskák ................................................................................................................. 79 2.7. Molytetvek (fehérlegyek, liszteskék) ...................................................................... 80 2.8. Pajzstetvek .............................................................................................................. 81 2.9. Levélbolhák ............................................................................................................ 81 2.10. Aknázólegyek ....................................................................................................... 81 2.11. Bogarak ................................................................................................................. 81 2.12. Sáskák ................................................................................................................... 81 2.13. Lepkék .................................................................................................................. 82 2.14. Ászkák .................................................................................................................. 82
A vírusok osztályozása
iv Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2.15. Fülbemászók ......................................................................................................... 82 2.16. Csigák ................................................................................................................... 82
3. A vírusátvitel módszertana .................................................................................................. 82 3.1. Vírusátvitel levéltetvekkel ...................................................................................... 82
3.1.1. ................................................................................................................... 82 3.2. Vírus-, illetve fitoplazma-átvitel kabócákkal .......................................................... 91
3.2.1. ................................................................................................................... 91 3.3. Vírusátvitel nematódákkal (fonálférgekkel) ........................................................... 92
3.3.1. ................................................................................................................... 92 3.4. Vírusátvitel talajlakó gombákkal ............................................................................ 98 3.5. Vírusátvitel Cuscuta fajokkal ................................................................................. 99
4. Rovarokkal történő vírusátvitel molekuláris aspektusai ...................................................... 99 4.1. Köpenyfehérje (CP) ................................................................................................ 99 4.2. Helper komponens (HC) ....................................................................................... 101
5. Fonálférgekkel történő vírusátvitel molekuláris aspektusai .............................................. 101 8. A biotesztek virológiai alkalmazása ........................................................................................... 104
1. A növény–vírus kapcsolat típusai ..................................................................................... 104 1.1. .............................................................................................................................. 104
1.1.1. ................................................................................................................. 104 2. A vírusfertőzés tünetei (szimptomatológia) ...................................................................... 105
2.1. .............................................................................................................................. 105 2.1.1. ................................................................................................................. 105
3. A vírusfertőzés mértékének meghatározása ...................................................................... 111 4. Fizikai tulajdonságok vizsgálati módszerei ....................................................................... 112 5. A vírusok differenciálása tesztnövényekkel ...................................................................... 113 6. A vírusok fenntartása tesztnövényeken ............................................................................. 115 7. Gazdanövénykörök ........................................................................................................... 118 8. A fás szárú növények virológiai ellenőrzése ..................................................................... 118
8.1. A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere ......................................................... 118 8.1.1. A szőlő üvegházi tesztelése ...................................................................... 119 8.1.2. A szőlő szabadföldi tesztelése .................................................................. 120
8.2. A gyümölcsfajok virológiai ellenőrzésének rendszere ......................................... 121 8.2.1. A gyümölcsfajok üvegházi, lágy szárú biológiai tesztelése ..................... 122 8.2.2. A gyümölcsfajok üvegházi, fás szárú tesztelése ....................................... 122 8.2.3. A gyümölcsfajok szabadföldi, fás szárú tesztelése ................................... 125
9. Szántóföldi növények virológiai ellenőrzése .................................................................... 126 9.1. A burgonya virológiai ellenőrzésének általános szempontjai ............................... 126
9.1.1. A burgonya vírusellenőrzésének rendszere .............................................. 127 9. Elektronmikroszkópos módszerek .............................................................................................. 128
1. Negatív festéses módszer .................................................................................................. 128 2. Immuno-elektronmikroszkópos módszer .......................................................................... 130 3. Dekorációs módszer .......................................................................................................... 131 4. Kicsapásos (precipitációs) módszer .................................................................................. 132 5. Finomszerkezeti vizsgálatok módszerei ............................................................................ 132 6. Citokémiai vizsgálatok ...................................................................................................... 134 7. Immunokémiai vizsgálatok ............................................................................................... 134
10. A vírusfertőzött növényi sejtek finomszerkezete ...................................................................... 135 1. Sejtek és sejtalkotók .......................................................................................................... 135 2. Zárványok ......................................................................................................................... 138
2.1. Kristályos citoplazmatikus zárványok .................................................................. 138 2.2. Amorf citoplazmatikus zárványok ........................................................................ 139 2.3. Hengeres citoplazmatikus, forgókerékszerű (pinwheel) zárványok ..................... 140 2.4. Kristályos sejtmagzárvány .................................................................................... 141
11. Fénymikroszkópos festéses módszerek .................................................................................... 142 1. Calcomine orange–Luxol brilliant green bl festés (o–g festés) ......................................... 143 2. Nukleoproteidek azúrkék festése ...................................................................................... 143
2.1. .............................................................................................................................. 144 2.1.1. ................................................................................................................. 144
12. A vírusok izolálása és tisztítása ................................................................................................ 145 1. A virionok tisztítása fertőzött növényekből ...................................................................... 145
A vírusok osztályozása
v Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1.1. A vírusok biológiai tisztasága ............................................................................... 145 1.2. A vírusok felszaporítása fogékony növényben ..................................................... 145 1.3. A feltárás és kivonás körülményei ........................................................................ 146 1.4. A vírusoldat szűrése .............................................................................................. 147 1.5. A vírusok elválasztása más sejtalkotórészektől .................................................... 147 1.6. A növényi fehérjék elkülönítése ........................................................................... 147 1.7. A virionok elkülönítése és a vírusoldat töményítése ............................................ 147 1.8. A tisztított vírusoldat minőségi ellenőrzése, eltartása ........................................... 148
2. A vírusfehérjék izolálása és tisztítása ................................................................................ 153 3. A vírusnukleinsavak kivonása és tisztítása ....................................................................... 154
3.1. RNS-kivonás tisztított vírusszuszpenzióból ......................................................... 154 3.1.1. ................................................................................................................. 154
3.2. Vírus-DNS kivonása ............................................................................................. 156 3.3. Kettős szálú rns-ek kivonása a fertőzött növényekből .......................................... 156
13. A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációja .............................................................. 159 1. A vírusreplikáció alapvető vizsgálati módszerei ............................................................... 159
1.1. Restrikciós enzimek és a vírusok elsődleges szerkezetvizsgálata ......................... 159 1.2. Kettős szálú nukleinsavmásolatok (cDNS) készítése egyszálú RNS-ből ............. 159 1.3. A protoplasztok virológiai alkalmazása ................................................................ 160 1.4. A sejtmentes, in vitro fehérjeszintetizáló rendszerek ............................................ 160
2. A vírusgenom szerveződésének alaptípusai ...................................................................... 160 2.1. A nukleinsavak jellemző végei ............................................................................. 161 2.2. Nyitott leolvasási szakaszok, fehérjetermékek ..................................................... 161 2.3. A vírusnukleinsav-replikáció általános menete .................................................... 161 2.4. A génkifejeződés általános módjai ....................................................................... 162
3. A génkifejeződés stratégiái a különböző vírusnemzetségekben ........................................ 163 3.1. A potyvirusok replikációja: poliprotein szintézise és transzláció utáni hasadási termékek
163 3.2. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) replikációja: osztott genom és
poliproteinek ............................................................................................................... 164 3.3. A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) replikációja: osztott genom és
szubgenomi RNS ......................................................................................................... 165 3.4. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikációja: átolvasott fehérje és
szubgenomi RNS-ek ................................................................................................... 166 3.5. A pararetrovirusok replikációja: fordított transzkripció ....................................... 167 3.6. Geminivirusok: kétirányú transzkripciós stratégia ............................................... 168 3.7. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) replikációja: negatív
és ambiszensz nukleinsavak transzlációja ................................................................... 169 3.8. A vírusok parazitái: a szatellit vírusok és a szatellit RNS-ek replikációja ............ 170 3.9. Defektív interferáló RNS-ek: a vírusreplikáció hibás termékei ............................ 171
4. A vírusok rokonsága, a vírusok törzsfejlődése .................................................................. 171 4.1. Vírus-„szupercsaládok” ........................................................................................ 171 4.2. Feltételezések a vírusok törzsfejlődéséről ............................................................ 173
14. Szerológiai vizsgálati módszerek .............................................................................................. 176 1. Immunológiai alapfogalmak ............................................................................................. 176
1.1. Az immunválasz ................................................................................................... 176 1.2. A vírus-köpenyfehérje felépítése és antigén tulajdonságai ................................... 177 1.3. Az antitest (immunoglobulin) felépítése és típusai ............................................... 177 1.4. Antigén–antitest kölcsönhatások .......................................................................... 178
2. Poliklón antitestek előállítása ............................................................................................ 178 2.1. A kísérleti állat kiválasztása ................................................................................. 179 2.2. Az immunizálás .................................................................................................... 179 2.3. Injektálási módszerek ........................................................................................... 179 2.4. Vérvétel és szérumnyerés ..................................................................................... 180 2.5. Az IgG tisztítása az antiszérumból ....................................................................... 180
3. Monoklón antitestek előállítása ......................................................................................... 180 3.1. A monoklón antitestek alkalmazásának lehetőségei ............................................. 182
4. A szerológiai reakciók alaptípusai .................................................................................... 184 4.1. Precipitáció ........................................................................................................... 184 4.2. Agglutináció ......................................................................................................... 185
A vírusok osztályozása
vi Created by XMLmind XSL-FO Converter.
4.3. Immunodiffúziós tesztek ...................................................................................... 186 4.4. Immunoelektroforézis ........................................................................................... 187 4.5. ELISA-módszerek ................................................................................................ 188 4.6. Radioimmuno-vizsgálat (RIA) ............................................................................. 192 4.7. Immunoblotting .................................................................................................... 192
5. A különböző szerológiai eljárások alkalmazása a vírusdiagnosztikában .......................... 194 15. A nukleinsavak jellemzésének módszerei ................................................................................ 195
1. Gél-elektroforézis .............................................................................................................. 195 2. Nukleinsav-hibridizáció .................................................................................................... 196
2.1. Dot-blot hibridizáció ............................................................................................. 197 2.2. Southern-hibridizáció ........................................................................................... 198 2.3. Northern-hibridizáció ........................................................................................... 199 2.4. Szendvics-hibridizáció .......................................................................................... 200 2.5. Próbakészítés ........................................................................................................ 200
3. Nukleinsav-szekvencia meghatározása ............................................................................. 202 4. Polimeráz láncreakció (pcr) .............................................................................................. 203
16. Növényi vírusbetegségek és növekedést szabályozó anyagok .................................................. 207 1. A növényi hormonok jellemzése ....................................................................................... 207
1.1. Juvenilhormonok .................................................................................................. 207 1.2. Szeneszcenciahormonok ....................................................................................... 209
2. A vírusfertőzött növények hormonváltozásai .................................................................... 210 3. A növényi hormonok meghatározása ................................................................................ 211
3.1. Az auxin (indol-3-ecetsav) meghatározása ........................................................... 213 3.2. A gibberellinek meghatározása ............................................................................. 218 3.3. A citokininek meghatározása ................................................................................ 221 3.4. Az etilén meghatározása ....................................................................................... 226 3.5. Az abszcisszinsav meghatározása ......................................................................... 228
17. Aktív oxigénformák és antioxidáns enzimrendszerek .............................................................. 232 1. Az aktív oxigénformák ...................................................................................................... 233
1.1. Szuperoxid gyök (•O2–) .......................................................................................... 233
1.2. Hidrogén-peroxid (H2O2) ...................................................................................... 234 1.3. Hidroxil gyök (•OH) .............................................................................................. 235 1.4. Egyéb aktív oxigénformák .................................................................................... 235
2. Antioxidáns folyamatok, enzimek, enzimrendszerek és nem enzimatikus antioxidánsok 236 2.1. Szuperoxid-dizmutáz (SOD) ................................................................................ 236 2.2. Aszkorbát .............................................................................................................. 236 2.3. Glutation, α-tokoferol, flavonoidok ...................................................................... 237 2.4. Kataláz .................................................................................................................. 237
3. Az aktív oxigénformák lehetséges keletkezési helye és módja ......................................... 237 4. Az aktív oxigénformák kórfolyamatban betöltött szerepe ................................................ 240
4.1. Antimikrobiális aktivitás ...................................................................................... 240 4.2. Fitoalexinek termelődése ...................................................................................... 240 4.3. Hiperszenzitív reakció .......................................................................................... 240 4.4. Szisztemikus szerzett rezisztencia ........................................................................ 240 4.5. Indukált sejtfal-megszilárdítás .............................................................................. 240
5. Mérési módszerek és értékelésük ...................................................................................... 241 5.1. KJ / keményítő módszer ....................................................................................... 242 5.2. CeCl3 módszer ...................................................................................................... 244 5.3. Ti(IV)Cl4 módszer ................................................................................................ 245 5.4. 4-nitro-tetrazóliumkék (NBT) módszer ................................................................ 246 5.5. Diaminobenzidin (DAB) módszer ........................................................................ 246 5.6. Kemilumineszcenciás módszer ............................................................................. 247 5.7. Egyéb mérési módszerek ...................................................................................... 247
18. A vírus-ellenállóságra nemesítés hagyományos módszerei ...................................................... 251 1. A rezisztenciára nemesítés fő irányai ................................................................................ 251
1.1. .............................................................................................................................. 251 1.1.1. ................................................................................................................. 251
2. A rezisztenciagének működése egyes növényfajokban ..................................................... 252 2.1. .............................................................................................................................. 257
2.1.1. ................................................................................................................. 257
A vírusok osztályozása
vii Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3. Az extrém rezisztencia kialakítása és ellenőrzési módszerei ............................................ 261 3.1. .............................................................................................................................. 262
3.1.1. ................................................................................................................. 262 19. A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei ................................................... 266
1. Szomatikus hibridizáció .................................................................................................... 266 1.1. .............................................................................................................................. 266
1.1.1. ................................................................................................................. 266 1.2. A burgonya és a Solanum brevidens szomatikus hibridjeinek sajátosságai .......... 269
2. Molekuláris genetikai módszerek ...................................................................................... 269 2.1. Védekezés növényi eredetű rezisztenciagének beépítésével ................................. 270
2.1.1. Transzpozon mutagenezisen alapuló génizolálás ..................................... 270 2.1.2. Térképezésen alapuló génizolálás ............................................................ 271
2.2. A kórokozótól származtatott rezisztencia ............................................................. 273 2.2.1. A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia ................................... 273 2.2.2. A replikáz génnel indukált rezisztencia .................................................... 277 2.2.3. A mozgásfehérjegénnel indukált rezisztencia .......................................... 277 2.2.4. A szatellit RNS (sat-RNS) által közvetített rezisztencia .......................... 278 2.2.5. A defektív interferáló (DI) RNS által közvetített rezisztencia ................. 278 2.2.6. A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia mechanizmusa ................. 278 2.2.7. Az RNS által közvetített rezisztencia mechanizmusa .............................. 279
2.3. Egyéb rezisztenciagének ....................................................................................... 280 2.3.1. ................................................................................................................. 280
3. A rezisztenciagének beépítése a növényi genomba ........................................................... 281 3.1. Az agrobaktériumos transzformálás ..................................................................... 281 3.2. DNS-bevitel polietilén-glikollal (PEG) és elektromos impulzussal ..................... 284 3.3. Génátvitel biolisztikus módszerrel ........................................................................ 284
3.3.1. ................................................................................................................. 284 20. Függelék ................................................................................................................................... 285
1. A vírusok, a vírusszerű organizmusok és a viroidok nemzetközi forgalmának (terjedésének)
ellenőrzése és megakadályozása ........................................................................................... 285 1.1. Vírusokra és vírusszerű kórokozókra vonatkozó növény-egészségügyi határozatok 285
1.1.1. ................................................................................................................. 285 1.1.2. Az Európai Közösségben (EU) elő nem forduló, és az EU-ra nézve fontos
vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok ......................................................... 286 1.1.3. Az Európai Közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos fitoplazma
kórokozók .......................................................................................................... 288 1.1.4. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése a meghatározott védett
zónákban tilos .................................................................................................... 288 1.1.5. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése valamennyi tagországban
tilos, ha azok egyes növényeken és növényi termékeken előfordulnak ............. 288 1.1.6. Az Európai közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos vírus,
vírusszerű, viroid és spiroplaza kórokozók ........................................................ 289 1.2. Egyéb határozatok ................................................................................................ 291
2. Karantén és veszélyes vírusok, vírusszerű organizmusok és viroidok Európában ............ 291 3. Az ábrák eredete ................................................................................................................ 294
Irodalom ......................................................................................................................................... 297
viii Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az ábrák listája
1. A vírusok sematikus ábrázolása. A: helikális dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); B:
izometrikus, kubikális szimmetriájú tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus); C:
bakteriofág (Echerichia coli T2-fágja) ................................................................................................. 2 2. A: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött Nicotiana tabacum cv. Samsun
mozaikos levelei; B: tünetek a karfiol mozaik vírussal (cauliflower mosaic caulimovirus) inokulált
Brassica rapa var. rapa levelén ........................................................................................................... 6 3. Növénypatogén vírusok családjainak és nemzetségeinek vázlatos ábrázolása. dsDNA = kettős szálú
dezoxiribonukleinsav, ssDNA = egyszálú dezoxiribonukleinsav, dsRNA = kettős szálú ribonukleinsav,
ssRNA = egyszálú ribonukleinsav, (–) = negatív szálú vírus, (+) = pozitív szálú vírus. Méretjelző = 100
nm [Murphy et al., 1995 után] ............................................................................................................ 7 4. A: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) elektronmikroszkópos képe (29 nm, 127
000-szeres nagyítás); B: az uborka mozaik vírus szisztemikus tünete Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc
növényen; C: Cucumis sativus növény levelén ................................................................................ 11 5. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) partikulumainak
elektronmikroszkópos képe [D. Peters szívessége folytán] .............................................................. 12 6. A répa sárgaság vírus [beet yellows closterovirus (1250 nm × 10 nm)]flexibilis partikulumai [J. Brandes
szívessége folytán] ............................................................................................................................ 14 7. A: a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) elektronmikroszkópos képe (730 nm x 11 nm); B: a rizs
törpülés vírus (rice dwarf phytoreovirus) kabócavektora (Nephotettix cincticeps); C: a rizs törpülés vírus
tünete rizsnövény levelén [F. Nakasuyi szívessége folytán] ............................................................. 17 8. A: Pittosporum érsárgulás vírussal (Pittosporum vein yellowing nucleorhabdovirus) természetes úton
fertőződött Pittosporum tobira növény levele; B: egészséges növény .............................................. 19 9. A csorbóka sárgaerűség vírus (sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus) lövedékszerű partikulumai
(230 nm × 100 nm) [D. Peters szívessége folytán] ........................................................................... 20 10. A paszternák sárga foltosság vírus (parsnip yellow fleck sequivirus) izometrikus partikulumai (31 nm)
[A.F. Murant szívessége folytán] ...................................................................................................... 21 11. A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) helyi (lokális) nekrózisokat idéz elő a
növényeken; A: Nicotiana glutinosa; B: Datura innoxia; C: Solanum ochroleucum; D: Ocimum
gratissimum ...................................................................................................................................... 23 12. A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) virionjai (A) és szisztemikus tünetei
Brassica rapa var. rapa (B), valamint Crambe strigosa (C) növényeken .......................................... 24 13. Carlavirusok virionjai. A: burgonya M-vírus (potato M carlavirus, 650 nm × 12 nm); B: burgonya S-
vírus (potato S carlavirus, 650 nm × 12 nm); C: vöröshere érmozaik vírus (red clover vein mosaic
carlavirus, 600-700 nm × 12 nm) [B és C: J. Brandes szívessége folytán] ....................................... 25 14. A: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) virionjai (515 nm × 13 nm) [J. Brandes szívessége
folytán]; B: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) lokális léziókat mutató gazdanövényének
(Gomphrena globosa) levele ............................................................................................................. 29 15. A, B, C: a Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus, 26-28 nm) részecskéinek
elektronmikroszkópos képe. A: 1%-os formalinnal fixált, urániummal árnyékolt víruspreparátum; B: a
vírusrészecskék hexagonális elrendeződése ún. negatív festéses („negativ staining”) módszerrel végzett
vizsgálat alapján; C: a formalinnal és a negatív festéses módszerrel fixált virionok; D: a csomós ebír
foltosság vírus (cocksfoot mottle sobemovirus) szférikus részecskéi (30 nm) [A-C: C.I. Kado, D: A.J.
Gibbs szívessége folytán] ................................................................................................................. 31 16. A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) pálcika alakú virionjai (300 nm × 18 nm); B:
dohány mozaik vírussal inokulált Nicotiana tabacum cv. Samsun növény mozaikos és deformált levelei
32 17. A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) hosszú (A) (180–215 nm) és rövid (B) (46–115 nm)
partikulumai [B.D. Harrison szívessége folytán];C: Solanum capsicastrum a vírus nekrotikus tünetekkel
reagáló diagnosztikai növénye .......................................................................................................... 32 18. A: Brassica chinensis a tarlórépa mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) propagatív
gazdanövénye [D. Mamula szívessége folytán];B: burgonya andeszi látens vírus (potato Andean latent
tymovirus) szférikus partikulumai (30 nm) [A.J. Gibbs szívessége folytán] .................................... 33 19. A burgonya T-vírus (potato T vitivirus) flexibilis virionjai (637 nm × 12 nm) [L.F. Salazar szívessége
folytán] ............................................................................................................................................. 35 20. A víruskapcsolatok és specifitások identifikálásának stratégiai diagramja. GVL = gazda–vírus lista,
VCsA = víruscsoport-adatok, VA = vírusadatok [Brunt et al., 1990 után] ....................................... 47
A vírusok osztályozása
ix Created by XMLmind XSL-FO Converter.
21. A virológiában alkalmazott fontosabb oltási módszerek. A: zöldoltás hasítékba; B: párosítás; C: héj alá
oltás; D: érintkezéses oltás; E: palackoltás; F: hagymaoltás; G: szemzés; H: szemlapozás (chipszemzés); I:
gumóba oltás; J: heteroplasztikus oltás (zöld hajtás fás részbe oltása); K: levéloltás kétszikűek esetében; L:
levéloltás az egyszikű Liliaceae családba tartozó növényeknél [Schmelzer, 1980 után] .................. 68 22. A: dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Samsun és B: N.
tabacum cv. Érdi dohánynövények levelein [Horváth József szívessége folytán] ............................ 69 23. A vírusok mechanikai átviteléhez használatos eszközök. A: orsóprés [J.A. de Bokx szívessége
folytán]; B: 1 = gömblombik; 2 = dörzsmozsarak; 3 = üvegspatulák; 4 = desztillált víz; 5 = műanyag jelfa;
6 = pufferoldat; 7 = mérőhenger; 8 = karborundumszóró [Horváth József szívessége folytán] ....... 70 24. A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei a fertőzött paradicsommaggal történő
átvitel után Lycopersicon esculentum növények levelein; B: bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic
potyvirus) tünetei Phaseolus vulgaris cv. Red Kidney növényen [Horváth József szívessége folytán] 71 25. Az Olpidium brassicae gombavektor zoosporangiumai. A: saláta törzs (lettuce strain) vektora; B:
káposzta törzs (cabbage strain) nem vektor; C: az Olpidium spp. zoospórái [Teakle, 1967 után] ... 73 26. A: az uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic tobamovirus) tünetei
Cucumis sativus cv. Delicatess uborkanövényen; B: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic
cucumovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc dohányon [Horváth József szívessége folytán]
74 27. Levéltetűvel történő árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus) átvitel sematikus
ábrázolása. A nyilak a cirkulatív vírusátvitel útját jelzik. JNyM: járulékos nyálmirigy, EnyM: elsődleges
nyálmirigy, KB: középbél, UB: utóbél [A. Miller szívessége folytán] ............................................. 75 28. Az őszirózsa sárgaság fitoplazma (aster yellows phytoplasma) kabócavektorai A-B: Macrosteles
fascifrons; C-D: Elymana virescens. Balról hátoldali, jobbról hasi helyzetben lévő nőnemű egyedek [L.N.
Chiykowski szívessége folytán] ....................................................................................................... 77 29. A: kifejlett Aceria tulipae atkavektor sematikus rajza az emésztőcsatornával és a petefészekkel. Fg =
előbél, Mg = középbél, Hg = utóbél, Ct = fejtor, Fl = mellső lábak, Hl = hátsó lábak, Go = ivarszerv
nyílása, E = tojás, Oc = érett petesejt, Hs = utóbél végbélszerű zsákja, As = anális tapadókorong [Paliwal
és Slykhuis, 1967 után]; B: búza csíkos mozaik vírussal (wheat streak mosaic tritimovirus) fertőződött
búza levelei a fertőzöttség súlyossága sorrendjében (alulról felfelé) [J.T. Slykhuis szívessége folytán]
78 30. Thrips tabaci, a tospovirusok vektora [K.M. Smith szívessége folytán] ..................................... 79 31. Piesma quadratum a répa levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ? rhabdovirus) levélpoloska-vektora
[G. Proeseler szívessége folytán] ...................................................................................................... 79 32. A crinivirusok átvitelében szerepet játszó molytetvek (Trialeurodes vaporariorum) populációja
dohánylevélen [Szalay-Marzsó László szívessége folytán] .............................................................. 80 33. Retek mozaik vírussal (radish mosaic comovirus) fertőzött Brassica campestris növény levele
[Horváth József szívessége folytán] ................................................................................................. 81 34. A–C: szövethálóval és üvegajtóval ellátott inszektáriumok; D–F: miniatűr levéltetű-inszektáriumok,
amelyeket csíptetővel lehet a növények levelére, egy meghatározott helyre elhelyezni [Horváth József
szívessége folytán] ............................................................................................................................ 83 35. A membránhártyák elkészítésének folyamata. 1. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 2. a gyűrűre ráfeszítjük
az első parafilmet (P1); 3–4. a kifeszített hártyára rácseppentjük a táplálékot; 5. kifeszítjük a második
parafilmet (P2); 6. a P2 parafilmet ráhelyezzük az első parafilm tetejére; 7–8. a két filmet összeszorítjuk és
széleiket feltekerjük; 9. az elkészült membránhártya [Kunkel, 1977 után] ...................................... 86 36. A gyűrűk összeállításának módozatai (a 35. ábra folytatása). 9. az elkészült membránhártya; 10. a
gyűrű oldalról, ill. felülről; 11. gyűrű a hártyával. Az egyszerű gyűrűk (12–13.) és a választásos kamrák
(15–16.) alja nejlon fátyolszövet, amelyet mikroszkóp tárgylemezéhez erősített parafadugóhoz ragasztunk.
A választásos kamra keresztirányú darabja (14.) üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva
[Kunkel, 1977 után] .......................................................................................................................... 86 37. A kifejlett kabócák gyűjtésére alkalmas szívókészülék [Washio et al., 1968 után módosítva Noordam
(1973) után] ...................................................................................................................................... 92 38. A Trichodorus fajok izolálásához szükséges, ún. Baerman-féle tölcsér [Noordam, 1973 után] . 94 39. A Trichodorus fajok izolálásának következő lépése [Noordam, 1973 után] .............................. 94 40. A: szűrő (0,05 mm) a Petri-csészében az állványon; B: doboz a bevésett négyzetráccsal: 1. fogantyú,
2. emelt szegély; C: disznószőr vékony fadarabra ragasztva [Noordam, 1973 után] ........................ 95 41. Talajból izolálható nematódafajok. 1. Tylenchorhynchus dubius. 2. Rhabditid. 3.*Longidorus
elongatus. 4. Dorilaimid. 5. Rotylenchus uniformis. 6.*Xiphinema diversicaudatum. 7. Tylolaimophorus.
8. Diphtherophora. 9. Trichodorus. A *-gal jelölt fajok vírusátvitelre alkalmasak [J. Seinhorst rajza alapján
Noordam, 1973 után] ........................................................................................................................ 95
A vírusok osztályozása
x Created by XMLmind XSL-FO Converter.
42. A vírus megőrzésének speciális helyei a vektor fonálférgekben. A vírus kapcsolatban van a
tápcsatorna falával a jelzett területeken [Taylor és Robertson, 1975 után] ...................................... 96 43. Javított standard módszerrel végzett vírusátvitel fonálférgekkel[R. Fritzsche szívessége folytán] 97 44. A burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top pomovirus) lokális tünetei Chenopodium
amaranticolor diagnosztikai tesztnövényen, 27 nappal az inokulálás után [Horváth József szívessége
folytán] ............................................................................................................................................. 98 45. A: Vicia faba hiperszenzitív reakciója a bab sárga mozaik vírussal (bean yellow mosaic potyvirus) és
B: Melandrium sárgafoltosság vírussal (Melandrium yellow fleck bromovirus) szemben [Horváth József
szívessége folytán] .......................................................................................................................... 104 46. Lokális szimptómák Datura stramonium (A) és D. gigantea (B) inokulált levelein. A: klorotikus léziók
belladonna foltosság vírussal (belladonna mottle tymovirus) fertőzött növény levelén; B: nekrotikus léziók
dohány gyűrűsfoltosság vírussal (tobacco ringspot nepovirus) inokulált növény levelén [Horváth József
szívessége folytán] .......................................................................................................................... 106 47. Szisztemikus szimptómák. A: lucerna mozaik vírussal (alfalfa mosaic alfamovirus) inokulált Solanum
marginatum mozaikos levele; B: paradicsom magtalanság vírussal (tomato aspermy cucumovirus)
inokulált Nicotiana glutinosa deformált levele; C: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) inokulált
burgonya (Solanum tuberosum) levele; D: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött
Petunia atkinsiana páfránylevelűsége [Horváth József szívessége folytán] .................................... 108 48. A: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Nicotiana tabacum szárnekrózisa; B: nekrotikus
léziók a burgonya Y-vírus NTN-törzsével fertőzött burgonya (Solanum tuberosum) bogyóin; C:
nekrotikus léziók a burgonya Y-vírus NTN törzsével fertőződött burgonyagumókon; D: tarlórépa mozaik
vírussal (turnip mosaic potyvirus) fertőződött Matthiola incana virágának színtörése (flower breaking) [A
és D: Horváth József szívessége folytán; B és C: Pintér Csaba szívessége folytán] ....................... 108 49. A: dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) által előidézett tünetek Libertas burgonyafajta
gumószöveteiben; B: répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein benyvirus) által
előidézett gyökérproliferáció (szakállasodás) cukorrépán [Horváth József szívessége folytán] .... 109 50. A: Chenopodium amaranticolor a polifág uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és B:
burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) virofil gazdája [Horváth József szívessége folytán] ......... 114 51. A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere [Lázár János szívessége folytán] ........................ 119 52. Különböző morfológiájú növénypatogén vírusok. A: pálcika alakú dohány mozaik vírus (tobacco
mosaic tobamovirus); B: fonál alakú saláta mozaik vírus (lettuce mosaic potyvirus); C: szférikus
belladonna foltosság vírus (belladonna mottle tymovirus) [Horváth József szívessége folytán] .... 128 53. BSMV: árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) és LRSV: Lychnis
gyűrűsfoltosság vírus (Lychnis ringspot hordeivirus) részecske-hosszúság eloszlása. A sötét oszlopok a
mért virionok eloszlását mutatják, míg a vonaldiagram a három csoport folyamatos összegezésével kapott
eredményt ábrázolja. ⇓ : normál hosszúság; ↓: látszólagos hosszúság [Gibbs et al., 1963 után] .... 130 54. Vírusfelhalmozódás a kloroplasztiszban. Két vírushalmaz dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic
tobamovirus) fertőzött dohány (Nicotiana tabacum) mezofillum sejtjének kloroplasztiszában. Az alsó
szétnyomja a gránumokat, a felső halmaz kidomborítja a kloroplasztiszt határoló kettős membránt. GR =
gránum, V = vírushalmaz, VA = központi sejtüreg, W = sejtfal. 30 000-szeres nagyítás [Esau, 1968 után]
135 55. A: tarlórépa sárga mozaik vírussal (turnip yellow mosaic tymovirus) fertőzött kínai kel (Brassica
pekinensis) levél mezofillumsejtjének kloroplasztiszai. Jellegzetes széli vezikulumok (V) a
kloroplasztiszban, és virionok felhalmozódása a két kloroplasztisz közötti citoplazmában. B: széli
vezikulumok kinagyított képe. Nyilak jelzik a kettős membránnal borított hólyagocskák nyaki részét,
amely a citoplazmába nyílik. Az alsó vonalak mérete = 100 nm [Francki et al., 1985 után] ......... 136 56. A kloroplasztiszok kóros eltérései paradicsom bronzfoltosság vírussal (tomato spotted wilt tospovirus)
fertőzött Nicotiana benthamiana növények levelének mezofillumsejtjeiben A: a megnagyobbodott
keményítőszemcsék (nyíllal jelölve) szétnyomják a tilakoidmembránokat; B: a kloroplasztiszok alakja
megváltozott, a belső membránrendszer fellazult. A tilakoidok (T), a plasztoglobulusok (P) és a
kloroplasztiszban található vezikulumok nyíllal jelölve; C: az erősen duzzadt kloroplasztiszban
plasztoglobulusok halmozódtak fel (nyíl jelzi); D: a fertőzés utolsó szakaszában a külső burokkal
rendelkező virionok az egész citoplazmában megtalálhatók, de sohasem fordulnak elő a
kloroplasztiszokon belül. A nyíllal jelzett virionok hármas-négyes csoportokban, vagy többesével láthatók
egy közös membránban .................................................................................................................. 137 57. Kristályos citoplazmatikus zárvány, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött
dohány (Nicotiana tabacum) parenhimasejtjében. A pálcika alakú virionok egymással párhuzamosan,
sorokba rendeződve, számos réteget képeznek. 26 000-szeres nagyítás. CH = kloroplasztisz, VA =
központi vakuólum, W = sejtfal [Esau, 1968 után] ........................................................................ 139
A vírusok osztályozása
xi Created by XMLmind XSL-FO Converter.
58. Amorf citoplazmatikus zárvány (X-test) dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus)
fertőzött Nicotiana tabacum levelének parenhimasejtjében. A tubulusok (csövecskék) kis csoportokban, a
nyalábok egymással szöget bezárva rendeződtek. RB = riboszómák, ER = endoplazmatikus retikulum, VA
= üregek, V = virionok [Esau, 1968 után] ...................................................................................... 140 59. Potyvirusokra jellemző forgókerékszerű (pinwheel) zárványok (A, B, C). C: Malva érkivilágosodás
vírus (Malva vein clearing potyvirus) forgókerékszerű zárványai. 80 000-szeres nagyítás. La = lemezes
aggregátumok, P = plasztid (kloroplasztisz), M = mitokondrium, Pw = forgókerékszerű (pinwheel)
zárvány [Horváth József szívessége folytán] .................................................................................. 140 60. Sejtmagzárványok dohány karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) fertőzött dohánylevél
(Nicotiana tabacum) sejtjeiben. A: a metszés síkja merőleges a zárvány síkjára; B: a metszet egy
bipiramidális zárvány lemezének síkjában készült. Az ábrák bal alsó sarkában a vonal 500 nm-nek felel
meg. Nu = nucleolus (sejtmagvacska) [Francki et al., 1985 után] .................................................. 141 61. A: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) fénymikroszkópos zárványai; B: retek
mozaik vírus (radish mosaic comovirus) zárványai. 800-szoros nagyítás; C: karfiol mozaik vírus
(cauliflower mosaic caulimovirus) zárványai. 450-szeres nagyítás; IB = zárványtestek (inclusions), N =
sejtmag, P = plasztid, CN = kristályos, tűszerű zárványok, V = vakuolum [Horváth József szívessége
folytán] ........................................................................................................................................... 142 62. A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) lokális tünetei Nicotiana knightiana (A) és
Solanum capsicastrum (B) növények levelein [Horváth József szívessége folytán] ...................... 146 63. A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a belőle izolált fehérje és nukleinsav abszorpciós
spektruma [Francki és McLean, 1968 után] ................................................................................... 149 64. A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) szisztemikus tünetei néhány gazdanövényen. A:
Ocimum viridae; B: Solanum marginatum; C: Viburnum opulus [Horváth József szívessége folytán] 154 65. Dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) tünetei. A: lokális tünetek Datura gigantea
növény levelén; B: szisztemikus szimptómák Tropaeolum peregrinum növény levelén [Horváth József
szívessége folytán] .......................................................................................................................... 155 66. Dohány-mezofillumból izolált protoplasztok ........................................................................... 160 67. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikáció szakaszai a növényi sejtben. A:
fertőzés, B: az RNS kiszabadulása, C: kötődés a riboszómákhoz, D: vírusreplikáz (vagy egy része), E: a
replikatív forma keletkezése, F: replikatív intermedierek keletkezése, G: replikatív komplex, H:
összeépülés, I: kész virionok, RF: replikatív forma, RI: replikatív intermedier, sRNS: kis (szubgenomi)
RNS [Érsek és Gáborjányi, 1998 után] ........................................................................................... 162 68. A potyvirusok [szilva himlő vírus (plum pox potyvirus)] géntérképe. P1(Pro) = P1 fehérje
proteázaktivitással, HC-Pro = segítő (helper) komponens, P3 = P3 fehérje, 6K1 = 6K1 fehérje, CI (Hel) =
citoplazmikus zárványfehérje helikázaktivitással, 6K2 = 6K2 fehérje, NIa = sejtmagfehérje, NIb (Rep) =
sejtmagfehérje replikázaktivitással, CP = köpenyfehérje, poli (A) = poliadenilsav. Magyarázat a
szövegben [Riechmann et al., 1991 után] ....................................................................................... 163 69. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) géntérképe és a transzláció utáni hasadás
termékei: poli(A) = poliadenilsav farok, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton.
Magyarázat a szövegben [Matthews, 1991 után] ............................................................................ 164 70. A rozsnok mozaik vírus génszerveződése. cap = sapka, tRNS = transzfer RNS-szerű vég, ORF = nyílt
leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton [Matthews, 1991 után] ................................... 165 74. A geminivirusok génszerveződése és lehetséges géntermékei. Magyarázat a szövegben [Mullineaux et
al., 1984 után] ................................................................................................................................. 168 75. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) osztott genomja és
génkifejeződése. mRNS = messenger RNS, vRNS = vírus-RNS, p = fehérje (protein), kD = kilodalton.
Magyarázat a szövegben [German et al., 1992 után] ...................................................................... 169 76. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) és a poliovirusok fehérjegénjeinek hasonló
elrendeződése és konzervált szekvenciái. CPMV = tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus).
VP = vírusprotein, VPg = vírusgenomhoz kötött fehérje. A pontozott részek a homológ szekvenciákat
jelölik [Matthews, 1985 után] ......................................................................................................... 171 77. A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), a rozsnok mozaik vírus (brome mosaic
bromovirus) és a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) genomszerveződésének hasonlósága
a szekvenciában homológ szakaszokkal. AMV = lucerna mozaik vírus, BMV = rozsnok mozaik vírus,
TMV = dohány mozaik vírus, CP = köpenyfehérje. A vonalazott részek a megfelelő konzervált szakaszok
[Matthews, 1985 után] .................................................................................................................... 172 78. Az antigén, az antigént megjelenítő sejt, a T és a B nyiroksejtek közötti kölcsönhatás [Hampton et al.,
1990 után] ....................................................................................................................................... 176 79. Az immunoglobulin- (IgG) molekulák felépítése és típusai enzimes hasítás után [Hampton et al., 1990
után] ................................................................................................................................................ 178
A vírusok osztályozása
xii Created by XMLmind XSL-FO Converter.
80. A monoklón antitest előállításának folyamatábrája; A: az egér immunizálása, B: a myeloma- és a
légsejtek fúzióra történő előkészítése;C: sejtfúzió; D: a sejthibridek szelekciója, szaporítása,
krioprezerválása és klónozása; E: a hibridómák szkrínelése; F: monoklón antitest termeltetése és tisztítása
[Hampton et al., 1990 után] ............................................................................................................ 181 81. A kettős géldiffúzió precipitációs íveinek értelmezése. Magyarázat a szövegben [Hampton et al., 1990
után] ................................................................................................................................................ 186 82. A különböző ELISA-eljárások sematikus ábrázolása. A: Y = IgG, • = vírus, YE = IgG-enzim
konjugátum; B: V = F (ab‟)2, • = vírus, Y = IgG, EA = Protein A-enzim konjugátum; C: Y = IgG, • = vírus,
Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum; D: A = Protein A, Y = IgG, • = vírus, EA = Protein A-enzim
konjugátum; E: • = vírus, YE = IgG-enzim konjugátum; F: • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim
konjugátum [Hampton et al., 1990 után] ........................................................................................ 188 83. A gél-elektroforézis vázlata [Brown, 1990 után] ...................................................................... 196 84. A Southern-hibridizáció vázlata [Sain és Erdei, 1985 után] ..................................................... 198 85. A blottolás [Sambrook et al., 1989 után] .................................................................................. 199 86. A szendvics-hibridizáció vázlata [Molnár János szívessége folytán] ....................................... 200 87. A cDNS-készítés folyamata [Brown, 1990 után] ...................................................................... 200 88. Próbakészítés nick-transzlációval. ↓: Eredeti nick pozíció, ⇓ : Végső nick pozíció, →→→→ : Jelölt
szál [Brown, 1990 után] .................................................................................................................. 201 89. A biotinálás vázlata [Molnár, 1991 után] ................................................................................. 202 90. A polimeráz láncreakció. A és B: az eredeti DNS-szálak, A‟ és B‟: a két oligonukleotid primer. A
szaggatott vonal az in vitro szintetizált DNS-t jelöli [McInnes és Symons, 1991 után] ................. 203 91. Az RNS-vírusok detektálása RT-PCR reakcióval. Elsőszál komplementer DNS (cDNS) készítése
reverz transzkripcióval (RT) RNS templátról, majd a cDNS felszaporítása polimeráz láncreakcióval (PCR)
[McInnes és Symons, 1991 után] .................................................................................................... 205 92. Az indol-3-ecetsav szerkezeti képlete ....................................................................................... 207 93. A G3 gibberellinsav szerkezeti képlete ..................................................................................... 208 94. A: a citokininbázisok, B: nukleozidok és C: nukleotidok általános szerkezeti képlete ............ 208 95. Az etilén szerkezeti képlete ...................................................................................................... 209 96. Az abszcisszinsav szerkezeti képlete ........................................................................................ 210 97. A zeatin (Z) elektronütköztetéses tömegspektruma (a spektrumban csak a legjellegzetesebb
fragmentumok szerepelnek). Bi+ = bázision; Mi+ = molekulaion; R.I. = relatív intenzitás; m/z =
tömeg/töltés arány ........................................................................................................................... 223 98. A növényeket befolyásoló hét „stresszhatás” [Schlee, 1992 után] ........................................... 232 99. Az aktív oxigénformák szerepe a növényben lejátszódó folyamatok aktiválásában. RP =
receptormolekulák, G = G-protein, SA = szalicilsav, SA• = szalicilát gyök, BA2H = benzoesav-2-
hidroxiláz, + = pozitív hatás, – = negatív hatás [Hammond-Kosack és Jones, 1996 után módosítva] 237 100. Az aktív oxigénformák kétfázisú termelődése kórokozó–növény kapcsolatban [Baker és Orlandi,
1995 után] ....................................................................................................................................... 238 101. Az AOF termelődése (A, B) és sejthalál (C, D) a P.s. tabaci (Pseudomonas syringae pv. tabaci) és
P.s. gly. (Pseudomonas syringae pv. glycinea) 4-es és 6-os rasszával fertőzött dohány- és szója-
sejtkultúrákban. Inkompatibilis (teli szimbólumok) és kompatibilis (üres szimbólumok) gazda–parazita
kapcsolatok [Baker és Orlandi, 1995 után] ..................................................................................... 239 102. A H2O2 kimutatása agarlemezes módszerrel. A: gyökereken a baloldali növény a kontroll, B és C:
burgonya-levélkorongokon felül a kontroll látható mindkét esetben [Wu et al., 1995 után] .......... 242 103. H2O2 szöveti meghatározása csíranövényből szövetlenyomatok készítésével [Schopfer, 1994 után]
244 104. Nekrotikus léziók körül keletkező szuperoxid és a NBT reakciója során keletkező formazán
elszíneződése, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) inokulált Nicotiana tabacum cv.
Samsun NN dohány levélkorongjain [Doke és Ohashi, 1988 után] ................................................ 246 105. Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (A), Nicotiana suaveolens (balról fertőzött, jobbról egészséges,
kontroll növény) (B) és Datura stramonium (C) hiperszenzitív rezisztenciája a dohány mozaik vírussal
(tobacco mosaic tobamovirus) szemben. Burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Capsicum
annuum cv. Bogyiszlói szisztemikus tünetei (D) ............................................................................ 252 106. A: a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni hiperszenzitív reakció (az inokulált
leveleken kialakuló nekrotikus léziók) Solanum tuberosum növényen. B: Solanum venturi (BGRC 8237)
vad faj reakciója (szisztemikus mozaik) a burgonya X-vírussal (potato X potexvirus) szemben ... 259 107. A transzpozon nyomon követés lépései. Az első lépésben a domináns rezisztenciagént (R gén)
homozigóta formában tartalmazó, nem-autonóm transzpozont hordozó növényt olyan növénnyel
keresztezik, amely a transzpozon autonóm párját tartalmazza. A nem-autonóm elem az „A” marker gént
hordozza annak érdekében, hogy biztosítsák jelenlétét a növényekben. Az F1 hibridben a nem-autonóm
A vírusok osztályozása
xiii Created by XMLmind XSL-FO Converter.
elem transzlokációját a „B” marker gén meginduló expressziója jelzi. Ezután további keresztezésekkel
eliminálják a riporter gént és az autonóm elemet tartalmazó kromoszómarészt, illetve szelektálják a
mutáns, vírusfogékony növényeket. P = promóter régió ................................................................ 270 108. Rezisztenciagén-izolálás molekuláris térképezés segítségével. A: majdnem izogén vonalak analízise
(Nearly Isogenic Lines – NIL). A domináns rezisztenciagént hordozó, vírusellenálló növényt (P1)
keresztezik a fogékony fenotípusú fajtával (P2). A heterozigóta F1 hibridet a fogékony (P2) szülővel
visszakeresztezik. Az utódnövények közül kiválogatják a rezisztens fenotípusúakat (heterozigóták), majd
azokat újból a homozigóta recesszív (P2) szülővel keresztezik. Ezt a visszakeresztezést több generáción
keresztül ismétlik, és mindig a domináns, vírusellenálló fenotípusra szelektálnak. A kromoszómapárok
rekombinációja („crossing over”) következtében a hetedik nemzedékben szinte a teljes genom – a
rezisztenciagént tartalmazó szűk régió kivételével – a fogékony szülőtől (P2) származik. Ezek tehát
majdnem tökéletesen izogén vonalak. B: hasadópopuláció-analízis (Bulked Segregant Analyzis – BSA). A
domináns (rezisztens), illetve recesszív (fogékony) homozigóta szülők keresztezéséből származó F1
hibridet önmagával keresztezik. A hasadó F2 nemzedék egyedeit fenotípusuk alapján két csoportra
osztják. A kromoszómapárok rekombinációja („crossing over”) következtében a rezisztenciagénnel
azonos kromoszómán lévő molekuláris markerek átrendeződnek. C: a molekuláris markereket
(polimorfizmusokat) összehasonlítják a hibrid vonalak fenotípusával, és megkeresik a rezisztenciával
együtt hasadó markereket. Ezek a keresett lókusz közvetlen környezetéből származó szekvenciarészletek,
amelyek segítségével a genomi könyvtárból izolálhatók a rezisztenciagének ................................ 272 109. A növény idegen génnel történő transzformálásának főbb lépései [Salazar, 1996 után] ........ 281 110. A pGA 482 alapú plazmid. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus – CMV) Trk7-es
törzse cDNS klónjáról származó, 1200 bázispár hosszúságú régiót, mely a vírus köpenyfehérje génjét (CP)
hordozza, az ábrán jelölt XbaI helyre klónozták 35S promóter és NOS transzkripciós terminál régió közé.
BR = (right border) a T-DNS jobb oldali határszekvenciája; BL = (left border) a T-DNS bal oldali
határszekvenciája; NptII = neomicin-foszfotranszferáz II NOS promóter és terminál régió között; Tet =
tetraciklin-rezisztenciagén baktériumpromóter mögött .................................................................. 282
xiv Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A táblázatok listája
1. Növénypatogén víruscsaládok és nemzetségeik száma ................................................................ 10 2. Tospovirusok átvitelében szerepet játszó vektorok ...................................................................... 12 3. A Nemzetközi Vírustaxonómiai Bizottság által újonnan jóváhagyott vírusrendszer .................... 35 4. Növenypatogen vírusnemzetségek és típustagjainak fontosabb tulajdonságai ............................. 38 5. A növénypatogén vírusnemzetségek típus vírusfajainak összefoglaló tulajdonságai1 ................. 44 6. A vírusok magyar és angol nevei, valamint akronímjai1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ...................................... 52 7. A növényvirológiában használt fontosabb kísérleti növények kódjai1 ......................................... 66 8. A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) átvitele levéltetvekkel (Govier és Kassanis, 1974 után) 87 9. Burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és helper komponens átvitelek levéltetvekkel (Govier és
Kassanis, 1974 után) ......................................................................................................................... 88 10. Lokális növény-vírus kapcsolatok ............................................................................................ 106 11. Szisztemikus növény-vírus kapcsolatok ................................................................................... 107 12. Lokálislézió-számlálás latin négyzet módszerrel ...................................................................... 111 13. Lokálislézió-számlálás féllevél és latin négyzet módszerrel .................................................... 112 14. A dohány mozaik vírus és a paradicsom mozaik vírus szétválasztása differenciáló tesztnövényekkel
(Horváth, 1993a után) ..................................................................................................................... 114 15. Vírusok fenntartására alkalmas tesztnövények és azok inokulációjának optimális ideje (Noordam,
1973 után) ....................................................................................................................................... 115 16. Néhány vírus fenn tarthatósága gazdanövény ékben ................................................................ 116 17. A magyar vírusellenőrzési rendszerben használt fás szárú indikátorokkal kimutatható szőlőpatogén
vírusok1 .......................................................................................................................................... 120 18. Gyümölcsfajok üvegházi fás szárú biológiai tesztelése (Bach és Szőnyegi, 1996 után)1 ........ 123 19. A citoplazmatikus és a normális sejtalkotórészek elszíneződése különböző festések alkalmazásakor
(Dijkstra és De Jager, 1998 után) .................................................................................................... 142 20. Növényvírusok, amelyekkel szemben monoklón antitesteket állítottak elő (van Regenmortel és Dubs,
1993 után módosítva) ..................................................................................................................... 182 21. Az indol-3-ecetsavnak és különböző származékainak tömegspektrumában előforduló jellegzetes
ioncsúcsok m/z értékei és a bázisionhoz viszonyított relatív intenzitásuk (zárójelben). IES = = indol-3-
ecetsav, Me = metil, TMS = trimetil-szilil, Mi+(Mi-) = molekulaion, Bi+(Bi-) = bázision. .......... 216 22. Citokininvegyületek és származékaik elektronütköztetéses tömegspektrumát alkotó fontosabb
ioncsúcsok m/z értékei és relatív intenzitásuk a bázision százalékában (zárójelben). iP = izopentenil-
adenin, [9R]iP = izopentenil-adenin-ribozid, Z = zeatin, [9R]Z = zeatin-ribozid, TMS = trimetil-szilil,
perMe = permetil, Mi+ = molekulaion, Bi+ = bázision. ................................................................. 224 23. Az AOF mérési módszereinek összefoglalása (Schroeder et al., 1996 után módosítva) .......... 241 24. Nicotiana tabacum fajták és törzsek vírusrezisztenciája ........................................................... 253 25. A paradicsom vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után módosítva) .................... 254 26. A Capsicum genotípusok rezisztenciája és a tobamovirus patotípusok közötti kapcsolat (Boukema,
1984 után) ....................................................................................................................................... 255 27. A paprika komplex vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után) ............................. 256 28. Paprikafajták tobamovirus-ellenállósága .................................................................................. 257 29. A genetikai bázis (Solanum fajok) vírusrezisztenciája (Horváth, 1988 után) 1, 2, 3 ................ 258 30. Fontosabb rezisztenciaszabályozó gének (Foxe, 1992 után) .................................................... 259 31. A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) törzsek csoportosítása (Foxe, 1992 után) .............. 260 32. Új burgonyafajták nemesítésének vázlata (Ross, 1986 után módosítva) .................................. 263 33. Protoplaszt-tenyésztés és a növényregenerálás körülményei .................................................... 268 34. A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia a transzgénikus növényekben (Miller és Hemenway,
1998) ............................................................................................................................................... 274 35. Az Európai Közösségben elő nem forduló kórokozók1 ........................................................... 286 36. Az Európai Közösségben elő nem forduló, de az Európai Közösségre nézve fontos vírus, vírusszerű és
viroid kórokozók ............................................................................................................................. 288 37. Az Európai Közösségben előforduló és az Európai Közösségre nézve fontos károsítók ......... 289 38. Európai karantén károsítók (vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok) az EPPO-régióban (Smith et
al., 1997 után) ................................................................................................................................. 292
1 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1. fejezet - Előszó
A Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek c. egyetemi tan- és kézikönyv megírását az tette
szükségessé, hogy a Pannon Agrártudományi Egyetem Georgikon Mezőgazdaságtudományi Karának
(Keszthely) Növényvédelmi Intézete elnyerte az Országos Akkreditációs Bizottsághoz benyújtott pályázatát
„Növényvirológiai Iskola” (Ph.D.-képzés) megteremtésére. Tekintettel arra, hogy magyar nyelvű
vírusmódszertani kiadvány – eltekintve a korábbi években megjelent növényvirológiai könyvekben és
folyóiratokban közzétett szűkebb körű ismeretektől – nem áll korszerű formában rendelkezésre a Ph.D.
hallgatók számára, ezért nélkülözhetetlennek tartottuk ennek a könyvnek a kiadását. Úgy gondoljuk, hogy Ph.D.
hallgatóinkon kívül az agrármérnök, az agrárkémikus agrármérnök, a növényvédelmi szakmérnök és a
növényorvosi szak hallgatóinak régi kívánsága teljesül azzal, hogy a Növényvírusok és virológiai vizsgálati
módszerek c. tankönyv megjelenik. Reméljük, hogy ezt a könyvet nemcsak az agráregyetemi és főiskolai
képzésben, hanem a biológusképzésben részt vevő hallgatók is örömmel fogadják.
Az egyetemi tankönyvet „kigondoló” szerkesztők részéről talán merész vállalkozásnak tűnhet, hogy a
módszertani könyv megírását nagyobb részben virológus Ph.D. hallgatóinkra bíztuk. Ezzel azt kívántuk elérni,
hogy saját tudományterületük témáiban minél jobban elmélyedjenek, megismerjék a legalapvetőbb
módszereket, és azokat úgy írják meg, ahogyan megálmodták egy hazai, „még nem létező” tankönyvben. Az
egyes fejezetek végén megtalálható Irodalom az ismeretek szélesebb körű elsajátításában kí-ván segítséget
nyújtani.
A szerkesztők és a szerzők köszönetüket fejezik ki mindazoknak, akik a könyv kéziratának elkészülte során
hasznos észrevételeket tettek. A kézirat előkészítésében, szerkesztésében nyújtott technikai segítségért hálás
köszönetünket fejezzük ki Hun Lajosné, Ihász Zoltánné és Molnár Katalin munkatársainknak. Messzemenő
köszönetünket fejezzük ki Balázs Ervin, Barna Balázs, Király Zoltán és Klement Zoltán professzor uraknak
azért, hogy a Pannon Agrártudományi Egyetem Virológiai Doktori Iskola munkájában közreműködtek és
segítették a virológus doktorjelöltek tudományos tevékenységét és e tankönyvben való közreműködését.
Köszönetet mondunk azoknak a hazai és külföldi kollégáinknak és kiadóknak, akik eredeti és már megjelent
értékes ábráikat rendelkezésünkre bocsátották. Nem utolsó sorban köszönetettel tartozunk a könyv lektorainak,
akik észrevételeikkel és tanácsaikkal gazdagították a könyvet. Köszönet illeti a Mezőgazda Kiadót és minden
pártfogó támogatót, hogy e könyv megjelentetését elősegítették.
A Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek c. egyetemi tankönyvet azzal a gondolattal bocsátjuk útjára,
hogy felhívjuk vele a figyelmet a rohamosan fejlődő növényvirológia fontosságára és elősegítjük az egyetemi
hallgatóknak és a Doktori Iskola Ph.D. hallgatóinak munkáját, ismereteik gyarapodását, továbbá a tudományba
vetett hitük megőrzését és továbbadását.
Keszthely–Budapest, 1998 novemberében
Horváth József Gáborjányi Richard
intézetigazgató egyetemi tanár, egyetemi magántanár,
az MTA lev. tagja az MTA doktora
Pannon Agrártudományi
Egyetem Magyar Tudományos Akadémia
Növényvédelmi Intézet, Növényvédelmi Kutatóintézete,
Keszthely Budapest
2 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2. fejezet - Bevezetés a virológiába
1. A vírusok jelentősége
A vírusok az élővilág olyan parazitái, amelyek növényekben, emberekben, állatokban, rovarokban és különböző
mikroorganizmusokban többnyire súlyos megbetegedéseket idéznek elő. A vírusbetegségek (himlő, veszettség,
sárgaláz, sertéspestis, Eupatorium sárgalevelűség, tulipán színtörés) hosszú idők óta ismertek, bár etiológiai
kutatásuk és fertőzőképességük bizonyítása csak a XIX. század végén kezdődött el. Finlay 1881-ben igazolta a
sárgaláz víruskórokozójának átvitelét Aedes aegypti csípőszúnyoggal, Mayer 1886-ban a dohány mozaik
betegséget okozó vírus átvitelét fertőző dohánynövény szövetnedvével, Loeffler és Frosch pedig 1898-ban
bizonyította a szarvasmarhák száj- és körömfájás-betegség víruskórokozójának szűrhetőségét. Jelenlegi
ismereteink szerint a vírusok a Földön mindenütt előfordulnak. Csupán Európában mintegy ezer növényi
vírusbetegség ismert; a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) a volt Jugoszlávia területén mintegy 16 millió
szilvafát betegített meg és pusztított el. A növényvírusok által előidézett termésveszteségekre vonatkozóan (több
mint 30 vírus esetében) Pennazio et al. (1996) közölt legújabban összefoglaló tanulmányt. Az ember- és
állatpatogén influenzavírusok (A és B típus) 8–10 évenként igen jelentős epidémiákat, néha pandémiákat
okoznak. A XX. században három, nagy morbiditással és gyors terjedéssel járó vírus-influenzapandémiát
figyeltek meg. Az első az ún. „spanyolnátha” volt, amely 1918 áprilisában lépett fel, és mintegy 20 millió ember
halálát okozta. A második, az ún. „ázsiaiinfluenza”-járvány 1957-ben alakult ki (Bakács és Farkas, 1965). A
harmadik járványt – amely 1968/1969-ben az Amerikai Egyesült Államokban lépett fel – az influenzavírus ún.
„Hongkong” típusa idézte elő.
2. A vírusok morfológiája és felépítése
A vírusok olyan fertőzőképes, szubmikroszkopikus obligát sejtparaziták, amelyeknek szférikus (izometrikus)
formái 20–200 nm átmérőjűek, megnyúlt pálcika, ill. fonál alakú formái 100–2000 nm hosszúságúak és 10–20
nm átmérőjűek. A vírusok nagyobb része helikális szimmetriájú; egyes baktériumvírusok (bakteriofágok)
binálisak (1. ábra). A geminivirusoknak iker virionjaik vannak. A vírusok a genetikai információt hordozó
egyszálú, kétszálú, lineáris vagy cirkuláris ribonukleinsavból (RNS) vagy dezoxiribonukleinsavból (DNS) és a
nukleinsav védelmi funkcióját ellátó fehérjeburokból (kapszid) állnak. A nukleinsav és a kapszid együttesen
alkotja a nukleokapszidot. Az ilyen összetételű vírusokat burok nélküli (non-enveloped) vírusoknak nevezzük
[pl. dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), rovarpatogén iridovirus stb.]. A vírusok egy másik
részénél a nukleokapszidot még egy külső glükoproteid burok (peplon) veszi körül [pl. paradicsom
bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus), valamint néhány növény- és rovarpatogén rhabdovirus].
Egyes vírusok még különböző mértékben lipideket, cukrot és nyomokban poliaminokat is tartalmaznak.
1. ábra - A vírusok sematikus ábrázolása. A: helikális dohány mozaik vírus (tobacco
mosaic tobamovirus); B: izometrikus, kubikális szimmetriájú tarlórépa sárga mozaik
vírus (turnip yellow mosaic tymovirus); C: bakteriofág (Echerichia coli T2-fágja)
3. A vírusok replikációja
Bevezetés a virológiába
3 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vírusok saját anyagcserével nem rendelkeznek, replikációjukhoz a gazdasejt fehérje- és nukleinsav-
szintetizáló képességét használják fel. A replikáció során a gazdasejt tevékenységét úgy programozzák át, hogy
a sejt saját anyagai elősegítsék új virionok bioszintézisét (produktív infekció). Bizonyos ember-, ill. állatpatogén
vírusok képesek a gazdasejt rosszindulatú átalakítására is (malignus transzformáció); ebben az esetben a sejtek a
rákos sejtekhez válnak hasonlóvá. Produktív infekció esetén a vírusok replikációja hat szakaszra osztható: (1)
adszorpció, (2) penetráció, (3) dekapszidáció, (4) eklipszis, (5) maturáció, (6) kiszabadulás. Az adszorpciós
fázisban a sejt felszíne és a virion között stabil kötődés jön létre. A penetráció során a virion különböző
mechanizmusokkal (növényvírusoknál vektorok segítségével, állatpatogén vírusoknál fagocitózis-szerű
folyamattal, baktériumvírusok esetében nukleinsav-„belövéssel”) jut be a sejtbe. A penetráció után a virion
dekapszidálódik. E folyamatban egyes vírusoknál ún. kapszid fehérjéket bontó enzim vesz részt, más vírusoknál
(pl. influenzavírus) pedig a peplon egyesül a sejtmembránnal és a citoplazmába csak a nukleokapszid hatol be.
Az eklipszis szakaszban a vegetatív vírus nukleinsavban tárolt információi nukleinsav-polimerázok segítségével
új nukleinsavak képződését eredményezik (replikáció). Hasonlóan fontos a nukleinsavat bontó nukleázoknak
(RNázok, DNázok) és a nukleinsavtöréseket összekapcsoló, valamint a vírusnukleinsavnak a sejtgenomba
történő beépítését végző ligázoknak a szerepe. A vírusnukleinsav replikációjával párhuzamosan kezdődik a
vírusfehérjék szintézise. A maturációs (érési) szakaszban a szintetizálódott nukleinsav-, a fehérje- és az egyéb
komponensek érett, fertőző vírusokká egyesülnek. Az összeépülés az izometrikus RNS-tartalmú vírusoknál a
nukleinsav- és a fehérjealegységek fizikokémiai konfigurációjából adódóan csak egyféle virion kialakulásához
vezethet. Más vírusok spontán is aggregálódhatnak, de ismertek olyanok is (pl. adenovirusok), amelyeknek az
alkotórészei nem tudnak minden esetben komplett virionná összeépülni, és ún. „üres” köpenyfehérje-burkok
jönnek létre. A vírusok replikációjáról A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációja című fejezetben
találhatók részletes ismeretek.
4. A vírusos betegségek kialakulása és a tünetek (szimptómák)
A vírussal fertőzött gazdaszervezetben morfológiai, citológiai, fiziológiai stb. elváltozások figyelhetők meg,
amelyek külső és belső tünetekben nyilvánulnak meg. A növényvírusok a fertőzött sejtek plazmodezmáin
keresztül hatolva fertőzik meg a szomszédos sejteket (4–80 µm/óra terjedési sebesség), majd a
szállítószövetekben, a floemben és a xylemben 0,1–1,8 cm/óra sebességgel képesek terjedni. A hiperszenzitíven
reagáló növényi szövetekben a vírusok terjedése a nekrotizálódó sejtek miatt megáll. Az állatpatogén vírusok a
nyirok- és véredényekben vagy az idegpályákon keresztül terjednek. A rovarpatogén vírusok orális felvételt
követően a gyomorba jutva lokalizálódhatnak, vagy a hemolimfán keresztül más szövetbe (zsírszövet,
szaporítószervek, idegrendszer) jutnak. A tünetek a fertőzést követő néhány nap múlva megjelenhetnek
(növény-, ember- és állatpatogén vírusok), míg a bakteriofágok esetében néhány perc alatt. Ismeretesek ún.
„lassú” vírusok is, amelyek néhány hónap (veszettség vírus), ill. 1–2 év alatt (fás szárú növények vírusai)
manifesztálódnak. A növényvírusok külső tünetei szín- és formaelváltozásokban jutnak kifejezésre (abnormális
kalluszképződés, sejtfalvastagodás, amorf és kristályos zárványok). Az ember- és állatpatogén vírusok által
előidézett betegségtünetek (láz, fej- és izomfájás, étvágytalanság, fokozott váladékképződés), hasonlóan a
növényvírusok tüneteihez, nem specifikusak. A legfontosabb betegségszindrómák az alábbi csoportokba
sorolhatók: idegrendszeri, légúti, légzőszervi, bőr- és nyálkahártya-, szem-, máj-, emésztőszervi, nyirok- és lázas
betegségek.
5. A vírusok átvitele, terjedése
Minden növényvírus átvihető fogékony gazdanövényére kertészeti oltással, de természetes terjedésük főképpen
vektorokkal (levéltetvek, kabócák, fonálférgek, talajban élő gombák) és parazita növényekkel (Cuscuta spp.)
történik. A vektormentes átvitelen kívül a vegetatív szaporítószervekkel (gumó, hagyma, rizóma), a generatív
szaporítószervekkel (mag, pollen) és a mechanikai úton történő terjedésnek van jelentősége. Az ember- és
állatpatogén vírusok terjedésében a kontakt átvitelnek, a csepp- és bőrfertőzésnek, a transzplantációnak és a
passzázsnak (tojás, anyatej) van jelentősége. A vírusok igen széles körű elterjedése, tág gazdaköre, valamint a
kedvező ökológiai körülmények sok esetben időben és térben egybeeső epidémiák kialakulását, vagy olyan
pandémiák kialakulását eredményezi, amelyek kiterjedése és időtartama határtalan. Az epidémiák és pandemiák
kialakulásában az ember direkt és indirekt szerepén kívül igen fontos szerepet játszik a növények esetében a
rezisztencia hiánya, a megnövekedett nemzetközi forgalom stb. Az ember- és állatpatogén vírusoknál az
ökoszisztémában bekövetkezett változások, a széles körben elterjedt háziállat–ember kapcsolattal együttjáró víz-
és táplálékkontaminációk, valamint a vektorpopulációk által terjesztett számos vírus olyan betegségek
epidémiáját és pandemiáját képes előidézni, mint pl. a veszettség, influenza stb.
Bevezetés a virológiába
4 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
6. A vírusok diagnosztikája
Vírusbetegségnek csak az tekinthető, aminek víruskórokozóját sikerül izolálni, antigénjeit a gazdaszervezetben
kimutatni és/vagy a betegséget mesterséges inokulációval reprodukálni. A vírusfertőzés következtében fellépő
tünetek (szimptómák) alapján bizonyos vírusokra lehet következtetni, de a gazda–vírus reakciókat befolyásoló
környezeti tényezők jelentős volta, továbbá a számos látens és lassú fertőzés (slow vírusok) miatt a
szimptomatológia egyedül igen megbízhatatlan a vírusok diagnosztikájában. A vírusok mesterséges átvitele
tesztnövényekre, tesztállatokra, valamint olyan objektív diagnosztikai eljárások, mint pl. az ELISA-módszer, a
komplementkötési reakció, a hemaglutináció, a neutralizáció, az elektronmikroszkópia, az immuno-
elektronmikroszkópia, az RNS-DNS hibridizáció, a polimeráz láncreakció (PCR) stb. jelentős szerepet játszanak
a vírusok azonosításában. A vírusok fizikai tulajdonságain (hőinaktiválási pont, in vitro eltarthatóság,
hígíthatóság stb.) alapuló diagnosztika megbízhatatlan.
7. A vírusok elleni védekezés
A vírusokkal mint fertőző betegségekkel szembeni védekezés két csoportba osztható: (1) megelőzés (profilaxis)
és (2) gyógyítás (terápia). A növényvírusokkal szembeni preventív eljárások közül a rezisztenciára nemesítésnek
(rezisztens fajták előállításának), a vírusmentes szaporítóanyagok használatának, a fertőzési források
(gyomnövények), a vírusátvitelben szerepet játszó vektorok elpusztításának és a karantén rendszabályok
betartásának a legnagyobb a jelentősége. Újabban eredményeket értek el a gyenge vagy gyengített vírustörzsek
preimmunizálásával kapcsolatban. A keresztvédettség (cross protection) jelenség néven ismertté vált biológiai
védekezés lényege az, hogy egy vírus gyenge, enyhe megbetegedést okozó törzse védelmet nyújt ugyanazon
vírus súlyos betegséget előidéző törzsének fertőzésével szemben, és ez utóbbi vírus szaporodása is jelentősen
csökken. A biotechnológiai módszerek közül figyelmet érdemel a köpenyfehérjegénnel, a szatellit RNS-sel, az
értelmetlen (antiszensz) nukleinsavval és a defektív interferáló molekulákkal kialakított indukált rezisztencia. A
biotechnológiai módszerek alkalmazását a növényvírusok ellen azok az elmúlt években történt biológiai,
biokémiai és molekuláris biológiai felfedezések tették lehetővé, amelyekkel ismertté vált az egyes szervezetek
működését ellenőrző gének megismerése és megváltoztatása. A génsebészeti, ill. a génátültetési módszerek
felhasználásával forradalmi változások következtek be a mezőgazdaságban és a növényvédelemben. Egyes
vélemények szerint 1–2 évtized múlva a világ élelmezésében szerepet játszó 29 fő tápnövény 80%-a
genetikailag módosított, azaz transzgénikus növény lesz. A transzgénikus növények előállításával kapcsolatban
részletes adatok találhatók A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei c. fejezetben.
A terápiai eljárások közül főképpen a hőterápiának és a regenerációs terápiának (merisztéma kultúra) van
jelentősége. A növényvírusok – és általában a vírusok – elleni kemoterápiát (vírusellenes anyagok) igen nagy
mértékben hátráltatja az a tény, hogy a vírusoknak nincs önálló anyagcseréjük, ezért az in vivo végzett
kemoterápikumok nemcsak a kórokozót, hanem a gazdasejtet is károsítják. Ennek ellenére egyes vírusellenes
szerek (pl. Ribavirin, Tiazofurin, Pyrazofurin) tápoldatba adásával sikerült egyes vírusok [pl. burgonya X-vírus
(potato X potexvirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus)] szaporodását merisztéma kultúrában gátolni,
vagy megszüntetni. Újabban metil-benzimidazol-2il-karbamát tartalmú gombaölő szerekkel is (pl. Benlate,
Bartstin) sikerült mérsékelni egyes növényvírusok tünettani hatását.
A növényvírusok elleni védekezéssel kapcsolatos antivirális, kémiai anyagokról Gáborjányi és Tóbiás
(1986a,b), Hansen (1988, 1989), Schuster (1988), Kluge et al. (1990), Tallóczy és Gáborjányi (1990),
Yordanova et al. (1996), valamint Horváth (1999) munkái adnak összefoglaló áttekintést.
Az ember- és állatpatogén vírusok elleni preventív védekezésben az a lényeges különbség, hogy a
gerincesekben, beleértve az embert is, a vírusfertőzésre immunreakció lép fel, amelyet igen hatásosan lehet
felhasználni. A preventív védekezés a vírus terjedésének megakadályozására (hygiene, fertőtlenítő
rendszabályok betartása, vektorok elleni védekezés, az emberre veszélyes állati gazdák eliminálása),
védőoltásokra, premunizálásra és a karantén-rendszabályok betartására terjed ki, míg a terápia (gyógyítás) a
tüneti kezelésre és a kémiai gyógyításra szorítkozik. Az aktív immunizálás (védőoltás) humorális immunitást és
a celluláris immunreakció aktiválását indukálja, ezáltal a legfontosabb profilaktikus eljárás. Ilyen pl. az
influenza elleni védőoltás (kisgyermekeknek, 65 év feletti és veszélyeztetett személyeknek), amely 1 évig, vagy
a sárgaláz elleni védőoltás (fertőzött területekre utazóknak), amely 10 évig jelent védettséget. A járványos
gyermekbénulás ellen az 1970-es években bevezetett „Kiterjesztett Immunizációs Program” (Expanded
Programme on Immunization = EPI) eredményeként a WHO becslése szerint több mint 400 ezer gyermeket
sikerült megmenteni attól, hogy nyomorékká váljon, és remélhetőleg ez a járványos betegség az ezredfordulóra
megszűnik. A premunizálás (nem specifikus védelmi szisztéma) mind profilaktikusan, mind terápikusan rövid
Bevezetés a virológiába
5 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
idejű védelmet jelent az emberre és az állatra egyaránt. Ezt igazolják az interferonnal végzett kutatási
eredmények, amelyeket a különböző daganatokat előidéző vírusok ellen használnak. Az interferon nincs
hatással a vironra; hatását úgy fejti ki, hogy egy másik mRNS transzkripcióját depresszálja. Ez a mRNS a
riboszómákban egy sejtfehérjének (antivirális protein, AVP) a transzlációját segíti elő, ami gátolja a
vírusfehérjék transzlációját úgy, hogy a vírus-mRNS-t nem engedi a riboszómákhoz kötődni. Széles körű
használatának gátat szab a toxikusság, a toleranciafázis és a szelektivitás (arra a szervezetre hat, amely
termelte). A tüneti kezelésre irányuló terápia a betegség klinikai megjelenését (pl. láz, vérnyomásváltozás) veszi
figyelembe, noha jól ismert, hogy vírusellenes szer nem áll rendelkezésre. Krónikus és látens vírusfertőzések
egyáltalán nem befolyásolhatók, mivel nem ismeretes, hogy a vírust, ill. a vírusgenomot a sejtből hogyan lehet
eltávolítani.
Ennél sokkal fontosabb és egyben igen veszélyes probléma az, hogy az antivirális anyagok gyakran rezisztens
vírusmutánsok kialakulásához vezetnek. Az antivirális terápia megválasztásánál fontos szempont a fertőzési
stádiumnak és a replikáció stádiumának megfelelő antivirális anyagok kiválasztása. A penetrációs szakaszban a
fehérje kapszid gátlására influenza A-vírus esetén ciklikus aminok használata javasolt. Az orthomyxo- és
togavirusok penetrációs folyamatát gátolja pl. az amantadin, amelynek sósavas sója Viregyt néven ismert
Magyarországon. A ciklikus aminok (pl. Amantadin) gátolják az influenza A-vírust a korai fertőzési szakaszban,
és emellett jó profilaktikus hatásuk is van. A transzkripciót gátló szerek közül ismert a Rifampicin, amely a
mRNS átírásához szükséges polimeráz enzimeket gátolja. A transzlációt gátló kemoterapikumok közül
legismertebb a Marboran, amely főleg az adeno- és herpesvírusok ellen hatásos. A nukleinsav-szintézis gátlására
alkalmasak a polimeráz enzimek szintézisére ható moroxidinszármazékok és a Virazol, amely kísérleti
állatokban gátolja a herpesvírus és több influenzavírus szaporodását. A pirimidin-analógok a purinanalógokkal
ellentétben toxikus mellékhatást eredményeznek, noha egyes vírusfertőzések (pl. herpes simplex) ellen
hatásosak. A purinanalógok (Acyclovir) hatásosak a herpesvírusok ellen és kevésbé toxikusak.
A növényvírusok (vírusbetegségek) elleni védekezési lehetőségeket Hadidi et al. (1998) legújabb kézikönyve
tárgyalja.
8. A vírusok eredete
A vírusok eredete extrém alkalmazkodóképességük és gyors változékonyságuk miatt ma még ismeretlen, de
számos lehetséges teória van arra vonatkozóan, hogy a növény- és állatvírusok közös eredetűek (Goldbach,
1986; Roossinck, 1997). Tekintettel arra, hogy a vírusok obligát sejtparaziták, létezésük csak a sejtes élőlények
megjelenésével együtt vagy azok megjelenését követően képzelhető el, és mint genetikai szintű paraziták, csak
az élettel párhuzamos evolúciós múltra tekinthetnek vissza. Ezt bizonyítja az a tény is, hogy a jelenleg ismert
növényvírus-nemzetségből 52-nek (több mint 80%) a genomja RNS, és leginkább (46) egyszálú RNS. Egyre
több bizonyíték van arra, hogy a vírusok vagy azok egy része a sejtből alakult ki úgy, hogy a sejtek hosszú időn
át, egymást követő mutációk eredményeképpen elvesztették enzimrendszereiket és emiatt függő viszonyba
kerültek egy másik sejttel szemben, amelynek enzimjeit a reprodukcióhoz felhasználhatta. A sejtből származás
elvét támogatja az, hogy például egyes pozitív szálú RNS-vírusok és az RNS-tartalmú bakteriofágok
nukleinsava inkább hasonlít a gazdasejthez, mint egymáshoz. Ismert az is, hogy a gazdasejtben szaporodó vírus-
RNS molekulák és a gazdasejt nukleinsava között a riboszómakötő helyek számát tekintve hasonlóság van. A
szomszédos nukleotid párok gyakoriságának vizsgálata során összefüggések mutathatók ki a vírus-DNS és a
sejt-DNS szerkezete között.
A vírusokban és a különböző élőlényekben a nukleinsavak kapcsolatai és kölcsönhatásai igen szorosak és
sokrétűek. A vírusok evolúciójában a kapszidnak alapvető jelentősége van, ui. a fertőzés természetes
körülmények között csakis a védett génállományú virion útján lehetséges. A vírusok evolúciója tehát az élet
evolúciójával párhuzamos genetikai információ-evolúciónak az eredménye. Érdemes megjegyezni, hogy
morfológia, replikációs stratégia és vektortípusok alapján történő víruscsoportosítás valószínűleg tükrözi
evolúciós kapcsolataikat, mivel a közös jegyek (tulajdonságok) azok, amelyeket a közös „őstől” örököltek. Az a
tény, hogy kevés víruscsoportnak (nemzetségnek) van hasonló tulajdonság-együttese, arra utal, hogy a
különböző csoportoknak (nemzetségeknek) különböző az eredete. Ez azt jelenti, hogy a vírusok polifiletikus
eredetűek. Az a tény, hogy az egyes víruscsoportok tagjai különböznek egymástól a gazdanövénykörben és a
vektorokban arra utal, hogy a növényi vírusfajok létrejöttének oka (vagy eredménye) az új gazda-, ill.
vektorfajok megszerzése.
A vírusok evolúciójában kétséget kizáróan a mutáció, a rekombináció és a gének újrarendeződése
(génkicserélődés) játszotta a legfontosabb szerepet (Chenault és Melcher, 1994; White et al., 1995; Hu és
Ghabriel, 1996; Roossinck, 1997).
6 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3. fejezet - A vírusok osztályozása és rendszertana
A vírusok fejlődéstörténeti rokonsága még nem tisztázott, csak egyes részletei ismertek, ezért egységes
osztályozásuk nehézségekbe ütközik. Tekintettel arra, hogy a vírusok egy része (pl. rhabdovirusok)
növényekben és rovarokban is szaporodik, ezért a gazdák szerinti osztályozás tudományos szempontból nem
elfogadható. Ennek ellenére a könnyebb áttekinthetőség, valamint számos alapvető ismeret hiánya miatt a
vírusokat gyakorlati szempontból a következők szerint csoportosíthatjuk: (1) növény-, (2) ember-, (3) állat-, (4)
rovar-, (5) baktérium-, (6) gomba-, (7) alga- és (8) fitoplazmavírusok.
A vírusokkal kapcsolatos kezdeti kutatások során megállapítást nyert, hogy a virionok fénymikroszkóppal nem
láthatók, táptalajon nem tenyészthetők és nem szűrhetők. A szűrhetőség volt az egyetlen olyan fiziko-kémiai
tulajdonság, amelyből következtetni lehetett a vírus méretére. A legtöbb tanulmány ebben az időben a vírusok
fertőzőképességével foglalkozott. Ezért a vírusok osztályozásának kezdeti próbálkozásai az általános patogén
tulajdonságokat, ökológiai tulajdonságokat és az átvitel lehetőségeit vették figyelembe. A vírusokat a
növényvírusok által előidézett tünetek (szimptómák) alapján csoportosították (vulgáris nevezéktan). Az azonos
tüneteket mutató vírusokat egy csoportba sorolták („mozaik vírusok”), ahova olyan vírusok tartoztak (pl. dohány
mozaik vírus = tobacco mosaic tobamovirus, karfiol mozaik vírus = cauliflower mosaic caulimovirus) (2. ábra),
amelyekről ma már tudjuk, hogy tulajdonságaikban teljesen eltérnek egymástól.
2. ábra - A: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött Nicotiana
tabacum cv. Samsun mozaikos levelei; B: tünetek a karfiol mozaik vírussal (cauliflower
mosaic caulimovirus) inokulált Brassica rapa var. rapa levelén
A vulgáris nevezéktant később az ún. számkatalogizáló nevezéktan váltotta fel. A számkatalogizáló nevezéktan
sem vitte előbbre a fejlődést, és lényegében alig jelentett változást a vulgáris nevezéktanhoz képest. A
számkatalogizáló nevezéktanra jellemző, hogy a vírust a fő gazdanövény vulgáris (pl. tobacco = dohány), vagy
latin genusznevével (pl. Nicotiana) és a vírus szóhoz csatolt számmal jelölte (pl. tobacco virus 1 vagy Nicotiana
virus 1).
A számkatalogizáló nevezéktant később egy újabb nómenklatúra-rendszer váltotta fel, illetve egészítette ki. Ez
az új nevezéktan csak annyiban tért el a számkatalogizáló nevezéktantól, hogy azt még a vírus egy speciális
tulajdonságával egészítette ki. Így pl. a tobacco virus 1, illetve Nicotiana virus 1 az új nevezéktan alapján
nagyfokú hőtoleranciája miatt a Nicotiana virus altathernus nevet kapta.
Az 1930-as évek végén Holmes (1939) egy újabb rendszert dolgozott ki. A kettős nevezéktan vagy binominális
nómenklatúra az élő szervezetek elnevezéséhez hasonlóan nemzetség- és fajnevet használ. Az elnevezések
alapját azonban ebben a rendszerben is a fő gazdanövényeken okozott tünetek képviselik. A mozaik típusú
betegségeket a binominális rendszer pl. „Marmor” néven csoportosította, és a tobacco mosaic virust Marmor
tabaci névvel jelölte.
A növénypatogén vírusoknak a fenti elvek alapján történt elnevezése egyre inkább tarthatatlanná vált.
Bebizonyosodott ti., hogy a vírusok által előidézett szimptómák még ugyanabban a gazdanövényben is eltérőek
lehetnek, amelyet a külső környezeti feltételek is lényegesen befolyásolhatnak, továbbá ugyanahhoz a
A vírusok osztályozása és
rendszertana
7 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
vírusfajhoz tartozó különböző törzsek szimptomatológiailag ugyanabban a gazdanövényben eltérően
viselkedhetnek. A fő szimptómákra alapozott vírusnevezéktan tehát nem bizonyulhatott véglegesnek. Először
Bawden (1950) vetette fel, hogy a vírusok csoportosítására a virion tulajdonságai a legalkalmasabbak. Ennek
figyelembevétele alapján született meg a növénypatogén vírusok újabb csoportosítása, amelynek alapját a
pálcika alakú vírusok (rod-shaped viruses), ill. a fonal alakú vírusok (filamentous viruses) képezték (Brandes és
Bercks, 1965). A pálcika, ill. a fonal alakú vírusokat hat csoportba sorolták, és mindegyik csoportot egy-egy jól
ismert, reprezentatív vírusról nevezték el: (1) tobacco rattle virus csoport, (2) tobacco mosaic virus csoport, (3)
potato virus X csoport, (4) potato virus S csoport, (5) potato virus Y csoport és (6) beet yellows virus csoport.
Lwoff et al. (1962), Lwoff és Tournier (1966) véleménye szerint a virion szerkezetére vonatkozó négy jellemző
tulajdonság alapján is lehetőség van a vírusok osztályozására. Ez a „lényeges integránsnak” nevezett négy
jellemző tulajdonság a következő: (1) genetikai anyag, DNS vagy RNS, (2) virion-szimmetria, (3)
nukleokapszid: csupasz vagy burkolt és (4) mennyiségi adatok (a nukleokapszid átmérője, a kapszomérek
száma).
Az Ideiglenes Vírus Nómenklatúra Bizottság (Provisional Committee of Nomenclature of Viruses, P.C.N.V.)
1966-ban újabb ajánlatokat terjesztett elő, amelyet Pereira (1966) a következőkben körvonalazott: a) az állatok,
növények és baktériumok vírusait egyetlen törzsben (Vira) kell csoportosítani, b) a törzset altörzsekbe,
osztályokba, rendekbe, családokba, nemzetségekbe és fajokba kell beosztani, c) a nemzetségeknek latin vagy
latinos nevet kell adni „virus” szóvégződéssel. Mindegyik nemzetséget egy jól ismert, autentikus fajjal kell
tipizálni. A típusfajt nemzetközi kultúra-kollekcióban kell fenntartani, d) minden családot egy típusnemzetségről
kell elnevezni, amelyhez az „idae” toldalékszócskát kell csatolni, e) a kódban ne legyen elsőbbségi jog, f) a
P.C.N.V. elé olyan hagyományos névjegyzéket kell terjeszteni, amelyben fenntartják a közhasználatban levő
vírusneveket, g) személyek neveivel, anagrammákkal, betűjelzésekkel, hibridnevekkel vagy értelmetlen
nevekkel megjelölt taxonok nem fogadhatók el, és h) az elfogadható új neveket jogi bizottság útján a
Nemzetközi Nómenklatúra Bizottság (International Committee of Nomenclature, I.C.N.) elé kell terjeszteni.
A Gibbs et al. (1966), Gibbs (1969) által előterjesztett alternatív rendszer nem kísérli meg a vírusoknak mint
konvencionális organizmusoknak a kezelését. Rendszerük az ún. Adanson-féle elveken alapszik, azaz az
organizmusok csoportosításának olyan módszerén, amely a legtöbb közös vonást veszi figyelembe. Gibbs és
munkatársai (1966) azzal indokolják elképzelésüket, hogy jelenleg nem ismerik eléggé az egyes tulajdonságok
relatív fontosságát, ezért valamennyi jellegzetesség egyformán fontos. Gibbs et al. (loc. cit.) szerint a vírusokat
népnyelvi, triviális nevekkel és az egyes ismert és még nem ismert tulajdonságokat tartalmazó kriptogrammal
kell megjelölni.
A Vírusok Nemzetközi Nómenklatúra Bizottsága (ICNV) 1973-ban Vírustaxonómiai Nemzetközi Bizottsággá
(International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) alakult. Az ICTV jelenleg 6 albizottságból, 45
csoportból és mintegy 400 virológusból áll. Az ICTV mexikói értekezletén két víruscsalád és 24 vírusnemzetség
elnevezését fogadta el (Wildy, 1971). Ezt követően az ICTV 1971 és 1991 között öt jelentést állított össze,
amelyben megtalálhatóak azok az újabb eredmények, amelyek a vírusok osztályozásával és elnevezésével
kapcsolatosak (Wildy, 1971; Francki et al., 1991). Az ICTV hatodik jelentésében már 164 nemzetségbe és 24
nem végleges nemzetségbe tartozó, több mint 3600 vírusfajról számol be (Murphy et al., 1995).
A jelenlegi univerzális vírustaxonómiai rendszer az alábbi négy kritériumra épül: (1) a vírusgenom típusa, (2) a
vírusgenom egy- vagy kétszálúsága, (3) a fordított transzkripció (átírás) lehetősége, (4) a vírusgenom polaritása
(Murphy et al., 1995; Mayo, 1996; Pringle, 1998; Mayo és Pringle, 1998).
A legújabb vírustaxonómiai kiadvány (Murphy et al., 1995) vázlatosan, diagramokban szemlélteti a
víruscsaládokat és nemzetségeket, a vírus fő gazdája (primer gazda) szerint. A növényeket (primer gazdákat)
fertőző vírusok kettős szálú dezoxiribonukleinsav-tartalmú vírusokra (dsDNA) és egyszálú
dezoxiribonukleinsav-tartalmú vírusokra (ssDNA), valamint egyszálú ribonukleinsav-tartalmú (ssRNA) és
kettős szálú ribonukleinsav-tartalmú vírusokra (dsRNA) csoportosíthatók (3. ábra).
3. ábra - Növénypatogén vírusok családjainak és nemzetségeinek vázlatos ábrázolása.
dsDNA = kettős szálú dezoxiribonukleinsav, ssDNA = egyszálú dezoxiribonukleinsav,
dsRNA = kettős szálú ribonukleinsav, ssRNA = egyszálú ribonukleinsav, (–) = negatív
szálú vírus, (+) = pozitív szálú vírus. Méretjelző = 100 nm [Murphy et al., 1995 után]
A vírusok osztályozása és
rendszertana
8 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az egyszálú RNS-vírusok (ssRNA) tovább csoportosíthatók negatív (–) értelmű [ssRNA(–)] és pozitív (+)
értelmű [ssRNA(+)] vírusokra. A negatív (–) jelölés azt fejezi ki, hogy a negatív szálú vírusok esetében szükség
van egy kiegészítő szál szintézisére is, mielőtt a transzláció megindulna. A pozitív (+) jelölés azt fejezi ki, hogy
a vírus-RNS hírvivő (messenger) RNS-ként viselkedik, ami arra utal, hogy sejtmentes transzlációs
rendszerekben közvetlenül képes fehérjék átírására.
1.
1.1.
1.1.1.
1.1.1.1.
1.1.1.1.1. Vírusrendek
A vírusrend a víruscsaládok csoportjából áll. A vírusrendeket a -virales képző (rag) fejezi ki. A növénypatogén
vírusok jelenlegi ismereteink szerint két rendbe (Mononegavirales, Nidovirales) sorolhatók (Pringle, 1998).
1.1.1.1.2. Víruscsaládok és alcsaládok
A víruscsaládok a vírusnemzetségek csoportjából állnak; közös tulajdonságokkal rendelkeznek és
megkülönböztethetők más víruscsaládok tagjaitól. A víruscsaládokat a -viridae képző (rag) fejezi ki, pl.
Potyviridae, ahova több vírusfaj is tartozik (burgonya Y-vírus = potato Y potyvirus). A víruscsaládok nagy része
különbözik a virion morfológiájában, a genomstruktúrában, a replikációs stratégiában stb. Négy családban
(Poxviridae, Herpesviridae, Parvoviridae és Paramyxoviridae) ún. alcsaládok bevezetésére került sor, amelyek
jelölésére a -virinae képzőt használják, pl. Alphaherpesvirinae.
1.1.1.1.3. Vírusnemzetségek
A vírusnemzetségek a vírusfajok csoportjából állnak; közös tulajdonságaik vannak, és különböznek más
nemzetségek vírustagjaitól. A vírusnemzetségeket a -virus képző (rag) fejezi ki, pl. Potyvirus.
A vírusnemzetségek vírusfajaira egyaránt az alábbiak jellemzőek: a) a vírusrészecskék szerkezete azonos,
összetételük nagyon hasonló, b) a genom stratégiája hasonló, c) ökológiai életciklusuk hasonló, d) eltérnek
természetes és mesterséges gazdanövénykörükben, e) eltérnek a gazdanövényeiken okozott tünetekben
(szimptómákban), f) eltérnek vektoraikban.
1.1.1.1.4. Vírusfajok
Az osztályozásban a legfontosabb hierarchikus szint a vírusfaj, amelyet 1991-ben az ICTV elfogadott (Francki
et al., 1991; Van Regenmortel, 1991, 1997).
1.1.1.1.5. Vírustörzsek
A vírusok osztályozása és
rendszertana
9 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A gazdanövénykör és a tünetek nem taxonómiai értékűek. Ennek ellenére, ha két vírusfaj virulenciában
különbözik egymástól, de gazdanövénykör tekintetében nem, akkor azok minden valószínűséggel ugyanazon
vírus különböző törzseinek tekintendők.
1.1.1.1.6. Vírusizolátumok
Egy vírusfaj gazdanövényköre és a gazdanövényeken létrehozott tünetek a vírusok igen változó
tulajdonságainak tekintendők. Ugyanis ismert, hogy akár egyetlen nukleotid megváltozása (mutáció)
megváltoztathatja az izolátum virulenciáját. Tehát ha két vírusizolátumnak ugyanaz a gazdanövényköre és
azokon ugyanazokat a tüneteket idézik elő, akkor feltehetően ugyanannak a vírusnak az izolátumairól van szó.
Ez a következtetés annál meggyőzőbb, minél több gazdanövényre terjed ki a fenti megállapítás.
A vírusok tulajdonságainak felhasználása a taxonómiában
A laboratóriumi technika tökéletesedése következtében a vírusok jellemzése gyors előrehaladást és ugyanakkor
a taxonómiában is változásokat idézett elő. A vírustaxonómia jelenleg a következő tulajdonságokat veszi
figyelembe:
Morfológia (a virion alakja és mérete, a peplomérek megléte vagy hiánya, a peplomérek természete, a burok
jelenléte vagy hiánya, a kapszid szimmetriája és struktúrája).
Fizikokémiai és fizikai tulajdonságok [a virion molekulatömege, a virionsűrűség (céziumkloridban,
cukoroldatban), a virion ülepedési állandója, a pH-tűrés, a hőtűrés, a kationtűrés, az oldhatósági stabilitás, a
detergens ellenállóság, a besugárzási stabilitás, a nukleinsav típusa (RNS vagy DNS), a genom mérete, a
nukleinsavszálak (egyszálú, kétszálú), a nukleinsav térbeli szerkezete (lineáris vagy cirkuláris), a nukleinsav
polaritása (pozitív, negatív vagy ambiszenz), a szegmentek száma és mérete, a nukleinsav-szekvencia, ismétlődő
szekvenciák jelenléte, az izomerizáció megléte, a G+C arány, az 5‟-végi szekvencia jellege, az 5‟-véghez
kovalens kötéssel kapcsolódó genomhoz kötött fehérje megléte vagy hiánya, a 3‟-vég poli-adenilált farok
megléte vagy hiánya].
Fehérjék (a strukturális fehérjék száma, mérete és működése, a nem strukturális fehérjék száma, mérete és
működése, az enzimfehérjék működése, mint pl. a transzkriptáz, reverz transzkriptáz működése stb.).
Lipidek.
Szénhidrátok.
Antigén tulajdonságok.
Biológiai tulajdonságok [a természetes gazdakör, az átvitel módja a természetben, a vektorkapcsolatok, a
földrajzi elterjedés, a patogenitás, a betegséggel való kapcsolat, a szövetek tropizmusa, a patológia, a
szövetpatológia, a genomszerveződés és -replikáció, -replikációs stratégia, a nyitott olvasási keret (open reading
frame, ORF) helyzete és száma, a transzkripciós sajátosságok, a transzlációs sajátosságok, a poszt-transzlációs
folyamatok, a virion proteinek felhalmozódási helye, a virion összeépülésének helye, a virion kialakulásának és
kiszabadulásának helye és természete].
2. A víruscsaládok és nemzetségeik általános jellemzése
A növénypatogén vírusok 12 jól definiált víruscsaládba tartoznak (Murphy et al., 1995). E családokba 51
vírusnemzetség tartozik; a növényvírusok azonban csak 34 nemzetségre terjednek ki (1. táblázat). Az egyes
víruscsaládok, nemzetségeik és típus vírusfajaik tulajdonságairól – kiemelve a növénypatogén vírusokat – az
alábbiakban számolunk be.
Bromoviridae család
Alfamovirus nemzetség
Bromovirus nemzetség
Cucumovirus nemzetség
A vírusok osztályozása és
rendszertana
10 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Ilarvirus nemzetség
Oleavirus nemzetség
1. táblázat - Növénypatogén víruscsaládok és nemzetségeik száma
Víruscsalád
neve1,2 Vírusnemzetségek
száma3
Bromoviridae 5/5
Bunyaviridae 5/1
Closteroviridae 2/2
Comoviridae 3/3
Geminiviridae 3/3
Luteoviridae4 3/3
Partitiviridae 4/2
Potyviridae 5/3
Reoviridae 9/3
Rhabdoviridae 5/2
Sequiviridae 2/2
Tombusviridae 5/5
Összesen: 12 51/34
1 A Bunyaviridae, a Reoviridae és a Rhabdoviridae családokban a növénypatogén vírusokon kívül gerinceseket
és gerincteleneket fertőző, a Partitiviridae családban növénypatogén vírusokon kívül gombákat fertőző vírusok
is vannak.
2 Újabban – a könyv kéziratának elkészülte után – lényeges változások következtek be egyrészt a már ismert
víruscsaládokba (Geminiviridae, Tombusviridae) sorolt vírusnemzetségek nevét és számát, másrészt új
víruscsaládok (Arenaviridae, Barnaviridae, Caulimoviridae, Luteoviridae, Partitiviridae) és vírusnemzetségek
elnevezését illetően (pl. Begomovirus, Benyvirus, Crinivirus, Curtovirus, Enamovirus, Mastrevirus,
Polerovirus). A könyv Új rendszertani javaslatok c. fejezete tájékoztat a növénypatogén vírusok
rendszertanában bekövetkezett változásokról, amelyek részletesen a 11. Nemzetközi Virológiai Kongresszust
(Sydney, Ausztrália, 1999) követően, az ICTV hetedik jelentésében, várhatóan 2000-ben látnak napvilágot.
3 A számlálóban a víruscsalád összes nemzetségének száma, a nevezőben a növénypatogén nemzetségek száma
van feltüntetve.
4 Új víruscsalád (vö.: Smith és Baker, 1999)
A Bromovirus, Cucumovirus és Ilarvirus nemzetségbe tartozó izometrikus vírusok virionjai 26–35 nm
átmérőjűek, ikozaéder szimmetriájúak. A virionok belsejében három genomi és egy szubgenomi egyszálú RNS
molekula van. A cucumovirusoknál legalább két szubgenomi RNS van. Az RNS1 és RNS2 külön
partikulumokban, az RNS3 és RNS4 (szubgenomi) egy víruspartikulumban található. Az Alfamovirus
nemzetség (részben az Ilarvirus nemzetség is) virionjai többnyire bacilus formájúak, 30–57 nm hosszúságúak és
A vírusok osztályozása és
rendszertana
11 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
18 nm átmérőjűek. A virion RNS-tartalma 14–15%, a köpenyfehérje molekulatömege 20–26 × 103. A
köpenyfehérje gyengén immunogén. A nemzetségek között szerológiai rokonság nincs.
A Bromovirus és a Cucumovirus nemzetségekbe tartozó vírusok szűk gazdanövénykörrel rendelkeznek [kivételt
képez a Cucumovirus nemzetségbe tartozó uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus)], ezek
gazdanövényei több mint ezer növényfajra terjednek ki. Az Alfamovirus gazdanövényköre tág, az ilarvirusok
főleg a fás növényekre patogének.
A Bromoviridae család tagjai mechanikailag átvihetők. A Cucumovirus és Alfamovirus nemzetség fajai nem-
perzisztens módon levéltetvekkel terjednek. Az ilarvirusok számos gazdanövény magjával és pollennel, a
bromovirusok közül egyesek bogárvektorokkal, mások levéltetvekkel és fonálférgekkel terjednek. A
Bromoviridae családba és az egyes nemzetségekbe tartozó legismertebb és legjelentősebb növénypatogén
vírusok az alábbiak: lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), dohány csíkosság vírus (tobacco streak
ilarvirus), uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) (4. ábra).
4. ábra - A: az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus)
elektronmikroszkópos képe (29 nm, 127 000-szeres nagyítás); B: az uborka mozaik
vírus szisztemikus tünete Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc növényen; C: Cucumis
sativus növény levelén
Az Oleavirus nemzetség a Bromoviridae család újabb nemzetségeként vált ismertté (Martelli és Grieco, 1997).
A monotípusos nemzetség tagja az olajfa látens vírus 2 (olive latent 2 oleavirus), amely korábban az Ourmia
nemzetség tagjaként volt ismert. A vírus mechanikailag könnyen átvihető, de levéltetvekkel nem terjed. Az
izometrikus, ill. bacillus alakú virionok mérete 37–55 × 18 nm. A vírus 19% egyszálú RNS-t és 81% fehérjét
tartalmaz. A Chenopodium quinoa és a Gomphrena globosa diagnosztikailag a legismertebb növény a vírus
kimutatására. A vírus fenntartására legalkalmasabb növény a Nicotiana benthamiana.
Bunyaviridae család
Bunyavirus nemzetség
A vírusok osztályozása és
rendszertana
12 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Hantavirus nemzetség
Nairovirus nemzetség
Phlebovirus nemzetség
Tospovirus nemzetség
A virionok morfológiai tulajdonságai eltérőek az öt nemzetségben, de általában izometrikusak (vagy változó
alakúak) és 80–120 nm nagyságúak. A virion molekulatömege 300–400 × 106. A virionok magas
hőmérséklettel, detergensekkel és formaldehiddel szemben igen érzékenyek. A virionban negatív vagy
ambiszensz jellegű egyszálú RNS-ek vannak. A családba tartozó összes vírus négy strukturális fehérjét
tartalmaz [2 külső glikoprotein (G1 és G2), nukleokapszid protein (N) és egy nagy transzkriptáz protein (L)].
A Bunyaviridae családban gerinceseket, gerincteleneket és növényeket fertőző vírusok egyaránt megtalálhatók.
A Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus és Phlebovirus nemzetségekben növénypatogén vírus nem ismert. A
Tospovirus nemzetségbe tartozó vírusok növényekben is szaporodnak. A Tospovirus nemzetségbe tartozó típus
vírus a paradicsom bronzfoltosság vírus [syn.: paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus)]
(5. ábra), amelynek mintegy 82 növénycsaládba tartozó 800 gazdanövénye ismert. A Tospovirus nemzetségbe
tartozó vírusok (12 vírusfaj) nyolc tripszfajjal terjednek (2. táblázat).
5. ábra - A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus)
partikulumainak elektronmikroszkópos képe [D. Peters szívessége folytán]
2. táblázat - Tospovirusok átvitelében szerepet játszó vektorok
A vírusok osztályozása és
rendszertana
13 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tospovirusok Vektorok1
A B C D E F G H
Paradicsom bronzfoltosság
(tomato spotted wilt) + + + + + +
Paradicsom klorotikus
foltosság (tomato chlorotic
spot) + +
+
Földimogyoró
gyűrűsfoltosság (groundnut
ringspot) + +
Impatiens nekrotikus
foltosság (Impatiens
necrotic spot) +
+
Földimogyoró
rügynekrózis (groundnut
bud necrosis)
+
Görögdinnye
ezüstfoltosság (watermelon
silver mottle)
+
Dinnye foltos hervadás
(melon spotted wilt)
+
Chrysanthemum
szárnekrózis
(Chrysanthemum stem
necrosis)
ni ni ni ni ni ni ni ni
Cukkini letális klorózis
(zucchini lethal chlorosis) ni ni ni ni ni ni ni ni
Iris sárga foltosság
(Iris yellow spot) +
+
Földimogyoró klorotikus
foltosság (peanut chlorotic
fan-spot)
+
Görögdinnye rügynekrózis
(watermelon bud necrosis) ni ni ni ni ni ni ni ni
1 A = Frankliniella occidentalis, B = F. schulzei, C = F. fusca, D = F. intonsa, E = Thrips tabaci, F = T. setosus,
G = T. palmi, H = Scirtothrips dorsalis, ni = nem ismert (vö.: Brunt et al., 1996a; Peters és Goldbach 1998).
A vírusok osztályozása és
rendszertana
14 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Feltehetően a Bunyaviridae családba tartozik még hét csoportba tartozó 19 vírus és 22, csoportba nem sorolható
vírus; ezek pontos rendszertani helye még nem ismert.
Closteroviridae család
Closterovirus nemzetség
Crinivirus nemzetség
A Closteroviridae családra vonatkozó ismeretek az elmúlt néhány évben jelentősen megszaporodtak. A családba
tartozó tipikus vírusokra általában jellemző, hogy az erősen flexibilis, helikális szimmetriájú virionok mérete
extrém nagy (1200–2000 nm × 12 nm) és levéltetvekkel átvihetők (Agranovsky, 1996). Ismert poloskákkal
terjedő closterovirus [cukornád enyhe mozaik vírus (sugarcane mild mosaic closterovirus)] is (Murphy et al.,
1995). A virion lineáris, egyszálú RNS-t tartalmaz, amely a virion tömegének 5–6%-a, a köpenyfehérje
molekulatömege 23–28 × 103. A virion mérsékelten immunogén. Az újabb kutatások során vált ismertté, hogy a
Closteroviridae családba tartozó atipikus vírusok a floemben lokalizálódnak, rövid virionokkal (700–800 nm)
rendelkeznek és molytetvekkel (liszteskékkel) terjednek (Agranovsky, 1996). Az említett tulajdonságok alapján
a Closteroviridae család két nemzetségbe (Closterovirus, Crinivirus) sorolható (Dolja et al., 1994; Wisler et al.,
1998a).
A Closterovirus nemzetségbe tartozó vírusok egykomponensűek és levéltetvekkel terjednek. A Closterovirus
nemzetség típustagja a répa sárgaság vírus (beet yellows closterovirus), amely a levéltetűvel történő átvitelen
kívül mechanikailag nehezen, maggal és pollennel pedig nem terjed. A flexibilis virionok mérete 1250 × 10 nm
(6. ábra). A virion 5% egyszálú RNS-t tartalmaz. A vírus gazdanövényköre szűk. Diagnosztikai növénye a
Chenopodium quinoa. A vírus fenntartására legalkalmasabb növény a Beta vulgaris. A Closterovirus
nemzetségbe feltételesen tartozó, levéltetvekkel terjedő vírusok a következők: citrus tristeza vírus (citrus tristeza
closterovirus), a Dendrobium érnekrózis vírus (Dendrobium vein necrosis closterovirus?) és a Heracleum vírus
6 (Heracleum 6 closterovirus?) (Murphy et al., 1995).
6. ábra - A répa sárgaság vírus [beet yellows closterovirus (1250 nm × 10 nm)]flexibilis
partikulumai [J. Brandes szívessége folytán]
A Crinivirus nemzetségbe tartozó vírusok kétkomponensűek és molytetvekkel terjednek. A Crinivirus
nemzetség legjobban ismert tagja (típustag) a saláta fertőző sárgaság vírus (lettuce infectious yellows
crinivirus), amely széles gazdanövénykörrel (15 növénycsalád 45 faja) rendelkezik és Bemisia tabaci
molytetvekkel (A-biotípus) szemiperzisztens módon terjed (Duffus et al., 1986). Diagnosztikai és propagatív
A vírusok osztályozása és
rendszertana
15 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
gazdanövényei közül legismertebb a saláta (Lactuca sativa) és a Nicotiana clevelandii. A flexibilis virionok
egyszálú RNS-t tartalmaznak. A vírus gazdasági jelentősége igen nagy. Az Amerikai Egyesült Államok dél-
nyugati területein salátában, uborkában és cukorrépában okozott évi termésveszteség 20 millió dollárra
becsülhető (Duffus et al., 1986). A Crinivirus nemzetségbe – ismereteink szerint – a típustagon kívül még 6
rendes tag [répa álsárgaság vírus (beet pseudo yellows crinivirus), uborka klorotikus foltosság vírus (cucumber
chlorotic spot crinivirus), tök sárga törpülés rendellenesség vírus (cucurbit yellow stunting disorder crinivirus),
saláta klorózis vírus (lettuce chlorosis crinivirus), paradicsom fertőző klorózis vírus (tomato infectious chlorosis
crinivirus), paradicsom klorózis vírus (tomato chlorosis crinivirus)] és 4 feltételezett tag [édesburgonya
klorotikus törpülés vírus (sweet potato chlorotic stunt ? crinivirus), Abutilon sárgaság vírus (Abutilon yellows ?
crinivirus), uborka sárgaság vírus (cucumber yellows ? crinivirus), Diodia érklorózis vírus (Diodia vein
chlorosis ? crinivirus), sárgadinnye sárgaság vírus (muskmelon yellows ? crinivirus)] tartozik. A paradicsom
fertőző klorózis vírus és a legújabban leírt paradicsom klorózis vírus sok tulajdonságban hasonlít egymáshoz (a
virionok hosszúsága 800–850 nm, a virionok a floem szövetekben helyezkednek el, citoplazmahólyagocskák
képződése, a két nem homológ RNS enkapszidációja, szekvencia-azonosság), de a vektorfajok tekintetében
eltérések vannak közöttük (Wisler et al., 1998b). A paradicsom fertőző klorózis vírus csak a Trialeurodes
vaporariorummal, a paradicsom klorózis vírus pedig 4 molytetűfajjal vihető át: Trialeurodes vaporariorum, T.
abutilonea, Bemisia tabaci (A és B biotípus = ? B. argentifolii).
1991 óta nyolc újabb, molytetvekkel terjedő vírust írtak le, ami feltehetően arra vezethető vissza, hogy pl.
Kaliforniában 1970–1990 között a Bemisia tabaci populációja az 1600-szorosára növekedett. Ennek oka
ismeretlen, de feltételezhetően a globális felmelegedésre, a szintetikus, szerves inszekticidek használata
következtében fellépő vegyszer-rezisztenciára és a nemzetközi szaporítóanyag-csere megnövekedésére
vezethető vissza (Cohen et al., 1992; Wisler et al., 1998a).
Comoviridae család
Comovirus nemzetség
Fabavirus nemzetség
Nepovirus nemzetség
A burok nélküli virionok átmérője 28–30 nm. A hőstabil virionok szerves oldószerekkel szemben is ellenállóak.
A vírusrészecskék molekulatömege 3,2–3,8 × 106. A genom a lineáris, pozitív egyszálú RNS két típusát
tartalmazza. Mindkét RNS-re szükség van a fertőzés létrejöttében. Az RNS-ek mérete eltér az egyes
nemzetségekben. A Nepovirus RNS1 = 7,2–8,4 kb, RNS2 = 3,9–7,2 kb, Fabavirus és Comovirus RNS1 = 5,9–
7,2 kb, RNS2 = 3,5–4,5 kb. A Comovirus és Fabavirus nemzetség fajai két köpenyfehérjét (molekulatömege =
40–43 × 103 és 22–27 × 103), a Nepovirus nemzetség tagjai egyféle köpenyfehérjét tartalmaznak (55–60 × 103).
A Comovirus nemzetség tagjai jó immunogének. A nemzetségen belül az egyes tagok szerológiailag gyakran
távoli rokonságot mutatnak. A Comovirus nemzetség tagjainak gazdanövényköre szűk, míg a Fabavirus és
Nepovirus nemzetség fajai tág gazdanövénykörrel rendelkeznek. A Comoviridae család nemzetségeinek eltérő
vektoraik vannak: a Comovirus nemzetség tagjai bogárvektorokkal [Ceratoma spp., Diabrotica spp.: tehénborsó
mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus)], a Fabavirus nemzetség tagjai levéltetvekkel [Aphis spp., Myzus spp.:
lóbab hervadás vírus (broad bean wilt fabavirus)], a Nepovirus nemzetség több tagja fonálférgekkel [Longidorus
spp., Xiphinema spp.: dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus)] és pollennel terjednek.
A Comovirus nemzetség típustagja a tehénborsó mozaik vírus, amelyhez még 15 állandó vírusfaj tartozik. A
Fabavirus nemzetség típustagja a lóbab hervadás vírus. A nemzetségbe 3 további rendes vírusfaj tartozik. A
Nepovirus nemzetség típustagja a dohány gyűrűsfoltosság vírus. Ide tartozik még 28 állandó és 8 feltételezett
vírusfaj.
Geminiviridae család
Bigeminivirus nemzetség (újabb neve: Begomovirus nemzetség)
Hybrigeminivirus nemzetség (újabb neve: Curtovirus nemzetség)
Monogeminivirus nemzetség (újabb neve: Mastrevirus nemzetség)
Ikerpartikulumú virionokkal (18 × 30 nm) rendelkeznek, amelyekben a genom cirkuláris (kör alakú), egyszálú
DNS molekulákból áll. A családon belüli felosztás alapja az, hogy az ikervirionok egyféle (Monogeminivirus),
A vírusok osztályozása és
rendszertana
16 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
két különböző (Bigeminivirus) vagy két egymáshoz hasonló (Hybrigeminivirus) szekvenciájú DNS-t
tartalmaznak. A virion egyszerű strukturális fehérjeköpenyt tartalmaz (molekulatömege 28–34 × 103). A
Geminiviridae családba tartozó vírusnemzetségek elnevezésében jelentős változások történtek az utóbbi évben
(Pringle, 1998).
A Bigeminivirus (újabban Begomovirus) nemzetségbe 49 állandó vírusfaj [típustag = bab aranysárga mozaik
vírus (bean golden mosaic begomovirus)] és 9 feltételezett vírusfaj tartozik (Murphy et al., 1995; Polston és
Anderson, 1997). A fehérlegyekkel átvihető begomovirusok cirkuláris, egyszálú, egykomponensű vagy
kétkomponensű DNS-ből állnak. A nemzetségbe tartozó vírusfajok szerológiailag viszonylag szoros
kapcsolatban vannak. A Begomovirus nemzetség fajai szűk gazdanövénykörrel rendelkeznek és kétszikű
növényeket fertőznek. A vírusok Bemisia tabaci vektorokkal terjednek. Néhány vírus mechanikailag is átvihető
[pl. bab törpülés mozaik vírus (bean dwarf mosaic begomovirus)]. A Begomovirus nemzetség új tagja a
fehérlegyekkel (Bemisia tabaci, A-biotípus) perzisztens módon terjedő, Mexikóban (Sinaloa) izolált Sinaloa
paradicsom levélgöndörödés vírus (Sinaloa tomato leaf curl begomovirus) (Brown et al., 1993; Idris és Brown,
1998). A Solanaceae és Malvaceae családba tartozó néhány növényfajban mutatták ki. A vírus mechanikailag
nehezen átvihető Nicotiana benthamiana növényre. A paradicsom levélgöndörödés vírus (tomato leaf curl
bigeminivirus) – amely újabb nemzetségnéven (Begomovirus) vált ismertté – jelenleg a kutatások középpontjába
került azáltal, hogy vele kapcsolatban először sikerült szatellit DNS-t (sat-DNS; 682 nt cirkuláris DNS)
kimutatni (Dry et. al., 1998).
A Hybrigemini (újabban Curtovirus) nemzetségbe egy állandó vírusfaj [típustag = répa levélcsúcs fodrosodás
vírus (beet curly top curtovirus)] és két feltételezett növénypatogén vírus tartozik. A répa levélcsúcs fodrosodás
vírus gazdanövényköre széles (44 növénycsalád 300 faja). A nemzetségbe tartozó fajok viszonylag szoros
szerológiai rokonságot mutatnak. A répa levélcsúcs fodrosodás vírus terjedése Circulifer spp. kabócafajokkal, a
paradicsom ál-levélgöndörödés vírus (tomato pseudo-curly top hybrigeminivirus) terjedése Micrutalis
kabócafajokkal történik.
A Monogeminivirus (újabban Mastrevirus) nemzetségbe tartozó típustag [kukorica csíkosság vírus (maize streak
mastrevirus)] szűk gazdanövénykörrel rendelkezik, ami a Gramineae családba tartozó növényekre terjed ki. A
vírus kabócákkal (Cicadulina spp.), cirkulatív, nem propagatív módon terjed. E nemzetségbe tartozó
növénypatogén vírusok mechanikailag nem vihetők át.
Luteoviridae család
Luteovirus nemzetség
Polerovirus nemzetség
Enamovirus nemzetség
A luteovirusok osztályozásával Smith és Baker (1999), valamint Mayo és D‟Arcy (1999) legújabb munkái
foglalkoznak. Ezek a tanulmányok a könyv kéziratának leadása után jelentek meg és a Luteoviridae új
víruscsalád tulajdonságait és rendszerbe foglalását tartalmazzák. E könyvben a luteovirusokkal a Luteovirus
nemzetség ismertetésénél foglalkozunk.
Partitiviridae család
Alphacryptovirus nemzetség
Betacryptovirus nemzetség
Chrysovirus nemzetség
Partitivirus nemzetség
Az izometrikus virionok 30–40 nm átmérőjűek. A virionok butanolban és kloroformban stabilak. A virionok
két, nem hasonló, lineáris, kétszálú RNS-t tartalmaznak. A virionok jó antigén tulajdonsággal rendelkeznek.
A Partitiviridae családba tartozó vírusok között gombákat és növényeket fertőző vírusok vannak. A Partitivirus
és a Chrysovirus nemzetségbe tartozó vírusok gombapatogének. Az Alphacryptovirus és Betacryptovirus
nemzetségbe tartozó vírusok növényekre patogének. Az Alphacryptovirus nemzetség típustagja a fehérhere
rejtett vírus 1 (white clover 1 alphacryptovirus), amely mechanikailag, maggal és pollennel terjed. A
A vírusok osztályozása és
rendszertana
17 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
vírusnemzetségbe 16 állandó és 10 feltételezett vírusfaj tartozik. A Betacryptrovirus nemzetség típustagja a
fehérhere rejtett vírus 2 (white clover 2 betacryptovirus), amely mechanikailag nem, de maggal átvihető. A
vírusnemzetségbe 4 állandó vírusfaj és 1 feltételezett vírusfaj tartozik.
Potyviridae család
Bymovirus nemzetség
Potyvirus nemzetség
Rymovirus nemzetség
Ipomovirus feltételezett nemzetség
Macluravirus feltételezett nemzetség
A családra jellemző hajlékony fonál alakú virionok 11–15 nm átmérőjűek, hosszúságuk az egyes
nemzetségekben azonban eltérő. Az Ipomovirus, Potyvirus, Rymovirus és Macluravirus nemzetségbe tartozó
vírusfajok hosszúsága 900, 750, 700, ill. 650 nm. A Bymovirus nemzetség osztott virionjainak hosszúsága 250–
300, ill. 500–600 nm. A Potyvirus és Rymovirus nemzetség vírusfajai egyszálú, lineáris RNS-t tartalmaznak,
míg a Bymovirus nemzetség tagjainak genomja két egyszálú RNS-ből áll. A virion köpenyfehérje-
molekulatömege 30–40 × 103. A virionok 5% nukleinsavat és 95% fehérjét tartalmaznak. A család tagjai
mérsékelten immunogének, és szerológiailag rokonság van a tagok között. A Potyviridae család tagjaira
jellemző, hogy a fertőzött növényekben intracelluláris, hengeres, forgókerék, ill. szélkerék formájú zárványokat
(pinwheels) képeznek. A gazdanövénykörök nagysága tekintetében eltérések vannak az egyes vírusfajok között.
Mechanikailag könnyen átvihetők, egyes vírusok maggal is terjednek. A Potyvirus nemzetség fajai nem
perzisztens módon levéltetvekkel (pl. Myzus persicae), a Rymovirus nemzetség fajai levélatkákkal (pl. Abacarus
hystrix), a Bymovirus nemzetség fajai gombával (Polymyxa graminis) terjednek.
A Potyviridae család két feltételezett nemzetsége közül az Ipomovirus nemzetség két tagja [édesburgonya enyhe
foltosság vírus (sweet potato mild mottle ipomovirus) és édesburgonya sárga törpülés vírus (sweet potato yellow
dwarf ipomovirus)] molytetvekkel terjed. A feltételezett Macluravirus nemzetség tagjai [Maclura mozaik vírus
(Maclura mosaic macluravirus) és a Narcissus látens vírus (Narcissus latent macluravirus)] nem perzisztens
módon levéltetvekkel terjednek.
A Potyviridae családba mintegy 184 vírusfaj tartozik, amelyből 85 vírusfaj állandó tag és 99 feltételezett tag
(Potyvirus 75/93, Rymovirus 5/2, Bymovirus 5/0, Ipomovirus 2/0, Macluravirus 2/0). Az egyes nemzetségek
típustagjai az alábbiak: Potyvirus nemzetség [burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) (7A ábra), Rymovirus
nemzetség [angolperje mozaik vírus (ryegrass mosaic rymovirus), Bymovirus nemzetség [árpa sárga mozaik
vírus (barley yellow mosaic bymovirus)], feltételezett Ipomovirus nemzetség [édesburgonya enyhe foltosság
vírus (sweet potato mild mottle ipomovirus)], feltételezett Macluravirus nemzetség [Maclura mozaik vírus
(Maclura mosaic macluravirus)].
7. ábra - A: a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) elektronmikroszkópos képe (730
nm x 11 nm); B: a rizs törpülés vírus (rice dwarf phytoreovirus) kabócavektora
(Nephotettix cincticeps); C: a rizs törpülés vírus tünete rizsnövény levelén [F. Nakasuyi
szívessége folytán]
A vírusok osztályozása és
rendszertana
18 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Stenger et al. (1998), valamint Choi et al. (1999) újabb molekuláris és filogenetikai analízis vizsgálatai alapján a
búza csíkos mozaik vírus (wheat streak mosaic rymovirus) és a rozsnok csíkos mozaik vírus (brome streak
mosaic rymovirus) nem a Potyviridae család Rymovirus nemzetségébe, hanem egy újonnan javasolt
nemzetségbe, a Tritimovirus nemzetségbe sorolandó.
Reoviridae család
Aquareovirus nemzetség
Coltivirus nemzetség
Cypovirus nemzetség
Fijivirus nemzetség
Orbivirus nemzetség
Orthoreovirus nemzetség
Oryzavirus nemzetség
Phytoreovirus nemzetség
Rotavirus nemzetség
A virionok felépítése ikozaéder, alakjuk szférikus. Általában 60–80 nm átmérőjűek és kettős fehérjeburokkal
rendelkeznek. A virion molekulatömege 120 × 106. Lineáris, kétszálú RNS-t tartalmaznak. A virion 15–20%-a
RNS, 80–85%-a fehérje. A vírusok antigén tulajdonsága csoportspecifikus. Az egyes nemzetségek között nincs
szerológiai rokonság. A gazdafogékonyság tekintetében különbség van a nemzetségek között. Egyes vírusok
(orthoreovirusok, rotavirusok) csak gerincesekben, mások ízeltlábúakban és gerincesekben is szaporodnak
(orbivirusok, coltivirusok). A Cypovirus nemzetségbe rovarpatogén vírusok, az Aquareovirus nemzetségbe
főleg édes- és tengervízi halakat fertőző vírusok tartoznak. A növénypatogén vírusok (Fijivirus, Oryzavirus,
Phytoreovirus) növényekben és ízeltlábúakban szaporodnak.
A Fijivirus nemzetség típus tagja a Fiji betegség vírus (Fiji disease fijivirus), amely mechanikailag nehezen, de
kabócákkal (Laodelphax spp., Javasella spp., Sogatella spp.) könnyen átvihető; áttelelése a diapauzában levő
kabócákban és néhány vad növényfajban történik. A nemzetségbe 5 állandó vírusfaj tartozik.
Az Oryzavirus nemzetség típustagja a rizs érdes törpülés vírus (rice ragged stunt oryzavirus), amely a
Gramineae növényekre patogén, és kabócákkal (pl. Nilaparvata lugens) terjed. A nemzetségbe két rendes
vírusfaj tartozik.
A Phytoreovirus nemzetség típustagja a here seb tumor vírus (clover wound tumor phytoreovirus). A vírus
mindenekelőtt a kétszikű növényekre patogén, és kabócákkal (Agallia spp., Agalliopsis spp., Nephotettix spp.)
terjed. A vírus mechanikailag nem vihető át. A nemzetségbe két vírusfaj tartozik [pl. rizs törpülés vírus (rice
dwarf phytoreovirus)] (7B,C ábra). A vírus beteg növények magjával nem terjed.
Rhabdoviridae család
Cytorhabdovirus nemzetség
Ephemerovirus nemzetség
Lyssavirus nemzetség
Nucleorhabdovirus nemzetség
Vesiculovirus nemzetség
A virionok mérete 100–430 nm hosszúságú és 45–100 nm átmérőjű. A defektív vírusrészecskék mérete
arányosan kisebb lehet. A Vesiculovirus nemzetségbe tartozó vírusfajok állatpatogének (emlősök, halak,
rovarok). Ide tartozik az egyik legrégebb óta ismert sertés vírusbetegség, a hólyagos szájgyulladás vírus
(vesicular stomatitis vesiculovirus). A Lyssavirus nemzetség vírusfajai szintén állatokra patogének.
A vírusok osztályozása és
rendszertana
19 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Legismertebbek a nyulakat megbetegítő vírus (rabies lyssavirus) és az európai denevér vírus (European bat
lyssavirus). Ezek az állatok jelentős szerepet játszanak a fertőző nyállal háziállatokra (kutya) és vadon élő
állatokra terjedő lyssavirusok átvitelében. Az Ephemerovirus nemzetségbe tartozó vírusok állatpatogének
(viziló, szarvasmarha). Főleg a trópusokon és szubtropikus övezetekben fordulnak elő. A vírusok átvitelében
(terjedésében) az ízeltlábúak játszanak fontos szerepet; a vírusokat szúnyogokból is sikerült izolálni.
A Rhabdoviridae család két nemzetsége (Cytorhabdovirus, Nucleorhabdovirus) növénypatogén. Elnevezésüket
a vírus kialakulási helye szerint különböztették meg. A citoplazmában kialakuló Cytorhabdovirus nemzetség
típustagja a saláta nekrotikus sárgaság vírus (lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus). Ide tartozik még 8
állandó vírusfaj. Általában levéltetvekkel (pl. Hyperomyzus lactucae) terjednek (pl. saláta nekrotikus sárgaság
vírus), de ismertek kabócákkal (pl. Laodelphax striatellus) terjedő vírusok is [árpa sárga csíkos mozaik vírus
(barley yellow striate mosaic cytorhabdovirus)].
A sejtmagban replikálódó növénypatogén vírusnemzetség a Nucleorhabdovirus nemzetség. Típustagja a
burgonya sárga törpülés vírus (potato yellow dwarf nucleorhabdovirus). Ide tartozik a Pittosporum érsárgulás
vírus (Pittosporum vein yellowing nucleorhabdovirus) (8. ábra) és még 6 állandó vírusfaj. Ismertek közöttük
levéltetvekkel terjedők [csorbóka sárgaerűség vírus (sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus) (9. ábra), és
kabócákkal terjedők (burgonya sárga törpülés vírus)]. A Rhabdoviridae családba tartozik még mintegy 60
rovarpatogén és 61 növénypatogén rhabdovirus; ezek pontos rendszertani helye azonban még nem ismert.
Sequiviridae család
Sequivirus nemzetség
Waikavirus nemzetség
8. ábra - A: Pittosporum érsárgulás vírussal (Pittosporum vein yellowing
nucleorhabdovirus) természetes úton fertőződött Pittosporum tobira növény levele; B:
egészséges növény
A vírusok osztályozása és
rendszertana
20 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
9. ábra - A csorbóka sárgaerűség vírus (sowthistle yellow vein nucleorhabdovirus)
lövedékszerű partikulumai (230 nm × 100 nm) [D. Peters szívessége folytán]
A vírusok osztályozása és
rendszertana
21 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A virion izometrikus, 30 nm átmérőjű. A virion 40% pozitív, egyszálú RNS-t és három fő fehérjét tartalmaz
(CP1, 32 × 103; CP2, 26 × 103; CP3, 23 × 103). Jó immunogén, a poliklón antiszérum tartalmazza az összes
ellenanyagot a virion proteinjeivel szemben. A családba tartozó növénypatogén vírusok gazdanövényköre szűk.
A vírusok szemiperzisztens módon levéltetvekkel (Sequivirus nemzetség vírusfajai) vagy kabócákkal terjednek
(Waikavirus nemzetség vírusfajai). A vírusátvitelhez ún. segítő (helper) proteinre (Waikavirus), vagy a segítő,
helper vírus (Sequivirus) átkódolására van szükség. Mechanikailag, maggal és pollennel nem terjednek. A
Sequivirus nemzetség típustagja a paszternák sárga foltosság vírus (parsnip yellow fleck sequivirus), amely
mechanikailag és levéltetvekkel (Cavariella spp.) szemiperzisztens módon átvihető (10. ábra). A nemzetségbe
három állandó vírusfaj tartozik. A Waikavirus nemzetség típustagja a rizs tungro szférikus vírus (rice tungro
spherical waikavirus), amely szemiperzisztens módon kabócákkal (pl. Nephotettix virescens) terjed. Segítő
(helper) vírus [rizs tungro bacilus alakú vírus (rice tungro bacilliform badnavirus)] a vírusátvitelt megkönnyíti
(Druka és Hull, 1998). A Waikavirus nemzetségbe három állandó vírusfaj tartozik.
10. ábra - A paszternák sárga foltosság vírus (parsnip yellow fleck sequivirus)
izometrikus partikulumai (31 nm) [A.F. Murant szívessége folytán]
A vírusok osztályozása és
rendszertana
22 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A kukorica klorotikus törpülés vírus (maize chlorotic dwarf waikavirus) szekvenciaanalízise alapján
hasonlóságot mutat a Sesquiviridae, Comoviridae és Potyviridae családok néhány vírusfajával. A
genomszerveződés alapján a vírus a Sesquiviridae család Waikavirus nemzetségébe tartozik (Reddick és Habera,
1997).
Tombusviridae család
Carmovirus nemzetség
Dianthovirus nemzetség (újabb nemzetség)
Machlomovirus nemzetség
Necrovirus nemzetség
Tombusvirus nemzetség
A Tombusviridae családba tartozó vírusfajok virionjai ikozaéder szimmetriájúak, 180 fehérjealegységből állnak
és 30 nm átmérőjűek. A virionok hőstabilak (a hőinaktiválási pont 80 °C felett van). A virion molekulatömege
8,2–8,9 × 106. A virion pozitív, lineáris, egyszálú, 4,7 kb nagyságú RNS-t tartalmaz. A fertőzött sejtekben a
genomi RNS-en kívül két kisebb, ún. szubgenomi RNS van jelen. Defektív interferáló (DI) és szatellit RNS-ek
előfordulása ismert. A DI RNS erősen gátolja a helper vírus (segítő vírus) replikációját a növényben, aminek
jelentős tünetcsökkentő hatása van. A DI és a szatellit RNS-ek csak helper vírus jelenlétében képesek
replikációra.
Az egyes vírusfajok természetes gazdanövényköre viszonylag szűk, és főleg a kétszikű növényekre terjed ki. A
mesterséges gazdanövények köre kiterjedt. A Tombusviridae családba tartozó vírusfajok mechanikailag
könnyen átvihetők, egyesek közülük maggal is terjednek. A vektorok között megtalálható az Olpidium spp.
gomba [uborka levélfoltosság vírus (cucumber leaf spot carmovirus)] és bogárvektor (Diabrotica spp.) is [bab
enyhe mozaik vírus (bean mild mosaic carmovirus). Természetes vizekből is kimutathatók [paradicsom bokros
törpülés vírus (tomato bushy stunt tombusvirus)].
A Carmovirus nemzetség típustagja a szegfű foltosság vírus (carnation mottle carmovirus). Vektora nem ismert.
Az állandó tagok száma 12, a feltételezett tagok száma 7. A Tombusvirus nemzetség típustagja a paradicsom
bokros törpülés vírus. Az állandó tagok száma 13; feltételezett tag nem ismert.
A vírusok osztályozása és
rendszertana
23 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A Tombusviridae családba a korábban ismert két nemzetségen (Carmovirus, Tombusvirus) kívül három újabb
nemzetséget (Dianthovirus, Machlomovirus, Necrovirus) soroltak. A Dianthovirus nemzetség típustagja a
szegfű gyűrűsfoltosság vírus (carnation ringspot dianthovirus). A Machlomovirus nemzetségnek egyetlen tagja
ismert [kukorica klorotikus foltosság vírus (maize chlorotic mottle machlomovirus)]. Az ikozaéder típusú virion
30 nm átmérőjű, részletes struktúrája nem ismert. A virion lineáris, pozitív, egyszálú RNS. A fehérje
molekulatömege 25,1 × 103. A virion 18% nukleinsavat és 82% fehérjét tartalmaz. Mechanikailag és maggal
terjed. A vírus ún. Kansas- és Nebraska-izolátumai bogárvektorokkal (Diabrotica spp.) kísérleti úton átvihetőek.
A Hawai-izolátum tripszekkel terjed. A vírus természetes gazdája a Zea mays L. Kísérleti gazdanövényei között
a Zea mays (hibridek) és a Triticum aestivum a legjelentősebb. Hasonlóság figyelhető meg a Tombusviridae
családba tartozó nemzetségek (Machlomovirus, Necrovirus, Luteovirus, valamint a Sobemovirus) között
(Lesemann, 1998). A Necrovirus nemzetségbe tartozó vírusok ikozaéder szimmetriájúak és megközelítőleg 28
nm átmérőjűek. A virionnal kapcsolatos szatellit vírus 16,8 nm átmérőjű. A virion molekulatömege 7,6 × 106
(szatellit vírus, 1,64 × 106). A virion lineáris, pozitív egyszálú RNS. A köpenyfehérje molekulatömege 29–30 ×
103.
A Necrovirus nemzetség tagjai mérsékelten immunogének, széles gazdanövénykörrel rendelkeznek, az egy- és
kétszikű növényekre egyaránt kiterjednek. Mechanikailag és talajban élő gombával (Olpidium brassicae)
terjednek.
A Necrovirus nemzetség típustagja a dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) (Pringle, 1998). A
vírus (tobacco necrosis necrovirus) 19% nukleinsavat és 81% fehérjét tartalmaz. Gazdanövényköre közepesen
kiterjedt. Természetes fertőzések során a gazdanövények gyökérrendszerét károsítja. Kísérleti gazdanövényein
(Phaseolus vulgaris, Vigna spp., Nicotiana spp., Solanum spp., Datura spp., Ocimum spp.) nekrotikus léziókat
okoz (11. ábra). Szisztemikus fertőzés igen ritkán fordul elő [kivételt képez a vírus ún. bab rajzos mintázatú
törzse (bean stipple streak strain)].
11. ábra - A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) helyi (lokális)
nekrózisokat idéz elő a növényeken; A: Nicotiana glutinosa; B: Datura innoxia; C:
Solanum ochroleucum; D: Ocimum gratissimum
A Necrovirus nemzetségbe három rendes és két feltételezett vírusfaj tartozik. A 30 nm átmérőjű, RNS-tartalmú,
3662 nukleotidát és öt nyitott olvasási keretet (open reading frame, ORF) tartalmazó, mechanikailag átvihető,
szűk gazdanövénykörrel rendelkező póréhagyma fehér csíkos vírus (leek white stipe necrovirus) a Necrovirus
nemzetség legújabban leírt tagja (Lot et al., 1996). A polimerázok (ORF I, ORF II) a szekvenciahasonlóság
magas fokát mutatják a Tombusviridae család nemzetségeinek (Necrovirus, Tombusvirus, Carmovirus,
Dianthovirus, Machlomovirus) vírusfajaival.
A Tombusviridae család eddig ismert öt nemzetségét újabban kiegészítették egy 6. nemzetséggel is, amelyet
Auereusvirus nemzetségnek neveztek el (Martelli et al., 1998). Ide tartozik a Pothos látens vírus (Pothos latent
aureusvirus) és a korábban Carmovirus nemzetségbe sorolt uborka levélfoltosság vírus (cucumber leaf spot
aureusvirus).
3. A vírusnemzetségek általános jellemzése
Eddigi ismereteink szerint 34 olyan növénypatogén vírusnemzetség van, amely víruscsaládokba sorolható.
Ezekről a vírusnemzetségekről az előzőekben A víruscsaládok és nemzetségeik általános jellemzése című
A vírusok osztályozása és
rendszertana
24 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
fejezetben számoltunk be. Ismert 24 olyan vírusnemzetség is, amelynek tagjai növényekre patogének;
víruscsaládokba történő besorolásuk folyamatban van. Ezekről a nemzetségekről és típus vírusfajaik
tulajdonságairól az alábbiakban számolunk be.
Badnavirus nemzetség
A virionok bacilus alakúak, párhuzamos oldalakkal és lekerekített végekkel. Általában 130 nm hosszúak és 30
nm szélesek, de a vírusrészecskék hosszúsága 60–900 nm között váltakozhat. A virion kétszálú DNS-t és fő
szerkezeti fehérjét (35–37 × 103) tartalmaz. A virionok közepesen antigének. A poliklón antiszérum-titer elérheti
az 1/128–1/512 értéket. A nemzetségbe tartozó vírusoknak általában szűk gazdanövénykörük van. Elsősorban
vegetatív úton terjednek; egyes vírusok átvitelében a poloskáknak [Planococcoides spp., kakaó duzzadt hajtás
vírus (cacao swollen shoot badnavirus)], a kabócáknak [Nephotettix spp., rizs tungro bacilus alakú vírus (rice
tungro bacilliform badnavirus)] és a levéltetveknek [Aphis fabae, Myzus persicae, Dioscorea bacilus alakú vírus
(Dioscorea bacilliform badnavirus)] van szerepe. Ismertek maggal és/vagy pollennel terjedő badnavirusok is.
A Badnavirus nemzetség típustagja a Commelina sárga foltosság vírus (Commelina yellow mottle badnavirus),
amely kertészeti oltással vihető át, mechanikailag nem terjed. A bacilus alakú virion 133 nm hosszú és 24 nm
széles. A nemzetségbe 10 állandó vírusfaj és 4 feltételezett faj tartozik. A badnavirusok hasonlítanak a genom
típusában (kétszálú DNS) a caulimovirusokhoz, de a genom méretében, a virion morfológiájában, a vektorokban
és a hisztopatológiában különböznek egymástól.
A Badnavirus nemzetséget újabban a Caulimoviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).
Caulimovirus nemzetség
A burok nélküli izometrikus vírusok mérete 50 nm. A virion kétszálú DNS-t tartalmaz. A burokfehérje a
negyedik nyitott olvasási keretből (open reading frame, ORF IV) íródik át és szerveződik köpenyfehérjévé (57 ×
103). Az ORF I leolvasási szakasz felelős a vírus sejtről sejtre történő terjedéséért, az ORF II pedig a levéltetű-
átvitelt segítő faktort kódolja. A vírus immunogén, az egyes vírusfajok között szerológiai rokonság van. A
vírusok gazdanövényköre szűk. Mechanikailag átvihetők, levéltetvekkel szemiperzisztens vagy nem perzisztens
(stylet-borne) módon terjednek.
A Caulimovirus nemzetség típustagja a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) (12A ábra),
amely a mechanikai átvitelen kívül mintegy 25 levéltetű fajjal nem perzisztens módon terjed. A vírus
diagnosztikai és propagatív gazdája a Brassica campestris, a Brassica rapa var. rapa és a Crambe strigosa (12B,
C ábra). A nemzetségbe 11 állandó és 6 feltételezett vírusfaj tartozik. A Caulimovirus – hasonlóan a
Badnavirushoz – olyan vírusnemzetség (2 ilyen növénypatogén vírusnemzetség ismert), amelynek tagjai ún.
fordított transzkripcióval valósítják meg a nukleinsavak szintézisét. A m-RNS-DNS átírását a reverz
transzkriptáz (reserve transcriptase) enzim végzi. A két nemzetség azonban a virion morfológiájában, a
genomszerveződésben, a gazdanövénykörben és a vektorokban különbözik egymástól.
12. ábra - A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) virionjai (A) és
szisztemikus tünetei Brassica rapa var. rapa (B), valamint Crambe strigosa (C)
növényeken
A Caulimovirus nemzetséget újabban a Caulimoviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).
Capillovirus nemzetség
A vírusok osztályozása és
rendszertana
25 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A flexibilis virionok mérete 640 × 12 nm. A virion lineáris, pozitív értelmű, egyszálú RNS, amely a virion
súlyának 5%-a. A virionok közepes antigén tulajdonsággal rendelkeznek. A vírusok gazdanövényköre általában
szűk. Rovarvektorok nem ismertek. Egyes vírusok maggal [alma törzsbarázdáltság vírus (apple stem grooving
capillovirus)], mások oltással [Nandina szár himlő vírus (Nandina stem pitting capillovirus)] vihetők át.
A Capillovirus nemzetség típus vírusfaja a hajlékony (flexibilis), 600–700 nm hoszszúságú és 12 nm szélességű
alma törzsbarázdáltság vírus. Mechanikailag, oltással és maggal terjed. Gazdanövényköre szűk-közepes (kilenc
növénycsalád 20 faja). A vírus izolálására és fenntartására a legjobb növény a Chenopodium quinoa. A
Capillovirus nemzetségbe 3 állandó és 1 feltételezett vírusfaj tartozik. Ezek a vírusok morfológiailag és
aminosav-szekvenciájukban hasonlítanak a closterovirusokhoz és a trichovirusokhoz, de a
genomszerveződésben és a replikációs stratégiájukban eltérnek egymástól.
A Capillovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).
Carlavirus nemzetség
A flexibilis virionok mérete 610–700 nm × 12–15 nm. A virionok lineáris, egyszálú RNS-ből és egyszerű
polipeptidből (31–36 × 103) állnak. A vírusoknak erős immunogén tulajdonsága van. Egyes vírusok szűk, más
vírusok széles gazdanövénykörrel rendelkeznek. A nemzetségbe tartozó vírusok mechanikailag átvihetők.
Általában nem perzisztens módon, levéltetvekkel [burgonya M-vírus (potato M carlavirus), burgonya S-vírus
(potato S carlavirus), vöröshere érmozaik vírus (red clover vein mosaic carlavirus)] (13. ábra) terjednek. Két
feltételezett vírusfaj [cassava barna csíkossággal társult vírus (cassava brown streak-associated carlavirus),
tehénborsó enyhe foltosság vírus (cowpea mild mottle carlavirus)] molytetvekkel (liszteskékkel) terjed (Bemisia
tabaci).
13. ábra - Carlavirusok virionjai. A: burgonya M-vírus (potato M carlavirus, 650 nm ×
12 nm); B: burgonya S-vírus (potato S carlavirus, 650 nm × 12 nm); C: vöröshere
érmozaik vírus (red clover vein mosaic carlavirus, 600-700 nm × 12 nm) [B és C: J.
Brandes szívessége folytán]
A Carlavirus nemzetség típustagja a szegfű látens vírus (carnation latent carlavirus), amely levéltetvekkel
(Myzus persicae) nem perzisztens módon terjed. Mechanikailag átvihető, de maggal nem terjed. A vírus lokális-
léziós gazdája (assay host) a Chenopodium quinoa. A vírus fenntartására legalkalmasabb növény a Dianthus
barbatus. A Carlavirus nemzetségbe 29 állandó vírusfaj és 29 levéltetvekkel, valamint 2 fehérlegyekkel terjedő
feltételezett vírusfaj tartozik.
A Carlavirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).
A vírusok osztályozása és
rendszertana
26 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A carlavirusok vírusreplikációs génje szekvenciahasonlóságot mutat az alphamovirusokhoz, tobamovirusokhoz,
tobravirusokhoz és a furovirusokhoz, de szorosabb homológiát mutat a potex-, a tymo- és a closterovirusokkal
is. A flexibilis Narcissus látens vírust (Narcissus latent macluravirus) korábban a Carlavirus nemzetségbe
sorolták. Újabban kimutatott intracelluláris zárványai (pinwheels), valamint a 103 molekulatömegű
köpenyfehérjéje alapján a Maclura mozaik vírussal (Maclura mosaic macluravirus) mutatott szerológiai
rokonsága miatt a Potyviridae család feltételezett Macluravirus nemzetségébe sorolandó.
Enamovirus nemzetség
A poliéder alakú virionok két különböző méretben (25 nm és 28 nm) fordulnak elő. A vírus két típusú lineáris,
pozitív értelmű RNS-t tartalmaz (RNS1, RNS2). Egyes vírustörzsekben egy harmadik típusú RNS is található
(RNS3). A strukturális fehérjéket az RNS1 típusú nukleinsav kódolja. Az egyes izolátumokban lévő kis fehérjék
(minor protein) – amelyeknek molekulatömege 54 × 103 – összefüggésben vannak a vírus levéltetű-
átvihetőségével. A vírusok közepesen immunogének.
A nemzetségbe tartozó eddig ismert egyetlen vírus (típustag), a borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic
enamovirus) 28% lineáris, egyszálú RNS-t és 72% fehérjét tartalmaz. Gazdanövényköre főleg a Leguminosae
családra terjed ki. A vírus mechanikailag és perzisztens, nem propagatív módon levéltetvekkel terjed.
Figyelemre méltó, hogy a vírus levéltetvekkel történő átvihetősége a mechanikai sorozat-passzázsok
következtében megszűnik. A vektorátvitel hatékonysága egyéb vírus [bab sárga érszalagosodás vírus (bean
yellow vein banding umbravirus)] jelenlétében fokozódik. A vírus legjelentősebb diagnosztikai növénye a
Nicotiana clevelandii. Propagatív gazdája a Pisum sativum, lokális-léziós gazdanövénye a Chenopodium
quinoa.
Az Enamovirus nemzetségnek – amely újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába tartozik
(Pringle, 1998) – eddig egyetlen tagja ismert.
Dianthovirus nemzetség
Az ikozaéder szimmetriájú virionok átmérője 32–35 nm. A virionok teljes (részletes) struktúrája még nem
ismert. A virion pozitív, egyszálú RNS. Molekulatömege 8,6 × 106. A köpenyfehérje molekulatömege 37 × 103.
A nemzetségbe tartozó vírusok mérsékelten immunogének. Természetes gazdanövénykörük közepes, főleg a
kétszikű növényekre terjed ki. Mesterséges gazdanövénykörük széles, főképpen a Solanaceae, a Leguminosae, a
Cucurbitaceae és a Compositae családokat foglalja magában. A Dianthovirus nemzetségbe tartozó vírusok
mechanikailag könnyen átvihetők, maggal, rovarokkal és talajban élő gombákkal nem terjednek. Fonálférgekkel
történő terjedésük kérdéses.
A Dianthovirus nemzetség típustagja a szegfű gyűrűsfoltosság vírus (carnation ringspot dianthovirus), amely
20,5% nukleinsavat és 79,5% fehérjét tartalmaz. A vírus diagnosztikai és propagatív növénye a Phaseolus
vulgaris, Gomphrena globosa, lokális-léziós gazdája a Chenopodium quinoa. A nemzetségbe két rendes és egy
feltételezett vírusfaj tartozik.
A Dianthovirus nemzetséget újabban a Tombusviridae családba sorolták (Pringle, 1998).
A Dianthovirus nemzetségbe tartozó vírusok köpenyfehérje-szekvenciája hasonlóságot mutat a Tombusviridae
Necrovirus és Machlomovirus, valamint a Barnaviridae család Luteovirus nemzetségébe tartozó vírusfajaival.
Furovirus nemzetség
A pálcika alakú virionok általában kétféle méretűek; 92–160 nm, ill. 250–300 nm hoszszúak és 20 nm
átmérőjűek. A nemzetség két feltételes vírusfaja 380–390 nm hosszú. A multikomponensű virionok általában
két lineáris, pozitív, egyszálú RNS-t (RNS1, RNS2) tartalmaznak. Kivételt képez a négy RNS-t tartalmazó répa
nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein furovirus). Az egyszerű burokfehérje molekulatömege
19,7–23,0 × 103. A nemzetségbe tartozó legtöbb vírusfaj jó immunogén. A természetes gazdanövénykör nagyon
szűk. A vírusok mechanikailag és talajban élő gombákkal (Polymyxa graminis, P. betae, Spongospora
subterranea) terjednek.
A Furovirus nemzetség típustagja a búza talajlakó mozaik vírus (wheat soil-borne mosaic furovirus), amely 5%
RNS-t és 95% fehérjét tartalmaz. A vírus lokális-léziós gazdája a Chenopodium quinoa. A diagnosztikai és
propagatív gazdák közül jelentősek a Triticum-fajok. A furovirusok szerológiailag különbözőek, ugyanakkor
szerológiailag rokonságot mutatnak a dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus). A Furovirus
nemzetség jelenlegi ismereteink szerint öt állandó vírusfajból és öt feltételezett vírusfajból áll.
A vírusok osztályozása és
rendszertana
27 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A Furovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).
Megemlítjük, hogy a legújabb molekuláris eredmények (nukleotid szekvenciaanalízis, génszerveződés,
fehérjeburok-kompozíció stb.) alapján a Furovirus nemzetségen belüli osztályozásában feltehetően változások
következnek be (Torrance és Mayo, 1997). Javaslat született arra, hogy a búza talajlakó mozaik vírus, a zab
arany csíkos vírus (oat golden stripe furovirus) és a Sorghum klorotikus foltosság vírus (Sorghum chlorotic spot
furovirus) képezze változatlanul a Furovirus nemzetséget. A burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top
pomovirus), a répa talajlakó vírus (beet soil-borne furovirus) és a lóbab nekrózis vírus (broad bean necrosis
furovirus) kerüljön át az újonnan javasolt Pomovirus nemzetségbe. A földimogyoró bokrosodás vírus (peanut
clump virus) és az indiai földimogyoró bokrosodás vírus (Indian peanut clump virus) tartozzon az új Pecluvirus
nemzetségbe. A répa nekrotikus sárgaerűség vírus és a búza talajlakó mozaik vírus az új Benyvirus, az árpa
csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic virus) pedig a már ismert Hordeivirus nemzetségbe tartozzon.
Javaslat született arra is, hogy a pálcika alakú vírusokat hét nemzetségbe (Pomovirus, Pecluvirus, Benyvirus,
Hordeivirus, Furovirus, Tobravirus és Tobamovirus) és a nemzetségeket összefoglaló új Barnaviridae családba
sorolják. Az új javaslatot a Nemzetközi Vírusnomenklatúra és Taxonomiai Bizottság 1996-ban beterjesztette, és
1997-ben elfogadta (Pringle, 1998).
Hordeivirus nemzetség
A helikális szimmetriájú pálcika alakú multikomponensű virionok mérete 110–150 nm × × 20 nm. A stabil
virionok növényi szövetnedvben néhány napig, esetleg néhány hétig is megőrzik fertőzőképességüket. A virion
pozitív, három egyszálú RNS-t tartalmaz, amely 3,8 kb (RNSα), 3,3 kb (RNSβ) és 3,2 vagy 2,8 kb (RNSγ). Egy
negyedik RNS (2,5 kb) az árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) argentínai izolátumában
fordul elő. A vírus RNSα és RNSγ 70 nukleotidája közötti szoros szekvenciaazonosság arra mutat, hogy az
RNS-rekombináció szignifikáns szerepet játszott az árpa csíkos mozaik vírus evolúciójában. A köpenyfehérje-
alegységek molekulatömege 22 × 103. A Hordeivirus nemzetségbe tartozó vírusok jó immunogének, egymás
között távoli szerológiai rokonságot mutatnak.
A nemzetség típustagja az árpa csíkos mozaik vírus, amelynek természetes gazdanövényköre – az
Anthoxanthum látens halvány vírussal (Anthoxanthum latent blanching hordeivirus) és a Poa szemilátens
vírussal (Poa semilatent hordeivirus) együtt – a Gramineae családba tartozó fűfélékre terjed ki. A Hordeivirus
nemzetségbe tartozó negyedik vírus [Lychnis gyűrűsfoltosság vírus (Lychnis ringspot hordeivirus)] gazdái a
Caryophyllaceae és a Labiatae családban találhatók meg. A nemzetség típustagja, az árpa csíkos mozaik vírus
3,8–4% nukleinsavat és 96% fehérjét tartalmaz. A vírus mechanikailag átvihető; terjedésében a maggal történő
átvitel (90–100%) igen jelentős. A vírus diagnosztikai és propagatív gazdája a Triticum aestivum, Hordeum
vulgare, lokális-léziós gazdája pedig a Chenopodium quinoa.
A Hordeivirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).
Idaeovirus nemzetség
A nemzetségbe tartozó egyetlen izometrikus vírus [málna bokros törpülés vírus (raspberry bushy dwarf
idaeovirus)] mérete 33 nm. A virion három lineáris, pozitív RNS-t tartalmaz. Az RNS1 5,4 kb, az RNS2 2,2 kb,
az RNS3 1,0 kb. A köpenyfehérje molekulatömege 30 × 103. A virion 24% nukleinsavat és 76% fehérjét
tartalmaz. A vírus közepesen immunogén. Átvitelében vektoroknak nincs szerepe. A mechanikai terjedésen
kívül fontos szerepe van a magátvitelnek (70%), és feltehetően pollennel is terjed. Természetes gazdanövénye a
Rubus fajokra terjed ki. Kísérleti gazdanövényei között fon-tos szerepe van a Chenopodium amaranticolor,
valamint a C. quinoa fajoknak. Az inokulált növények lokálisan (klorotikus léziók) és szisztemikusan is
fogékonyak (klorotikus gyűrűk).
Az Ideovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).
Luteovirus nemzetség
Az izometrikus virionok mérete 25–30 nm. A virionok pozitív értelmű egyszálú RNS-t tartalmaznak, amelyben
28% a nukleinsav és 72% a fehérje. A fehérjék funkciója részben ismeretlen, részben tartalmazzák a
köpenyfehérjét és részben szerepet játszanak a vírus levéltetű-átvitelében. A nemzetségbe tartozó vírusok erősen
immunogének. A luteovirusok nagyobb részének gazdanövényköre szűk: csupán egyetlen növénycsaládra terjed
ki. Átvitelük mechanikailag, maggal és pollennel nem lehetséges. Cirkulatív, nem propagatív módon
törzsspecifikus levéltetűfajokkal terjednek.
A vírusok osztályozása és
rendszertana
28 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A nemzetség típustagja az árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus), amelynek kísérleti
gazdanövényköre szűk. A diagnosztikai és propagatív gazdák között legnagyobb az Avena sativa és a Hordeum
vulgare fajok jelentősége.
A Luteovirus nemzetségbe 11 állandó vírusfaj (és több vektorspecifikus vírustörzs), valamint 14 feltételezett
vírusfaj tartozik.
A Luteovirus nemzetség újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába tartozik (Pringle, 1998).
A borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) nukleinsav- (RNS1-) molekulaszerveződése
hasonlít a Luteovirus nemzetségbe tartozó árpa sárga törpülés vírus II. alcsoportjába tartozó vírusokhoz. A borsó
enációs mozaik vírus RNS2-szerveződése pedig emlékeztet az árpa sárga törpülés vírus I. alcsoportjába tartozó
vírusokhoz. A Luteovirus nemzetségbe tartozó vírusok fejlődéstani rokonságot mutatnak a Sobemovirus és
Carmovirus nemzetségbe tartozó vírusokkal.
D‟Arcy és Mayo (1997) a Cirencesterben (Nagy-Britannia) megtartott Luteovirus Konferencián a
luteovirusokkal kapcsolatos legújabb taxonómiai és osztályozási javaslatokról számolt be. Tekintettel arra, hogy
a luteovirusok két különböző polimeráz génnel rendelkeznek (Mayo és Ziegler-Graf, 1996), az eredeti
Luteovirus nemzetséget három nemzetségre kívánják osztani. Az eredeti Luteovirus nemzetséget típustagként
képviselné az árpa sárga törpülés vírus MAV-törzse (barley yellow dwarf luteovirus MAV strain = BYDV-
MAV). A másik nemzetség elnevezésére javasolják a Betaluteovirus nemzetségnevet. Ebbe a nemzetségbe
tartozna a répa nyugati sárgaság vírus (beet western yellows betaluteovirus), amely az új nemzetség típustagja.
A harmadik javasolt nemzetség neve a Polerovirus vagy Potleavirus nemzetség, ahova a burgonya
levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) mint típustag tartozna. A luteovirusok taxonómiájára
vonatkozóan rövidesen újabb határozatok születnek (lásd D‟Arcy és Mayo, 1997). A luteovirusokról –
könyvünk kéziratának leadása után – megjelent mű (Smith és Baker, 1999) Luteoviridae családot különített el,
amelybe három nemzetség tartozik (Luteovirus, Polerovirus, Enamovirus). Ezek típustagjai az árpa sárga
törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus), a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) és a
borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) (Mayo és D‟Arcy, 1999).
Macluravirus nemzetség
A flexibilis virionok mérete 657–664,5–672 nm × 13–13,7 nm. A virionok 3–4,25% nukleinsavat és 95–97%
fehérjét tartalmaznak. Az RNS egyszálú. A Macluravirus nemzetségbe tartozó Maclura mozaik vírus (Maclura
mosaic macluravirus) levéltetvekkel nem perzisztens módon és mechanikailag átvihető. A Maclura mozaik
vírus (típustag) természetes gazdája a Maclura pomifera. A kísérleti gazdanövények közül legjelentősebb a
Chenopodium album (klorotikus lokális léziók) és a Nicotiana clevelandii (szisztemikus mozaik).
A Maclura mozaik vírus szerológiai rokonságban van a bab sárga mozaik vírussal (bean yellow mosaic
potyvirus), a Narcissus látens vírus pedig a liliom tünetmentes vírussal (lily symptomless carlavirus).
Marafivirus nemzetség
Az ikozaéder virion 28–32 nm. A virion lineáris, egyszálú RNS-t tartalmaz, amelynek molekulatömege 2,0–2,4
× 106. A köpenyfehérje molekulatömege 27 × 103–22 × 103. A nemzetségbe tartozó vírusok szűk
gazdanövénykörrel (Gramineae család) rendelkeznek [kivételt képez a kétszikű növényeket is fertőző zab kék
törpülés vírus (oat blue dwarf marafivirus), és közepesen immunogének.
A Marafivirus nemzetség típustagja a kukorica finom csíkozottság vírus (maize rayado fino marafivirus), amely
33% nukleinsavat és 67% fehérjét tartalmaz. A vírus kabócákkal (Dalbulus spp.) vihető át perzisztens módon;
mechanikailag és maggal nem terjed. Gazdanövényköre szűk, természetes és kísérleti gazdanövénye a Zea
mays. A vírus a legtöbb esetben fitoplazmával és spiroplazmával együtt fordul elő. A Marafivirus nemzetségbe
három állandó vírusfaj tartozik.
A Marafivirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle, 1998).
Nanavirus nemzetség
Az izometrikus vírusok mérete 17–26 nm. A vírus-nukleinsav egyszálú, cirkuláris DNS. A virionok 16-17%
nukleinsavat és 83-84% fehérjét tartalmaznak. Levéltetvekkel szemiperzisztens vagy perzisztens módon vihetők
át. A vírusok mechanikailag, maggal és pollennel nem terjednek. Gazdanövénykörük szűk.
A vírusok osztályozása és
rendszertana
29 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A Nanavirus nemzetségbe öt rendes vírusfaj tartozik: banán csúcscsokrosodás vírus (banana bunchy top
nanavirus), kókusz hajtás leromlás vírus (coconut foliar decay nanavirus), lóbab nekrotikus sárgaság vírus (faba
bean necrotic yellows nanavirus), baktövis (Astragalus) törpeség vírus (milk vetch dwarf nanavirus), here
földalatti törpülés vírus (subterranean clover stunt nanavirus).
Ourmiavirus nemzetség
A bacilus alakú virionok mérete 24–41,6–76 nm × 18–21,1–26 nm. A virionok 15–25% nukleinsavat (egyszálú,
lineáris RNS) és 75–85% fehérjét tartalmaznak. A nemzetségbe tartozó vírusok mechanikailag átvihetők. A
Pelargonium foltosság vírus (Pelargonium zonale spot ourmiavirus) maggal, pollennel és tripszekkel is átvihető.
Az Ourmiavirus nemzetségbe négy állandó vírus [manioka Ivoriai bacilus formájú vírus (cassava ivorian
bacilliform ourmiavirus), epirusz cseresznye vírus (epirus cherry ourmiavirus), ourmia dinnye vírus (ourmia
melon ourmiavirus), Pelargonium foltosság vírus] tartozik. A nevezett vírusok gazdanövényköre közepesen
nagy. A nemzetségbe tartozó vírusok legjobb diagnosztikai és propagatív növényei közé tartozik a
Chenopodium quinoa, a Gomphrena globosa, a Nicotiana glutinosa és a N. clevelandii.
Potexvirus nemzetség
A fonál alakú virionok mérete 470–580 nm × 13 nm. A genom lineáris, egyszálú RNS, molekulatömege 3,5 ×
106. A virion fehérjeburka 1000–1500 fehérjealegységből áll, amelynek molekulatömege 18–27 × 103. A
köpenyfehérje erősen immunogén, számos, a nemzetségbe tartozó vírusfaj között szerológiai rokonság van. A
vírusok gazdanövényköre kiterjedt. Mechanikailag könnyen átvihetők, vektorok nem ismertek.
A Potexvirus nemzetségbe 20 állandó és 21 feltételezett vírusfaj tartozik. A Potexvirus nemzetség típustagja a
burgonya X-vírus (potato X potexvirus), amely 515 nm hosszú és 13 nm átmérőjű (14. ábra). A virion 6%
nukleinsavat és 94% fehérjét tartalmaz. Diagnosztikai növényei közül a Nicotiana tabacum, Datura stramonium
és a Gomphrena globosa a legismertebb (14. ábra).
14. ábra - A: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) virionjai (515 nm × 13 nm) [J.
Brandes szívessége folytán]; B: a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) lokális
léziókat mutató gazdanövényének (Gomphrena globosa) levele
A vírusok osztályozása és
rendszertana
30 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A Potexvirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládba sorolták (Pringle, 1998).
Sobemovirus nemzetség
Az ikozaéder szimmetriájú virion 30 nm átmérőjű. A virionok 180 alegységből állnak, molekulatömegük 6,6 ×
106. A vírusrészecskék pozitív, lineáris egyszálú RNS-t tartalmaznak. A köpenyfehérje molekulatömege 30 ×
103. A fehérje jó immunogén. Az egyes vírusok törzsei között és a nemzetség néhány vírusfaja között
szerológiai rokonság van.
A Sobemovirus nemzetségbe tartozó vírusok gazdanövényköre viszonylag szűk. A vírusok mechanikailag
könnyen átvihetők. Egyes vírusok [Solanum nodiflorum foltosság vírus (Solanum nodiflorum mottle
sobemovirus)] átvitelében a bogaraknak (Epilachna spp.) vagy egyéb rovaroknak (Cyrtopeltis nicotianae) van
jelentősége [bársonyos dohány foltosság vírus (velvet tobacco mottle sobemovirus)].
A Sobemovirus nemzetségbe 10 állandó és 5 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a bab déli
mozaik vírus (bean southern mosaic sobemovirus), amely 21% nukleinsavat és 79% fehérjét tartalmaz. A vírus
bogárvektorokkal (Ceratoma spp.) szemiperzisztens módon, valamint maggal és pollennel terjed.
Gazdanövényköre szűk. Diagnosztikai és propagatív növényei között a Phaseolus és Vigna fajoknak van a
legnagyobb jelentőségük. A vírus egyes törzsei gazdaspecifikusságot mutatnak. A vírus típus „babtörzse”
megfertőzi a Phaseolus vulgaris fajtákat, de apatogén a Vigna sinensis növényre. A vírus ún. „tehénborsó”
(cowpea) törzse megbetegíti a legtöbb Vigna fajtát, de nem képes megbetegíteni a Phaseolus vulgaris fajtákat. A
A vírusok osztályozása és
rendszertana
31 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Sobemovirus nemzetségbe tartozik a Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus) és a csomós
ebír foltosság vírus (cocksfoot mottle sobemovirus) (15. ábra).
15. ábra - A, B, C: a Chenopodium mozaik vírus (sowbane mosaic sobemovirus, 26-28
nm) részecskéinek elektronmikroszkópos képe. A: 1%-os formalinnal fixált,
urániummal árnyékolt víruspreparátum; B: a vírusrészecskék hexagonális
elrendeződése ún. negatív festéses („negativ staining”) módszerrel végzett vizsgálat
alapján; C: a formalinnal és a negatív festéses módszerrel fixált virionok; D: a csomós
ebír foltosság vírus (cocksfoot mottle sobemovirus) szférikus részecskéi (30 nm) [A-C:
C.I. Kado, D: A.J. Gibbs szívessége folytán]
A Sobemovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle,
1998).
A Sobemovirus nemzetség vírusfajaihoz hasonlóságot (morfológiai, az egyszálú genomikus RNS
enkapszidációja stb.) mutatnak a Tombusviridae család Tombusvirus és Carmovirus nemzetségeibe tartozó
vírusok. Ugyanakkor a sobemovirusok köpenyfehérjéjének molekulatömege és genomszerveződése eltér a fenti
nemzetségek vírusfajaitól.
Tenuivirus nemzetség
A virionok vékonyak, fonál alakúak, 3–10 nm szélesek és spirálisak. A virion egyszálú, osztott RNS-t tartalmaz,
amelynek négy típusa ismert. A kukorica sávos mozaik vírusnak (maize stripe mosaic tenuivirus) öt típusú
RNS-e van. A nukleokapszidban levő fehérje molekulatömege 31–34 × 103, a beteg növényekben és
kabócavektorokban kimutatott, nem strukturális protein molekulatömege 20 × 103. A nemzetségbe tartozó
vírusok immunogének, de a tagok között csak a rizs csíkosság vírus (rice stripe tenuivirus) és a kukorica sávos
mozaik vírus között van szerológiai rokonság. A Tenuivirus nemzetség vírusainak gazdanövényköre szűk, és
csupán a Gramineae növénycsalád néhány fajára terjed ki. A vírusok mechanikai átvitele nehéz, kabócákkal
perzisztens módon terjednek.
A Tenuivirus nemzetségbe 4 állandó és 3 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a rizs csíkosság
vírus, amely 12% RNS-t és 88% fehérjét tartalmaz. A vírus átvitelében a Laodelphax striatellus kabóca játssza a
legfontosabb szerepet. Az átvitel perzisztens módon történik, a vírus a vektorban szaporodik (propagatív vírus).
A vírus diagnosztikai és propagatív növénye az Oryza sativa, a Zea mays és a Triticum aestivum.
A Tenuivirus nemzetséget újabban a Mononegavirales rend Arenaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle,
1998).
A vírusok osztályozása és
rendszertana
32 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tobamovirus nemzetség
A merev, pálcika alakú, helikális szimmetriájú virionok [pl. dohány mozaik vírus (tobacco mosaic
tobamovirus)] mérete 300 nm × 18 nm (16A ábra). A virion pozitív, lineáris, egyszálú RNS, molekulatömege 2
× 106. A köpenyfehérje molekulatömege 17–18 × 103. Az e nemzetségbe tartozó vírusok erősen immunogének.
A legtöbb fajnak korlátozott gazdanövényköre van, vektor nélkül, mechanikailag terjednek, egyes vírusfajok
terjedésében fontos szerepe van a maggal történő vírusátvitelnek.
16. ábra - A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) pálcika alakú
virionjai (300 nm × 18 nm); B: dohány mozaik vírussal inokulált Nicotiana tabacum cv.
Samsun növény mozaikos és deformált levelei
A Tobamovirus nemzetségbe 13 állandó vírusfaj és 2 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a
dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), amely 5% nukleinsavat és 95% fehérjét tartalmaz. A vírus
mechanikailag és maggal átvihető, de pollennel nem. Gazdanövényköre igen kiterjedt. Diagnosztikai, propagatív
és lokális-léziós gazdanövényei közül a Nicotiana tabacum cvs Samsun (16B ábra), Xanthi-nc, a N. glutinosa és
a Chenopodium quinoa a legjelentősebb.
A nemzetség összes tagja szerológiailag különböző mértékben rokon.
A Tobamovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringle,
1998).
Tobravirus nemzetség
A cső alakú, merev, helikális szimmetriájú virionok alapvetően – az egyes izolátumoktól függően – nagy (180–
215 nm) és kis partikulumokban (46–115 nm) nyilvánulnak meg (17A, B ábra). A virionok 21,3–23,1 nm
átmérőjűek, amelyben a központi üreg átmérője 4–5 nm. A nagy virionok molekulatömege 48–50 × 106, a kis
virionok molekulatömege 11–29 × 106. A virionok a különböző pH-értékekkel, szerves oldószerekkel szemben
igen ellenállóak, de EDTA-kezeléssel szemben igen érzékenyek. A genom osztott, két lineáris, pozitív, egyszálú
RNS-molekulát (RNS1, RNS2) tartalmaz. A strukturális fehérje molekulatömege 22–24 × 103. A Tobravirus
nemzetségbe tartozó vírusok mérsékelten immunogének. Szerológiai rokonság a nemzetség tagjai között nincs,
vagy ha van, igen kis mértékű. A gazdanövénykör mind az egyszikű, mind a kétszikű növényekre igen kiterjedt.
Mechanikailag átvihetők, fonálférgekkel (Trichodorus spp., Paratrichodorus spp.) terjednek. A vírusok
replikációja a vektor fonálférgekben nem bizonyított.
17. ábra - A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) hosszú (A) (180–215 nm) és
rövid (B) (46–115 nm) partikulumai [B.D. Harrison szívessége folytán];C: Solanum
capsicastrum a vírus nekrotikus tünetekkel reagáló diagnosztikai növénye
A vírusok osztályozása és
rendszertana
33 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A Tobravirus nemzetségbe 3 állandó vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a dohány rattle vírus (tobacco
rattle tobravirus), amely 5% nukleinsavat és 95% fehérjét tartalmaz. A vírus gazdanövényköre kiterjedt,
mechanikailag, fonálférgekkel és néhány növény magjával (Viola arvensis, Capsella bursa-pastoris, Solanum
tuberosum) kis mértékben átvihető. Diagnosztikai, propagatív és lokális-léziós növényei közül jelentős a
Chenopodium quinoa, a Nicotiana clevelandii, a Phaseolus vulgaris, a Solanum capsicastrum (17C ábra).
A Tobravirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae családjába sorolták (Pringle, 1998).
Trichovirus nemzetség
A helikális szimmetriájú, fonál alakú virionok mérete 640–800 nm × 12 nm. A virionok mérsékelten toleránsak
a hőmérséklettel (55–60 °C) és a szerves oldószerekkel szemben. A virion lineáris, pozitív, egyszálú RNS. A
köpenyfehérje molekulasúlya 22–27 × 103.
A Trichovirus nemzetségbe tartozó vírusok gyengén vagy mérsékelten immunogének. Gazdanövénykörük szűk,
mechanikailag általában átvihetők.
A Trichovirus nemzetség típustagja az alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot
trichovirus).
A Trichovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae új víruscsaládjába sorolták (Pringler, 1998).
Tymovirus nemzetség
Az ikozaéder szimmetriájú, burok nélküli vírusok átmérője 30 nm. A virion lineáris, pozitív, egyszálú RNS-t
tartalmaz, amely éterrel, kloroformmal és butanollal szemben stabil. A vírus közepesen immunogén; a
nemzetség tagjai között részben szoros vagy távoli rokonság van, egyes vírusok között pedig szerológiai
kapcsolat nem mutatható ki.
A Tymovirus nemzetség tagjainak gazdái a kétszikű növényekre terjednek ki. A viszonylag szűk
gazdanövénykör magyarázatul szolgálhat a tymovirusok korlátozott elterjedéséhez. Mechanikailag és
bogárvektorokkal terjednek (Phyllotreta spp., Psylloides spp., Phaedon cochleariae).
A Tymovirus nemzetségbe 17 állandó és 1 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a tarlórépa sárga
mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus), amely 37% nukleinsavat és 63% fehérjét tartalmaz. A vírus
gazdanövényköre szűk, mechanikailag, bogárvektorokkal és maggal (Camelina sativa) terjed. A Brassica
chinensis (18A ábra), a B. rapa var. rapa és a Raphanus sativus a vírus diagnosztikai és propagatív gazdái. Ebbe
a nemzetségbe tartozik a burgonya andeszi látens vírus (potato Andean latent tymovirus), amely Dél- és Közép-
Amerikában igen elterjedt burgonyapatogén vírus (18B ábra).
18. ábra - A: Brassica chinensis a tarlórépa mozaik vírus (turnip yellow mosaic
tymovirus) propagatív gazdanövénye [D. Mamula szívessége folytán];B: burgonya
A vírusok osztályozása és
rendszertana
34 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
andeszi látens vírus (potato Andean latent tymovirus) szférikus partikulumai (30 nm)
[A.J. Gibbs szívessége folytán]
A Tymovirus nemzetséget újabban a Nidovirales rend Barnaviridae családjába sorolták (Pringle, 1998). A
nemzetség tagjai morfológiailag hasonlítanak a Marafivirus nemzetség (Tymoviridae család) tagjaihoz. Ez
utóbbi nemzetség tagjai azonban – ellentétben a tymovirusokkal – mechanikailag nem, csak kabócákkal vihetők
át.
Umbravirus nemzetség
Burokkal határolt, 52 nm átmérőjű vírusrészecskéket sikerült eddig kimutatni a nemzetségbe tartozó sárgarépa
foltosság vírussal (carrot mottle umbravirus) fertőzött növényi sejtek vakuoláiban. A fertőző nukleinsav
egyszálú RNS, és feltehetően nem poliadenilált. Lipid előfordulása nem kizárt. A vírusok antigén tulajdonságai
nem ismertek.
Az egyes umbravirusok természetes gazdái csak néhány növényre terjednek ki. A kísérleti gazdanövénykör
szélesebb, de mindenképpen szűk. A vírusok mechanikai átvitele nehéz, de specifikus segítő vírus (helper vírus)
jelenlétében [levéltetvekkel nem perzisztens módon terjedő sárgarépa vörös levelűség vírus (carrot red leaf
luteovirus)] az átvihetőség biztosított.
Az Umbravirus nemzetségbe 5 állandó és 4 feltételezett vírusfaj tartozik. A nemzetség típustagja a sárgarépa
foltosság vírus levéltetvekkel (Cavariella aegopodii) perzisztens módon terjed. Mechanikailag igen, de maggal
és pollennel nem átvihető. A diagnosztikai, propagatív és lokális-léziós gazdanövények közül legjelentősebb a
Chenopodium quinoa, a Nicotiana clevelandii és a Phaseolus vulgaris.
A legújabb aminosav-szekvencia vizsgálatok hasonlóságot állapítottak meg az Umbravirus nemzetség, valamint
a Carmo, a Tombus és a Luteovirus nemzetségek között. Az Umbravirus nemzetséget újabban a Nidovirales
rend Barnaviridae családjába sorolták (Pringle, 1998).
Varicosavirus nemzetség
A pálcika alakú, burok nélküli vírusok mérete 120–268,3–300 nm × 18–22–30 nm. A genom kettősszálú RNS.
A nemzetségbe tartozó vírusok talajban élő gombával (Olpidium brassicae) terjednek. A nemzetségbe tartozó
állandó vírusfajok közül a Freesia levél nekrózis vírus (Freesia leaf necrosis varicosavirus) mechanikailag
nehezen, a saláta érvastagodás vírus (lettuce big-vein varicosavirus) és a dohány satnyulás vírus (tobacco stunt
varicosavirus) mechanikailag könnyen átvihető.
A Varicosavirus nemzetségbe 3 állandó tag és 1 feltételezett tag [Camellia sárga foltosság vírus (Camellia
yellow mottle ? varicosavirus)] tartozik.
Vitivirus nemzetség
A Vitivirus nemzetség (Nidovirales rend, Barnaviridae család) egy újabban ismertté vált vírusnemzetség
(Martelli et al., 1997), amelynek típustagja a szőlő A-vírus (grapevine A vitivirus). Ide tartozik a burgonya T-
vírus (potato T vitivirus) (19. ábra), amely korában a morfológiailag és fizikokémiailag hasonló Trichovirus
nemzetségbe volt sorolva (Murphy et al., 1995). E vírusfajok újabb nemzetségbe sorolását és a trichovirusoktól
történő elválasztását a legújabban megismert tropizmus, a génszerveződés és az epidemiológiai különbségek
indokolják, amelyek között a legnagyobb jelentőségű volt a vitivirusokra jellemző két extra cisztron kódolta
A vírusok osztályozása és
rendszertana
35 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
polipeptid. A fent említett két vitivirus természetes gazdanövényköre egy-egy fajra korlátozódik. Mindkét vírus
mechanikailag átvihető. A burgonya T-vírus maggal is terjed. A diagnosztikai és a propagatív gazdanövények
közül legjelentősebb a Chenopodium quinoa, valamint a Phaseolus vulgaris.
19. ábra - A burgonya T-vírus (potato T vitivirus) flexibilis virionjai (637 nm × 12 nm)
[L.F. Salazar szívessége folytán]
4. Új rendszertani javaslatok
4.1. Aktuális vírusrendszer: a növénypatogén vírusnemzetségek és típus vírusfajok fontosabb tulajdonságai
Az ICTV (Nemzetközi Vírustaxonómiai Bizottság) 6. jelentését (vö. Murphy et al., 1995) követően több javaslat
született a vírusok taxonómiájával kapcsolatban. Ezek közül az ICTV plenáris ülése a 10. Nemzetközi
Virológiai Kongresszuson (Jeruzsálem, 1996) és az ICTV Végrehajtó Bizottsági Ülésén (Strasbourg, 1997)
számos új javaslatot fogadott el (Pringle, 1998). Az elfogadott új javaslatokat (vírusrendek, víruscsaládok,
vírusnemzetségek és típus vírusfajok) és a jelenleg érvényben lévő vírusrendszert a 3. táblázatban foglaljuk
össze (Pringle, 1998; de Kochko et al., 1988; Smith és Baker, 1999).
3. táblázat - A Nemzetközi Vírustaxonómiai Bizottság által újonnan jóváhagyott
vírusrendszer
Vírusrend Víruscsalád1 Vírusnemzetség Típustag angol (magyar) neve
Egyszálú
DNS vírusok
Geminiviridae Begomovirus
Curtovirus
Beán golden mosaic begomovirus
(Bab aranysárga mozaik vírus)
A vírusok osztályozása és
rendszertana
36 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Mastrevirus Béét curly top curtovirus
(Répa levélcsúcs fodrosodás vírus)
Maize streak mastrevirus
(Kukorica csíkosság vírus)
DNS és RNS
fordított transz-
kripciójú
vírusok
Caulimoviridae Badnavirus
Caulimovirus
„Cassava vein mottle-
like
viruses "
„Legume-infecting
viruses"
„Rice tungro
bacilliform-
like viruses "
Commelina yellow mottle
badnavirus
(Commelina sárga foltosság vírus)
Cauliflower mosaic caulimovirus
(Karfiol mozaik vírus)
Cassava vein mosaic virus
(Cassava érmozaik vírus)
Soybean chlorotic mottle virus
(Szójabab klorotikus foltosság
vírus)
Rice tungro bacilliform badnavirus
(Rizs tungro bacilus alakú vírus)
Kétszálú RNS
vírusok
Reoviridae Fijivirus
Oryzavirus
Phytoreovirus
Fiji disease/i/i'vi'nw
(Fiji betegség vírus)
Rice ragged stunt oryzavirus
(Rizs érdes törpülés vírus)
Clover wound tumor phytoreovirus
(Here seb tumor vírus)
Parti ti viridae Alphacrypto-
virus
Betacrypto-
virus
White clover cryptic
alphacryptovirus
[=White clover 1 alphacryptovirus
(Fehérhere rejtett vírus 1)]
White clover cryptic
betacryptovirus
[= White clover 2 betacryptovirus
(Fehérhere rejtett vírus 2]
Negatív szálú
RNS vírusok
Mono-
negavirales
Rhabdoviridae Cytorhabdo-
virus
Nucleorhabdo-
Lettuce necrotic yellows
cytorhabdo-
virus (Saláta nekrotikus sárgaság
vírus)
A vírusok osztályozása és
rendszertana
37 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
virus Potato yellow dwarf
nucleorhabdovirus
(Burgonya sárga törpülés vírus)
Arenaviridae Tenuivirus Rice stripe tenuivirus
(Rizs csíkosság vírus)
Bunyaviridae Tospovirus Tomato spotted wilt tospovirus
(Paradicsom bronzfoltosság vírus)
Pozitív szálú
RNS vírusok Nidovirales Barnaviridae Benyvirus
Capillovirus
Carlavirus
Furovirus
Hordeivirus
Idaeovirus
Marafivirus
Pecluvirus
Pomovirus
Potexvirus
Sobemovirus
Tobamovirus
Tobravirus
Trichovirus
Tymovirus
Umbravirus
Vitivirus
Beet necrotic yellow vein
benyvirus (Répa nekrotikus
sárgaerűség vírus)
Apple stem grooving capillovirus
(Alma törzsbarázdáltság vírus)
Carnation latent carlavirus
(Szegfű látens vírus)
Wheat soil-borne mosaic furovirus
(Búza talaj lakó mozaik vírus)
Barley stripe mosaic hordeivirus
(Árpa csíkos mozaik vírus)
Raspbery bushy dwarf idaeovirus
(Málna bokros törpülés vírus)
Maize rayado fino marafivirus
(Kukorica finom csíkozottság
vírus)
Peanut clump pecluvirus
(Földimogyoró bokrosodás vírus)
Potato mop-topjromovi'nw
(Burgonya szártörpülés vírus)
Potato Xpotexvirus (Burgonya X-
vírus)
Beán southern mosaic sobemovirus
(Bab déli mozaik vírus)
Tobacco mosaic tobamovirus
(Dohány mozaik vírus)
Tobacco rattle tobravirus
A vírusok osztályozása és
rendszertana
38 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
(Dohány rattle vírus)
Apple chlorotic leaf spot
trichovirus (Alma klorotikus
levélfoltosság vírus)
Turnip yellow mosaic tymovirus
(Tarlórépa sárga mozaik vírus)
Carrot mottle umbravirus
(Sárgarépa foltosság vírus)
Grapevine A vitivirus (Szőlő A-
vírus)
Bromoviridae Alfamovirus
Bromovirus
Cucumovirus
Ilarvirus
Oleavirus
Alfalfa mosaic alfamovirus
(Lucerna mozaik vírus)
Brome mosaic bromovirus
(Rozsnok mozaik vírus)
Cucumber mosaic cucumovirus
(Uborka mozaik vírus)
Tobacco streak ilarvirus
(Dohány csíkosság vírus)
Olive latent oleavirus [Olive latent
2 oleavirus (Olajfa látens vírus 2)]
1 A Tombusviridae családba egy újabb vírusnemzetséget (Aureusvirus) soroltak, amelybe a Pothos látens vírus
(Pothos latent aureusvirus) tartozik (Martelli et al., 1998).
A vírusok jelenlegi ismereteink szerint 189 nemzetségbe sorolhatók. Ezek közül 166 nemzetség 55
víruscsaládba tartozik. A maradék 23 vírusnemzetség családi hovatartozása még nem nyert megállapítást. A
növénypatogén vírusok a legújabb vírusrendszer alapján (3. táblázat) 16 családba tartoznak (Pringle, 1998). A
növénypatogén vírusnemzetségek száma jelenlegi ismereteink szerint 57 (61). Minden nemzetséget egyetlen
típus vírusfaj (tag) képvisel. A vírusnemzetségekre és típus vírusfajokra vonatkozó fontosabb adatok a 4.
táblázatban találhatók meg. A 4. táblázat adatai alapján látható, hogy a nukleinsav típusában, a morfológiában,
a vektorokban és a vírusátviteli lehetőségekben igen jelentős eltérések vannak a vírusnemzetségek és a típus
vírusfajok között.
4. táblázat - Növenypatogen vírusnemzetségek és típustagjainak fontosabb
tulajdonságai
Vírusnemzetsé Nukleinsav1'2 Morfológia Vektor/átvitel3 Típustag magyar (angol) neve4
A vírusok osztályozása és
rendszertana
39 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
gek
típus konfigur
áció
Alfamovirus ssRNS lineáris bacilus A/Me,S,P Lucerna mozaik vírus
(Alfalfa mosaic alfamovirus)
Alphacryptovi
rus dsRNS lineáris izometrikus Nk,?/Me,S Fehérhererejtettvírus 1
(White clover cryptic 1
alphacryptovirus)
Badnavirus dsDNS cirkuláris bacilus M,LH,?/- Commelina sárga foltosság
vírus
(Commelina yellow mottle
badnavirus)
Begomovirus ssDNS cirkuláris izometrikus
(gemini) T/Me(?) Bab aranysárga mozaik vírus
(Beán golden mosaic
begomovirus)
Benyvirus ssRNS lineáris pálcika F/Me Répa nekrotikus sárgaerűség
vírus
(Beet necrotic yellow vein
benyvirus)
Betacryptovir
us dsRNS lineáris izometrikus Nk,?/S Fehérhere rejtett vírus 2
(White clover cryptic 2
betacryptovirus)
Bromovirus ssRNS lineáris izometrikus A(?),N(?)/Me Rozsnok mozaik vírus
(Brome mosaic bromovirus)
Bymovirus ssRNS lineáris fonál F/Me Árpa sárga mozaik vírus
(Barley yellow mosaic
bymovirus)
Capillovirus ssRNS lineáris fonál Nk,?/Me,S Alma törzsbarázdáltság vírus
(Apple stem grooving
capillovirus)
Carlavirus ssRNS lineáris pálcika A/Me(?) Szegfű látens vírus
(Carnation latent carlavirus)
Carmovirus ssRNS lineáris izometrikus F,B,?/Me Szegfű foltosság vírus
(Carnation mottle carmovirus)
„Cassava vein dsDNS cirkuláris izometrikus -/Me Cassava érmozaik vírus
A vírusok osztályozása és
rendszertana
40 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
mottle-like
viruses" (Cassava vein mosaic virus)
Caulimovirus dsDNS cirkuláris izometrikus A/Me Karfiol mozaik vírus
(Cauliflower mosaic
caulimovirus)
Closterovirus ssRNS lineáris fonál A,M/Me(?) Répa sárgaság vírus
(Beet yellows closterovirus)
Comovirus ssRNS lineáris izometrikus B/Me,S Tehénborsó mozaik vírus
(Cowpea mosaic comovirus)
Crinivirus ssRNS lineáris fonál W/Me(?) Saláta fertőző sárgaság vírus
(Lettuce infectious yellows
crinivirus)
Cucumovirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me,S Uborka mozaik vírus
(Cucumber mosaic
cucumovirus)
Curtovirus ssDNS cirkuláris izometrikus
(gemini) LH/Me(?),Cu(
?)_ Répa levélcsúcs fodrosodás
vírus
(Beet curly top curtovirus)
Cytorhabdovir
us ssRNS lineáris lövedék A,LH/Me Saláta nekrotikus sárgaság
vírus
(Lettuce necrotic yellows
virus)
Dianthovirus ssRNS lineáris izometrikus N(?)/Me Szegfű gyűrűsfoltosság vírus
(Carnation ringspot
dianthovirus)
Enamovirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me,S(?) Borsó enációs mozaik vírus
(Pea enation mosaic
enamovirus)
Fabavirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me Lóbab hervadás vírus
(Broad bean vfütfabavirus)
Fijivirus dsRNS lineáris izometrikus LH/Me(?) Fiji betegség vírus (Fiji
disease/i/mmj)
Furovirus ssRNS lineáris pálcika F/Me Búza talaj lakó mozaik vírus
(Wheat soil-borne mosaic
furovirus)
A vírusok osztályozása és
rendszertana
41 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Hordeivirus ssRNS lineáris pálcika Nk,?/Me,S,P Árpa csíkos mozaik vírus
(Barley stripe mosaic
hordeivirus)
Idaeovirus ssRNS lineáris izometrikus NK,?/Me,S,P(
?) Málna bokros törpülés vírus
(Raspberry bushy dwarf
idaeovirus)
Ilarvirus ssRNS lineáris izometrikus
(bacilus) T/Me,S,P Dohány csíkosság vírus
(Tobacco streak ilarvirus)
„ Legume-
infecüng
viruses "
dsDNS cirkuláris izometrikus -/Me Szójabab klorotikus foltosság
vírus
(Soybean chlorotic mottle
virus)
Luteovirus ssRNS lineáris izometrikus A/- Árpa sárga törpülés vírus
(Barley yellow dwarf
luteovirus)
Machlomoviru
s ssRNS lineáris izometrikus B,T/Me,S Kukorica klorotikus foltosság
vírus
(Maize chlorotic mottle
machlomovirus)
Macluravirus ssRNS lineáris fonál A/Me Maclura mozaik vírus
(Maclura mosaic
macluravirus)
Maraflvirus ssRNS lineáris izometrikus LH/- Kukorica finom csíkozottság
vírus
(Maize rayado fino
marqflvirus)
Mastrevirus ssDNS cirkuláris izometrikus
(gemini) LH/- Kukorica csíkosság vírus
(Maize streak mastrevirus)
Nanavirus ssDNS cirkuláris izometrikus A/- Lóbab nekrotikus sárgaság
vírus
(Fába bean necrotic yellows
nanavirus)
Necrovirus ssRNS lineáris izometrikus F/Me Dohány nekrózis vírus
(Tobacco necrosis necrovirus)
Nepovirus ssRNS lineáris izometrikus N,A(?)T(?)/M
e,S,P Dohány gyűrűsfoltosság vírus
A vírusok osztályozása és
rendszertana
42 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
(Tobacco ringspot nepovirus)
Nucleorhabdo
virus ssRNS lineáris bacilus
(lövedék) A,LH/Me, Tu Burgonya sárga törpülés vírus
(Potato yellow dwarf
nucleorhabdovirus)
Oleavirus ssRNS lineáris izometrikus ?/Me Olajfa látens vírus 2
(Olive latent 2 oleavirus)
Oryzavirus dsRNS lineáris izometrikus LH/- Rizs érdes törpülés vírus
(Rice ragged stunt oryzavirus)
Ourmiavirus ssRNS lineáris bacilus Nk,?/Me,S,P Dinnye ourmia vírus
(Melón ourmia ourmiavirus)
Pecluvirus ssRNS lineáris pálcika F/Me,S Földimogyoró bokrosodás
vírus
(Peanut clump pecluvirus)
Phytoreovirus dsRNS lineáris izometrikus LH/- Here seb tumor vírus
(Clover wound tumor
phytoreovirus)
Polerovirus ssRNS lineáris izometrikus A/Tu Burgonya levélsodródás vírus
(Potato \eafro\\polerovirus)
Pomovirus ssRNS lineáris pálcika F/Me, Tu Burgonya szártörpülés vírus
(Potato mop-top pomovirus)
Potexvirus ssRNS lineáris fonál Mi,A,?/Me,
Tu Burgonya X- vírus (Potato X
potexvirus)
Potyvirus ssRNS lineáris fonál A/Me, Tu Burgonya Y- vírus (Potato Y
potyvirus)
Rymovirus ssRNS lineáris fonál Mi/Me Angolperje mozaik vírus
(Ryegrass mosaic rymovirus)
„Rice tungro
bacilli-form-
like viruses "
dsDNS cirkuláris bacilus LH/- Rizs tungro bacilus alakú
vírus
(Rice tungro bacilliform
badnavirus)
Sequivirus ssRNS lineáris izometrikus A/Me Paszternák sárga foltosság
vírus
(Parsnip yellow fleck
sequivirus)
A vírusok osztályozása és
rendszertana
43 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Sobemovirus ssRNS lineáris izometrikus A,LH,B/Me,S,
P Bab déli mozaik vírus
(Beán southern mosaic
sobemovirus)
Tenuivirus ssRNS lineáris amorf LH/Me(?) Rizs csíkosság vírus
(Rice stripe tenuivirus)
Tobamovirus ssRNS lineáris pálcika NK,?/Me,S Dohány mozaik vírus
(Tobacco mosaic
tobamovirus)
Tobravirus ssRNS lineáris pálcika N/Me,S Dohány rattle vírus
(Tobacco rattle tobravirus)
Tombusvirus ssRNS lineáris izometrikus F,B,?/Me,S(?),
P(?) Paradicsom bokros törpülés
vírus (Tomato bushy stunt
tombusvirus)
Trichovirus ssRNS lineáris fonál M/Me(?) Alma klorotikus levélfoltosság
vírus (Apple chlorotic leaf
spot trichovirus)
Tospovirus ssRNS lineáris izometrikus T/Me Paradicsom foltos hervadás
vírus [syn.: paradicsom
bronzfoltosság vírus
(Tomato spotted wilt
tospovirus)]
Tymovirus ssRNS lineáris izometrikus B/Me,S Tarlórépa sárga mozaik vírus
(Turnip yellow mosaic
tymovirus)
Umbravirus ssRNS lineáris nem ismert A/Me Sárgarépa foltosság vírus
(Carrot mottle umbravirus)
Varicosavirus dsRNS lineáris pálcika F/Me Dohány satnyulás vírus
(Tobacco stunt varicosavirus)
Vitivirus ssRNS lineáris fonál M/Me Szőlő A-vírus (Grapevine A
vitivirus)
Waikavirus ssRNS lineáris izometrikus LH/- Rizs tungro szférikus vírus
(Rice tungro spherical
waikavirus)
1 ss = single stranded (egyszálú).
2 ds = double stranded (kétszálú).
A vírusok osztályozása és
rendszertana
44 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3 A számlálóban a vektorra, a nevezőben az egyéb átviteli lehetőségekre (különös tekintettel a típus vírusfajra)
vonatkozó adatok vannak feltüntetve. Számlálóban: A = aphids (leveltetvek), B = beetles (bogarak), F = fungus
(gombák), LH = leafhoppers (kabócák), M = mealybugs (vandorpajzstetvek), Mi = mites (atkák), N =
nematodes (fonálférgek), Nk = nőt known (nem ismert), T = thrips (tripszek), W = whiteflies (molytetvek), - = a
típus vírusfaj vektora (aláhúzva), 2 = a típus vírusfaj vektora ismeretlen (aláhúzva), (?) = a vektor bizonytalan,
vagy a vektorral és egyéb átviteli módszerrel történő terjedés bizonytalan (esetleg csak speciális eljárással
lehetséges). Nevezőben: Cu = Cuscuta spp., Me = mechanical transmission (mechanikai átvitel), P = pollen
(virágpor), S = seeds (magvak),Tu = tuber (burgonyagumó), -= az oltással történő átvitelen kívül egyéb terjedés
nem ismert.
4 A Nanavirus nemzetség típustagja nincs definiálva. A lóbab nekrotikus sárgaság vírus (fába bean necrotic
yellows nanavirus) az öt nanavirus egyik tagja (Brunt ét ál., 1996a,b).
Az összefoglaló áttekintés alapján megállapítható, hogy a 61 növénypatogén vírusnemzetségből 52 RNS-t és 9
DNS-t tartalmaz (5. táblázat). Az 5. táblázatban jelentős többségben vannak az izometrikus vírusok (34), a
levéltetvekkel átvihető vírusok (18), valamint a mechanikailag átvihető vírusok (50). A típus vírusfajok között
vannak fonál, pálcika, bacilus, amorf és lövedék alakú vírusok is. Egyetlen vírusnak [sárgarépa foltosság vírus
(carrot mottle umbravirus)] ismeretlen egyelőre a pontos morfológiája. A típus vírusfajok egy része
levéltetűvektorokon kívül még kabócákkal, bogarakkal, fonálférgekkel, atkákkal, tripszekkel és fehérlegyekkel
(liszteskékkel), valamint gombavektorokkal és maggal, továbbá pollennel is átvihetőek (4. és 5. táblázatok).
5. táblázat - A növénypatogén vírusnemzetségek típus vírusfajainak összefoglaló
tulajdonságai1
Tulajdonságok A típus vírusfajok száma Tulajdonságok A típus vírusfajok száma
Nukleinsav:
ssRNS
dsRNS
ssDNS
dsDNS
46
6
4
5
Vektor (állati):
levéltetvek
kabócák
bogarak
fonálférgek
atkák
tripszek
fehérlegyek
vándorpajzstetvek
18
11
6
3
o
5
2
1
Morfológia:
izometrikus
fonál
pálcika
bacilus
izometrikus (gemini)
izometrikus (bacilus)
amorf
lövedék
bacilus lövedék
nem ismert
30
10
9
4
3
1
1
1
1
1
1 A táblázatban csak azokat az ismereteket tettük közzé, amelyek az egyes típus vírusfajok esetében bizonyítást
nyertek. Tehát az olyan adatok, mint pl. a Cuscuta-fajokkal bizonytalanul, vagy nem igazolhatóan átvihető vírus
A vírusok osztályozása és
rendszertana
45 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
[répa levélcsúcs fodrosodás vírus (béét curly top curtovirus)], vagy a mechanikailag nehezen átvihető vírus [bab
aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic begomovirus)] nem szerepel a táblázatban.
4.2. Rendszertanilag nem besorolható vírusok
A vírusok egy része – tulajdonságaik ismeretének hiányos volta miatt – családokba, nemzetségekbe még nem
sorolható. Murphy et al. (1995) legújabb vírustaxonómiai munkája 24 olyan növény-, állat-, gomba- és
rovarpatogén vírust ismertet, amelyek rendszertanilag még nem sorolhatók be. Ebben a kiadványban 11
rendszertanilag nem ismert növénypatogén vírus van, amelyek között mind RNS-, mind DNS-tartalmú vírusok
megtalálhatók. A molekuláris virológiai és biológiai kutatások intenzitását jellemzi, hogy Brunt et al. (1996a) –
az előző kiadványt követő egy év múlva – a korábban rendszertanilag nem ismert vírusból nyolcat
rendszertanilag besorolt legalapvetőbb tulajdonságaik megismerése után.
Jelenlegi ismereteink szerint az egyszálú RNS-növényvírusok közül a kukorica fehérvonalas vírus (maize white
line mosaic virus, MWLMV) és a szőlő foltosodás vírus (grapevine fleck virus, GFkV) rendszertani helye nem
ismert (de Zoten és Reddick, 1984; Boulila et al., 1990). A kétszálú DNS-növényvírusok közül az uborka
érsárgulás vírus (cucumber vein yellowing virus, CVYV) rendszertani besorolásra vár (Sela et al., 1980).
Milne et al. (1996) az Ophiovirus csoport (nemzetség) elfogadását javasolja. Ennek a javasolt új nemzetségnek
(csoportnak) a tagjai a tulipán enyhe foltosság vírus (tulip mild mottle ? ophiovirus), a Ranunculus 3 vírus
(Ranunculus 3 ? ophiovirus), a citrus sömör-gyűrűsfoltosság vírus (citrus psorosis-ringspot ? ophiovirus)
hasonlítanak a Tenuivirus nemzetség tagjaihoz, de gazdanövényei a Gramineae családba nem tartoznak.
Mindhárom vírusfaj egyszálú RNS-t tartalmaz, a fehéjeburok 42–50 kD, mechanikailag kétszikű növényekre
vihetők át. A virionok nemcsak a floemben, hanem a parenhimasejtekben is megtalálhatók. A fenti három vírus
szerológiailag nem rokon. Kígyószerű (snaky) virionjaik és fenti tulajdonságaik alapján Milne et al. (1996)
szerint ophiovirusnak tekintendők.
46 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
4. fejezet - A vírusok adatbázisa
Az újabb és újabb gazda–vírus kapcsolatok megállapításával lényegesen kiszélesedett a vírusok földrajzi
elterjedése is. A vírusdiagnosztikai technikák és a molekuláris virológiai vizsgálatok egyre biztonságosabbá
váltak. Az ICTV 50 víruscsaládot, 9 alcsaládot, 164 nemzetséget és több mint 3600 vírusfajt regisztrál, és
jelentősen több a vírustörzsek, altípusok és a kellőképpen nem identifikált vírusok száma. Megállapítható, hogy
jelenleg a világ víruslaboratóriumaiban mintegy 30 000 víruskultúrát tartanak nyilván. A vírusok adatbázisa
mintegy 500–1000 tulajdonságot vesz figyelembe (cf. Boswell et al., 1986). Ezeket a tulajdonságokat az
Univerzális Vírus Adatbank az ICTVDB (International Committee on Taxonomy on Viruses Database) őrzi. A
növényvírusok adatbázisát (VIDE Project = Virus Identification Data Exchange) az Ausztráliai Nemzeti
Egyetem (Australian National University, Canberra, Australia) az angol Nemzetközi Kertészeti Kutatási
Központtal (Horticulture Research International, Littlehampton, UK) és a Mezőgazdasági és Élettudományi
Nemzetközi Központtal (Centre for Agriculture and Biosciences International, Wallingford, UK) együtt kezeli.
A VIDE adatbázis jelenleg 55 nemzetségbe tartozó, több mint 890 vírusfaj 569 jellemzőjét tartalmazza (Boswell
et al., 1986; Brunt et al., 1990; Brunt et al., 1996b).
1. Az adatbázis szerepe a vírusidentifikálásban
1.1. Az adatbázis elvi szempontjai
A vírusokat – mint obligát sejtparazitákat – két, nem összefüggő fázisból álló biokémiai életciklus különbözteti
meg a mikroorganizmusoktól. A diszperzív fázisban (1) a vírusok olyan részecskék, amelyek a genomot egy
fehérjeburokban (köpenyfehérje) tartalmazzák. Egyes vírusok virionjai még enzimeket is tartalmaznak, gyakran
vírus-transzkriptázokat, de sohasem katabolikus enzimeket vagy transzfer-RNS-t (t-RNS). A reproduktív
fázisban (2) a vírus a fogékony gazdanövénybe kerül és ott szétbomlik. Ekkor a vírusgének metabolikusan
aktívvá válnak, megváltoztatják a gazdanövény anyagcseréjét úgy, hogy az lemásolja a vírusgenomot és
vírusfehérjéket hoz létre. Ezt követően az „utód” genomok és a vírusfehérjék egyesülnek, virionokat hoznak
létre. A fentiekre tekintettel tehát a vírusok életciklusában metabolikusan inaktív virionok és reprodukálódó
vírus-makromolekulák váltakoznak. Mindkét fázis (diszperzív és reproduktív) olyan információkat szolgáltat,
amelyek a vírusok (egy új vírus) meghatározásához és jellemzéséhez feltétlen szükségesek. A diszperzív
fázisban lévő virionok biokémiailag jellemezhetők, a reproduktív fázis pedig információt nyújt a vírus
gazdanövénykörére, a tünetekre és a replikációs stratégiára (Boswell és Gibbs, 1983).
1.2. Az adatbázis gyakorlati szempontjai
Egy új vírus identifikálása abból áll, hogy megállapítjuk az ismeretlen vírus tulajdonságait és azokat
összehasonlítjuk a már ismert vírusok tulajdonságaival; ennek alapján eldönthető, hogy az „ismeretlen” vírust
korábban leírták-e. A korábban leírt vírusok nagy része megfelelően jellemzett, és ezek a jellemzők
(specifitások) az ún. „Adatbázis”-ban vannak tárolva (Boswell és Gibbs, 1983; Boswell et al., 1986; Brunt et al.,
1990, 1996). Az „Adatbázis”-ban tárolt vírus-jellemzők összehasonlíthatók az „ismeretlen” vírusról szerzett
információkkal. Ennek alapján kerülhet meghatározásra az a víruscsoport, ahova az „ismeretlen vírusfaj”
tartozik. A víruscsoportnak és a vírusfajnak azonban nincsenek abszolút kritériumai, csupán a célszerűség miatt
került sor ilyen taxonok megállapítására. A vírusnemzetség (csoport) olyan vírusok kollekciója, amelyeknek
közös tulajdonságaik vannak; egy ilyen csoportosítás már nagymértékben segíti az „ismeretlen” vírus
meghatározását.
Az egyes vírusnemzetségeket az alábbi közös tulajdonságok jellemzik: (1) a víruspartikulumok azonos
szerkezete és csaknem azonos összetétele, (2) hasonló genomstratégia, (3) hasonló ökológiai életciklus, (4)
hasonló természetes és mesterséges gazdanövénykör, (5) azonos növényfajokon okozott azonos tünetek, (6)
azonos vektorfajok. A víruspartikulumok azonos szerkezetére (összetételére), a hasonló genomstratégiára és a
hasonló ökológiai életciklusra vonatkozó adatok igen hasznosak az „ismeretlen” vírus faji hovatartozásának az
előrejelzésére; ezek a tulajdonságok azért is fontosak, mert tükrözik evolúciós kapcsolatukat, azokat a
tulajdonságokat, amelyeket a közös őstől örököltek.
A természetes és mesterséges gazdanövénykörre, a tünetekre és a vektorokra vonatkozó adatok egymagukban
nem adnak elégséges információt az identifikáláshoz. Az „Adatbázis” kétharmada mégis a gazdanövények
vírusfogékonyságára vonatkozó ismereteket tartalmazza annak ellenére, hogy minden virológus egyetért
Hamilton et al. (1981) véleményével, mely szerint a tesztnövények és a tünetek a vírusidentifikálásban nem a
A vírusok adatbázisa
47 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
legfontosabbak, de a vírusok standardizálásában nélkülözhetetlenek. Ezt bizonyítja az a tény, hogy a tünetek,
amelyeket az „ismeretlen” vírus egy standard indikátornövény-soron létrehoz, feltehetően a leghasznosabb
információk arra vonatkozóan, hogy az adott vírus nem tagja-e egy bizonyos víruscsoportnak.
1.3. A vírusidentifikálás stratégiája
Egy „ismeretlen” vírus identifikálása során a diagnosztikai stratégiának három követelményt kell kielégítenie:
(1) a víruspartikulumok szerkezete, összetétele, a genomstratégia és az ökológiai életciklus alapján
megállapítani, hogy az „ismeretlen” vírus melyik vírusnemzetségbe (csoportba) tartozik, (2) a
gazdanövénykörökben, a tünetekben és a vektorokban megnyilvánuló eltérések alapján különbséget kell tenni az
egyes vírusfajok között, (3) a provizórikus diagnózist specifikus vírusdiagnosztikai módszerek-kel (szerológia,
nukleinsav-hibridizáció, nukleotid- vagy aminosav-sorrend, immuno-elektronmikroszkópos vizsgálat stb.) kell
kiegészíteni.
Egy ismeretlen vírus identifikálása során a vírust jellemző tulajdonságok megállapításán kívül szükség van a
korábban leírt vírusokról szerzett információkra is, amelyeket az „Adatbázis” tartalmaz. A pragmatikus, vagy
logikai identifikációs stratégia a különböző forrásokból szerzett információkra épül (20. ábra). A pragmatikus
stratégia azon a tényen alapul, hogy mindegyik vírus egy meghatározott gazdanövénykörrel rendelkezik, ami
kiterjed egynéhány vagy több növénycsaládra, és ezeket a növényeket könynyebb identifikálni, mint a vírusokat.
Először a vírus természetes gazdájának meghatározására kerül sor, majd ezt követően meg kell állapítani, hogy
az adott gazdanövényből korábban milyen vírust vagy vírusokat izoláltak, és ezeknek a vírusoknak a
tulajdonságait össze kell hasonlítani az ismeretlen vírus tulajdonságaival. Bizonytalan esetekben szerológiai és
nukleinsav-hibridizációs vizsgálatot kell végezni. A fentiekre tekintettel az identifikációs stratégia iránya a 20.
ábra felső részén kezdődik, és folytatódik a specifikus összehasonlító tesztekkel. A logikai identifikációs
stratégia első lépése annak a megállapítása, hogy az ismeretlen vírus melyik víruscsoport csoportspecifikus
tulajdonságaihoz (víruspartikulumok alakja és mérete) hasonlít. Ezt követik a specifikus identifikálási
módszerek (lásd 20. ábra).
20. ábra - A víruskapcsolatok és specifitások identifikálásának stratégiai diagramja.
GVL = gazda–vírus lista, VCsA = víruscsoport-adatok, VA = vírusadatok [Brunt et al.,
1990 után]
1.4. Adatbázis-karakterek (jellemzők)
Az individuális vírusok „Adatbázisa” 18 fő szempontra van tekintettel, ezen belül pedig több mint 500
tulajdonságkaraktert foglal magában. A 18 fő szempont a következő: (1) a vírus neve, (2) bevezetés, (3)
természetes gazdanövénykör és tünetek, (4) átvitel és ökológia, (5) geográfia és elterjedés, (6) kísérleti
gazdanövénykör, (7) a víruspartikulum stabilitása és koncentrációja növényi szövetnedvben, (8) vírustisztítás,
(9) morfológia, (10) fizikai tulajdonságok, (11) kémiai összetétel, (12) replikáció, (13) citopatológia, (14)
szerológia, (15) rokonsági kapcsolatok, (16) diagnózis, (17) irodalom, (18) megjegyzés (ha van). A fő
szempontokon belül több mint 500 ismert karaktert tárol az „Adatbázis”. A „Vírusátvitel és ökológia” című pont
a fő szemponton belül pl. a következő karaktereket (jellemzőket) is tartalmazza:
A vírus terjedése a természetben:
1. Vektorral?
A vírusok adatbázisa
48 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2. Vektor nélkül?
3. Egyéb módszerrel? Ha igen, megnevezni!
Ha a vírus vektorral átvihető:
Vektorok:
1. A vektorok rovarok?
2. A vektorok atkák?
3. A vektorok fonálférgek?
4. A vektorok gombák?
5. A vektorok egyéb organizmusok?
A vektorok hova tartoznak?
1. Aleyrodidae?
2. Aphididae?
3. Cicadellidae?
4. Delphacidae?
5. Gymnocerata?
6. Psyllidae?
7. Membracidae?
8. Pseudococcidae?
9. Coleoptera?
10. Thysanoptera?
11. Eryophidae?
12. Tetranychidae?
13. Dorylamidae?
14. Trichodoridae?
15. Plasmodiophorales?
16. Chytridiales?
17. Egyéb? Ha igen, megnevezni!
Ha a vektor rovar, milyen kapcsolata van a vírussal?
1. Nem perzisztens?
2. Szemiperzisztens?
3. Perzisztens (cirkulatív)?
A vírust:
A vírusok adatbázisa
49 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1. Megőrzi a vektor, ha vedlik?
2. Elveszíti a vektor, ha vedlik?
A vírus:
1. Szaporodik a vektorban?
2. Nem szaporodik a vektorban?
A vírus:
1. Átvihető az utódokkal (pl. tojás)?
2. Nem vihető át az utódokkal?
Szükség van, vagy nincs szükség helper (segítő) komponensre az átvitelnél?
1. Szükséges helper vírus a vektorátvitelnél?
2. Nem szükséges helper vírus a vektorátvitelnél?
3. Szükséges helper komponens a vektorátvitelnél?
4. Nem szükséges helper komponens a vektorátvitelnél?
Ha a vírus nem vektorral vihető át, akkor:
A vírus:
1. Mechanikailag terjed?
2. Nem terjed mechanikailag?
A vírus:
1. Oltással vihető át?
2. Nem vihető át oltással?
A vírus:
1. Átvihető kontaktérintkezéssel?
2. Nem vihető át kontaktérintkezéssel?
A vírus:
1. Átvihető maggal?
2. Nem vihető át maggal?
A vírus:
1. Átvihető pollennel és maggal?
2. Átvihető pollennel történő beporzással?
3. Nem vihető át pollennel?
A „Morfológia” című, 9. pontba tartozó fő szemponton belül pl. a következő karakterek vannak:
A víruspartikulumok:
A vírusok adatbázisa
50 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1. Izometrikusak?
2. Ikerpartikulumok (gemini)?
3. Bacilus formájúak?
4. Pálcika vagy fonál alakúak?
5. Rhabdovirus-szerűek?
6. Szokatlan alakúak? Megnevezni!
A vírus:
1. Rendelkezik lipid burokkal?
2. Nem rendelkezik lipid burokkal?
Izometrikus, kvázi-izometrikus, gemini vagy bacilus formájú víruspartikulumok:
Víruspartikulumok:
1. Mekkora az átmérő nm-ben?
2. Mi a hosszúsága a bacilus formájú víruspartikulumoknak, vagy mi a tengelyhosszúsága az
ikerpartikulumoknak nm-ben?
Profil:
1. Lekerekített?
2. Angularis (szögletes)?
3. Átmeneti?
Kapszomer elrendeződés:
1. Jól látható?
2. Nem látható jól?
Pálcika alakú, fonál alakú vagy rhabdovirus alakú víruspartikulumok:
Partikulumok:
1. Pálcika?
2. Fonál?
Partikulumok:
1. Hosszúsága tisztán látható?
2. Hosszúsága nem látható tisztán?
Partikulumok:
1. Mekkora a tiszta hosszúság nm-ben?
2. Mekkora az átmérő nm-ben?
Axiális csatorna:
1. Látható?
A vírusok adatbázisa
51 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2. Homályos?
Mekkora az axiális csatorna átmérője nm-ben?
A vírusrészecske fő spirálja:
1. Látható?
2. Homályos?
Mekkora a fő spirál emelkedése nm-ben?
A nukleotidák/köpenyfehérje-alegységek száma?
Fehérjealegységek/spirál fordulatszáma?
Minden partikulumtípusra vonatkozóan:
A fertőzött növény szövetnedve:
1. Kevés partikulumot (kevesebb mint 10 partikulum/látómező, 20 000-szeres nagyításnál) tartalmaz?
2. Sok partikulumot (több mint 10 partikulum/látómező, 20 000 szeres nagyításnál) tartalmaz?
Szükséges-e fixálni a víruspartikulumokat a negatív festés előtt?
A 18 fő szempontot és több mint 500 tulajdonságot magában foglaló „Adatbázis” több szempontból is igen
jelentős: a) „ismeretlen” vírusok tulajdonságainak egzakt megállapításánál nélkülözhetetlen, b) új vírusok
elismertetése összehasonlító tulajdonságok nélkül nem lehetséges, c) a víruskutatásban és a vírusok egyetemi
oktatásában nélkülözhetetlen.
52 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
5. fejezet - A növényvírusok hivatalos elnevezése és akronímjai
A vírusok elnevezése és a vírusnevek gyakran pontatlan használata számos problémát és félreértést okozott. Az
idegen nyelvekből magyarra fordított vírusnevek a hazai irodalomban sem egységesek, és sok esetben hibásak.
Több hazai virológus megkísérelte közreadni a vírusok magyar neveit azzal a céllal, hogy a hazai nómenklatúra
egységes legyen. Az első ilyen összefoglaló munka Horváth (1972) nevéhez fűződik. Ebben a munkában
mintegy 700 növényvírus javasolt magyar neve található meg. Ezt követte V. Németh (1979) munkája, amely
elsősorban a gyümölcsfapatogén vírusok magyar neveit adta közre. Ez a két kézikönyv a növényvírusok magyar
neveit illetően ma is alapműnek tekinthető. Tekintettel azonban arra, hogy az egyes nyelvek (többek között a
magyar) nem tudják minden esetben pontosan visszaadni az eredetileg legtöbbször angol nyelven leírt vírusok
nevét, a növényvirológiában a vírusnevek írását illetően az angol nómenklatúra az elfogadott, amely minden
nemzet virológusai számára azonos értelmű és kötelező.
A növényvírusok nevei többnyire három [dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus)] vagy négy szóból
állnak [Dandelion sárga mozaik vírus (Dandelion yellow mosaic sequivirus)], de ismertek öt szóból álló
vírusnevek is [uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic tobamovirus)]. Ezek írása,
esetleg többször ismétlése egy tanulmányon belül szükségessé tette olyan betűszavak (akronímok) használatát,
amelyekkel a vírusok nevei lerövidíthetőek. Az akronímoktól elvárandó követelmények a következők: legyenek
egyszerűek, kerüljék az ismétléseket és a vírus szót, ill. nemzetségnevet „V” betűvel fejezzék ki (a viroidoknál
ez „Vd”). A vírusok standard akronímjairól elsőként Hull et al. (1991) közölt listát. Ebben a listában több mint
500 növényvírus akronímja található meg. Az akronímok fellelhetők még Matthews (1991), Horváth (1993a, b,
c) és Brunt et al. (1996a, b) összefoglaló munkáiban.
Az e könyvben előforduló vírusok magyar és angol hivatalos neveit, valamint akronímjait a 6. táblázat
tartalmazza.
6. táblázat - A vírusok magyar és angol nevei, valamint akronímjai1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
Magyar név Angol név Akroním
Abutilon sárgaság vírus Abutilon yellows ? crinivirus* AYV
Alma 227 epinasztia és
pusztulás vírus Apple spy 227 epinasty and
decline virus (syn.: Quince sooty
ring spot virus); (syn.: Apple stem
pitting virus)
ASEDV
Alma klorotikus levélfoltosság
vírus Apple chlorotic leaf spot
trichovirus** ACLSV
Alma mozaik vírus Apple mosaic ilarvirus ApMV
Alma törzsgöndörödés vírus Apple stem pitting virus****** ASPV
Alma törzsbarázdáltság vírus Apple stem grooving capillovirus ASGV
Ananász klorotikus
levélcsíkosság vírus Pineapple chlorotic leaf streak ?
nucleorhabdovirus PCLSV
Angolperje mozaik vírus Ryegrass mosaic rymovirus RGMV
Anthoxanthum látens halvány
vírus Anthoxanthum latent blanching
hordeivirus ALBV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
53 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Arabis mozaik vírus Arabis mosaic nepovirus ArMV
Arracacha B-vírus Arracacha B ? nepovirus AVB
Articsóka tarka fodrosodás
vírus Artichoke mottled crinkle
tombusvirus AMCV
Áfonya levélfoltosság vírus Blueberry leaf mottle nepovirus BLMV
Árpa csíkos mozaik vírus Barley stripe mosaic hordeivirus BSMV
Árpa sárga csíkos mozaik
vírus Barley yellow striate mosaic
cytorhabdovirus BYSMV
Árpa sárga mozaik vírus Barley yellow mosaic bymovirus BaYMV
Árpa sárga törpülés vírus Barley yellow dwarf luteovirus BYDV
Árpa sárga törpülés vírus
MAV törzs Barley yellow dwarf luteovirus
(MAV strain)*** BYDV-
MAV
Bab aranysárga mozaik vírus Bean golden mosaic
begomovirus** BGMV
Bab déli mozaik vírus Bean southern mosaic
sobemovirus SBMV
Bab enyhe mozaik vírus Bean mild mosaic carmovirus BMMV
Babhüvely foltosság vírus Bean pod mottle comovirus BPMV
Bab közönséges mozaik vírus Bean common mosaic potyvirus BCMV
Bab sárga érszalagosodás
vírus Bean yellow vein banding
umbravirus BYVBV
Bab sárga mozaik vírus Bean yellow mosaic potyvirus BYMV
Bab törpülés mozaik vírus Bean dwarf mosaic begomovirus BDMV
Baktövis (Astragalus)
törpeség vírus Milk vetch dwarf nanavirus MVDV
Banán csúcscsokrosodás vírus Banana bunchy top nanavirus BBTV
Bársonyos dohány foltosság
vírus Velvet tobacco mottle
sobemovirus VTMoV
Beléndek mozaik vírus Henbane mosaic potyvirus HMV
Borsó ál-levélsodródás vírus Pea false leaf roll virus PFLV*
Borsó enációs mozaik vírus Pea enation mosaic enamovirus PEMV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
54 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Borsó korai barnulás vírus Pea early browning tobravirus PEBV
Borsó súlyos mozaik vírus Pea severe mosaic potyvirus PeSMV
Burgonya andeszi foltosság
vírus Potato Andean mottle comovirus APMoV
Burgonya andeszi látens vírus Potato Andean latent tymovirus APLV
Burgonya A-vírus Potato A potyvirus PVA
Burgonya fekete
gyűrűsfoltosság vírus Potato black ringspot nepovirus PBRSV
Burgonya levélsodródás vírus Potato leafroll luteovirus PLRV
Burgonya levélsodródás vírus Potato leafroll polerovirus PLRV
Burgonya M-vírus Potato M carlavirus PVM
Burgonya sárgaság vírus Potato yellowing alfamovirus PYV
Burgonya S-vírus Potato S carlavirus PVS
Burgonya sárga törpülés vírus Potato yellow dwarf
nucleorhabdovirus PYDV
Burgonya szártarkulás vírus Tobacco rattle tobravirus TRV
Burgonya szártörpülés vírus Potato mop-top pomovirus** PMTV
Burgonya T-vírus Potato T vitivirus** PVT
Burgonya X-vírus Potato X potexvirus PVX
Burgonya Y-vírus Potato Y potyvirus PVY
Burgonya V-vírus Potato V potyvirus PVV
Búza csíkos mozaik vírus Wheat streak mosaic
tritimovirus*** WSMV
Búza talajlakó mozaik vírus Wheat soil-borne mosaic
furovirus SBWMV
Búza törpülés vírus Wheat dwarf monogeminivirus WDV
Camellia sárga foltosság vírus Camellia yellow mottle ?
varicosavirus CYMV
Cassava afrikai mozaik vírus Cassava African mosaic
bigeminivirus ACMV
Cassava barna csíkossággal- Cassava brown streak-associated CBSaV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
55 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
társult vírus carlavirus
Cassava érmozaik vírus Cassava vein mosaic virus CsVMV
Chenopodium mozaik vírus Sowbane mosaic sobemovirus SoMV
Chrysanthemum szárnekrózis
vírus Chrysanthemum stem necrosis
tospovirus CSNV*
Citrus ér-enációs vírus Citrus vein enation virus CVEV
Citrus gyűrűsfoltosság vírus Citrus ringspot virus CRSV
Citrus leprózis vírus Citrus leprosis ? rhabdovirus CiLV
Citrus mozaik vírus Citrus mosaic badnavirus CiMV
Citrus psorozis vírus Citrus psorosis virus CiPV
Citrus rongyoslevelűség vírus Citrus tatter leaf capillovirus CTLV
Citrus sömör-gyűrűsfoltosság
vírus Citrus psorosis-ringspot ?
ophiovirus CPsRSV
Citrus tarkaság vírus Citrus variegation ilarvirus CVV
Citrus tristeza vírus Citrus tristeza closterovirus CTV
Commelina sárga foltosság
vírus Commelina yellow mottle
badnavirus ComYMV
Cukkini letális klorózis vírus Zucchini lethal chlorosis
tospovirus ZLCV*
Cukkini sárga mozaik vírus Zucchini yellow mosaic potyvirus ZYMV
Cukornád enyhe mozaik vírus Sugarcane mild mosaic
closterovirus SMMV
Cymbidium gyűrűsfoltosság
vírus Cymbidium ringspot tombusvirus CymRSV
Cseresznye aprógyümölcsűség
vírus Cherry little cherry virus CLCV
Cseresznye érdeslevelűség
vírus Cherry rasp leaf nepovirus CRLV
Cseresznye levélsodródás
vírus Cherry leafroll nepovirus CLRV
Csomós ebír foltosság vírus Cocksfoot mottle sobemovirus CoMV
Csorbóka sárgaerűség vírus Sowthistle yellow vein
nucleorhabdovirus SYVV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
56 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Dandelion sárga mozaik vírus Dandelion yellow mosaic
sequivirus DYMV
Dália mozaik vírus Dahlia mosaic caulimovirus DMV
Dendrobium érnekrózis vírus Dendrobium vein necrosis ?
closterovirus DVNV
Dinnye foltos hervadás vírus Melon spotted wilt tospovirus* MSWV
Dinnye ourmia vírus Melon ourmia ourmiavirus OuMV
Diodia érklorózis vírus Diodia vein chlorosis ? crinivirus DVCV
Dioscorea bacilus alakú vírus Dioscorea bacilliform badnavirus DBV
Dohány csíkosság vírus Tobacco streak ilarvirus TSV
Dohány enyhe zöld mozaik
vírus Tobacco mild green mosaic
tobamovirus TMGMV
Dohány érfoltosság vírus Tobacco vein mottling potyvirus TVMV
Dohány gyűrűsfoltosság vírus Tobacco ringspot nepovirus TRSV
Dohány karcolatos vírus Tobacco etch potyvirus TEV
Dohány mozaik vírus Tobacco mosaic tobamovirus TMV
Dohány nekrotikus törpülés
vírus Tobacco necrotic dwarf luteovirus TNDV
Dohány nekrózis vírus Tobacco necrosis necrovirus TNV
Dohány rattle vírus Tobacco rattle tobravirus TRV
Dohány sárga törpülés vírus Tobacco yellow dwarf
monogeminivirus TYDV
Dohány satnyulás vírus Tobacco stunt varicosavirus TStV
Édesburgonya enyhe foltosság
vírus Sweet potato mild mottle
ipomovirus SPFMV
Édesburgonya klorotikus
törpülés vírus Sweet potato chlorotic stunt ?
crinivirus SPVSV
Édesburgonya sárga törpülés
vírus Sweet potato yellow dwarf
ipomovirus SPMMV
Epirusz cseresznye vírus Epirus cherry ourmiavirus EpCV
Euphorbia mozaik vírus Euphorbia mosaic bigeminivirus EuMV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
57 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Fehérhere mozaik vírus White clover mosaic potexvirus WClMV
Fehérhere rejtett vírus 1 White clover cryptic
alphacryptovirus WCCV-1
Fehérhere rejtett vírus 2 White clover cryptic
betacryptovirus WCCV-2
Fekete málna látens vírus Black raspberry latent ilarvirus BRLV
Fiji betegség vírus Fiji disease fijivirus FDV
Földieper enyhe sárga
levélszélűség Strawberry mild yellow edge ?
potexvirus vírus SMYEaV
Földieper érszalagosodás vírus Strawberry vein banding ?
caulimovirus******* SVBV
Földieper göndörödés vírus Strawberry crinkle
cytorhabdovirus SCrV
Földieper látens C-vírus Strawberry latent C ? rhabdovirus SLV
Földieper látens
gyűrűsfoltosság vírus Strawberry latent ringspot ?
nepovirus SLRSV
Földimogyoró bokrosodás
vírus Peanut clump pecluvirus** PCV
Földimogyoró foltosság vírus Peanut mottle potyvirus PeMoV
Földimogyoró gyűrűsfoltosság
vírus Groundnut ringspot tospovirus GRSV*
Földimogyoró klorotikus
legyező-foltosság vírus Peanut chlorotic fan-spot
tospovirus PCSV
Földimogyoró rügynekrózis
vírus Groundnut bud necrosis
tospovirus* GBNV
Földimogyoró satnyulás vírus Peanut stunt cucumovirus PSV
Freesia levél nekrózis vírus Freesia leaf necrosis
varicosavirus FLNV*
Görögdinnye ezüstfoltosság
vírus Watermelon silver mottle
tospovirus* WSMV
Görögdinnye mozaik vírus Watermelon mosaic potyvirus WMV
Görögdinnye mozaik 2-vírus Watermelon mosaic 2 potyvirus WMV-2
Görögdinnye rügynekrózis
vírus Watermelon bud necrosis
tospovirus WBNV*
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
58 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Heracleum látens vírus Heracleum latent ? trichovirus HLV
Heracleum vírus 6 Heracleum 6 ? closterovirus HV-6*
Here földalatti törpülés vírus Subterranean clover stunt
nanavirus SCSV
Here nekrotikus mozaik vírus Sweet clover necrotic mosaic
dianthovirus SCNMV
Here sárga erűség vírus Clover yellow vein potyvirus ClYMV
Here seb tumor vírus Clover wound tumor
phytoreovirus WTV
Impatiens nekrotikus foltosság
vírus Impatiens necrotic spot tospovirus INSV*
Indiai földimogyoró
bokrosodás virus Indian peanut clump pecluvirus** IPCV*
Iris sárga foltosság vírus Iris yellow spot tospovirus IYSV*
Kakaó duzzadt hajtás vírus Cacao swollen shoot badnavirus CSSV
Karfiol mozaik vírus Cauliflower mosaic caulimovirus CaMV
Kókusz hajtás leromlás vírus Coconut foliar decay nanavirus CFDV
Körte érsárgulás vírus Pear vein yellows virus (syn.:
Apple stem pitting virus) ASPV
Körte kövecsesedés vírus Pear stony pit virus PSPV*
Kukorica csíkos mozaik vírus Maize dwarf mosaic potyvirus
(syn.: Kukorica törpe mozaik
vírus)
MDMV
Kukorica csíkosság vírus Maize streak mastrevirus** MSV
Kukorica fehérvonalas mozaik
vírus Maize white line mosaic virus MWLMV
Kukorica finom csíkozottság
vírus Maize rayado fino marafivirus MRFV
Kukorica klorotikus foltosság
vírus Maize chlorotic mottle
machlomovirus MCMV
Kukorica klorotikus törpülés
vírus Maize chlorotic dwarf waikavirus MCDV
Kukorica sávos mozaik vírus Maize stripe mosaic tenuivirus MSpV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
59 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Kukorica finom csíkozottság
vírus Maize rayado fino marafivirus MRFV
Liliom tünetmentes vírus Lily symptomless carlavirus LSV
Lóbab enyhe foltosság vírus Broad bean mild mottle
bromovirus BBMMV
Lóbab foltosság vírus Broad bean mottle bromovirus BBMV
Lóbab hervadás vírus Broad bean wilt fabavirus BBWV
Lóbab nekrotikus sárgaság
vírus Faba bean necrotic yellows
nanavirus FBNYV*
Lóbab nekrózis vírus Broad bean necrosis furovirus BBNV
Lóbab tarkulás vírus Broad bean mottle bromovirus BBMV
Lucerna látens vírus Alfalfa latent carlavirus ALV
Lucerna mozaik vírus Alfalfa mosaic alfamovirus AMV
Lychnis gyűrűsfoltosság vírus Lychnis ringspot hordeivirus LRSV
Maclura mozaik vírus Maclura mosaic macluravirus MacMV
Manióka afrikai mozaik vírus Cassava African mosaic
bigeminivirus ACMV
Manioka Ivoriai bacilus
formájú vírus Cassava Ivorian bacilliform
ourmiavirus CIBV*
Málna bokros törpülés vírus Raspberry bushy dwarf
idaeovirus RBDV
Málna levélgöndörödés vírus
(amerikai) Raspberry leaf curl ? luteovirus RLCV
Málna gyűrűsfoltosság vírus Raspberry ringspot nepovirus RpRSV
Melandrium sárga foltosság
vírus Melandrium yellow fleck
bromovirus MYFV
Nandina szár himlő vírus Nandina stem pitting capillovirus NSPV
Narcissus látens vírus Narcissus latent macluravirus NLV
Odontoglossum
gyűrűsfoltosság vírus Odontoglossum ringspot
tobamovirus ORSV
Olajfa látens vírus 2 Olive latent 2 oleavirus** OLV-2
Ourmia dinnye vírus Ourmia melon ourmiavirus OuMV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
60 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Őszibarack (amerikai) mozaik
vírus Peach (American) mosaic vírus PAMV
Őszibarack rozettás mozaik
vírus Peach rosette mosaic nepovirus PRMV
Papaya gyűrűsfoltosság vírus Papaya ringspot potyvirus PRSV
Paprika enyhe foltosság vírus Paprika mild mottle tobamovirus PaMMV
Paprika enyhe „tigré” vírus Pepper mild tigré ? bigeminivirus PepMTV
Paprika érfoltosság vírus Pepper veinal mottle potyvirus PVMV
Paprika érszalagosodás vírus Pepper vein banding virus PVBV*
Paprika foltosság vírus Pepper mottle potyvirus PepMoV
Paradicsom ál-
levélgöndörödés vírus Tomato pseudo-curly top hybri-
geminivirus RPCTV
Paradicsom bokros törpülés
vírus Tomato bushy stunt tombusvirus TBSV
Paradicsom bronzfoltosság
vírus Tomato spotted wilt tospovirus TSWV
Paradicsom fekete gyűrűs
vírus Tomato black ring nepovirus TBRV
Paradicsom fertőző klorózis
vírus Tomato infectious chlorosis
crinivirus TICV*
Paradicsom Florida vírus Tomato Florida virus* ToFV
Paradicsom foltos hervadás
vírus Tomato spotted wilt tospovirus
(syn.: Paradicsom bronzfoltosság
vírus)
TSWV
Paradicsom foltosság vírus Tomato mottle bigeminivirus ToMoV
Paradicsom gyűrűsfoltosság
vírus Tomato ringspot nepovirus ToRSV
Paradicsom klorotikus
foltosság vírus Tomato chlorotic spot tospovirus TCSV*
Paradicsom klorózis vírus Tomato chlorosis crinivirus ToCV*
Paradicsom levélgöndörödés
vírus Tomato leaf curl bigeminivirus
(-begomovirus)
TLCV
Paradicsom levélráncosodás
vírus Tomato leaf crumple
bigeminivirus TLCV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
61 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Paradicsom magtalanság vírus Tomato aspermy cucumovirus TAV
Paradicsom mozaik vírus Tomato mosaic tobamovirus ToMV
Paradicsom sárga
levélgöndörödés vírus Tomato yellow leaf curl
bigeminivirus TYLCV
Paszternák sárga foltosság
vírus Parsnip yellow fleck sequivirus PYFV
Pelargonium foltosság vírus Pelargonium zonale spot
ourmiavirus PZSV
Pittosporum érsárgulás vírus Pittosporum vein yellowing
nucleorhabdovirus PVYV
Poa szemilátens vírus Poa semilatent hordeivirus PSLV
Póréhagyma fehér csíkos vírus Leek white stripe necrovirus LWSV*
Pothos látens vírus Pothos latent aureovirus* PoLV
Prunus nekrotikus
gyűrűsfoltosság vírus Prunus necrotic ringspot ilarvirus PNRSV
Ranunculus 3 vírus Ranunculus 3 ? ophiovirus RnV3*
Retek mozaik vírus Radish mosaic comovirus RaMV
Répa álsárgaság vírus Beet pseudo yellows crinivirus* BPYV
Répa levélcsúcs fodrosodás
vírus Beet curly top curtovirus** BCTV
Répa levélgöndörödés vírus Beet leaf curl ? rhabdovirus BLCV
Répa nekrotikus sárgaerűség
vírus Beet necrotic yellow vein
benyvirus**** BNYVV
Répa nyugati sárgaság vírus Beet western yellows ?
betaluteovirus*** BWYV
Répa nyugati sárgaság vírus Beet western yellows luteovirus BWYV
Répa sárgaság vírus Beet yellows closterovirus BYV
Répa talajlakó vírus Beet soil-borne furovirus BSBV
Rizs csíkosság vírus Rice stripe tenuivirus RSV
Rizs érdes törpülés vírus Rice ragged stunt oryzavirus RRSV
Rizs törpülés vírus Rice dwarf phytoreovirus RDV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
62 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Rizs tungro bacilus alakú vírus Rice tungro bacilliform
badnavirus RTBV
Rizs tungro szférikus vírus Rice tungro spherical waikavirus RTSV
Rozsnok csíkos mozaik vírus Brome streak mosaic
tritimovirus*** BrSMV*
Rozsnok mozaik vírus Brome mosaic bromovirus BMV
Saláta érvastagodás vírus Lettuce big-vein varicosavirus LBVV
Saláta fertőző sárgaság vírus Lettuce infectious yellows
crinivirus** LIYV
Saláta klorózis vírus Lettuce chlorosis crinivirus LCV*
Saláta mozaik vírus Lettuce mosaic potyvirus LMV
Saláta nekrotikus sárgaság
vírus Lettuce necrotic yellows
cytorhabdovirus LNYV
Satsuma törpülés vírus Satsuma dwarf ? nepovirus SDV
Sárgadinnye sárgaság vírus Muskmelon yellows ? crinivirus MYV
Sárgarépa foltosság vírus Carrot mottle umbravirus CMoV
Sárgarépa vörös levelűség
vírus Carrot red leaf luteovirus CRLV
Seb tumor vírus Wound tumor phytoreovirus WTV
Sinaloa paradicsom
levélgöndörödés Sinaloa tomato leaf curl
begomovirus vírus STLCV
Solanum nodiflorum foltosság
vírus Solanum nodiflorum mottle
sobemovirus SNMV
Sorghum klorotikus foltosság
vírus Sorghum chlorotic spot furovirus SgCSV
Szatellit dohány nekrózis vírus Tobacco necrosis satellivirus satTNV
Szatellit köles mozaik vírus Panicum mosaic satellivirus PMV
Szegfű foltosság vírus Carnation mottle carmovirus CarMV*
Szegfű gyűrűsfoltosság vírus Carnation ringspot dianthovirus CRSV
Szegfű karcolatos gyűrűs vírus Carnation etched ring
caulimovirus CERV
Szegfű látens vírus Carnation latent carlavirus CLV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
63 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Szegfű nekrotikus foltosság
vírus Carnation necrotic fleck
closterovirus CNFV
Szegfű vírus 1 Carnation 1 alphacryptovirus CCV-1
Szilva (amerikai) vonalas
mintázottság Plum (American) line pattern
ilarvirus vírus APLPV
Szilva himlő vírus Plum pox potyvirus PPV
Szilva törpülés vírus Prune dwarf ilarvirus PDV
Szójabab klorotikus foltosság
vírus Soybean chlorotic mottle virus SbCMV
Szójabab mozaik vírus Soybean mosaic potyvirus SMV
Szójabab törpülés vírus Soybean dwarf luteovirus SbDV
Szőlő A-vírus Grapevine A vitivirus** GAV
Szőlő bulgáriai látens vírus Grapevine Bulgarian latent
nepovirus GBLV
Szőlő enációs vírus Grapevine enation virus* GEnV
Szőlő érmenti mozaik vírus Grapevine veinal mosaic virus* GVMV
Szőlő érnekrózis vírus Grapevine veinal necrosis virus* GVNV
Szőlő faszöveti barázdáltság
vírus Grapevine stem pitting
closterovirus GSPV
Szőlő fertőző leromlás vírus Grapevine fanleaf nepovirus
(syn.: Szőlő páfránylevelűség
vírus)
GFLV
Szőlő foltosodás vírus Grapevine fleck virus GFkV
Szőlő króm mozaik vírus Grapevine chrome mosaic
nepovirus GCMV
Szőlő parakérgűség vírus Grapevine corky bark-associated
? closterovirus* GCBaV
Szőlő páfránylevelűség vírus Grapevine fanleaf nepovirus
(syn.: Szőlő leromlás vírus) GFLV
Szőlő vonalas mintázottság
vírus Grapevine line pattern ? ilarvirus GLPV
Tarlórépa göndörödés vírus Turnip crinkle carmovirus TCV
Tarlórépa mozaik vírus Turnip yellow mosaic tymovirus TYMV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
64 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tarlórépa rozettás vírus Turnip rosette sobemovirus TRoV
Tarlórépa sárga mozaik vírus Turnip yellow mosaic tymovirus TYMV
Tehénborsó enyhe foltosság
vírus Cowpea mild mottle carlavirus CPMMV
Tehénborsó klorotikus
foltosság vírus Cowpea chlorotic mottle
bromovirus CCMV
Tehénborsó mozaik vírus Cowpea mosaic comovirus CPMV
Tehénborsó súlyos mozaik
vírus Cowpea severe mosaic comovirus CPSMV
Tök levélgöndörödés vírus Squash leaf curl bigeminivirus SLCV
Tök mozaik vírus Squash mosaic comovirus SqMV
Tök sárga törpülés
rendellenesség vírus Cucurbit yellow stunting disorder
crinivirus CYSDV*
Tulipán enyhe foltosság vírus Tulip mild mottle ? ophiovirus TMMV*
Tulipán színtörés vírus Tulip breaking potyvirus TBV
Uborka érsárgulás vírus Cucumber vein yellowing virus CVYV
Uborka klorotikus foltosság
vírus Cucumber chlorotic spot
crinivirus** CCSV
Uborka levélfoltosság vírus Cucumber leaf spot
carmovirus***** CLSV
Uborka mozaik vírus Cucumber mosaic cucumovirus CMV
Uborka nekrózis vírus Cucumber necrosis tombusvirus CuNV
Uborka sárgaság vírus Cucumber yellows ? crinivirus CuYV
Uborka zöldfoltosság mozaik
vírus Cucumber green mottle mosaic
tobamovirus CGMMV
Vad uborka mozaik vírus Wild cucumber mosaic tymovirus WCMV
Vöröshere érmozaik vírus Red clover vein mosaic carlavirus RCVMV
Vöröshere tarkulás vírus Red clover mottle comovirus RCMV
Vöröshere vírus 2 Red clover 2 betacryptovirus RCCV-2
Zab arany csíkos vírus Oat golden stripe furovirus OGSV
Zab kék törpülés vírus Oat blue dwarf marafivirus OBDV
A növényvírusok hivatalos
elnevezése és akronímjai
65 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1 E helyen azoknak a vírusoknak a felsorolása található, amelyek a könyvben előfordulnak. Részletesebb adatok
Hull et al. (1991), Matthews (1991), Horváth (1993a,b,c), Brunt et al. (1996a,b) és Pringle (1998) munkáiban
találhatók.
2 A *-gal megjelölt vírusok akronímjai Brunt et al. (1996a,b) munkájában nem szerepelnek.
3 A ?-lel megjelölt vírusok taxonómiai helye még bizonytalan.
4 A **-gal jelölt vírusok új taxonómiai helye.
5 A ***-gal nevezett vírusok újabban javasolt taxonómiai helye.
6 A ****-gal jelölt vírus [répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein virus)] újabban a
Benyvirus nemzetségbe tartozik.
7 A *****-gal jelölt vírus [uborka levélfoltosság vírus (cucumber leaf spot carmovirus)] újabb taxonómiai helye
a Tombusviridae család Aureusvirus nemzetségben van; újabb tudományos neve: cucumber leaf spot
aureusvirus (Martelli et al., 1998).
8 A ******-gal elölt vírus [alma törzsgöndörödés vírus (apple stem pitting virus)] a legújabb vizsgálatok szerint
a Foveavirus nemzetségbe tartozik (Martelli és Jelkmann, 1998).
9 A *******-gal jelölt vírus földieper érszalagosodás vírus (strawberry vein banding ? caulimovirus)], a
Caulimovirus nemzetség definitív tagja (Petrzik et al., 1998).
66 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
6. fejezet - A növényvirológiában használt fontosabb növények kódjai
Néhány évvel korábban javaslatot tettünk a növényvirológiában használt diagnosztikai, propagatív, általános
próbanövények (assay host), lokális gazdanövények (local assay host) és szisztemikus gazdanövények (systemic
assay host), valamint a nem gazdanövények (non-hosts) kódjaira vonatkozóan (Horváth, 1993a, b, c). A
kódrendszert az Amerikai és Japán Gyomnövénykutató Társaság (Weed Science Society of America, WSSA,
Weed Science Society of Japan, WSSJ) javasolt komputerkódjainak adaptálásával és kiterjesztésével készítettük
el. Tekintettel arra, hogy ezek a komputerkódok nem terjedtek ki a növényfajták és hibridek neveire, valamint a
gazdanövények legfontosabb tulajdonságaira (diagnosztikai, propagatív és assay-növények) – holott ezeknek a
növényvirológiában igen nagy a jelentőségük –, ezekre vonatkozóan is javaslatot tettünk.
A növények kódja öt betűből áll. Az első három betű a növény nemzetségnevét (LAC = Lactuca), az utolsó két
betű pedig a fajnevet (SA = sativa) fejezi ki; Lactuca sativa = LACSA. Ha a fajnév nincs megjelölve, akkor az
ismeretlen fajnév jelölésére az SS kódot kell használni (pl. Lactuca species = LACSS).
A növényfajták és -hibridek nevének rövidítésére olyan három betűt javasolunk, amely a szó, ill. a szavak
összetételében a legkönnyebben kiejthető, és amelyet kötőjellel elválasztva adunk meg. A saláta (Lactuca sativa
= LACSA) Valmaine fajta (VAL) kódja a következő: LACSA-VAL.
A növények családi hovatartozására – amelynek ismerete nagyon fontos a virológiában – hárombetűs kódot
ajánlunk, amelyet kötőjel választ el a faj, ill. a fajta vagy hibrid nevétől: Compositae család = COM. Az említett
példa alapján a családba tartozó Lactuca sativa Valmaine fajta kódja a következő: LACSA-VAL-COM
(Horváth, 1993c).
A gazdanövények a virológiában lényeges tulajdonságaik alapján öt csoportba sorolhatók: (1) általános próba-
(assay-) növények, (2) lokális próbanövények, (3) szisztemikus próbanövények, (4) diagnosztikai növények, (5)
propagatív növények. A gazdanövényeknek eme tulajdonságai igen fontosak, ezért a fenti tulajdonságok
kódjaira a következő 2–4 betűs kódot javasoljuk: AH = általános próbanövény, AHL = lokális próbanövény,
AHLS = lokális és szisztemikus próbanövény, AHL(S) = lokális próbanövény, de egyes vírustörzsekre
szisztemikus is, AHS = szisztemikus próbanövény, DH = diagnosztikai gazda, PH = propagatív gazda (Horváth,
1993c).
A fentiek alapján a növényvirológiában előforduló fontosabb növények kódrendszerét a 7. táblázatban közöljük.
7. táblázat - A növényvirológiában használt fontosabb kísérleti növények kódjai1
A növény latin neve Növénykód
Fajta-
vagy
hibridkó
d
Családk
ód2
Gazdatulajdons
ág
kódja3
Ammi majus AMINA UMB DH, PH
Beta vulgaris cv. Monobusch BEAVA MOB CHE PH
Brassica campestris cv. Just Right BRSCA JTR CRU PH
Chenopodium quinoa CHEQU CHE AHL, AHS
Cucumis melo CUMME CUC DH, PH
C. sativus cv. Delicatess CUMSA DEL CUC DH, PH
Datura metel DATME SOL DH, PH
A növényvirológiában használt
fontosabb növények kódjai
67 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
D. stramonium DATST SOL AHL
Gomphrena globosa GOMGL AMA DH, PH, AHL
Lactuca sativa cv. Valmaire LACSA VAL COM DH, PH
Lycium spp. LYUSS SOL AHL, DH
Lycopersicon esculentum LYPES SOL PH
Nicotiana benthamiana NIOBE SOL DH, PH
N. clevelandii NIOCL SOL DH, PH
N. glutinosa NIOGT SOL AHL, DH, PH
N. tabacum cv. Samsun NIOTA SAM SOL DH, PH
N. tabacum cv. White Burley NIOTA WHB SOL DH, PH
N. tabacum cv. Xanthi-nc NIOTA XNC SOL AHL, DH, PH
Petunia hybrida PEUHY SOL DH, PH
Phaseolus vulgaris cv. Pinto PHSVX PIN LEG AHL, DH, PH
P. vulgaris cv. Red Kidney PHSVX RKY LEG DH, PH
Physalis floridana PHYFL SOL DH, PH
Pisum sativum PIBSA LEG DH, PH
Solanum demissum x S. tuberosum
„A6‟ SOLHY TUA SOL AH. AHL, DH
Tetragonia expansa TEATE AIZ DH, PH
Tropaeolum majus TOPMA TRP PH
Vigna sinensis VIGSI LEG DH, PH
Zinnia elegans ZITEL COM PH
1 Részletesebb adatok találhatók Horváth (1993a, b) munkáiban.
2 AIZ, Aizoaceae; AMA, Amaranthaceae; CHE, Chenopodiacea; COM, Compositae; CRU, Cruciferae; CUC,
Cucurbitaceae; LEG, Leguminosae; SOL, Solanaceae; TRP, Tropaeolaceae; UMB, Umbelliferae.
3 AH, kvantitatív vizsgálatokra alkalmas lokális gazda; AHL, lokális gazda; AHS, kvantitatív vizsgálatokra
alkalmas szisztemikus gazda; AHLS, lokális és szisztemikus kvantitatív vizsgálatokra alkalmas növény; DH,
diagnosztikai célokra alkalmas növény; PH, a vírus felszaporítására alkalmas gazdanövény. A növények eme
tulajdonságai gazda–vírus kapcsolatok szerint váltakoznak.
68 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
7. fejezet - A vírusátvitel módszerei
A vírusok átvihetőségének (terjedésének) ismerete – a betegségeket kiváltó egyéb kórokozókhoz hasonlóan –
alapvető jelentőségű. A vírusok élő szervezetbe jutása passzív folyamat. A vírusoknak ui. nincsenek olyan
enzimei, amelyek lehetővé tehetnék a növényi sejtekbe történő aktív bejutását. Az átvitel többnyire külső
segítséggel történik. A vírusátvitel lehetőségei alapvetően két nagy csoportba sorolhatóak: (1) állatvektor nélküli
vírusátvitel és (2) állatvektorokkal történő vírusátvitel. Az egyes terjedési, vírusátviteli módok vírusoktól
függően eltérőek lehetnek, de az egyes átviteli lehetőségek kombinálódhatnak is egymással (Horváth, 1972;
Fritzsche et al., 1972; Schmelzer, 1980; Jones, 1993a,b; Dijkstra és De Jager, 1998; Horváth, 1999).
1. Állatvektor nélküli vírusátvitel
1.1. Oltással történő átvitel
Alapvetően minden növényvírus oltással átvihető; ennek feltétele, hogy a vírus szisztemikus megbetegedést
legyen képes kiváltani, és hogy a vírusbeteg, valamint egészséges növények között szöveti kompatibilitás
legyen. Az oltás, a szemzés, a dugvá-nyozás igen kiterjedt módszere a vírusátvitelnek. Az alany vagy az
oltóvessző fertőzöttsége az egész növényre egyaránt átterjed. Az oltás különböző módjait a 21. ábra szemlélteti.
21. ábra - A virológiában alkalmazott fontosabb oltási módszerek. A: zöldoltás
hasítékba; B: párosítás; C: héj alá oltás; D: érintkezéses oltás; E: palackoltás; F:
hagymaoltás; G: szemzés; H: szemlapozás (chipszemzés); I: gumóba oltás; J:
heteroplasztikus oltás (zöld hajtás fás részbe oltása); K: levéloltás kétszikűek esetében;
L: levéloltás az egyszikű Liliaceae családba tartozó növényeknél [Schmelzer, 1980 után]
Az oltás módszere (Noordam, 1973)
a. Egy vízszintesen félbevágott Nicotiana tabacum növény szárán tegyünk kb. 3 cm mély metszést. Ez képezi
majd az oltás alapját, és ez akadályozza meg az oltóág és az alany elmozdulását egymástól.
b. Vágjuk le egy N. glutinosa növény hajtását. Távolítsunk el róla 1–2 alsó levelet, ezzel megelőzhetjük az
oltóvessző elhervadását. Túl sok levelet nem érdemes eltávolítani, mert ez megakadályozhatja a további
növekedést. Nyessük meg a szár végét úgy, hogy kb. 2 cm hosszú ék keletkezzen rajta.
c. Helyezzük a N. glutinosa szárának ék alakú végét a N. tabacum bevágott szárába. Tekerjük körbe rafiával
vagy kötözőhánccsal, amelyet előzőleg vízzel hajlékonnyá tettünk. A kötözéshez használhatunk gumiszalagot
vagy parafilmet is.
d. Címkézzük fel a cserepeket és különítsük el a növényt a többitől.
e. Ugyanilyen módszerrel helyezzünk el három N. tabacum alanyra egy N. glutinosa és két N. tabacum hajtást.
Hagyjunk meg két N. glutinosa és két N. tabacum növényt teljesen sértetlenül. Valamennyi dohánynövényt
helyezzük biztonságba, páradús helyre.
A vírusátvitel módszerei
69 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
f. Egy hét elteltével inokuláljuk az alanyon lévő leveleket 5 mg/l dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic
tobamovirus) és ugyanígy a kontrollnövények alsó leveleit.
g. Szellőztessük a növényeket, óvjuk őket a befülledéstől. Először három nap múlva, majd rövid
periódusonként, később rendszeresen, hosszabb időközönként szellőztessünk.
h. Távolítsuk el az alsó levelek új hajtásait.
i. Ellenőrizzük a vírusátvitel eredményességét.
A Nicotiana tabacum cv. Samsun növények levelein (akár alany volt akár nem) egy hét után érkivilágosodás
vagy mozaik jelenik meg. A N. glutinosa növények inokulált alsó levelein két nap múlva lokális léziók tűnnek
fel. A N. glutinosa oltóvesszők csúcsi levelein nekrózisok fejlődnek ki, míg a kifejlett levelek tünetmentesek
maradnak. Ebből arra következtethetünk, hogy a vírustranszport a floemen keresztül valósul meg, valamint
láthatóvá válnak a rezisztenciában megmutatkozó különbségek is.
1.2. Mechanikai átvitel
A mechanikai átvitel a vírusok legegyszerűbb terjedési módja, amely sebzéseken keresztül történik.
Eredményessége függ a vírus környezeti hatásokkal szembeni ellenállóságától, a vírusgazdanövény adottságaitól
(inhibitorok) és a fertőzendő tesztnövény fogékonyságától. Ez utóbbit befolyásolják a külső környezeti
feltételek, a növény kora és fiziológiai állapota (Schmelzer et al., 1980; Gáborjányi, 1991; Horváth, 1993 a, b;
Jones, 1993 a, b). A növény inhibitorai a fertőzés során általában csak ahhoz a családhoz tartozó növények
esetében hatnak, amelyekhez maga az inhibitort tartalmazó növény is tartozik. Ezért ezek a gátló anyagok
inkább gazda-, mint vírusspecifikusak. A mesterséges mechanikai átvitel (inokulálás) előnye, hogy kis
koncentrációban előforduló vírusok is átvihetők a beteg növény szövetnedvével és általában könnyen
felismerhető tüneteket okoznak a tesztnövényeken. A természetes mechanikai átvitelre klasszikus példa a
dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), amely a szomszédos növények leveleinek érintkezésével is
terjed. A talajművelés, ill. a növényápolás is gyakran elősegíti a vírusok terjesztését (traktorok, kaszálógépek).
Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc dohánynövények mechanikai inokulálása dohány mozaik vírussal
(tobacco mosaic tobamovirus)
A dohány mozaik vírus fogékony gazdanövényen (Nicotiana tabacum cv. Samsun) mozaikfoltokat, míg
rezisztens növényen (Nicotiana tabacum cv. Érdi) lokális léziókat okoz (22. ábra).
a. A mozaiktüneteket mutató N. tabacum cv. Samsun legfelső leveleiből egy gramm mennyiséget helyezzünk
dörzsmozsárba, és adjunk hozzá 2,5 ml 0,1 M Sörensen foszfát-puffert (pH 7,0). Alaposan dörzsöljük el.
b. Szórjuk be finoman karborundumporral (500 mesh = 50 µm) egy egészséges N. tabacum cv. Xanthi-nc
fertőzni kívánt leveleit. Legegyszerűbb, ha a műveletet lakkfújóval végezzük. A karborundumpor helyett
használhatunk Cellitet (kovaföld) is. Ezek az úgynevezett abrazívumok olyan szemcsés anyagok, amelyek
segítik a levélfelület felsértését. A levélfelületen keletkezett mikrosérüléseken keresztül jutnak a virionok a
levél epidermiszsejtjeibe.
c. Egyik kezünket helyezzük a levél alá, a másikba fogjunk egy sterilezett spatulát. Az üvegspatula segítségével
a levél csúcsától az alap felé közepes erősséggel, körkörös mozdulatokkal vigyük fel a vírusos szövetnedvet.
A kezünk és a levél közé helyezhetünk kivágott szűrőpapír-darabkákat is. Érdemes az inokulált leveleket
megjelölni (pl. steril műanyag szívószállal kis lyukat fúrunk a levél csúcsába).
d. Az inokulálást követő 2–3 nap múlva lokális, nekrotikus léziók jelennek meg a megjelölt leveleken.
22. ábra - A: dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei Nicotiana
tabacum cv. Samsun és B: N. tabacum cv. Érdi dohánynövények levelein [Horváth
József szívessége folytán]
A vírusátvitel módszerei
70 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Megjegyzés: Mesterséges mechanikai átvitelt lehetőség szerint mindig a reggeli vagy a kora délelőtti órákban
végezzünk. A mechanikai vírusátvitelhez különböző segédeszközökre van szükség (23. ábra).
23. ábra - A vírusok mechanikai átviteléhez használatos eszközök. A: orsóprés [J.A. de
Bokx szívessége folytán]; B: 1 = gömblombik; 2 = dörzsmozsarak; 3 = üvegspatulák; 4 =
desztillált víz; 5 = műanyag jelfa; 6 = pufferoldat; 7 = mérőhenger; 8 =
karborundumszóró [Horváth József szívessége folytán]
1.2.1.
1.2.1.1.
1.2.1.1.1. Egyléziós kultúrák kialakítása
Ha tiszta, tehát azonos populációt képviselő tenyészetet szeretnénk kapni, egyetlen lézióból kell kiindulni. Az
így kapott vírusizolátumot egyléziós kultúrának nevezzük.
a. A levél felületét 2%-os NaOH-val fertőtleníteni kell.
A vírusátvitel módszerei
71 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
b. Szakítsuk le egy lokális tüneteket mutató Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc egyik levelét, és vágjunk ki belőle
egy léziót.
c. A léziót helyezzük porcelán dörzsmozsárba és adjunk hozzá pár csepp 0,1 M Sörensen foszfát-puffert (pH
7,0). Dörzsöljük szét.
d. A kapott szövetnedvet óvatosan vigyük fel a 2–3 leveles N. tabacum cv. Xanthi-nc növény levelére.
e. Ha a levélen pár nap múlva megjelennek a tünetek, már a teljes levelet eldörzsölhetjük, és a szövetnedvet
átvihetjük egészséges dohánynövényekre.
1.2.1.1.2. Petricsésze-módszer
A módszer előnye, hogy nem kell egy teljes növényt használni a vizsgálathoz a kórokozó tesztelésekor,
elegendő hozzá a tesztnövény egyetlen levele is. Ezt a vizsgálatot Petri-csészében, nedves szűrőpapíron
végezzük (Horváth és Pocsai, 1971). A módszert lokális tüneteket okozó vírusoknál alkalmazzuk.
1.3. Vegetatív szaporítószervekkel történő vírusátvitel
Ismert, hogy továbbszaporításhoz felhasznált szervek (gumók, hagymák, rizómák stb.) – az anyanövényhez
hasonlóan – vírussal fertőződhetnek. Ezért a vegetatív úton történő növényszaporítással vírusterjedés érhető el a
leghatékonyabb vírusátvitel.
A burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) fertőzött anyanövény alól származó gumók
többnyire vírusfertőzöttek lesznek, de előfordul az is, hogy nem mindegyik gumó fertőződik, ezért ezekből
egészséges növények is kifejlődhetnek. A gumókkal átvihető burgonyavírusok súlyos gazdasági problémát
jelenthetnek a termesztésben. A vegetatív szaporítószervekkel történő átvitelben szerepet játszhat a gumón kívül
a módosult föld alatti megvastagodott szár, a rizóma, a szamóca indája vagy a tulipán hagymája. A tulipán
színtörés vírus (tulip breaking potyvirus) átvitelében és terjedésében a legnagyobb szerepe a vírusfertőzött
tulipánhagymának van.
Rügydugványteszt (Horváth, 1962)
A burgonya nyugalmi állapotát megszakító vegyi készítmények alkalmazásával lehetővé vált a rügydugványok
vizsgálata már az ültetések megkezdése előtt. Ennél a módszernél a gumók dugófúróval kivájt csíráit
virágcserepekbe ültetjük. Ha a burgonya pl. levélsodródás vírust (potato leafroll polerovirus) tartalmazott, akkor
megfigyelhető a fiatal növények leveleinek főér menti sodródása, kanalasodása. Biztosabb eredményt érhetünk
el, ha a rügyeket a gumó csúcsi részéből vesszük és azokat gibberellinnel (10–50 mg/l) kezeljük.
1.4. Maggal és pollennel történő átvitel
A maggal és pollennel történő átvitel a vírusok természetes elterjedésének gyakori lehetőségei. A maggal
történő vírusátvitel gazdaságilag nagyon jelentős problémákat okoz (Mink, 1993; Schmidt, 1994). Jelenlegi
ismereteink szerint több mint száz, maggal átvihető vírus ismert; ezek a vírusok 25 taxonómiai csoportba
(nemzetségbe) tartoznak. Öt vírusnemzetségben [alfamovirus (1) cucumovirus (4), waikavirus (1), enamovirus
(1), tospovirus (1)] 8 olyan vírus található, amelyek maggal 100%-ban átvihetők. Az összes cryptovirus [pl.
szegfű vírus 1 (carnation 1 alphacryptovirus), vöröshere vírus 2 (red clover 2 betacryptovirus)] maggal könnyen
átvihető, és eltekintve a növények vegetatív szaporításától, ez az egyetlen vírusterjedési lehetőség a fenti vírusok
esetében. A maggal terjedő vírusok mechanikailag is átvihetőek, és parenchimasejteket fertőznek. A floem-
fertőző vírusok [pl. burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus)] maggal nem terjednek. A
magátvitel szempontjából fontos a vírusszaporodás, -terjedés és a gazdanövény növekedésének mértéke közötti
egyensúly (Johansen et al., 1994). Befolyásoló tényező többek között a növények fiziológiai állapota, a
vírusstabilitás, a hőmérséklet, a fajta és a tárolási idő is. Ha a kórokozó a mag felületén tapad meg, külső
magátvitelről beszélünk. Ilyenkor a csíranövény a talajban, a talajrögök által ejtett apró sérülések következtében
fertőződik. Az átvitelnek ez a formája főleg stabil vírusoknál lehetséges [dohány mozaik vírus (tobacco mosaic
tobamovirus) (24A ábra)].
24. ábra - A: a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) tünetei a fertőzött
paradicsommaggal történő átvitel után Lycopersicon esculentum növények levelein; B:
A vírusátvitel módszerei
72 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic potyvirus) tünetei Phaseolus vulgaris cv.
Red Kidney növényen [Horváth József szívessége folytán]
A belső magátvitel bonyolultabb folyamat. Feltétele – többek között – az, hogy a vírus bejuthasson a
csírakezdeménybe vagy azok sejtjeibe. A bab sárga mozaik vírus (bean yellow mosaic potyvirus) is ezzel a
módszerrel terjed (24B ábra). Ez egyes esetekben sterilitást is eredményezhet [paradicsom magtalanság vírus
(tomato aspermy cucumovirus)].
A maggal átvihető vírusok a vírusbeteg növények pollenjével is terjednek. A kontaminálódott virágpor nemcsak
az embriózsákot, hanem a magkezdeményeket is fertőzi. Ilyen kórokozó a bab közönséges mozaik vírus (bean
common mosaic potyvirus). A vírusok pollennel történő terjedésének jelentős epidemiológiai szerepe van
(Schmelzer, 1980).
1.5. Vírusátvitel a talajban
A talajban történő vírusátvitel általában gyökérrel, alacsonyabb rendű gombákkal és nematódákkal
(fonálférgekkel) történhet; ez utóbbi átvitelről a Nematódák (fonélférgek) c. alfejezetben számolunk be.
Ismeretesek azonban olyan vírusok is, amelyek talajban vektor nélkül terjednek. A jelenleg ismert 13, talajjal
terjedő vírus [pl. szegfű foltosság vírus (carnation mottle carmovirus), Chenopodium mozaik vírus (sowbane
mosaic sobemovirus), szegfű gyűrűsfoltosság vírus (carnation ringspot dianthovirus), burgonya X-vírus (potato
X potexvirus), dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus), paradicsom bokros törpülés vírus (tomato
bushy stunt tombusvirus)] hat vírusnemzetségbe tartozik. Az említett vírusok mindegyike nagy koncentrációban
fordul elő a növényekben, igen stabil, széles gazdanövénykörrel rendelkezik, és mechanikailag könnyen
átvihető. A növények talajból, abiotikus körülmények között történő fertőződésének mechanizmusa nem ismert.
1.5.1. Gyökérrel történő átvitel
A vírusfertőzött növény gyökere jelentős szerepet játszik néhány vírus átvitelében. Feltétele az, hogy a fertőzött
növényben a víruskoncentráció elég nagy legyen, gyökerei pedig szorosan érintkezzenek az egészséges növény
A vírusátvitel módszerei
73 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
gyökereivel. Ez az átviteli lehetőség különösen nagy gondot okoz a faiskolákban [pl. alma mozaik vírus (apple
mosaic ilarvirus)], valamint a szőlőkultúrákban és a többéves hüvelyes takarmánynövények köré-ben is.
1.5.2. Alacsonyabb rendű gombákkal történő átvitel
A gyökérfertőző Olpidium gomba az egyik legismertebb vírusvektor, amely több vírus [dohány nekrózis vírus
(tobacco necrosis necrovirus), uborka nekrózis vírus (cucumber necrosis tombusvirus), saláta érvastagodás vírus
(lettuce big vein varicosavirus), dohány satnyulás vírus (tobacco stunt varicosavirus)] átvitelére képes (25.
ábra). Egy másik gomba, a Polymyxa betae a répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein
benyvirus) terjesztésében vesz részt. Az árpa sárga mozaik vírust (barley yellow mosaic bymovirus) a
gabonaféléken élő Polymyxa graminis terjeszti. A Spongospora spp. a burgonya szártörpülés vírust (potato mop-
top pomovirus), míg a Pythium spp. a borsó ál-levélsodródás vírust (pea false leaf roll virus) képes átvinni
(Horváth, 1972).
25. ábra - Az Olpidium brassicae gombavektor zoosporangiumai. A: saláta törzs
(lettuce strain) vektora; B: káposzta törzs (cabbage strain) nem vektor; C: az Olpidium
spp. zoospórái [Teakle, 1967 után]
A vírusok gombaátvitelének kritériumai a következők: a) légszáraz talajban a fertőzőképesség megmaradása; b)
a jelenlevő vírus mechanikai átvitellel vagy oltással történő kimutatása; c) kapcsolat a gomba és a vírus között;
d) a gombamentes vírusfertőzött gazdanövényekről a vírussteril gomba által történő vírusfelvétel és vírusátvitel.
1.6. Vírusátvitel Cuscuta fajokkal
A Cuscuta nemzetségbe tartozó fajok levél nélküli, megnyúlt, fonalszerű szárral rendelkező gyomnövények,
amelyek klorofillban szegények, ezért más növények parazitálására kényszerülnek. Az arankafajok a száron
kifejlődő szívógyökerek (hausztórium) segítségével veszik fel a gazdanövényből a táplálékot és ezzel gyakran a
vírusokat is. A vírus átvitele rendszerint passzívan történik, a parazita növény táplálékáramlása közben. A
tápanyagok a hausztóriumokon keresztül mind a fertőzött, mind az egészséges növény edénynyaláb-
A vírusátvitel módszerei
74 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
rendszeréből az aranka floemjébe jutnak, és itt keverednek egymással. Számos Cuscuta faj alkalmas az átvitelre,
de a hatékonyság fajonként különböző. Legnagyobb jelentőségűek a C. subinclusa és a C. campestris fajok
(Schmelzer, 1956; Hosford, 1967; Jones, 1993a). Mindkét faj közismert vírus-gazdanövény is. Olyan
növényekre is átvihető a vírus arankával, amelyek a szövet-inkompatibilitás miatt nem mutatják az átvitelt
oltással vagy szemzéssel. Az aranka-átvitel különösen jelentős akkor, amikor mechanikai vagy vektorátvitellel
nem érhető el eredmény [pl. orgona boszorkányseprűsödés fitoplazma (lilac witches broom phytoplasma)].
1.7. Vízzel történő vírusátvitel
Csaknem négy évtizedre nyúlnak vissza azok a vizsgálatok, amelyek alapján megállapítást nyert, hogy öntöző-
és vízleeresztő csatornák (vízfolyások) vizéből növényvírus [uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber
green mottle mosaic tobamovirus) (26A ábra)] izolálható (Van Dorst, 1961). Megállapítást nyert az is, hogy az
öntözővízben jelen lévő vírus és az uborka vírusfertőzöttsége között szoros összefüggés van (26B ábra). Az
elmúlt évtizedekben számos stabil növénypatogén vírust izoláltak folyók és tavak vizeiből (Koenig és
Lesemann, 1985; Koenig, 1986; Horváth et al., 1986; Juretiæ et al., 1986; Koenig et al., 1988), valamint
vízinövényekből (Horváth, 1994). Ezek a kutatási eredmények felvetették azt a lehetőséget – amely később
bizonyítottá vált –, hogy növények vektormentes úton (állatvektorok és/vagy talajban élő gombák nélkül),
gyökéren keresztül, vírussal kontaminálódott vízzel (pl. öntözővízzel) is fertőződhetnek. Ezáltal a víz mint
„vektor” szerepet játszik stabil vírusok átvitelében és a növények megbetegítésében (Meyer-Kahsnitz, 1993).
Ismert az is, hogy a bentonit és az agyagásványok proteineket (vírusrészecskéket) képesek adszorbeálni, és
ezáltal a növényekből a kórokozó vírusok a talajkomponensekhez adszorbeálódva víz közvetítésével további
fertőzést indukálhatnak (Gibbs és Harrison, 1976; Blanco-Sanches et al., 1986; Juretiæ és Horváth, 1991).
26. ábra - A: az uborka zöldfoltosság mozaik vírus (cucumber green mottle mosaic
tobamovirus) tünetei Cucumis sativus cv. Delicatess uborkanövényen; B: az uborka
mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) tünetei Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc
dohányon [Horváth József szívessége folytán]
2. Állatvektorokkal történő vírusátvitel
A vírusok terjedésének talán legjelentősebb formája az állat-, rovarvektorokkal történő átvitel. Vektoroknak
nevezzük azokat az élő szervezeteket, amelyek egyes vírusok terjesztésében közvetítő szerepet játszanak.
Legfontosabb természetes vírusvektorok a szúró-szívó és rágó szájszervű rovarok, valamint a nematódák
(fonálférgek).
A vírusátvitel módszerei
75 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2.1. Levéltetvek
A növénypatogén vírusok terjesztésének kétségtelenül legáltalánosabb és gazdaságilag legfontosabb módja a
rovarvektorokkal történő vírusátvitel (Horváth, 1972; Fritzsche et al., 1972; Harris és Maramorosch, 1980). A
Homoptera rend – amely magában foglalja többek között a levéltetveket (Aphididae) és a mezei kabócákat
(Cicadellidae) – tartalmazza a legnagyobb számú és a legjelentősebb növényi vírusvektort. A Homoptera rendbe
tartozó más családok bizonyos fajai szintén terjesztik a növénypatogén vírusokat, de sem számukban, sem
jelentőségükben nem hasonlíthatók össze a levéltetvekkel és a kabócákkal. Ezen családok közé tartoznak a
levélbolhák (Psylloidae), a molytetvek (liszteskék vagy fehérlegyek) (Aleurodoidae), a pajzstetvek (Coccoidae),
valamint a púpos kabócák (Membracidae). A növénypatogén vírusok néhány rovarvektora más rendbe tartozik,
mint pl. a poloskák (Heteroptera), a tripszek (Thysanoptera), a bogarak (Coleoptera) és a szöcskék, sáskák
(Orthoptera) (Agrios, 1988). A szúró-szívó szájszervvel rendelkező rovarokhoz képest a rágó szájszervű rovarok
vírusátvitele kisebb jelentőségű. A vírusok terjesztésében a rovarok közül a levéltetvek játsszák a legnagyobb
szerepet. Az átvitelnek négy speciális formáját ismerjük (Horváth, 1972).
2.1.1.
2.1.1.1.
2.1.1.1.1. Nem-perzisztens (stylet-borne) vírusok
A fertőzött növény szövetnedvével való táplálkozás közben vírusrészecskék tapadnak a rovar szipókájára
(styletum). Ez esetben a rovar egészséges növényre kerülve azonnal fertőzőképes lesz, nincs szükség lappangási
időre. A vektorok hamar, egy-két szívás után elveszítik vírusátviteli képességüket. A stylet-borne vírusok a
levélparenchimában lokalizálódnak, mozaikos tüneteket okoznak, és mechanikailag könnyen átvihetők. A
védekezés ellenük szinte lehetetlen, leginkább a levéltetvek számának csökkentésére korlátozódik. Erre az
átviteli módra példa a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és a zöld őszibarack levéltetű (Myzus persicae)
kapcsolata.
A vírus és a vektor alapvető tulajdonságai a következőkben foglalhatók össze: 1. a felvételi szívás után a rovar
azonnal fertőzőképes lesz, inkubációs idő nincs; 2. A forrásnövényen való táplálkozás idejének növekedésével a
vektor fertőzőképessége csökken; 3. a vírusátviteli képesség a felvételi szívást megelőző éheztetéssel növelhető;
4. a vektorok egészséges növényen való szívogatás közben fertőzőképességüket hamar elveszítik; 5. a vírusok a
vektor szipókájának csúcsi barázdáiban helyezkednek el; 6. a vírus felvételét követő vedlés a fertőzőképességet
nagymértékben csökkenti; 7. a vektor testüregébe mesterségesen bejuttatott vírussal a rovart nem lehet fertőzővé
tenni; 8. a vírusok a rovar hemolimfájából nem nyerhetők vissza; 9. a nem-perzisztens vírusoknak nincsenek
speciális vektoraik.
2.1.1.1.2. Cirkulatív (perzisztens) vírusok
Ezek a vírusok abban különböznek az előző csoporttól, hogy rendszerint a floemben vagy a xylemben
lokalizálódnak, sárgaság típusú tüneteket okoznak, és mechanikailag alig, vagy nehezen vihetők át.
Legismertebb cirkulatív vírus az árpa sárga törpülés vírus [barley yellow dwarf luteovirus (27. ábra)] és a
burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), amelyek leghatékonyabban Macrosiphum (Sitobion)
avenae, Rhopalosiphum spp. és Myzus persicae levéltetűvel terjednek.
27. ábra - Levéltetűvel történő árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf
luteovirus) átvitel sematikus ábrázolása. A nyilak a cirkulatív vírusátvitel útját jelzik.
JNyM: járulékos nyálmirigy, EnyM: elsődleges nyálmirigy, KB: középbél, UB: utóbél
[A. Miller szívessége folytán]
A vírusátvitel módszerei
76 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vírus–vektor kapcsolat főbb jellemzői: 1. a forrásnövényen való táplálkozás idejének növekedésével a vektor
fertőzőképessége nő; 2. a vírusátviteli képességet a felvételi szívás előtti éheztetés nem befolyásolja; 3. a vírus
felvétele és az első eredményes fertőzés között meghatározott idő telik el, ezalatt a vektor még fertőzésképtelen.
Az inkubációs idő addig tart, amíg a kórokozó az utóbélből a hemolimfa rendszeren keresztül a
melléknyálmirigybe jut; 4. az inkubációs idő letelte után a vektorok fertőzőképességüket sokáig, gyakran életük
végéig megőrzik; 5. a vektor fertőzőképességét a vedlés nem befolyásolja; 6. a vektor fertőzővé tehető a
testüregébe mesterségesen bejuttatott vírussal; 7. a vírus visszanyerhető a vektor hemolimfájából; 8. a cirkulatív
vírusok vektorspecifikusak (általában egy, vagy kevés vektorral rendelkeznek).
2.1.1.1.3. Szemiperzisztens vírusok
Az ide tartozó vírusok a perzisztens és a nem-perzisztens csoport közötti átmenetet képviselik. A
szemiperzisztens vírusok mechanikailag általában nem vihetők át, vagy átvitelük nehéz [répa sárgaság vírus
(beet yellows closterovirus)].
A vírus–vektor kapcsolat főbb tulajdonságai: 1. a vektor rövidebb és hosszabb felvételi szívás után is képes a
kórokozót leadni; 2. a vektor felvételi szívás előtti éheztetése a vírusátvitel eredményességét nem érinti; 3. a
vektor fertőzőképességére a vedlés nincs hatással.
2.1.1.1.4. Propagatív vírusok
Ezek a vírusok a cirkulatív vírusokhoz tartoznak, de annak legmagasabb szinten specializálódott fokát mutatják.
A propagatív név abból adódik, hogy a vektor a vírust mintegy szaporítja, vagyis „számát növeli”. A répa
nyugati sárgaság vírus (beet western yellows luteovirus) így szaporodik pl. M. persicae levéltetűben. A
propagatív vírusok nemcsak szaporodnak a vektor szervezetében, hanem gyakran a rovarokban
betegségtüneteket is okoznak. Ez esetben már nehéz eldönteni, hogy növénypatogén (fito-) vírusról, vagy
rovarpatogén (arbo-) vírusról van-e szó. Az „arbo” rövidítés az angol arthropod-borne kifejezésből származik. A
saláta nekrotikus sárgaság vírus (lettuce necrotic yellows cytorhabdovirus) például Hyperomyzus lactuce
levéltetű vektorban szaporodik. A vírus jellegzetes bacilus formájú partikulumait elektronmikroszkóppal
kimutatták a vektor izomszöveteiben, a zsírtestecskékben, az agyvelőben, a tracheákban, a nyálmirigyekben és
az emésztőcsatornában.
A vírus–vektor kapcsolat általános jellemzői a cirkulatív vírusoknál leírtakon kívül az alábbiakban foglalhatók
össze: 1. a vírus a vektor testében hosszú ideig megmarad, sőt gyakran tojásaik is fertőződnek; 2. a vírus
mechanikai úton növényről növényre átvihetetlen, de a vírussal fertőzött levéltetvek szövetnedvével az
egészséges levéltetvekbe átvihető.
2.2. Kabócák
A sárgaság típusú növénybetegségek kórokozóit (vírusok és fitoplazmák) elsősorban kabócák terjesztik
(Horváth, 1972, 1974, 1999; Fritzsche et al., 1972; Harris és Maramorosch, 1980). A fitoplazmák főképpen
virágelzöldülést, virágellevelesedést és ún. boszorkánysöprűsödést idéznek elő. Hazánkban is elterjedt a sztolbur
fitoplazma (stolbur phytoplasma), a here virágelzöldülés fitoplazma (clover phyllody phytoplasma) vagy a here
törpülés fitoplazma (clover dwarf phytoplasma) (Gáborjányi és Lönhard, 1967; Horváth, 1969, 1970, 1972,
1974).
A vírusátvitel módszerei
77 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A kabócákkal átvihető vírusok a levéltetvekkel átvihető vírusokhoz hasonlóan stylet-borne, szemiperzisztens,
cirkulatív és propagatív természetűek lehetnek. Ez a négy csoport azonban nem különül el egymástól olyan
élesen, mint a levéltetveknél. A rizs tungro szférikus vírus (rice tungro spherical waikavirus) szemiperzisztens.
A Nephotettix impicticeps kabóca az éheztetés után a vírust egy órán belül képes felvenni és leadni. Az
őszirózsa sárgaság fitoplazmát (aster yellows phytoplasma) a Macrosteles fascifrons és az Elymana virescens
kabóca (28. ábra) csak akkor tudja felvenni, ha a táplálkozási idő meghaladja a két órát. A felvett kórokozót
viszont bármilyen rövid idő alatt le tudja adni. Tipikus cirkulatív természetű a répa levélcsúcs fodrosodás vírus
(beet curly top curtovirus). Szemiperzisztens a Psammotettix alienus vektor által átvihető búza törpülés vírus
(wheat dwarf monogeminivirus). A kabóca a forrásnövényen való 5 perces tartózkodás után felveszi a vírust. A
kórokozó inkubációs ideje egy és négy nap között ingadozik. A propagatív rizs törpülés vírus (rice dwarf
phytoreovirus) a Nephotettix apicalis kabócában szaporodik. A nőstényvektorok hét generáción keresztül
képesek a vírust átvinni. Egyes nem-vektor kabócafajok inokulációs technikával fertőzöttekké tehetők, és a vírus
felszaporodása szervezetükben kimutatható. A propagatív vírusok replikációjának kezdeti helye az
emésztőcsatornában van. A vírus később kimutatható a hemolimfából, a nyálmirigyekből és a petefészekből is.
A sárgaság típusú betegségek kórokozói transzováriálisan (a rovar tojásával) is terjednek. Elsősorban a
zsírtestecskékben és a sejtmagban okoznak kóros elváltozásokat. A kabócák élettartama gyakran megrövidül.
28. ábra - Az őszirózsa sárgaság fitoplazma (aster yellows phytoplasma) kabócavektorai
A-B: Macrosteles fascifrons; C-D: Elymana virescens. Balról hátoldali, jobbról hasi
helyzetben lévő nőnemű egyedek [L.N. Chiykowski szívessége folytán]
2.3. Nematódák (fonálférgek)
A talajban élő nematódák jelentős szerepet játszanak a vírusok átvitelében (Raski és Hewitt, 1967). Mintegy 20
növényi vírust képesek átvinni a talajban élő fonálférgek. Ezeket az ektoparazitákat négy nemzetség egy vagy
több faja képviseli. A nematódákkal átvihető vírusok alapvetően két csoportba (NEPO-vírusok, NETU-vírusok)
sorolhatók (Horváth, 1972; Fritzsche et al., 1972). A Longidorus és a Xiphinema nemzetségbe tartozó fajok a
poliéder alakú NEPO-vírusok [dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus), a paradicsom
gyűrűsfoltosság vírus (tomato ringspot nepovirus), a málna gyűrűsfoltosság vírus (raspberry ringspot
nepovirus), a paradicsom fekete gyűrűs vírus (tomato black ring nepovirus), a cseresznye levélsodródás vírus
(cherry leafroll nepovirus), a rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus), a szőlő páfránylevelűség vírus;
syn.: szőlő fertőző leromlás vírus (grapevine fanleaf nepovirus)] vektorai. A Trichodorus és a Paratrichodorus
nemzetségbe tartozó fonálférgek a hajlékony, pálcika alakú, tubuláris NETU-vírusokat képesek terjeszteni. Ilyen
a dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) és a borsó korai barnulás vírus (pea early browning tobravirus).
A talajban élő nematódák a fertőzött növény gyökerén történő táplálkozás után könnyen átvihetik a vírusokat az
egészséges növényre (Harris és Maramorosch, 1980). Nemcsak az imágó, hanem a lárva is képes az átvitelre.
Ha lerakja tojását vagy a lárva vedlik, ismét táplálkoznia kell a forrásnövényen ahhoz, hogy visszanyerje
fertőzőképességét.
2.4. Atkák
Az atkákkal átvihető vírusok terjesztésében elsősorban az Eriophyidae család egyes fajai vesznek részt. Az
atkák egyik része szabadon él, levelek fonákán szívogatnak anélkül, hogy azokon különösebb kárt okoznának.
Másik részük viszont toxikusan ható nyálával súlyos deformációkat, gubacsképződményeket idéz elő. A
gubacsatkák közül néhány faj a növénypatogén vírusok terjesztésében is jelentős szerepet játszik. Az Aceria
tulipae atka gyakran tömegesen lép fel és súlyos gubacsszerű tüneteket okoz. Részt vesz pl. a búza csíkos
A vírusátvitel módszerei
78 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
mozaik vírus (wheat streak mosaic tritimovirus) terjesztésében (29. ábra). A vírus–atkavektor kapcsolatban a
vírus–tesztnövények nem okvetlenül gazdanövényei a vektornak, amint ez más vírus–vektor kapcsolatban
természetes. Az atkavektorok fejlődési stádiuma nem határozza meg vírusátvivő képességüket (Horváth, 1972).
29. ábra - A: kifejlett Aceria tulipae atkavektor sematikus rajza az emésztőcsatornával
és a petefészekkel. Fg = előbél, Mg = középbél, Hg = utóbél, Ct = fejtor, Fl = mellső
lábak, Hl = hátsó lábak, Go = ivarszerv nyílása, E = tojás, Oc = érett petesejt, Hs =
utóbél végbélszerű zsákja, As = anális tapadókorong [Paliwal és Slykhuis, 1967 után];
B: búza csíkos mozaik vírussal (wheat streak mosaic tritimovirus) fertőződött búza
levelei a fertőzöttség súlyossága sorrendjében (alulról felfelé) [J.T. Slykhuis szívessége
folytán]
2.5. Tripszek
A tripszek a Thysanoptera rendbe tartozó kozmopolita, polifág rovarok. A tripszfajok közül a Thrips tabaci és a
Frankliniella fajok a legjelentősebb vírusvektorok (30. ábra). A tripszek nyála nem fitotoxikus. A vírus átviteli
módja általában cirkulatív, de előfordul, hogy 30 perc is elég a vírus felvételére és leadására. A vírus vektorban
történő szaporodása bizonyított. A mechanikailag könnyen átvihető, bár eléggé labilis paradicsom
bronzfoltosság vírust (tomato spotted wilt tospovirus) a Thysanoptera rendbe tartozó vektorok csak
lárvastádiumban képesek felvenni. Az imágók, amelyek vírussal fertőzött lárvákból fejlődtek ki,
fertőzőképességüket életük végéig megtartják (Horváth, 1972). A paradicsom bronzfoltosság vírusnak
hazánkban két vektora ismert: a Thrips tabaci és a Frankliniella occidentalis. Ezek közül a Thrips tabaci
őshonos, a Frankliniella occidentalis behurcolt faj. Szabadföldi körülmények között a T. tabaci vektornak 4–6
nemzedéke fejlődhet ki. A kifejlett nőstény áttelel, ezért már kora tavasszal fertőző forrás lehet. Az
üvegházakban egész évben zavartalanul szaporodik, ilyenkor 10–12 nemzedéke is kifejlődik. Az Észak-
A vírusátvitel módszerei
79 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Amerikából behurcolt F. occidentalis a magyarországi körülmények között szabadföldön nem tud áttelelni.
Télen csak üvegházi és hajtatóházi növényeken marad fenn. Mindkét faj széles tápnövénykörű, és közöttük több
növényfaj a paradicsom bronzfoltosság vírusnak is gazdanövénye. A hazai vizsgálatokat üveg-házi körülmények
között végezték a szabadföldön fertőzött gyomnövényekről gyűjtött T. tabaci egyedekkel. A rovarok jelentős
mértékben átvitték a vírust Nicotiana benthamiana tesztnövényekre (Gáborjányi et al., 1993, 1994, 1995;
Jenser, 1995). A paradicsom bronzfoltosság vírus szaporodását Frankliniella fusca tripszvektorban először
1998-ban igazolták (Pappu et al., 1998).
30. ábra - Thrips tabaci, a tospovirusok vektora [K.M. Smith szívessége folytán]
2.6. Poloskák
A Miridae és Piesmidae családok közül a Piesmidae családba tartozó poloskafajok vírusátvivő szerepe ismert
jobban (Horváth, 1972). A Nabidae családba sorolható Nabis punctipennis és a Tingidae családba tartozó
Stephanitis spp. vírusátvivő képességét nem sikerült minden kétséget kizáróan megállapítani. A répa
levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ? rhabdovirus) és a Piesma quadratum (31. ábra) levélpoloska kapcsolata
a következőképpen alakul: a Piesma quadratum a növény parenchimájában és floemjében is szívogat.
Szúrósertéi 5–10 perc alatt elérik a rostacsöveket. A répa levélgöndörödés vírus cirkulatív természetű. A vektor
lárvái felveszik a vírust, leadni azonban nem tudják. A bélfal megcsapolásával azonban minden lárvastádium
alkalmas az átvitelre. Az átte-lelt imágók nyáron sokkal jobb vírusátviteli eredményt mutatnak, mint a fiatal
utódok. Ebből a vírus vektorban történő szaporodására lehet következtetni. A vírus felvételi ideje minimum 1–2
óra, leadási ideje 40 perc körül alakul. A vírus cirkulációja 3–4 hétig is eltarthat. A vírust hordozó nőnemű
poloskák később rakják le tojásaikat, mint a vírust nem tartalmazó poloskák, és tojásprodukciójuk is kisebb.
31. ábra - Piesma quadratum a répa levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ?
rhabdovirus) levélpoloska-vektora [G. Proeseler szívessége folytán]
A vírusátvitel módszerei
80 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2.7. Molytetvek (fehérlegyek, liszteskék)
A molytetvekkel, vagy más néven fehérlegyekkel, ill. liszteskékkel átvihető vírusok és vektoraik közötti
kapcsolatok viszonylag kevéssé ismertek. Cirkulatív vagy szemiperzisztens természetűek lehetnek. A Bemisia
tabaci az egyik legfontosabb szerepet játssza a vírusok terjesztésében. Vektora többek között a mechanikailag is
átvihető uborka érsárgulás vírusnak (cucumber vein yellowing virus). A vektorok szívás előtti éheztetése nem
befolyásolja a vírusátvitelt. A vírusfelvétel utáni éheztetés viszont rontja a vírus átvihetőségét. A vírusfelvételtől
a -leadásig tartó ciklus 60 percig tart. A paradicsom sárga levélgöndörödés vírus (tomato yellow leaf curl
bigeminivirus) és a répa álsárgaság vírus (beet pseudo yellows crinivirus) cirkulatív természetű, a kórokozó
azonban nem marad meg a vektorban annak élete végéig. A paradicsom levélgöndörödés vírus (tomato leaf curl
bigeminivirus) mechanikailag is átvihető, míg a répa álsárgaság vírus (beet pseudo yellows crinivirus) nem. Ez
utóbbi lappangási ideje a vektorban kevesebb, mint hat óra. A Trialeurodes vaporariorum (32. ábra) egy óra
alatt felveszi és ugyanennyi idő alatt át is viszi a vírust. A molytetveknél a transzováriális (tojással történő)
átvitel nem bizonyított. A nőstények alkalmasabbak az átvitelre, mint a hímek (Horváth, 1972).
32. ábra - A crinivirusok átvitelében szerepet játszó molytetvek (Trialeurodes
vaporariorum) populációja dohánylevélen [Szalay-Marzsó László szívessége folytán]
A vírusátvitel módszerei
81 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2.8. Pajzstetvek
Néhány trópusi növénypatogén vírus [kakaó duzzadt hajtás vírus (cacao swollen shoot badnavirus)]
terjesztésében fontos szerepet játszanak a Pseudococcidae családba tartozó vándorpajzstetvek. A pajzstetveknek
fontos szerepük van a szőlő levélsodródás vírus (grapevine leafroll closterovirus) terjesztésében is.
2.9. Levélbolhák
A vektorok egészen kicsiny, viszonylag jelentéktelen csoportját képviselik a levélbolhák. A körtefapusztulást
egy korábban vírusnak vélt fitoplazma (pear decline phytoplasma) okozza. A betegség csak oltással vagy a
Psylla pyricola, P. piri, P. pyrisuga levélbolhákkal terjed. A fertőzés évében a körtefák levelein mozaikosodás
jelentkezik, majd a fertőzést követő években a leveleken vörös pettyesség és hajtásnövekedés-gátlás alakul ki.
Az egészséges körtefákon táplálkozó levélbolhák körtefára telepítése vagy toxinjaik növényekbe injekciózása
nem idézett elő hasonló szimptómákat. A körtefán táplálkozó fertőzött egyedek levélhullást idéznek elő.
2.10. Aknázólegyek
A Diptera rendbe tartozó aknázólegyek (Agromyzidae) vírusátvitele a légyimágók tojócsövével történik. Két
vektor vírusterjesztő szerepe ismeretes. Az egyik a Liriomyza langei [Chenopodium mozaik vírus (sowbane
mosaic sobemovirus), dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus)], a másik a Phytomyza rufipes
[tarlórépa göndörödés vírus (turnip crinkle carmovirus)].
2.11. Bogarak
A Chrysomelidae családba tartozó vektoroknak lényegesen fontosabb szerepük van a vírusok átvitelében, mint a
Bruchidae és a Curculionidae családba tartozóknak. A bogarakkal átvihető vírusok tulajdonságai nagyon
hasonlóak. Viszonylag stabilak, a fertőzött növényekben magas koncentrációban vannak jelen, mechanikailag
átvihetők és erős antigén tulajdonságokkal rendelkeznek. A vektor vírusmegőrzése alapján a vírusok két
csoportba oszthatók. Az egyik csoportban a megőrzési periódus hosszú ideig (7–20 nap), a másik csoportban
csupán 24–48 óráig tart. Előbbihez tartozik a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus), a
tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus), a tök mozaik vírus (squash mosaic comovirus), a bab déli
mozaik vírus (bean southern mosaic sobemovirus). Az utóbbihoz sorolható a tarlórépa göndörödés vírus (turnip
crinkle carmovirus), a tarlórépa rozettás vírus (turnip rosette sobemovirus) és a retek mozaik vírus (radish
mosaic comovirus) (33. ábra) (Harris és Maramorosch, 1980). A vírus–bogárvektor kapcsolat
specializáltságának legmagasabb fokát a levélbogarak és a levélbogárlárvák, valamint az általuk átvihető
vírusok képviselik (Horváth, 1972). Ezek a rovarok nem rendelkeznek működőképes nyálmirigyekkel és
nyelőcső-összeköttetéssel. Táplálkozáskor folyadékot öklendeznek ki, amely a növény nedvéből és emésztési
enzimekből áll. Ha a vírusfertőzött növényen való táplálkozás közben a kórokozó az emésztőcsatornába jut, ott
bizonyos ideig aktív állapotban megmarad. Az újabb táplálkozás során – kiöklendezéssel egészséges növényre
kerülve – fertőzést idézhet elő.
33. ábra - Retek mozaik vírussal (radish mosaic comovirus) fertőzött Brassica
campestris növény levele [Horváth József szívessége folytán]
2.12. Sáskák
A vírusátvitel módszerei
82 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az Acrididae családba tartozó fajok közül a Melanopus differentialis játszik aktív szerepet a vírusok átvitelében.
Ez a sáska képes a burgonya X-vírus (potato X potexvirus), a dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot
nepovirus) és a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) terjesztésére. A szöcskék közül a
legaktívabb vektor a Tettigonia viridissima, amely több vírus átvitelére is képes (Horváth, 1972).
2.13. Lepkék
A Pieridae családból a Pieris brassicae képes a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)
és a tarlórépa göndörödés vírus (turnip crinkle carmovirus) átvitelére. Már 2 perces táplálkozás után felveszi a
vírust. A P. brassicae hernyói a dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) szájszerveiken hordozzák.
A hernyók éheztetésével a vírusátvitel eredményessége csökken. A táplálkozás idejének növekedésével az
átviteli képesség szintén csökken. A dohány mozaik vírus a hernyó ürülékében is kimutatható. A dohány mozaik
vírus terjesztésében a Sphingidae és a Noctuidae család különböző fajai vesznek részt.
2.14. Ászkák
Az Oniscus asellus ászkafaj szerepet játszik az uborka mozaik vírus (cucumber mo-saic cucumovirus)
terjesztésében. A vektornak a vírus járványtanában alárendelt szerepe van.
2.15. Fülbemászók
A Forficula auricularia fülbemászófaj vektora a tarlórépa sárga mozaik vírusnak (turnip yellow mosaic
tymovirus).
2.16. Csigák
A Gastropoda rend bizonyos fajai (Lehmannia marginata, Goniodiscus rotundatus stb.) alkalmi szerepet
játszanak a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) terjesztésében.
3. A vírusátvitel módszertana
3.1. Vírusátvitel levéltetvekkel
A vírus levéltetvekkel történő átvitele nem-perzisztens, szemiperzisztens vagy perzisztens (cirkulatív) módon
lehetséges. Egy nem-perzisztens vírust tartalmazó beteg növényen a levéltetveknek optimálisan 10–60
másodpercet kell táplálkozniuk ahhoz, hogy az adott vírust felvegyék. Az ún. felvételi táplálkozás hatékonysága
jelentősen csökken, ha pár perc helyett néhány napig tart. A vírus „inokulációs“ táplálkozással közvetlenül a
felvételi szívás után átvihető. Az átvitel hatékonysága fokozatosan csökken néhány perc után, és kb. 1 óra múlva
teljesen megszűnik. A levéltetveket az egészséges növényről (tápnövényről) levéve éheztetni kell néhány óráig,
ezzel az átvitel eredményessége növelhető. Szemiperzisztens vírusoknál a felvételi táplálkozás optimuma 12–24
óra. Ezt követően 1–3 nap múlva történik meg az átvitel. Perzisztens vírusok esetén legalább félórás felvételi
szívásra van szükség, de hosszabb ideig is történhet. A táplálkozás után 1–20 napos látens periódus (inkubációs
idő) van; ezt követően a vírus átvihetővé válik. Ez a típusú átvitel akkor történik meg, ha a felvételi táplálkozás
legalább néhány órán keresztül tart.
3.1.1.
3.1.1.1.
3.1.1.1.1. A vírusmentes levéltetvek tenyésztése
A vírusok ritkán vihetők át a levéltetvek tojásával. Az újonnan kikelő levéltetvek általában vírusmentesek, ezért
egy ilyen kultúrából elindítható a tenyészet (Sylvester, 1969).
a. Tegyük egy egészséges kínaikel-palánta (Brassica pekinensis) levelét Petri-csészébe, egy kissé
megnedvesített szűrőpapírra. A kifejlett, szárnyatlan (még szárnykezdeménnyel sem rendelkező) egyedeket
finom ecset segítségével rakjuk át 1 vagy 2 levélre. Megkönnyíti a munkánkat, ha az ecsetet előtte vízbe
mártjuk. Fedjük le a Petri-csészét, és néhány óra múlva tegyük át a levéltetveket egy egészséges kínai kel
növényre.
A vírusátvitel módszerei
83 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
b. A növényt helyezzük inszektáriumba (34A, B, C ábra), amelynek 3 oldalát háló határolja (20 mesh/cm),
egyet pedig üveglap zár le. Az inszektáriumnak nincs alja, de a váz alá homokkal vagy kaviccsal teli tálcát
helyezünk. Ez az inszektárium megakadályozza az állatok szökését. A szárnyas alakok kifejlődését a 16 órás
megvilágítás megakadályozza. A Myzus persicae folyamatos megvilágítást igényel, az Aphis fabae esetében
szükség van sötét periódusokra is. A vírusok átvitelének tanulmányozásához sok esetben ún. „miniatűr”
inszektáriumokat is használnak (34D, E, F ábra).
c. A levéltetvek rendkívül érzékenyek az inszekticidekre. A környezet permetezése a rovarok pusztulását vagy
fejlődésbeli visszamaradását eredményezheti. Ha mégis permeteznünk kell, használjunk olyan szert, amely
toxicitását csak pár napig őrzi meg, pl. tetraetil-pirofoszfátot.
34. ábra - A–C: szövethálóval és üvegajtóval ellátott inszektáriumok; D–F: miniatűr
levéltetű-inszektáriumok, amelyeket csíptetővel lehet a növények levelére, egy
meghatározott helyre elhelyezni [Horváth József szívessége folytán]
3.1.1.1.2. A tesztnövények felnevelése
A Myzus persicae táplálására a legalkalmasabb a retek (Raphanus sativus) és a kínai kel (Brassica pekinensis).
Ezek a növények magas páratartalmú helyiségben gyorsan csíráznak, a magvetéstől számított öt héten belül
felhasználhatók, és immunisak pl. a burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) szemben. A
gőzöléssel sterilezett és átszitált talajba ültetett magvak magas páratartalom és 27 °C hőmérséklet mellett hamar
kicsíráznak. Később elég a 20–22 °C is. Amikor az első, valódi levél eléri a sziklevelek hosszának felét, a
növények alkalmasak a fertőzésre. Célszerű hetente háromszor is magot vetni, hogy a felhasznált tesztnövények
egyforma fejlettségűek legyenek. A Physalis floridana tesztnövények kiváló vírusforrásai a Myzus persicae
levéltetveknek.
3.1.1.1.3. A nem-perzisztens és a perzisztens vírusokkal végzett tesztvizsgálat
Ebben a vizsgálatban a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll
polerovirus) átvitelét végezzük el, a levéltetvek egy csoportjával rövid, egy másik csoportjával pedig hosszú
ideig tartó felvételi szívás esetében (Miyamoto és Miyamoto, 1966). A rövid táplálkozási idő a nem-perzisztens,
a hosszú táplálkozási idő a perzisztens módon terjedő vírusok kimutatását szolgálja. A kísérlet akkor a
legeredményesebb, ha a nem-perzisztens vírus (burgonya Y-vírus) transzmissziós képességét csak rövid ideig
(kb. 1 óra) őrzi meg, a perzisztens vírus (burgonya levélsodródás vírus) pedig még egy nap elteltével is átvihető
marad. Hogy ezt nyomon kövessük, a levéltetveket egy második tesztnövényre helyezzük át az első inokulációs
táplálkozás után.
3.1.1.1.4. Háromnapos felvételi táplálkozás munkaterve
a. Tegyünk kb. 100 db szárnyatlan levéltetvet nedves ecset segítségével egy főzőpohárba. A vizsgálat alatti
áthelyezések során bánjunk óvatosan a levéltetvekkel. Ha a levéltetvek szipókája éppen a levélbe süllyedt,
ecsettel finoman piszkáljuk meg a potrohukat, és csak azután helyezzük át. Az átvitel sikere ettől függ. A
leválasztást úgy is megkönnyíthetjük, hogy a szívogató levéltetvekre hirtelen erős fényforrást bocsátunk, és
ilyenkor szipókájukat kihúzzák a növényből (Horváth, 1963).
b. A levéltetvek felét tegyük burgonya Y-vírussal, másik felét burgonya levélsodródás vírussal fertőzött
Physalis floridana növényekre.
A vírusátvitel módszerei
84 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
c. A növényeket levéltetvekkel együtt 3 napra helyezzük inszektáriumba.
d. Három nap múlva vizsgáljuk meg a beteg növényeket, és inszekticiddel pusztítsuk el a szárnyas egyedeket.
Tegyünk 5 db szárnyatlan levéltetvet a burgonya levélsodródás vírussal fertőzött növényről 1 db egészséges,
majd további 5–5 db levéltetvet 4 db egészséges P. floridana tesztnövényre. Legalább 10 másik levéltetvet
helyezzünk egy „tartalék” növényre. Ugyanezt ismételjük meg a burgonya Y-vírussal fertőzött levéltetvekkel
is.
e. Tegyük egy napra inszektáriumba valamennyi tesztnövényt.
f. A felvételi szívást követő 5. napon mindegyik levéltetvet rakjuk át új tesztnövényre. Az elpusztult vagy
szárnyassá alakult tetveket mindig a „tartalék” növényről pótoljuk.
g. Tartsuk a növényeket egy napig inszektáriumban.
h. A 6. napon ecsettel tegyük át a levéltetveket a tesztnövények utolsó sorozatára, vagy kezeljük a növényeket
inszekticiddel.
Háromperces felvételi táplálkozás munkaterve
a. Tegyünk kb. 100 db levéltetvet főzőpohárba, zárjuk le egy műanyag fedővel, és éheztessük őket naptól védett
helyen 1 óráig.
b. Öt levéltetvet helyezzünk egy burgonya levélsodródás vírussal fertőzött levélre. Nagyítóval megfigyelhetjük,
hogy az állatok táplálkoznak-e. A próbaszívás rendszerint kevesebb mint 30 másodpercig tart. Szívás közben
a szipóka merőleges a levélfelületre, a csáp pedig hátracsapva a testhez simul.
c. Három perc múlva öt levéltetvet tegyünk át egy tesztnövényre, a szondázás időtartamának figyelembevétele
nélkül.
d. Ismételjük meg a b és c pontot, és vigyük át a rovarokat még négy teszt- és egy tartalék növényre. Ha a
levelek lankadnának, frissítsük fel őket. A folytatás hasonló a burgonya Y-vírusnál leírtakhoz.
Az első tünetek 1–2 hét után láthatóvá válnak. A burgonya levélsodródás vírussal fertőzött növények erőteljesen
satnyulnak, a levelek sodródnak, sárgulnak (különösen a levél csúcsa), az erek zöldek maradnak. A burgonya Y-
vírussal megbetegített növények törpülnek az egészséges növényhez képest és mozaikos tüneteket mutatnak.
Jegyezzük fel a szimptómákat. Lehet, hogy a háromnapos és a háromperces felvételi táplálkozást követően az 5.
napon burgonya Y-vírussal fertőzött növények, valamint a háromperces táplálkozást követően az 1. és 2. napon
burgonya levélsodródás vírussal fertőzött tesztnövények mind egészségesek maradnak. A nem-perzisztens
vírusok (burgonya Y-vírus) esetében az átvitel hatékonyabb, ha a felvételi szívás három nap helyett pár percig
tart. A kérdést, hogy melyik vírus perzisztens és melyik nem, csak akkor dönthetjük el véglegesen, ha a
különböző kísérleti feljegyzéseket összevetjük egymással.
Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) átvitele gyakran eredménytelen. Ezért fontos, hogy
figyelembe vegyük a tesztnövények korát és a vírus koncentrációját a forrásnövényben (Stimman és Swenson,
1967). Ha Cucumis sativus tesztnövényt használunk, akkor a felvételi táplálkozást követően a levéltetveket a
növény sziklevelére kell helyezni, kb. 2–3 nappal a kikelés után. Azokat a levéltetveket használjuk, amelyek 10–
15 másodpercig tartó próbaszívást végeztek a forrásnövényen.
3.1.1.1.5. Epidemiológiai vizsgálatok nem-perzisztens vírusokat terjesztő levéltetvekkel
Ha választ szeretnénk kapni arra a kérdésre, hogy egy nagyobb területen előforduló levéltetű-populáció közül
mely fajok hozhatók leginkább öszzefüggésbe egy nem-perzisztens vírus [szilva himlő vírus (plum pox
potyvirus)] természetes elterjedésével, akkor nyomon kell követnünk a szárnyas levéltetvek rajzását és a
vektorok tevékenységének intenzitását (Basky és Gáborjányi, 1994).
Az intenzív vektoraktivitás idejének tesztelése fogónövényekkel
a) A vizsgálat elvégzéséhez válasszunk ki egy szilva himlő vírussal fertőzött szilvaültetvényt.
b) Áprilistól augusztus végéig 25–25 db GF 305 őszibarackmagoncot mint fogó-, illetve tesztnövényeket
helyezzünk ki és cseréljünk egyhetes időközönként egy igen fogékony Besztercei szilvaállományban.
A vírusátvitel módszerei
85 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
c) Az egyhetes expozíciós idő elteltével a növényeket tartsuk vektormentes üvegházban.
d) Két hónap után a vírusfertőzöttséget vizuálisan és DAS-ELISA módszerrel állapítsuk meg.
A szárnyas levéltetvek rajzásának regisztrálása
a) A szárnyas levéltetvek rajzását Rothamsted típusú szívócsapdával követhetjük nyomon. Ez a szívócsapda
óránként körülbelül 3000 m3 levegőt szív be, 12,2 m ma-gasságból. Ez az a magasság, amelyen a távolsági
repülés során a levéltetvek repülnek.
b) A szívócsapda által gyűjtött anyagot naponta ürítjük, jól zárható üvegekben, 75%-os alkoholban tároljuk, és
sztereomikroszkóp segítségével meghatározzuk a levéltetveket. A határozáshoz mindig kérjük szakember
segítségét. A Magyarországon leggyakrabban előforduló levéltetvek leírását és a preparátumaikról készült
fényképeket a Basky (1993) által írt határozóban találjuk meg.
3.1.1.1.6. Különböző levéltetűfajok vírusátviteli képességének vizsgálata
a. Gyűjtsünk legalább száz, ha lehet, kb. 300 db azonos fajú levéltetvet bármely fáról vagy lágy szárú növényről
(lehet zöldség- vagy gyomnövény is). Tegyük a levéltetveket lefedhető Petri-csészébe vagy hintőporba
mártott szájú főzőpohárba.
b. Kétórás éheztetés után a levéltetvekkel teli edénybe helyezzük be a forrásnövényt. Ez legtöbbször fertőzött
szilvahajtás. A vizsgálatok kimutatták, hogy mirobalánról vagy dohánynövényekről az átvitel hatékonysága
kisebb volt.
c. Ötperces felvételi táplálkozás után nedves ecset segítségével helyezzük át a szárnyatlan (még
szárnykezdeménnyel sem rendelkező) egyedeket 10 db GF 305 őszibarackmagoncra. A fejletlen lárvákat
csakúgy, mint a szárnyas alakokat, hagyjuk az edényben. Nagyítóval figyeljük a szipóka és a csápok állását.
A magoncokon három hajtást hagyjunk, és mindegyikre 10–10 levéltetű kerüljön. A próbaszívás alatt a
szipókára került vírus lehetővé teszi, hogy olyan rovarfajokat is tesztelhessünk, amelyeknek egyébként nem
gazdanövénye a szilva vagy az őszibarack.
d. Két nap elteltével a megmaradt példányokat Pirimor 50 D-vel lepermetezzük, és az akceptornövényeket
vírusmentes üvegházba szállítjuk. A vírusnak körülbelül 2–3 hónapra van szüksége ahhoz, hogy a növényben
kimutatható mértékben felszaporodjon.
e. Az inkubációs idő elteltével a növényeket DAS-ELISA-módszerrel vizsgáljuk. A vírusfertőzött és a vírussal
nem fertőződött akceptornövények aránya adja meg az adott faj százalékban kifejezett vektorhatékonyságát.
3.1.1.1.7. Membránhártyán keresztül történő mesterséges táplálás
Kunkel (1977) egy olyan módszert tökéletesített, amely különböző levéltetvek mesterséges táplálását szolgálja.
Ennél az eljárásnál egy membránhártyán keresztül kínáljuk fel a tápanyagokat a rovaroknak. Az aszeptikus
tasakokat két parafilm szembefordításával és felgöngyölítésével kapjuk. A parafilmből létrehozott membrán
előnye, hogy könnyen megformázható, továbbá szivárgásmentes, mert a kifeszített darabok szorosan egymáshoz
tapadnak. Tárolásuk mélyhűtőben egyszerűen megoldható.
Ha aszeptikus hártyákat akarunk készíteni, a parafilmdarabkákat UV-fénnyel kell besugározni. Ezért
szükségünk van egy kellően felszerelt szobára. A táplálék oldatának megszűrésére mikrobiológiai szűrőt
használunk. Kunkel (1977) a Millipore R-rendszert alkalmazta, amely egy fecskendőre szerelt szűrőrendszerből
áll.
3.1.1.1.8. Az aszeptikus hártyák elkészítése
a. Előzőleg vágjunk le kémcsőből vagy 2,6 cm átmérőjű műanyag csőből olyan darabokat, hogy gyűrű, illetve
henger alakú csöveket kapjunk. Az üveg, ill. műanyag széleit csiszoljuk le, hogy megelőzzük a film
megsérülését.
b. Parafilmből vágjunk ki négyzeteket. Ezeket szétterítjük egy edény vagy egy kesztyűsdoboz aljába, és 1–2
órán keresztül besugározzuk. Az expozíciós idő befolyásolja a parafilm fizikai tulajdonságait. Ha túl hosszú
ideig tesszük ki az UV-sugaraknak, a parafilm később a kinyújtás közben könnyen elszakad.
A vírusátvitel módszerei
86 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
c. Készítsük elő a fertőtlenített fecskendőt (kb. 20 ml) és néhány hengert. Vegyük ki a mélyhűtőből a táplálékul
szolgáló oldatot.
d. A két óra leteltével helyezzük a parafilmnégyzeteket a munkaasztalra, és miután feltöltöttük a fecskendőt,
tegyük rá a szűrőrendszert.
e. Vonjuk be a hengereket a parafilmmel a 35. ábra szerint. A két négyzetlap szembefordított oldalai sterilek. A
filmek keresztirányú meghúzásával egyenletes vastagságú, vékony hártyákat kapunk. Vigyázzunk, hogy a
kihúzás közben a membrán középső részét ne érintsük.
35. ábra - A membránhártyák elkészítésének folyamata. 1. a gyűrű oldalról, ill. felülről;
2. a gyűrűre ráfeszítjük az első parafilmet (P1); 3–4. a kifeszített hártyára
rácseppentjük a táplálékot; 5. kifeszítjük a második parafilmet (P2); 6. a P2 parafilmet
ráhelyezzük az első parafilm tetejére; 7–8. a két filmet összeszorítjuk és széleiket
feltekerjük; 9. az elkészült membránhártya [Kunkel, 1977 után]
3.1.1.1.9. Mini-inszektáriumok készítése az átvitelekhez
a. A csövekből levágott gyűrűkből készíthetők el azok a kis üveg- vagy műanyag inszektáriumok, melyek a
levéltetvek táplálkozásának helyei. Fontos, hogy a hengerek és a gyűrűk átmérője azonos legyen, mert az
elkészült membránhártyákra így tudnak tökéletesen illeszkedni.
b. Ezek a mini-inszektáriumok többféle úton állíthatók elő (36. ábra). Az egyszerű gyűrűk és a választásos
kamrák alja nejlon fátyolszövet. Ezt hozzáragasztjuk egy mikroszkóp-tárgylemezhez erősített parafadugó
tetejéhez. A választásos kamra keresztirányú darabja üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva. Ez
olyan szorosan zárja el a két oldalt egymástól, mint egy pecsét.
c. Az elkészült inszektáriumba helyezzük be a levéltetveket.
36. ábra - A gyűrűk összeállításának módozatai (a 35. ábra folytatása). 9. az elkészült
membránhártya; 10. a gyűrű oldalról, ill. felülről; 11. gyűrű a hártyával. Az egyszerű
gyűrűk (12–13.) és a választásos kamrák (15–16.) alja nejlon fátyolszövet, amelyet
mikroszkóp tárgylemezéhez erősített parafadugóhoz ragasztunk. A választásos kamra
keresztirányú darabja (14.) üveglapból van kivágva és parafilmmel beragasztva
[Kunkel, 1977 után]
A vírusátvitel módszerei
87 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Helper komponens (HC) jelenlétének kimutatása
A potyvirusok közül a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) nem-perzisztens módon terjed. Nem tudjuk
azonban, hogy a levéltetvek szipókájának pontosan mely részéhez tapad a kórokozó és miért csak bizonyos
levéltetűfajok képesek az átvitelre. Govier és Kassanis (1974) előzetes megfigyelései hasonló
membránhártyákon történtek, mint amilyeneket az előzőekben leírtunk. Ezeknek a mesterségesen előállított
hártyáknak az az előnyük, hogy a bennük lévő folyadék tetszés szerint változtatható. Govier és Kassanis (1974)
burgonya Y-vírussal fertőzött növények különböző módon előkészített kivonatait töltötték a tasakokba. A
levéltetvek (Myzus persicae) rövid ideig táplálkozhattak a membránokon, majd a tesztnövényekre kerültek.
Amikor a levéltetvek frissen készített növényi extraktumot kaptak, a tesztnövények 3/4 része fertőződött. Ha ezt
a kivonatot egy napon keresztül 4 °C-on vagy pár órán át 20 °C-on tartották, az átvitel néhány esetben
pozitívnak bizonyult. Ha csak a tisztított vírussal próbálkoztak, az átvitel eredménytelen maradt akkor is, ha a
fertőzött növény nagy mennyiségben tartalmazott burgonya Y-vírust. Ha azonban a tisztított vírust
összekeverték a tisztítás során keletkezett felülúszóval (szupernatáns), a tesztnövények (Nicotiana tabacum cv.
White Burley) többségén betegségtünetek jelentek meg. A felülúszó önmagában szintén nem volt alkalmas arra,
hogy az átvitel megvalósuljon. A kérdés az, hogy vajon a vírus változik-e meg a tisztítás alatt, vagy van egy
vírusidegen komponens, amely a tisztítás során a felülúszóba kerül. A 8. táblázat mutatja az elvégzett vizsgálat
eredményét.
8. táblázat - A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) átvitele levéltetvekkel (Govier és
Kassanis, 1974 után)
Vírus Ismétlés1
1. 2. 3.
Tisztított vírus 0/10 0/8 0/8
Tisztított vírus + felülúszó a fertőzött
növényből 10/10 7/8 8/8
Tisztított vírus + felülúszó az
egészséges növényből – – 0/8
A vírusátvitel módszerei
88 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Felülúszó a fertőzött növényből 0/10 0/8 0/8
1 A számlálóban a megfertőződött növények, a nevezőben a tesztnövények vannak feltüntetve.
A helper komponens (HC) kimutatásának eredeti módszere (Govier és Kassanis, 1974)
a. Mielőtt a levéltetvek (Myzus persicae) a membránon keresztül táplálkozni kezdenének, minden tisztított
extraktumhoz szaharózoldatot adunk (20 w/v%). Húsz perc múlva 10 db levéltetvet helyezünk mindegyik
tesztnövényre (Nicotiana tabacum cv. White Burley).
b. Az extrahálás folyamán a leveleket 0,1 M ammonium-acetátot (pH 7,0), 0,02 M EDTA-t és 0,02 M Na-
DIECA-t tartalmazó oldatba mártjuk és vákuum segítségével a folyadékkal átitatjuk. Ezután a leveleket
dörzsmozsárban szétdörzsöljük és muszlinon átnyomkodva leszűrjük. A megszűrt oldatot 20 percig 2,5%
Triton X-100-al rázatjuk, majd kétszer centrifugáljuk (90 perc, 100 000 g). A csapadékot 0,01 M borát-
pufferben (pH 8,0) oldjuk vissza úgy, hogy a végső koncentrációt 1 mg/ml-re állítjuk be.
c. A burgonya Y-vírussal fertőzött növények kivonatának centrifugálása során (90 perc, 100 000 g) keletkezett
felülúszó bizonyult fertőzőképesnek.
d. Ha a tisztított vírust és a felülúszót együtt vizsgáljuk, akkor 0,5 ml vírushoz 1 ml szupernatánst adjunk.
A burgonya Y-vírus levéltetvekkel történő átviteléhez tehát szükséges egy olyan komponens, amely jóval
kisebb, mint a víruspartikulum. E komponens eredetét további vizsgálatokkal próbálták kideríteni (Govier et al.,
1977). A vizsgálat hasonlóképpen történt, mint azt korábban leírtuk. A különbség csak annyi, hogy a
szaharózoldatot (20 w/v%) nem az extraktumhoz keverjük, hanem külön membránon kínáljuk fel (5 vagy 20
percig) a levéltetveknek (9. táblázat).
9. táblázat - Burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) és helper komponens átvitelek
levéltetvekkel (Govier és Kassanis, 1974 után)
Vírus Ismétlés1
1. 2.
Helper + vírus/5 perc táplálkozás
szaharózon 8/8 8/8
Helper/5 perc táplálkozás
szaharózon/vírus 8/8 7/8
Helper/20 perc táplálkozás
szaharózon/vírus – 3/8
Helper/vírus 8/8 7/8
1 A számlálóban a megfertőződött növények, a nevezőben a tesztnövények vannak feltüntetve.
Azt a komponenst, amely elősegíti a burgonya Y-vírus átvitelét, a szerzők segítő (helper) komponensnek (HC)
nevezték. Az eredmények szerint a levéltetvek akkor voltak képesek a burgonya Y-vírus felvételére és
átvitelére, ha előzőleg HC-t tartalmazó preparátumon szívogattak. Abban az esetben, ha sokáig (20 perc)
hagyták a rovarokat a szaharózoldatból táplálkozni, az átvitel hatékonysága jelentősen romlott.
A helper komponens (HC) kimutatásának újabb módszere (Wang et al., 1998)
Wang et al. (1998) négy levéltetűfaj potyvirus átviteli képességét vizsgálták. A levéltetvek táplálkozását, vagyis
a vírus megszerzésének folyamatát elektronikus monitoringgal követték nyomon, amellyel kiderítették, hogy a
különböző átviteli eredmények a levéltetvek eltérő táplálkozási magatartásából adódtak. A vírus szipókában
való megmaradását 125I-izotóppal jelölt virionokkal figyelték meg. Az eredmények azt mutatták, hogy a
A vírusátvitel módszerei
89 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
különböző levéltetűfajok tápcsatornájának alkotóelemei más-más kölcsönhatásba lépnek a potyvirusokkal, és ez
okozza az átvitelben megmutatkozó eltéréseket. Végül homológ és heterológ potyvirusok segítségével
kimutatták a segítő komponens meghatározó szerepét a vírusátvitelben.
A vizsgálathoz olyan levéltetűfajokat kell választani, amelyek ismert potyvirus vektorok (pl. Myzus persicae,
Aphis gossypii), illetve olyanokat, amelyek átviteli képessége a vírustól függően változik (pl. Lypaphis erysimi,
Myzus ascalonicus). A M. persicae és L. erysimi fajokat Brassica, az A. gossypii fajokat Cucumis, míg a M.
ascalonicus vektorokat Allium ascalonicum növényeken lehet fenntartani. A vizsgálatokban a szárnyas
egyedeket és a lárvaállapotú nimfákat lehet felhasználni.
3.1.1.1.10. A szívószájszerv (szipóka, stylet) aktivitásának kimutatása elektronikus jelekkel
a. A M. persicae és a L. erysimi levéltetveket óvatosan Petri-csészébe helyezzük, és szobahőmérsékleten (23–26
°C) 1–3 órát éheztetjük.
b. A M. ascalonicus egyedeket 24–26 órán át éheztetni kell.
c. A levéltetvekhez finom vezetőképes elektródot (3 cm hosszú, 20 μm átmérőjű) kell ragasztani, amelyet egy
EPG-vel (Electrical Penetration Graph) kötünk össze.
d. A másik elektródot egy cserepes, 2–3 leveles dohány tesztnövény földjéhez csatlakoztatjuk, amelyre alacsony
feszültségű egyenáramot kapcsolunk.
e. Amikor a rovarok szívó szájszervüket a levél epidermiszébe helyezik, záródik az áramkör, és ez jel
formájában megjelenik a monitoron.
f. Az elemzéshez a STYLET 2.0 programot kell alkalmazni (Tjallingii és Mayoral, 1992).
A vírus és a helper komponens (HC) tisztítása
a. A dohány karcolatos vírus (tobacco etch potyvirus) levéltetvekkel könnyen átvihető törzsének tisztítását
Murphy et al. (1990) alapján végezzük.
b. A tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) levéltetvekkel átvihető izolátumának tisztítására Murphy
et al. (1990), valamint Sako (1980) módszere nyújt útmutatást.
c. Mivel a dohány karcolatos vírus tisztított HC-je nem mutat eredményt az átvitelek során, ezért ezt a vírust a
burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) HC-jével lehet a levéltetvek számára felvehetővé tenni. A burgonya
Y-vírus HC-jének tisztítását Thornbury et al. (1985) szerint végezzük.
d. A tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) HC-jének tisztítása Sako és Ogata (1981) módszerének
kis módosításával történik (lásd e–l pontok).
e. A fertőzött tarlórépalevelek 50 g-ját 100 ml K-foszfátpufferrel homogenizáljuk (pH 8,5) és 15 percig 8000 g
fordulaton centrifugáljuk.
f. A felülúszót egy órán keresztül centrifugáljuk (120 000 g).
g. A felülúszóhoz (NH4)2SO4-ot adunk a 18%-os telítettség eléréséig és 4 °C-on 10 percig keverjük.
h. A kapott oldatot 20 percig jégen, keverés nélkül inkubáljuk.
i. Az inkubálás után 15 percig centrifugáljuk (8000 g) az oldatot.
j. A csapadékot 20 ml 0,02 M K-foszfát-pufferben (pH 7,5) feloldjuk és 10 percig 5000 g fordulaton
centrifugáljuk.
k. A felülúszóhoz annyi cukrot adunk, hogy a végső koncentrációban az oldat 20%-os legyen.
l. Az oldatot maradék nélkül szétosztjuk és –20 °C-on fagyasztjuk.
A vírusátvitel módszerei
90 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
m. A HC-preparátumok aktivitását a 100 g/ml tisztított vírushoz (dohány karcolatos vírus, tarlórépa mozaik
vírus) adott különböző mennyiségű HC-oldatok elegyével teszteljük. A további vizsgálatokhoz azokat az
elegyeket használjuk fel, amelyek a M. persicae vektorral 100%-os átvitelt mutatnak (Pirone, 1981).
n. A virionok radioaktív jódozását Wang et al. (1996) módszere alapján végezzük (lásd o–q pontok).
o. 200 μl tisztított viriont (3,5 g/l) helyezünk el egy erre a célra alkalmas IODO-GEN jódozócsőbe, és 10 percig
1 mCi Na125I-izotóppal reagáltatjuk.
p. A be nem épült Na125I-izotópokat a radioaktív virionoktól Sephadex G-25-oszlopon különítjük el.
q. A vírus koncentrációját spektrofotométerrel határozzuk meg. A jelölés akkor jó, ha a vírus aktivitása 2640–
4200 beütés per perc/nanogram (drive per minute/nanogram, d.p.m./ng) (dohány karcolatos vírus), ill. 1140–
1780 d.p.m./ng (tarlórépa mozaik vírus) közé esik. Ezt gammaszámlálóval kell mérni.
3.1.1.1.11. A vírusátvitel általános menete
a. A szárnyas levéltetveket üvegfiolákban tartjuk, és a felvételi táplálkozás előtt 2–3 órát éheztetjük.
b. A dohány karcolatos vírust dohánynövényről dohánynövényre, a tarlórépa mozaik vírust tarlórépanövényről
tarlórépanövényre visszük át.
c. A felvételi táplálkozást sztereomikroszkóp alatt követjük nyomon.
d. A levéltetvek 20–30 másodpercig táplálkoznak a fertőzött növényeken, azután egy éjszakára áthelyezzük
őket a tesztnövényekre.
e. Ha a rovarok táplálkozását nem kísérjük figyelemmel, akkor 10 percig hagyjuk őket a fertőzött növényeken,
és ezután helyezzük át a tesztnövényekre, ahol egy éjszakán át maradnak.
f. Ezt követően inszekticiddel elpusztítjuk a levéltetveket.
g. A növények szimptomatológiai megfigyelését végezzük rendszeresen.
h. A 125I-izotóppal jelölt vírus felvételét mini-inszektáriumokban, membránhártyákon keresztül lehet
megfigyelni.
i. A membrántasakokba 100 vagy 200 g/ml homológ vagy heterológ jelölt vírus kerül.
j. Az éheztetett levéltetvek 10 percig táplálkozhatnak. A felvételi táplálkozást befejező levéltetveket
tesztnövényekre helyezzük.
k. A rovarok szívogatását sztereomikroszkóppal figyeljük meg.
l. Kontrollként olyan jelöletlen dohány karcolatos vírust használunk, amely a burgonya Y-vírus HC-jét
tartalmazza.
m. A radioaktivitást folyadékszcintillációs számlálóval mérjük.
3.1.1.1.12. Az átviteli eredmények
A levéltetvek táplálkozása, vagyis a szívás folyamata három fázisra bontható: (1) az epidermisz (vagy membrán)
átszúrása, (2) a szívó szájszerv (szipóka, stylet) levélszövetben tartása és (3) a szipóka visszahúzása a
levélszövetből. A szívás időtartama (második fázis) a Myzus persicae, a M. ascalonicus és a Lipaphis erysimi
fajoknál – a vizsgálatok szerint – 3–11 másodperc között változott, szignifikáns különbség a vektorok között
nem mutatható ki (Wang et al., 1998).
Az elektronikus jelek feljegyzése szerint csak a második fázis szubfázisai (2/1, 2/2, 2/3) között tapasztalhatók
időtartam- és frekvenciabeli különbségek. Valószínű, hogy a 2/1 szubfázis a nem-perzisztens vírusok
inokulációjával, a 2/3 szubfázis a vírus megszerzésével függ össze.
A vírusátvitel módszerei
91 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A M. persicae és az Aphis gossypii levéltetűvektorok hatékonyak a dohány karcolatos vírus és a tarlórépa
mozaik vírus átvitelében. A L. erysimi csak a tarlórépa mozaik vírus átvitelére képes, míg a M. ascalonicus vagy
nem képes ezeket a vírusokat átvinni, vagy csak rendkívül kis hatékonysággal.
A vírus megtartásának folyamata jól nyomon követhető a 125I-izotóppal. A levéltetvek testében mért
radioaktivitás erősségében azonban nem mutatható ki különbség az egyes fajok között.
A vírust sikeresen kimutatták a levelekből, ha a rovarok a membránokon keresztül megszerezhették a HC-t
tartalmazó homológ vírust. Ha a membránokon keresztül történő etetéskor a heterológ vírussal (burgonya Y-
vírus HC-jét tartalmazó dohány karcolatos vírus, tarlórépa mozaik vírus HC-jét tartalmazó dohány karcolatos
vírus, burgonya Y-vírus HC-jét tartalmazó tarlórépa mozaik vírus) vehették fel a HC-t, a M. persicae levéltetű
nagy, a M. ascalonicus alacsony hatékonyságú vektornak bizonyult. A L. erysimi azonban eredményesen átvitte
a dohány karcolatos vírust, ha az tartalmazta a tarlórépa mozaik vírus HC-jét. Az A. gossypii vektor alacsony
átviteli képességet mutatott mindkét vírus esetén, ha azok a tarlórépa mozaik vírus HC-jét tartalmazták. Ezek az
eredmények egyértelműen bizonyítják a HC vírusátvitelben játszott kiemelkedő szerepét.
3.2. Vírus-, illetve fitoplazma-átvitel kabócákkal
A kabócákkal átvihető vírusok és fitoplazmák legnagyobb része csak hosszú inkubációs idő után vihető át
vektorokkal. A vírusok (és a fitoplazmák), valamint a kabócák közötti kapcsolat jellemzését célzó vizsgálatok
munka- és időigényesek. Ennélfogva fontos a megfelelő felszerelés beszerzése: inszektáriumok, fényforrások és
a növények egyenletes növekedésének biztosítása (Horváth, 1972).
3.2.1.
3.2.1.1.
3.2.1.1.1. A kabócák tenyésztése
Az 1–5 lárvastádiumú Euscelis plebejus kabócák táplálására a Faba vulgaris, az ötödik stádiumtól a Bromus
inermis növények a legalkalmasabbak (Musil, 1965). A Bromus növények előnye a Faba vulgaris növénnyel
szemben az, hogy a nőstények előszeretettel rakják levelére a tojásaikat, valamint hogy nem fogékonyak a
sárgaság típusú betegségekre. A tápnövényeket 7–10 naponta cseréljük frissre. A lárvák fejlődése fehérhere
növényeken meggyorsítható. Nyáron a kabócák szaporodása folyamatos. Télen a lárvák nyugalomba vonulnak,
erre a 0 – mínusz 5 °C a legmegfelelőbb (Horváth, 1972). Ha aszeptikus, azaz kórokozóktól mentes
környezetben szeretnénk felnevelni a rovarokat, akkor Mitsuhashi és Maramorosch (1963) szerint kell
eljárnunk:
a. A kabócatojásokat mikroszkóp alatt óvatosan, tű segítségével kivágjuk a levélből. A tojásokat ezután
viaszpapírcsíkokra erősítjük. A papírcsíkokat előzőleg 3 percig 0,1%-os Hiamin 2389-oldattal fertőtlenítjük.
b. A sterilezett tojásokat agar táptalajon felnevelt növényeket tartalmazó üvegpalackokba rakjuk. A nimfák
néhány nap alatt kikelnek a tojásból és a növényekre másznak.
c. 30 °C-on 16 órás megvilágítás mellett kifejlődnek az imágók, amelyeket újabb steril növényeket tartalmazó
üvegbe rakunk át. Itt párosodnak és lerakják tojásaikat.
d. A felesleges pára elszívására akasszunk kis szilikagéllel töltött zsákokat az üvegedénybe.
3.2.1.1.2. Steril növények termesztése
A steril növények termesztésének alapja a növényi magvak fertőtlenítése. Ezt egyperces etilalkoholos (70%),
majd 5 perces Hiamin 2389- (0,1%) oldatos, végül újra etilalkoholos (70%) mosással érhetjük el. Közben
mindig steril desztillált vízzel öblítsünk. A magvakat (rozs, árpa, kukorica, lucerna, saláta, hagyma, sárgarépa,
bíborhere stb.) Hoagland- és Knop-oldatot (Hoagland és Arnon, 1950) tartalmazó agar táptalajba helyezzük. A
kikelt csíranövényeket tenyész-kémcsövekben, 25 °C-on, hosszúnappalos megvilágítás alatt tartjuk. A Dalbulus
maidis a kukoricanövényeken, az Agallia constricta a lucernán és a bíborherén tenyészthető a
legeredményesebben. A Macrosteles fascifrons kabócák sárgarépa-szövetkultúrákon néhány hétig életben
tarthatók.
Here virágelzöldülés fitoplazma (clover phyllody phytoplasma) átvitele kabócával
A vírusátvitel módszerei
92 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A kapcsolódó kísérletet a here virágelzöldülés fitoplazmával (clover phyllody phytoplasma) végezhetjük el
Euscelis plebejus vektor segítségével, Trifolium pratense gazda-, ill. tesztnövényen (Peterson, 1953). A
kabócákat inszektáriumban tartjuk fenn, a rács mérete 50 mesh. A nimfákat ecset segítségével helyezzük át. A
kifejlett kabócákat a 37. ábrán látható „szívókészülékkel” fogjuk, és kémcsőbe gyűjtjük. Óvatosan helyezzünk
finom nejlonszűrőt az üvegcső nyílásához, hogy megakadályozzuk a kabócák kiszívását. Ha szükséges, a
rovarokat immobilizálhatjuk úgy, hogy pár másodpercig belefújunk a csőbe. A kabócák a kis lyukon keresztül
vihetők át egy másik növényre. Két napig tartó felvételi szívás után kb. 30 napnak kell eltelnie ahhoz, hogy a
kórokozó átvihető legyen a tesztnövényre. Az eredményes fertőzést követő inkubációs idő elteltével figyeljük az
indikátornövényeken megjelenő, betegségre utaló tüneteket.
37. ábra - A kifejlett kabócák gyűjtésére alkalmas szívókészülék [Washio et al., 1968
után módosítva Noordam (1973) után]
3.3. Vírusátvitel nematódákkal (fonálférgekkel)
A szárazföldi fajok gyűjtéséhez nagyon kevés és egyszerű eszközre van szükség (néhány doboz vagy zacskó és
kézi ásó). Nematódák mindenféle talajban élnek, amelyen növényzetet találunk. A fonálféreg-fauna 90%-a a
földfelszín 5–30 cm-es rétegében található, ezért felesleges mélyebbre ásni. Ha a begyűjtött állatokkal átviteli
vizsgálatokat végzünk, akkor fontos, hogy minél több példány életben maradjon. Ezért ügyelni kell arra, hogy a
dobozba vagy zacskóba gyűjtött földet ne tömörítsük, és minél gyorsabban a laboratóriumba szállítsuk. Ha erre
nincs mód, tegyük az anyagot pár napig hűtőszekrénybe.
3.3.1.
3.3.1.1.
3.3.1.1.1. A vírus talajban való jelenlétének bizonyítása teszt- (vagy csalogató) növényekkel
A begyűjtött földet tegyük olyan virágcserépbe, amelyben a tesztnövénypalántákat felnevelhetjük. Tekintettel
arra, hogy a fonálférgek élettartama és aktivitása (különösen a Xiphinema és Longidorus fajok), valamint a
vírusátvitel eredményessége a talaj nedvességétől függ, így a kísérleti növények talajának folyamatos vízellátása
nagyon fontos. Ezért ajánlatos műanyag cserepet használni. Ültessük el a „csalogató” növényeket a cserépbe.
A nematódák izolálása talajból és a tesztnövények inokulálása nematódákkal
Ha a laboratóriumba vitt minta friss és abban az állatok még élnek, akkor a fonálférgek kinyerését azok aktív
mozgására alapozzuk. Kétféle futtatás általános: a tölcséres és a tálcás. A tölcséres módszert Baermann-féle
futtatásnak is nevezzük.
Baermann-féle futtatás (Andrássy és Farkas, 1988)
A vírusátvitel módszerei
93 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
a. Egy üveg- vagy műanyag tölcsért állványra rögzítünk, a végére rövid gumicsövet húzunk és azt
pillanatszorítóval leszorítjuk.
b. A tölcsérbe 1,5 mm lyukbőségű fém- vagy műanyag hálót, szitát vagy teaszűrőt helyezünk. Ebben van a
kifuttatandó anyag.
c. Ha nem talajból, hanem növényről akarunk fonálférgeket nyerni, akkor a fertőzött növény gyökerét vagy a
föld feletti részét daraboljuk fel és kevés vízzel turmixoljuk öszsze.
d. Az alul elzárt tölcsérbe – lehetőleg a szita mellett – töltsünk annyi vizet, hogy az a mintát 1–2 cm-nyire
ellepje.
e. A mintában lévő fonálférgek aktív mozgásuk következtében kiszabadulnak a talaj- vagy a növényrészecskék
közül és a víznél nagyobb fajsúlyuk miatt lesüllyednek. Kb. 12 óra elég ahhoz, hogy a nematódák
összegyűljenek a gumicsőben a szorító felett.
f. Kinyitjuk a szorítót és a víz kis részét óraüvegbe vagy Petri-csészébe engedjük.
Tálcás futtatás (Andrássy és Farkas, 1988)
A tálcás futtatás elve is az állatok aktív mozgásán alapszik. Ezt a módszert akkor alkalmazzuk, ha egyszerre
nagyobb mennyiségű állatot akarunk kinyerni.
a) Egy lapos, 0,5–1 mm lyukbőségű szitába durva szövésű vászondarabot, gézt vagy vattát helyezünk.
b) Ezen szétterítjük a vizsgálandó anyagot.
c) A szitát lábakra állítva tálcára tesszük, majd annyi vizet töltünk rá, hogy a mintát ellepje.
d) Pár óra állás után a nematódák a tálcába kerülnek.
e) Meggyorsíthatjuk a futtatást, ha a szitát fölülről lámpával melegítjük. Ekkor a száradó anyagot a fonálférgek
igyekeznek minél gyorsabban elhagyni, ezáltal az alsó, nedvesebb régiók felé mozognak.
f) A tálcában lévő vizet ezután a benne lévő nematódákkal üveghengerbe töltjük, és kb. 10 perces várakozás
után a fölösleges vizet leöntve összegyűjtjük az állatokat.
g) A hengerben lévő vizet planktonhálón is átönthetjük, és a hálóban fennakadt állatokat Petri-csészébe mossuk.
Seinhorst (1956) két módszert írt le a fonálférgek izolálására, amely a fajok különböző méretéből adódik.
Első módszer: Trichodorus fajok izolálása
a. Mérjünk ki 500 g talajmintát (ha nagy a nematódák száma, elég 250 g is).
b. Tegyük a talajt 2 mm-es lyukátmérőjű, félgömb alakú szűrőbe, amelyet egy tölcsérben helyeztünk el. A
tölcsér nyílását dugóval zárjuk el. Helyezzük a tölcsért egy lombikba (38. ábra).
c. Öntsünk a tölcsérbe annyi vizet, hogy a mintát ellepje.
d. Ha a talaj agyagos, adjunk hozzá egy teáskanál nátrium-oxalátot vagy „Calgont”, és óvatosan keverjük össze.
e. A keverő segítségével tördeljük a földet kicsi, 1 cm-es darabokra.
f. Mozgassuk a szűrőt fel és le, hogy a talaj átjuthasson a lyukakon.
g. A madzag segítségével húzzuk ki a dugót a tölcsérből, és mossuk a földet a lombikba, majd ezt követően
töltsük tele vízzel.
h. Erősítsünk a lombikra kis műanyag tölcsért, és zárjuk le dugóval.
i. Fordítsuk meg a lombikot néhányszor oda-vissza.
A vírusátvitel módszerei
94 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
j. Helyezzük a lombikot fejjel lefelé egy vízzel telt főzőpohárba, és húzzuk ki a dugót a vízben. Mindezt olyan
gyorsan végezzük, amennyire csak lehet. Előzetesen próbáljuk ki, hogy a dugót elég gyorsan ki tudjuk-e
húzni, és hogy a lombikot elég jól tartja-e az állvány (39. ábra).
k. 12–15 perc után újra visszahelyezzük a dugót, és a felső lombikot visszafordítjuk. Eltávolítjuk a tölcsért, és
tartalmát tartályba ürítjük. A 12–15 perces időtartam alatt a homok és más részecskék lefelé, míg a víz felfelé
áramlik. Ez a felfelé áramlás akadályozza meg a Trichodorus (és más kisebb nematóda fajok) leülepedését. A
nagyobb Xiphinema fajoknak ez az áramlás túl lassú, ezért átkerülnek az alsó edénybe.
l. Ha szükséges, a h és k lépéseket újra megismételhetjük a főzőpohár tartalmával.
m. Öntsük át a tartály tartalmát 0,1 mm-es szűrőn keresztül egy másik tartályba.
n. Mossuk át a szűrőt gyorsan és finoman a második tartályba.
o. A szűrőn ragadt maradékot kis főzőpohárba öblítjük.
p. Az m és n lépést megismételhetjük a második tartály tartalmával. Nagyon hatékony a visszanyerés, ha a
szuszpenziót legalább ötször átszűrjük, de kétszeri szűrés általában elegendő.
q. Öntsük az o pontban összegyűjtött anyagot 0,05 mm-es lyukátmérőjű szűrőbe. Helyezzük a szűrőt
alátámasztva egy Petri-csészébe, és csak annyi vizet adjunk hozzá, hogy benedvesedjen, de a víz ne lepje el.
r. 4–24 óra múlva ellenőrizzük a Petri-csésze tartalmát sztereomikroszkóppal (nagyítás 40×-es), és helyezzük
fényre. A jobb vizsgálhatóság kedvéért használjunk négyzetrácsos műanyag dobozt. Amikor a nematódák
néhány perc múlva leülepednek, távolítsuk el a vizet, és ürítsük a kis főzőpohár tartalmát a műanyag
dobozba. Egy pici pálcára erősített disznószőrrel emeljük ki a fonálférgeket és tegyük vízbe egy kicsi,
szállítható, sima aljú edénybe (40A–C ábra).
38. ábra - A Trichodorus fajok izolálásához szükséges, ún. Baerman-féle tölcsér
[Noordam, 1973 után]
39. ábra - A Trichodorus fajok izolálásának következő lépése [Noordam, 1973 után]
A vírusátvitel módszerei
95 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
40. ábra - A: szűrő (0,05 mm) a Petri-csészében az állványon; B: doboz a bevésett
négyzetráccsal: 1. fogantyú, 2. emelt szegély; C: disznószőr vékony fadarabra ragasztva
[Noordam, 1973 után]
Könnyen észrevehető, hogy a nematódák alakja és mérete milyen különböző (41. ábra). Az elfogott
fonálférgeknek csak egy kis része tartozik azon fajokhoz, amelyek vírusátvivők (42. ábra). A Trichodorus
fajoknak lekerekített farka és görbült szájszerve van. Laboratóriumi gyakorlat nélkül a nematódák határozása
nehéz.
41. ábra - Talajból izolálható nematódafajok. 1. Tylenchorhynchus dubius. 2.
Rhabditid. 3.*Longidorus elongatus. 4. Dorilaimid. 5. Rotylenchus uniformis.
6.*Xiphinema diversicaudatum. 7. Tylolaimophorus. 8. Diphtherophora. 9.
Trichodorus. A *-gal jelölt fajok vírusátvitelre alkalmasak [J. Seinhorst rajza alapján
Noordam, 1973 után]
A vírusátvitel módszerei
96 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
42. ábra - A vírus megőrzésének speciális helyei a vektor fonálférgekben. A vírus
kapcsolatban van a tápcsatorna falával a jelzett területeken [Taylor és Robertson, 1975
után]
A formalinos rögzítésen kívül még ismertek többkomponensű fixálóoldatok is, de a határozás szempontjából
leginkább ajánlott módszer a hőmerevítés. Ha 45–50 °C-os vizet öntünk a már kiválogatott állatokra, vagy az
óraüvegben összegyűjtött szuszpenziót láng fölött párszor áthúzzuk, a fonálférgek kinyúlnak, ezáltal könnyen
mérhetők és tanulmányozhatóak. Vigyázzunk, a melegítést csak addig végezzük, amíg a vízben lévő állatok
erősen vibrálni nem kezdenek. A megdermedés pillanatában nyomban fixálni kell. A hazai agronematológiával
foglalkozó irodalom közül Andrássy és Farkas (1988), valamint Jávor (1974) kézikönyvében találhatók a
fonálférgek életmódjával, szaporodásával, vizsgálati módszereivel és határozásával kapcsolatos ismeretek.
A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) átvitele fonálférgekkel
a. Ültessünk 10 db Nicotiana tabacum növényt műanyag cserépben lévő, sterilizált földbe (legalább 3 héttel a
vizsgálat előtt).
b. Ültessünk dohány rattle vírussal fertőzött Nicotiana tabacum palántákat fonálférgeket tartalmazó földbe.
A vírusátvitel módszerei
97 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
c. Két nap múlva a földtől megtisztított nematódaszuszpenziót (akár szétválogattuk, akár nem) öt részre osztva
ömlesszük az egészséges dohánypalánták szárához közel lévő sekély lyukba. Hagyjuk a másik öt cserepet
kezeletlenül.
d. Kb. 10 nap múlva a leveleken megjelennek a dohány rattle vírus tipikus tünetei (nekrotikus gyűrűk,
érnekrózis). Ha a tünetek elmaradnak, vizsgáljuk meg, hogy a vírus a gyökérből kimutatható-e.
3.3.1.1.2. A vírus jelenlétének kimutatása gyökérből
A növényt vegyük ki a cserépből és mossuk le a földet a gyökeréről. Vágjuk le a gyökér egy darabját és
mozsárban dörzsöljük szét. Inokuláljunk egy karborundummal beszórt N. tabacum tesztnövényt, mindegyik
növény gyökerének szövetnedvével külön-külön. A szövetnedvet 1:10 arányban hígítsuk foszfát-pufferrel (pH
7,0). A tüneteket (nekrotikus foltok, gyűrűk) 2–5 nap elteltével ellenőrizhetjük.
Második módszer: Xiphinema és Longidorus fajok izolálása
A Xiphinema és a Longidorus fonálférgek sokkal nagyobbak, mint a Trichodorus fajok. Ezek a fonálférgek az
izolálás során a homokkal, törmelékkel együtt az üledékbe kerülnek (vö. az Első módszer című módszertani
leírás k pontjával). Ezeket a nematódákat csak szűrővel különítettük el a kisebb fajoktól. Az izolálást ettől a
lépéstől is folytathatjuk, vagy használhatjuk az eredeti talajmintát is.
a. Öntsünk vizet a talajmintára egy megfelelő edényben, pl. vödörben. Legalább tízszeresére hígítsuk a földet és
keverjük össze.
b. A durva talajdarabok pár másodperc múlva leülepednek.
c. Öntsük át a felülúszót 0,25 mm-es lyukátmérőjű szűrőn, és a maradékot gyűjtsük egy főzőpohárba.
d. Ismételjük meg a c pontot kétszer-háromszor.
e. Az így összegyűjtött maradékokat 0,1–0,2 mm-es lyukátmérőjű szűrőbe töltjük, és a szűrőt sekély rétegű
vizet tartalmazó Petri-csészébe helyezzük.
f. Sztereomikroszkóppal fény alatt vizsgáljuk.
g. A nematódák fertőzőképességét az előbb leírtak szerint ellenőrizzük. A vírus jelenlétét tesztnövényekkel
mutatjuk ki.
h. Fonálféreggel történő átvitel, javított standard módszerrel (Fritzsche, 1967)
i. A magvető ládákban kikelt 3–4 cm-es növényeket nem cserépbe, hanem 4 × 4 cm nagyságú kimélyített
üvegkockákba rakjuk (43. ábra).
j. Az üvegkockákba csak annyi sterilizált földet rakjunk, amennyi éppen ellepi a benne elültetett növény
gyökerét.
k. A talajnedvesség fenntartása céljából tegyük a kockákat egy nagy Petri-csészébe. A módszer előnye, hogy
így a fonálférgek közvetlenül a gyökér közelébe helyezhetők, mozgásukat a talaj nem befolyásolja. A
módszer hátránya, hogy a vizsgált növények élettartama igen rövid.
43. ábra - Javított standard módszerrel végzett vírusátvitel fonálférgekkel[R. Fritzsche
szívessége folytán]
A vírusátvitel módszerei
98 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3.4. Vírusátvitel talajlakó gombákkal
A talajlakó gombák közül a legismertebb az Olpidium brassicae, amely a dohány nekrózis vírus (tobacco
necrosis necrovirus) és a Spongospora subterranea, amely a burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top
pomovirus) (44. ábra) átvitelére alkalmas (Harris és Maramorosch, 1980; Jones, 1993b).
44. ábra - A burgonya szártörpülés vírus (potato mop-top pomovirus) lokális tünetei
Chenopodium amaranticolor diagnosztikai tesztnövényen, 27 nappal az inokulálás után
[Horváth József szívessége folytán]
A dohány nekrózis vírus átvitele Olpidium brassicae gombával
a. Az O. brassicae gombát légszáraz gyökérből vagy közvetlenül saláta- (Lactuca sativa) növény gyökeréből
izolálhatjuk. A Solanum nigrum, Solanum villosum vagy a Lactuca sativa növényeket virágcserépben
neveljük, durva homok és kagylózúzalék keverékén. Egy hét múlva hígítsunk Hoagland-oldatot 1:20
arányban (pH 7,0) és öntsük a virágcserépbe. További napokon vízzel öntözzük (Teakle, 1967).
A vírusátvitel módszerei
99 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
b. Amikor a gyökerek elérik a 3 mm-es hosszúságot, akkor a zoospóra-szuszpenziót a palánta szárához közel
lévő sekély lyukba öntjük. 5–8 nap után a zoospórák nagy tömegben vannak jelen.
c. Az inokuláláshoz kb. 60 db növény gyökerére van szükségünk, amelyet előzőleg folyóvízben gyorsan
lemostunk és kb. 30 ml desztillált vizet tartalmazó Petri-csészébe raktunk. 1%-os nyúlszérumot adunk a
vízhez, hogy meghosszabbítsuk a zoospórák mozgásképességét.
d. Kilenc rész zoospóra-szuszpenzióhoz (105–106 zoospóra /ml) egy rész dohány nekrózis vírust tartalmazó
szövetnedvet (15 g/l) adunk.
e. Öt perc elteltével 5 db Phaseolus aureus palánta gyökerét tesszük az elegybe, 5–30 percre. Ültessük a
növényeket Hoagland-féle ásványi tápoldattal átitatott homokba.
f. Az összehasonlítás kedvéért helyezzünk 5 db P. aureus növényt 5–30 percre dohány nekrózis vírust
tartalmazó szövetnedvbe (1,5 g/l), és utána ültessük el. Egy-két nap elteltével nekrotikus lokális léziók
jelennek meg a megfertőződött gyökereken.
3.5. Vírusátvitel Cuscuta fajokkal
Több vírus is képes egy olyan „természetes hídon” keresztül átjutni a fertőzött növényből az egészségesbe,
amelyet egy parazita növény, az aranka (Cuscuta spp.) indája hoz létre. Arankával nemcsak az átnövő szár
segítségével tudnak a vírusok átjutni a beteg növényről az egészséges növényre, hanem akkor is, ha a fertőző
növényen felnőtt aranka egy levágott hajtása rátekeredik a tesztnövény szárára és levelére.
Uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus)
átvitele arankával
A tesztelést elvégezhetjük vírussal fertőzött Nicotiana glutinosa növényről vírusmentes növényekre (Bakos et
al., 1995).
a. Tegyünk Cuscuta subinclusa magokat steril desztillált vizes, 0,5%-os agarózra (pH 5,5). Az arankamagoknak
kemény burka van, ezért áztassuk a magokat 20 percig H2SO4-ban, majd öblítsük háromszor bőséges
desztillált vízzel. Ezután tegyük 20 percre 20%-os hypóba, majd legalább háromszor alaposan mossuk le
desztillált vízzel. Az aranka a csírázást követően rendkívül gyorsan növekszik. A kezdetleges gyökérre csak
addig van szüksége, amíg a csíranövény számára szükséges vizet felveszi, később elszárad. A további
tápanyagfelvétel a hausztóriumokon keresztül történik.
b. Helyezzük a magról kelt 2–4 cm-es növényeket közvetlenül a gazdanövény szára vagy levélnyele mellé úgy,
hogy érintkezzenek egymással. Mindezt párás körülmények között végezzük. Olyan növények alkalmasak
gazdának, amelyeknek nincsen hosszú szőre (Beta vulgaris, Vicia faba). Mielőtt virágzásnak indulna, tegyük
át a csúcstól számított 10–20 cm hosszú szárakat egy új gazdanövényre, hogy megtartsuk az arankát
vegetatív stádiumban. A szárak csúcsain vannak ugyanis a gazdanövényt felismerő receptorok.
c. Az arankát fertőzhetjük úgy, hogy palántáját vagy 10–20 cm-es szárát a beteg növényre helyezzük.
Ügyeljünk arra, hogy a szár csúcsa elérje a gazdanövényt. Két hét múlva vagy később tegyük olyan közel a
tesztnövényhez, hogy az aranka szára átérhessen hozzá, vagy vágjunk 10–20 cm-es szárat és tekerjük ezt a
tesztnövény köré.
d. Egy-két nap elteltével figyeljük meg a megjelenő tüneteket a tesztnövények gyökerein.
4. Rovarokkal történő vírusátvitel molekuláris aspektusai
A vektorokkal történő vírusátvitel valamennyi típusában a víruspartikulumok mozgását kell nyomon követni. A
vírus és a vektor közötti molekuláris kölcsönhatást a víruspartikulumok felszíne határozza meg. A legtöbb vírus
esetében a virionok felszíne lép kölcsönhatásba a vektorral. Ez a kölcsönhatás lehet közvetlen, vagy történhet
közvetett módon is, egy másik, vírus által kódolt fehérjén keresztül (Hull, 1994). Ma már bizonyított tény, hogy
a vírusgenom és a géntermékek meghatározzák az átvitelt.
4.1. Köpenyfehérje (CP)
A vírusátvitel módszerei
100 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vírus-köpenyfehérje meghatározó az átvitel szempontjából. A köpenyfehérje pontos természete több esetben
még nem tisztázott, de azt tudjuk, hogy bizonyos aminosavak és domének lényegesek a folyamatban. A
köpenyfehérjét vizsgáló tanulmányok többségének középpontjában azok a módosult vagy módosított
vírusváltozatok állnak, amelyek eredetileg nem képesek a vírusátvitelre, de molekuláris úton átvihetővé tehetők
(Pirone, 1991).
A propagatív vírus–vektor kapcsolatok közül a here seb tumor vírus (clover wound tumor phytoreovirus) és a
kabócák között mutatták ki – első esetben molekuláris szinten – a köpenyfehérje szerepét. A here seb tumor
vírus vad típusú izolátumaiban a kettős szálú RNS 12 szegmensében hiány (deléció) található, ami az átviteli
képesség elvesztését eredményezi. A 2. vagy 5. szegmens deléciója esetén megszűnik az átvitel, és ezek az
izolátumok a rovarsejteket sem fertőzik. Ez a két génszakasz kódolja a vírus köpenyének 130 kD és 76 kD
nagyságú fehérjéit. A külső köpeny enzimatikus eltávolítása nem okozza a vektorsejtek fertőzöttségének
elvesztését. Valószínű, hogy a génszakaszok hiánya fontosabb az átvitel szempontjából, mint a külső köpeny
eltávolítása. Egy másik vírus, a burgonya sárga törpülés vírus (potato yellow dwarf nucleorhabdovirus)
felszínén glükoprotein (G-protein) „tüskék” helyezkednek el, ezek okozzák a kórokozó kabócával történő
átvihetőségét. A „tüskék” eltávolítása a rovar testében a vírusfertőzés csökkenését eredményezi, a növényben
azonban nem. A burgonya sárga törpülés vírusnak két törzse ismert, amelyet különböző kabócavektorok
terjesztenek. A két törzs G-proteinjének különböző izoelektromos pontja összefüggésben van az egyrétegű
vektorsejt fertőzésének pH-optimumával.
Az árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus) levéltetvekkel történő terjedése cirkulatív jellegű,
de a vírus a vektor testében nem szaporodik. Az árpa sárga törpülés vírus MAV-izolátuma normális
körülmények között nem vihető át Rhopalosiphum padi levéltetűvel, míg a vírus RPV-izolátuma igen. Ha a
MAV-izolátum RNS-ét az RPV-izolátum köpenyfehérjéjébe burkolták, akkor a MAV-RNS is átvihetővé vált R.
padi által. Cirkulatív átvitel esetén a köpenyfehérje szerepét bizonyítja az a tény is, hogy luteovirusokkal történt
kevert fertőzés hatására levéltetvekkel nem átvihető vírusok is átvihetővé válnak. A kevert fertőzéseknél a nem
luteovirus-RNS a luteovirus köpenyfehérjébe enkapszidálódik. A kevert vírusoknak speciális vektoraik vannak,
amelyeket a luteovirus eredetű köpenyfehérje határoz meg. A cirkulatív borsó enációs mozaik vírus (pea enation
mosaic enamovirus) átvitelét a köpenyfehérje kisebb alkotója határozza meg. Ez a 22 kD fehérje a levéltetűvel
átvihető és a nem átvihető izolátumokban egyaránt túlsúlyban van. Ennek a kis fehérjének a jelenléte összefügg
a levéltetűvel átvihető izolátumban egy magas molekulatömegű RNS1-gyel, amelyik a köpenyfehérjét kódolja.
A genom részének elvesztése eredményezi az 56 kD-os termék hiányát, ami nélkülözhetetlen a levéltetű-
átvitelben. Az árpa sárga törpülés vírus és a borsó enációs mozaik vírus esetében a kórokozónak be kell kerülnie
a vektor nyálmirigyébe, és ezt követően lehetséges a vírusátvitel. A köpenyfehérje szerepét egy geminivirus
vektorában génkicseréléssel bizonyították. Az egyszálú DNS-t tartalmazó geminivirusoknak két alcsoportját
különböztetjük meg. Az egyik alcsoportot molytetvek, míg a másikat kabócák terjesztik. Kiméra klónokat
állítottak elő úgy, hogy a konstrukcióban a molytetűvel átvihető Cassava afrikai mozaik vírus (Cassava African
mosaic bigeminivirus) DNS-éhez a kabócával átvihető répa levélcsúcs fodrosodás vírus (beet curly top
hybrigeminivirus = curtovirus) köpenyfehérjéjét illesztették. A kimérával növényeket fertőztek, majd a tisztított
víruskimérát kabócába injektálták. A rovar a vírust átvitte, a növény a Cassava afrikai mozaik vírus tüneteit
mutatta.
A nem cirkulatív vírusátvitelnél a vektor–vírus kölcsönhatás nem annyira specifikus, mint a cirkulatív vírusok
esetében. A nem cirkulatív vírusok mechanikailag könnyen átvihetők. Ebben a víruscsoportban is vannak
levéltetűvel kevésbé és jobban átvihető izolátumok. Mindkét típust használták a köpenyfehérje szerepének
kimutatására cucumovirusok és potyvirusok levéltetű átvitelében. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic
cucumovirus) eltérő izolátumaival végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az átvihetőséget az határozza meg,
hogy az RNS-t melyik típusú köpenyfehérje burkolja. A paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy
cucumovirus) V törzsének köpenyfehérjéje, amely levéltetvekkel átvihető, szintén lehetővé tette az uborka
mozaik vírus átvitelét. A paradicsom magtalanság vírus a dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) is
képes az előbb leírtak szerint a levéltetvek számára felvehetővé tenni. Az uborka mozaik vírus genomjában az
RNS-3 kódolja a köpenyfehérjét. A levéltetű-átvihetőséget szintén az RNS-3 határozza meg. Az
összehasonlítási vizsgálatok azt mutatták, hogy a köpenyfehérje 168. aminosava felelős a vírus terjedéséért. A
köpenyfehérje szerepét közvetett módon bizonyítja a dohány karcolatos vírus (tobacco etch potyvirus)
levéltetvekkel nem terjeszthető izolátuma. Ezen izolátumok köpenyfehérjéjének N-végén lévő aminosav-
szekvenciákat összehasonlították ugyanezen vírus magas átviteli hatékonysággal rendelkező izolátumaival és
más, levéltetűvel átvihető potyvirusok N-végeivel. Az eredmény meglepő volt. A levéltetűvel átvihető
izolátumokban három aminosav-szekvencia mutatkozott konzervatívnak: Asp-Ala-Gly (DAG). A nem átvihető
izolátumban pedig az Asp-Ala-Ser (DAS). Ez az aminosavtriplet foglalja magában a levéltetűvel történő
átvihetőséget. Más potyvirusok tripletjeivel végzett összehasonlító vizsgálatok azt mutatták, hogy a triplet 2., ill.
3. helye gyakran változik az izolátumokban, pl. a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) esetében Asp-Ala-Leu
A vírusátvitel módszerei
101 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
(DAL), a papaya gyűrűsfoltosság vírusnál (papaya ringspot potyvirus) és a cukkini sárga mozaik vírusnál
(zucchini yellow mosaic potyvirus) Asp-Thr-Gly (DTG), végül a szója mozaik vírusban (soybean mosaic
potyvirus) Asp-Ala-Asp (DAD). A triplet harmadik aminosavjának szerepét a dohány érfoltosság vírus (tobacco
vein mottling potyvirus) levéltetvekkel terjedő izolátumával bizonyították, amelyben a triplet Asp-Ala-Glu
(DAE). Olyan transzkriptumokkal fertőztek növényeket, amelyekben az átvihető izolátum teljes hosszúságú
cDNS klónjába a nem átvihető izolátum köpenyfehérjéjének cDNS klónját helyezték. Ezt a kiméra vírust a
levéltetvek képtelenek voltak átvinni, annak ellenére hogy a kiméra mechanikai fertőzhetőségét megőrizte.
Később felbecsülték a köpenyfehérje N-vég DAG-tripletjében létrejövő hiányok vagy helyettesítések
jelentőségét a dohány érfoltosság vírus levéltetű-átvitelében. A molekuláris módszerrel létrehozott mutánsokat a
dohány érfoltosság vírus levéltetűvel terjeszthető izolátumának teljes hosszúságú cDNS klónjába építették, és a
transzkriptumokkal növényeket fertőztek. A DAG-triplet teljes deléciója pl. az átviteli képesség megszűnésével
járt. Ha a triplet első aminosavját Asp-ról Asn-ra változtatták, akkor a mutáció az átvitelre nem volt hatással. A
második aminosavban történt változtatás már drasztikusan érinti az átviteli képességet. Ha a relatív átviteli
képességet százalékban fejezzük ki a kontroll DAG-izolátumokhoz képest, akkor ez az érték 3%. A harmadik
aminosav helyettesítése az átvitel hatékonyságát 0%-ra csökkentette. A továbbiakban azt kell meghatározni,
hogy a levéltetű-átvitelért felelős domain kiterjedése mekkora a genomban. Ehhez hasonló hiányok vagy
helyettesítések a természetben is létrejöhetnek, bizonytalanná téve a potyvirusok átvitelét. A potyvirusok
ugyanis megkötődhetnek a tápcsatornában vagy a vektor előbelében. A potyvirus-köpenyfehérje N-végének
aminosavai a virion felszínén helyezkednek el, ezért alapvetően befolyásolhatják a vírus kötődését és
megtartását.
4.2. Helper komponens (HC)
Míg a cirkulatív cucumovirusok levéltetű-átvitelét kizárólag a köpenyfehérje határozza meg, addig a potyvirusok
és caulimovirusok esetében szükség van egy vírus által kódolt, nem szerkezeti fehérjére. Ezt a fehérjét helper,
azaz segítő komponensnek (HC) nevezzük, de a caulimovirusoknál megszerzési vagy levéltetű-átviteli faktornak
is hívják.
A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) HC-je elősegíti a klónozott vírus-DNS fertőzését. A
deléciós mutánsok analízise és a karfiol mozaik vírus izolátumok különböző átviteli képességekkel rendelkező
kimérájának szerkezete bizonyítja, hogy a genom nyílt leolvasási szakasza (open reading frame, ORF), az
ORFII kódolja a HC-t. Az ORFII egy 18 kD (P18) fehérjét kódol, amely kimutatható a vírussal fertőzött
növényben. Valószínűleg a P18 fehérje maga a HC. A karfiol mozaik vírus levéltetvekkel nem átvihető
izolátumával fertőzött növényekben vagy nincs P18 fehérje, vagy van, de egy kicserélődés eredményeképpen
mutáció jön létre a 94. aminosav helyén. Egy deléció az ORFII rendszeren belül vagy a P18 fehérje végében a
levéltetű-átvitel megszűnését okozza. Nagyon nehéz közvetlenül bizonyítani, hogy a P18 tulajdonképpen a HC.
A karfiol mozaik vírus levéltetvekkel átvihető izolátumával fertőzött növények nedvével végzett membrán-
etetéses vizsgálatok pozitív összefüggést mutattak a P18 jelenléte és a levéltetű-átvihetőség között. Két
potyvirus [dohány érfoltosság vírus (tobacco mottling potyvirus) és burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus)] HC-
jét tisztították, és két fehérjét kaptak (53 kD, 58 kD). Ebből arra következtettek, hogy a HC biológiailag aktív
formája valószínűleg egy dimer. Az in vitro transzláció és a nukleotidok szekvenciaanalízise alapján a dohány
érfoltosság vírus HC-jét a második gén kódolja. Ha a vírus HC-jének N-terminusa blokkolt, nem lehetséges a
HC-gén 5‟ végének meghatározása. A vírus-HC N-vége valószínűleg szerin, míg C-terminusa a dohány
karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) analóg módon glicin. Ennek alapján a dohány érfoltosság vírus HC-
gén a 947. nukleotidnál kezdődik és a 2344. nukleotidnál végződik. Bizonyos burgonya Y-vírus és cukkini sárga
mozaik vírus törzsek a HC deléciója miatt váltak levéltetvekkel átvihetetlenné. A burgonya Y-vírus HC-defektív
törzsének elektroforetikus és immunológiai tulajdonságai hasonlítanak a burgonya C-vírushoz [= burgonya Y-
vírus C-törzse (C-strain of potato Y potyvirus)]. A burgonya Y-vírus és a C-vírus törzs aminosav szekvenciáinak
és nukleotidjainak összehasonlítása a HC–PRO (helper component-protease) régióban 92%-os homológiát
mutat, és csak 24 aminosavban van eltérés. A C-vírus törzs HC-szekvenciáit további öt potyvirussal
összehasonlítva csak két aminosavban van eltérés (lizinről glutaminsavra és izoleucinról valinra). Az
aminosavaknak a HC tevékenységében játszott szerepe a mai napig vizsgálat tárgyát képezi. A HC tehát
közvetlenül vagy közvetett úton képes irányítani a vírusátvitelt. A direkt viszonyban a köpenyfehérje N-
terminális aminosavai közvetlenül lépnek kölcsönhatásba a HC-vel, míg a közvetett (indirekt) viszonyban a HC
csak közvetítő szerepet játszik a virionok és a vírus megőrzési helye között a vektorban.
5. Fonálférgekkel történő vírusátvitel molekuláris aspektusai
A vírusátvitel módszerei
102 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A növényvírusok fonálférgekkel történő átvitele egyéb vektorokhoz (rovarok, gombák, stb.) hasonlóan három
fázisból tevődik össze: 1. a vírus felvétele, 2. a vírus megtartása és 3. a gazdanövény sejtbe juttatása. A vírus
felismerésének mechanizmusa ebben a kapcsolatban is rendkívül bonyolult és fajlagos. E folyamatban a
vírusgenom által kódolt fehérjék fontos szerepet játszanak. Az eddigi tanulmányok pl. azt mutatták, hogy a
tobravirusok esetében jelentősek a vírusnukleinsav által meghatározott nem-szerkezeti fehérjék (Schmitt et al.,
1998). A nepovirusok gén funkciói kevésbé ismertek, de a vírus–vektor kölcsönhatás a tobravirusokéhoz
hasonló (Vassilakos et al., 1997).
A nepovirusok pl. dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) osztott genomú, poliéder alakú
vírusok. E nemzetségbe tartozó vírusokat a Xiphinema és a Longidorus fajok terjesztik. A tobravirusok, pl.
dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus), borsó korai barnulás vírus (pea early-browing tobravirus),
paprika gyűrűsfoltosság vírus (pepper ringspot tobravirus) osztott genomúak, pálcika alakú virionjaik egyszálú
pozitív RNS-t tartalmaznak. A nagyobbik RNS-szál (RNS1) a replikációban játszik szerepet és a vírus sejtről
sejtre történő terjedéséért felelős. A kisebbik RNS-szál (RNS2) változó hosszúságú és szekvenciájú, amely a
köpenyfehérjét kódolja. Az RNS2 további géneket is tartalmazhat, amelyek nem-szerkezeti fehérjéket kódolnak.
A tobravirusokat a talajban élő Trichodorus és Paratrichodorus fonálférgek terjesztik. A szerológiailag jól
elkülöníthető vírusizolátumoknak speciális fonálféregfajaik vannak. Jelenleg a dohány rattle vírus PpK20 jelű
izolátumának Paratrichodorus pachydermus vektorral és a borsó korai barnulás vírus TpA56 jelű izolátumának
Trichodorus primitivus vektorral történő átvitele ismert részletesebben. A PpK20 jelű izolátumban az RNS2 két
nem-szerkezeti fehérjét kódoló gént (29,4K, ill. 32,8K) tartalmaz, míg a TpA56 jelű izolátum három ilyen
fehérjét határoz meg (9K, 29,6K és 23K). MacFarlane et al. (1998) szerint ugyanezen gének molekulatömege
37K, 32.8K, ill. 9K, 29K, 23K.
A dohány rattle vírus PpK20 jelű izolátumával végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy a vírus mechanikai
inokulációját követően a két nem-strukturális fehérjét meghatározó génben bekövetkező hiányok az
enkapszidációt (köpenyfehérjébe burkolást) és az RNS1 és RNS2 együttes replikációját nem gátolják. A 29,4
kD fehérjét kódoló génszakaszban fellépő mutációk megszüntetik az átvitelt, míg a 32,8 kD fehérjét kódoló
régióban bekövetkező deléciók nem. Ebből arra következtettek, hogy a PpK20 izolátumban a 29,4K gén felelős
a vírusátvitelért (Hernández et al., 1997).
Az RNS2 vírusátvitelben játszott meghatározó szerepét pszeudorekombináns vírusokkal bizonyították,
amelyeket a vektorral könnyen átvihető dohány rattle vírus PpK20 jelű izolátum és a vektorral átvihetetlen
dohány rattle vírus PLB jelű izolátum RNS1 és RNS2 kicserélésével hoztak létre. A borsó korai barnulás vírus
TpA56 jelű izolátum RNS2-jének fertőző cDNS klónjában és egy ezzel rokon SP5 jelű izolátumban
bekövetkező mutációk analízise is azt mutatta, hogy a vírusátvitelben az RNS2-nek van szerepe.
MacFarlane et al. (1998) négy különböző tobravirus izolátum genom-analízisét végezték el. A vírusizolátumok
a következők voltak: a már említett TpA56 jelű borsó korai barnulás vírus izolátum és a PpK20 jelű dohány
rattle vírus izolátum, valamint további két újabb dohány rattle vírus izolátum (TpO1 és PaY4). Az izolátumok
nukleotid szekvenciái között történt összehasonlítások nagyfokú homológiára, de szembetűnő eltérésekre is
rámutattak. A köpenyfehérjén kívül a vírusgenom további két vagy három fehérjét kódol. A TpA56 jelű
izolátum és a TpO1 jelű izolátum köpenyfehérjegénje és 29K génje között helyezkedik el a 9K gén. A megelőző
vizsgálatok arra mutattak, hogy ez a fehérje magában foglalja a vírusátviteli képességet. Később beigazolódott,
hogy szerepe van ebben a folyamatban. A nem-szerkezeti fehérjék közül a 29K fehérjének nélkülözhetetlen
szerepe van a vírusátvitelben. A borsó korai barnulás vírus TpA56 jelű izolátum 29K fehérjéjét kódoló gén
nagyfokú homológiát mutat a többi három dohány rattle vírus izolátum ennek megfelelő génszakaszaival (PaY4
27K, TpO1 29K, PpK20 37K). Az utolsó gén hosszúsága és szekvenciái igen változatosak a különböző
izolátumokat illetően (TpA56 23K, PaY4 32,1K, TpO1 18K, PpK20 32,8K). Az előzetes vizsgálatok azt
mutatták, hogy a borsó korai barnulás vírus TpA56 jelű izolátum 23K fehérjéjét érintő nagyobb átírási szakasz
mutációi meggátolják az átvitelt, míg a kisebb deléciók csökkentik a hatásfokát. Létrehoztak olyan mutánst is,
amelyből teljesen hiányzik a 23K fehérje. Ez a mutáns átvihető ugyan fonálférgekkel, de csak nagyon kis
hatékonysággal. A 23K gén, ill. fehérje szerepének pontos tisztázása még további vizsgálatokat igényel. Ennek a
köpenyfehérjétől legtávolabb kódolt fehérjének az aminosavai és a dohány rattle vírus izolátumok megfelelő
fehérjéinek az aminosavai között nem mutatható ki homológia. A dohány rattle vírus PpK20 izolátum 32,8K
génjének és a PaY4 izolátum 18K génjének a hiánya a vírusátvitel gyakoriságát nem csökkenti a
Paratrichodorus anemones fonálféreg alkalmazása esetében. A PaY4 izolátumot a P. anemones és a P.
pachydermus fajok, míg a PpK20 izolátumot csak a P. pachydermus fajok terjesztik. A jövőbeni vizsgálatoknak
az a célja, hogy megállapítsák a köpenyfehérje vagy a mellette elhelyezkedő 27K (PaY4), ill. 37K (PpK20)
fehérjék szerepét az eltérő vírusátvitelben.
A vírusátvitel módszerei
103 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A fonálférgekkel történő vírusátvitellel kapcsolatban új eredményekről számolt be Brown és Trudgill (1998).
Vizsgálataik során olyan mikrotechnikát fejlesztettek ki, amely alkalmas volt a fonálférgek vírusátvitelének
vizsgálatára. Négy nepovirus átvihetőségét mutatták ki a Xiphinema americanum vonalba tartozó fonálférgek
közül. Ebbe a vonalba 45 szűznemzéssel szaporodó és morfológiailag hasonló X. americanum faj tartozik. Ezt a
technikát alkalmazva megállapították, hogy az Európában élő Longidorus vektorfajok egy vagy két,
szerológiailag jól megkülönböztethető vírustörzset képesek terjeszteni, míg az Amerikában élők akár mind a
négy nepovirust. További érdekes megfigyeléseket tettek a X. americanum fajt illetően. Észak-Amerikában
ugyanis a vírusterjesztő fajok csak a harmadik lárvastádiumig fejlődnek, míg a világ többi részén, ha a negyedik
lárvastádium is kialakul, ezek az alakok már nem képesek a vírusátvitelre. Ezt a felfedezést biológiai jelzőként
használják fel a vírus–vektor kapcsolatban.
Az 1990-es évektől kezdődően kifejlődő molekuláris technikák lehetővé tették, hogy zöld fluoreszcens fehérjék
tobravirus izolátumokba építésével láthatóvá váljék a Trichodorus vektorfajok táplálkozási mechanizmusának
vírusátvitelben betöltött szerepe, valamint a vírus terjedése a gyökérben. A jelenleg folyó kutatások
középpontjában a fonálférgek elleni kémiai védekezés helyett a vírusátvitel megelőzése szerepel. Ennek
érdekében burgonyában a fonálférgekkel terjedő vírusokkal szemben kialakított természetes rezisztencia
létrehozása az elsődleges kutatási feladat.
104 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
8. fejezet - A biotesztek virológiai alkalmazása
A vírusok vizsgálatának tesztnövényes módszere egyidejűleg fejlődött a növényvirológiával. Mayer (1886) volt
az első, aki a dohány mozaik betegségét vizsgálta, és megállapította, hogy a betegség kórokozója növényi
nedvvel átvihető az egészséges növényre. Ez a felfedezés, valamint Johnson (1925), Holmes (1929) és Smith
(1931) tesztnövényekkel végzett kísérletei, majd Price (1940) és Holmes (1946) a gazdanövénykörökről szóló
tanulmányai megnyitották az utat a felbecsülhetetlen fontosságú elméleti és gyakorlati tudományos eredmények
felé. Azok a vizsgálatok, amelyeket a kutatók a XX. században a vírusok tesztnövényeivel végeztek,
napjainkban sem veszítették el jelentőségüket annak ellenére, hogy a tesztnövények használata a
vírusdiagnosztikában drága; sok kézi munkát, helyet és időt igényel. A biotesztek jelentősége főleg abban van,
hogy a vírusok patológiai tulajdonságai csak tesztnövényeken vizsgálhatók, és eredményei bizonyos esetekben
megbízhatóbbak, mint a szerológiai és egyéb vizsgálatoké. A növényi nedvből a tesztnövények segítségével kis
víruskoncentráció esetén is kimutathatók a vírusok. Az utóbbi években kifejlesztett gyors és megbízható
víruskimutatási módszerek (ELISA-módszer, elektronmikroszkópos vizsgálatok, PCR-technika) sem zárják ki a
tesztnövények használatának szükségességét, hiszen a növényi vírusok tanulmányozása növények nélkül nem
lehetséges. A CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses c. kiadvány 446 növényfajt (43 család és 163 nemzetség
fajait) említ mint a biotesztek során használható tesztnövényt (Murant és Harrison, 1970–1988; Horváth, 1993 a,
c).
1. A növény–vírus kapcsolat típusai
A növények és vírusok közötti alternatív kapcsolat a kompatibilitásban és az inkompatibilitásban jut kifejezésre
(Horváth, 1976). A növény–vírus kapcsolat egy különleges esete a túlérzékenység, ill. hiperszenzitivitás
(hypersensitive reaction, HR-reaction) (45. ábra).
45. ábra - A: Vicia faba hiperszenzitív reakciója a bab sárga mozaik vírussal (bean
yellow mosaic potyvirus) és B: Melandrium sárgafoltosság vírussal (Melandrium yellow
fleck bromovirus) szemben [Horváth József szívessége folytán]
1.1.
1.1.1.
1.1.1.1.
1.1.1.1.1. Kompatibilitás
Kompatibilis gazda–parazita kapcsolatban a növény gazdája a vírusnak. Az ilyen növényben a kórokozó
replikációjának és elterjedésének nincs akadálya. A kompatibilis növény gyakran látható tünetekkel reagál az
inokulációra. Az inokulált növények reakciója (szimptómák) attól függően, hogy a növény inokulált levelein
vagy a nem inokulált (az inokuláció után képződött) új levelein mutatkozik-e, lokális vagy szisztemikus lehet.
Egyes gazda–vírus kombinációban lokális és szisztemikus kapcsolat együtt is kialakulhat. A kompatibilis
A biotesztek virológiai alkalmazása
105 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
növény–vírus kapcsolat egyes esetekben nem jut kifejezésre látható tünetekben, hanem tünetmentes marad. A
látens fogékonyság mind lokális, mind szisztemikus, mind pedig lokális és szisztemikus lehet. Horváth (1983)
egyik összefoglaló tanulmányában 1312 új gazda–vírus kapcsolatot állapított meg, amelyből 13% látensnek
bizonyult. A kompatibilis gazda–vírus kapcsolatban a tünetek megjelenése után bekövetkezhet az ún.
kigyógyulás (recovery), amely az újabb vélemények szerint a rezisztencia egyik formájának tekinthető
(Pennazio et al., 1999).
1.1.1.1.2. Inkompatibilitás
Inkompatibilitás esetében a növény–vírus kapcsolatban a kórokozó ugyan eredményesen fertőzi a növényt, de
nem betegíti meg. Az inkompatibilitás létrejöhet a vírus elégtelen támadóképessége vagy a növény ellenálló
tulajdonsága miatt. Az inkompatibilis kapcsolatban a vírus replikációja zavart szenved, majd leáll, és a kórokozó
nem terjed el a gazdanövényben (nem szisztemizálódik).
1.1.1.1.3. Hiperszenzitivitás
Az inkompatibilitás gyakran hiperszenzitivitás formájában jelentkezik. A túlérzékenységi vagy hiperszenzitív
reakció esetén a gazdanövénybe juttatott vírus helyileg replikálódik ugyan, de a folyamat a gazdaszervezet aktív
leküzdési reakciója következtében gátolt. Hiperszenzitív reakció (nekrózis, esetleg amputáció) esetén a növény
igyekszik a kórokozót lokalizálni. A hiperszenzitív reakció attól függően, hogy a növény melyik részén lép fel,
kétféle lehet: lokális és szisztemikus. A hiperszenzitív reakciónak nagy jelentősége van a növénynemesítésben.
1.1.1.1.4. A növény–vírus kapcsolatokat befolyásoló tényezők
A tesztnövények fejlettségi állapota befolyásolja fogékonyságukat a vírusfertőzéssel szemben. A Chenopodium
amaranticolor, a Chenopodium quinoa és a Nicotiana clevelandii 10 leveles, a Nicotiana glutinosa 7 leveles, a
Nicotiana tabacum és a Gomphrena globosa 4 leveles állapotban ideális diagnosztizálási célra. Az uborkának
(Cucumis sativus) és a töknek (Cucurbita pepo) a sziklevelét, a babnak (Phaseolus vulgaris) és a tehénborsónak
(Vigna sinensis) a primer leveleit kell inokulálni, mert a növény idősebb levelei nem alkalmasak a fertőzésre. Az
uborkát pl. a vetést követően a 10. és a 15. nap között kell fertőzni, mert a 10 napnál fiatalabb és a 15 napnál
idősebb sziklevelek rezisztensek a vírusfertőzéssel szemben (Yarword, 1971).
A növény vírusfogékonyságát a levél helyzete (a levélemelet szekvenciája) is befolyásolja; a fertőzés idejében
kritikus a levél mérete is (Horváth, 1969 a, b).
Fontos ismernünk a tesztnövények fotoperiódusát is. A Chenopodium quinoa és a Nicotiana clevelandii
hosszúnappalosak, a Chenopodium album és a Glycine max rövidnappalosak, míg a Vicia faba, a Cucumis
sativus és a Phaseolus vulgaris közömbös a napszakok hosszának változására. Harrison és Jones (1971) a
hőmérséklet és a fény hatását tanulmányozták a burgonya szártörpülés vírussal (potato mop-top pomovirus)
fertőzött dohányleveleken. Megállapították, hogy a vírusakkumuláció növekedett, ha a növényeket 22 °C-os
megvilágított helyről 14 °C-os sötétbe helyezték. Horváth és Pocsai (1972) különböző fotoperiódusos kezelések
során azt tapasztalták, hogy alacsony hőmérsékleten a lokális léziók megjelenését elősegítette a hosszabb
megvilágítás, míg magas hőmérsékleten a rövidebb megvilágítás volt hatásos.
2. A vírusfertőzés tünetei (szimptomatológia)
A kompatibilis gazda–vírus kapcsolatban a vírusfertőzés és a vírusreplikáció következtében a gazdanövény
gyakran tünetekkel (szimptóma) reagál a fertőzésre. A tünetek vizsgálatával a tünettan (szimptomatológia)
foglalkozik (Bos, 1970; Schmelzer, 1980). A vírusfertőzés következtében megjelenő szimptómák két nagy
csoportra oszthatók: szabad szemmel látható, a növényeken megjelenő, ún. makroszkópos, ill. külső
szimptómák és szabad szemmel nem látható, a növényekben megjelenő, ún. mikroszkópos, ill. belső
szimptómák. E fejezetben a makroszimptómák részletezésével foglalkozunk.
2.1.
2.1.1.
2.1.1.1.
2.1.1.1.1. Makroszimptómák
A biotesztek virológiai alkalmazása
106 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vírusfertőzés hatására a növényeken jelentkező, szabad szemmel látható tünetek két csoportra oszthatók:
lokális vagy primer szimptómákra és szisztemikus vagy szekunder szimptómákra. A makroszimptómák
osztályozása az alapján is ismert, hogy a növény mely részén (gyökér, levél, szár, virág, termés, mag) jelennek
meg a tünetek.
2.1.1.1.2. Lokális tünetek
Kompatibilis kapcsolat esetén az inokulációt követően néhány nap, esetleg néhány óra múlva a gazdanövény
inokulált levelén klorotikus és/vagy nekrotikus elváltozások jelentkeznek, amelyeket lokális lézióknak nevezünk
(46. ábra). A léziók mérete gombostűfej nagyságútól több centiméter átmérőjű nekrotikus vagy klorotikus foltig
terjedhet. A léziók lehetnek klorotikusak (világoszöld, sárgászöld és sárgásfehér foltok) vagy nekrotikusak
(fekete, barna, vörös és szürkésfehér foltok). A lokális léziók formája igen változatos; lehetnek foltszerűek,
gyűrű alakúak és csíkok (10. táblázat).
10. táblázat - Lokális növény-vírus kapcsolatok
Gazda–vírus kapcsolat Lokális tünettípus
Chenopodium amaranticolor–dohány
mozaik vírus1 nekrotikus léziók
Chenopodium amaranticolor–uborka
mozaik vírus2 klorotikus léziók
Chenopodium quinoa–burgonya Y-vírus3 klorotikus léziók
Chenopodium quinoa–dohány mozaik vírus1 klorotikus léziók
Datura stramonium–paradicsom mozaik
vírus4 nekrotikus léziók
Nicotiana glutinosa–paradicsom mozaik
vírus4 nekrotikus léziók
Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc–dohány
mozaik vírus1 nekrotikus léziók
Phaseolus vulgaris–lucerna mozaik vírus5 nekrotikus léziók
1 tobacco mosaic tobamovirus
2 cucumber mosaic cucumovirus
3 potato Y potyvirus
4 tomato mosaic tobamovirus
5 alfalfa mosaic alfamovirus
46. ábra - Lokális szimptómák Datura stramonium (A) és D. gigantea (B) inokulált
levelein. A: klorotikus léziók belladonna foltosság vírussal (belladonna mottle
tymovirus) fertőzött növény levelén; B: nekrotikus léziók dohány gyűrűsfoltosság
vírussal (tobacco ringspot nepovirus) inokulált növény levelén [Horváth József
szívessége folytán]
A biotesztek virológiai alkalmazása
107 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2.1.1.1.3. Szisztemikus tünetek
A szisztemikus tünetek megjelenéséig az inokulációt követően napok, hetek vagy hónapok, sőt egyes esetekben
évek kellenek. A lágy szárú növények gyorsabban reagálnak a fertőzésre, mint a fásszárúak, a fiatal növények
általában fogékonyabbak, mint az idősek. A szisztemikus tünetek megjelenésénél beszélhetünk lappangó
(látens) és heveny (akut) fázisról. A leggyakrabban előforduló szisztemikus tünetek: mozaik, érnekrózis,
érkivilágosodás, hólyagosodás, márványozottság, levéldeformáció, páfránylevelűség, kinövések (11. táblázat).
11. táblázat - Szisztemikus növény-vírus kapcsolatok
Gazda–vírus kapcsolat Szisztemikus tünettípus
Cucurbita maxima–tök mozaik vírus1 kinövések (enációk)
Datura stramonium–beléndek mozaik vírus2 levéldeformáció
Nicotiana glutinosa–uborka mozaik vírus3 márványozottság, mozaik,
növekedésgátlás
N. tabacum cv. Samsun–dohány mozaik
vírus4 mozaik
Nicotiana tabacum cv. Samsun–burgonya
Y-vírus5 érkivilágosodás, mozaik (C-, N-törzs)
Nicotiana tabacum cv. Samsun–burgonya
Y-vírus5 érkivilágosodás, mozaik, érnekrózis (R-,
NTN-törzs)
Phaseolus vulgaris–bab közönséges mozaik
vírus6 hólyagosodás, mozaik,
levéldeformálódás
A biotesztek virológiai alkalmazása
108 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Vitis vinifera–szőlő páfránylevelűség vírus7 páfránylevelűség
1 squash mosaic comovirus
2 henbane mosaic potyvirus
3 cucumber mosaic cucumovirus
4 tobacco mosaic tobamovirus
5 potato Y potyvirus
6 bean common mosaic potyvirus
7 grapevine fanleaf nepovirus
2.1.1.1.4. A növényi szerveken lévő tünetek
A növényi szerveken megjelenő tünetek közül a leveleken lévők mutatják a legváltozatosabb képet. Ha a levél
fejlődésében zavar áll be, elszíneződések (sárgulás, nekrózis, érkivilágosodás, mozaikfoltok, tarkulás, gyűrűk,
minták, csíkok, hálózatosság stb.) és deformációk (ráncosodás, hólyagosodás, torzulás, kinövések,
levélkeskenyedés, páfránylevelűség stb.) alakulhatnak ki (47. ábra).
47. ábra - Szisztemikus szimptómák. A: lucerna mozaik vírussal (alfalfa mosaic
alfamovirus) inokulált Solanum marginatum mozaikos levele; B: paradicsom
magtalanság vírussal (tomato aspermy cucumovirus) inokulált Nicotiana glutinosa
deformált levele; C: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) inokulált burgonya
(Solanum tuberosum) levele; D: dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus)
fertőzött Petunia atkinsiana páfránylevelűsége [Horváth József szívessége folytán]
A száron, hajtáson, terméseken és virágokon mutatkozó tünetek közül a különböző foltok, elszíneződések,
nekrózisok, deformációk, internódium-megnyúlás, ill. -rövidülés, hajtáshervadás és a szártumorok a
legjelentősebbek (48. ábra).
48. ábra - A: burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Nicotiana tabacum
szárnekrózisa; B: nekrotikus léziók a burgonya Y-vírus NTN-törzsével fertőzött
burgonya (Solanum tuberosum) bogyóin; C: nekrotikus léziók a burgonya Y-vírus NTN
törzsével fertőződött burgonyagumókon; D: tarlórépa mozaik vírussal (turnip mosaic
potyvirus) fertőződött Matthiola incana virágának színtörése (flower breaking) [A és D:
Horváth József szívessége folytán; B és C: Pintér Csaba szívessége folytán]
A biotesztek virológiai alkalmazása
109 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A korai vírusfertőzés a generatív szerveken is elváltozásokat okoz. A virágtakaró levelek színtörését a tulipán
színtörés vírus (tulip breaking potyvirus) vagy a tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic potyvirus) okozza (48D
ábra), de találhatunk a virágon nekrotikus foltokat, kinövéseket, létrejöhet deformáció, és gyakori tünet a
pártacső felrepedése is.
A burgonya Y-vírus NTN törzsének (potato Y potyvirus, PVYNTN) fertőzése esetén a burgonyagumón és bogyóin
nekrotikus foltok keletkeznek (48B és C ábra). A dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) jellegzetes
nekrotikus tüneteket idéz elő a burgonyagumókon (49A ábra). Kövecsesedést okoz a körte termésén a körte
kövecsesedés vírus (pear stony pit virus), amely a gyümölcs minőségét jelentősen rontja. A vírusfertőzés egyes
tünetei a magvak felületén is megjelennek. A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) a fertőzött szilván
gyűrűket, torzulásokat idéz elő.
49. ábra - A: dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) által előidézett tünetek
Libertas burgonyafajta gumószöveteiben; B: répa nekrotikus sárgaerűség vírus (beet
necrotic yellow vein benyvirus) által előidézett gyökérproliferáció (szakállasodás)
cukorrépán [Horváth József szívessége folytán]
A növényi szervek közül a gyökéren lévő vírustünetek (valószínűleg elhelyezkedésük miatt) ismertek a
legkevésbé. Az eddigi vizsgálatok nekrózist, járulékos gyökérképzést és gyökértumor-képződést mutattak ki.
Járulékos gyökérképződést idéz elő a cukorrépa rizománia betegsége, amit a répa nekrotikus sárgaerűség vírus
(beet necrotic yellow vein benyvirus) idéz elő (49B ábra).
A biotesztek virológiai alkalmazása
110 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vírusfertőzés következtében keletkező rendkívül változatos tünetek sora szükségessé teszi azok szimbolikus
jelekkel történő írását. Erre vonatkozóan nemzetközileg is egységes normák azonban nem állnak rendelkezésre.
A továbbiakban néhány tünet angol és magyar nyelvű rövidítését ismertetjük:
B: browning (barnulás)
Bli: blistering (hólyagosodás)
Cb: colour breaking (színtörés)
Ch: chlorosis (klorózis)
Chl: chlorotic lesions (klorotikus léziók)
D: plant death (a növény elhalása)
E: etched patterns (tölgyfalevél-mintázat)
Fle: fern leaf (páfránylevelűség)
Gr: growth reduction (növekedésgátlás)
HR: hypersensitive local necrotic lesions (lokális hiperszenzitív reakció)
HRS: hypersensitive systemic symptoms (szisztemikus hiperszenzitív reakció)
La: latent or symptomless (tünetmentes)
Ldef: leaf deformation (levéltorzulás)
Led: leaf drop (levéllehullás)
Lo: local (lokális)
M: mosaic (mozaik)
Mo: mottling (foltosodás)
N: necrosis (nekrózis)
Nl: necrotic lesions (nekrotikus léziók)
NLL: necrotic local lesions (nekrotikus lokális léziók)
NLRi: necrotic local rings (nekrotikus lokális gyűrűk)
P: pattern (mintázottság)
S: systemic (szisztemikus)
Sledef: systemic leaf deformation (szisztemikus levéldeformáció)
SMo: systemic mosaic symptoms (szisztemikus mozaiktünetek)
Sp: spots (foltok)
Tn: top necrosis (csúcsnekrózis)
Vb: vein banding (érszalagosodás)
Vc: vein clearing (érkivilágosodás)
Vn: vein necrosis (érnekrózis)
A biotesztek virológiai alkalmazása
111 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Vnt: vein netting (érhálósodás)
Ysp: yellow spots (sárga foltok)
Megjegyzés: A szimptomatológia a tüneteket általában tört alakban írja le, ahol a számlálóban a lokális tünetek,
a nevezőben a szisztemikus tünetek rövidítései találhatók. Például: Nl/Ldef (lokális nekrotikus
léziók/szisztemikus levéldeformáció).
Mikroszimptómák (anatómiai elváltozások)
A vírusfertőzés hatására a növényekben megjelenő belső elváltozások a sejtek, szövetek belsejében figyelhetők
meg (Horváth, 1972). Ilyenek pl. a magállomány gyors növekedése, a kloroplasztiszok degenerálódása,
intracelluláris zárványok kialakulása, citoplazmatikus zárványok, a rostacsövek nekrózisa, floem hipertrófia,
kromoszóma-abnormalitás (törések) (Esau, 1967; Schmidt, 1980). A mikroszimptómákat A vírusfertőzött
növényi sejtek finomszerkezete, illetve a Fénymikroszkópos festéses módszerek c. fejezetek ismertetik.
3. A vírusfertőzés mértékének meghatározása
A vírusfertőzés mértékének megállapítására korábban a félleveles lokálislézió-számlálás és a latin négyzet
módszerét alkalmazták. Erre ma már az ELISA-féle szerológiai módszer a megfelelőbb.
Lokálislézió-számlálás féllevél módszerrel
a. A kiválasztott vírust, pl. a dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) tartalmazó szövetnedvet a
megfelelő töménységűre hígítjuk (pl. 10–2).
b. Tíz darab, 8–10 leveles Nicotiana glutinosa 5 levelének a jobb, 5 levelének pedig a bal felét inokuláljuk a
vírussal. A lokális léziók a kezelt leveleken jól megszámolhatók.
c. Sztereomikroszkópba szerelt okulár mikrométerrel a lokális léziók pontos területe (cm2) megmérhető.
Megjegyzés: Kellő számú ismétlés estén a módszer alkalmas különféle kezelések (hormonok, vírusgátló
anyagok stb.) közvetlen fertőzésfogékonyságot befolyásoló hatásának statisztikai elemzésére is.
Lokálislézió-számlálás latin négyzet módszerrel
A tesztnövényeken keletkezett lokális léziók számának összehasonlítására különböző levélméret esetén a latin
négyzet módszer alkalmazható. A kísérlet beállítását, 4 különböző vírusszuszpenziót (A, B, C, D) és 4 db
tesztnövényt használva (I–IV), a 12. táblázat mutatja.
12. táblázat - Lokálislézió-számlálás latin négyzet módszerrel
A kezelt
levelek
sorszáma
A tesztnövények sorszáma
I II III IV
1 A D B C
2 B A C D
3 C C A B
4 D B D A
Megjegyzés: Pontosabb eredmény kapható, ha a latin négyzet és a féllevél módszert együtt használjuk (13.
táblázat). A vírusfertőzés mértékét az előző módszerhez hasonlóan a lokális léziók számával, a nekrózis
mértékét a léziók területének kiszámításával állapíthatjuk meg.
A biotesztek virológiai alkalmazása
112 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
13. táblázat - Lokálislézió-számlálás féllevél és latin négyzet módszerrel
A kezelt
levelek
sorszáma
A tesztnövények sorszáma
I II III
jobb bal jobb bal jobb bal
1 A B C B C A
2 B A B A B C
3 C C A C A B
4. Fizikai tulajdonságok vizsgálati módszerei
A fizikai tulajdonságokat vizsgáló módszerek eredményei tájékozódást nyújtanak a vírusok fizikai
tulajdonságairól (hőinaktiválási pont, hígíthatósági határ, in vitro eltarthatóság, eltarthatóság kiszárítással
szobahőmérsékleten, ill. alacsony hőmérséketen) (Horváth, 1972). A fizikai tulajdonságok meghatározásával
kapcsolatos módszereket Horváth (1966a,b), Noordam (1973), Schmelzer et al. (1980) és Hill (1984) alapján az
alábbiakban foglaljuk össze. Dijkstra és De Jager (1998) e könyv kéziratának leadása után megjelent
vírusmódszertani könyvükben a fizikai tulajdonságok meghatározását részletesen tárgyalják.
Hőinaktiválási pont meghatározása
A vírusok hőmérséklettől függő tulajdonsága a vírusra jellemző érték. A hőinaktiválási pont az a legalacsonyabb
hőmérséklet, amelyen a hígítatlan présnedv tízperces kezelés után már elveszti fertőzőképességét.
a. A hígítatlan dohány mozaik vírust (tobacco mosaic tobamovirus) tartalmazó szövetnedvből 2–2 ml-t 6 db
vékonyfalú kémcsőbe pipettázunk, s a kémcsöveket parafa- vagy vattadugóval lezárjuk.
b. Egy-egy kémcsövet 10–10 percre 95, 90, 80, 70 és 60 °C-os vízfürdőbe állítunk, és hagyunk egy kezeletlen
kontrollt. A kezelés után a kapott növénynedvet tesztnövényekre (pl. Nicotiana glutinosa) visszük át. Az
inokulációt követően a keletkezett tünetek alapján megállapítható a vírus hőinaktiválási pontja, amely a
dohány mozaik vírus esetében 90 és 95 °C között van.
Hígíthatósági határ meghatározása
A vírustartalmú növényi nedv fokozatos hígításával fokozatosan csökken a fertőzőképesség is. A hígíthatóság
határa az a legnagyobb hígíthatósági érték, amelynél még kimutatható a fertőzőképesség.
a. A kísérlethez 8 db kémcső szükséges, amelyekből hétbe 9–9 ml vizet pipettázunk. A nyolcadik kémcsőbe 2
ml hígítatlan vírustartalmú szövetnedvet teszünk.
b. A hígítatlan szövetnedvből kiveszünk 1ml-t, ezt belerakjuk a következő kémcsőbe, majd ebből is kiveszünk
1ml-t és a következő kémcsőbe pipettázzuk. Ezt a műveletet addig folytatjuk, amíg az utolsó kémcsőhöz nem
érünk. Így 10–1, 10–2, 10–3, 10–4, 10–5, 10–6, 10–7 töménységű hígítási sorozatot kapunk.
c. Az így kapott oldatokkal lokális tesztnövényeket (Nicotiana glutinosa) inokulálunk, s a kifejlődött léziók
alapján megállapítható a vírus szövetnedvének hígítási végpontja. A dohány mozaik vírus esetében ez 10–6 és
10–7 között van.
In vitro eltarthatóság meghatározása
A fertőzött növényi szövetnedv szobahőmérsékleten tartva fokozatosan elveszti fertőzőképességét. A virionok
stabilitását az in vitro eltarthatóság határával órákban, napokban vagy hetekben fejezzük ki.
A biotesztek virológiai alkalmazása
113 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
a. Uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) fertőződött Nicotiana tabacum cv. Samsun
leveleiből 25 g-ot dörzsmozsárban homogenálunk, majd a kapott növénynedvből 2–2 ml-t 7 db kémcsőbe
töltünk.
b. A kémcsöveket gumi- vagy vattadugóval lezárjuk, és szobahőmérsékleten, kb. 20 °C-on 0, 4, 8, 24, 48, 72 és
96 órát hagyjuk. Egyes vírusok esetében az in vitro eltarthatóság hosszabb is lehet.
c. A tárolási idő letelte után a kezelt növénynedvekkel tesztnövényeket inokulálunk, majd ellenőrizzük a
fertőzőképesség csökkenését. Az uborka mozaik vírus a 72 órás, szobahőmérsékleten való tárolás után
elveszti fertőzőképességét, tehát in vitro a kevésbé stabil vírusok közé tartozik.
Eltarthatóság kiszárítással szobahőmérsékleten
A vírusok inaktiválódásának vagy in vitro eltarthatóságának egyik, gyakorlati szempontból is lényeges kérdése,
hogy mennyire viselik el a kiszáradás körülményeit.
a. Az uborka mozaik vírussal szisztemikusan fertőződött Nicotiana tabacum cv. Samsun növényeket 20–22 °C-
os szobahőmérsékleten felfüggesztve szárítjuk.
b. Minden 24. órában néhány levelet leveszünk a növényről, dörzsmozsárban homogenáljuk, majd pár csepp
vizet hozzáadva, az oldattal Nicotiana glutinosa növényeket inokulálunk.
c. A kísérletek szerint a vírus 12–50 napi szobahőmérsékleten való tárolás után is megtartja fertőzőképességét.
Egyes vírusok (pl. a dohány mozaik vírus) több évig, évtizedig is megőrzik fertőzőképességüket a száraz
levelekben.
Eltarthatóság kiszárítással alacsony hőmérsékleten (Horváth, 1976; Horváth és Besada, 1980)
a. Az előzőleg vírussal inokulált és megbetegedett növények leveleit a főér kivételével zsilettel vékony csíkokra
vagdossuk és hűtőszekrényben 2 °C és 5 °C között a CaCl2-tól perforált alumíniumlemezzel elválasztva steril
Petri-csészékben és steril szitaszöveten tároljuk.
b. A beszárított vírustartalmú levélszövetből bizonyos idő eltelte után (hetek, hónapok, évek) mintát veszünk és
a mintával azonos mennyiségű foszfát-pufferrel (0,1 M, pH 7,0) szövetpépet készítünk.
c. Az inokulációra lehetőleg lokális léziókkal reagáló tesztnövényeket használunk, s megállapítjuk a vírus
fertőzőképességét, ill. eltarthatóságát.
Megyjegyzés: Az egyes vírusok eltarthatósága (19 vírus 24 izolátum esetében) 10–87 hónap között váltakozhat
(Horváth és Besada, 1980).
5. A vírusok differenciálása tesztnövényekkel
A vírusok differenciálásának szükségessége már akkor felmerült, amikor a virológia még az ún.
szimptomatológiai korszakát élte. A növényvírusok szeparálása kezdetben mégsem tünettani ismeretekre
támaszkodott – amely bizonyára a gazda–vírus kapcsolatok nem kellő ismeretéből fakadt –, hanem kémiai-
fizikai ismeretekből indult ki (Horváth, 1967). A korai növényvirológiai kutatások megállapították, hogy
különböző vírusok, pl. az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és a burgonya X-vírus (potato X
potexvirus) elválasztására a nátrium-permanganát, az ezüst-nitrát, a fenol és a higany-klorid alkalmas. A későbbi
vizsgálatok a különböző vírusok eltérő pH-val és alkohollal szembeni toleranciájának a megállapítására és a
vírus differenciálásban történő felhasználhatóságára vonatkoznak.
A vírusdifferenciálás során ún. virofil növényeket, relatív virofób növényeket és intermedier vírusgazdákat
használunk (Horváth, 1976). A virofil növények, pl. a Chenopodium amaranticolor (50. ábra) vagy a Nicotiana
clevelandii számos vírusra fogékonyak. Ismertek azonban olyan növények is, mint pl. a Crucianella stylosa és a
Ruta graveolens, amelyek viszonylag kevés vírusra fogékonyak. Az intermedier vírusgazdák jelentősége abban
áll, hogy az eredeti donor vírusgazdához viszonyítva kevesebb vírusinhibitort tartalmaznak, és ennélfogva
lehetővé teszik a vírusizolálást olyan virofil gazdában, amelyben egyébként a gazda nagy inhibitortartalma miatt
az izolálás alig, vagy egyáltalán nem lehetséges. Ilyen növények pl. a Cucumis sativus és a Gomphrena globosa.
Újabb besorolások diagnosztizáló, vírust fenntartó, ill. felszaporító, tesztelő, tisztító, szűrő és áthidaló
A biotesztek virológiai alkalmazása
114 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
tesztnövényeket különböztetnek meg. Az ideális tesztnövény gyors és jellegzetes választ ad az inokuláció után,
amely a leveleken keletkezett lokális léziókban nyilvánul meg (Horváth, 1993a, b).
50. ábra - A: Chenopodium amaranticolor a polifág uborka mozaik vírus (cucumber
mosaic cucumovirus) és B: burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) virofil gazdája
[Horváth József szívessége folytán]
A differenciáló tesztnövények azért lényegesek a vírusdiagnosztika szempontjából, mivel egyesek érzékenyek a
vírusokra, mások pedig nem fertőzhetők, ennélfogva tehát alkalmasak arra, hogy segítségükkel elkülönítsük
őket egymástól. Egyesek lokális vagy szisztemikus tünetekkel, mások lokális és szisztemikus tünetekkel
reagálnak a fertőzésre (14. táblázat).
14. táblázat - A dohány mozaik vírus és a paradicsom mozaik vírus szétválasztása
differenciáló tesztnövényekkel (Horváth, 1993a után)
Tesztnövények Vírusok1
TMV ToMV
Nicotiana sylvestris LS2 L
Chenopodium
amaranticolor L LS
Chenopodium quinoa L LS
Lycopersicon esculentum S S
Plantago major L LS
1 TMV = dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); ToMV = paradicsom mozaik vírus (tomato
mosaic tobamovirus).
2 L = lokális tünetek; S = szisztemikus tünetek; LS = lokális és szisztemikus tünetek.
Johnson (1925) és Köhler (1933) szerint a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a burgonya Y-vírus
(potato Y potyvirus) a Datura stramonium növényen elkülöníthető, ugyanis a burgonya X-vírusra fogékony, a
A biotesztek virológiai alkalmazása
115 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
burgonya Y-vírusra pedig extrém rezisztens (immunis). A Chenopodium fajok kiválóan alkalmasak bizonyos
vírusok és vírustörzsek elkülönítésére. Horváth (1969c) megállapította, hogy a burgonya X-vírus a
Chenopodium murale-n lokális léziókat okoz, míg a burgonya Y-vírus nem mutat tüneteket. A Chenopodium
amaranticolor és a Plantago major alkalmas két tobamovirus, a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic
tobamovirus) és a paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus) elkülönítésére (vö.: 14. táblázat). A
Chenopodium quinoa gazdája az arabis mozaik vírusnak (arabis mosaic nepovirus), és alkalmas arra, hogy a
vírus egyes dísznövényeken előforduló törzseit a tünetek alapján szétválassza. A vírus rózsáról származó
izolátuma kicsi, szisztemikus érközötti léziókat okoz a tesztnövényen, míg a tulipánról származó izolátum
lokális nekrotikus tüneteket és csúcsnekrózist okoz (Thomas, 1983). A Nicotiana sylvestris szintén alkalmas
vírusok szétválasztására. A paradicsom mozaik vírus csak lokális tüneteket, a dohány mozaik vírus viszont
lokális és szisztemikus tüneteket mutat a tesztnövényen (14. táblázat). A Physalis minima tesztnövény
segítségével szétválaszthatjuk az uborka mozaik vírust (cucumber mosaic cucumovirus) a bab közönséges
mozaik vírustól (bean common mosaic potyvirus) és a bab sárga mozaik vírustól (bean yellow mosaic
potyvirus), amelyek sok esetben együtt lépnek fel. A uborka mozaik vírus jól látható tüneteket mutat a Physalis
minima növényen, a bab közönséges mozaik vírussal és a bab sárga mozaik vírussal való inokuláció után pedig
tünetmentes marad a tesztnövény. Ma már ismertek olyan gazdanövények, amelyek nemcsak az individuális
vírusfajok, hanem víruscsoportok identifikálására és elkülönítésére is alkalmasak (Horváth, 1993c).
6. A vírusok fenntartása tesztnövényeken
A növényvírusok élő növényen való fenntartásának napjaink virológiai kutatásaiban is nagy jelentősége van.
Olyan gazdanövényekre van szükség, amelyek laboratóriumi körülmények között is könnyen felnevelhetők, jól
inokulálhatók, és bennük az adott vírus megfelelően replikálódik.
A vírusok fenntartása tesztnövényeken a megfelelő gazdanövény kiválasztásával kezdődik. A tesztnövények
magvainak vetése előtt el kell végezni a szükséges magkezelési eljárásokat (koptatás, áztatás, fertőtlenítés, hideg
kezelés). A munka ütemezéséhez fontos tudni, hogy a vetést követően mikor kapunk inokulálható állapotban
levő növényeket (15. táblázat).
15. táblázat - Vírusok fenntartására alkalmas tesztnövények és azok inokulációjának
optimális ideje (Noordam, 1973 után)
Növényfaj A mag vetésétől
eltelt idő általában Fejlettségi állapot
Beta vulgaris 5 hét 5 lomblevél
Brassica pekinensis 3–4 hét 5 lomblevél
Celosia argentea 4 hét 6 lomblevél
Chenopodium
amaranticolor 2 hónap 6 lomblevél
Chenopodium quinoa 2 hónap 6 lomblevél
Cucumis sativus 10 nap szikleveles állapot
Datura stramonium 5–8 hét 1–2 lomblevél
Dianthus barbatus 6–7 hét 3 pár lomblevél
Dianthus caryophyllus 6–7 hét 3 pár lomblevél
Gomphrena globosa 10 hét 2–4 pár lomblevél
A biotesztek virológiai alkalmazása
116 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Lycopersicon esculentum 3–4 hét 2–3 lomblevél
Nicotiana glutinosa 6 hét 3–4 lomblevél
Nicotiana rustica 5 hét 3–4 lomblevél
Nicotiana tabacum cv.
Samsun 5 hét 3–4 lomblevél
Petunia hybrida 5 hét 3–4 lomblevél
Phaseolus vulgaris 10 nap 2 primer lomblevél
A növény fejlettségi stádiuma az inokuláció szempontjából rendkívül fontos. A töknek (Cucurbita pepo) pl. a
sziklevelét, a babnak (Phaseolus vulgaris) az első két lomblevelét inokuláljuk, mert az idősebb levelek nem
fogékonyak a vírusfertőzésre. A Chenopodium amaranticolor kifejlett lomblevelei a legalkalmasabbak e célra.
A tesztnövények fertőzés előtti sötétben tartása általában fokozza azok érzékenységét, s ugyanaz igaz a 36 °C-os
vagy annál magasabb hőmérsékletre is. Több gazdanövény szövetnedve általában inhibitort (gátlóanyagot)
tartalmaz, amely a vírusátvitelt akadályozza vagy meggátolja. Ezért a vírust tartalmazó növényi nedvet 1:10
arányban vízzel kell hígítani és 0,01 M-os foszfát-pufferrel pH 7-re beállítani. Az inokuláció előtt a növényre
karborundumport szórunk, majd a vírust tartalmazó növényi nedvet finoman rádörzsöljük a tesztnövény
levelére. Ezt követően az általános növényápolási munkákat (öntözés, árnyékolás, növényvédelem) kell
elvégezni a következő passzálásig.
Az egyes vírusok fenntartására más és más tesztnövényeket használnak (16. táblázat). Újabban, a számítógépek
használatának általános elterjedésével, előtérbe került a vírusok és víruscsaládok nevének rövidítése mellett a
tesztnövények botanikai nevének (nemzetségnév, fajnév, fajtanév) és családnevének rövidítése, ill. annak
nemzetközileg is elfogadott használata (Horváth, 1993a, b). Pl.: a Nicotiana tabacum cv. Xanthi fajta jelölését
(NIOTA XAN SOL) a következőképpen kell értelmezni: NIO a Nicotiana nemzetség rövidítése, a TA a
tabacum fajnévre utal, a XAN a fajta nevét jelenti, a SOL rövidítés pedig a Solanaceae család nevének
rövidítése (16. táblázat).
16. táblázat - Néhány vírus fenn tarthatósága gazdanövény ékben
Vírus neve Gazdanövény és kódja1
Bab közönséges mozaik vírus
(bean common mosaic potyvirus)
Phaseolus vulgáris (PHSVX LÉG),
Nicotiana clevelandit (NIOCL SOL)
Beléndek mozaik vírus
(henbane mosaic potyvirus)
Chenopodium amaranticolor (CHEGI CHE),
Datura stramonium (DATST SOL),
Nicotiana sylvestris (NIOSI SOL),
Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc
(NIOTAXAN SOL)
Burgonya M-vírus (potato M
carlavirus) Lycopersicon esculentum (LYPES SOL)
Burgonya S-vírus (potato S
carlavirus) Nicotiana clevelandit (NIOCL SOL)
A biotesztek virológiai alkalmazása
117 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Burgonya X- vírus (potato
üpotexvirus) Datura stramonium (DAST SOL),
Gomphrena globosa (GOMGL AMA)
Burgonya Y- vírus (potato Y
potyvirus) Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (NIOTA
XAN SOL)
Dohány gyűrűsfoltosság vírus
(tobacco ringspot nepovirus)
Chenopodium amaranticolor (CHEGI CHE),
Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (NIOTA
XAN SOL)
Dohány mozaik vírus
(tobacco mosaic tobamovirus)
Nicotiana sylvestris (NIOSI SOL),
Nicotiana tabacum cv. Samsun (NIOTA
SAM SOL)
Karfiol mozaik vírus
(cauliflower mosaic caulimovirus)
Brassica campestris (BRSRA CRU)
Lucerna mozaik vírus
(alfalfa mosaic alfamovirus)
Chenopodium quinoa (CHEQU CHE),
Nicotiana benthamiana (NIOBE SOL),
Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (NIOTA
XAN SOL)
Melandrium sárgafoltosság vírus
(Melandrium yellow fleck
bromovirus)
Gomphrena globosa (GOMGL AMA),
Melandrium album (MELAL CÁR)
Paradicsom mozaik vírus
(tomato mosaic tobamovirus)
Nicotiana tabacum cv. Samsun (NIOTA
SAM SOL)
Retek mozaik vírus
(radish mosaic comovirus)
Brassica campestris (BRARA CRU)
Répa mozaik vírus (beet mosaic
potyvirus) Spinacia oleracea (SPQOL CHE)
Rozsnok mozaik vírus
(brome mosaic bromovirus)
Hordeum vulgare (HORVX GRA)
Tarlórépa sárga mozaik vírus
(turnip yellow mosaic tymovirus)
Chenopodium amaranticolor (CHEGI CHE),
Chenopodium quinoa (CHEQU CHE),
Brassica rapa (BRSRA CRU)
Uborka mozaik vírus
(cucumber mosaic cucumovirus)
Nicotiana clevelandit (NIOCL SOL),
Nicotiana megalosiphon (NIOSU SOL)
Zeller mozaik vírus (celery mosaic Ammi május (ANIMAUMB)
A biotesztek virológiai alkalmazása
118 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
potyvirus)
1 Anövények kódja megtalálható Horváth (1993b) dolgozatában.
7. Gazdanövénykörök
Egyes növények általában érzékenyek, mások ellenállók (immunisak) a vírusok fertőzésére. A vírusfertőzésekre
fogékony gazdanövények csaknem minden növénycsaládban megtalálhatók. Horváth (1993a) által a vírus–
gazda kapcsolatok szempontjából fontosnak tartott nemzetségek az alábbiak: Amaranthus, Capsicum,
Chenopodium, Cucumis, Cucurbita, Gomphrena, Lycium, Nicotiana, Phaseolus, Pisum, Physalis, Solanum,
Tetragonia, Vigna. A biotesztek során a legszélesebb körben alkalmazott gazdanövények a felhasználás
gyakoriságának sorrendjében a következők: Chenopodium quinoa, Chenopodium amaranticolor, Nicotiana
clevelandii, Phaseolus vulgaris, Nicotiana glutinosa, Gomphrena globosa, Cucumis sativus, Datura
stramonium, Pisum sativum, Nicotiana tabacum, Chenopodium murale, Tetragonia expansa, Nicotiana tabacum
cv. White Burley, Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc, Vigna sinensis.
A könyv korlátozott terjedelme miatt nem tudunk kitérni valamennyi gazdakör jellemzésére, így csak a
tesztnövényekkel végzett virológiai vizsgálatok során példaként a leggyakrabban használt Chenopodium fajokat
részletezzük. A Chenopodium fajok és a vírusok között 123 gazda–vírus kapcsolatot (99 lokális, valamint 24
lokális és szisztemikus) határoztak meg (Horváth, 1986). A Chenopodium fajok közül leggyakrabban az
alábbiakat használják: C. album, C. amaranticolor, C. ambrosioides, C. capitatum, C. foetidum, C. foliosum, C.
hybrida, C. murale, C. quinoa. Edwardson és Christie (1991) szerint a Potyvirus nemzetségből 141 vírus
kapcsolódik a Chenopodiaceae családhoz, amelyből 68 vírus patogén a C. amaranticolor, ill. C. quinoa
növényekre. A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) egyike azoknak a fűféléken előforduló
vírusoknak, amely lokális léziókat idéz elő a C. amaranticolor, a C. quinoa és a C. album növényeken.
Ugyancsak e három növény a gazdája a lucerna mozaik vírusnak (alfalfa mosaic alfamovirus) is. Vannak
természetesen olyan vírusok is, amelyek nem fertőzik meg a Chenopodium fajokat, ilyen pl. a lucerna látens
vírus (alfalfa latent carlavirus). A Chenopodium quinoa és a C. amaranticolor kevesebb inhibitort tartalmaznak,
ezért igen jelentős vírusgazdák. Érzékeny indikátorai a fás szárú növények vírusainak, alacsonyabb
víruskoncentráció esetén is alkalmasak a vírusok kimutatására. A Chenopodium quinoa a fonál alakú vírusok, a
C. amaranticolor a poliéder alakú vírusok meghatározó tesztnövényei. Mindkét növény jól használható a
rutinteszteléseknél és a dísznövényvírusok diagnosztizálásánál. A Chenopodium murale és a C. album fontos
gazdanövénye a paradicsom bronzfoltosság vírusnak (tomato spotted wilt tospovirus). Thomas (1983) 47
dísznövényvírust tesztelt, amelyek közül 19-nek volt a Chenopodium quinoa a gazdája és 12-nek a C.
amaranticolor. Megemlítjük, hogy az utóbbi években a Nicotiana benthamiana a legjelentősebb
vírusdiagnosztikai tesztnövényként vált ismertté. Horváth (1993d) adatai szerint a nevezett növény 24
víruscsoportba (-nemzetségbe) tartozó 203 vírussal szemben fogékony.
8. A fás szárú növények virológiai ellenőrzése
A fás szárú növények (szőlő, gyümölcs) gazdasági jelentősége igen nagy. A vírus és fitoplazma eredetű
betegségek a gyümölcstermesztést és szőlőtermesztést súlyosan veszélyeztetik (Németh, 1979, 1986; Lehoczky,
1992). Az ellenük való védekezés egyetlen módja a vírusmentes szaporítóanyag előállítása, ill. használata (Kiss,
1998).
A fás szárú növények virológiai tesztelése és vírusmentesítése eltér a lágy szárú növények vizsgálatától, ezért
ezzel külön fejezetben foglalkozunk (Lehoczky és Beczner, 1980; Lehoczky, 1981; Németh és Kölber, 1998;
Lázár, 1998; Voigt és Kállay, 1998).
8.1. A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere
A vírusok és más oltással átvihető fertőző kórokozók (viroidok, fitoplazmák) a szőlő termesztett fajtáinak
jelentős mértékű – az egyes vírusoktól és a fertőzöttség mértékétől függően évenként 10–80%-os – leromlását
okozzák (Lehoczky, 1992; Lázár, 1998). A termesztés számos területén jelentkezhetnek a vírusbetegségek
gazdasági következményei, amelyek a fokozatos tőkeleromlásban és -elhalásban, a hozam csökkenésében, a
minőség gyengülésében, a tőkék produktív időszakának megrövidülésében, az oltványkészítés
eredményességének csökkenésében, a szaporítóanyag gyökeresedőképességének romlásában, a beteg tőkék
környezeti tényezőkkel szembeni ellenálló képességének csökkenésében nyilvánulnak meg.
A biotesztek virológiai alkalmazása
119 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A szőlőtermesztő államok, így hazánk is, kidolgozta a szőlő növény-egészségügyi vizsgálatának programját,
amely tartalmazza a szőlő virológiai szűrését (ellenőrzését) is (51. ábra).
51. ábra - A szőlő virológiai ellenőrzésének rendszere [Lázár János szívessége folytán]
8.1.1. A szőlő üvegházi tesztelése
A tesztelésre kijelölt tőkék előszűrését mechanikai vírusátvitellel lágy szárú tesztnövényeken kell elvégezni
(Lázár, 1996). Ez a tevékenység egész évben végezhető, amennyiben a nyári időszakban az üvegház
hőmérséklete nem haladja meg a 25 °C-ot. A téli időszakban vizsgálatba vont fajta, ill. klón ellenőrzése hajtatott
dugványainak leveleiből történik. Az április–május hónapban (virágzásig) a szabadban fakadó tőkék
hajtáscsúcsi (vitorla alatti 3–4. levél), ill. később a hónalj levelei a legalkalmasabbak a vizsgálatokra.
A tesztelés menete
a. A levélminta felületi fertőtlenítése 2%-os NaOH-val és folyóvizes öblítéssel.
b. A minta homogenizálása grammonként 3 ml 0,067 M-os foszfát-puffer (pH 7,2) és 3%-os polietilén-glikol
(PEG 6000) hozzáadásával.
A biotesztek virológiai alkalmazása
120 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
c. A lágy szárú tesztnövények (Chenopodium amaranticolor, C. quinoa, Cucumis sativus cv. Delicatess,
Gomphrena globosa, Nicotiana clevelandii, N. glutinosa, N. tabacum cv. Samsun, Phaseolus vulgaris cv.
Beautiful) inokulálása, majd leöblítése vízzel.
d. A tünetek folyamatos értékelése.
Megjegyzés: a fás szárú növényekben előforduló inhibítorok (gátlóanyagok, amelyek megnehezítik vagy
megakadályozzák a vírusátvitelt) semlegesítésére ajánlott a koffein (1–3% w/v), a tojásalbumin (0,3–1,0% w/v),
a nikotin (1–2% w/v) és a 0,01 M, foszfát-puffer pH 7,0 (Dijkstra és De Jager, 1998).
8.1.2. A szőlő szabadföldi tesztelése
A szőlő fás szárú növényeken történő tesztelése lehetőséget ad a fertőzöttség vagy a vírusmentesség
megállapítására. E tesztelési módszer alapja az egyes szőlőfajták (indikátorok) fokozott érzékenysége, ami jól
látható elváltozásokban (levéldeformáció, mozaik, törpe növés) nyilvánul meg. A szőlőfajták virológiai
ellenőrzéséhez a tesztelésre kerülő fajták tőkéit a törzsültetvények vizuális szelekciójával jelölik ki. A szelekciót
két alkalommal, június elején-közepén (virágzás) és szeptember közepén-végén (érés) kell végezni.
A szőlő vírusbetegségeinek kimutatásához 9 indikátorfajtát (17. táblázat) használnak 5 ismétlésben. A
vizsgálatba vont tőke vesszőiből az összehasonlító ellenőrzéshez 5 db kontrollnövény beállítása is szükséges.
17. táblázat - A magyar vírusellenőrzési rendszerben használt fás szárú indikátorokkal
kimutatható szőlőpatogén vírusok1
Fás szárú indikátorok Vírusok
Siegfriedrebe (FS 4 201-39) Szőlő fertőző leromlás vírus
Arabis mozaik vírus
Paradicsom fekete gyűrűs
Szőlő bulgáriai látens vírus
Vitis rupestris cv. St. George Paradicsom fekete gyűrűs vírus
Szőlő fertőző leromlás vírus
Szőlő foltosság vírus
Arabis mozaik vírus
Szőlő faszöveti barázdáltság
vírus
Vitis vinifera cv. Pinot noir
(és egyéb vörös fajták)
Szőlő levélsodródás vírus
Szőlő króm mozaik vírus
Arabis mozaik vírus
Paradicsom fekete gyűrűs vírus
Lucerna mozaik vírus
Vitis vinifera cv. Chardonnay Szőlő fertőző leromlás vírus
Lucerna mozaik vírus
Paradicsom fekete gyűrűs vírus
A biotesztek virológiai alkalmazása
121 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Vitis riparia cv. Glorie de
Monpellier Szőlő érmenti mozaik vírus
Szőlő bulgáriai látens vírus
Vitis vinifera cv. Jubileum 75 Szőlő króm mozaik vírus
Szőlő vonalas mintázottság
vírus
Kober 5BB (V. berlandieri x V.
riparia) Szőlő faszöveti barázdáltság
vírus
LN 33 (Couderc 1613 x V.
berlandieri) Szőlő parakérgűség vírus
Szőlő enációs vírus
Szőlő faszöveti barázdáltság
vírus
110 R (V. rupestris x V.
berlandieri) Szőlő érnekrózis víru
1 A szőlővírusokkal kapcsolatos hazai információk Martelli és Lehoczky (1968), Lehoczky és Beczner (1980),
Beczner és Lehoczky (1981), Lehoczky et al. (1984), Lehoczky és Burgyán (1986) és Lehoczky (1992)
munkáiban találhatók meg. Köszönettel tartozom néhány adat rendelkezésre bocsátásáért dr. Kobza Sándornak
(Budapest).
A tesztelés menete
a. A tesztelésre kerülő tőkék és az indikátorfajták beérett vesszőinek begyűjtése.
b. A vesszők előkészítése 24 órás, vízben történő áztatással, majd 5 órán keresztül 0,5%-os Solvochin Extra-
kezeléssel.
c. Téli tárolás hűtőtárolóban, 1–2 °C-on.
d. Tavasszal az indikátorfajták vesszőinek előkészítése: 2 rügyes dugványok vágása, alsó rügy „kivakítása”. Az
alsó rügy alatt 0,5–1 cm-rel kell „megtalpalni” a vesszőt, a felső rügy felett 2–3 cm-es csonkot kell hagyni.
e. A kétrügyes (indikátor) dugványvessző felső, ép rügye alatt 0,5–1 cm-re egy 12–15 mm hosszú metszlapot
kell készíteni.
f. A vizsgálandó tőke vesszőjéről az indikátorfajtával megegyező pozícióból történő, az arról leválasztott
metszlappal azonos méretű szövetpajzs készítése.
g. A szövetpajzs rugalmas fóliával történő rögzítése az indikátor dugványvesszőhöz.
h. A dugványok gyökereztető közegbe (fóliakonténerbe) helyezése.
i. A dugványok hajtatása üvegházban, növényasztalon, talpmeleg biztosításával.
j. A 4–6 lombleveles, begyökeresedett dugványok kiültetése szabadföldi iskolába.
k. A kísérlet értékelése két éven keresztül, évente két alkalommal.
8.2. A gyümölcsfajok virológiai ellenőrzésének rendszere
A vírusmentes szaporítóanyag az alapja a versenyképes, jó minőségű termés előállításának. A fejlett
gyümölcstermesztő országokban – köztük hazánkban is – már több évtizede kialakítottak olyan központosított,
zárt vírusmentesítési rendszereket, ahol teljes koordinációban történik a fajtaminősítés, a törzskönyvezés, a
A biotesztek virológiai alkalmazása
122 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
növény-egészségügyi ellenőrzés, amelyekhez szervesen kapcsolódik az előállított vírusmentes faiskolai termék
igazolvánnyal való ellátása.
8.2.1. A gyümölcsfajok üvegházi, lágy szárú biológiai tesztelése
A vizsgálatokhoz lágy szárú indikátornövényeket használnak. A vírusátvitel során a mechanikai módszert
alkalmazzák.
Az almatermésűek lágy szárú biológiai tesztelése (Bach és Szőnyegi, 1996)
a. A tesztelés során használt lágy szárú tesztnövények a következők: Cucumis sativus (mozaik és NEPO
vírusok), Chenopodium quinoa [alma klorotikus levélfoltosság vírus (apple chlorotic leaf spot trichovirus);
alma törzsbarázdáltság vírus (apple stem grooving capillovirus) és NEPO vírusok] és a Celosia argentea
(alma klorotikus levélfoltosság vírus).
b. A vizsgálatokat március–április hónapokban kell elvégezni.
c. A tesztelésnél használt növényi rész a virágszirom, amelyhez 1 : 5 arányban stabilizáló puffer szükséges. Az
almástermésűek esetében kétféle puffert használnak: 0,01 M Tris/HCl-puffer (pH 8,5) + 0,005 M MgSO4 +
1% koffein; 0,01 M Tris/HCl-puffer (pH 8,5) + 0,005 M MgSO4 + 0,1% Na2SO3 + 0,1% aszkorbinsav + 1%
ni-kotin.
d. A virágszirmokat porcelánmozsárban, a stabilizáló puffer jelenlétében kell szétdörzsölni, és a kapott
szövetnedvvel inokulálni a tesztnövények leveleit.
e. A Cucumis sativus esetében 20, a Chenopodium quinoa és a Celosia argentea esetében 6-6 ismétlés
beállítása szükséges.
f. A tesztnövényeket a vizsgálat időtartamára (kb. 20 napra) 20–22 °C-os, vektormentes üvegházban kell
elhelyezni.
A csonthéjasok lágy szárú biológiai tesztelése
a. A tesztelés során használt lágy szárú tesztnövények a következők: Cucumis sativus [Prunus nekrotikus
gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus); szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) és a
NEPO vírusok), Chenopodium quinoa (Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus, alma klorotikus
levélfoltosság vírus és a NEPO vírusok), és Celosia argentea (alma klorotikus levélfoltosság vírus)].
b. A vizsgálatokat február végétől április végéig kell elvégezni.
c. A tesztelés során használt növényi részhez (meghajtatott rügyek levelei) 1: 3 arányban stabilizáló puffert kell
adni. A csonthéjasok esetében használt puffer a következő: 1/5 M foszfát-puffer (pH 7,5) és 0,005 M DIECA
+ 0,001 M N,N-difeniltiokarbamid + 0,03 M koffein 1:1:1 arányban.
d. A meghajtatott rügyek leveleit porcelánmozsárban, a stabilizáló puffer jelenlétében szét kell dörzsölni és a
kapott szövetnedvvel inokulálni a tesztnövények leveleit.
e. A Cucumis sativus esetében 20, a Chenopodium quinoa és a Celosia argentea esetében 6–6 ismétlés
beállítása szükséges.
f. A tesztnövényeket a vizsgálat időtartamára (kb. 20 napra) 20–22 °C-os vektormentes növényházba kell
elhelyezni.
8.2.2. A gyümölcsfajok üvegházi, fás szárú tesztelése
Az oltás nyugalmi állapotban lévő, cserepes és jól meggyökeresedett alanyokra történik. A vírusátvitel történhet
kettős oltással, amely akkor használatos, ha az alany, a vizsgált fa és az indikátor azonos fajhoz tartoznak. A
kéregátültetést akkor kell használni, ha az alany és a vizsgált fa nem azonos fajhoz tartozik. A gyökéroltást a
Golden Delicious indikátoron, az alma seprűsödés fitoplazma (apple proliferation phytoplasma) kimutatására
használják. E módszer kivitelezése a következő: a vizsgálandó növényekből márciusban szedett
gyökérdarabokat rá kell oltani almamagoncgyökerekre kézben oltással, nyelves párosítással, majd ezt követően
az alanyokat be kell oltani a Golden Delicious indikátorral.
A biotesztek virológiai alkalmazása
123 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az üvegházi fás szárú biológiai tesztelés során használt indikátorokat, a kimutatható kórokozókat és a kísérlet
körülményeit a 18. táblázat tartalmazza.
18. táblázat - Gyümölcsfajok üvegházi fás szárú biológiai tesztelése (Bach és Szőnyegi,
1996 után)1
Indikátornövény Kimutatható kórokozók Ismétlés Hőmérsékle
t °C Időtartam
Alma
Malus pumila
R 12740-7A
Spy 227
Alma klorotikus levélfoltosság vírus
(apple chlorotic leaf spot trichovirus)
Alma 227 epinasztia és pusztulás vírus
(apple spy 227 epinasty and decline
virus)
Alma törzsgöndörödés vírus
(apple stem pitting virus)
3
3
18–20
22–26
4 hét
3 hónap
Virginia Crab Alma törzsgöndörödés vírus
(apple stem pitting virus)
Alma törzsbarázdáltság vírus
(apple stem grooving capillovirus)
3 22–26 4 hét
Golden Delicious
Pyronia veitchii
Alma seprűsödés fitoplazma
(apple proliferation phytoplasma)
Alma fapuhulás fitoplazma
(apple rubbery wood phytoplasma)
Alma klorotikus levélfoltosság vírus
(apple chlorotic leaf spot capillovirus)
4
3
18–20
22
4 hónap
10 hét
Körte
Pyronia veitchii
Pyrus calleriana
Körte érsárgulás vírus
(pear vein yellows virus)
Alma 227 epinasztia és fapusztulás
vírus
(apple 227 spy epinasty and decline
virus)
Alma fapuhulás fitoplazma
(apple rubbery wood phytoplasma)
Körte érsárgulás vírus
(pear vein yellows virus)
3
3
23
22
10 hét
4 hét
A biotesztek virológiai alkalmazása
124 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Cseresznye és
meggy Prunus
persica
GF 305, vagy
Elberta magonc
Prunus tomentosa
IR 473/1, vagy
IR 474/1
Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság
vírus
(Prunus necrotic ringspot ilarvirus)
Szilva törpülés vírus
(prune dwarf ilarvirus)
Földieper látens gyűrűsfoltosság vírus
(strawberry latent ringspot nepovirus)
Alma szárgöndörödés vírus
(apple stem pitting virus)
Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság
vírus
(Prunus necrotic ringspot ilarvirus)
Szilva törpülés vírus
(prune dwarf ilarvirus)
Alma klorotikus levélfoltosság vírus
(apple chlorotic leaf spot trichovirus)
5
3
20
22
3 hónap
3 hónap
Szilva, kajszi és
őszibarack
Prunus persica
GF 305 vagy
Elberta
Prunus tomentosa
IR 473/1, vagy
IR 474/1
Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság
vírus
(Prunus necrotic ringspot ilarvirus)
Szilva törpülés vírus
(prune dwarf ilarvirus)
Alma klorotikus levélfoltosság vírus
(apple chlorotic leaf spot trichovirus)
Földieper látens gyűrűsfoltosság vírus
(strawberry latent ringspot nepovirus)
Alma szárgöndörödés vírus
(apple stem pitting virus)
Szilva himlő vírus (plum pox
potyvirus)
Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság
vírus
(Prunus necrotic ringspot ilarvirus)
Szilva törpülés vírus
(prune dwarf ilarvirus)
5
3
20
22
3 hónap
3 hónap
A biotesztek virológiai alkalmazása
125 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Alma klorotikus levélfoltosság vírus
(apple chlorotic leaf spot trichovirus)
1 Köszönettel tartozom dr. V. Németh Máriának (Budapest) kritikai észrevételeiért.
8.2.3. A gyümölcsfajok szabadföldi, fás szárú tesztelése
A gyümölcsfák virológiai tesztelésénél alkalmazott átviteli módszer megválasztását befolyásolja az
indikátornövény típusa, az indikátor és az alany faja, a kimutatandó vírus és az, hogy a kórokozó a fa melyik
részében helyezkedik el, valamint a környezeti körülmények.
Átviteli módszerek
a. Egyszerű szemzés abban az esetben alkalmazható, ha az indikátorként használt alany és a vizsgálandó fa
azonos fajhoz tartoznak, vagy legalábbis szemzésnél kompatibilisek (pl. GF 305 – Myrobalan). A
Shirofugen-tesztnél inkompatibilis partnerek esetében is használható az egyszerű szemzés, mert a
vírusátvitelhez elegendő a Prunus serrulata var. Shirofugen-indikátor és a vizsgálandó fáról származó szem
3–4 napos öszszetapadása.
b. Kettős szemzést akkor alkalmazunk, ha az indikátor valamely nemes faj vagy vad faj. Ebben az esetben
egymás fölé kell szemezni a vizsgált fáról és az indikátorról származó szemeket, majd a következő évben a
kihajtás után a vizsgálandó fáról származó szemből kihajtó hajtást (az alsót) vissza kell csípni.
c. A kettős oltás ugyanazon az elven alapszik, mint a kettős szemzés. Az indikátort kézben kell oltani a
megvizsgálandó fa oltóvessző darabjára, majd ez a kettős kombináció kerül egy vírusmentes alanyra. Ez a
módszer szabadföldön csak módszertani kísérleteknél használatos, elterjedtebb az üvegházi fás szárú
teszteléseknél.
d. Kéregátültetés akkor használandó, ha az alany és a vizsgált növény különböző fajhoz tartoznak. Legkevesebb
3-4 nyelv alakú, szem nélküli kéregpajzsot kell készíteni, és azt az alanyon megfelelően bevágott, lehetőleg
spirálisan elhelyezett bemetszésekbe kell helyezni. Ha nem az alany az indikátor, akkor a kéregpajzsocskák
fölé kell szemezni az indikátort.
e. Indikátorkombinációk alkalmazása esetén a fa teszteléséhez szükséges növényszámot csökkentik. E módszer
használata esetén a kettős szemzéssel kapott egyéves indikátorsuhángokra augusztusban 60–70 cm
magasságban újabb indikátorszem kerül.
Szabadföldi gyorstesztek (Shirofugen-teszt, GF 305-teszt, GF 31-teszt)
Ezek a módszerek a csonthéjas gyümölcsfajok gazdaságilag legsúlyosabb vírusbetegségeinek kimutatására
alkalmasak, és aránylag rövidebb időt igénybevevő, nagy tömegben végezhető vizsgálatok.
Shirofugen-teszt
A Prunus nekrotikus gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) és a szilva törpülés vírus (Prune
dwarf ilarvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 6 hét. A terület kiválasztásánál izolációs
távolságra nincs szükség, mert a Shirofugen-növények vektorokkal nem fertőződnek, a fák nem virágoznak,
ezért pollenfertőzés sem lehetséges. A lúgos kémhatású talajok nem felelnek meg a neveléshez.
Az alanyok közül a Mazzard F 12/1 a legmegfelelőbb. A növények térállása lehetőleg 1,5 × 1 m legyen. Az
alanyok szemzése júliusban–augusztusban történik, a gyökérnyakba. Az egyéves suháng korig a növények
faiskolai nevelése a szokásos körülmények között történik. Az 1 éves Shirofugen-suhángot tavasszal 80 cm
magasságban vissza kell vágni, majd a legfelső 3–4 rügy kivételével a törzset fel kell tisztítani. A vizsgálandó
fákról 5–5 szem kerül egymás fölé 2–3 cm távolságra a lelevelezett hajtásokra. Egy hajtás 1–3 fa vizsgálatára
elegendő. A szemzés ideje július vége, augusztus eleje. A kiértékelést a szemzés után 6 héttel kell elvégezni, a
szem körüli mézgásodás, majd a szemzés felvágása után a szem körüli szövetnekrózis alapján (Németh, 1979).
GF 305-teszt
A biotesztek virológiai alkalmazása
126 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus), a szilva törpülés vírus (prune dwarf ilarvirus) és a Prunus nekrotikus
gyűrűsfoltosság vírus (Prunus necrotic ringspot ilarvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 1 év. A
terület kiválasztásánál fontos az 500 m-es izolációs távolság betartása (a szilva himlő vírus fertőzéstől való
védelem érdekében). A talaj nematódamentessége is fontos. A telepítéshez vírusmentes mag vagy magoncalany
szükséges. Kívánatos térállás: 0,8 × 0,5 m. A faiskolai nevelést a szokásos módon végzik. A GF 305
magoncokra az átvitel augusztus hónapban egyszerű szemzéssel vagy kéregátültetéssel történik. Egy fa
vizsgálatához 5 növényt kell felhasználni. A tüneteket az alanyon fejlődött hajtások mutatják, amelyek
kiértékelését 15–20 cm-es és 30–40 cm-es hajtáshosszúságnál kell elvégezni.
GF 31-teszt
A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) kimutatására alkalmas. A tesztelés időtartama 1 év. A terület
kiválasztásánál 500 m-es izolációs távolság betartása fontos (a szilva himlő vírus fertőzéstől való védelem
érdekében). A talaj nematódamentessége is fontos. A telepítés fás dugványból előállított vírusmentes GF 31
alanyokkal, 0,8 × 0,5 m-es térállásban történik. A faiskolai nevelést a szokásos módon végzik. A magoncokra az
átvitel egyszerű szemzéssel, augusztus hónapban történik. A beszemezett növényeket a következő év tavaszán a
szemzés felett 15–20 cm-re vissza kell vágni. Kihajtás után a szemzés alatti részt le kell „vadalni”, a szemzést
vissza kell csípni, a szemzés felett két, ellenkező oldalon elhelyezkedő hajtást meg kell hagyni, a többi hajtást
pedig el kell távolítani. Augusztus közepén a meghagyott két hajtást le kell levelezni. A bonitálás augusztus
végén, szeptember elején történik addig, amíg a hajtások kérge még zöld színű. Vírusfertőzés esetén a hajtások
alsó részén, a kérgen rozsdabarna parásodás, repedezettség látható.
Szabadföldi főteszt
Jelenlegi ismereteink szerint ez a gyümölcstermő növények legmegbízhatóbb biotesztelési módszere. A
központi törzsültetvények kontrollvizsgálatainál alkalmazzák, mert idő-, munka- és területigényes. A tesztelés
időtartama, a telepítés és szemzés évét is beleszámítva, 4 év. A bonitálások az almástermésűeknél júniustól
szeptember közepéig tartanak. A csonthéjas indikátornövényeknél, a tünetek értékelése május eleje és június
vége között 3 alkalommal történik.
9. Szántóföldi növények virológiai ellenőrzése
A szántóföldi növények vírusfertőzöttsége az utóbbi években jelentősen megnövekedett. Ennek következtében
az egyes növényeken fellépő mennyiségi és minőségi veszteségek igen jelentősekké váltak (Pennazio et al.,
1996). Ez indokolja azt, hogy a fás szárú növényeken kívül a szántóföldi növények vírusmentesítése is képezze
a növényvédelem szerves részét. Ezt támasztják alá azok a szántóföldi növényfajták állami elismerését,
fenntartását, vetőmag-előállítását és -forgalmazását, virológiai ellenőrzését és vírusmentességi igazolási
rendszerét szabályozó rendeletek [FM 88/1997. (XI. 28.)], a növényvédelemről szóló 1988. évi 2. törvényerejű
rendelet, valamint ennek végrehajtásáról szóló rendelet [FM, 89/1997. (XI. 28.)], amelyek egyértelműen
megszabják azokat a feladatokat, amelyek az egészséges, vírusmentes növények termesztését segítik elő.
A szántóföldi növények közötti jelentős biológiai és termesztési eltérések miatt az ellenőrzési rendszerek is
kisebb-nagyobb mértékben eltérnek egymástól. Több növény esetében az ellenőrzési rendszerek még nincsenek
kidolgozva, vagy csak részben valósultak meg. Az egyes növényekkel (gabonafélék, burgonya, kukorica,
hüvelyes növények, szálas takarmánynövények) kapcsolatos vírusmentesítési rendszerekről Pocsai (1998)
közleménye adott áttekintő tájékoztatást. Az alábbiakban – e munkát felhasználva – áttekintést adunk a
modellnövényként szereplő burgonyára vonatkozó vírusmentesítési rendszer lényeges szempontjairól.
9.1. A burgonya virológiai ellenőrzésének általános szempontjai
A burgonya azok közé a növények közé tartozik, amelynek affinitása a különböző vírusokkal szemben igen
nagy (Horváth, 1988, 1990, 1995; Horváth és Kazinczi, 1999). A vegetatív szaporítószervekkel és levéltetvekkel
terjedő vírusok elleni védekezés legfontosabb módja az egészséges (vírusmentes) vetőburgonya előállítása és
használata. A burgonya egészségi állapotának fenntartására az alábbi rendszabályokat kell betartani:
a. Burgonya-vetőgumó csak olyan területen szaporítható, amelyen a szaporítást megelőző négy évben
burgonyát nem termeltek.
A biotesztek virológiai alkalmazása
127 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
b. Az elővetemények között dohány (Nicotiana tabacum), paprika (Capsicum annuum), paradicsom
(Lycopersicon esculentum), tojásgyümölcs (Solanum melongena), cukorrépa (Beta vulgaris), kukorica (Zea
mays) és lucerna (Medicago sativa) nem szerepelhet.
c. A szaporítótáblán belül elhelyezett, különböző fajtájú és szaporítási fokozatú, valamint különböző helyekről
(vetőgumó-előállító hely) származó, fémzárolt vetőgumótáblák (parcellák) között 1,5 m izolációs távolságot
kell hagyni.
d. A vetőgumótábla széleitől 200 m távolságon belül Solanaceae családba tartozó növényeket (pl. burgonya,
paradicsom, dohány, paprika) nem lehet termelni.
e. A vetőgumót előállító szaporítótáblában a levéltetűvektorok megjelenését ellenőrizni kell, és veszélyes
populációszám elérése esetén inszekticidekkel szükséges ellenük védekezni.
f. Szártalanításos módszerrel történő vetőgumó-szaporítás esetén – amelyet általában vetőgumó-előhajtatás és
korai ültetés előz meg – a burgonya fejlődését agrotechnikai módszerekkel és megfelelő tápanyag-
utánpótlással elő kell segíteni, hogy a levéltetű-vektorok tömeges rajzásának idejére a szártalanítás
elvégezhető legyen.
9.1.1. A burgonya vírusellenőrzésének rendszere
A burgonya vírusfertőződésének ellenőrzésénél az alábbiakra kell tekintettel lenni:
a. A vetőgumó szaporítótábláinak szimptomatológiai (tünettani) ellenőrzését a tünetek megjelenésekor
(virágzáskor) és a burgonyagumók fiziológiai beérésekor kell elvégezni.
b. A mintavételi terek száma a vetőburgonya-tábla nagyságától függ; 20 ha-ig 4 mintateret, és ezt követően
további 10 ha-onként 2 mintaterületet kell kijelölni.
c. Az egyes mintaterek nagyságát 200 burgonyanövény tenyészterülete adja meg.
d. A vizsgált (ellenőrzött) mintatereken fel kell jegyezni a tüneteket (tünettani csoportonként), és meg kell
határozni a beteg növények előfordulását %-ban. Ezt jegyzőkönyvben rögzíteni kell.
e. A tünettani vizsgálatokat laboratóriumi vizsgálatokkal kell kiegészíteni; ehhez a szabadföldről vizsgálati
mintákat kell begyűjteni.
f. Az ELISA-féle szerológiai, laboratóriumi vizsgálatot ki kell terjeszteni a következő vírusokra: burgonya
levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), burgonya A-vírus
(potato A potyvirus), burgonya M-vírus (potato M carlavirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus),
burgonya X-vírus (potato X potexvirus), dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) és lucerna mozaik
vírus (alfalfa mosaic alfamovirus). Ezekhez a vizsgálatokhoz 30 ha-onként 250 növény- (levél- vagy gumó-)
mintát kell megvizsgálni.
g. A vírusfertőzöttség mértéke a szuperelit szaporítási fokozatnál a 0,2%-ot, az elit szaporítási fokozatnál a
0,5%-ot, az utántermesztésnél a 2,0%-ot nem haladhatja meg. Ha ezek a határértékek nagyobbak, akkor a
burgonyatáblát a továbbszaporításból ki kell zárni.
h. A vírusfertőzöttség mértéke alapján alkalmasnak minősített vetőgumó-szaporító területek termését gumó-
vírusvizsgálattal is ellenőrizni kell.
Nem szabad figyelmen kívül hagyni, hogy a burgonya és általában a növények vírusellenőrzési és
vírusmentesítési módszere alapvetően a) diagnosztikai és biotechnológiai technikák, valamint b)
vírusmentesítési technikák együttes alkalmazásából áll. A vírusdiagnosztikai technikák (pl. szimptomatológia,
biotesztek, szerológiai és elektronmikroszkópiai vizsgálatok, molekuláris technikák, nukleinsav-hibridizáció,
elektroforezis, PCR-technika stb.) a vírusfertőzöttség pontos meghatározását, a vírusmentesítési technikák
(hőterápia, kemoterápia, merisztématenyésztés stb.) pedig a vírusok eltávolítását eredményezik. Ezeket a
módszereket a könyv egyes fejezeteiben részletesen ismertetjük.
128 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
9. fejezet - Elektronmikroszkópos módszerek
A növényvírusok a gazdanövényben olyan szöveti elváltozásokat idézhetnek elő, amelyeket elektronmikroszkóp
segítségével megfigyelhetünk. Egy új vírus leírása ma már elképzelhetetlen elektronmikroszkópos vizsgálatok
nélkül. A növényvírusok rendszerét összefoglaló tanulmányok, kézikönyvek is tartalmaznak
elektronmikroszkópos felvételeket minden csoport egy-egy fontosabb, jellegzetes képviselőjéről (Schmidt,
1980a; Milne, 1984, 1993; Francki et al., 1985). A vírusfertőzés hatására bekövetkezett kóros változások a
növény élettani működésében mindig valamilyen szerkezeti eltéréshez kapcsolhatók. A beteg növény
anyagcsere-folyamataira vonatkozó mérések és az ultrastrukturális vizsgálatok eredményeinek együttes
elemzése teljesebb képet adhat a fertőzés hatásmechanizmusáról. Ezért az elektronmikroszkópos kutatómunkán
alapuló adatok nem önállóan, hanem többnyire összetett vizsgálatok részeredményeként értékelhetők. A
növényvírusok osztályozása alakjuk, méretük, felépítésük, szerológiai jellemzőik, genetikai szerkezetük és
újabban replikációs stratégiájuk szerint történik. Ezért a növényvirológia számára új, még le nem írt vírusok
rendszerbe sorolása részben elektronmikroszkópiai technikákon alapul. Ahhoz, hogy ilyen jellegű vizsgálatokat
végezzünk, tisztában kell lennünk a növényvírusok morfológiájával, amelyet csak elektronmikroszkóppal
tudunk megállapítani. A virionok nukleinsavból (vírusgenom) és az azt körülvevő fehérjeburokból állnak. A
fehérjeburok (kapszid) köpenyfehérje-alegységekből (kapszomer) épül fel. Ezek elrendeződése szabja meg a
virion szimmetriáját, illetve alakját, amely lehet izometrikus, ikozaéder (más szóval szférikus, mivel kisebb
felbontású felvételeken gömbölyűnek tűnnek) és anizometrikus szimmetriájú – ezen belül megkülönböztetünk
merev pálcika, hajlékony fonál formát és bacilus alakot (52. ábra). A legkisebb, izometrikus virion átmérője 12
nm körüli, míg a leghosszabb, fonál alakú vírusok hoszszúsága körülbelül 2000 nm.
52. ábra - Különböző morfológiájú növénypatogén vírusok. A: pálcika alakú dohány
mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus); B: fonál alakú saláta mozaik vírus (lettuce
mosaic potyvirus); C: szférikus belladonna foltosság vírus (belladonna mottle
tymovirus) [Horváth József szívessége folytán]
1. Negatív festéses módszer
Az eljárás lényege, hogy a fertőzött növényből származó, virionokat tartalmazó nedvet vagy tisztított
víruspreparátumot nagy molekulatömegű nehézfémsókkal „megfestjük”. Az erősen elektronszóró
nehézfémionok a hátteret alkotó hártyához kötődnek aspecifikusan, azokat a virionok nem adszorbeálják. Így az
elektronmikroszkóp képernyőjén a virionok a sötét háttérből világosan rajzolódnak ki (mivel önmagukban nem
elég elektronszóróak). A módszer neve is innen származik, ugyanis az így előállított kép hasonlít egy fénykép
negatívjára (Hitchborn és Hills, 1965).
A festés menete
A vizsgálathoz legjobb olyan 400 mesh mintahordozó fémrácsot (gridet) használni, amelyet előzőleg
szénréteggel vagy műanyag hártyával (Formvar) vonunk be, és ezt követően szenezünk. A víruspreparátum és a
nehézfémsó-oldat egyesítése és feljuttatása a rácsra kétféle módon történhet: 1. a preparátumot felcseppentjük a
gridre, és a hártyához kötődés után adjuk hozzá a festéket; 2. a mintát a festékkel már a rácsra történő felvitel
Elektronmikroszkópos módszerek
129 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
előtt egyenlő arányban összekeverjük. Ha a minta és a festékoldat a rácson van, a felesleg eltávolítása után
hagyjuk rászáradni. A virionok egyenletesebb eloszlása érdekében a minta felvihető spray vagy sűrített
levegővel működő szórópisztoly segítségével, apró cseppek formájában is. Ennek a módszernek az az előnye,
hogy mennyiségi meghatározásra is alkalmas lehet. A virionok ugyanis többnyire a cseppek szélén gyűlnek
össze, és a cseppek elég kicsik ahhoz, hogy a teljes kerületük áttekinthető legyen.
A festéshez használt oldatok
a. Nátrium- vagy kálium-foszfo-volframát 2%-os vizes oldata, melynek kémhatását pH 7,0-re állítjuk be Na-,
illetve KOH-dal. Bizonyos vírusok szerkezetét károsítja ez az oldat [pl. a Cucumo, a Gemini, Ilarvirus
nemzetség tagjait: lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), paradicsom bronzfoltosság vírus
(tomato spotted wilt tospovirus)]. Feltehetően a kapszidot stabilizáló nukleinsav-fehérje között létrejött
kölcsönhatások lazításával vagy felbontásával, illetve a Tospovirus nemzetség és Rhabdoviridae család
tagjainál a külső burok sérülésével, ezért ilyen esetben a víruspreparátumot tartalmazó gridet a festés előtt
szobahőmérsékleten, öt percig, 1%-os glutáraldehid-oldattal kell kezelni.
b. Uranil-acetát 2,0 vagy 0,1%-os vizes oldata, a pH-t nem állítjuk be. (Az uranil-acetát gyengén radioaktív,
kezelése fokozott elővigyázatosságot igényel. Fényérzékenysége miatt sötét üvegben tárolandó.) A
volframáthoz képest kontrasztosabb, részletgazdagabb kép nyerhető a finomszerkezet jobb megtartásának
köszönhetően, azonban 5,5 pH-érték felett kicsapódik. Gondot okozhat, ha a növényi nedv vagy a foszfát-
ionok koncentrációja nem megfelelő. A kristályképződés elkerülése érdekében ügyelni kell arra, hogy a
mintát hordozó rácson ne legyen semmiféle szennyeződés.
c. Uranil-formiát vizes oldata az uranil-acetátnál leírt hígításban; elsősorban helikális szerkezetű vírusok
negatív festésére használják.
d. Ammónium-molibdát 2%-os vizes oldata, a közeg pH-ját 4–9 közé kell beállítani ammóniával vagy sósavval.
Bár a kontraszt szegényes, előnye, hogy az oldat közvetlenül összekeverhető a víruskészítménnyel, és a
labilis vírusok szerkezetét is jól megtartja.
A felsoroltakon kívül még számtalan nehézfémsó választható vírusok negatív festésére; a fentiekben a teljesség
igénye nélkül a legelterjedtebb, legszélesebb körben használt anyagokat soroltuk fel.
Általános tudnivalók
Mint minden in vitro vizsgálati módszer alkalmazása esetén, így az elektronmikroszkópos munka során is
keletkezhetnek műtermékek, ezért külön figyelmet kell fordítanunk ezek kiküszöbölésére, vagy ha nem
lehetséges, számolnunk kell velük az eredmények értékelésekor. Például a közeg összetételétől és fizikai-kémiai
tulajdonságaitól függően változik a pálcika alakú vírusok virionjainak hossza, mint ahogyan ez a dohány mozaik
vírus (tobacco mosaic tobamovirus) esetében jól ismert. Zavaró lehet, ha szennyezés kerül a gridre; ilyenkor
vízzel vagy semleges 0,01–0,05 M-os foszfát-pufferral mossuk le a nemkívánatos anyagokat (a mosást 0,1 M
CaCl2 oldattal is végezhetjük, akár a festés előtt). Uranil-acetát használatakor előfordul, hogy a nehézfémsó nem
a hártyához kötődik, nem jön létre elektronszóró háttérréteg. Ez olyan, mintha pozitív képet kapnánk, és ezért a
virionok átmérője is kisebb, közel fele a normális módon kapott értéknek. Ilyenkor a hártyázott rács
elektrosztatikus feltöltődését kell megszüntetnünk (például nagyfeszültségű kisülést hozunk létre levegőn, 0,1
torr nyomáson). Ha másképp nem sikerül, akkor 0,01–0,1% marha- (bovin-) szérumalbumin hozzáadásával a
festéket rögzíteni tudjuk a hártyához. Gyakran találkozunk olyan növényi mintával, amelyben kevert fertőzés
van, tehát a mintánk két, három, vagy akár több vírus virionjait is tartalmazza.
A virionok között versengés lép fel a tartóhártya szabad kötőhelyeiért, és mivel a vírus szerkezetétől, fizikai-
kémiai sajátságaitól függően a kialakuló kötőerők nem azonos erősségűek, nem feltétlenül a koncentrációjuknak
megfelelő eloszlás alakul ki a rácson; sőt, el is veszíthetjük egy részüket úgy, hogy végül csak egyetlen vírus
marad a preparátumon. Ha olyan vírussal akarunk dolgozni, melynek negatív festésére vonatkozóan nincs saját
tapasztalatunk, sem irodalmi adatok nem állnak rendelkezésünkre, akkor problémát okozhat a megfelelő
nehézfémsó-oldat megválasztása. Különböző festékek és eljárások kipróbálásával, az oldatok pH-jának vagy
koncentrációjának megváltoztatásával találhatjuk meg az adott vírus esetében legmegfelelőbb vagy az
elfogadható módszert.
Brandes-féle „levél-bemártásos” (leaf-dip) módszer
Ezt az eljárást a vírus(ok) gyors kimutatására dolgozták ki, mert közvetlenül az élő növényből, mindennemű
tisztítási folyamat nélkül, igen egyszerűen megállapítható, hogy milyen típusú virionok vannak a gazdaszervezet
Elektronmikroszkópos módszerek
130 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
sejtjeiben (Brandes, 1964; Ball, 1971; Schmidt, 1980b). A frissen elvágott levelet vagy epidermisznyúzatot
keresztülhúzzuk egy tárgylemezre cseppentett vízcseppen, így a sérült sejtek tartalma részben a csepp belsejébe,
részben annak felületére kerül. Egy hártyázott rácsot a víz felületébe érintünk, hogy a sejtnedv rátapadjon, majd
negatív festést alkalmazunk. A minta felvételét úgy is végezhetjük, hogy a levél metszett felszínét közvetlenül a
griden lévő festékcseppen húzzuk keresztül, majd szárítjuk.
A vírusok méretének meghatározása
Szférikus (izometrikus) vírusok átlagos átmérőjének számítása általában nem okoz gondot, az átlagtól való
eltérések nem jelentősek. Hitchborn és Hills (1965) például a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic
tymovirus) átmérőjének átlagértékét 27,0 nm-nek állapította meg úgy, hogy a negatívan festett mintában 50
viriont vizsgáltak 400 000 szeres nagyítás mellett.
A pálcika és a fonál alakú vírusok hosszúságában ezzel szemben nagy különbségek lehetnek, bár a virionok
többségének mérete szűk határok közé esik. Azt az átlagértéket, amely ebben az intervallumban található, Bode
és Köhler (1952) elnevezte a vírus normál hosszának. Később a normál hossz meghatározását módosították
(Brandes és Wetter, 1959; Brandes, 1964; Schmidt, 1980b), és javasolták a fő maximum átlagát. A mérések
eredményét hisztogramokon lehet ábrázolni: a vízszintes tengelyen a virionok hosszát veszik fel (nm-ben), a
függőleges tengelyen a megfelelő hosszhoz tartozó virionok számát, vagyis az eloszlási gyakoriságot (53. ábra).
Gibbs et al. (1963) úgy pontosították a számításokat, hogy az egyes hosszúságkategóriákat megjelenítő
oszlopokat a két szomszédos oszloppal összegezték (folyamatos összegzés, „running sums of three groups”). Így
az egymás mellett lévő oszlopok magasságában (vagyis az egyes csoportokba tartozó virionok számában) kapott
nagy eltérésekben rejlő hiba lehetőségét csökkenteni tudták. A mérést, illetve számolást végezhetjük a mintáról
készült fényképen, vonalzót használva. A negatívokon szereplő nagyításértékeket pontosan kell kalibrálni, a
mikroszkóp nagyítását időről időre ellenőrizni kell.
53. ábra - BSMV: árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus) és LRSV:
Lychnis gyűrűsfoltosság vírus (Lychnis ringspot hordeivirus) részecske-hosszúság
eloszlása. A sötét oszlopok a mért virionok eloszlását mutatják, míg a vonaldiagram a
három csoport folyamatos összegezésével kapott eredményt ábrázolja. ⇓ : normál
hosszúság; ↓: látszólagos hosszúság [Gibbs et al., 1963 után]
A virionok hosszúságát (a hajlékony, fonál alakú vírusokat kivéve) a negatívokon is meg lehet mérni
sztereomikroszkóp segítségével, átvilágító fénnyel, 0,6 vagy 1,0 × objektívvel. Az okulárlencsébe épített
mikrométerskálát szintén kalibrálni kell. A mérést addig folytatjuk, amíg legalább 100 viriont találunk, amelyek
hosszúsága a főmaximumsávba esik.
2. Immuno-elektronmikroszkópos módszer
Az elektronmikroszkópos vizsgálatok kombinálása szerológiai meghatározással lehetővé teszi a vírusok pontos
azonosítását, illetve rendszertani helyük megállapítását, rokonsági körük felderítését. Az immunosorbent
electron microscopy (ISEM) technikát akkor alkalmazzuk, ha a víruskészítményben olyan alacsony a virionok
koncentrációja, hogy hagyományos negatív festéssel nem detektálhatóak (Milne és Lesemann, 1984; Dijkstra és
De Jager, 1998). A módszer előnye a fajlagosság és az érzékenység növelése. A rácson lévő szenezett hártyára
antitesteket kötünk, majd inkubáljuk a vírustartalmú szuszpenzióban. Az antitestek megkötik az antigenikusan
Elektronmikroszkópos módszerek
131 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
közelálló rokon vírusokat. A rácsterületre számított részecskeszám-növekedés a szerológiai reakció nélküli
mintákhoz képest 2000–10 000-szeres is lehet.
Az antitest és az antiszérum hígítása
A negatív festéshez hasonlóan 400 mesh, Formvar vagy Parlodion hártyával bevont, szenezett rácsot
használunk. Az antiszérum-, vagy antitest-készítmény hígítása általában 1:1000, illetve 1:5000 arányban
ajánlott. Kisebb hígítás (pl. 1:100) esetében az antigén (vagyis a virionok) kötődése gátolt az IgG és az egyéb
szérumfehérjék között kialakuló, a kötőhelyekért folyó versengés miatt. Az antiszérum és egyben a
víruskészítmény hígítására többféle puffer alkalmas. Sok esetben jó a 0,1 M-os, semleges foszfát-puffer, de a
6,0–8,0 közé eső pH-optimumot be kell állítanunk. 0,05 M-os Tris-HCl-oldat (pH 7,2–7,5), vagy az ELISA-
tesztben is használt 9,6 pH-jú nátrium-karbonát-puffer szintén megfelelő lehet. Az antiszérummal történő
inkubációhoz öt perc elegendő. Erősebb kötődést érünk el, ha az inkubációt nem szobahőmérsékleten, hanem 37
°C-on végezzük; ez a negatív festék jobb eloszlását is elősegíti. A vírusok kivonásához, a gazda–vírus kapcsolat
típusától függően, különböző puffereket használhatunk. Bizonyos növényeknél nyers kivonat készítésekor
szükség lehet különböző védőanyagok hozzáadására. Ezzel részben elkerüljük a növény gátló, vagy roncsoló
komponenseinek károsító hatását. Kínai kelből (Brassica pekinensis) tarlórépa mozaik vírus (turnip mosaic
potyvirus) kinyerésekor a szövetnedvhez 0,1 M EDTA-t, szilvából vagy kajszibarackból történő szilva himlő
vírus (plum pox potyvirus) kivonása esetében 2,5%-ban nikotint kell tennünk. Egyéb vírusoknál még 2%-os
polivinil-pirrolidon (PVP) vagy 1%-os polietilén-glikol (PEG) hozzáadása is lehetséges.
A kontrasztosítás
A kontrasztosításnak három alapvető módja van: 1. árnyékolás platina/palládiummal; 2. pozitív festés etanolos
uranil-acetáttal és 3. negatív festés, amely az előbbi kettővel szemben olyan előnyös tulajdonságokkal
rendelkezik, hogy a növényi vírusdiagnosztikában már szinte kizárólag a negatív festést alkalmazzák. Az
aspecifikus reakciók kizárása és a tiszta háttér biztosítása érdekében a befejező fázist kivéve (kontrasztosítás)
minden egyes lépés után mossuk át a rácsot a hígításnál használt pufferral vagy desztillált vízzel. Ez úgy
történhet, hogy valamilyen tiszta felületre (például parafilmdarabka, Petri-csésze) kevés folyadékot (puffer vagy
desztillált víz) cseppentünk, majd óvatosan belemerítjük vagy ráúsztatjuk a gridet. Végül a negatív festéket
felvisszük a rácsra, rászárítjuk, és ezzel hozzáfoghatunk a minta elektronmikroszkópos vizsgálatához.
3. Dekorációs módszer
Az eljárás megegyezik az ISEM-technikával, azzal a különbséggel, hogy a negatív festés előtt az antitestekkel a
hártyához adszorbeált virionokat antitest-készítménnyel inkubáljuk. Ez a másodlagos jelölés (dekoráció,
„díszítés”) tovább növeli a kimutatás érzékenységét (az ELISA-hoz hasonló mértékben). A virionok élesebben
rajzolódnak ki, mivel méretük is növekszik a hozzájuk kötődő antitestek által. Az ELISA-teszttel ellentétben
nem kell konjugált antitestet használni, az eredmény közvetlenül értékelhető. Kis mennyiségű hígított
antiszérum (5–10 µl) és víruskészítmény (1 µl) elegendő. A szenynyező növényi anyagok és a nem specifikus
reakciók nem zavaróak, mivel a virionoktól morfológiailag jól megkülönböztethetőek. Az ELISA-teszttel
történő összehasonlításból azonban nem szabad azt a következtetést levonni, hogy ez a módszer teljes
mértékben felválthatja az ELISA-módszert, mert például magas költségigénye miatt a dekoráció és általában az
elektronmikroszkópos eljárások nem alkalmasak nagyszámú minta feldolgozására. A vírus azonosításán kívül ez
az eljárás módot ad az antiszérum titerének megállapítására, a vírusok közötti szerológiai rokonság
meghatározására is (Dijkstra és De Jager, 1998).
A dekorációs módszer lépései
a. Az antiszérum, ill. antitest hígítása, a mindenkori antiszérum titerértékétől függően 1:1000 vagy 1:5000-
szeresére, 0,1 M pH 7,0 foszfát-pufferrel.
b. Hártyázott rács inkubálása az antiszérumot tartalmazó oldatban 5 percig, 37 °C-on.
c. Mosás desztillált vízzel vagy foszfát-pufferrel.
d. Inkubáció a víruspreparátummal 15 percig szobahőmérsékleten vagy 37 °C-on.
e. Mosás desztillált vízzel vagy foszfát-pufferrel.
f. Az antiszérumot 1:10 vagy 1:100 hígításban használjuk. Inkubáció 15 percig szobahőmérsékleten.
Elektronmikroszkópos módszerek
132 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
g. A grid mosása desztillált vízzel vagy foszfát-pufferrel.
h. Negatív festés.
4. Kicsapásos (precipitációs) módszer
A víruskészítményt összekeverjük az antiszérummal és inkubáljuk. Az immunreakció lejátszódása után az
összecsapódott anyagot felvesszük a gridre és negatív festékkel kontrasztosítjuk.
5. Finomszerkezeti vizsgálatok módszerei
A növényi szövet tartósításával, megtartásával a virionokat sejten belüli környezetükben tanulmányozhatjuk
(Kay, 1961). Az elektronmikroszkóp felbontóképességének köszönhetően sokkal részletgazdagabb képet
kapunk a fertőzés okozta tünetekről. A gyantába ágyazott mintából bármikor készíthetünk metszeteket (Martelli
és Russo, 1984), amelyeket szintén tárolhatunk és később újra vizsgálhatunk. Citokémiai módszerek
alkalmazásával nyomon követhetjük egyes anyagcseretermékek sejten belüli elhelyezkedését, vagy
megállapíthatjuk adott képletek (például zárványok) kémiai természetét.
A növényi szövetminta megválasztása
A vizsgálati anyag megválasztásánál tekintetbe kell vennünk, hogy szisztemikusan vagy lokálisan fertőzött
növénnyel dolgozunk-e, meg kell különböztetnünk a tünetes és a (látszólag) tünetmentes, illetve a különböző
szintről vett leveleket. Figyelnünk kell arra, hogy a minták a lehetőségekhez mérten eléggé homogének
legyenek, tehát például sötétzöld-világoszöld mozaik esetén egy mintába vagy csak a sötét, vagy csak a világos
területből kerüljön a szövet. Érdemes a növényt mintavétel előtt sötétben tartani, hogy a kloroplasztiszok
keményítőtartalmát csökkentsük (ilyenkor az egészséges kontrollnövényt is sötétben kell tartani).
Fixálás
Célja, hogy a szöveten, sejten belüli alkotóelemeket a mintavételkor fennálló állapotukban rögzítsük és a sejt
szerkezetét a legkevésbé drasztikus beavatkozással megőrizzük. A fixáló oldat és a fixálás körülményeinek
meghatározásakor több tényezőt kell számításba venni. Problémát okozhat a kristályos aggregátumok,
zárványok jelenléte, ilyen esetben speciális fixálást kell alkalmazni.
A fixálók úgy működnek, hogy bizonyos molekulák között keresztkötéseket hoznak létre. Ehhez először be kell
jutniuk a sejt belsejébe, ami kémiai természetüktől függően gyorsan vagy lassabban történhet. Minél később
alakulnak ki a kereszthidak, annál nagyobb a valószínűsége a műtermék keletkezésének. Ezért először
előfixálást kell végezni egy aldehid típusú anyaggal, amely aránylag gyorsan bejut a sejtbe, és a
fehérjemolekulák között, illetve a molekulákon belül képez keresztkötéseket.
A következő aldehideket használják általánosan fixálóként: glutáraldehid, formaldehid, akrolein, glutáraldehid
és formaldehid keveréke (Karnovsky-féle fixáló). A glutáraldehid előnye, hogy gyorsan létrehozza a
keresztkötéseket, jól megőrzi a citoplazma és a sejtalkotók szerkezetét, viszont lassabban hatol be a szövetekbe.
A fixálást szobahőmérsékleten, 3–6%-os glutáraldehid koncentrációjú, 0,05–0,1 M foszfát- vagy kakodilát-
pufferben, semleges pH-n végezzük. A nagy tisztaságú oldatot felhasználás előtt tartsuk hidegen és sötétben. A
formaldehid reverzíbilis metilén-hidakat alakít ki. Önmagában kizárólag enzimatikus vizsgálatokra használják,
glutáraldehiddel keverve kitűnő fixálószer.
A következő lépés az utófixálás, amihez leggyakrabban ozmium-tetroxidot használnak. Ez az oldat lassabban jut
be a sejtekbe, és ott a telítetlen lipidmolekulák között alkot keresztkötéseket, így a membránok láthatóvá
tételéhez feltétlenül szükséges. 0,02–0,1 M (pH 7) kakodilát-, foszfát-, Veronal- vagy PIPES-NaOH-pufferban
oldjuk, 1–2%-ban. Az ozmium-tetroxidot – mivel gőzei erősen roncsolóak mind belélegezve, mind bőrön
keresztül – tartsuk elszívófülke alatt. Bizonyos esetekben kálium-permanganáttal végzik az utófixálást (2–5%-os
vizes oldatban), ez azonban erélyes oxidálószer, ezért a citoplazmában található virionokat és riboszómákat is
tönkreteszi.
A legáltalánosabban használt pufferek a következők: 0,1 M kakodilát-HCl, 0,2 M Na-foszfát, Millonig-féle Na-
dihidrogén-foszfát. Ozmium-tetroxid oldásához használhatunk Veronal-acetátot és 0,05 vagy 0,1 M kakodilát-
vagy foszfát-puffert.
Elektronmikroszkópos módszerek
133 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A fixálás úgy történik, hogy a levéllemezből (vagy az adott növényi szervből) borotvapengével 0,5–1 cm2-es
darabokat vágunk, majd egy csepp fixálóoldatban még kisebb, 1 × 1 × 1,5 mm-es mintákat készítünk. Fiolába
tesszük őket, és annyi fixáló oldatot öntünk hozzá, hogy a szövetdarabkák belemerüljenek. Ha nem süllyednek
le a minták, a szövetek közötti térben lévő levegőt vízlégszivattyú segítségével távolíthatjuk el. Az aldehides
előfixálás 1–3 óráig tart szobahőmérsékleten. Ezután az aldehidmaradványokat pufferral mossuk ki a mintákból
Pasteur-pipettával. Ozmium-tetroxiddal utófixálás következik 1–3 óra hosszat szobahőmérsékleten, vagy 4 °C-
on egy éjszakán át. Desztillált vizes mosással (2–3-szor 1 órán keresztül) eltávolítjuk a maradék OsO4-ot.
Dehidratálás
A gyantába ágyazás előtt a szövetekből ki kell vonnunk a víztartalmat és az oldatot szerves oldószerre kell
cserélni, mert a gyanták általában vízben nem oldódnak. A víztelenítés fokozatosan növekvő koncentrációjú
aceton- (epoxi gyanták) vagy etanol- és propilén-oxid-oldat sorozattal történhet. Minden oldatban 10, de
maximum 30 percig állhat a minta (máskülönben a lipidek kioldódnának). Etanolos dehidratálás során a
koncentrációsorozat: 1 × 30 perc 20, 40, 60, 95%-os és 2 × 30 perc abszolút alkoholban.
Gyantába ágyazás
Metszet készítésére a puha növényi szövetek kevésbé alkalmasak, különösen, ha ultravékony metszeteket
akarunk nyerni. A gyanták jobb tartást adnak az anyagnak és meghosszabbítják a minta eltarthatóságát. Kémiai
természetüket tekintve a gyanták polimer vegyületek, beágyazásra is különböző típusúak alkalmasak. Három fő
csoportjuk az epoxi-, a poliészter- és az akril-gyanták. Szobahőmérsékleten folyékonyak, magasabb
hőmérsékleten polimerizálódnak. A folyékony gyantakomponensek összemérésekor, illetve formába öntésekor
vigyázzunk, hogy az a bőrünkre ne kerüljön, mert ezek általában rákkeltő anyagok. Az epoxi típusú gyanták
közé tartoznak az Epon, az Araldit és a kettő keveréke. Ebben az esetben etanolos víztelenítés után 2x30 percre
propilén-oxidba tesszük a mintákat, majd propilén-oxid:gyanta 3:1 arányú keverékébe helyezzük. Végül friss,
tiszta gyantát öntünk a formákba, amelyekbe megfelelő orientációval beletesszük a szövetdarabkákat.
Kemencében az előírt hőfokon és ideig (30–40 °C-on, egy éjszakán át) hagyjuk megkeményedni
(polimerizálódni) az anyagunkat. Manapság sok laboratóriumban szívesebben használnak ún. Spurr gyantát
(vinil-ciklohexén-dioxid), mert egyszerűbb vele dolgozni, víztelenítésre pedig egyaránt alkalmazhatunk etanolt
vagy acetont. Magasabb hőmérsékleten polimerizálódik (kb. 70 °C-on, minimum 8 órán át). Akril-gyanta
például a glikol-metakrilát, amely vízben oldódó vegyület, ezért a víztelenítést nem szerves oldószerrel
végezzük, hanem közvetlenül víz és gyanta keverékének sorozatával.
A minta metszése
Ahhoz, hogy a gyantába ágyazott mintáinkból (amelyet blokknak neveznek) megfelelő méretű és vastagságú
metszeteket tudjunk készíteni, mikroszkóp alatt egy csonkagúla vagy piramis alakot kell kifaragnunk. Ennek
célja részben az, hogy eltávolítsuk a fölösleges gyantát a minta fölött (és körül), másrészt ez az alakzat
biztosítja, hogy jól metsződjön a minta és ne törjön le. A piramis oldalait határozott mozdulattal alakítsuk ki,
hogy a sík felületek simák legyenek. A piramis csúcsát metsszük le úgy, hogy felülnézetből négyszög alakú
lapot kapjunk. Ez a sík felület merőlegesen essen a mintánk síkjára vagy a levéldarabka lemezére, ha
levélkeresztmetszetet akarunk vizsgálni. Ezzel a felülettel párhuzamosan fogjuk metszeni a blokkot. Ezt a
műveletet érdemes gondosan elvégeznünk, mert nagyon sok múlik azon, hogy hogyan képeztük ki a vágási
felületet, amely nem lehet nagyobb 0,5 × 0,5 mm-nél.
A következő lépés a minta metszése ultramikrotómmal. A készülékbe gyémánt- vagy üvegkést fogunk be, adott
szögbe állítjuk. Ha nem áll rendelkezésünkre gyémántkés, vagy nem rendelkezünk elég gyakorlattal, üvegkést
magunk is készíthetünk késtörő műszerrel. A késhez ún. „csónakot” kell készíteni, amelyet a késhez ragasztunk
és vízzel töltünk fel. A kész metszetek a csónakban lévő víz felületére úsznak rá. Jó esetben a metszetek sorban
egymás után, szalagszerűen összekapcsolódva jönnek le a késről. A metszeteket összetereljük egy
fogpiszkálóból vagy gyufaszálból és néhány szál ecsetszőrből készített eszközzel, majd felszedjük a gridre
(egyszerűen belemerítjük a rácsot a vízfelületbe). Választhatunk 300–400 mesh hártyázatlan rácsot, vagy
nagyobb rácsméretű, 200 mesh hártyázott (és szenezett) gridet. Ha sikerült a metszeteket a rácsra juttatni,
szűrőpapírral finoman leitatjuk a vizet.
Festés (kontrasztosítás)
A biológiai anyagok jellemzője, hogy nem eléggé szórják az elektronokat, ezért az elektronmikroszkópban
kapott kép kontrasztszegény lesz. Különböző eljárásokkal megnövelhetjük az elektronszóródást, s ezáltal a
kontrasztot. Nehézfémionokat tartalmazó oldattal megfestve a mintánkat nagyon jó eredményt érhetünk el.
Elektronmikroszkópos módszerek
134 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Kontrasztosítást végezhetünk a fixálás során, víztelenítés előtt vagy alatt, illetve a beágyazás és metszés után,
magukon a metszeteken uranil-acetát, uranil-nitrát vagy egyéb urániumsók oldatával. Víztelenítés előtt 15
percre 0,5–2,0%-os vizes oldatba tesszük a mintákat. Víztelenítés alatt a 70%-os etanol- vagy acetonoldathoz
1%-ban uranil-acetátot adunk, vagy uranil-acetátra nézve telített oldatot készítünk, és 15 percig tartjuk benne a
mintákat. A metszeteket úgy festjük, hogy vízben, vagy 50%-os etanolban telített uranil-acetát-oldatot
készítünk, és 1 órát hagyjuk benne a mintákat. Metszetek esetében használhatunk ólomsókat is (ólom-citrát, -
tartarát), de ezek oldatban hajlamosak a levegő CO2-tartalmával karbonátos csapadékot képezni. Leginkább
bevált festési mód az uranil-acetát és ólom-citrát együttes alkalmazása, amit kettősfestésnek nevezünk.
A kettősfestés menete
a. 50%-os etanollal 2%-os uranil-acetát-oldatot készítünk.
b. A grideket a metszeteket hordozó felületükkel fölfelé 10 percre vagy 1 órára az oldatba helyezzük.
c. 20–30 csepp 50%-os etanollal mossuk, majd száraz szűrőpapírra tesszük.
d. Néhány darab szilárd NaOH-pasztillát Petri-csészébe rakunk, lefedjük hidrofób anyaggal.
e. A hidrofób anyagra ólom-citrátot csepegtetünk.
f. A cseppekre 2 percre ráúsztatjuk a grideket.
g. CO2-mentes desztillált vízzel mossuk.
h. A grideket szűrőpapíron szárítjuk.
6. Citokémiai vizsgálatok
A fertőzött sejtek bizonyos alkotóelemeinek kémiai természetét vagy a sejten belüli elhelyezkedését enzimatikus
emésztés vagy kelátok alkalmazása révén határozhatjuk meg. Enzimes kezelést a vizsgálat céljától függően vagy
a gyantába ágyazás előtt, vagy azt követően végezhetünk. Az első esetben az aldehides fixálás után történik az
enzim hozzáadása, ezután OsO4-os utófixálás, víztelenítés és beágyazás következik. A második esetben a
beágyazást követi az enzim alkalmazása.
7. Immunokémiai vizsgálatok
Konjugált immunoglobulinok használatával szerológiai reakción alapuló kimutatásokat elektronmikroszkópos
vizsgálathoz előkészített ultravékony metszeteken is végezhetünk. Az immunoglobulinokhoz ferritin- vagy
kolloidális aranyszemcséket kötnek (immunogold jelölés), amelyek eloszlása jelzi, hogy a kérdéses anyag hol
fordul elő a sejtben.
Immunokémiai és citokémiai vizsgálatok végzésekor a gyantába ágyazáshoz jobb olyan gyantát használni,
amely alacsony hőmérsékleten polimerizálódik (pl. LR Gold), mert így a sejtalkotók, az enzimek és a fehérjék
működőképesek maradnak (Van Lent et al., 1990; Dijkstra és De Jager, 1998).
135 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
10. fejezet - A vírusfertőzött növényi sejtek finomszerkezete
Ha a fertőzés során a gazdanövény és a vírus között kölcsönhatás alakul ki, akkor a vírus bejut a növény
sejtjeibe, és ott közvetlen vagy közvetett úton kóros elváltozásokat okoz. A vírusok – mint közismert – önálló
szaporodásra képtelenek, a gazdaszervezet anyagait, illetve replikációs-transzlációs egységét parazitálják, s
ezzel fölborítják a növény anyagcsere-folyamatainak egyensúlyát. A sejt működésében bekövetkező eltérések
gyakran együttjárnak a szerkezet változásával, amit elektronmikroszkópos metszeteken tanulmányozhatunk. Ez
azért is fontos, mert a fertőzés folyamatának megértéséhez tudnunk kell, hogy a vírusreplikáció a növény mely
sejtalkotóiban történik (de Zoeten, 1976). A növényi szövetek, sejtek vizsgálata módot nyújt arra, hogy a vírus
sejtbe jutásától a virionok összeépüléséig végbemenő változásokat lépésről lépésre nyomon kövessük. Másrészt
e készítményeken vizsgálhatjuk a virionokat vagy a vírus eredetű képleteket, illetve ezek sejten belüli
elhelyezkedését.
1. Sejtek és sejtalkotók
Vírusfertőzött növényeknél gyakori jelenség a sejtfal megvastagodása. Ennek oka a sejt fenil-propanoid
anyagcsere-folyamatainak kóros megváltozása. A növény a mérgező vegyületek felhalmozódását úgy
akadályozza meg, hogy a sejtfalban megkötött enzimjei segítségével átalakítja azokat ligninné vagy egyéb
polimerekké, és ilyen formában a sejt anyagforgalmából kivonja azokat. Ezek az anyagok a sejtfalra rakódnak,
ezáltal sejtfalvastagodást idéznek elő (Mc Mullen et al., 1977). A plazmodezmák szerkezete is módosulhat a
fertőzés következtében. Például a plazmodezma-átmérő jelentős növekedése szerepet játszhat a virionok sejtről
sejtre történő terjedésében (Davison, 1969). Dália mozaik vírussal (dahlia mosaic caulimovirus) fertőzött
dálialevélben a virionokat tartalmazó plazmodezmák átmérője közel kétszerese volt az egészséges növény
plazmodezmáinak (Kitajima és Lauritis, 1969). A mitokondriumok megnagyobbodását és a sejt egyes területein
történő tömörülését, a kriszták fellazulását is észlelték (Matthews, 1980, 1981).
Számos gazda–vírus kapcsolatban kialakuló mikroszkopikus tünet a kloroplasztiszok rendellenessége: külső
alakjuk eltérése, belső membránrendszerük felbomlása vagy a tilakoidok és gránumok számbeli változása (Mc
Mullen et al., 1978). Ezek az eltérések attól függetlenül kiakulhatnak, hogy a vírus szaporodása a
kloroplasztiszban megy végbe vagy sem. Nem zárult le a vita arról, hogy a dohány mozaik vírus (tobacco
mosaic tobamovirus) fertőzéskor tapasztalt fotoszintetikus aktivitáscsökkenés közvetlen vagy közvetett gátlás
következménye-e. Esau (1968) elektronmikroszkópos felvételein dohány mozaik vírussal fertőzött Nicotiana
tabacum növények kloroplasztiszaiban vírusfelhalmozódás látható (54. ábra). Reinero és Beachy (1986, 1989)
vírus-köpenyfehérjét mutattak ki a tilakoidokhoz kapcsolódva, és feltételezték, hogy ez a PSII (photosystem II)
fehérjéihez kötődve közvetlenül gátolja azok működését. Így valószínűnek tűnt, hogy a vírusreplikáció vagy a
virionok összeépülése itt történik. Ezzel szemben olyan mutáns vírusok, amelyek köpenyfehérjéje nem képes
bejutni a kloroplasztiszba, ugyanolyan tüneteket okoztak, mint a vad típusú vírus (Lindbeck et al., 1991).
54. ábra - Vírusfelhalmozódás a kloroplasztiszban. Két vírushalmaz dohány mozaik
vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzött dohány (Nicotiana tabacum)
mezofillum sejtjének kloroplasztiszában. Az alsó szétnyomja a gránumokat, a felső
halmaz kidomborítja a kloroplasztiszt határoló kettős membránt. GR = gránum, V =
vírushalmaz, VA = központi sejtüreg, W = sejtfal. 30 000-szeres nagyítás [Esau, 1968
után]
A vírusfertőzött növényi sejtek
finomszerkezete
136 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Nem ilyen ellentmondásos a helyzet a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) fertőzése
esetében. A kloroplasztiszok szélén apró hólyagok lefűződését írták le. A hólyagocskák a két kloroplasztisz-
borítómembrán betűrődésével keletkeznek, nyaki részük nyitott a citoplazma felé, tehát a tartalmuk
kapcsolatban marad a citoplazmával. Részletes vizsgálatok alapján (Matthews, 1981) megállapították, hogy a
sejtben lejátszódó események a következő sorrendben követik egymást: először megjelennek az említett apró
hólyagocskák a kloroplasztisz borítómembránjainak belső felületén. Ezután a kloroplasztisz duzzadni kezd,
keresztmetszetben kör alakot mutat. Egyre több hólyagocska fejlődik, ezek csoportokba tömörülnek, közelükben
endoplazmatikus retikulummembránok képződnek a kloroplasztisz felőli oldalon, sima felszínnel; a citoplazma
felé eső oldalukhoz riboszómák kapcsolódnak. Ezek a membránok egymással is összeköttetésben vannak, így
egy hálózatot hoznak létre a kloroplasztisz körül. A következő szakaszban az endoplazmatikus retikulum hártyái
eltűnnek; ezek a területek elektromikroszkópban elektronáteresztővé válnak. A kloroplasztiszok
összecsapódnak, majd a közöttük lévő elektronáteresztő zónában virionok halmozódnak föl (55. ábra). Végül a
levelek öregedésével (szeneszcencia) a citoplazma és a kloroplasztiszok vakuolizálódnak, szétesnek.
Megállapították, hogy a vezikulumok a vírus-RNS szintézisével hozhatók összefüggésbe, vagyis a
vírusreplikáció helye ebben a nemzetségben (Tymovirus) a kloroplasztisz. Árpa csíkos mozaik vírus (barley
stripe mosaic hordeivirus) szisztemikus fertőzés esetében Lin és Langenberg (1985) igazolták a plasztiszok
vírus-RNS-tartalmát. Egy olyan vírus–gazda kapcsolatban, mint a paradicsom bonzfoltosság vírus (tomato
spotted wilt tospovirus) és Nicotiana benthamiana – amelyben a vírus nem a kloroplasztiszban replikálódik –, a
fertőzési folyamat végére a plasztiszok szerkezete teljesen fölbomlik (Almási et al., 1996). Ezek az
organellumok a fertőzés kezdeti szakaszában csak enyhe változást mutatnak, később duzzadttá válnak, tilakoid
membránjaik fellazulnak, eltávolodnak egymástól, nagy keményítőszemcsék és lipidcseppek (ozmiofil
globulusok) halmozódnak föl, végül szétesnek (56. ábra). Mohamed (1973) hólyagok (vezikulumok)
keletkezését is megfigyelte, amelyeknek azonban nem a vírusreplikációban, hanem a kloroplasztisz
fölbomlásában van szerepük (Matthews, 1980). Ezekkel a tünetekkel párhuzamosan a klorofillkoncentráció is
csökken, sok más vírusfertőzéshez hasonlóan (Mohamed, 1973; Brakke et al., 1988).
55. ábra - A: tarlórépa sárga mozaik vírussal (turnip yellow mosaic tymovirus) fertőzött
kínai kel (Brassica pekinensis) levél mezofillumsejtjének kloroplasztiszai. Jellegzetes
széli vezikulumok (V) a kloroplasztiszban, és virionok felhalmozódása a két
A vírusfertőzött növényi sejtek
finomszerkezete
137 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
kloroplasztisz közötti citoplazmában. B: széli vezikulumok kinagyított képe. Nyilak
jelzik a kettős membránnal borított hólyagocskák nyaki részét, amely a citoplazmába
nyílik. Az alsó vonalak mérete = 100 nm [Francki et al., 1985 után]
56. ábra - A kloroplasztiszok kóros eltérései paradicsom bronzfoltosság vírussal (tomato
spotted wilt tospovirus) fertőzött Nicotiana benthamiana növények levelének
mezofillumsejtjeiben A: a megnagyobbodott keményítőszemcsék (nyíllal jelölve)
szétnyomják a tilakoidmembránokat; B: a kloroplasztiszok alakja megváltozott, a belső
membránrendszer fellazult. A tilakoidok (T), a plasztoglobulusok (P) és a
kloroplasztiszban található vezikulumok nyíllal jelölve; C: az erősen duzzadt
kloroplasztiszban plasztoglobulusok halmozódtak fel (nyíl jelzi); D: a fertőzés utolsó
szakaszában a külső burokkal rendelkező virionok az egész citoplazmában
megtalálhatók, de sohasem fordulnak elő a kloroplasztiszokon belül. A nyíllal jelzett
virionok hármas-négyes csoportokban, vagy többesével láthatók egy közös
membránban
A vírusfertőzött növényi sejtek
finomszerkezete
138 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az endoplazmatikus retikulum, a Golgi-készülék és egyéb membránok vesznek részt a paradicsom
bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) virionjainak „érési” folyamatában. Ez a vírus, akár a
Bunyaviridae család többi tagja, azért különleges a növényvírusok között, mert a vírusgenomot a
köpenyfehérjén kívül még egy glükoprotein burok borítja. A virionok összeépülése bonyolult (Dubois-Dalcq et
al., 1984); a külső burkot a különböző sejtalkotókon történő áthaladás során nyerik (Ie, 1971; Kitajima et al.,
1992).
2. Zárványok
A fertőzés során létrejött zárványokat (inclusions) elhelyezkedésük, felépítésük, illetve eredetük alapján
csoportosíthatjuk. Vannak a citoplazmában található zárványok, és vannak olyanok, amelyek különböző
sejtalkotókban (sejtmag, mitokondrium stb.) helyezkednek el. Szerkezetük és származásuk szerint virionokból
vagy vírus eredetű képletekből és növényi eredetű összetevőkből állhatnak. Szabályos kristályos elrendeződést,
kristályszerű vagy lazább amorf halmazt alkothatnak. A különböző vírusok létrehozhatnak hasonló belső vagy
mikrotüneteket, ennek ellenére egyes zárványtípusok annyira egyedi jellegűek, hogy diagnosztikai célra is
felhasználhatók. A zárványok finomszerkezete elektronmikroszkóppal vizsgálható, a szöveten belüli
elhelyezkedésüket, gyakoriságukat fénymikroszkóppal lehet megfigyelni (Christie és Edwardson, 1977, 1986;
Martelli és Russo, 1977; Edwardson et al., 1993; Dijkstra és De Jager, 1998).
2.1. Kristályos citoplazmatikus zárványok
A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) által szisztemikusan fertőzött növények sejtjeinek
citoplazmájában a virionok gyakran nagy területre kiterjedő aggregátumokat hoznak létre (Esau, 1968). A
A vírusfertőzött növényi sejtek
finomszerkezete
139 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
szabályos kristályszerkezet úgy alakul ki, hogy a virionok szorosan egymás mellé és fölé rendeződnek, több
rétegben hexagonális síkot alkotnak. Ezért ezeket a zárványokat sokszor hexagonális lemezekként említik (57.
ábra). A kristályok metszete hatszögletű, négyzet vagy téglalap alakú lehet. A dohány mozaik vírus egyes
törzsei és a Tobamovirus nemzetség egyéb tagjai esetében a zárványok nem egyenes síkokkal határoltak, hanem
kör, ovális vagy szabálytalan alakúak. Ezeknél több lemez kerül egymás fölé, amelyekben a lemez síkjára
merőlegesen, hexagonális rendszerben találhatók a virionok, egy vagy több rétegben. A lemezek behajolhatnak,
keresztmetszetben koncentrikus köröket alkotnak. A vírus „aucuba” törzse olyan virionfelhalmozódást okoz,
amelyben az egyes rétegek egy síkban fekszenek és a virionok rétegenként körülbelül 60°-os szöget zárnak be
egymással. Ezek hosszú nyaláboknak vagy tű alakú képleteknek látszanak. A fertőzés előrehaladtával a
szabályos kristályos szerkezet fellazulhat, ekkor a virionok kristályszerű zárványt képeznek.
57. ábra - Kristályos citoplazmatikus zárvány, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic
tobamovirus) fertőzött dohány (Nicotiana tabacum) parenhimasejtjében. A pálcika
alakú virionok egymással párhuzamosan, sorokba rendeződve, számos réteget
képeznek. 26 000-szeres nagyítás. CH = kloroplasztisz, VA = központi vakuólum, W =
sejtfal [Esau, 1968 után]
2.2. Amorf citoplazmatikus zárványok
A virionok (elsősorban a fertőzés korai szakaszában) amorf zárványokat is létrehozhatnak. A dohány mozaik
vírussal szisztemikusan fertőzött dohánynövényben Esau (1968) X-testnek nevezte el ezeket a formákat,
amelyek mátrixba ágyazott érett virionokat tartalmaznak (58. ábra). A mátrix, amely riboszómákat is tartalmaz,
A vírusfertőzött növényi sejtek
finomszerkezete
140 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
szemcsékből (granulumok), csövecskékből (tubulusok) és membránokból áll. Az érett virionok jelenléte a
citoplazmában a vírusösszeépülés folyamatára utal. Az X-testeket ezért viroplazma néven is említik.
58. ábra - Amorf citoplazmatikus zárvány (X-test) dohány mozaik vírussal (tobacco
mosaic tobamovirus) fertőzött Nicotiana tabacum levelének parenhimasejtjében. A
tubulusok (csövecskék) kis csoportokban, a nyalábok egymással szöget bezárva
rendeződtek. RB = riboszómák, ER = endoplazmatikus retikulum, VA = üregek, V =
virionok [Esau, 1968 után]
A karfiol mozaik vírussal (cauliflower mosaic caulimovirus) fertőzött tarlórépa sejtjeiben az amorf
zárványokban az izometrikus virionokon kívül a vírus nem-szerkezeti géntermékét is kimutatták (Espinoza et
al., 1991). A vírusgenomban kódolt fehérje a zárványok egy részében a levéltetű-átvitelért felelős. A zárványok
másik részében más fehérje-összetevőket találtak, melyek valószínűleg a vírusreplikációban és az összeépülési
folyamatban vesznek részt.
2.3. Hengeres citoplazmatikus, forgókerékszerű (pinwheel) zárványok
A Potyviridae család tagjai egy egészen különleges zárvány képződését idézik elő a fertőzött növényekben. A
zárványnak több típusa van, amely vírusra jellemző, és nem függ a gazda–parazita között kialakuló kölcsönhatás
jellegétől. Ezért ez az elektronmikroszkópos tünet diagnosztikai jelentőségű. A zárvány típusa szerint négy
alcsoportot különböztetünk meg. Az I. alcsoportba tartoznak azok a vírusok, amelyek csak lemezes zárványt, a
II. alcsoportba, amelyek csak tekercseket hoznak létre, a III. alcsoport tagjai a tekercsek mellett rövid, lemezes
aggregátumokat is képeznek, míg a IV. alcsoportban a tekercsek hosszú lemezekkel együtt fordulnak elő
(Christie és Edwardson, 1977). Felépítésükben egy egyszerű, a vírusgenom által kódolt, nem-glükozilált protein
vesz részt. Egy központi tubulusból és abból kiinduló öt–tizenöt visszahajló lemezből állnak. Keresztmetszetben
forgókerékszerű (pinwheel) alakzatot mutatnak, hosszmetszetben a lemezek nyalábként tűnnek föl (59. ábra). A
lemezek kiterítve négyszög vagy háromszög alakúak; az előbbiek hengeres, az utóbbiak kúpos zárványt
alkotnak. Ha a lemezek egyenesek maradnak, akkor lemezes aggregátumról beszélünk, ha feltekerednek, akkor
tekercsről.
59. ábra - Potyvirusokra jellemző forgókerékszerű (pinwheel) zárványok (A, B, C). C:
Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus) forgókerékszerű
zárványai. 80 000-szeres nagyítás. La = lemezes aggregátumok, P = plasztid
(kloroplasztisz), M = mitokondrium, Pw = forgókerékszerű (pinwheel) zárvány
[Horváth József szívessége folytán]
A vírusfertőzött növényi sejtek
finomszerkezete
141 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A zárványoknak a fertőzési folyamatban betöltött szerepét sokan tanulmányozták és tanulmányozzák
napjainkban is (Shukla et al., 1994). A hengeres zárványok a fertőzés első szakaszában a plazmalemma
közelében képződnek és központi tubulusuk a plazmodezmán áthúzódik; később eltávolodnak a
plazmalemmától, a sejt belseje felé kerülnek és a citoplazmában gyűlnek össze. Ezért valószínű, hogy a virionok
sejtről sejtre történő terjedését segítik elő. Másrészt viszont a lemezek általában a durva felszínű
endoplazmatikus retikulummal is szorosan kapcsolódnak (Huth et al., 1984). A zárványfehérje egyes
aminosavszakaszai nukleotidkötő képességgel rendelkeznek, és az N-végi régiója helikáz-aktivitást mutat. Ezek
a tulajdonságok, és az a tény, hogy a zárványokhoz virionok is kapcsolódnak, azt a feltételezést támasztják alá,
hogy részt vesznek a vírusreplikációban és a virionok összeépülésében is (Ammar et al., 1994).
2.4. Kristályos sejtmagzárvány
A Potyviridae család egyes tagjai (elsősorban a II. alcsoportba tartozók) a gazdanövény sejtmagjában kristályos
zárványok keletkezését váltják ki (60. ábra). Ezek eltérő alakúak: négyoldalú csonka piramis, bipiramidális
rombusz, csonkagúla, kocka vagy tű alakúak (Shukla et al., 1994; Edwardson és Christie, 1991). Kimutatták
bennük azt a vírus eredetű proteázt, amely a vírusgenomban kódolt poliprotein poszt-transzlációs feldarabolását
végzi, és egy másik fehérjét is, az RNS-függő RNS-polimeráz enzimet is.
60. ábra - Sejtmagzárványok dohány karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus)
fertőzött dohánylevél (Nicotiana tabacum) sejtjeiben. A: a metszés síkja merőleges a
zárvány síkjára; B: a metszet egy bipiramidális zárvány lemezének síkjában készült. Az
ábrák bal alsó sarkában a vonal 500 nm-nek felel meg. Nu = nucleolus (sejtmagvacska)
[Francki et al., 1985 után]
142 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
11. fejezet - Fénymikroszkópos festéses módszerek
Fénymikroszkópos vizsgálatokat a növényvirológiában elsősorban akkor végzünk, ha valamely tünet, illetve a
fertőzés hatására létrejött képlet jelenlétére vagy pontos elhelyezkedésére vagyunk kíváncsiak (Esau, 1968; de
Zoeten, 1976; Christie és Edwardson, 1977, 1986; Schmidt, 1980; Matthews, 1981). Megfigyelhetjük például a
kristályos zárványok durva morfológiáját, vagy azt, hogy mely növényi szövetekben találhatók (61. ábra).
Módunk van arra is, hogy a festődés alapján megkülönböztessük a fehérjetermészetű zárványokat a nukleotid
tartalmúaktól (19. táblázat). A trifán-kék, a narancs-zöld (O–G) pl. a fehérjetermészetű, a metilzöld-pironin a
nukleinsavak megfestésére alkalmas (Dijkstra és De Jager, 1998). Elektronmikroszkópos vizsgálatok
eredményének kiegészítésére is lehetőségünk nyílik, ha ugyanabból az anyagból készítünk mintát a
fénymikroszkópos analízishez is. A festési technika előnye, hogy olcsó, gyors és egyszerű munkára ad
lehetőséget, ezenkívül a növényi szövet nagy területéből vehetünk mintát.
19. táblázat - A citoplazmatikus és a normális sejtalkotórészek elszíneződése különböző
festések alkalmazásakor (Dijkstra és De Jager, 1998 után)
Festék Sejtmag Sejtmagvac
ska Plasztidák
Citoplazm
a Zárványok
Trifán-kék világoskék kékesfekete színmentes
(a
kloroplasz
- tiszok
zöldek)
színmentes kékesfekete
Floxin-metil-
kék rózsaszín rózsaszín-
viola
rózsaszín színmentes rózsaszín-viola
Metilzöld-
pironin kék világosvörö
s világosvör
ös színmentes rózsaszíntől
sötétvörösig
Azúr-A kék vörös-viola színmentes színmentes rózsaszíntől és
vörös-violától
színmentesig
(proteinszerű
zárvány
esetén)
Narancs-zöld
(O-G) narancs zöld sárgászöld sárgászöld zöldesbarna
61. ábra - A: Malva érkivilágosodás vírus (Malva vein clearing potyvirus)
fénymikroszkópos zárványai; B: retek mozaik vírus (radish mosaic comovirus)
zárványai. 800-szoros nagyítás; C: karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic
caulimovirus) zárványai. 450-szeres nagyítás; IB = zárványtestek (inclusions), N =
Fénymikroszkópos festéses
módszerek
143 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
sejtmag, P = plasztid, CN = kristályos, tűszerű zárványok, V = vakuolum [Horváth
József szívessége folytán]
A növényi minta előkészítése
Ennél az eljárásnál általában friss növényi szövetekből készítünk mintát, de bizonyos esetekben lehet
formalinnal vagy glutáraldehiddel fixált szövetet használni. Friss anyagból nehezebb metszeni, fixálás során
viszont sérülhetnek a zárványok. Készíthetünk epidermisznyúzatot finom, egyenes szárú csipesz segítségével.
Ha levélkeresztmetszetet akarunk vizsgálni, bodzabélben rögzíteni tudjuk a levelet és borotvapengével
vághatunk vékony szeletet. Ilyenkor a levél epidermiszét az egyik oldalról előzőleg el kell távolítani, hogy a
festék be tudjon diffundálni a sejtekbe (a kutikula akadályozza a festék bejutását).
1. Calcomine orange–Luxol brilliant green bl festés (o–g festés)
Protein tartalmú zárványok festésére alkalmas (ilyenek a potyvirus fertőzések következtében kialakuló
zárványok) (Dijkstra és De Jager, 1998).
A festés menete
A háromféle festékből (calcomine orange 2RS vagy direct orange 102, ill. 26 és Luxol brilliant green BL)
külön-külön törzsoldatot készítünk. A törzsoldatokat szobahőmérsékleten korlátlan ideig tárolhatjuk.
a. 1 g festéket 100 ml 2-metoxi-etanolban oldunk, összekeverjük, majd leszűrjük.
b. A törzsoldatokból és vízből egy kisméretű óraüvegen keveréket készítünk a következő arányban: 1 rész
narancs festékhez 1 rész vizet és 8 rész zöld festéket adunk. A narancs és a zöld festék egymáshoz
viszonyított aránya ettől eltérhet, de a víz a teljes térfogat 10%-a legyen.
c. A mintát a festékben 5–10 percig inkubáljuk.
d. A festékoldatot Pasteur-pipettával eltávolítjuk, majd 95%-os etanollal többször mossuk (egy-egy mosás 15–
20 másodpercig tartson). Ezután kevés 2-metoxi-etilacetátot adunk hozzá.
e. 5 perc elteltével csipesz segítségével felvesszük a mintát, tárgylemezre helyezzük, egy csepp rögzítőt
(Euparal) teszünk rá, és óvatosan rányomjuk a fedőlemezt (hogy a szövet kisimuljon).
f. A mintát olaj-immerziós tárgylencsével, kb. 1000-szeres nagyítással tanulmányozhatjuk.
Amennyiben zöld Luxol festékhez nem tudunk hozzájutni, magunk is előállíthatjuk, a következő módon: 2 g
1,3-di-orto-tolylguanidint (DOTG) oldunk 50 ml 0,7 M HCl-oldatban (3 ml 37%-os HCl-at vízzel 50 ml-re
hígítunk), keverjük, majd átszűrjük szűrőpapíron. 3 g Guinea-zöld B (savas zöld 3-CI42085) festéket 50 ml
vízben feloldunk. Az így kapott két törzsoldatot összeöntjük, keverés után szűrjük, és a csapadékot többször
átmossuk vízzel. Végül a szűrőpapíron összegyűlt csapadékot (kb. 2,7 g) vákuum alatt 1–2 percig szárítjuk.
2. Nukleoproteidek azúrkék festése
Fénymikroszkópos festéses
módszerek
144 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A festéket mindig frissen kell készíteni. A tiazin típusú festékek közül elterjedt az azúr-A, de helyette az azúr-B,
toluidin kék is megfelel. A mintát a növényi szövetből ugyanúgy nyerjük, mint az előző festésnél.
a. 0,1 g azúr-A festéket 100 ml 2-metoxi-etanolban feloldunk. Ebből 18 részt (cseppet) veszünk, ehhez
hozzáadunk 2 rész (csepp) 0,2 M Na2HPO4-ot, és összekeverjük.
b. Ezt követően az előzőekben leírt Calcomine orange–Luxol brilliant green BL (O–G festés) festésnél leírtak
szerint járunk el, ha epidermisznyúzattal dolgozunk.
2.1.
2.1.1.
2.1.1.1.
2.1.1.1.1. Vastagabb szövetdarabok festése
a. Eltávolítjuk az epidermiszt, és levéldarabkákat vágunk.
b. A szövetet 30 percre 100%-os 2-metoxi-etanolba helyezzük, hogy kivonjuk a mintánkból a klorofillt.
c. Megfestjük azúr-A-val (10–15 perc).
d. 95%-os etanolban mossuk (10–15 perc).
e. 15–30 percen át egy lefedett edényben 2-metoxi-etilacetátban áztatjuk, hogy a festékfeleslegtől
megszabaduljunk.
f. A mintát tárgylemezre rögzítjük, majd megvizsgáljuk.
Megjegyzés: Ha ezen a módon nem sikerül a festés (mint a tobamovirusok esetében), akkor az eljárás végén,
amikor a szövetdarab már a tárgylemezen van és fedőlemezzel lefedtük, 1–2 percig melegítsük 60 °C-on.
145 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
12. fejezet - A vírusok izolálása és tisztítása
A vírusokról szerzett ismereteink lényegesen gazdagodtak, amióta lehetővé vált a virionok tisztítása, és ezáltal
fizikai és kémiai szerkezetük feltárása. A tisztítási és elválasztási módszerek tökéletesedésével magas
tisztaságfokú és jelentékeny mennyiségű anyagot lehetett a biofizikai és biokémiai vizsgálatok számára
előállítani és a vírusszerológia számára alkalmassá tenni. Az izolálásra és tisztításra általános módszer nincsen,
hiszen az alkalmazott eljárás minden esetben a vírusbeteg növénytől, a víruskoncentrációtól és elsődlegesen a
kórokozó fizikai és kémiai tulajdonságaitól függ. Mindezek ellenére vannak olyan alapvető eljárások és
módszerek, amelyeket részleteiben ugyan módosítva, de minden vírus tisztításánál alkalmazhatunk (Dijkstra és
De Jager, 1998; Foster és Taylor, 1998).
1. A virionok tisztítása fertőzött növényekből
A vírusok tisztítása elsősorban a virionok elkülönítését jelenti a növény más anyagaitól, míg más értelemben, pl.
az osztott genomú (multikomponens) vagy a szatellit vírusok esetén az egyes viriontípusok elválasztását is
jelenti. Nyilvánvaló, hogy első lépésként a tiszta, azaz a más vírusokat nem tartalmazó izolátumot a megfelelő
körülmények megválasztásával fel kell szaporítani a számára legkedvezőbb (azaz a legnagyobb
víruskoncentrációt biztosító) gazdanövényben. Ezt követi a növény sejtjeinek feltárása, a virionok kivonása,
extrahálása. A feltárt vírusszuszpenziót több lépésben meg kell tisztítani a durva és a finomabb
sejtalkotórészektől, és tömény állapotba kell hozni, azaz koncentrálni kell. Az így kapott vírusoldat további
tisztítása elsősorban a virionok és a hozzájuk molekulatömegben és alakban hasonló anyagok különválasztását,
vagy az egyes víruskomponensek elválasztását jelenti. A tisztítási folyamat végén a virionok tisztaságát és
töménységét kell ellenőrizni és tárolásra alkalmassá tenni.
1.1. A vírusok biológiai tisztasága
A fertőzött növények az esetek nagy részében más vírusokkal vagy ugyanazon vírus eltérő törzseivel is
fertőzöttek lehetnek. Alapvető követelmény, hogy a tisztításra váró anyag idegen kórokozót ne tartalmazzon. A
biológiai tisztaságot a gazdanövénykör ismeretében olyan differenciáló vagy szeparáló (elválasztó) növényekkel
biztosíthatjuk, amelyek csak a számunkra kiválasztott vírus gazdanövényei. A víruselválasztás egyes esetekben
akár bonyolult rendszert is jelent, amelynek eredményeképp egy komplex fertőzés összetevői biztosan
elkülöníthetők (lásd A vírusok differenciálása tesztnövényekkel c. fejezetet). A biológiai tisztaság legfontosabb
követelménye a genetikai azonosság. A növényekből izolált vírusok általában genetikailag nem teljesen azonos
populációt képviselnek, bennük eltérő törzsek, szerotípusok vagy mutánsok is előfordulhatnak. Megközelítő
tisztaságú izolátumhoz úgy juthatunk, ha egy lokális gazdanövényt mechanikai módszerrel úgy inokulálunk,
hogy csak kevés lézió fejlődjön ki. Egyetlen léziót (ami nagy valószínűséggel homogén populációt képvisel)
kiválasztunk, és abból kiindulva új lokális gazdanövényt fertőzünk, majd ennek egyetlen léziójából kezdjük el
az izolátum felszaporítását egy fogékony gazdanövényben. Egyléziós kultúra kialakítására nem minden esetben
nyílik lehetőség. Egyes esetekben a fajlagos vektorátvitel nyújt lehetőséget a más kórokozóktól való
elkülönítésre. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) például könnyen tisztítható
más, mechanikailag átvihető vírusoktól, ha az izoláláshoz tripsz vektort használunk. Hasonló lehetőség
kínálkozik a levéltetvekkel terjedő vírusok elválasztására is olyan komplexekből, amelyek többi tagjai
levéltetvekkel nem vihetők át, vagy eltérő levéltetű-átviteli módszerrel (cirkulatív vagy nem-perzisztens
módszer) terjednek.
1.2. A vírusok felszaporítása fogékony növényben
A vírusokat tisztításra elegendő mennyiségben kell előállítani. E célra olyan fogékony gazdanövény a
legalkalmasabb, amelyben a lehető legnagyobb víruskoncentráció érhető el, gátló anyagokat (nyálkát,
inhibitorfehérjéket) vagy nagymennyiségű fenolt nem tartalmaz, ami a feltárás során oxidálódva a labilisabb
vírusokat inaktiválja. A növény levelei lehetőség szerint laza szerkezetűek, vízben gazdagok legyenek.
Ellenkező esetben a kivonó oldattal többszöri feltárást kell végezni. Az esetek többségében a legnagyobb
víruskoncentrációt a növények fiatal csúcsi levelei biztosítják. Ha csak lokális gazdanövények állnak
rendelkezésre [például a dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) esetében], akkor a tisztításhoz
lényegesen nagyobb mennyiségű növényi anyagra van szükség (62. ábra).
A vírusok izolálása és tisztítása
146 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
62. ábra - A dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus) lokális tünetei
Nicotiana knightiana (A) és Solanum capsicastrum (B) növények levelein [Horváth
József szívessége folytán]
Lényeges szempont a vírusfelszaporítás körülményeinek jó megválasztása. A felszaporítás céljaira használt
növény folyamatos növekedésű, harmonikus tápanyag-ellátottságú legyen. A magasabb szintű nitrogénellátás
többnyire kedvez a nagyobb víruskoncentráció elérésének. Az alacsony hőmérséklet általában nem segíti a
vírusok replikációját, s hasonlóképpen kerülni kell az igen magas üvegházi hőmérsékleteket is; mindkettő
megváltoztathatja a gazdanövény reakciótípusát vagy mutációkhoz vezethet. Az árnyékolás, különösen nyáron,
kedvező hatású, a víruskoncentráció nagyobb lesz, a lazább levélszerkezet pedig a feltárást segíti.
A felszaporításhoz legmegfelelőbb a 20–25 °C hőmérséklet, amelyet ellenőrzött körülmények között legjobban
klímakamrákban biztosíthatunk. A felszaporított növényi anyag vírustisztításra akkor a legalkalmasabb, ha a
víruskoncentráció a legnagyobb értéket éri el. Ennek ideje a gazda–vírus kapcsolattól függ, de általában a
tünetek teljes kifejlődésével esik egybe. Tisztításra legalkalmasabbak a levelek, de egyedi esetekben a
gyökerekből is történhet. A floémben lokalizálódó sárgaság típusú vírusok (luteovirusok) tisztításához
elsősorban a levélereket használják.
A frissen összegyűjtött növények a legmegfelelőbbek a tisztításra. A hűtőszekrényben vagy fagyasztóládában
történő tárolás lényegesen rontja a hatékonyságot, különösen labilis szerkezetű vírusoknál. A szisztemikus
gazdanövény víruskoncentrációját vagy a tisztítás egyes lépéseinek hatékonyságát lokális gazdanövények
inokulációival folyamatosan ellenőrizhetjük.
1.3. A feltárás és kivonás körülményei
A tisztításhoz olyan kíméletes eljárással kell a gazdanövény sejtjeit elroncsolni, hogy a virionok ne
inaktiválódjanak, vagy ne denaturálódjanak. A feltárás történhet kis mennyiség esetén porcelán dörzsmozsárban,
míg nagyobb tömegű anyag esetén általában késes homogenizálást alkalmazunk. A feltáráshoz feleslegben adott
kivonó puffert használunk, amelynek összetétele a tisztítandó vírustól függ. Az oxidációs és más
enzimfolyamatok visszaszorítása érdekében a feltárást alacsony (0–4 °C) hőmérsékleten kell végezni, amit jeges
fürdővel, hűtött eszközökkel, illetve hideg szobában történő munkával érhetünk el. Egyes esetekben ajánlott a
folyékony nitrogénben történő feltárás is.
A kivonó puffer kiválasztása a legfontosabb, hiszen ennek kémhatása a vírus stabilitása szempontjából döntő.
Leggyakrabban 7,0 pH körüli, enyhén lúgos kémhatású puffereket használunk, de egyes virionok [például a
rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus)] csak savas közegben tárhatók fel. A túlságosan lúgos
A vírusok izolálása és tisztítása
147 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
közegben ugyanis a nukleinsavak és a fehérjék közötti kötés fellazul, a virionok felduzzadnak, szétesnek. Az
ionerősség megválasztása is a tisztítandó vírustól függ, általában ez 0,1–0,2 M közötti érték.
Adalékanyagokat használhatunk a virionok stabilitásának növelésére (Ca++), a fenoloxidáció elkerülésére
(koffein, nikotin szulfát, polivinil-pirrolidon), más oxidatív folyamatok ellensúlyozására (aszkorbinsav, cisztein,
tioglikolsav, dietil-ditiokarbamát), és a fehérje- vagy a nukleinsavbontó enzimek gátlására (proteináz-
inhibítorok, bentonit). A szállítószövetekben felhalmozódott, nehezen feltárható vírusok esetében sejtfalbontó
enzimekkel (maceráz, pektináz) növelhetjük a kitermelés hatékonyságát.
1.4. A vírusoldat szűrése
A vírusokat tartalmazó nyers növényi szövetnedv tisztításában az első lépés a szűrés. Géz, tüllháló (cheesecloth)
igen alkalmas a legdurvább sejtmaradványok, rostok eltávolítására, bár a felületük sok viriont is megköthet.
Alacsony koncentráció esetén a szűréskor visszamaradt rostokat még egyszer feltárhatjuk a kivonó pufferrel.
1.5. A vírusok elválasztása más sejtalkotórészektől
A tisztítás lényege, hogy a szövetkivonatot lehetőség szerint minden, vírustól idegen szennyeződéstől, a lehető
legkevesebb veszteséggel megtisztítsuk. A sötétzöld, zavaros szűrt nyers présnedv sok alakos elemet
(kloroplasztiszt, sejtmagvakat, sejtfaldarabokat, a vakuólum zárványait, keményítőt stb.) tartalmaz. Alacsony
fordulatú centrifugálással (5–6000 ford/perc) viszonylag rövid idő alatt a durvább és a nehezebb alakos elemek
eltávolíthatók. Szerves oldószereket (kloroform, kloroform és butanol keveréke, széntetraklorid) tanácsos a
centrifugálás előtt a présnedvhez adni, azzal jól összerázni, majd hűtés mellett állandóan keverni. Az apoláros
szerves oldószerek a lipoproteideket és a klorofill nagy részét összegyűjtik. Ezeket az oldószereket néha már a
feltárásnál is használjuk. A centrifugálás az emulziót elválasztja vizes és oldószeres fázisra, ez utóbbit
eltávolítva a virionokat tartalmazó felülúszó tisztább, enyhén opálos, halványzöld lesz. (A barna szín oxidált
fenolok jelenlétét jelzi, ajánlott ilyenkor redukáló szerek alkalmazása.) A szerves oldószeres tisztítást
természetesen azoknál a vírusoknál nem lehet alkalmazni, amelyeknek külső lipoproteid vagy glükoproteid
burkuk van (tospovirusok, rhabdovirusok). A szerves oldószerek alkalmazása esetenként tetemes veszteségeket
okozhat.
1.6. A növényi fehérjék elkülönítése
A nyers, egyszer centrifugált szövetnedv sok növényi fehérjét tartalmaz. Hőkezeléssel ezek közül sok
denaturálódik, kicsapódik, és így az oldatból alacsony fordulatszámú centrifugálással eltávolítható. Csak igen
stabil vírusok [például a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)] tisztításánál
alkalmazható a virionok károsodása nélkül. A hőkezeléshez hasonlóan a fagyasztás is alkalmas lehet a növényi
fehérjék koagulálására. A fagyasztás és újrafeloldás e célból célravezetőbb, mint az egyszeri fagyasztás, de
alkalmazása azzal a veszéllyel jár, hogy a tisztítandó vírus is inaktiválódik. A fehérjék kicsapása az oldat
kémhatásának csökkentésével is történhet. Alacsony (pH 5,0 körüli) értéknél sok fehérje kiválik. Izometrikus
vírusoknál ez bevált módszer, helikális vírusoknál [például a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic
tobamovirus)] nem.
Régebben a fehérjék kisózását gyakran használták tisztítási célra. Legelterjedtebb a 0,4%-os
ammóniumszulfátos kisózás, de a citoplazma és kloroplasztisz riboszómáinak elválasztására Ca++ és Mg++ sókat
is alkalmaznak. Derítéssel a tisztítandó oldatból számos olyan anyag (fenolok, inhibitorok, ribonukleázok, zöld
sejttörmelékek stb.) eltávolítható, ami a tisztítás folyamatát zavarja. E célra felületaktív anyagokat,
leggyakrabban faszénport, bentonitot, Celit-et (tisztított kovaföld), Ca-foszfát gélt, vagy DEAE cellulózt
használhatunk. Tekintettel arra, hogy az adszorpció a pH és az ionerősség függvénye, a derítés körülményeit
úgy kell megválasztani, hogy a virionok ne kötődjenek meg a felületen. A derítéshez használt anyagot szűréssel
vagy centrifugálással különíthetjük el. Derítésnek tekinthetjük azt az eljárást is, amikor az egészséges növény
fehérjéivel szemben termelt antiszérumot keverjük a tisztítandó oldathoz. Ez esetben a gazdanövény fehérjéi
specifikusan kicsapódnak a vírusoldatból.
1.7. A virionok elkülönítése és a vírusoldat töményítése
A szennyezőanyagoktól mentesített növényi szövetnedv nagy hígításban tartalmazza a virionokat, amelyeket az
oldattól el kell választani (izolálni), illetve a vírusoldatot be kell töményíteni. E célra leggyakrabban a vírusok
kémiai kicsapását vagy fizikai ülepítését (ultracentrifugálását) alkalmazzák.
A vírusok izolálása és tisztítása
148 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A kémiai kicsapás lényege azonos a növényi fehérjéknél alkalmazott módszerrel. Izoelektromos pontjuk
közelében a virionok (nukleoproteidek) kicsaphatók, pl. a pH megváltoztatásával, extrém (3–5 pH) értékeken. A
kicsapódott virionok centrifugálással gyűjthetők össze. A módszer hátránya, hogy csak a vírus fizikai
tulajdonságainak teljes ismeretében biztonságos, az irreverzíbilis hatások miatt. A kicsapásra ezért inkább
nagyobb koncentrációjú sóoldatokat – leggyakrabban ammóniumszulfátot – használnak. Az első kisózásnál
(20%) a növényi fehérjék nagy része kicsapódik a virionok viszont nem. A centrifugálás után a felülúszó
sókoncentrációját növelve (40%) már a vírusok nagy része kicsapódik a virion inaktiválódása nélkül. A
kicsapást lassan, fokozatosan, kevergetés közben, hidegen kell végezni. A művelethez kristályos sót vagy
tömény oldatot egyaránt használhatunk. A virionok kíméletes kicsapását az igen elterjedt (szintén több lépcsős)
polietilén-glikolos (Mt 6000) kezeléssel érhetjük el. Ez esetben a virionok hidrátburkukat vesztve ülepíthetők ki
az oldatból, ami a kémiai kicsapáshoz hasonló folyamat.
A fizikai elválasztási módszerek közül az ultraszűrésnek, a mozgó határfelületű elektroforézisnek vagy
ioncserélő és adszorbciós oszlopon történő elválasztásának alárendelt jelentősége van. A leggyakoribb és
legeredményesebb a virionok ultracentrifugással történő ülepítése. A nagy (40 000 ford/perc feletti)
fordulatszámú szögfejes ultracentrifugákban a virionok mintegy két óra alatt a cső aljára ülepíthetők. Az
ülepítést feloldás (szuszpendálás) követi, általában 1/10, vagy 1/5-rész pufferben. Az oldásra használt puffer
gyakran azonos a kivonó pufferrel, ionerőssége azonban lényegesen kisebb, gyakran tartalmaz virionokat
stabilizáló Ca- vagy Mg-ionokat. Lényeges, hogy a csapadék oldása lassan (akár egy éjszakán keresztül)
történjen, a teljes oldódásig. Az oldhatatlan maradékot kis fordulatszámú centrifugálással különíthetjük el.
Gyakran az ultracentrifugálás és a kis fordulatszámú centrifugálás lépéseit megismételve magas tisztaságfokú
(opálos) vírusoldatot (szuszpenziót) kapunk. Az ultracentrifugálás többórás ideje alatt a fehérje- és
nukleinsavbontó enzimek károsítanak, ezért az alacsony hőmérsékletet tartósan biztosítani kell, a feloldásra
használt puffert célszerű sterilezni.
A hosszabb, helikális vírusok (potyvirusok) virionjai sérülékenyek, az ultracentrifugálás alatt eltörhetnek.
Kíméletes ülepítési mód, ha a centrifugacsövek aljára pufferben oldott, töményebb „cukorpárna”-réteget
teszünk, ami lassítja a virionok ülepedését.
A vírusok tisztításában döntő fordulatot jelentett a kilendülőfejes centrifugák és a lineáris cukorsűrűség-
gradiensek alkalmazása. Ezekben a centrifugákban a gravitációs erő hatására a virionok a centrifugacső azonos
magasságaiban koncentráltan, ülepedési állandójuknak megfelelően, egy zónában helyezkednek el. Ha az
ülepítéshez cukorsűrűség-gradiens oldatot használunk, a virionok egyre töményebb oldattal találják szembe
magukat, ülepedésük lelassul, leáll. A centrifugálás befejezése után a vírusokat tartalmazó zónák egymástól
elválnak. Kellő töménység esetén az egyes frakciók felső megvilágítással, sötét háttérben jól láthatók.
A nukleoproteid tartalmú frakciók a centrifugacső injekcióstűvel történő megcsapolásával, vagy UV-detektorral
ellátott frakciószedő géppel összegyűjthetők. Az ülepedési állandók különbözősége alapján a multikomponens-
vírusok azonos nagyságú, de eltérő tömegű virionjai egymástól elkülöníthetők, frakcionálhatók.
A cukorsűrűséggradiens-centrifugálás terméke a virionokat tartalmazó sűrű cukoroldat. Az oldatot újból
szögfejes ultracentrifugában ülepíthetjük. Híg pufferoldattal szemben dializálva a cukor eltávolítható, polietilén-
glikollal (Mt 20000) szemben végzett fordított dialízissel töményíthető. Az egyes frakciók pontosabb
elkülönítését teszi lehetővé a cézium-kloridos (CsCl2-os), borkősavas vagy nátrium-bromidos gradiens-
centrifugálás.
1.8. A tisztított vírusoldat minőségi ellenőrzése, eltartása
A vírusok fizikai jellemzői közül a vírustisztítás szempontjából a legfontosabb az ülepítési állandó
(szedimentációs koefficiens), amely a részecskék adott gravitációs térben történő ülepedési idejét jelzi. Egysége
a Svedberg (1S = 1 × 10–13 cm s–1 dyn–1 = 0,1 ps, picosecundum), amit analitikai ultracentrifugában kísérletesen
határoztak meg. Mértékét befolyásolja a virionok nagysága, alakja és sűrűsége, a közeg viszkozitása. Értéke 50S
[szatellit dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis satellivirus)] és 1000 S (rhabdovirusok) között van. Az
ülepedési állandó ismeretében lehet megszabni az ultracentrifugálás idejét és az alkalmazott fordulatszámot.
A tisztított vírusoldat elvileg csak nukleoproteinből áll. A víruskoncentrációt UV-fényben állapítják meg, az
oldat 220 és 300 nm közötti fényelnyelése (optikai denzitása, extinkció) alapján. Az extinkciós együttható
(extinkciós koefficiens) egységnyi töménységű vírusoldatban mért, a vírusra jellemző (általában 2 és 10 közötti)
érték (1 mg/ml vírusoldat 1 cm fényútnál mért extinkciója 260 nm hullámhosszon). A vírusok UV-abszorpciós
spektruma nem vírusspecifikus, de jelzi a készítmény tisztaságát (63. ábra). A virionoldatok általában 260 nm
közelében mutatnak abszorpciós maximumot, míg a minimumérték 240 nm-nél észlelhető.
A vírusok izolálása és tisztítása
149 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
63. ábra - A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a belőle izolált fehérje és
nukleinsav abszorpciós spektruma [Francki és McLean, 1968 után]
A fehérjék adszorpciós maximuma 280 nm-nél van (A280), a nukleinsavaknál a legnagyobb érték 260 nm-nél
mérhető (A260). A két érték hányadosa (A280/A260) alapján következtethetünk a nukleinsav-tartalomra.
Csak stabil vírusok tarthatók hűtőszekrényben hosszabb ideig. Tartósítószerként mertiolátot vagy nátriumazidot
is alkalmaznak, utóbbi azonban a szerológiai reakciókat zavarhatja. A tisztított vírus tartósítására használt
puffert az adott helyzetnek megfelelően kell kiválasztani. Jó tárolást biztosít a fagyasztás és –20 °C-on való
tárolás is, azonban a többszörös felengedés és fagyasztás tönkreteszi a virionokat. Egyes vírusok 50% glicerin
hozzáadásával tartósíthatók. A tisztított vírusok legjobban folyékony nitrogénben vagy liofilezve tárolhatók.
Megjegyzés: A könyvben csak néhány víruscsoportra jellemző vírus tisztítása szerepel példaként. A virológiai
irodalom azonban tisztítási módszerekben gazdag, célszerű az adott vírus tisztítása előtt ezekről tájékozódni. A
legtöbb ismert vírus tisztítására útmutatást találunk Murrant és Harrison (1970–1988) C.M.I./A.A.B.
Descriptions of Plant Viruses című sorozatában, továbbá Dijkstra és De Jager (1998), valamint Foster és Taylor
(1998) vírusdiagnosztikai könyvében. Magyarul először a burgonya M-vírus (potato M carlavirus) tisztításáról
jelent meg közlemény (Horváth, 1972), majd ezt követően Balázs és Vassányi (1984) számolt be mintegy
harminc vírus tisztítási módszereiről.
Stabil, egykomponensű RNS-vírus egyszerű tisztítása (Gooding és Hebert, 1967)
A stabil, egykomponensű vírusok közül a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) a legismertebb
növénypatogén kórokozó. A fogékony dohánynövényekben nagy koncentrációban, parakristályos formában van
jelen. A tisztításra legalkalmasabbak a fiatal, mozaikos felső levelek. Merev, pálcika alakú virionjai 300 nm
A vírusok izolálása és tisztítása
150 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
hosszúak és 18 nm vastagok. 95% fehérje és 5% (egyszálú, pozitív) ribonukleinsav alkotja. Tisztítás során a
virionok gyakran aggregálódnak. A vírus tisztításának egyes lépései a következők:
a. A frissen leszedett vagy fagyasztott leveleket késes homogenálóban (Waring blendor) feltárjuk. A feltáráshoz
125 g levelet és vele azonos mennyiségű (125 ml) kivonó (extrakciós) puffert (0,25 M Na2HPO4 és 5 mM
Na2EDTA), 1 g aszkorbinsavat és 1 ml 2-merkaptoetanolt adunk.
b. A kivonatot 25 ml kloroformmal emulgeáljuk, jól összekeverjük, majd az elegyet durva szűrőpapíron, tüll-
vagy nejlonszöveten átszűrjük.
c. A szűrletet centrifugálással (10 perc, 10 000 g) tisztítjuk, a felülúszót durva szűrőpapíron szűrjük át.
d. 80 ml szűrlethez 10 ml 5 M NaCl-t és 10 ml 30%-os PEG-et (0,02 g Na-azidot tartalmazó 30%-os polietilén-
glikol 6000) adunk kis adagokban, majd az oldatot 20 percig lassan kevertetjük.
e. A kicsapódott vírusokat 10 perces centrifugálással (10 000 g) ülepítjük. A felülúszót elöntjük, az üledéket 10
ml oldó pufferben (hígított NaOH-val pH 7,6-ra állított 2 mM Na2EDTA) feloldjuk. Az oldathoz 3 ml
kloroformot adunk.
f. Centrifugálással (3 perc, 10 000 g) a fázisokat elválasztjuk, a felső, vizes fázist Pasteur-pipettával
összegyűjtjük, a kloroformos fázist elöntjük.
g. A tisztított vírusoldatot 1 órán át 150 000 g-vel ultracentrifugáljuk. A felülúszót elöntjük.
h. A csapadékot az oldó pufferrel (e pont) feloldjuk, majd alacsony fordulatszám mellett centrifugáljuk (10
perc, 15 000 g).
i. A tisztított vírusoldatot ultracentrifugában (1 óra, 150 000 g) újra ülepítjük.
j. Az üledéket az oldó pufferben feloldjuk, mintegy 20 mg/ml töménységben.
Megjegyzés: A tisztított vírusoldat (1 mg/cm3) fajlagos fényelnyelése (abszorpciója) E260 = 3,0. Tároláskor a
hűtőszekrényben lassan aggregálódik, ami a biológiai (RNS) vagy a szerológiai tulajdonságokra (fehérje) nincs
hatással. 5% etilén-glikol jelenlétében –70 °C-on jól eltartható.
Bomlékony, egykomponensű RNS-vírus tisztítása (López-Moya, 1993)
A bomlékony egykomponensű RNS-vírusok közül a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) az egyik gazdasági
szempontból legfontosabb kórokozó. Helikális, hajlékony, fonál alakú virionjai mintegy 700 nm hosszúak,
törékenyek. A feltárás során elsősorban a szerológiai tulajdonságokat meghatározó köpenyfehérje (CP) N-végi
szakaszai károsodnak, amelyek a virion külső részein helyezkednek el. A kíméletes feltárás érdekében
proteinázkeveréket (cocktail) alkalmazva a CP különlegesen labilis része nem károsodik, megőrzi eredeti
szerológiai tulajdonságait. A vírustisztítás lépései a következők:
a. Mintegy 100 g fertőzött, fiatal levelet (Nicotiana benthamiana vagy N. clevelandii) kétszeres mennyiségű
proteáz inhibitor „coctail”-t [(1 mM fenolmetil-szulfonil-urea (MSF), 2 mM EDTA és 20 mM Na-jódacetát)]
tartalmazó pufferben, késes homogenálóban hidegen feltárjuk. A 0,18 M McIlvain-puffer (pH 7) 0,25%
tioglikolsavat, 0,01 M Na-DIECA-t és 0,5 M ureát tartalmaz. A feltáráshoz egyharmad térfogat (30 ml)
kloroformot adunk.
b. Szűrés után a növényi nedvet alacsony fordulatszámú centrifugában (Sorvall GSA) 10 percig (6000
ford/perc) ülepítjük.
c. A felülúszót T 30 rotorban (Beckman) 90 percig ultracentrifugáljuk (25 000 ford/perc) 4 °C-on.
d. A kiülepedett vírusokat (0,2% 2-merkapto etanolt és 1,0 M ureát tartalmazó) 0,01 M citrát-foszfát-pufferrel
(pH 7,0) hidegen, minimum két órán keresztül szuszpendáljuk, a kiindulási súly negyedének megfelelő (25
ml) mennyiségű pufferben.
e. A vírusszuszpenziót 10 percig centrifugáljuk (6000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.
f. A felülúszót Ti 50 rotorban (Beckman) 90 percig (25 000 ford/perc) hidegen ultracentrifugálva a virionokat
kiülepítjük.
A vírusok izolálása és tisztítása
151 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
g. A csapadékot egy éjszakán keresztül tized térfogat (10 ml) (0,01 M Na2EDTA-t tartalmazó) 0,1 M borát-
pufferrel (pH 7,0) oldjuk.
h. A vírusszuszpenziót 10 percig centrifugáljuk (10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.
i. A virionokat ultracentrifugálással ülepítjük (Beckman Ti 50 rotor, 25 000 ford/perc, 3 óra).
j. Az összegyűjtött virionokat 1 ml 50 mM-os borát-pufferben (pH 8,2) oldjuk. A spektrofotometriás méréshez
mintegy 50-szeres hígítást használunk. E260 = 2,4.
Többkomponensű, ill. multikomponens-vírusok tisztítása (Lane, 1986)
A többkomponensű rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) fogékony gazdanövényeiben (árpa, búza)
nagy koncentrációban fordul elő. A víruskoncentráció a fertőzés után egy-két héttel a legnagyobb. A 30 nm
átmérőjű izometrikus virionok 20% nukleinsavat tartalmaznak. A tisztított vírus osztott genomú, négy
komponense van. Az azonos nagyságú, de eltérő nukleinsav-tartalmú virionok a tisztítás után cukorgradiens-
centrifugálással elkülöníthetők. A vírustisztítás lépései a következők:
a. A fertőzött szöveteket azonos mennyiségű kivonó pufferrel (0,5 M Na-acetát, 0,8 M ecetsav) késes
homogenálóban (Waring blendor) homogenáljuk.
b. A kivonattal és kloroformmal (0,2 ml/g szövet) emulziót készítünk, az oldatot összerázzuk.
c. Alacsony fordulaton centrifugáljuk (10 perc, 5 000 g).
d. A felülúszót durva szűrőpapíron átszűrjük, majd állandó kevergetés közben (harminc percig) 1/4 rész 30%-os
PEG-et (30% polietilén-glikol 6 000 és 0,02% NaN2) adunk hozzá. Erős kicsapódás látható.
e. A kicsapódott vírusokat 10 perces centrifugálással (5 000 g) összegyűjtjük. A felülúszót kiöntjük.
f. A csapadékot az eredeti súlynak (g) megfelelő 0,2 ml mennyiségű desztillált vízzel oldjuk, és a folyadék
térfogatának megfelelő 0,4 rész kloroformmal emulgeáljuk.
g. Öt perces centrifugálás után (5 000 g) a felülúszóhoz újra 1/4 térfogatnyi, 30%-os polietilén-glikolt (PEG) és
1/20 térfogatnyi 5 M NaCl-t adunk, állandó keverés (30 perc) közben.
h. Centrifugálás (10 perc, 5 000 g) után a felülúszót elöntjük.
i. A csapadékot az eredeti súlynak (g) megfelelően grammonként 0,2 ml acetát-pufferben (0,05 M Na-acetát,
0,01 M ecetsav, 1 mM Na2EDTA, 1 mM MgCl2) oldjuk.
Megjegyzés: A rozsnok mozaik vírus fajlagos abszorpciója E260 = 5 mg. A kitermelés kb. 1 mg/g szövet. Az
oldat –70 °C-on fagyasztva (5% etilén-glikol hozzáadásával) tartható el a legjobban. A módszer alkalmas más
izometrikus vírusok [lóbab foltosság vírus (broad bean mottle bromovirus), tehénborsó klorotikus tarkulás vírus
(cowpea chlorotic mottle bromovirus), tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)]
tisztítására is.
DNS-vírus tisztítása (Guilfoyle, 1986)
A DNS-genomú vírusok legismertebb képviselője a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus). Az
izometrikus virionok 50 nm átmérőjűek. A köpenyfehérje 42 kD, a kétszálú, kör alakú DNS mintegy 8 kilobázis
(kb) nagyságú. A gazdanövényköre szűk. A felszaporításra leggyakrabban a tarlórépát (Brassica rapa cv. Just
Right) használják. Az inokulációt követő 1-2 hét a legalkalmasabb a vírustisztításra. A víruskoncentráció a
fiatal, tüneteket mutató levelek sejtjeiben (citoplazmában) a legnagyobb, ahol zárványtestekben (inklúziók
formájában) fordul elő. A tisztítás sikere rendszerint a zárványtestek feltárásától függ. A tisztítás 2–4 °C-on
történik.
a. A fertőzött szöveteket folyékony nitrogénben, dörzsmozsárban vagy acélköpenyes Waring blendorban
elporítjuk. Kioldás után a szöveteket a nyers súlynak megfelelő térfogatú, 0,75% nátriumszulfitot tartalmazó,
0,5 M foszfát-pufferrel (pH 7,2) feltárjuk, majd magas fordulaton tovább homogenáljuk még egy percig.
b. A homogenátumot nyolc réteg tüllhálón és egy réteg nejlonszűrőn (Miracloth, Calbiochem) átszűrjük.
A vírusok izolálása és tisztítása
152 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
c. A szűrlethez Triton X-100-at (2,5% koncentrációig) és 1 M ureát adunk, majd a szövetnedvet 10–16 órán
keresztül keverjük. Az oldathoz az enzimfolyamatok gátlására proteáz inhibitor PMSF-et (fenilmetil-
szulfonilurea) adhatunk.
d. A kivonatot centrifugálással (7 000 g, 10 perc) tisztítjuk meg a durva szennyeződésektől. Az üledéket
eltávolítjuk.
e. A felülúszó ultracentrifugálásával (40 000 rpm, 1 óra, 45-Ti Beckman-rotorban) a virionok kiülepíthetők.
f. A vírusokat is tartalmazó üledéket 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1mM EDTA és 2,5% Triton X-100 pufferrel
feloldjuk.
g. A szuszpenziót a durva szennyezésektől centrifugálással (7000 g, 10 perc) tisztítjuk meg, a virionok a
felülúszóban maradnak.
h. Újabb ultracentrifugálással (lásd e pont) a virionok újra kiülepíthetők.
i. A csapadékot ionmentesített vízben oldjuk, 36% céziumklorid hozzáadása után 16–24 óráig 35 000
fordulaton 75-Ti Beckman-rotorban centrifugáljuk.
j. A centrifugálás után a virionok határozott opaleszkáló réteget mutatnak a gradiens közepe táján, amit
frakciószedővel vagy a centrifugacső lékelésével összegyűjtünk.
k. A tisztított vírusoldatot dialízissel sómentesítjük 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 1 mM EDTA és 150 mM NaCl
ellenében 24 órán keresztül, a dializáló oldat többszöri cseréjével. A cézium-klorid-gradiens helyett
cukorgradiens is használható.
Megjegyzés: A kitermelés 1–10 mg vírus/kg levél.
Glükoproteid burkú vírus tisztítása (Tas et al., 1977)
A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) az állatpatogén vírusokkal rokon. A
növénypatogén vírusok nagy részétől egyrészt a glükoproteid burok megléte, másrészt a multikomponens RNS-
genom kettős, részben pozitív, és részben negatív jellege (ambiszenz polaritás) különbözteti meg. A 70–100 nm
átmérőjű, változékony, majdnem szférikus virionok nagyon bomlékonyak, a membránburok lipofil jellege
kizárja a poláros oldószerek használatát, a tisztítást állandóan alacsony hőmérsékleten (3 °C-on) kell végezni.
a. 60–100 g fertőzött (Nicotiana rustica, vagy N. benthamiana) levelet vákuumban infiltrálunk 0,01 M Tris,
0,01 M nátrium-szulfit és 0,1% cisztein-hidroklorid (pH 8,0) extrakciós pufferrel. A leveleket Waring
Blendorban homogenáljuk alacsony fordulaton 30 másodpercig.
b. A szövetnedvet gézen átszűrjük, centrifugáljuk (10 perc, 10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk. Az
üledék is sok vírust tartalmaz, ezért nem dobjuk el, hanem újra feltárjuk.
c. A centrifugálás üledékét 200 ml szuszpenziós pufferrel (0,01M glicin, 0,1% cisztein-hidroklorid és 0,1 Na-
szulfit, pH 7,9) oldjuk, és 1–2 órán keresztül állni hagyjuk.
d. A harmadik kivonatot újra centrifugáljuk (10 perc, 10 000 ford/perc), a felülúszót megtartjuk.
e. Az első (b pont) és a második centrifugálás (d pont) felülúszóit elkülönítve ultracentrifugáljuk (30 perc, 25
000 ford/perc, Spinco R30 rotorban), a virionokat kiülepítjük.
f. Az üledéket 20 ml szuszpendáló pufferben (c pont) oldjuk, majd a tisztított szövetnedvhez 0,2–0,4 ml
egészséges növény (N. rustica vagy N. benthamiana) fehérjéivel szemben készített antiszérumot adunk, a
szövetnedvet állni hagyjuk egy órára.
g. A fehérjeprecipitátumot centrifugálással (10 perc, 10 000 ford/perc) eltávolítjuk, a felülúszót megtartjuk.
h. A felülúszót 6 ml-es adagokban szuszpenziós pufferben készített 3–30%-os cukorsűrűség-gradiens tetejére
rétegezzük, majd kilendülőfejes centrifugában (23 000 ford/perc, 45 perc, SW 25 Spinco rotor) ülepítjük.
i. A vírustartalmú zónát összegyűjtjük, majd 25–50% cukorsűrűség-gradiensben újra 5–16 órán keresztül
ultracentrifugáljuk (23 000 ford/perc).
A vírusok izolálása és tisztítása
153 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
j. A virionokat szuszpenziós pufferrel hígítjuk, majd az oldatot 30 000 ford/perc fordulaton 1 órán keresztül
ultracentrifugálva koncentráljuk.
Megjegyzés: A kitermelés 1 mg/100 g szövet. A tospovirusokhoz tartozó vírusok [Impatiens nekrotikus
foltosság vírus (Impatiens necrotic spot tospovirus), földimogyoró gyűrűsfoltosság vírus (groundnut ringspot
tospovirus), paradicsom klorotikus foltosság vírus (tomato chlorotic spot tospovirus)] tisztítására Feldhoff et al.
(1996) dolgoztak ki új módszert. Az extrakciós puffer 0,1 M Na2SO3-at tartalmazó 0,1 M foszfát-puffer (pH 6), a
szuszpenziós puffer tizedannyi töménységű. Az ultracentrifugálás 30 000 fordulatszámon történik harminc
percig, a cukorgradiens-centrifugálás 27 000 fordulatszámon, 2 órán át, 20–50%-os cukoroldatban. A végső
koncentrálás 1 órán keresztül tart, 50 000 ford/perc mellett.
2. A vírusfehérjék izolálása és tisztítása
Korábban a vírus-köpenyfehérje aminosavsorrendjének megismerése állt a vizsgálatok homlokterében, ma
azonban inkább a vírusgenom által kódolt összes fehérjék másodlagos és harmadlagos szerkezetének
megismerésén van a fő hangsúly, amelyek célja a virionok felépítésének és működésének tanulmányozása, az
antigénszerkezet megismerése. A továbbiakban csak a köpenyfehérje vizsgálatának főbb módszereit tárgyaljuk.
A vírusfehérjéket tisztított vírusokból izoláljuk. Általában a kivonásnak olyan módszereit kell alkalmazni, amely
megvédi a fehérjék természetes (natív) jellegét és nem vezet a térbeli szerkezet módosulásához. Az alkalmazott
módszer természetesen a vizsgálat céljától, és nem utolsósorban az adott vírus tulajdonságaitól függ. Az izolálás
első lépése a fehérjék és más alkotórészek (nukleinsav) közötti kötések megbontása, majd a nemkívánatos
szennyezőanyagok denaturálása és eltávolítása.
A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) köpenyfehérje-tisztítása hideg ecetsavas
módszerrel (Fraenkel-Conrat, 1957)
a. A vírus vizes oldatához (10–30 mg/ml) fokozatosan két térfogat hideg jégecetet adunk, az oldatot 30–60
percig állni hagyjuk, időszakonként felkeverjük.
b. Az oldatot centrifugálással (10 perc, 10 000 ford/perc) tisztítjuk meg a kicsapódott nukleinsavtól.
c. A felülúszót 2–3 napig dializáljuk desztillált vízzel, a víz többszöri cserélésével. A dialízis során a fehérje
kicsapódik, ahogy az oldat pH-ja az izoelektromos ponthoz közelít.
d. A kicsapódott fehérjéket centrifugálással összegyűjtjük, majd a fehérjét desztillált vízzel szuszpendáljuk. A
pH-értéket híg lúggal (NaOH) fokozatosan 8,0-ra emeljük, majd az oldatot egy éjszakára állni hagyjuk, hogy
a fehérje feloldódjék.
e. Az oldhatatlan anyagokat (emésztetlen virionok, denaturálódott fehérjék) ultra-centrifugálással (10 0000 g, 1
óra) eltávolítjuk.
Megjegyzés: A kitermelés a vírus összetételének megfelelően mintegy 95%-os. A módszer alkalmas más
tobamovirusok, valamint a tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus) és a dohány rattle
vírus (tobacco rattle tobravirus) köpenyfehérjéjének tisztítására is.
A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) köpenyfehérje-tisztítása hideg kalcium-kloridos
módszerrel (Yamazaki és Kaesberg, 1963)
Ismert, hogy a virionok magas sókoncentrációjú oldatban disszociálnak. A módszer alapja, hogy a kétértékű Ca-
ionok a virionban a fehérjék és nukleinsavak közötti kötést megbontják.
a. Dializáljuk a tisztított vírusoldatot 1 M CaCl2-oldatban (pH 6,3) 12 órán keresztül, 4 °C-on. Az oldat
opaleszkálóvá válik.
b. A precipitátumot (RNS) centrifugálással (2 500 g, 20 perc) eltávolítjuk és a tiszta, fehérjéket tartalmazó
felülúszót pufferrel szemben dializáljuk.
Megjegyzés: A módszer kis módosítással alkalmas egyéb vírusok [lóbab tarkulás vírus (broad bean mottle
bromovirus), az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), az árpa csíkos mozaik vírus (barley
stripe mosaic hordeivirus) és a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) (64. ábra)]
köpenyfehérjéjének tisztítására is. Más vírusok [(tehénborsó klorotikus foltosság vírus (cowpea chlorotic mottle
A vírusok izolálása és tisztítása
154 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
bromovirus), vad uborka mozaik vírus (wild cucumber mosaic tymovirus)] alkalikus közegben disszociálnak
(Tsugita és Hirashima, 1972).
64. ábra - A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) szisztemikus tünetei
néhány gazdanövényen. A: Ocimum viridae; B: Solanum marginatum; C: Viburnum
opulus [Horváth József szívessége folytán]
3. A vírusnukleinsavak kivonása és tisztítása
3.1. RNS-kivonás tisztított vírusszuszpenzióból
A vírusnukleinsavak (RNS vagy DNS) kivonása a vírus struktúrájának megbontása, roncsolása nélkül nem
lehetséges, ezért a nukleinsav-kivonás mindig bizonyos mértékű veszteséggel vagy a nukleinsavak
károsodásával jár. Az alkalmazott módszerek e veszteségek csökkentésére, illetve a nukleinsavak károsodásának
megakadályozására irányulnak. A virion szerkezetének megbontása természetesen nagymértékben függ az adott
vírus stabilitásától. A feltárás során a vírusnukleinsavak kémiai és biológiai épségét meg kell őrizni, óva
egyrészt a denaturáló hatásoktól (alacsony vagy magas pH), másrészt a nukleinsavbontó enzimektől. A legtöbb
nukleinsav-tisztítási módszer alapja a kétfázisú fenolos módszer, amely során detergenseket,
nukleázinhibitorokat, fémkelátképző anyagokat használnak. Az alkalmazott módszerek lényege, hogy a feltárás
minél rövidebb ideig tartson, és a fehérjéktől kétfázisú rendszerben a nukleinsavak elkülöníthetők legyenek. A
nukleinsav-tisztítás centrifugálással, alkoholos kicsapással vagy szilárd fázison történő megkötéssel történik
(Bruening, 1972).
3.1.1.
3.1.1.1. Feltárás fenolos extrakcióval
A nukleinsavak feltárására leggyakrabban vízzel telített fenolt használnak, ami további víz (puffer)
hozzáadásakor kétfázisú rendszert képez. A nukleinsavak nagy része a vizes fázisban marad, míg az opálos,
fenolos fázis többnyire a kicsapódott fehérjéket tartalmazza. A két rendszer alapos összerázása után a frakciók
egymástól centrifugálással elválaszthatók. Néha interfázis is kialakul, ami a fenolban nem oldott fehérjéket
tartalmazza. Alacsony sótartalom mellett, 60–65 °C-on, interfázis nem alakul ki. Ha a kirázáskor kloroformot
(kloroform és fenol 1:1 arányú keverékét) is használnak – ami javítja a tisztaságot –, akkor interfázis alakulhat
ki. Ez 1% izoamil-alkohollal javítható.
A fenolos módszer gyakran akár 50% RNS-kinyerési veszteséget okoz, amit javítani lehet azzal, ha a fenolhoz
krezolt keverünk. A vizes fázisból a nukleinsavak ultracentrifugálással kiülepíthetők. Ez az üledék azonban
vírusfehérjéket is tartalmaz. Az üledék oldása és detergenssel történő kezelése után magas tisztaságfokú
nukleinsavat nyerhetünk óvatos cukor- vagy céziumklorid-gradiens-centrifugálással. Ha a centrifugacsövek 1/4
részébe 25%-os cukoroldatot rétegezünk, a gyorsabban ülepedő nukleinsavak a sűrűbb cukorpárnába ülepednek,
míg a kisebb ülepedési sebességű fehérjék a felső részben maradnak.
A nukleinsavak kicsapásának ismert módszere a savas közegben (0,05–0,1 M kálium-acetát, pH 5) kétszeres
mennyiségű 95%-os alkohollal történő kicsapás 0 °C-on vagy 0 °C alatt. A kicsapott nukleinsav centrifugálással
(10 000 g, 15 perc) összegyűjthető. A tisztított nukleinsav biológiai állapotát a fertőzőképesség megmaradásával
ellenőrizhetjük (pl. lokális léziós gazdanövényeken).
A vírusok izolálása és tisztítása
155 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Megjegyzés: A fenol maró hatású, a bőrön nehezen gyógyuló égési sebeket okoz. Az eljárás során
védőszemüveg, gumikesztyű, köpeny használata kötelező. Fenolos extrakcióhoz üvegeszközöket használjunk.
Dohány mozaik vírus- (tobacco mosaic tobamovirus) RNS-kivonás fertőzött levelekből, fenolos
módszerrel (Schlegel, 1960)
a. A növényi anyagot súlyának megfelelő 4-szeres vagy többszörös mennyiségű, vízzel telített fenol és 1%
nátrium-pirofoszfát (Na4P2O4) 1:1 arányú keverékével homogenáljuk 5 percig, hűtött eszközökkel. (Az egész
kivonást ajánlott hideg szobában, 5 °C alatt végezni).
b. A kapott emulziót 5 percig 6 000 fordulaton centrifugáljuk.
c. A nukleinsavat tartalmazó vizes fázist 2-szeres vagy többszörös mennyiségű, vízzel telített fenollal újra
átrázzuk.
d. A vizes fázisból a fenolmaradékot éterrel távolítjuk el, háromszor ismételve a kirázást.
e. A nukleinsavakat 2 térfogatnyi hideg, 95%-os etanollal kicsapjuk.
f. Az alkoholos oldatot 5 percig centrifugáljuk (6 500 ford/perc).
g. A nukleinsavat tartalmazó csapadékot hideg, 1%-os K2HPO4-oldattal feloldjuk. (A fertőzőképesség
ellenőrzésére kontrollként az 1%-os K2HPO4-ban homogenált levélszöveteket használhatunk.)
Megjegyzés: A fenti módszer egyéb vírusok [lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), uborka mozaik
vírus (cucumber mosaic cucumovirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), dohány gyűrűsfoltosság vírus
(tobacco ringspot nepovirus) (65. ábra), dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis necrovirus), borsó enációs
mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus)] esetében is fertőzőképes nukleinsavat eredményezett.
65. ábra - Dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) tünetei. A: lokális
tünetek Datura gigantea növény levelén; B: szisztemikus szimptómák Tropaeolum
peregrinum növény levelén [Horváth József szívessége folytán]
Javított (kloroform-fenol) módszer nukleinsavak (RNS és DNS) kivonására tisztított oldatból
A vírusok izolálása és tisztítása
156 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
a. Egy rész konyhasóval telített fenolt fél térfogat vizes oldattal és egy térfogat kloroformmal Vortexben 10
percig keverünk, fél térfogatmintával (vírusszuszpenzió).
b. A két fázist 2 perces centrifugálással mikrocentrifugában elválasztjuk. A szerves fázis a 8-hidroxikinolintól
sárga színű, általában alul helyezkedik el. Ha a sókoncentráció magas, akkor a fázisok fordítva helyezkednek
el.
c. A vizes fázist összegyűjtjük és új csőbe tesszük. Ügyeljünk, hogy a vizes fázis interfázist és szerves oldószert
ne tartalmazzon.
d. A vizes fázist egy térfogat kloroformmal összerázzuk, majd az elegyet 2 perces centrifugálással
szétválasztjuk. A tiszta kloroformos fázis alul marad.
e. A vizes fázist tiszta kémcsőbe gyűjtjük.
f. A vizes fázishoz 1/10 térfogat 3 M Na-acetátot (pH 7) és 2,5 tf 95%-os etanolt adunk. Vortex-szel keverjük,
majd 10 percig jeges fürdőn állni hagyjuk. Kis mennyiségeknél a kicsapás egy éjszakán át tart, vagy –20 °C-
on rövidebb ideig.
g. A csapadékot mikrocentrifugával ülepítjük (min. 10 perc, 14 000 ford/perc). Tíz mikrogrammnál több
nukleinsav már látható üledéket ad.
h. Mikropipettával a felülúszót eltávolítjuk.
i. Az üledékhez 500 mikroliter 80%-os etanolt adunk. Összerázás után 5 percig (14 000 ford/perc)
centrifugáljuk, majd az alkoholt óvatosan elöntjük.
j. Az üledéket vákuummal szárítjuk, míg az alkohol el nem párolog.
k. A nukleinsavat steril vízben vagy pufferben oldjuk.
3.2. Vírus-DNS kivonása
A növénypatogén vírusok kisebb részében a genom DNS, és leginkább kétszálú. E vírusok jelentősége
elsősorban abban van, hogy a magasabb rendű élőlények genetikai anyagával megegyező felépítésűek, így
különösen alkalmas objektumai a molekuláris virológiai és a biotechnológiai kutatásoknak.
DNS-kivonás fenolos módszerrel (Shepherd et al., 1968)
A karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) különösen stabil kapszidjait csak fenolos, vagy csak
nátrium-dodecil-szulfátos (SDS, 2,5 mg/ml), vagy pronázos (50 µg/mg vírus) inkubálással bonthatjuk meg 37
°C-on (Shepherd et al., 1970).
a. A tisztításhoz tisztított vírusoldatot használunk, amit 37 °C-on inkubálunk 6 órán keresztül 50 mM Tris-HCl-
pufferben (pH 7,2) 10 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Sarkosyl és 500 µg/ml proteináz K jelenlétében.
b. A proteázos emésztés után az oldathoz CsCl2-t teszünk, 0,78 g/ml végkoncentrációig, majd 300 µg/ml
etidium-bromidot keverünk hozzá.
c. A DNS-t ultracentrifugálással tisztítjuk (24 óra, 52 000 ford/perc 20 °C-on, Ti-75 Beckman rotorban). A
DNS-zóna helyzetét UV-fényben láthatjuk, ezt a frakciót összegyűjtjük.
d. Az etidium-bromidot 3 M CsCl2-dal telített izopropanollal ismételt kirázással távolítjuk el.
e. A DNS-oldatot 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) és 1 mM EDTA-val szemben dializáljuk, az oldat többszöri
cseréjével.
Megjegyzés: Ha az enzimes kezelés után a DNS-t fenol-kloroformos módszerrel választjuk el, a Sarkosyl
helyett SDS-t használunk. Fenolos kivonásnál az enzimes feltárás után a kivonó pufferhez 1 mM etanolamint
(pH 10,5) keverve a kitermelés javítható.
3.3. Kettős szálú rns-ek kivonása a fertőzött növényekből
A vírusok izolálása és tisztítása
157 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az egészséges növény szövetei a DNS és RNS mellett – ha kis mennyiségben is, de – kettős szálú
ribonukleinsavakat (dsRNS) is tartalmaznak; néhány vírus genomja maga is dsRNS. A növénypatogén vírusok
nagy része azonban egyszálú RNS (ssRNS), ami a replikáció során kétszálú formában fordul elő. Ez egy
replikatív forma (RF), amely a pozitív genomi RNS-ből és annak negatív tükörképéből (template) áll. Az RF
mellett azonban a fertőzött sejtekben olyan kettős szálú formák, a replikációs intermedierek (RI) is előfordulnak,
amelyeken már egyszálú RNS-részek is vannak – ezek kisebbek, mint a RF. E szálakat azonban a tisztítás során
az RNázok többnyire elemésztik.
A dsRNS-kivonás több módszerrel is lehetséges (cf. Jones, 1992): (1) a szövetek DNáz- és RNáz-kezelésével,
(2) sóoldatban (pl. LiCl), eltérő oldékonyság alapján, (3) cukorsűrűség-gradiens centrifugálással, (4) cellulózról
eltérő etanololdékonyság alapján. Morris és Dodds (1979) módszere egyesíti a fenti lehetőségeket. E módszer
lényege, hogy az általában folyékony nitrogénben elporított szövetet olyan pufferrel tárják fel, ami az RNáz-
aktivitást alacsony szinten tartja (magas pH, nagy sókoncentráció, detergensek, antioxidánsok és kelátképző
anyagok). A nukleinsavak és fehérjék elválasztása általában kloroform és fenol keverékében történik, majd a
nukleinsavakat cellulózporon választják el. A maradék, szennyező DNS-t és RNS-t enzimes emésztéssel
távolítják el. Az így kinyert dsRNS-eket agaróz- vagy poliakrilamid-gélelektroforézissel lehet elválasztani.
Részletesebb leírást és gyakorlati kimutatásra alkalmas módszereket Dodds (1986) tanulmánya tartalmaz.
Egyszerűsített módszer dsRNS kivonására (Morris et al., 1983)
a. 10 g szövetet folyékony nitrogénben, dörzsmozsárban elporítunk és 10 ml (vagy több) kétszeres töménységű,
1% SDS-t és 0,1% 2-merkaptoetanolt tartalmazó STE-pufferrel (1 × STE = 100 mM NaCl, 50 mM Tris,
1mM EDTA, pH 8) extraháljuk.
b. 10 ml vízzel telített fenol és 5 ml kloroform-pentanol (25:1) keverékével keverjük.
c. A kivonatot 10 percig centrifugáljuk (10 000 g), majd a vizes felülúszót összegyűjtjük.
d. A vizes fázishoz annyi etanolt adunk, hogy annak végső koncentrációja 16–18% legyen.
e. Az oldatot lassan, kis mennyiségekben 18% etanolt tartalmazó, STE-pufferben szuszpendált cellulózporral
(Whatman CF11) töltött oszlopra (injekciós fecskendő) öntjük.
f. A cellulózoszlopot 18% etanolt tartalmazó STE-pufferrel néhányszor átmossuk, ami az egyszálú RNS-t és a
DNS-t lemossa az oszlopról.
g. A dsRNS-t kis mennyiségű (1–3 ml), alkoholt nem tartalmazó STE-pufferrel leoldjuk (eluáljuk) az oszlopról.
h. 2,5 térfogat etanol hozzáadásával a dsRNS-eket kicsapjuk. Az alkoholos oldatot éjszakára –15 °C-ra vagy
néhány órára –70 °C-ra helyezzük.
i. A kicsapódott dsRNS-eket centrifugálással (10 perc, 10 000 g) gyűjtjük össze, majd a csapadékot kiszárítjuk.
Feloldjuk 100 µl (10% RNáz-mentes szaharóz és egy kevés brómfenol-kéket tartalmazó) TPE-pufferrel (35
mM Tris, 30 mM NaH2PO4, l mM EDTA, pH 7,6).
j. Az oldatot 5 percig (5 000 g) centrifugálva tisztítjuk, majd a felülúszó nukleinsavmintát az előző példában
leírtak szerint elektroforézissel elválasztjuk. Jelzőanyagként uborka mozaik vírus (cucumber mosaic
cucumovirus) vagy dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) dsRNS-t használhatunk.
Fás szárú növények esetében alkalmazható módszer (Watkins et al., 1990)
a. 10 g friss vagy fagyasztott szövetet folyékony nitrogénnel mozsárban elporítunk és 20 ml 2% polivinil-
pirrolidont (PVP) (Mt. 44000), 1% SDS-t, 1% bentonitot, 0,2% DIECA-t és 0,1% thioglicerolt tartalmazó
TMS-pufferrel (100 mM TRIS, 10 mM magnézium-acetát, 500 mM NaCl, pH 8,5) extrahálunk.
b. 20 ml (10% m-krezolt, 0,3 % 8-hidroxikinolint és 20 ml kloroform és pentanol 25:1 arányú keverékét
tartalmazó) vízzel telített fenollal keverjük.
c. Az elegyet 60 °C-on 15 percig állni hagyjuk.
d. Az oldatot centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), a vizes felülúszót összegyűjtjük.
A vírusok izolálása és tisztítása
158 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
e. A vizes fázishoz ml-enként 0,02 g cellulózport (Cellex N-1 vagy Whatman CF-11) és 0,22 ml etanolt (95%)
adunk.
f. A szuszpenziót 30 percig keverjük szobahőmérsékleten.
g. Tízperces centrifugálást követően (10 000 g) a felülúszót elöntjük.
h. A cellulózüledéket feloldjuk 1–2 ml 18% etanolt tartalmazó STE-pufferben (200 mM NaCl, 50 mM Tris, 1
mM EDTA, pH 7).
i. 10 perces (10 000 g) centrifugálást követőn a felülúszót elöntjük.
j. A cellulózüledéket kétszer mossuk 18%-os alkoholt tartalmazó STE-pufferben, a cellulózt centrifugálással
gyűjtsük össze.
k. Az utolsó mosáskor a cellulózt 18%-os etanollal szuszpendáljuk, és üvegoszlopra vagy eldobható injekciós
fecskendőre öntjük, majd száradni hagyjuk.
l. Az oszlopról a dsRNS-t és a maradék szennyező DNS-t etanolt már nem tartalmazó STE-pufferrel eluáljuk
(leoldjuk).
m. A leoldott dsRNS-t 2,5 térfogat etanollal (95%) kicsapjuk, és egy éjszakán keresztül állni hagyjuk –15 °C-on,
vagy néhány órán keresztül –70 °C-on.
n. A kicsapott nukleinsavakat centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), elöntjük a felülúszót, a csapadékot 1 ml (30
mM MgCl2-t tartalmazó) STE-ben oldjuk.
o. 10 µg/ml DNázzal kezeljük és 60 percig inkubáljuk 30 °C-on.
p. Hozzáadunk 1 ml (1 mM EDTA-t és 4% SDS-t tartalmazó) 20 mM-os Tris-puffert, majd 60 °C-on további
15 percig inkubáljuk.
q. Azonos mennyiségű vízzel telített fenollal emulgeáljuk.
r. Centrifugáljuk (10 000 g, 10 perc), majd összegyűjtjük a vizes felülúszót és hozzáadunk 2,5 térfogatnyi
etanolt. Ezt követően egy éjszakán –15 °C-on vagy –70 °C-on néhány órát állni hagyjuk, míg a dsRNS-ek
kicsapódnak.
s. Centrifugálás után (10 perc, 10 000 g) a felülúszót elöntjük, a kicsapódott dsRNS-t kiszárítjuk. A csapadékot
100 µl RNáz-mentes, 10%-os szaharózoldatban készített, kevés brómfenol-kéket is tartalmazó TPE-pufferrel
(35 mM Tris, 30 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, pH 7,6) szuszpendáljuk.
t. A szuszpenziót 5 percig centrifugáljuk (5 000 g), majd 20–40 µl mintát 7% TPE-pufferben készített
poliakrilamid- vagy 1% agarózgélre felviszünk.
u. A mintákat 50 V feszültség mellett 16–20 órán keresztül poliakrilamid-gélben, vagy 3–5 órán át
agarózgélben futtatjuk.
v. A géleket etidium-bromiddal vagy ezüstnitráttal festjük.
159 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
13. fejezet - A vírusgenom szerveződése és a vírusok replikációja
A vírusok – bár az élettelen és az élő anyag szerveződésének határterületén állnak – felfoghatók olyan obligát
parazita (biotróf), azaz feltétlen élősködő szervezetekként is, amelyek önálló anyagcserével nem rendelkeznek,
hanem a gazdanövény nukleinsav- és fehérjeszintetizáló rendszerét parazitálva annak anyagcseretermékeit
(energiaforrásait, nukleinsavbázisait és aminosavait) használják fel saját bioszintézisükhöz. A vírusoknak önálló
szaporodásuk nincs; ehhez az életjelenséghez ugyanis olyan szaporítószervekre vagy szaporító képletekre és
önálló anyagcserére lenne szükségük, amivel nem rendelkeznek.
A vírusokat (és a viroidokat is) fertőző genetikai információként is felfoghatjuk, ami ebben a megfogalmazásban
azt jelenti, hogy olyan fertőző (és betegségeket okozó) nukleinsavak, amelyek a gazdanövény nukleinsav-
anyagcseréjébe kapcsolódva saját genetikai anyaguk újratermelését (bioszintézisét) biztosítják.
A vírusnukleinsavnak kettős szerepe van. Egyrészt meg kell sokszoroznia saját genetikai anyagát (ez maga a
nukleinsav-replikáció); másrészt irányítania és kódolnia kell a gének kifejeződését, azaz a vírusfehérjék
szintézisét (génexpresszió). A vírusfertőzött sejtben ez a két folyamat időben és térben szigorúan meghatározott
sorrendben és elválasztva, rendezetten megy végbe, amelynek végső eredménye az új virionok szintézise.
A nyugalomban levő, meghatározott alakkal rendelkező (tehát elektronmikroszkóppal látható), inaktív
vírusrészecskéket virionoknak nevezzük. A fertőzés után azonban a virionok „felbomlanak” (dissembly), és
megkezdődik az új virionok szintézise. Ebben az állapotában „vegetatív vírus”-ként tartjuk számon a kórokozót.
A szintetizált vírusnukleinsavak és a köpenyfehérje in vitro összeépülése (assembly) zárja a vírusbioszintézis
folyamatát, amelynek végén újra virionok mutathatók ki, legtöbbször a vakuolumokban vagy a citoplazmában
felhalmozottan. A vírusfertőzés következtében új genetikai információ kerül a sejtekbe, amelyek már a
továbbiakban új, nehezen megbontható biológiai egységet jelentenek.
A replikáció vizsgálata során három alapvető kérdésre keressük a választ: 1. Hogyan szerveződik a vírusgenom
(milyen géneket, milyen sorrendben tartalmaznak)? 2. E gének milyen módon nyilvánulnak meg (mi a
génkifejeződés stratégiája)? 3. A szintézis milyen fehérjetermékeket eredményez (mi ezek feladata, működése)?
1. A vírusreplikáció alapvető vizsgálati módszerei
A vírusreplikációval kapcsolatos ismereteink az elmúlt két évtizedben ugrásszerűen szaporodtak. Ezt az
időszakot – amelyet a molekuláris virológia és a biotechnológia kez-deti korszakának is tekinthetünk – több új,
alapvető vizsgálati módszer bevezetése jellemezte.
1.1. Restrikciós enzimek és a vírusok elsődleges szerkezetvizsgálata
A restrikciós endonukleázok (mikrogombákból vagy baktériumokból izolált, a kettős szálú nukleinsavszálakat
nem a végeiken, hanem a lánc belsejében fajlagosan bontó enzimek) és a nukleinsavsorrendet meghatározó
módszerek segítségével elsőként a karfiol mozaik vírus (cauliflower mosaic caulimovirus) mintegy nyolcezer
bázispárból álló teljes nukleinsavsorrendje vált ismertté (Franck et al., 1980; Rezelman et al., 1980; Ahlquist et
al., 1981; Gardner et al., 1981; Balázs et al., 1982).
1.2. Kettős szálú nukleinsavmásolatok (cDNS) készítése egyszálú RNS-ből
A fordított átírást (RNS-től függő DNS-polimeráz) szabályozó reverz transzkriptáz enzim retrovirusokból
történt izolálása és azok növényvirológiai alkalmazása lehetővé tette az egyszálú RNS-vírusok kettős szálú
DNS-kópiává (cDNS) történő átírását. E cDNS-szakaszok restrikciós enzimekkel bonthatók, szekvenciájuk
meghatározható. Először a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) és viszonylagos egyszerűségük
miatt az osztott genomú vírusok [tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus), rozsnok mozaik vírus
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
160 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
(brome mosaic bromovirus)] teljes szekvenciáit határozták meg (Goelet et al., 1982; Lomonossoff és Shanks,
1983). Napjainkra a legfontosabb típusvírusok e szempontból már ismertté váltak, és több esetben
megismerhettük az egyes vírustörzsek közötti biológiai eltérések molekuláris hátterét is.
1.3. A protoplasztok virológiai alkalmazása
A genomban foglalt információk kifejeződéséről szerzett ismereteinket részben az izolált protoplasztok
virológiai alkalmazásának köszönhetjük. A vírusfertőzés során a nukleinsav-replikáció és a vírusfertőzés többi
lépése (sejtről sejtre terjedés, majd az egész növény fertőződése) során szükséges funkcionáló gének és fehérjék
szerepe nem különíthető el pontosan. A sejtfaluktól enzimes (macerozim, celluláz, pektináz) úton megfosztott
protoplasztok cm3-enként több millió sejtből álló szuszpenziója (66. ábra) azonnal fertőzhető, azaz a replikáció
szempontjából szinkron-, in vivo rendszernek tekinthető. A génekben kódolt fehérjék szintézise viszonylag
azonos időben történik meg, jól nyomon követhető. Az 1970-es évek végén és az 1980-as évek elején végzett
kísérletek úttörő munkák voltak a molekuláris virológia kialakulásában (Takebe, 1975; Howell és Hull, 1978;
Gonda és Symons, 1979; Jarvis és Murakishi, 1980; Nassuth et al. 1983).
66. ábra - Dohány-mezofillumból izolált protoplasztok
1.4. A sejtmentes, in vitro fehérjeszintetizáló rendszerek
E transzlációs rendszerek (retikulocita-lizátum, búzacsíra-kivonat, Xenopus oocyta) virológiai alkalmazhatósága
azon alapszik, hogy ezekben az alakos sejtalkotórészeket nem, de riboszómákat tartalmazó szuszpenziókban –
ha minden más feltétel (nukleozidok, energiaforrás, transzfer RNS-ek, stb.) adott – a kívülről bejuttatott pozitív
értelmű ribonukleinsavak, így a vírusnukleinsavak is (mint messenger RNS-ek) az információjuknak megfelelő
fehérjék szintézisét megindítják. Ez az folyamat is gyakorlatilag azonos időben megy végbe. A szinkron
tenyészetek adták az első alkalmat a vírusok proteinszintézisének megismerésére (Efron és Marcus, 1973;
Davies és Kaesberg, 1974; Dougherty és Hiebert, 1980). A két utóbbi módszer (protoplaszt- és sejtmentes
fehérjeszintézis) eredményei együttesen adnak útmutatást a fehérjetermékekre, azok képzési mechanizmusaira.
2. A vírusgenom szerveződésének alaptípusai
A vírusok teljes génállománya a genom. Mint ismert, ezek formái: egyszálú DNS (pl. geminivirusok); kettős
szálú RNS (pl. reovirusok), kettős szálú DNS (pl. caulimovirusok); valamint a növénypatogén vírusok túlnyomó
többsége egyszálú (+) RNS. A növény- és az állatpatogén vírusok határán – mintegy a rokonságot bizonyítandó
– foglalnak helyet a rhabdovirusok és a tospovirusok, amelyek genomja negatív (antiszensz), illetve részben
kettős (+ és –), azaz ambiszenz. A nukleinsavlánc lehet fonalas (lineáris) vagy kör alakú (cirkuláris). Bár a
nukleinsavak térbeli szerkezete sem közömbös, a főbb tulajdonságokat a nukleotidsorrend (nukleinsav-
szekvencia) határozza meg. Egy nukleotid eltérés – különösen, ha az a fehérjében aminosavcserét eredményez –
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
161 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
már a biológiai tulajdonságok megváltozását (pl. tünettípus, átvitel, hőérzékenység stb.) okozhatja. A vírusok és
vírustörzsek rokonságát a nukleinsav-homológia foka határozza meg.
A genom lehet egykomponensű, azaz osztatlan, de lehet osztott, azaz multikomponensű is. Ez utóbbi esetben az
egyes komponensek csak együtt fertőzőképesek, hiszen a megosztottság a feladatok megosztását is
eredményezi.
2.1. A nukleinsavak jellemző végei
A vírus-RNS 5‟ és 3‟ végei sajátos szerveződésűek. Egyes RNS-ek 5‟ végén 7metil-guanozin (m7Gppp) sapka
(cap) van (Tobamovirus, Potexvirus, Bromovirus nemzetségek), míg másokra (Comovirus, Nepovirus,
Potyvirus, Sobemovirus) a genomhoz kötött kis molekulatömegű fehérje (VPg) a jellemző (Davies és Hull,
1982). A sapka jelenléte a fertőzés eredményességét, az RNS stabilitását és a transzlációt befolyásolja; szerepe a
proteinszintézis megindításában van. A VPg-regulátor szerepe az RNS-szintézis megindításában nem minden
vírus esetén bizonyított, de feltételezhető, hiszen ez az egyetlen fehérjemolekula, amely a replikáció teljes idején
a nukleinsavhoz kötődik (Matthews, 1991).
Az RNS 3‟ végén egyes nemzetségeknél (Tymovirus, Tobamovirus, Bromovirus, Potyvirus, Cucumovirus)
tRNS-re emlékeztető szerveződésű és szerepű szakasz található, másoknál (Comovirus) ezt egy poliadenilsav-
láncból [poly (A)] álló hosszú farok (tail) helyettesíti. A tRNS-szerű vég feltehetően a replikáz enzim
felismerési helye, ahol a negatív szálak szintézise elkezdődhet. Szerepe egy olyan aminosav megkötésében van,
ami elősegíti a replikációban szereplő enzimek felismerését és a transzlációt. A poly (A) farok a replikációnál
nélkülözhetetlen, az RNS-t stabillá teszi. A láncvégi szerveződés nem követi a virion morfológiáját, de
jellemzője lehet a vírusok új, nukleinsav-szerveződésen alapuló rendszerének. Az osztott genomú
(multikomponens) vírusok nukleinsavvégei típus szerint megegyeznek.
Az RNS kezdeti szakaszain hosszabb, fehérjéket nem kódoló, de a működés szempontjából fontos szakaszok is
lehetnek. Az 5‟ vég fehérjét nem kódoló szakaszai például a riboszómákhoz történő kötődést biztosíthatják. Az
egyes gének között néha csak egy-két, máskor több száz nem kódoló nukleotid van. A növénypatogén vírusok (a
geminivirusok kivételével) intronokat nem tartalmaznak.
2.2. Nyitott leolvasási szakaszok, fehérjetermékek
A vírusgenom, hosszúságától függően, 1–12 gént tartalmazhat. Egy gént tartalmaz például a szatellit dohány
nekrózis vírus (tobacco necrosis satellivirus) virionja, míg a potyvirusokban a gének száma 10, a reovirusokban
12. Minden nyílt leolvasási szakasz (open reading frame, ORF) elején egy kezdő szignál, a végén pedig egy stop
kondon (termination signal) foglal helyet. Ez a szakasz egy peptid vagy polipeptid leolvasására ad lehetőséget,
amelynek nagysága a leolvasási szakasz hosszától függ. Ha a stop kodon gyenge, akkor ezt a riboszómák
átolvashatják, és egy, a korábbinál hosszabb polipeptid szál is keletkezik (read-through protein). Ritkán átfedő
(overlapping) gének is vannak egy nukleinsavszakaszon, ami azt eredményezi, hogy azon a szakaszon akár két
fehérjetermék is képződhet. Gének lehetnek a negatív szálon is (pl. tospovirusok), de ez esetben ezek
megnyilvánulása egy mRNS szintézisétől függ.
A fehérjetermékek feladatuknak megfelelően az alábbiak szerint csoportosíthatók: 1. strukturális fehérjék (pl.
köpenyfehérje); 2. replikációban szereplő enzimek (proteázok, polimerázok, helikázok); 3. transzport-fehérjék,
amelyek a vírus növényen belüli elterjedését, a fertőzés szisztemizálódását biztosítják; vagy 4. ún. segítő
(helper) fehérjék, amelyek a vektortevékenységet fajlagosan segítik.
2.3. A vírusnukleinsav-replikáció általános menete
A fertőzés után a pozitív (+) szálú RNS-vírusok (67. ábra) replikációjuk első lépésében fehérjeburkukat veszítik
el, deproteinizálódnak. A folyamat az 5‟ végen kezdődik el, és lehetővé teszi a nukleinsav (80S) riboszómákhoz
történő kapcsolódását és az első géntermék, legtöbbször egy polimeráz enzim szintézisét. Ennek az RNS-től
függő RNS polimeráz enzimnek (replikáz) segítségével a pozitív szálról egy negatív szálú (–) minta- (templát)
RNS íródik át. A negatív szál bázissorrendjében a kiegészítő nukleotidokat tartalmazza, tehát tükörképe a
pozitív szálnak. A két szál együtt egy kettős szálú RNS-nek felel meg, amit replikatív formának (RF) nevezünk.
Ennek az átmeneti formának a jelenlétét több gazda–vírus kapcsolat [pl. árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe
mosaic hordeivirus)] esetében sikerült bizonyítani. A továbbiakban a negatív szálról indul meg több ponton is a
pozitív szálak szintézise. Ezt a csak részben kétszálú, de már több (+) egyszálú RNS-t tartalmazó formát
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
162 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
replikatív intermediernek (RI) nevezzük. A replikáció helye víruscsoportonként eltérő is lehet, történhet a
sejtmagban, a citoplazmában a kloroplasztiszok határán vagy a citoplazma elkülönült helyein (viroplazma).
67. ábra - A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikáció szakaszai a
növényi sejtben. A: fertőzés, B: az RNS kiszabadulása, C: kötődés a riboszómákhoz, D:
vírusreplikáz (vagy egy része), E: a replikatív forma keletkezése, F: replikatív
intermedierek keletkezése, G: replikatív komplex, H: összeépülés, I: kész virionok, RF:
replikatív forma, RI: replikatív intermedier, sRNS: kis (szubgenomi) RNS [Érsek és
Gáborjányi, 1998 után]
A templát RNS a 3‟-végtől íródik át. A VPg és köpenyfehérje (5‟-végen vannak) a fehérjeszintézis elkezdésében
játszik szerepet. Az egyes genomnál kisebb, azaz szubgenomi RNS-ek szintézisét szintén a replikáz enzim
komplex szabályozza. Néha [pl. tarlórépa sárga mozaik vírus (turnip yellow mosaic tymovirus)] az RNS
szintézisében (pontosabban az RNS-től függő RNS polimeráz komplex képzésében) a gazdanövény fehérjéi
(host coded proteins) is részt vesznek. A vírusfertőzés eredményessége (a gazdanövénykör kialakulása) attól is
függ, hogy mennyire képes a kórokozó a gazdanövény fehérjéit saját nukleinsav-szintéziséhez felhasználni.
Az egyszálú, de negatív értelmű RNS-ek replikációja (tospovirusok) pozitív templát RNS segítségével valósul
meg. A kettős szálú DNS-vírusok (caulimovirusok) replikációja szintén mRNS szintézisét igényli, erről a
mRNS-ről fordított transzkripcióval képződik a pozitív szálak szintézise. E speciális eseteket a következő
fejezetben tárgyaljuk.
2.4. A génkifejeződés általános módjai
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
163 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vírus-nukleinsav második funkciója hírvivő (messenger) RNS jellegű, feladata a génkifejeződés biztosítása. A
transzlációkor a genomnak csak az 5‟ végi, első nyílt leolvasási szakasza fejeződik ki polipeptid formájában, a
többi „néma” marad. A vírusoknak a teljes génkifejeződéshez többféle stratégiát, egyszerre esetleg több
módszert kell választani ahhoz, hogy minden génje expresszálódjék. Erre több lehetőség is van. Az első esetben
a) a genom osztatlan (bennük belső stop szignál nincs), egyetlen poliprotein képződik, ami később, a transzláció
után hasad funkcióképes alegységekre; b) a genom osztottságából adódik, a multikomponens-vírusok minden
virionja (általában) csak egy-egy RNS-darabot foglal magában, ezek az RNS-ek csak egy (vagy két) gént
hordoznak; c) a genomban több gén is van, a belső szakaszok leolvasását egy vagy több, a genomnál kisebb,
azaz szubgenomi RNS szintézise előzi meg. Ezek a szubgenomi RNS-ek már csak egy (vagy két) rövidebb gént
tartalmaznak. Egy vírus génkifejeződéséhez egyszerre több szubgenomi RNS-t is felhasználhat; d) ha a 3‟ vég
zárószekvenciái gyengék, lehetővé válik a stop kodon átolvasása és egy hosszabb szál szintézise is. Az így
képződött átolvasott fehérje (read-trough protein) hosszabb szekvenciái tehát részben azonosak a rövid száléval.
Hasonló a mechanizmusa a különböző leolvasási fázisokban keletkezett (transframe) fehérjéknek is. Ez esetben
e) egy fehérje szintézise még nem ér véget, de a másik fehérje szintézise már megkezdődhet.
3. A génkifejeződés stratégiái a különböző vírusnemzetségekben
A növénypatogén vírusok a génexpresszióhoz az alapvető lehetőségeket vírusnemzetségenként jellemző módon,
egy formában, vagy különböző kombinációkban valósítják meg (Foster és Taylor, 1998). Ez a forma egyes
nagyobb csoportok esetében hasonlóságokat mutat, ami alkalmas új vírusrendszer alapjainak felvázolásához is.
Az alábbiakban csak néhány jól ismert stratégiát mutatunk be.
3.1. A potyvirusok replikációja: poliprotein szintézise és transzláció utáni hasadási termékek
A potyvirusok [burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), kukorica csíkos mozaik vírus (maize dwarf mosaic
potyvirus), szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) stb.] virionjai helikálisak, kb. 700 nm hosszúak. Az egyszálú
(+) RNS genom mintegy 10 000 nukleotidot tartalmaz. 5‟ végén VPg van, 3‟ vége poliadenilált. Az első,
mintegy 85–205 nukleotid nem kódoló régiót egy hosszú leolvasási szakasz követi, amiről egyetlen (350–360
kD) hosszú poliprotein-prekurzor íródik át, amit a vírus által kódolt proteázok vágnak el a transzláció után
funkcióképes fehérjékké. A potyvirusok génkifejeződésének szabályozását valószínűleg e különböző fehérjék
időben eltérő megjelenése teszi lehetővé (Riechmann et al., 1992).
A potyvirusok génkifejeződését a szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) példáján mutatjuk be (Riechmann et
al., 1992) (68. ábra). Az első géntermék (P1 fehérje) biológiai szerepe még nem teljesen tisztázott, de ismert,
hogy proteolitikus aktivitású és transzport-fehérje funkciót is betölthet. A fertőzött levelek epidermiszsejtjeiben
zárványok formájában halmozódik fel. A második végtermék a levéltetűvel történő átvitelt segítő fehérje (helper
komponens, HC-Pro) szintén többfunkciós jellegű, nemcsak a vektorátvitelben van szerepe, de a floemben
történő transzportban is. A fehérje C terminális része proteáz jellegű. A sejtekben amorf zárványokat alkot. A
harmadik polipeptid (P3 protein) szerepe jórészt ismeretlen. Részt vehet a proteolitikus hasítás szabályozásában.
A 6K1 és 6K2 fehérjéknek – szekvenciájuk alapján – a replikációban, a VPg mebránhoz kötésében van
jelentőségük. A henger vagy forgó kerék (szélkerék) alakú citoplazmikus zárványfehérje (CI) a potyvirusok
legjellemzőbb terméke. Helikáz-aktivitású. A kis sejtmagi zárványfehérje (NIa) proteáz-aktivitású, és felelős a
poliprotein nagyobbik részének hasításában. A genomhoz kötött protein (VPg) az RNS pozitív szálak
szintézisének megindításához szükségesek. A nagy sejtmagi zárványfehérje (NIb) anyagáról feltehető, hogy ez
az RNS-től függő RNS-polimeráz, ami a CI, a VPg(NIa), valamint a 6K1 és 6K2 fehérjékkel együtt a replikációs
komplex egyik tagja. A hosszú polipeptidlánc utolsó származéka a kapszid- vagy köpenyfehérje (CP). Szerepe –
a nukleinsavat védő funkcióján kívül – a gazdaspecifitásban és a levéltetűvel történő átvitelben van. A
potyvirusok taxonómiája elsősorban a köpenyfehérje eltérésein alapul. A CP N terminális része igen
változékony, vírus- és törzsspecifikus eltéréseket tartalmaz. A középső régió erősen konzervatív, ez felelős a
sejtről sejtre terjedésért és a vírus összeépüléséért. A C és az N végek a virionok felületén helyezkednek el.
68. ábra - A potyvirusok [szilva himlő vírus (plum pox potyvirus)] géntérképe. P1(Pro)
= P1 fehérje proteázaktivitással, HC-Pro = segítő (helper) komponens, P3 = P3 fehérje,
6K1 = 6K1 fehérje, CI (Hel) = citoplazmikus zárványfehérje helikázaktivitással, 6K2 =
6K2 fehérje, NIa = sejtmagfehérje, NIb (Rep) = sejtmagfehérje replikázaktivitással, CP
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
164 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
= köpenyfehérje, poli (A) = poliadenilsav. Magyarázat a szövegben [Riechmann et al.,
1991 után]
A potyvirusok jellegzetes replikációjában az egyes fehérjetermékek azonos, tehát ekvimoláris mennyiségben
termelődnek. Ahhoz, hogy egyetlen köpenyfehérje-molekula kialakuljon, az egész nukleinsavnak újra
transzlálódnia kell. Ennek a „gazdaságtalan” termelésnek egyrészt az a következménye, hogy kevés a
növényben felhalmozott burok- (kapszid-) fehérje és virion mennyisége, másrészt a bioszintézis más
„felesleges” termékei zárványok formájában halmozódnak fel.
3.2. A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) replikációja: osztott genom és poliproteinek
A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) a Comovirus nemzetség típus tagja. A vírusnemzetség
hazai képviselője a vöröshere tarkulás vírus (red clover mottle comovirus). A genom két (+) RNS szálra osztott
(M és B); ezek külön-külön, azonos méretű (30 nm) izometrikus virionokban enkapszidálódnak. A rövidebb M
szál 3481 nukleotidból (nt) áll. A hosszabb B szál 5889 nt nagyságú. Mindkét szál 5‟ végén kovalens kötésű
VPg található, a 3‟ végén poliadenilált. Mindkét szál első 44 kezdeti szekvenciáiban, illetve a szálak adenilált
része előtti szakaszaiban nagy a hasonlóság. Ez utóbbinak valószínűleg a köpenyfehérje-felismerésében van
szerepe (69. ábra).
69. ábra - A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) géntérképe és a
transzláció utáni hasadás termékei: poli(A) = poliadenilsav farok, ORF = nyílt leolvasási
szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [Matthews, 1991
után]
Az egyes szálak külön replikálódnak. Mindkét szál replikatív formáját a fertőzött levelekben azonosították, és
csak egy-egy leolvasási szakaszt tartalmaznak. A replikáció során így mindkét szálról csak egy poliprotein (105
és 202 kD) szintézise valósul meg, amelyek a transzláció után proteolitikusan alegységekre hasadnak. A
protoplasztok fertőzésekor kimutatható első hosszú polipeptid (202 kD) többlépcsős hasadási termékei közül
egy (32 kD) proteáz-aktivitású, míg az 58 kD-os fehérje a replikáz enzim része, de ugyanennek a poliproteinnek
a terméke a 4 kD nagyságú VPg is. A 110 kD nagyságú replikáz enzim is a B komponensben kódolt. Ha a
protoplasztokat csak a B komponenssel fertőzték, akkor virionok nem képződtek. Eredménytelen volt a
protoplasztok fertőzése akkor, ha azokat csak a rövidebb komponenssel fertőzték. Az eredménytelenség oka –
ma már nyilvánvalóan – arra vezethető vissza, hogy a replikáz enzim kódja a B RNS-hez kötött. Ha a két
komponens a fertőzéskor együtt volt, akkor a fertőzés eredményes volt, és komplett virionok is képződtek. A
virionokhoz szükséges két köpenyfehérje (37 és 23 kD) ugyanis az M szálon kódolt, hasonlóan az 58 és 48 kD
nagyságú fehérjékkel, amelyek a sejtről sejtre terjedés feltételeit biztosítják. A 48 kD nagyságú fehérjét a
membránokból izolálták. Mindezek a peptidek egyetlen polipeptid (105, illetve 95 kD) hasadási termékei, ezt az
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
165 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
elsődleges terméket azonban – valószínűleg gyors bomlása miatt – a fertőzött protoplasztokból nem lehetett
kimutatni. Mindkét elsődleges poliproteinszál hasítását a B komponensben kódolt (24 kD) fehérje végzi
(Goldbach és van Kammen, 1985; Rezelman et al., 1989).
A vírusszintézisben a B komponensben kódolt 60 és 58 kD, illetve 110 kD fehérjék mellett részt vesznek a
gazdanövény polimeráz emzimei is, amelyek jelenlétét sikerült a fertőzött növényekből kimutatni (Dorssers et
al., 1984). A replikáció helye a citoplazma, a virionok a sejtfal mellett tubuláris szerkezetű formákból, a
viroplazmából mutathatók ki, majd a citoplazmában és a vakuolumokban halmozódnak fel.
A comovirusokhoz hasonló replikációs stratégiát követnek a nepovirusok [dohány gyűrűsfoltosság vírus
(tobacco ringspot nepovirus) és a paradicsom fekete gyűrűs vírus (tomato black ring nepovirus)] is.
3.3. A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) replikációja: osztott genom és szubgenomi RNS
A rozsnok mozaik vírus (brome mosaic bromovirus) a gabonaféléket hazánkban is gyakran fertőző, jól ismert
kórokozó. Három részre osztott genomja 8243 nukleotidot tartalmaz (Ahlquist et al., 1984; Ahlquist, 1987). Az
egyes nukleinsavszálak mellett az izometrikus (30 nm) virionokba még egy kis szubgenomi RNS is
enkapszidálódik úgy, hogy cukorgradiens-centrifugálással csak három nukleinsavat tartalmazó [nehéz (B),
közepes (M) és könnyű (L) frakció különíthető el] (70. ábra). A nehéz, B szálban egy hosszú nukleinsavszál
(RNS1) van, a középsőben két kisebb (RNS3 és a szubgenomi RNS), míg a harmadik frakcióban ugyancsak egy
szál (RNS2) foglal helyet. A fertőzött növényből azonban egy negyedik, nukleinsavat nem tartalmazó üres
köpenyfehérje-kagylókból álló (T), ún. felső frakció is elválasztható.
70. ábra - A rozsnok mozaik vírus génszerveződése. cap = sapka, tRNS = transzfer
RNS-szerű vég, ORF = nyílt leolvasási szakasz, nt = nukleotid, kD = kilodalton
[Matthews, 1991 után]
Az RNS1 3234, az RNS2 2865 és a RNS3 2144 nukleotidot tartalmaznak. Minden szál 5‟ végén metil-guanozin
„sapkát”, 3‟ végén tirozin megkötésére alkalmas traszfer-RNS-hez hasonló másodlagos szerkezetet hordoz.
Elvileg minden nukleinsavszálon egy gén foglal helyet, azaz egy leolvasási szakaszt tartalmaz. Ez alól kivétel az
RNS3, amelyen két, fehérjének megfelelő leolvasási szakasz is helyet foglal. A két gén között rövid, mintegy
250 nukleotid hosszúságú nem kódoló szakasz is van, amiből mintegy 20 adenilált.
A replikációs stratégia lényege a genom osztottságából ered. Az RNS-eken csak egy leolvasási szakasz van, ami
egy-egy fehérje szintézisét teszi lehetővé. A harmadik RNS-szál azonban két cisztront is tartalmaz, a 3‟ vég felé
eső részen foglal helyet a köpenyfehérje-gén. Ez egy új, genomnál kisebb, 0,9 kilobázis nagyságú szubgenomi
RNS szintézisén keresztül olvasódik le. A szubgenomi RNS maga is hasonló a genomi RNS-ekhez, amennyiben
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
166 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
ez is 5‟ végén „sapkát” hordoz, 3‟ vége pedig szintén tRNS-jellegű. A szubgenomi RNS maga is
enkapszidálódik az RNS3-al, együtt alkotva a középső (M) frakciót.
Az RNS1 terméke (109 kD) részt vesz az RNS-replikációban, metil-transzferáz- és helikáz-aktivitása van. Az
RNS2 által kódolt fehérje (94 kD) szintén részt vesz a replikációban (valószínűleg ez az RNS-függő RNS-
polimeráz enzim). Az RNS3 olyan fehérje (32 kD) szintézisét irányítja, ami a vírus növényen belüli elterjedését
segíti (transzport-fehérje). A negyedik termék – amelynek szintézise a rövid szubgenomi RNS-től függ – a
köpenyfehérje (20 kD).
A replikáció – feltehetően a genom osztottsága miatt – igen gyors és nagyon hatékony. Mind a négy kettős szálú
RNS (dsRNS) kimutatható a fertőzött protoplasztokból. Először a hosszabb RNS-ek termékei jelennek meg,
majd az idő haladtával túlnyomóvá válik a köpenyfehérje szintézise. A különböző bromovirusok egyes
komponensei (például az RNS3) annyira hasonlóak, hogy azok egymással kicserélhetők [tehénborsó klorotikus
tarkulás vírus (cowpea chlorotic mottle bromovirus)] (pszeudo-rekombináció). A vírustörzsek, esetleg
vírusfajok közötti rekombináció a faj számára nagy evolúciós előnyt jelenthet, az új kombinációk a természetes
szelekció révén vagy állandósulhatnak, vagy eltűnhetnek.
A bromovirusok a sejtmagban [pl. lóbab tarkulás vírus (broad bean mottle bromovirus)] replikálódnak, de az új
virionok a citoplazmában (esetenként viroplazmában) halmozódnak fel. A bromovirusokhoz hasonló replikációs
utat követnek a cucumovirusok [pl. uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus)], a hordeivirusok [pl.
árpa csíkos mozaik vírus (barley stripe mosaic hordeivirus)] és az ilarvirusok [pl. alma mozaik vírus (apple
mosaic ilarvirus)], valamint a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) is. Utóbbi kórokozó e
szempontból azért érdekes, mert a nukleinsav-replikáció kezdeményezésében a köpenyfehérjének különleges
szerepe van.
3.4. A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) replikációja: átolvasott fehérje és szubgenomi RNS-ek
A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) a tobamovirus nemzetség típustagja. A legrégebben és
legrészletesebben tanulmányozott víruskórokozó. A genom egy pozitív szálú, 6395 nukleotidból álló RNS.
Teljes szekvenciája 1982 óta ismert (Goelet et al., 1982). Az 5‟ végen 7-metil guanozin sapka (m7Gppp), a 3‟
vég tRNS-szerű (hisztidint kötő) másodlagos szerkezetű. Az RNS 3‟ végétől kb. 1000 nukleotid távolságra a
köpenyfehérjét specifikusan felismerő és megkötő szekvenciák helyezkednek el. Az RNS első 70 nukleotidja és
a 3‟ vég utolsó szekvenciái fehérjét nem kódoló szakaszok.
Az első leolvasási szakasz egy 126 kD nagyságú fehérje szintézisét teszi lehetővé. Ezt egy gyenge stop kodon
(UAG) követi, ami lehetővé teszi annak „átolvasását” és ezen keresztül a második leolvasási szakasznak
megfelelő, az előbbinél hosszabb fehérjeszakasz (183 kD) szintézisét eredményezi (71. ábra). E fehérje 5‟ vég
felőli része szekvenciájában teljesen azonos a 126 kD fehérjével. Az átírt szakasz, ami a harmadik leolvasási
szakasznak felelne (ORF3) meg, elvileg egy önálló (54 kD) fehérje lehetne, ezt a fehérjét azonban a fertőzött
növényekben nem találták meg. Mind a 126, mind a 183 kD fehérje RNS-től függő RNS-polimeráz, tehát maga
a replikáz enzim.
A belső gének további kifejeződése szubgenomi RNS-ekhez kötött. Az I2 szubgenomi RNS két leolvasási
szakaszt (ORF4 és ORF5) is tartalmaz, amelyek közül csak az első (ORF4) nyilvánulhat meg. Ennek terméke a
30 kD nagyságú peptid, transzport-fehérje, tehát a sejtről sejtre történő terjedésben van szerepe. A belső
leolvasási szakasz (ORF5) transzlációja csak egy újabb, egycisztronos, kis szubgenomi RNS (sRNS) révén
valósul meg. Az ORF5 a köpenyfehérje (17,6 kD) kódját foglalja magában. Mindkét szubgenomi RNS-t (I2 és
sRNS) a fertőzött növényekből izolálták. Érdekes, hogy a két szubgenomi RNS közül csak az sRNS metilált. A
rövid sRNS gyors és nagy tömegű köpenyfehérje szintézisét teszi lehetővé. A köpenyfehérje szerepe többoldalú,
egyrészt védi a nukleinsavat a káros külső hatásoktól, másrészt részt vesz a kompatibilitási viszonyok
kialakításában is.
A vírusreplikáció általános menete a A vírusnukleinsav replikációjának általános menete című fejezetrészben
ismertettek szerint történik. A sejtbe került virionokról – valószínűleg több pontból kiindulva – a köpenyfehérje
elemésztődik, szabaddá válik az RNS 5‟ vége, ahonnan a 80S riboszómákon megindul az első két ORF-termék
szintézise. Mindkét fehérje részt vesz annak a replikációs komplexnek a kialakításában, amiben a gazdanövény
által kódolt fehérjéknek is meghatározó szerepük van. A vírusspecifikus RNS-től függő RNS-polimeráz a
membránhoz kötött poliriboszómákhoz (30 000 g frakció) kötődik. Ez katalizálja mind a pozitív, mind a negatív
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
167 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
szál szintézisét. E frakcióból mind a replikatív forma (RF), mind a replikatív intermedier (RI) jelenléte
kimutatható.
A szubgenomi RNS-ek szintézisének szabályozási mechanizmusa kevésbé ismert. A replikáció végén
felszaporodó köpenyfehérje felismeri az RNS 3‟ véghez közeli (5290–5527 nukleotid közötti), speciális
bázispárosodású szakaszait (felismerési régió), és megkezdődik mindkét irányban a köpenyfehérje-korongok
nukleinsavval történő összeépülése (assembly) és az új virionok kialakítása. A reakció in vitro körülmények
között is végbemegy, egyes esetekben a kötőhelyek a rokon vírusok fehérjéit is felismerik.
A vírusszintézis helye a citoplazma, az endoplazmatikus retikulum speciális része (viroplazma). Felmerült
annak a lehetősége is, hogy a kloroplasztiszok is a vírusbioszintézis helyei. Valószínűbb azonban, hogy a vírus-
köpenyfehérje és a virionok csak később épülnek be a színtestekbe. A képződött új virionok a citoplazmában és
a vakuolumokban halmozódnak fel igen nagy mennyiségben, s gyakran hexagonális parakristályos formába
rendeződnek.
A tobamovirusokhoz hasonló expressziót követnek az egyéb tulajdonságaikban távol álló luteovirusok is.
3.5. A pararetrovirusok replikációja: fordított transzkripció
A caulimovirusok a kettős szálú DNS-vírusok egyedüli képviselői. Típustagjuk a karfiol mozaik vírus
(cauliflower mosaic caulimovirus). Gazdasági kárt nem okoz, tudománytörténeti szempontból mégis jelentős.
Kezdetben a magasabbrendű szervezetekre jellemző génállománya miatt került a molekuláris biológiai, majd a
biotechnológiai, génsebészeti kutatások homlokterébe. Később a replikációs stratégia különlegessége keltette fel
iránta azt a tudományos érdeklődést, amely mind a mai napig tart. Nukleinsav-újratermelése ugyanis egy RNS-
től függő DNS-polimeráz, a reverz transzkriptáz enzim működésén alapul. E replikációs mód az állat- és
humánpatogén retrovirusokra jellemző, ezért is használják a caulimovirusokra a pararetrovirus elnevezést.
A karfiol mozaik vírus több törzsének a teljes nukleinsavsorrendje már viszonylag korán ismertté vált (Franck et
al., 1980; Gardner et al., 1981; Balázs et al., 1982). A genom két, bázispárosodással pontosan illeszkedő, kör
alakú DNS-szálból áll (72. ábra). A bázispárok száma kb. 8000. A külső (alfa) szál egy helyen szakad meg (gap
1 = kapu), míg a belső (béta) szálon két kapu is van (gap 2 és 3). A genom hat gént, de nyolc elvi lehetőséget
tartalmaz.
Az első nyitott leolvasási szakasz (ORF I) terméke a 37 kD nagyságú fehérje, amit a fertőzött levelek
sejtfalfrakcióiból lehet kimutatni. Szerepe a plazmodezmák átjárhatóságának biztosítása, tehát transzlokációs
fehérjének tekinthető. A második és harmadik gén (ORF II és ORF III) termékei hasonló (18, ill. 15 kD)
nagyságúak. Az első (18 kD) a levéltetűvel történő vírusátvitelt segíti (helper protein), az utóbbi (15 kD)
strukturális fehérje a virion belsejében van. A negyedik fehérje (57 kD) az ORF IV terméke, a köpenyfehérje
előanyaga, belőle származik proteolízissel a köpenyfehérje (42 kD). Az ORF V a leghosszabb leolvasási
szakasz, egy RNS-től függő DNS-polimeráz (reverz transzkriptáz) enzimet kódol. A hatodik, az ORF VI
génterméke a viroplazma-fehérje, szerepe a betegség indukciójában és a tünetek kifejlődésében van. Az utolsó
két kis molekulatömegű fehérje (ORF VII és OFRF VIII) szerepe nem kellően ismert.
A caulimovirusok nukleinsav-szintézise különleges módon történik (73. ábra). A sejtbe jutott virionok
köpenyfehérje-burkukat elveszítve jutnak el a sejtmagba. Itt a két DNS-szálról a kapukat átfedő RNS-végek
leoldódnak és a genom teljes (megszakítás nélküli) kettős kört formál, ún. minikromoszómát alkot. A
továbbiakban a szálak közötti kötés fellazul. Az egyik (alfa) szálról mRNS-ek szintézise (19 S és 35 S RNS)
indul meg. Közülük a 35S RNS a genom teljes információit hiánytalanul tartalmazza. A replikáció második
szakaszában mindkét RNS-szál elhagyja a sejtmagvat és a citoplazmába jut. Itt a 19S RNS a viroplazma
fehérjeszintézisét irányítja.
A 35S RNS a viroplazmában kezdi meg egy új DNS- (–) szál szintézisét, tehát egy fordított transzkripciót, azaz
RNS-től függő DNS-szintézist (Guilley et al., 1983; Hull és Covey, 1983). A reakciót katalizáló enzimet reverz
transzkriptáznak nevezzük. Ehhez hasonló különleges enzim csak az állatpatogén retrovirusokban fordul elő.
Így, ha rövid időre is, de egy RNS-templát és a neki megfelelő DNS- (–) szál együtt fordul elő. A későbbiekben
a mRNS-t RNázok elemésztik (egy rövid rész megmarad a gap-ek borítására), és a (–) DNS-szálról mint
primerről másik (+) DNS-szál képződik (Hull et al., 1987).
Az új DNS-szálak szintézisével lépést tartva történik a köpenyfehérje-szintézis. Az új DNS-szálak a
köpenyfehérjével komplett virionokat alkotnak, amelyek elsősorban a viroplazmában vagy azok közvetlen
közelében halmozódnak fel.
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
168 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3.6. Geminivirusok: kétirányú transzkripciós stratégia
A geminivirusok különlegessége, hogy a genom az amúgy is jellegzetes (18 × 30 nm nagyságú)
ikerpartikulumokban egyszálú, kör alakú DNS. Ez lehet egyetlen szál [pl. búza törpülés vírus (wheat dwarf
monogeminivirus)], vagy két szál [pl. bab aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic begomovirus)]. A
bigeminivirusok két DNS-szála különböző. A harmadik csoport (hybrigeminivirus) nukleinsava mindkét
alaptípusra hasonlít; a két szál hasonló, de nem azonos. Típus képviselőjük pl. a répa levélcsúcs fodrosodás
vírus (beet curly top hybrigeminivirus, újabban: beet curly top curtovirus). A geminivirusok replikációs
stratégiája több hasonlóságot mutat. Minden geminivirusban megtalálható egy arginin–timin gazdag hurok, és
egy rövid, kb. 200 nukleotid nagyságú, fehérjét nem kódoló, közös szakasz.
A replikáció módját legismertebb képviselőjük, a kukorica csíkosság vírus (maize streak monogeminivirus,
újabban: maize streak mastrevirus) példáján (Stanley, 1985; Stanley és Davies, 1989) mutatjuk be. Az egyszálú,
cirkuláris genom 2687 nukleotidból áll (Mullineaux et al., 1984). A nukleinsavszálon négy nyílt leolvasási
szakasz van, kettő a pozitív polaritású, ún. „virionszálon” (V1 és V2), kettő pedig a negatív, ún. „komplementer
szálon” (C1 és C2). E két szálrészt egy rövid intergenikus szakasz választja el egymástól. Az első (V1)
fehérjetermék (10,9 kD) szerepe ismeretlen, a második (V2) a köpenyfehérje (27 kD). A másik leolvasási
szakaszon is két fehérje kódolt (C1 és C2), ezek a replikációhoz szükségesek (74. ábra). A transzláció
egyszerre, két irányban megy végbe. Maga a nukleinsav-replikáció kétszálú formák (dsDNS) képzésével, ún.
„forgó kerék” (rolling circle) formában valósul meg, amely folyamatban a gazdanövény fehérjéi is szerepet
kapnak. A fehérjeszintézis ún. naszcens RNS-primerek segítségével történik (Dhar és Singh, 1995).
74. ábra - A geminivirusok génszerveződése és lehetséges géntermékei. Magyarázat a
szövegben [Mullineaux et al., 1984 után]
A replikáció a sejtmagban történik, ugyanitt halmozódnak fel a kész virionok is, gyakran kristályos
elrendeződésben. A citoplazmában granuláris zárványok figyelhetők meg. Számos geminivirus a floem
parenchima szöveteiben található nagyobb mennyiségben (Harrison, 1985).
A kétszálú geminivirusok [pl. a bab aranysárga mozaik vírus (bean golden mosaic bigeminivirus, újabban: bean
golden mosaic begomovirus)] szekvenciái – a közös régiótól eltekintve – eltérőek. Elnevezésük szerint a két
szál: DNS-A és DNS-B. Ezek felépítése is elkülönül virion részre és komplementer szálra, tehát a transzkripció
itt is egyszerre két irányban valósulhat meg. A DNS-A szálon átfedésben a replikációs fehérjék (AC1, AC2,
AC3) olvasódnak le. Ezek közül az AC1 elég a replikációhoz, a többi termék csak a hatásfokot növeli. A DNS-
A komplementer szál két fehérjét (AV1 és AV2) kódol. Az első szerepe nem ismert, a második a köpenyfehérje.
A DNS-B szál virion része és komplementer régiója is egy-egy transzlokációs fehérjét (movement protein)
kódol (BV1, BC1). A geminivirusok replikációja a sejtmagban megy végbe, itt jellegzetes fibrilláris
citopatológiai elváltozásokat is okoznak. A virionok parakristályok formájában itt halmozódnak fel.
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
169 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Újabban olyan egyszálú DNS-vírusokat fedeztek fel, amelyek a geminivirusokhoz hasonló felépítésűek,
virionjaik izometrikusak, de nem ikervirionokból állnak. Növénypatogén képviselőik pl. a levéltetvekkel terjedő
banán csúcscsokrosodás vírus (banana bunchy top nanavirus) vagy a kabócák útján fertőző kókusz hajtás
leromlás vírus (coconut foliar decay nanavirus). E víruscsalád (Circoviridae) genomja a geminivirusnak
mintegy fele (kb. 1 kilobázis). A genom szerveződése távoli hasonlóságot mutat a geminivirusokkal. A
hurokképződés itt is megfigyelhető egy fehérjét nem kódoló szakaszon, és feltehetően hasonlóság van a
génkifejeződésben is (Chu et al., 1995).
3.7. A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) replikációja: negatív és ambiszensz nukleinsavak transzlációja
A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) kb. 80–100 nm, változó nagyságú, nem
teljesen gömb alakú (teleomorf) virionjait – a többi növénypatogén vírusoktól eltérően – kettős glükoproteid
burok veszi körül. A virionban három nukleinsavszál foglal helyet. A leghosszabb (L-RNS) szál (8,9 kb) negatív
polaritású. A középső (M-RNS 4,8 kb) és a rövid (S-RNS 2,9 kb) szál kezdeti (5‟ végi) szakasza pozitív, végső
(3‟ felőli) negatív, azaz kettős (ambiszensz) jellegű (75. ábra). A negatív RNS-szál információja csak úgy
nyilvánulhat meg, ha róla egy pozitív, azaz messenger aktivitású komplementer szál képződik. E mRNS terméke
egy nyitott leolvasási szakasznak megfelelő (331 kD nagyságú) protein. A másik két vírus RNS (M és S)
ambiszensz jellege azzal az előnnyel jár, hogy a rajtuk levő gének egyszerre olvasódhatnak le. A pozitív részen
ez közvetlenül megy végbe, míg a negatív részről ugyanúgy mRNS segítségével, mint az L (–) szál esetében is
történik. A leghosszabb RNS-szál (L) fehérjeterméke 331 kD, ami a nukleinsav-szekvencia alapján feltehetően a
polimeráz enzim. Az S-RNS két fehérjét (N 28,8 kD és NSs 54,2 kD) kódol, az M-RNS pedig az NSm-fehérje
(33,6 kD) és a két glükoproteid (G1/G2 127,4 kD) szintézisét irányítja (de Haan, 1994).
75. ábra - A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) osztott
genomja és génkifejeződése. mRNS = messenger RNS, vRNS = vírus-RNS, p = fehérje
(protein), kD = kilodalton. Magyarázat a szövegben [German et al., 1992 után]
A replikáció helye a viroplazmában van. A glükoproteid-membrán vagy az endoplazmatikus retikulumból, vagy
a Golgi-készülékről szakad le és burkolja be a virionokat. Ennek megfelelően a glükoproteid-burok egy része
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
170 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
gazdanövény eredetű, hasonlóan a gerinceseket fertőző bunyavirusokhoz, amelyeknél a glükoproteid-burkokat a
gazdaszervezet szolgáltatja.
A tospovirusok különös érdekessége a defektív részecskék képződése. Sorozatos mechanikai átvitelek után
glükoproteid-burok nem képződik, ami azzal jár, hogy a burok nélküli vírusrészecskék elvesztik tripsz
vektorokkal (Thrips spp., Frankliniella spp. Scirtothrips ssp.) történő átvihetőségüket.
3.8. A vírusok parazitái: a szatellit vírusok és a szatellit RNS-ek replikációja
Szatellit vírusok
Már az 1920-as években felfigyeltek arra, hogy egyes, a dohány nekrózis vírussal (tobacco necrosis necrovirus)
fertőzött növényekben nemcsak a dohány nekrózis vírusra jellemző 30 nm átmérőjű izometrikus virionokat
lehetett kimutatni, hanem azoknál lényegesen kisebb, 18 nm átmérőjű, ugyancsak izometrikus virionokat is.
Ezek a szatellit vírus elnevezést kapták, hasonlóan a nagyobb égitestek mellett előforduló kis bolygókhoz
(szatellitek). Ezek a csak részben vagy egyáltalán nem önálló virionok egymagukban nem fertőzik a
növényeket, csak az őket segítő (helper) vírussal együtt. A satellivirusok jellegzetes képviselője, a szatellit
dohány nekrózis vírus (tobacco necrosis satellivirus) replikációjában az őt segítő helper vírustól specifikusan
függ. E sajátos függés alapja, hogy a szatellit vírus genomja replikációra képtelen, e folyamathoz a segítő vírus
replikáz enzimét használja fel, mintegy a helper vírust parazitálva. A szatellit dohány mozaik vírus mintegy
1200 bázis nagyságú genomja csak egy gént kódol, a saját köpenyfehérje-szintéziséhez szükséges információt
tartalmazza. A helper és szatellit virionok köpenyfehérjéje teljesen eltér egymástól. A hosszú, fehérjét nem
kódoló szakasz szerepe szinte ismeretlen, feltételezhetően a virion stabilitásában van szerepe.
A szatellit vírusok jelenléte egyes esetekben lényegesen befolyásolja a tünetek megjelenését, azok erősségét.
Ennek oka az, hogy a szatellit jelenlétében – feltehetően versengés következtében – visszaszorul a helper vírus
replikációja. Hasonló működésű szatellit vírusokat [pl. szatellit köles mozaik vírus (panicum mosaic
satellivirus)] is leírtak, de ezek nincsenek egymással rokonságban.
Szatellit RNS-ek
Az 1970-es években Elszász tartományban figyeltek fel a paradicsom járványos pusztulására. A fertőzött
növényekből az uborka mozaik vírust (cucumber mosaic cucumovirus) izolálták. A tisztított vírus nukleinsav-
vizsgálata azonban azt mutatta, hogy az uborka mozaik vírus három genomi és egy szubgenomi RNS-e mellett
még egy ötödik, rövid nukleinsav is előfordult a virionokban enkapszidált formában (Kaper és Waterworth,
1977, 1981). Ez az ötödik, az uborka mozaik vírushoz kapcsolt nukleinsavszál (cucumber mosaic virus
associated RNA5, CARNA5) okozta a tünetek súlyosságát, a beteg növények teljes pusztulását. A CARNA5
jelenléte a virionokban nem befolyásolta a levéltetű-átvitelt.
A CARNA5 genom 330–390 bázis nagyságú. A helper vírusához hasonlóan a szatellit RNS 5‟ vége metilált
(m7Gppp), 3‟ végén hidroxilcsoport van. A genomon egytől három nyílt leolvasási szakasz is van, ezek azonban
in vivo fehérjét nem kódolnak. A szatellit vírusokhoz hasonlóan a szatellit RNS-ek jelenléte az inokulumban
jelentősen csökkenti a fertőzőképességet. A helper vírus RNS1 és RNS2 egyes szakaszai komplementerek a
szatellit RNS-sel, illetve maguk is képesek megkötni a helper vírus köpenyfehérjéjét. Ez a térszerkezet teszi
lehetővé a szatellit RNS-ek beépülését a helper vírus virionjaiba.
A helper vírusokhoz hasonló felépítésű szatellit RNS-ek replikációja a helper vírustól függ. Abban az esetben,
ha a szatellit RNS nem hasonlít a helper vírusra, akkor egy negatív templáton alapuló, autokatalitikusan bomló
kétszálú RNS-ről képződnek az új RNS-szálak (forgó kerék mechanizmus). Ez a viroidokra jellemző replikációs
formához hasonló.
Számos vírusnál [pl. földimogyoró satnyulás vírus (peanut stunt cucumovirus)] is megfigyelték a szatellit RNS-
ek jelenlétét, a nepovirusok körében pedig általánosan előfordulnak (Murant és Mayo, 1982; Francki, 1985). Azt
is megfigyelték, hogy a szatellit vírusok jelenléte – a helper vírus replikációjának visszaszorítása révén –
csökkentheti is a tüneteket. Harrison et al. (1987) kimutatták, hogy az uborka mozaik vírus szatellit RNS-sel
transzformált dohánynövényekben az uborka mozaik vírus tünetei mérséklődtek és replikációja is gátlást
szenvedett, a rendszer biológiai védekezésre alkal-mas volt.
A szatellit vírusok annyiban hasonlók a szatellit RNS-ekhez, hogy a) mindkettő genomja rövid, egyszálú RNS;
b) a replikációjuk a helper vírustól függ; c) a replikációjuk visszaszorítja a helper vírus replikációját; d) saját
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
171 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
RNS-templátjukat használják fel; e) jelenlétük a tüneteket befolyásolja (gyengíti vagy erősíti). Különbség, hogy
a szatellit vírusok önálló virionokat alkotnak, míg a szatellit RNS-ek a helper vírussal közösen
enkapszidálódnak.
Szatellit DNS-ek
Újabban a paradicsom levélgöndörödés vírussal (tomato leaf curl bigeminivirus = begomovirus) kapcsolatban
szatellit DNS-t mutattak ki (Dry et al., 1998). Ez az első adat arra vonatkozóan, hogy nemcsak szatellit RNS-
molekulák, hanem szatellit DNS-molekulák is vannak.
3.9. Defektív interferáló RNS-ek: a vírusreplikáció hibás termékei
A paradicsom bokros törpülés vírus (tomato bushy stunt tombusvirus) esetén kimutatták, hogy a fertőzött
növényekben a vírusreplikáció során néha olyan „hibás” virionok is keletkeztek, amelyek nem a teljes genomot,
hanem annak töredékeit tartalmazzák (Hillmann et al., 1987). Ennek megfelelően ezek a nukleinsavak homológ
szekvenciákat mutatnak az eredeti vírus RNS-sel, deléciós mutánsként is felfoghatók. Általában defektív
interferáló RNS-eknek (DI) nevezzük, mert felszaporodásuk a fertőzött növényekben jelentősen gátolja a teljes
genomú vírus replikációját és a betegség tüneteit. A defektív RNS-ek replikációja és enkapszidációja teljesen a
„helper” vírustól függ. Kialakulásával kapcsolatban kétféle feltevés is van: (1) a replikáció során meghatározott
helyeken autokatalitikus vagy enzimatikus hasítással jöttek létre; vagy (2) az RNS-polimeráz a replikáció során
ugyanannak az RNS-nek más pontjára „átugrott”. Ez utóbbi feltételezést több kísérleti érv is támogatja (Roux et
al., 1991).
Defektív interferáló RNS-ek gyakran fordulnak elő a tombusvirus nemzetségben [pl. cymbidium
gyűrűsfoltosság vírus (cymbidium ringspot tombusvirus)] (Burgyán et al., 1989), de az állatpatogén vagy a
gombákat fertőző vírusok között is.
4. A vírusok rokonsága, a vírusok törzsfejlődése
Egyes vírusok teljes nukleinsav-szekvenciájának megismerése azzal a meglepő eredménnyel járt, hogy
egymástól morfológiailag távol eső (pl. izometrikus és helikális) vírusok virionokat nem alkotó fehérjéinek
(tehát nem a köpenyfehérjéknek) a kódjai nagymértékű szekvenciahomológiát mutattak egymással, illetve egyes
állatpatogén RNS-vírusok azonos típusú génjeivel. Az nem volt meglepő, hogy egyes taxonómiai egységekben
(pl. víruscsaládok) a génkifejeződés hasonló utakat követ, az azonban igen, hogy rendszertanilag igencsak távoli
taxonok replikációs stratégiája is azonos megoldásokon alapszik (Matthews, 1985).
Felvetődött, hogy maga a növény- és állatpatogén vírusok merev elkülönítése is mesterséges, és valójában e két
fő – eddig mereven elkülönített – víruscsoport evolúciós rokonságban van egymással. Azoknak a
víruscsaládoknak a megismerése, amelyek egyes tagjai állat-, mások növénypatogének (Reoviridae,
Rhabdoviridae és Bunyaviridae), megerősítették ezt a feltételezést.
4.1. Vírus-„szupercsaládok”
Picornavirusokhoz hasonló növényvírusok
A comovirusok [pl. tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus)], a nepovirusok [pl. paradicsom fekete
gyűrűs vírus (tomato black ring nepovirus)], és bizonyos mértékig a potyvirusok [pl. burgonya Y-vírus (potato Y
potyvirus)] közös tulajdonságokat mutatnak a Picornaviridae családba tartozó poliovirusokkal. Közös
tulajdonságaik a következők: 1. az egyszálú (+) RNS genom VPg-t hordoz az 5‟ végen, a 3‟ vég pedig
poliadenilált; 2. a géntermékek egy hosszú poliproteidből transzláció után hasadnak egy vírus által kódolt
proteáz segítségével; 3. a genom több hasonló szerepű, nem-szerkezeti fehérjét kódol, amelyek aminosav-
szekvenciája meglehetősen hasonló (g 20%); 4. az ún. konzervált szekvenciák a genomban hasonló
elrendezésűek (76. ábra).
76. ábra - A tehénborsó mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus) és a poliovirusok
fehérjegénjeinek hasonló elrendeződése és konzervált szekvenciái. CPMV = tehénborsó
mozaik vírus (cowpea mosaic comovirus). VP = vírusprotein, VPg = vírusgenomhoz
kötött fehérje. A pontozott részek a homológ szekvenciákat jelölik [Matthews, 1985
után]
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
172 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Bár az említett vírusok köpenyfehérjegénjei igen különbözőek, mégis mind a comovirusok, mind a poliovirusok
izometrikus virionjai kétféle köpenyfehérjéből hasonló módon épülnek fel (Goldbach, 1986). A potyvirusok
némileg elkülönülő csoportot alkotnak, ezek köpenyfehérje-génje ugyanis az RNS-szál 3‟ végén helyezkedik el.
Sindbisvirusokhoz hasonló növényvírusok
Az elmondottakhoz hasonlóan nagy meglepetést okozott az a felfedezés is, hogy egyes, felépítésükben
ugyancsak eltérő (izometrikus és helikális, osztatlan és osztott genomú) növénypatogén vírusok (Alfamovirus,
Bromovirus, Tobamovirus) hasonló transzlációs stratégiát követnek. Közös jellemzőik az alábbiak: 1. az
egyszálú (+) RNS genom 5‟ végén sapka van, ugyanakkor a 3‟ vég eltérő lehet; 2. a lucerna mozaik vírus és a
rozsnok mozaik vírus RNS1 és RNS2 által kódolt fehérjék három szakaszban (mintegy 250–300 aminosav)
nagy szekvencia-homológiát mutattak egymással, valamint a dohány mozaik vírus 126 és 183 kD fehérjéivel; 3.
e fehérjék szerepe a vírus-RNS-szintézisben van, polimeráz-aktivitásúak; 4. hasonlóság mutatkozik mindhárom
esetben a kb. 30 kD fehérjék és a köpenyfehérjék szintézisében is, ami szubgenomi RNS-ek segítségével valósul
meg (77. ábra). A dohány mozaik vírus átírt fehérje (183 kD) és a rozsnok mozaik vírus RNS2 terméke
aminosav-szekvenciájában, valamint a gének elrendeződésében hasonló a Togaviridae család gerincteleneket és
gerinceseket egyaránt fertőző sindbisvirusokhoz.
77. ábra - A lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus), a rozsnok mozaik vírus
(brome mosaic bromovirus) és a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus)
genomszerveződésének hasonlósága a szekvenciában homológ szakaszokkal. AMV =
lucerna mozaik vírus, BMV = rozsnok mozaik vírus, TMV = dohány mozaik vírus, CP =
köpenyfehérje. A vonalazott részek a megfelelő konzervált szakaszok [Matthews, 1985
után]
A luteovirusok szupercsaládja átmeneti típus-e?
Újabban egyre több bizonyíték szolgál annak erősítésére, hogy a luteovirusok is egy önálló szuperfamília alkotói
lehetnek. E csoportba a tombusvirusok, a dianthovirusok, a hordeivirusok és a luteovirusok, esetlegesen a
sobemovirusok tartoznak, részben a szekvencia-homológia, részben a gének működése és elrendezése alapján. A
csoportnak közös vonásai vannak a Sindbis és a Picornavirus szupercsaláddal, lehetséges, hogy összekötő
kapocsként szerepelnek e két taxonómiai csoport között. Mindezek a lehetőségek már a jelenlegi
vírustaxonómiában is tükröződnek.
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
173 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Pararetrovirusok: a retrovirusokhoz hasonló növényvírusok
Korábban azt gondolták, hogy csak a gerinceseket fertőző, tumort okozó RNS-vírusok replikációja történik
fordított transzkripcióval, azaz a reverz transzkriptáz segítségével. Később igazolták, hogy egyes DNS-vírusok,
mint pl. a hepatitisz B-vírus vagy a növénypatogén karfiol mozaik vírus hasonlóan replikálódnak. A
retrovirusok reverz transzkriptáz enzime hasonló szekvenciákat mutat, mint a hepatítisz B-vírus vagy a karfiol
mozaik vírus reverz traszkriptáz enzim, utalva e vírusok rokonságára. Hasonlóságot fedeztek fel a proteázok és
endonukleázok megfelelő szakaszain is.
4.2. Feltételezések a vírusok törzsfejlődéséről
Az állat- és a növénypatogén vírusok aminosav-szekvenciáiban talált hasonlóságok felvetették a vírusok
evolúciós rokonságának kérdését. Hogyan lehetséges, hogy az állat- és a növényvilág már 1,2 × 109 évvel ezelőtt
olyan elvált, genetikai parazitákkal rendelkezik, amelyek génjei hasonló elrendeződésűek és hasonló fehérjéket
kódolnak?
A vírusok törzsfejlődésére vonatkozólag több hipotézis is van: 1. a vírusok közös eredetűek (monofiletikus
származás), azaz közös őstől erednek, és ökológiai tényezők miatt különültek el az eltérő gazdaszervezetek
alapján; 2. az eredetileg különböző eredetű vírusok párhuzamos evolúció során váltak hasonlókká (polifiletikus
származás), vagyis az azonos feladatot betöltő fehérjék hasonló szerkezetűekké váltak. A 3. feltételezés szerint a
vírusok egymástól függetlenül fejlődtek ki, úgy, hogy a gazdaszervezettől transzdukcióval hasonló, a
replikációhoz szükséges, önálló, konzervált géneket vettek át (Goldbach, 1986).
A lehetséges változatok közül az első feltevés a legvalószínűbb, tehát az, hogy a vírusok közös eredetűek, és a
különböző irányú evolúció következményeként eltérő vírusok fejlődtek ki, amelyek azonban magukon viselték a
rokonság konzervatív bélyegeit. E felosztásnak megfelelően a növénypatogén RNS-vírusok eddig két
szupercsoportba (Picornavirus és Sindbisvirus) sorolhatók, más állatpatogén vírusokkal együtt. Ennek jó
példáját mutatja a comovirusok és a poliovirusok hasonlósága. Ugyanebbe a Picornavirushoz hasonló csoportba
oszthatók az egykomponensű potyvirusok és a kétkomponensű nepovirusok is. A másik szupercsoportot a
Sindbisvirusokhoz hasonló növényi vírusok alkotnák, amelyhez a bromovirusok, cucumovirusok és
tobamovirusok tartoznak. Az említett szupercsoportok bár nagy morfológiai eltéréseket mutatnak, ezek azonban
éppen a belső extracelluláris lehetőségekhez való alkalmazkodást tükrözik. Ennek eredménye lehet az, hogy
különösen a védő szerepet betöltő köpenyfehérje mutatja a legváltozatosabb formákat, a legnagyobb eltéréseket.
Ugyancsak nem meglepő, hogy a vírustörzsek (pl. a potyvirusok esetében) általában a köpenyfehérje-
szekvenciákban térnek el leginkább egymástól.
Hasonlóan szuperfamíliaként lehet kezelni azokat a vírusokat is, amelyek sajátos replikációjuk folytán reverz
transzkripciót követnek. A caulimovirusok e tekintetben a retrovirusokhoz hasonlóak, a pararetrovirusok
csoportját alkotják.
A vírusok újszerű csoportosításában eltűnik a megszokott különbség a genom osztottsága és osztatlansága
között. E tekintetben az evolúciós előny mindenképpen a multikomponens-vírusoké. A genom osztottságából
adódó előnyök a következők: a) az RNS-ek gyors rekombinációs újrarendeződésére adnak lehetőséget; b)
megnövelhető a genom mérete (nincsenek enkapszidációs problémák); c) csökken a mutagén és károsító hatások
lehetősége, javul az RNS-replikáció megbízhatósága; d) könnyebbé válik a transzláció önellenőrzése, a
termékek arányainak önszabályozása; e) a kis virionok vektorokkal történő átvitele könnyebbé válik, egyszerűbb
lesz a virionok mozgása a növényen belül (Goldbach, 1986).
Mindezek az előnyök azonban egy esetben, a mechanikai átvitelben bizonyos mértékig eltűnnek. Míg az
egykomponensű vírusok fertőzéséhez elvben egyetlen virion is elegendő, az osztott genomú vírusoknál ez
többszörös, hiszen a fertőzés helyén, ugyanabban a sejtben egyszerre minden komponensből legalább egynek
jelen kell lennie ahhoz, hogy a fertőzés eredményes legyen. A rovarokkal vagy a maggal történő vírusátvitel
esetén ez biztosított is, ezért lehetséges az, hogy a növénypatogén vírusok körében gyakori a genom osztottsága.
Evolúciós szemszögből tekintve az osztott genom fejlettebb formát jelent (Goldbach, 1986).
Az állat- és növénypatogén vírusok közös eredetének több bizonyítéka van. Több rovarpatogén RNS-vírus is
növényi betegségeket okozhat. Feltehetően ez a csoport a legújabb idők evolúciós terméke. A növénypatogén
vírusok egy részét ugyanis rovarok terjesztik, közülük több (rhabdovirusok, luteovirusok, reovirusok,
marafivirusok, tenuivirusok, tospovirusok) a rovar testében is replikálódik. Ugyanakkor ismertek olyan RNS-
rovarvírusok is, amelyek emlősöket is fertőznek. A rovarpatogén vírusok között több az RNS jellegű.
Feltételezések szerint a növénypatogén comovirusok és a gerincespatogén picornavirusok ilyen közös
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
174 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
rovarvírusoktól származnak. A rovarpatogén RNS-vírusok között osztott genomú is van (nodamuravirusok). Ez
a forma a növénypatogén vírusok esetében gyakori, az állatpatogéneknél azonban nem fordul elő. A
rovarpatogén RNS-vírusok e tekintetben is összekötő láncszemet, evolúciós átmenetet jelentenek a
növényvírusok származására.
Az evolúció mechanizmusa
A vírusok gyors változásokra képesek, hamar alkalmazkodnak a megváltozott körülményekhez. E változások
hosszú evolúció eredményei, és ebben szerepet játszott a gazdaszervezettel való tartós együttélés,
alkalmazkodás, együttes fejlődés, a koevolúció is. Ismert, hogy egyes víruscsoportok melyik földrészen
fordulnak csak elő, vagy az, hogy pl. a tymovirusok Európában vagy Amerikában stb. eltérőek. Egyes vírusok
földrajzi eredete is jól meghatározható (pl. burgonyapatogén vírusok). A vírusevolúció ma is tartó folyamat,
amelynek mozgatórugói a genomot érő külső hatások.
Általában a legnagyobb evolúciós erőt a mutációk, a rekombinációk, a gének újrarendeződése (gene
reassortment), esetenként a gének megkettőződése vagy kiesése jelenti, de lehetséges egyes növényi gének
átvétele is (Roossinck, 1997). A génekben történt kis szekvenciaváltozások összegeződve a vírusok
mikroevolúcióját eredményezik, míg a nagyobb szakaszokat érintő génkicserélődések következménye a
biológiai funkciók erőteljes változásával járó makroevolúció.
A géneket károsító erők minden élő szervezetre egyaránt hatnak. A növényvírusfajok nukleotid szekvenciái
azonban – összevetve más fajokkal – igen nagy eltéréseket mutatnak, bizonyítva, hogy ezek a hatások a vírusok
esetében kifejezettebben érvényesülnek. Ennek okai a növényvírusok jellegéből fakadnak.
A növénypatogén vírusok túlnyomó többségét jelentő (+) RNS-vírusok replikációja az RNS-től függő RNS-
polimeráz enzimhez kötött. Az átírás hibaszázaléka magas, 10–4, ami 10 kilobázisonként átlagosan egy tévedést
jelent. Ennek oka az, hogy az RNS-polimeráz működéséhez nem igényli a bázispárosodást, tehát kevéssé függ a
primer jelenlététől. Káros oxidációs hatások gyakran okoznak a genomban mutációkat. Egy sejtet átlagosan
egyetlen nap mintegy 10 000 „ütés” ér, amit a szervezet reparáló hatásai legtöbbször hatástalanítanak.
Míg a kettős szálú DNS bázispárosodása miatt a DNS-genom jobban védett a mutagén hatásoktól, addig az
RNS-genom ezekkel szemben sokkal érzékenyebb, ami újabb és újabb vírustörzsek kialakulását
eredményezheti. E módosulások az egyes vírustörzseknél a gazdanövénykör szűkülését vagy tágulását egyaránt
eredményezhetik (Roossinck, 1997).
A rekombináció lehetősége mind az RNS-, mind a DNS-vírusoknál egyaránt előfordul. E hatást leginkább a
defektív interferáló (DI) RNS-ek, illetve a vírusok deléciós változatai esetén tanulmányozták, amelyeknél a
homológ rekombináció révén a hiányos szekvenciák regenerálódhatnak. Azonos vírusok törzsei vagy hasonló
vírusfajok kevert fertőzései is gyakran eredményezhetnek rekombinációt, ami fontos eredő pontja lehet új
vírusok, vírustörzsek kialakulásának. A egyes növénypatogén vírusok (luteovirusok, nepovirusok, bromovirusok
és cucumovirusok) változékonyságában bizonyított a rekombináció nagy jelentősége (Nagy és Bujarski, 1995;
Roossinck, 1997). Az új vírus (törzs) életképességét a természetes szelekció dönti el.
Néhány növényvírusnál bizonyítható a génkicserélődés is, mint a génexpresszió ellenőrző mechanizmusa. A
hybrigeminivirusoknál például egyes mesterségesen előállított pszeudo-rekombináns esetén bizonyították egyes
génszakaszok újrarendeződését. Hasonló jelenséget figyeltek meg természetes körülmények között az uborka
mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) és a földimogyoró satnyulás vírus (peanut stunt cucumovirus)
nukleinsavai között is, ahol az RNS3-szál cseréje történt meg. Bár a génkicserélődés nem túl gyakori jelenség,
egy új vírus kialakulásában drámai jelentőségű lehet. A vírusok közötti tartós kapcsolat meglepő eredményre
vezethet. Ennek példája a borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic enamovirus) esete, amelynek RNS1
frakciója a luteovirusokkal mutat rokonságot, míg az RNS2 – amely a replikáz enzim kódját tartalmazza – a
carmovirusokhoz és a tombusvirusokhoz hasonló.
Egyes vírusok esetén a komplex fertőzések az RNS-rekombináció vagy a hetero-enkapszidáció révén új
konstrukciók kialakulását eredményezik, azaz egy vírusfaj a másik vírusfaj köpenyfehérjéjével burkolódik be.
Ez a vektorátvitel megváltozását is jelentheti. E lehetőség kísérletileg bizonyított, így környezetvédelmi
szempontból néha joggal vetődik fel az a félelem, hogy a vírusgének felhasználásával előállított transzgenikus
növények révén új, patogénebb vírustörzsek is keletkeznek. Napjaink génsebészeti törekvései ezért inkább arra
irányulnak, hogy a patogén eredetű rezisztencia kialakítása helyett inkább a növények természetes
rezisztenciagénjeit kutassák fel, és ezeket használják fel a genetikailag módosított szervezetek előállítására.
A vírusgenom szerveződése és a
vírusok replikációja
175 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az evolúciós vizsgálatok felvetik a vírusok eredetére vonatkozó kérdéseket is. Felmerült az az elképzelés is,
hogy a vírusok egy sejt előtti, precelluláris világ fosszíliái, amelyek a földi élet kialakulásában és a gének
horizontális mobilitásában fontos szerepet játszanak (Roossinck, 1997). Matthews (1991) összefoglaló
véleménye szerint a növénypatogén vírusokon belül négy evolúciós csoport körvonalai bontakoznak ki: 1.
egyszálú pozitív RNS-vírusok; 2. a növénypatogén reovirusok, rhabdovirusok és bunyavirusok; 3.
caulimovirusok és 4. geminivirusok, amelyek feltehetően a prokariotikus szervezetek vírusaiból származnak.
176 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
14. fejezet - Szerológiai vizsgálati módszerek
1. Immunológiai alapfogalmak
A növényvírusok többféle (1–10) proteint kódolnak, amelyekből a zárványfehérjék és a köpenyfehérjék
fordulnak elő a legnagyobb koncentrációban a fertőzött növényben. E kettő közül a köpenyfehérjék azok,
amelyeket antigénként a leggyakrabban felhasználnak a vírusfertőzés kimutatására (Matthews, 1957; Siitari et
al., 1986; Brakke, 1990). A szerológiai reakciók alapelve az a felismerés, hogy ha melegvérű állat vérébe nagy
molekulatömegű fajidegen anyag (pl. fehérje) kerül, akkor ez az állat vérsavójában ellenanyag (antitest,
immunoglobulinok) képződését indukálja. Az antitestképzés fajlagos, azaz egy antigén hatására csak a neki
megfelelő antitest képződik. Az antitestek a nekik megfelelő antigéneket felismerik, így létrejön az
immunválasz-reakció, ami lehetővé teszi a kórokozó pontos azonosítását.
1.1. Az immunválasz
Az antigén hatására bekövetkező immunválasz molekuláris magyarázata Harlow és Lane (1988), Long és Kindt
(1988), Ezquerra és Coligan (1988), továbbá Fox (1988) kutatók nevéhez fűződik.
Az antigén-specifikus antitestképződéshez az állatban háromféle, egymással kölcsönhatásban álló sejt (az ún.
antigénhez kapcsolódó sejt, továbbá a T sejt és a B limfocita sejt) összehangolt működése szükséges. Ha az
antigén bekerül az állat testébe, az antigénhez kapcsolódó ún. APC sejtek (APC: antigen-presenting cell) a
makrofágokhoz hasonlóan bekebelezik és átformálják azt (78A ábra). Ezután a „megemésztett” antigén az APC
sejt felszínére kerül, ahol egy speciális, kompatibilis, ún. MHC (MHC: major histocompatibility molecule)
molekulához kapcsolódik. A következő lépésben a T sejt – amely mind az átformált antigén, mind pedig az
MHC molekula kapcsolódásához alkalmas receptorhelyekkel rendelkezik – összekapcsolódik az APC sejttel
(78B ábra). Ekkor az APC sejt felületén létrejön egy három molekulából álló komplex, a T sejt
antigénreceptora, az átformált antigén és az MHC molekula között (78C ábra). Ez a komplex az APC és a T
sejteket oldékony anyagok, ún. interleukinok (IL-1, IL-2) kiválasztására serkenti, amelyek a T sejteket
aktiválják (78D és 78E ábra). Az aktivált T sejtek ezután az antigénhez kapcsolódó B sejtekhez kötődnek.
Ekkor a T sejtek elkezdik az IL-4 és IL-5 anyagok termelését, amelyek a B (limfocita) sejtek osztódását és
differenciálódását stimulálják (78F ábra). Megfelelő serkentés esetén a B sejt immunoglobulin-genomja
közvetlenül antitest képződését indukálja. Ha az állat immunrendszere később ugyanazzal az antigénnel
találkozik, az immunoglobulin genom azon része, amely az antigénmegkötő sajátságért felelős, szomatikus
mutációk sorozatán megy át. Ezek a mutációk pedig antitestek képződését indukálják, melyek többé-kevésbé
affinisak az adott antigénre.
78. ábra - Az antigén, az antigént megjelenítő sejt, a T és a B nyiroksejtek közötti
kölcsönhatás [Hampton et al., 1990 után]
Azok a B sejtek, amelyek az antigénnel szemben nagymértékű affinitással rendelkező antitestet képeznek, több
és több antigént vonzanak, gyorsan növekednek, osztódnak és még több magas affinitású antitestet képeznek. A
T sejtek által kiválasztott IL-5 anyag – más szignálokkal együtt – arra serkenti a B sejteket, hogy vagy rövid (3–
Szerológiai vizsgálati módszerek
177 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
4 napos) élettartamú, nagy mennyiségű antitestet kiválasztó plazmasejtekké, vagy pedig hosszú élettartamú, ún.
memory (emlékező) sejtekké differenciálódjanak. Az ún. memory B sejtek elsőrendű feladata, hogy reagáljanak
egy újabb antigénstimulusra, és nem az antitestek kiválasztása, hanem inkább azok megjelenítése történik meg a
felületükön (78F ábra).
Egy anyag akkor antigén, ha egy melegvérű állat sejtjeiben, ill. testnedvében immunválaszt indukál. Antigén
sajátságokkal a nagy molekulatömegű anyagok rendelkeznek. Bár az alacsony molekulatömegű anyagok is (pl. a
10–15 aminosavból álló szintetikus fehérjék) megemésztődnek és kifejezésre jutnak az APC sejt MHC
molekuláján, túl kis méretűek ahhoz, hogy az APC sejt MHC molekulája és a T sejt receptora egyidejűleg
felismerje őket. Egyes esetekben a kis molekulatömegű anyag antigén sajátosságát növelni lehet, ha azt kémiai
úton nagyobb molekulatömegű molekulához rögzítjük (Harlow és Lane, 1988).
1.2. A vírus-köpenyfehérje felépítése és antigén tulajdonságai
Az epitóp fogalma és típusai
A vírus-köpenyfehérjének azt a (minimum 5–7 aminosavból álló) szakaszát, amely az antitesttel kapcsolatba
lép, epitópnak nevezzük. Egy fehérjén egy vagy több ilyen ún. antigén tulajdonsággal rendelkező szakasz lehet.
Az epitópok lépnek kölcsönhatásba az állatok által produkált antitestekkel. Az epitópok különböző típusainak a
meghatározására olyan szintetikus peptideket alkalmaznak, amelyek a természetes fehérjék fragmentumai
(Jerne, 1974; van Regenmortel, 1988). Az epitópoknak többféle típusa van. A véletlenszerűen összecsavarodott
szerkezetű fehérjeszakasz az ún. szekvenciális epitóp. A specifikus szerkezetű fehérjeszakaszt konformációs
epitópnak nevezzük, amelyen belül folyamatos (két vagy több aminosavcsoportba tartozó aminosavak
kapcsolódnak egymáshoz) és megszakított (két különálló peptidlánc kapcsolódásából, vagy egyetlen
összecsavarodott peptidláncból álló fehérjeszakasz) epitópokat különböztetünk meg. A kriptotópok olyan, ún.
„rejtett” epitópok, melyek csak az antigén disszociációja, fragmentációja vagy denaturációja után válnak
immunogénné. Ha az antitest enzimmel kapcsolt szubsztráton lép az epitóppal kölcsönhatásba, akkor neotópnak
hívjuk az epitópot. A metatópok olyan epitópok, melyek a köpenyfehérjének a disszociált és a polimerizált
formáján is jelen vannak. A semleges vagy neutralizációs epitópok olyan antitestek felimerésére képesek,
melyek a vírus fertőzőképességét semlegesítik.
A fehérjealegységek antigén sajátosságának erőssége attól függ, hogy a molekulán hol helyezkednek el. A
hidrofil aminosav-maradványok, amelyek a folyamatos epitópoknak felelnek meg, általában az antigén külső
részén vannak. A hidrofób maradványok kevéssé hozzáférhetőek az immunrendszer számára, hacsak a molekula
nem denaturálódik. A flexibilis (10–20 nm) mozgással rendelkező epitópok szorosabb kölcsönhatásba lépnek az
antitesttel, mint a merev molekulák. Egy molekula hidrofil régiója, mely a szegmentális mobilitásért felelős, a
folyamatos epitópnak felel meg. Egy molekula karboxil- és aminocsoport-végei nagyfokú mobilitást tesznek
lehetővé. Ezek a terminális részek a molekula felületén elhelyezkedve tipikus folyamatos epitópokat alkotnak. A
rövid aminosav-szekvenciával rendelkező fehérjeszakaszok egyedülálló epitópot képviselnek a diagnosztikai
elkülönítésben. Valószínűleg ezek a régiók tolerálják a DNS-mutációkat, mert feltehetőleg nem szerepelnek
abban a kölcsönhatási kapcsolatban, amely a molekula összecsavarodásáért felelős (van Regenmortel, 1988).
1.3. Az antitest (immunoglobulin) felépítése és típusai
Az antitestek immunoglobulin-molekulák, amelyek antigén hatására az állat B limfocitáiban (nyiroksejtjeiben)
termelődnek. Minden molekulán minimum kettő vagy attól több, ún. paratóp helyezkedik el, amely az antigén
epitópját felismerő sajátsággal rendelkezik (Jerne, 1974). Az antitesteket két csoportba soroljuk: 1. a poliklón
antitestek több mint egy epitóppal szemben reaktívak, 2. a monoklón antitestek ezzel szemben csak egy
epitóppal reagálnak. A szakirodalom az antitest-molekulákat öt immunoglobulin (Ig) osztályba (IgG, IgM, IgA,
IgD és IgE), illetve nyolc alosztályba (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1, IgM2, IgA1 és IgA2) sorolja. Az IgA,
IgD és IgE típusú antitestek nem olyan jelentősek, mint az IgG és az IgM antitestek, ezért ezeket a
szerológiában csak ritkán alkalmazzák (Harlow és Lane, 1988).
Az IgG, IgD, IgE és az IgA antitest-molekulák mindegyike egy pár nehéz és egy pár könnyű polipeptidláncot
tartalmaz (79A ábra). A láncokat diszulfid hidak vagy pl. az IgA2 esetében nem kovalens kötések tartják össze.
Az IgM antitestek öt-öt pár könnyű és nehéz láncot tartalmaznak (pentamer szerkezet), míg az IgA két vagy
három ilyen párból áll (Barrett, 1988; 79B és C ábra). Az IgG papainnal történő emésztése során a molekula
három fragmentumra esik szét. Ezek közül két fragmentum egyforma méretű, nehéz és könnyű láncot egyaránt
tartalmaz, és antigénkötő hellyel rendelkezik (Fab fragmentumok). A harmadik fragmentumnak, amely csak a
nehéz láncot tartalmazza, antigénkötő helye nincs (Fc fragmentum) (79E ábra). A Fab és Fc fragmentumok
Szerológiai vizsgálati módszerek
178 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
közti régiót ún. „hinge” régiónak nevezzük, amely a molekula flexibilitását biztosítja, ami ahhoz szükséges,
hogy a Fab szegmensek egymástól függetlenül is tudjanak működni (79D ábra). Az IgG molekula pepszinnel
történő emésztése két Fab fragmentumot eredményez (amelyek egymással diszulfid híddal vannak összekötve),
ezenkívül (F(ab‟)2) és egy Fc‟ fragmentum is keletkezik (79F ábra). A könnyű és a nehéz lánc aminoterminális
részén 3–3, híd vagy keret (Fw: framework) által összekapcsolt determináns régió helyezkedik el. Ezek a CDR
rövidítéssel illetett helyek (CDR: complementary determining region), és bizonyos mértékig a Fw-k is, a
paratópon belül felelősek az antigénhez való kapcsolódásért. A CDR régiók aminosavsorrendje az antigéntől
függően változik, ezért ezeket hipervariábilis résznek is hívjuk (79D ábra). A CDR és a Fw régiókon kívül eső
rész kevéssé változik egy osztályon, ill. alosztályon belül, ezért ezeket konstans régióknak is nevezzük.
79. ábra - Az immunoglobulin- (IgG) molekulák felépítése és típusai enzimes hasítás
után [Hampton et al., 1990 után]
Az immunizált állatokban elsődleges immunválaszként IgM antitestek képződnek, amelynek koncentrációja a
szérumban az immunizálás után 10 nap múlva éri el a maximumát, aztán csökken. Ha az antigén sikeresen
indukálja a T sejtek válaszreakcióját, akkor ezután kb. két hét múlva IgG antitestek képződnek, a maximális
koncentrációban. Ha ugyanazt az állatot másodszorra is immunizáljuk, akkor az IgM- és az IgG-képződéshez
szükséges idő ugyanannyi lesz, mint az első immunválasz során, bár az IgG koncentrációja magasabb lesz
(Barrett, 1988). Ha az MHC molekulák inkompatibilisek egy antigénnel szemben, akkor csak IgM antitestek
fognak képződni.
1.4. Antigén–antitest kölcsönhatások
Az antigén és az antitestek között hidrogénhidak, ionos kötések, elektrosztatikus vonzóerők, Coulomb-,
hidrofób és van der Waal‟s erők által létesül kapcsolat (Harlow és Lane, 1988; Sheriff et al., 1987; van
Regenmortel, 1988).
A kapcsolódás reverzíbilis, és az affinitás erőssége a hőmérséklettől, a pH-tól és az oldhatósági viszonyoktól
függ. Ha ezek a körülmények változnak, az ugyanazon antigénnel és antitesttel végzett vizsgálatok (pl. ELISA)
eltérő eredményeket adnak. A stabil, ill. fél-reverzíbilis immunkomplexek az antigén és az antitest közötti
többszörös kölcsönhatás eredményeként jönnek létre. A stabil immunkomplexek kialakításának képességét
aviditásnak nevezzük. Az IgM típusú antitestek a 10 paratópjukkal többszörös kapcsolat kialakítását teszik
lehetővé, és nagyobb antigén-aviditással rendelkeznek, mint az IgG antitestek a maguk két paratópjával (79A és
C ábra). Az antitest egy paratópja alacsony affinitású egy antigénnel szemben. Ha ez a gyenge kölcsönhatás
megszűnik, akkor az antitest megmaradó paratópjai a közeli epitópokhoz kötődnek és stabilizálják az antitest–
antigén komplexet. Az alacsony affinitású IgM antitestnek még marad 9 paratópja, míg az alacsony affinitású
IgG antitestnek csak egy paratópja marad az antitest–antigén komplexek stabilizálásához. Ebből következik,
hogy az IgM antitestek, amelyek gyenge kapcsolatba lépnek több antigénnel, kevésbé specifikusak, mint az IgG
antitestek, mivel az IgM antitesteknek nagyobb kapacitásuk van ahhoz, hogy az antigén–antitest kapcsolatot
stabilizálják. Ezért egy ugyanolyan antigén-specifitással és gyenge affinitással rendelkező IgG nem marad
kötődve az antigénhez, és ezért nem mutatható ki úgy, mint az IgM antitest. Az antitest paratópját felépítő nehéz
és könnyű lánc hipervariábilis régiójához az antigén úgy kapcsolódik, mint ahogyan a kulcs (antigén) illik a
zárba (antitest) (Harlow és Lane, 1988). A röntgenkristálytan módszerével az antitest–antigén komplex
háromdimenziós szerkezetét már feltárták (Amitt et al., 1986; Colman et al., 1987; Sheriff et al., 1987).
2. Poliklón antitestek előállítása
Szerológiai vizsgálati módszerek
179 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A szerológiai diagnosztikában a monoklón és a poliklón antitestek közül választhatunk. A poliklón antitestek
előállítása egyszerűbb és a fajlagosságot növelni lehet, ha az antigén tisztaságát fokozzuk. Mind a poliklón,
mind pedig a monoklón antitestek keresztreakcióba léphetnek heterológ antigénekkel, vagy pedig annyira
specifikusak, hogy az ugyanazon vírus eltérő törzseiből származó heterológ antigéneket sem ismerik fel. Azt,
hogy poliklón, ill. monoklón antitesteket használjunk, a vizsgálatok típusa és célja dönti el. A poliklón
antiszérumok az antitestek változatos fajlagosságú vegyes populációját tartalmazzák, és ezért az antitest-
populációk különböző részei lehetnek reaktívak a különböző szerológiai tesztek során. Ezzel szemben a
monoklón antitestek csak egyféle típusú és specifitású homogén populációt tartalmaznak, így a tesztekben csak
egyféleképpen reagálnak. Meg kell azonban jegyezni, hogy a túlzott érzékenység hátrányos is lehet, pl. ha a
vírusban kis változás történik, és ez a változás éppen azt az antigén-determinánst érinti, amely ellen a
hibridómasejt az antitestet termeli. Ekkor a vírus felismerése elmarad, holott az a növényi mintában jelen van.
2.1. A kísérleti állat kiválasztása
Bármely melegvérű állatban (patkány, egér, tengerimalac, nyúl, csirke) immunszérum képződhet. A patkánynak,
az egérnek és a tengerimalacnak kevés a széruma. A csirkék testhőmérséklete magas, és az a vélemény, hogy a
csirkeszérum esetében az antigén–antitest-reakcióhoz magas ozmolaritás szükséges, és ilyen körülmények
között az antigén károsodhat. A nagyobb testű állatok (pl. birka, kecske, ló) véréből nagyobb mennyiségű
szérum nyerhető, de az immunizáláshoz több antigénre van szükség. Immunizálásra a leggyakrabban nyulakat
alkalmaznak, mert kis mennyiségű antigénre is magas titerértékű, megfelelő mennyiségű szérumot lehet nyerni
belőlük. Ha az antigéneket kicsapatjuk (pl. az agargél diffúziós módszer esetében), akkor a csirkék, a nyulak és
a lovak a legjobb szérumforrások, míg a tengerimalac, a patkány és az egér nem megfelelő. A csirke és a nyúl
antiszéruma sokféle koncentrációban ad precipitációs reakciót, míg a juh és a kecske antiszéruma csak szűkebb
koncentrációjú tartományban. Egy szérum előállításakor legalább ugyanazon faj két egyedét szükséges
ugyanazzal az antigénnel immunizálni.
2.2. Az immunizálás
Az immunizálásra használt antigén mennyisége függ az antigén sajátságaitól, az antigén előkészítésétől és a
beoltás módszereitől. A hosszú ideig tartó immunizálási folyamatnál, ahol nagy mennyiségű antigénre van
szükség, többféle és nagyobb mennyiségű antitestek képződnek, mint a rövidebb ideig tartó immunizálásnál, de
az antitestek alacsonyabb specifitásúak. Az immunizálásra gyakran kombinált injektálási módszereket
alkalmaznak. Általában az intravénás és az intramuszkuláris befecskendezés kombinációját alkalmazzák egy 5–
7 hétig tartó immunizálási folyamat során. Az intravénás injektálás után az antitest ugyan gyorsabban szétterjed,
de a szervezet védekező mechanizmusa folytán a véráramban gyorsan hatástalanná válik. Ezért több mint 8
intravénás injekció kell ahhoz, hogy a szérum a megfelelő koncentrációban tartalmazza az antitesteket.
Célszerű a pufferben lévő antigént ún. Freund-féle adjuvánssal 1:1 arányban emulgeálni intramuszkuláris
injektálás céljából. Az adjuváns paraffinolajat és emulgeálószert (mannid monooleát) is tartalmaz. A komplett
Freund-adjuváns hő által elölt baktériumokat is tartalmaz (Mycobacterium tuberculosis, M. butyricum, ill.
egyéb, savnak ellenálló fajokat), míg az inkomplett adjuvánsban nincsenek baktériumok. Az adjuváns feladata,
hogy stabilizálja és raktározza az antigént az izomszövetben, ezért nagyobb mennyiségű antitest képződésével
számolhatunk, mint ha ugyanolyan mennyiségű antigént vizes fázisban fecskendeztünk volna be az állatba. A
leggyakrabban alkalmazott Freund-adjuvánson kívül egyéb adjuvánsok használata is lehetséges, és újabban
jelentős eredmények születtek az adjuvánskutatás terén (Hampton et al., 1990).
2.3. Injektálási módszerek
Alapvetően hatféle befecskendezési módszert különböztetünk meg:
a. Intravénás (nyúlnál a fülén lévő marginális érbe, csirkénél a szárnyba, egérnél a farok-főérbe).
b. Intramuszkuláris (nyúlnál a lábikra vagy a comb izomzatába, csirkénél a lábba, ill. a mellizomzatba).
c. Hasnyálmirigybe (egérnél ez a módszer a legjobb).
d. Bőr alá (nyúl).
e. Bőrbe (nyúl).
f. Talpba (nyúl).
Szerológiai vizsgálati módszerek
180 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vírussal történő immunizálás során a megfelelő mennyiségű antitestképzéshez csirkében és nyúlban általában
2 intramuszkuláris és egy intravénás injekció szükséges, hetente 1–2 mg antigén mennyiségben. Az antiszérum
maximális titerértéke az első injektálás után vírustól függően változik, de legtöbbször 5–7 hét múlva várható. A
titerérték az antiszérum azon jellemző sajátossága, amely megmutatja azt, hogy az antiszérumot meddig
hígíthatjuk folyamatosan a kétszeresére, hogy még látható precipitációt kapjunk az antigénnel történő reakció
során.
A befecskendezni kívánt antigén mennyiségét csak akkor célszerű növelni, ha a titerérték hirtelen csökken.
Túlzott mennyiségű antigén használata a titerértéket nem növeli meg jelentősen. E célból előnyösebb az
injektálásának, illetve az antigén stabilizálásának a módján változtatni.
2.4. Vérvétel és szérumnyerés
Vérvétel előtt 12–18 órával az állatokat éheztetni kell, hogy a lipidakkumulációt a vérben megakadályozzuk.
Immunizálásra többnyire nyulakat használnak. A vérvétel a szívből, az artériákból és a vénákból történhet. A
leggyakoribb és a legkevésbé kockázatos a fülben lévő érből kéthetente 20–20 ml vért venni. A kinyert vért egy
óráig szobahőmérsékleten alvadni hagyjuk, majd 30 percig 37 °C-ra tesszük; ekkor a szérum mennyisége
megnő. Egy éjszakára hűtőbe rakjuk, majd a szérumot leöntjük, ill. leszívjuk. A sejtes elemek elkülönítése
céljából centrifugálás, majd szűrés következik. Ezt követi a Na-aziddal és glicerollal történő keverés, majd utána
a –20 °C-on történő liofilezés.
2.5. Az IgG tisztítása az antiszérumból
Az antitestek (IgG) tisztításának többféle módja ismeretes, amelyek egymással kombinálhatók (Hampton et al.,
1990). Az alkalmazott eljárások röviden a következők:
a. Részleges tisztítás ammónium-szulfátos kicsapatással.
b. Ioncserés kromatográfia.
c. Protein A affinitású kromatográfia.
d. Homológ antigén–antitest komplexekből történő disszociáció.
e. Cukorgrádiens-centrifugálás.
f. F(ab‟)2 fragmentumok kinyerése.
g. Magasnyomású folyadékkromatográfia (HPLC).
h. Méretspecifikus membránon történő ultraszűrés.
i. Gélszűrés (IgM osztályba tartozó, nagy molekulatömegű antitestek esetében).
3. Monoklón antitestek előállítása
A növénykórtanban a monoklón antitestek (monoclonal antibodies, Mabs) alkalmazása nem régi keletű (Stern és
Gamble, 1984; Campbell, 1984; Halk és Boer, 1985). Előnyei a következők:
a. Csak egyetlen epitóppal szemben specifikusak.
b. A kívánt fajlagosság a hibridóma-sejtvonalak sorozatvizsgálatával elérhető.
c. A hibridóma-sejtvonalak stabilak a tenyésztés, illetve a fagyasztott tárolás során.
Kohler és Milstein (1975) vezette be azt az eljárást, amelynek lényege, hogy a lép antitestképző nyiroksejtjeit
rákos myelomasejtekkel fuzionáltatva ún. hibridómákat kapunk, amelyben biztosított a specifikus antitest
kiválasztása és a folyamatos növekedés. Immunizálásra egereket vagy patkányokat használnak fel. Ezen állatok
vére kevés, azonban érzékenyek egy olyan tumorra, ami olyan ascites testfolyadékot produkál, amelyben annyi
az antitest, mint a vérszérumban. Az ascites testfolyadék használatának előnyei a következők:
Szerológiai vizsgálati módszerek
181 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
a. Az immunizáláshoz kevés antigén szükséges.
b. A testfolyadék mennyisége (ideális körülmények között) 20 ml.
c. Az antitesteket ugyanúgy lehet tisztítani és tárolni, mint a szérumból kivont IgG-t.
d. Hatékonyan alkalmazhatók egyes diagnosztikai eljárásokban, ahol a kimutatáshoz két, genetikailag
különböző szérumforrásból származó antigénrendszer szükséges.
A hibridómakultúrák klónozása és további szelekciója monoklón antitesteket (Mabs) eredményez, amelyek az
antigénnek csak egyetlen epitópjával szemben mutatnak aktivitást. A monoklón antitestek előállításának
technikai lépései több szerző munkájában megtalálhatóak. A monoklón antitestek előállításának folyamata a 80.
ábrán látható. A módszer fontosabb lépései az alábbiakban foglalhatók össze:
a. Az egerek vagy patkányok immunizálása. Azokból az egerekből, amelyekben az antiszérum titerértéke a
legmagasabb, a lépet eltávolítják, és fúzióra előkészítik.
b. Az egér myeloma-sejtvonalainak tenyésztése. A fagyasztott myeloma-kultúrából a fúzió előtt legalább tíz
nappal életképes, aktív növekedési állapotban (log fázisban) lévő sejtkultúrát kell készíteni.
c. A lépsejtek fuzionáltatása a myelomasejtekkel.
d. A fuzionált sejtek (hibridómák) tenyésztése szelektív táptalajon, amely a nem fuzionált sejtek növekedését
gátolja.
e. A hibridóma-kultúrák szűrése a monoklón antitestek kiválasztása céljából.
f. A hibridómák klónozása a monoklón sejtvonalak biztosítása céljából.
g. Ascites testfolyadék termelése.
80. ábra - A monoklón antitest előállításának folyamatábrája; A: az egér immunizálása,
B: a myeloma- és a légsejtek fúzióra történő előkészítése;C: sejtfúzió; D: a sejthibridek
szelekciója, szaporítása, krioprezerválása és klónozása; E: a hibridómák szkrínelése; F:
monoklón antitest termeltetése és tisztítása [Hampton et al., 1990 után]
Szerológiai vizsgálati módszerek
182 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
3.1. A monoklón antitestek alkalmazásának lehetőségei
A monoklón antitestek (Mabs) felhasználhatók a különböző növénypatogének (vírusok, baktériumok,
spiroplazmák, fitoplazmák) és törzseik meghatározására és jellemzésére, a patogének és az általuk kódolt
termékek lokalizációjának és felhalmozódásának, valamint a kórokozók és génproduktumaik szerkezetének a
jellemzésére (Goding, 1983; Adam et al., 1991; Herscheid, 1992). Jelenleg 19 víruscsoportba tartozó, több mint
60 növényvírusra készítettek monoklón antitesteket (20. táblázat).
20. táblázat - Növényvírusok, amelyekkel szemben monoklón antitesteket állítottak elő
(van Regenmortel és Dubs, 1993 után módosítva)
Angol név Magyar név Akroním
Alfalfa mosaic alfamovirus Lucerna mozaik vírus AMV
Apple chlorotic leaf spot
trichovirus Alma klorotikus levélfoltosság
vírus ACLSV
Apple mosaic ilarvirus Alma mozaik vírus ApMV
Arabis mosaic nepovirus Arabis mozaik vírus ArMV
Banana bunchy top nanavirus Banán csúcscsokrosodás vírus BBTV
Barley yellow dwarf luteovirus Árpa sárga törpülés vírus BYDV
Bean common mosaic potyvirus Bab közönséges mozaik vírus BCMV
Bean pod mottle comovirus Babhüvely foltosság vírus BPMV
Bean southern mosaic sobemovirus Bab déli mozaik vírus SBMV
Bean yellow mosaic potyvirus Bab sárga mozaik vírus BYMV
Beet necrotic yellow vein benyvirus Répa nekrotikus sárgaerűség
vírus BNYVV
Beet western yellows luteovirus Répa nyugati sárgaság vírus BWYV
Carnation etched ring caulimovirus Szegfű karcolatos gyűrűs vírus CERV
Carnation latent carlavirus Szegfű látens vírus CLV
Carnation mottle carmovirus Szegfű foltosság vírus CarMV
Carnation necrotic fleck
closterovirus Szegfű nekrotikus foltosság
vírus CNFV
Cassava African mosaic
bigeminivirus Manióka afrikai mozaik vírus CAMV
Citrus tristeza closterovirus Citrus tristeza vírus CTV
Citrus variegation ilarvirus Citrus tarkaság vírus CVV
Szerológiai vizsgálati módszerek
183 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Clover yellow vein potyvirus Here sárga erűség vírus ClYVV
Cowpea mosaic comovirus Tehénborsó mozaik vírus CPMV
Cowpea severe mosaic comovirus Tehénborsó súlyos mozaik vírus CPSMV
Cucumber green mottle mosaic
tobamovirus Uborka zöldfoltosság mozaik
vírus CGMMV
Cucumber mosaic cucumovirus Uborka mozaik vírus CMV
Grapevine fanleaf nepovirus Szőlő páfránylevelűség vírus GFLV
Lettuce mosaic potyvirus Saláta mozaik vírus LMV
Maize dwarf mosaic potyvirus Kukorica törpülés mozaik vírus MDMV
Maize streak mastrevirus Kukorica csíkosság vírus MSV
Odontoglossum ringspot
tobamovirus Odontoglossum gyűrűsfoltosság
vírus ORSV
Papaya ringspot potyvirus Papaya gyűrűsfoltosság vírus PRSV
Pea severe mosaic potyvirus Borsó súlyos mozaik vírus PeSMV
Peanut clump pecluvirus Földimogyoró bokrosodás vírus PCV
Peanut mottle potyvirus Földimogyoró foltosság vírus PeMoV
Plum pox potyvirus Szilva himlő vírus PPV
Potato leaf roll polerovirus Burgonya levélsodródás vírus PLRV
Potato A potyvirus Burgonya A-vírus PVA
Potato M carlavirus Burgonya M-vírus PVM
Potato X potexvirus Burgonya X-vírus PVX
Potato Y potyvirus Burgonya Y-vírus PVY
Prune dwarf ilarvirus Szilva törpülés vírus PDV
Prunus necrotic ringspot ilarvirus Prunus nekrotikus
gyűrűsfoltosság vírus PNRSV
Raspberry bushy dwarf idaeovirus Málna bokros törpülés vírus RBDV
Rice dwarf phytoreovirus Rizs törpülés vírus RDV
Rice ragged stunt oryzavirus Rizs érdes törpülés vírus RRSV
Szerológiai vizsgálati módszerek
184 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Rice stripe tenuivirus Rizs csíkosság vírus RSV
Satsuma dwarf nepovirus Satsuma törpülés vírus SDV
Soybean dwarf luteovirus Szójabab törpülés vírus SbDV
Soybean mosaic potyvirus Szójabab mozaik vírus SMV
Sweet clover necrotic mosaic
dianthovirus Here nekrotikus mozaik vírus SCNMV
Tobacco etch potyvirus Dohány karcolatos vírus TEV
Tobacco mosaic tobamovirus Dohány mozaik vírus TMV
Tobacco necrotic dwarf luteovirus Dohány nekrotikus törpülés
vírus TNDV
Tobacco streak ilarvirus Dohány csíkosság vírus TSV
Tomato mosaic tobamovirus Paradicsom mozaik vírus ToMV
Tomato ringspot nepovirus Paradicsom gyűrűsfoltosság
vírus ToRSV
Tomato spotted wilt tospovirus Paradicsom bronzfoltosság vírus TSWV
Tulip breaking potyvirus Tulipán színtörés vírus TBV
Watermelon mosaic 2 potyvirus Görögdinnye mozaik 2-vírus WMV-2
Wheat soil-borne mosaic furovirus Búza talajlakó mozaik vírus SBWMV
Zucchini yellow mosaic potyvirus Cukkini sárga mozaik vírus ZYMV
A Mabs-ok alkalmazhatók a vírusok mennyiségi és minőségi meghatározására, a vírusok közötti rokonsági
kapcsolat feltárására csakúgy, mint a strukturális és nem strukturális génproduktomok szerkezeti és funkcionális
tanulmányozására. Alkalmazhatók vírusok, vírustörzsek és szerotípusok közötti rokonsági kapcsolat feltárására.
A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) közönséges törzse ellen készült Mab segítségével további
tíz, a tobamovirusokhoz tartozó vírust sikerült elkülöníteni (Briand et al., 1982). Tekintettel arra, hogy a
monoklón antitestek csak egyetlen epitóppal szemben specifikusak, kitűnően alkalmazhatók az antigénszerkezet
molekuláris szintű tanulmányozására (Altschuh et al., 1985). A Mab segítségével lehetővé válik az epitópok
azonosítása, szerkezetük feltérképezése. Mab-ot használtak pl. a bab déli mozaik vírus (bean southern mosaic
sobemovirus), valamint a dohány mozaik vírus szerkezetének a tanulmányozására, valamint a potyvirusok, az
ilarvirusok és a tobamovirusok specifikus epitópjainak a meghatározására. Jelenleg már nemcsak a vírus-
köpenyfehérjével szemben készülnek monoklón antitestek, hanem pl. nukleáris zárványokkal, henger alakú
zárványfehérjékkel, amorf zárványokkal, és potyvirusok esetében a levéltetű-átvitelért felelős, ún. helper
komponensekkel szemben is.
4. A szerológiai reakciók alaptípusai
4.1. Precipitáció
Az elnevezés onnan származik, hogy ha megfelelő mennyiségű antigén és antitest találkozik egymással, akkor a
reakció látható csapadékképződésben nyilvánul meg. A növényi minta szövetnedvét összekeverjük az
Szerológiai vizsgálati módszerek
185 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
antiszérummal. Az inkubálás után szabad szemmel vagy mikroszkóppal értékelünk. Amennyiben az antigén
(azaz a keresett vírus) jelen volt a szövetnedvben, akkor az antigén–antitest reakció következtében apró
pelyhekből álló csapadék keletkezik. A precipitációs tesztek a legrégebben alkalmazott eljárások az antigén–
antitest kölcsönhatások tanulmányozására (Heidelberger és Kendall, 1935; Kleczkowski, 1966). A precipitáció
és az agglutináció elkülönítése a reagáló antigén mérete alapján történik. A precipitáció a makromolekulák és a
vírusrészecskék oldhatatlanságára utal, míg az agglutináció a sejtek, ill. a hozzá hasonló méretű részecskék
összetömörülését jelenti.
Folyékony közegben történő precipitációs teszt
a. Az antiszérumból megfelelő pufferrel hígítási sorozatot készítünk.
b. 0,5 ml antiszérumot ugyanannyi mennyiségű növényi szövetnedvvel kémcsőben összekeverünk és
vízfürdőben 25–40 °C-on inkubálunk.
c. Az a legmagasabb hígítási érték, amelynél az antiszérum a neki megfelelő, ismert koncentrációjú antigénnel
reagálva még látható precipitációt mutat, az antiszérum titerértékeként ismert és az inkubálás után egy, ill. két
órával meghatározható. A precipitációt láthatóbbá lehet tenni, ha a kémcsövet fekete hátterű fényforrás elé
helyezzük.
A precipitációs tesztek eredményességét számos tényező befolyásolja. Fontos tényező az antigén mérete. A
fonál alakú, 500–1000 nm hosszúságú vírusrészecskék már kisebb mennyiségű antitesttel is jól látható
precipitációt eredményeznek, mint a kisebb (izometrikus) virionok vagy a disszociált fehérjealegységek (Van
Slogteren és Dubs, 1993). A titerérték általában 10–3, ill. 10–4 a fonál alakú vírusoknál, míg a disszociált
vírusalegységeknél ritkán magasabb, mint 10–2.
Az antigén–antitest reakció kémcső helyett lejátszódhat tárgylemezen, vagy Petri-csészében is (Wetter, 1965;
Noordam, 1973; Dijkstra és De Jager, 1998). Ezek az ún. mikroprecipitációs tesztek. Tárgylemez használata
esetén az üvegfelületet hidrofóbbá kell tenni szilikonnal vagy 0,1%-os formvarral. Ha a reakció Petri-csészében
történik, akkor az evaporáció elkerülése végett ásványi olajat kell rétegezni a felületre. A lemezeket nedves
kamrában kell tartani. A csapadékképződést szobahőmérsékleten 0,5–1 órás inkubálás után mikroszkóppal lehet
megfigyelni. 4 °C-on hosszabb, mintegy 6 órás inkubációs idő szükséges. A mikroprecipitáció cseppben történő
lejátszódásának fő előnye a reagensek gazdaságos felhasználása.
A precipitációs tesztek másik altípusa az, mikor az antiszérum 10–30%-os glicerines sóoldatban hígítva egy kis
kémcső aljára kerül, amire úgy rétegzik rá az antigént, hogy a kettő között éles határfelület képződjön. Pozitív
reakció esetén a határfelületen precipitációs gyűrű alakul ki. E módszer előnye, hogy a reagensek koncentrációja
kevéssé kritikus. Többféle vírus kimutatására sikeresen alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).
A precipitációs teszteket vagy tisztított víruspreparátummal végzik, vagy a fertőzött növény leszűrt
szövetnedvével. Ha a vírus a gazdanövényében csak nagyon kis koncentrációban van jelen, akkor szükséges a
növényi szövetnedvet ultracentrifugálással koncentrálni.
A folyadékprecipitációs tesztek fő alkalmazási területe az antiszérum-titerérték segítségével a vírusok
jellemzése és a nagyméretű, immundiffúziós tesztekkel nem tanulmányozható vírusok közötti szerológiai
rokonság felderítése. Két vírus közötti rokonsági kapcsolat kimutatására jól használható az ún. szerológiai
differenciálindex (SDI).
4.2. Agglutináció
Az agglutinációs reakciókban az antigént vagy az antitestet a vörösvérsejtek vagy egyéb hordozórészecskék, pl.
latex szemcsék felületére kötik. Ebben az esetben a sejtek és a latex partikulák mérete miatt látható szerológiai
reakció képződik még akkor is, ha a reagensek alacsony koncentrációja a látható precipitációt nem tenné
lehetővé. A passzív hemagglutináció esetében a vírusrészecskék vagy az antitestek a vörösvérsejtekhez
különböző kémiai kezelések által kötődnek (Rajeshwari et al., 1981; van Regenmortel, 1982), míg a latex
tesztnél az antitest egyszerű adszorpcióval kötődik a latex partikulákhoz. Ezért a vírussal (antigénnel) történő
pozitív reakció esetén a latex szemcsével megnövelt antitest és a vírusrészecskék aggregálódása következtében a
precipitáció láthatósága megnövekszik. Az antitest-molekulák a latex szemcsékhez egy ún. protein A közbülső
réteggel is kapcsolódhatnak (Torrance, 1980). Az agglutinációs tesztek érzékenysége 2–3-szor nagyobb, mint a
precipitációs vagy az immunodiffúziós teszteké (van Regenmortel, 1982). A zselatinból és különböző színű
Szerológiai vizsgálati módszerek
186 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
gumiarábikumból készült, 3 μm átmérőjű zselatinszemcsék szintén sikerrel alkalmazhatók a növényi vírusok
kimutatásában.
4.3. Immunodiffúziós tesztek
Az immunodiffúziós tesztek gélben lejátszódó precipitációs tesztek. Két fő változatuk ismert.
Az egyszerű géldiffúzió esetében az antigén diffundál abba a közegbe, amely az antitestet tartalmazza. Az
immunodiffúziós teszteknek a növényi virológiában leggyakrabban használt változata a kettős (dupla)
géldiffúzió, amelyben mind az antigén, mind pedig az antitest gélközegbe vágott különálló lyukakban
helyezkedik el és egymás felé diffundál (Shepard, 1972). Az immuno-elektronmikroszkópos módszer az
immunodiffúziós teszteket és az elektronmikroszkópos vizsgálatokat együtt tartalmazza. Ezt a módszert
részletesen az Immuno-elektronmikroszkópos módszer c. fejezet tárgyalja.
Egyszerű géldiffúzió
A reakció kb. 1 cm-es átmérőjű és 7–8 cm hosszú kémcsőben zajlik le. A kémcső aljára kerül az antiszérummal
kevert agar vagy agaróz (szilárd fázis), rárétegezve pedig az antigén folyékony fázisban. A precipitációs gyűrű a
kémcső alja felé mozdul el. A mozgás sebessége az antigén diffúziós állandójától, valamint az antigén és az
antitest koncentrációjától függ. A többszörös zónák kialakulása különböző antigén-komponensek jelenlétére utal
(Oudin, 1952).
Radiál géldiffúzió
Az egyszerű diffúzió másik változata a sugárirányú, ún. radiális géldiffúzió (Vaerman, 1981), ahol az antigén
egy központi lyukban helyezkedik el, és az azt körülvevő, antitestet tartalmazó agargélbe diffundál. A lyuk
körüli precipitációs gyűrű vastagsága az antigén koncentrációjával arányos.
Kettős géldiffúzió
Az immunodiffúziós tesztek közül a növényvirológiában leggyakrabban az Ouchterlony-féle (1968) kettős
diffúziós módszert alkalmazzák. Ennek az a lényege, hogy vékony agarlemezbe lyukakat vágunk úgy, hogy egy
középső lyukat 6–8 másik lyuk vegyen körül. A középső lyukba antiszérumot cseppentünk, míg a szélsőkbe a
vizsgálandó növényi minták szövetnedvei kerülnek. Az antitestek és az antigének is diffundálnak az agarban.
Ahol találkoznak, ott az agarban félhold alakú precipitációs ív keletkezik. A módszer izometrikus és pálcika
alakú vírusokra alkalmazható. A hosszú, fonál alakú vírusokat előbb olyan kezelésnek kell alávetni, amely
biztosítja a köpenyfehérjék szabad diffúzióját. Miután a reagensek a lyukakba kerültek, az antigén diffúziós
együtthatójától függően a diffúzió 24–72 óráig tart. A párolgás gátlása céljából a Petri-csészét nedves kamrában
tartjuk, vagy a gél tetejére könnyű ásványi olajréteget helyezünk. A precipitációs ívek a Petri-csészét
megvilágítva sötét háttér előtt tisztán látszódnak.
Precipitációs minták
Ha a lyukakban a reagensek megfelelő arányban vannak, akkor a precipitációs ív helyzete és görbülete utal az
antigén méretére. Ha az antigén diffúziós koefficiense ugyanakkora, mint az antitestté (5 × 10–7 cm2 s–1), akkor a
precipitációs ív egyenes lesz, és egyforma távolságra helyezkedik el a két lyuktól. Ha a vírusrészecskék
diffúziós együtthatója alacsonyabb (0,3–1,6 × 10–7 cm2 s–1), akkor a precipitációs ív az antigén lyukhoz közel
helyezkedik el, és körbefogja azt (van Regenmortel, 1982). Ha két egymás mel-lett elhelyezkedő antigén
diffundál ugyanazon antitestforrás felé, akkor a precipitációs ívek találkozásánál különböző minták alakulhatnak
ki. Három alapváltozat lehetséges: 1. egybeolvadó (koaleszcens), 2. ívek kereszteződése és 3. sarkantyúképzés
(spur), amelyek a két vírus közötti rokonsági kapcsolat meghatározására jól használhatók. Ha a precipitációs
ívek összeérnek (koaleszcens minta), akkor a két egymás melletti lyukban elhelyezkedő vírus szerológiailag
azonos. Ha a két precipitációs ív keresztezi egymást, a két vírus nincs egymással rokonsági kapcsolatban. A
sarkantyú- vagy spurképződés arra utal, hogy a két összehasonlítandó vírus azonos, de különböző epitópokat is
tartalmaz (81. ábra).
81. ábra - A kettős géldiffúzió precipitációs íveinek értelmezése. Magyarázat a
szövegben [Hampton et al., 1990 után]
Szerológiai vizsgálati módszerek
187 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az Ouchterlony-technika alkalmazása Na-dodecil-szulfát (SDS) jelenlétében
A fonál alakú vírusok hosszúságuknak és aggregálódó képességüknek megfelelően a 0,5–1,0%-os agargélben
nem diffundálnak. Ahhoz, hogy a gélben történő diffúziót lehetővé tegyük, a részecskéket ultrahanggal össze
kell törni, vagy kémiai úton, alkáli pufferrel, detergensekkel, pirrolidinnel vagy nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS)
kell szétbontani (Purcifull és Batchelor, 1977). Az SDS-t vagy a gélbe keverik, vagy összekeverik az antigénnel,
hogy megkönnyítsék a disszociációt. Az eljárást Gooding és Bing (1970) dolgozta ki a hosszú, fonál alakú
vírusokra, de ma már más morfológiájú vírusokra, valamint fehérje-zárványtestek detektálására is alkalmazható.
A disszociált köpenyfehérje-alegységek már könnyen diffundálnak, és így lehetővé válik bármely méretű vírus
esetében az immunodiffúziós tesztek alkalmazása. A különböző vírusok disszociált alegységei szerológiailag
szorosabb rokonságot mutatnak, mint az intakt vírusok, ezért ezzel a megközelítéssel a rokon vírusok vagy
vírustörzsek között további keresztreakciókat lehet kimutatni (Shepard et al., 1974; Dijkstra és De Jager, 1998).
A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) meghatározása Ouchterlony-módszerrel SDS jelenlétében
(Purcifull és Batchelor, 1977)
a. Az agar előkészítése: A közeg 0,8% agart, 1% NaN3-t és 0,5% SDS-t tartalmaz. 4 g agarhoz 300 ml
desztillált vizet adunk és 5 perc alatt 100 °C-on felolvasztjuk. A felolvasztott agarhoz 5 g nátrium-azidot
(NaN3) adunk és jól összekeverjük. 2,5 g SDS-t 100 ml forró desztillált vízben feloldunk, ezt hozzáadjuk az
agaroldathoz. A keveréket 500 ml-ig forró desztillált vízzel kiegészítjük és összekeverjük. 11 cm átmérőjű
Petri-csészébe 12–12 ml oldatot öntünk. Miután az agar megszilárdult, a Petri-csészéket 4 °C-on nedves
kamrában tároljuk.
b. Az antigén előkészítése: A fertőzött és az egészséges növény levelét desztillált vízzel 1:1 arányban
homogenáljuk, majd minden gramm levélszövethez 1 ml 3%-os SDS-t adunk. A mintát gézen átszűrjük.
c. Az antiszérum előkészítése: A potyvirusok esetében az SDS-sel nem kezelt vírussal történő immunizálás is jó
eredményt ad. Az antiszérumot általában nem hígítjuk, de ha mégis szükséges, akkor vagy a PBS-pufferrel,
vagy 0,05 M Tris-HCl-lel (pH:7,2), amely 0,85% NaCl-ot és 5% bovin-szérumalbumint is tartalmaz.
d. Az agarba lyukvágóval 7 mm átmérőjű lyukakat vágunk. Egy centrális lyuk körül 6 db perifériális lyuk
legyen egymástól 4–5 mm-re. A középső lyukba az antiszérum, a szélsőkbe pedig a növényi minták
kerülnek.
e. Az inkubálás 24 °C-on történik, és az eredményeket 24–48 óra múlva feljegyezzük. A nem specifikus, nem
antigén–antitest reakció következtében létrejövő precipitációs ívek kialakulása elkerülhető, ha a gélközeghez
bovin-szérumalbumint is adunk.
4.4. Immunoelektroforézis
Az immunoelektroforézis a gélközegben történő elektroforézis és az immunodiffúzió kombinálása. Hatékony
módszer a komplex antigénkeverékek szétválasztására. Technikai leírása és alkalmazhatósága a növényi
virológiában Hampton et al. (1990) munkájában részletesen szerepel. Az immunoelektroforézis egyik változata
az ún. rocket immunoelektroforézis (Tóbiás et al., 1979; Laurell és McKay, 1981), amelyben az antigén az
antiszérumot tartalmazó gélközegben elektromos erőtér hatására diffundál. Ha a két reagens találkozik, a
precipitációs ív egy rakéta, ill. egy kúpszerű alakzat körvonalaihoz hasonló, a körülhatárolt terület nagysága
pedig az antigén koncentrációjával arányos. A módszer 1 mg levélszövetben jelenlévő 1 ng – 0,4 µg
mennyiségű vírus kimutatására alkalmas (Hagen et al., 1982).
Szerológiai vizsgálati módszerek
188 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) meghatározása rocket immunoelektroforézissel
(Tóbiás et al., 1979; Burgyán és Gáborjányi, 1984)
a. Az agarózoldat elkészítése. (Egy 9x12 cm-es nagyságú lemez 15 ml 0,75%-os agarózt tartalmazzon 0,02 M-
os veronál-pufferben (pH 8,6) és 0,1%-os Na azidban.)
b. Ha az agaróz 50–55 °C-ra lehűlt, akkor 2 cm2 agarózhoz 1 µl antiszérumot adunk.
c. Az agarózlemezre lyukakat vágunk, a növényi mintát ezekbe csepegtetjük.
d. A lemezt 24 óráig 4 °C-on, vagy szobahőmérsékleten, vízhűtés mellett, 50 V feszültség alá helyezzük (2
V/cm).
e. A lemezt – általában szűrőpapíros felitatással – megszárítjuk.
f. A megszárított lemezhez annyi foszfát-puffert adunk (pH: 7,0), hogy azt befedje, majd két óráig a pufferben,
egy óráig pedig desztillált vízben áztatjuk.
g. A lemezt „Comassie Brilliant Blue G-250” nevű festékkel színezzük. Fél óráig történő rázatás után a festéket
eltávolítjuk, majd 10 percig újraszínezünk. Ezt követően desztillált vizes áztatás, majd a lemez szárítása
következik.
h. Kalibrációs görbék segítségével a precipitációs csúcsok magasságából következtetni lehet a vírus
koncentrációjára.
4.5. ELISA-módszerek
Az „ELISA” mozaikszó, a vizsgálat angol elnevezésének kezdőbetűiből tevődik össze (Enzyme-linked
immunosorbent assay, enzimhez kötött ellenanyag-vizsgálat). Avrameas (1969) alkalmazta először
növényvírusok kimutatására.
Az enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálatok (ELISA) olyan, szilárd fázison lejátszódó színreakciók, ahol
a reagensek műanyag felülethez vannak kötve, és a reakciót enzimmel kapcsolt antitest segítségével követjük
nyomon. Mivel az ELISA-módszer igen érzékeny és a reagenseket gazdaságosan lehet tömegvizsgálatokra
felhasználni, az ELISA a precipitációs és az immunodiffúziós tesztek helyébe lépett, és a növényvírusok
diagnosztizálásában a legnépszerűbb szerológiai módszerré vált (Clark és Bar-Joseph, 1984). Direkt és indirekt
ELISA-eljárásokat különböztetünk meg. A direkt eljárásnál az enzimet az antitesthez kapcsolják, míg az indirekt
eljárásnál az enzim olyan molekulához kapcsolódik, amely az IgG-t felismeri. Mindkét csoporton belül többféle
változat lehetséges (82A–F ábra). Az antitest enzimmel történő konjugálása csökkenti az antitest affinitását,
ezért az enzimmel konjugált antitest nem mutat olyan erős reakciót a rokon vírus szerotípusokkal, mint a
konjugálatlan antitest. A direkt eljárás (pl. DAS ELISA, vagy „kettősszendvics-módszer”) igen specifikus,
pontos és érzékeny módszer. Fél nanogramm vírus is kimutatható vele. Az indirekt módszer, ahol az enzim nem
az antitesthez kötődik, nem annyira specifikus. A konjugált antitest specifikusabb a homológ szerotípusokkal
szemben.
82. ábra - A különböző ELISA-eljárások sematikus ábrázolása. A: Y = IgG, • = vírus,
YE = IgG-enzim konjugátum; B: V = F (ab’)2, • = vírus, Y = IgG, EA = Protein A-enzim
konjugátum; C: Y = IgG, • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum; D: A =
Protein A, Y = IgG, • = vírus, EA = Protein A-enzim konjugátum; E: • = vírus, YE =
IgG-enzim konjugátum; F: • = vírus, Y = IgG, A-E = anti-IgG-enzim konjugátum
[Hampton et al., 1990 után]
Szerológiai vizsgálati módszerek
189 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Direkt ELISA
• Kettősellenanyag-szendvics (DAS ELISA) (Clark és Adams, 1977)
A növényvirológiában a leggyakrabban az ún. duplaellenanyag-szendvics (double antibody sandwich) módszert
alkalmazzák (DAS ELISA) a fertőzések kimutatására. A vizsgálatokhoz ún. mikrotitráló lapokat használunk,
amelyek polisztirolból készülnek, és általában 8 × 12 = 96 db 300 μl-es bemélyedéssel (mintahely)
rendelkeznek.
Először az IgG oldatot pipettázzuk a cellákba. Az inkubálás során az IgG molekulák a poliszirolhoz kötődnek,
ezáltal a lap mélyedéseinek felszíne IgG molekulákkal lesz kibélelve. A nem kötődött IgG molekulákat
mosópufferrel eltávolítjuk. Ezután a cellákba a növényi minták szövetnedvei kerülnek. Amennyiben a minta
tartalmazta azt az antigént (vírust), amely ellen a kötődött IgG is készült, akkor a vírus a lemezhez kötött IgG-
hez kapcsolódik, míg a növényi fehérjék és más vírusok nem. Inkubálás után a nem kötődött anyagok a
cellákból pufferrel kimoshatók. Ezután pipettázzuk a cellákba a második, enzimmel jelzett IgG-t, azaz a
konjugátumot. Ha a vírus jelen van (az immobilizált IgG-hez kapcsolódva) a cellában, akkor az enzimmel jelzett
IgG (konjugátum) a vírus másik feléhez kötődik. Ezáltal létrejön az „immunszendvics”. A nem kötődött
konjugátumot pufferes mosással eltávolítjuk, majd az enzim szubsztrátjának oldata kerül a cellákba. A
leggyakrabban alkalmazott enzim, az alkalikus foszfatáz esetében a szubsztrát para-nitro-fenil-foszfát, amely
színtelen vegyület. Az alkalikus foszfatáz enzim a szubsztrátmolekulákról elkezdi hasítani a foszfátcsoportokat,
amelynek eredményeként sárga színű para-nitro-fenol keletkezik. A színváltozás erőssége közvetve a vírus
koncentrációjával arányos. Az enzim addig működik, amíg megfelelő kémiai környezet és szubsztrát jelen van.
Szerológiai vizsgálati módszerek
190 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A pozitív reakció szemmel is jól látható, de általában ELISA-értékelő fotométerrel (ELISA reader) értékelik az
eredményeket (82A ábra).
• Direkt eljárás
Az antigén kötődik először a mikrotitráló lemez falához (82E ábra). Ebben az esetben az antigén kötődik
először a cella falához, majd megfelelő mosás után az antitest és az enzim konjugátumát, végül pedig az enzim
szubsztrátumát adjuk a cellába, ahogyan az a DAS ELISA eljárásnál is történik.
• Direkt biotin-avidin ELISA
A szokványos ELISA-teszttel szemben, ahol az antitesthez kapcsolják az enzimet, a biotin-avidin rendszer
növeli a reakciók érzékenységét és szélesebb körű szerológiai rokoni kapcsolatok feltárását teszi lehetővé.
Viszonylag régóta ismert, hogy a tojásfehérjében található egy avidinnek nevezett fehérje, amely a biotinhez (H-
vitamin, koenzim R) kapcsolódva megakadályozza a biotinnek a belekből történő felszívódását. Később a
Streptomyces avidini baktérium egyik fehérjéjéről is hasonló tulajdonságot mutattak ki. E fehérjét
sztreptavidinnek nevezik. Mindkét anyag alkalmas a diagnosztikai felhasználásra. A sztreptavidin fizikai
tulajdonságai azonban jobbak, ezért ennek a felhasználása terjed. A módszer alapváltozatában az IgG-t
biotinálják, a sztreptavidint pedig enzimmel konjugálják. Az antitesthez kapcsolt biotin az antitest aktivitását
kevésbé csökkenti, mint az enzim. Az eljárás röviden a következő:
a. A cella falát először IgG-vel érzékenyítjük.
b. Mosás után a mintát hozzáadjuk.
c. Ezután biotinnal kapcsolt antitesttel inkubálunk.
d. Mosás után avidin (sztreptavidin)–enzim konjugátum hozzáadása következik.
e. Végül az enzim szubsztrátjának a bevitele történik.
• A paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus) kimutatása DAS ELISA módszerrel
Az eljáráshoz szükséges a vírus kimutatására alkalmas ELISA kit (Boehringer, Sanofi, Loewe), amely
tartalmazza az antiszérumot és az antiszérum–enzim konjugátumot, valamint a pozitív és negatív növényi
kontrollmintákat.
a. A lemez IgG-vel történő érzékenyítése: Az antiszérumot fedőpufferrel 500-szorosára hígítjuk. Az oldatból
200-200 μl-t pipettázunk a cellákba, és négy órán át 35 °C-on inkubálunk. Az inkubációs idő eltelte után
mosópufferrel kétszer kimossuk a cellákat, majd ismételten kétszer, de ekkor a puffert 3-3 percig a cellákban
hagyjuk.
b. A növényi minták felvitele: 0,4 g friss súlyú növényi mintát 2 ml homogenálópufferben eldörzsölünk, majd a
felülúszót leöntjük és Eppendorf-csőben 12 000 fordulatszámon (rpm) kb. 5 percig centrifugáljuk.
Nagyszámú minta esetén növényi homogenizálóberendezések is alkalmazhatók. Nemcsak a vizsgálandó
növényi mintákat, hanem pozitív és negatív kontrollmintákat is fel kell vinni a cellákba. A cellákba
pipettázott növényi mintákat egy éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk. Ezután kétszer mosópufferrel mossuk a
cellákat, majd ismételten háromszor, a mosópuffer három percig cellákban történő inkubálásával.
c. Az IgG-enzim (alkalikus foszfatáz) konjugátumot konjugátumpufferben 500-szorosára hígítjuk, majd a
cellákba pipettázzuk. A konjugátumot 4 órán át 35 °C-on inkubáljuk a cellákban, majd elvégezzük a mosást a
b pont szerint.
d. A szubsztrát (4-nitrofenil-foszfát) hozzáadása. A szubsztrát elkészítése: Folyamatos keverés mellett 4-
nitrofenil-foszfátot szubsztrátpufferben 1:1 arányban feloldunk. 150–150 μl-t a cellákba pipettázunk. 35 °C-
on kb. 30 percig inkubálunk.
e. A reakciót 50 μl 3N NaOH-oldattal leállítjuk (nem szükségszerű).
f. A színváltozás mértékét ELISA readerrel 405 nm hullámhosszon értékeljük. Ha a minták abszorbciós értékei
a negatív kontroll abszorbciós értékének a kétszeresét meghaladják, akkor tekinthető a vizsgált minta az adott
vírusra nézve pozitívnak.
Szerológiai vizsgálati módszerek
191 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
• A szükséges pufferek összetétele:
g. Fedő (coating) puffer: 1,59 g Na2CO3; 2,93 g NaHCO3; 0,2 g NaN3 1 liter oldatra desztillált vízzel kiegészítve
(pH 9,6).
h. PBS–Tween mosópuffer: 0,5 ml Tween-20 feloldása 1 liter-PBS oldatban, keverés mellett.
i. 10 × PBS-oldat (phosphate-buffer saline) (10-szeres töménységben, ezért közvetle-nül a felhasználás előtt
10-szeres hígítást kell készíteni): 72 g NaCl; 4,3 g KH2PO4; 14,4 g Na2HPO4 × 2 H2O (vagy: 29 g Na2HPO2 ×
12 H2O); 1g Merthiolát (Thimerosal) 1liter oldatra, desztillált vízzel kiegészítve (pH 7,4).
j. Kivonó (homogenáló) puffer: IgG puffer + 2% polivinil-pirrolidon (PVP).
k. IgG puffer: 1% BSA-t (marhabovin-szérumalbumin) vagy sovány tejport tartalmazó PBS–Tween-oldat,
melyet a tejpor szuszpendáltatása után több réteg szűrőpapíron át kell szűrni.
l. Konjugátumpuffer: ugyanaz, mint a kivonó puffer.
m. Alkalikus foszfatáz szubsztrátpuffer: 97 ml diethanol-amin; 0,2 g MgCl2 × 6 H2O; 0,2 g NaN3 1 1iter oldatra,
desztillált vízzel kiegészítve (pH 9,8; 1 N HCl-lel beállítva).
Indirekt ELISA
• Indirekt F(ab’)2 ELISA (Barbara és Clark, 1982)
Az első lépésben csak a specifikus IgG F(ab‟)2 fragmentuma kapcsolódik a lemezhez. Pufferes mosás után a
minta becsepegtetése és az antigén megkötődése következik. Ezt követően ismét mosás következik, majd a
következő műveletben a teljes IgG-t mérik be, amely az immobilizált antigénhez (vírushoz) kötődik. Ez az IgG
nincs enzimmel jelölve. A protein A-nak nevezett sejtfalfehérje – amelyet a Staphylococcus aureus nevű
baktérium termel – jellemző tulajdonsága az, hogy kötődik az IgG molekulák nem antigénspsecifikus F(c)
régiójához. Ezt a protein A-t ugyanúgy lehet enzimmel jelölni, mint az IgG molekulákat. Ha az indirekt ELISA
utolsó előtti lépésekor ilyen enzimmel konjugált protein A-t pipettázunk a lyukakba, akkor az csak a teljes IgG
molekulákhoz kapcsolódik, az antigén hiányában esetleg „csupaszon” maradt F(ab‟)2 fragmentumokhoz nem.
Az utolsó lépés ebben az esetben is az enzim szubsztrátjának a bevitele. E változatnál nem kell minden vírus
ellen termeltetett IgG-t külön-külön enzimmel konjugálni, elég a protein A-enzim konjugátum használata. Az
indirekt módszer elnevezés arra utal, hogy az enzim nem közvetlenül a specifikus IgG-hez van kapcsolva (82B
ábra).
• Indirekt DAS ELISA (van Regenmortel és Burckard, 1980)
E vizsgálatban először a vírus ellen egy állatfajban (1. állat) termeltetett IgG-vel érzékenyítjük a lemezt. Ezután
becsöpögtetjük a növényi mintát. A megfelelő inkubálás és mosások után egy másik állatfajban (2. állat)
ugyanarra a vírusra specifikusan termeltetett IgG kerül a lyukakba. Ezután a 2. állat IgG-je ellen termelt 3. állat
IgG-enzim konjugátuma következik. Végül pedig az enzim szubsztrátja kerül a cellába (82C ábra).
• Indirekt ELISA (Lommel et al., 1982)
Először az antigént kötjük a lemez falához, majd az IgG-t. Ezt követi az első állatfaj IgG-je ellen egy másik
állatfajban termeltetett IgG-enzim konjugátuma, majd a szubsztrátum hozzáadása (82F ábra).
• Módosított F(ab’)2 vagy protein A ELISA
Ennél a változatnál a protein A fehérjét kétszer kell bevinni a cellába (Edwards és Cooper, 1985). Először a
protein A réteget a cella falához kötjük, amihez a továbbiakban az antitest kötődik. A vírussal és a második
antitestréteggel történő inkubáció után enzimmel konjugált protein A-t adunk a második réteg antitest-
detektálása céljából. E módszer legfőbb előnye, hogy csak egyféle antiszérum szükséges hozzá, mivel az
enzimet nem az antitesthez, hanem a protein A-hoz kapcsoljuk (82D ábra).
• A protein A ELISA-eljárás
a. Általában 1 µg protein A-t 1 ml fedőpufferben feloldva 200 µl protein A-oldattal érzékenyítjük a lemezt,
majd kb. négy órán át 35 °C-on inkubálunk. Az inkubációs idő letelte után kétszer desztillált vízzel, majd
egyszer PBS–Tween mosópufferrel történő mosás szükséges.
Szerológiai vizsgálati módszerek
192 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
b. 200–200 μl specifikus IgG antiszérum felvitele az antiszérum titerértékétől függő, de általában 500–1000-
szeres hígításban történik. Négy óráig 35 °C-on történő inkubáció, majd mosás az a lépés szerint.
c. Növényi minták felvitele: 0,4 g friss levél 2 ml kivonópufferben történő homogenálása, majd a felülúszó
Eppendorf-csőben történő centrifugálása 5 percig, vagy a homogenátum vattán történő átszűrése. Inkubálás 4
°C-on egy éjszakán át, majd háromszori desztillált vízzel történő mosás, és kétszeri PBS–Tween
mosópufferrel történő mosás következik. Kiöntés előtt a puffert 3 percig hagyjuk a cellákban.
d. A második IgG réteg felvitele [lásd b lépés].
e. Protein A-enzim konjugátum felvitele. Előtte a konjugátumot ún. konjugátumpufferrel – a konjugátum
minőségétől függően – hígítjuk (pl. 20 ml pufferben 5 µl konjugátumot oldunk). Ezután a lépés után az
inkubáció 4 órán keresztül 35 °C-on történik, majd a c lépés szerinti mosás következik.
f. A szubsztrátum felvitele. Ha az enzim alkalikus foszfatáz, akkor a szubsztrát 4-nitrofenil-foszfát. Ha az
enzim peroxidáz, akkor a szubsztrát o-fenilén-diamin lesz.
g. A szubsztrát felvitele után a reakcióelegyet 35 °C-on inkubáljuk. A pozitív minták esetében rövid idő alatt
kialakul a narancssárga színreakció.
h. Ha az enzim alkalikus foszfatáz volt, a reakciót cellánként 50-50 μl 3N NaOH-oldattal leállítjuk.
i. A lemezt ELISA readerrel 405 nm hullámhosszon értékeljük.
O-fenilén-diamin (OPD) készítése:
a. 1 kapszula OPD-t 50 ml citromsavas foszfátpufferben feloldunk. Az OPD erősen rákkeltő hatású, ezért
gumikesztyű használata kötelező. Az OPD fényérzékeny, ezért feloldásakor a főzőpoharat alufóliába kell
csomagolni és a bemérés után a lemezt is takarni kell.
b. 50 ml bidesztillált vízben 1 tabletta Hyperolt oldunk fel. H2O2 keletkezik.
c. A hidrogén-peroxid (H2O2) oldatból 500 μl-t adunk az 50 ml OPD-oldathoz, és kevertetjük. Az így nyert
elegyből 150 l mennyiséget pipettázunk a lemez celláiba.
Citromsavas foszfátpuffer készítése:
5,6 g citromsav; 11,2 g Na2HPO4 1 liter oldatra desztillált vízzel kiegészítve (pH 5).
A reakcióhoz szükséges egyéb pufferek (fedő-, azaz coating), PBS–Tween mosópuffer, IgG-puffer,
kivonópuffer, konjugátumpuffer – mely ugyanaz, mint az IgG-puffer – elkészítésének módja az előző fejezetben
található.
4.6. Radioimmuno-vizsgálat (RIA)
A radioimmuno-tesztek során az antitestet nem enzimhez kötik, hanem radioaktív izotóppal jelölik. A költséges
számlálószerkezet, valamint a rádioaktív anyagok használata miatt ezt az eljárást a növényi virológiában csak
ritkán alkalmazzák (van Regenmortel, 1982).
4.7. Immunoblotting
Ezen eljárások az ELISA érzékenységét fokozó, annak továbbfejlesztett változatai. Az immunoblotting
eljárásokról nemrégiben kiváló tanulmányok születtek, és alkalmazásuk a növényi virológia területén Koenig és
Burgermeister (1986), Hampton et al. (1990) munkáiban részletesen leírásra kerültek. Az immunoblotting
diagnosztika három részterületet ölel fel. Ezek a következők: Western blot technika, dot-blot immunteszt (DIA)
és a szöveti (tissue) blotting.
A Western blot technika
Ezen eljárás első lépéseként a gélben lévő proteineket először elektroforézissel szétválasztják. Ezután a fehérjék
a gélből egy membránra kerülnek, amihez az antitesteket kötik. A proteinek a gélből a legegyszerűbben passzív
úton kerülnek a membrán felületére. A nagyobb molekulatömegű fehérjék esetében azonban hatékonyabb az ún.
Szerológiai vizsgálati módszerek
193 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
elektroblot immunteszt alkalmazása. Az eljárást Tobwin et al. (1979) fejlesztették ki, melynek lényege röviden a
következő: a gélben lévő proteineket először itt is elektroforézissel választják szét. A gél egyik oldalán
szűrőpapír, a másik oldalán pedig membrán és szűrőpapír van. Ezt a „szendvicset” elektromos áram alá
helyezik, melynek hatására a térerősségtől és a gél vastagságától függően 1–12 óra alatt a fehérjék a szűrőre
kerülnek. A termelődött hő elvezetéséről gondoskodni kell. Az újabban elterjedt, ún. „félszáraz” blottolási
technika esetében kevesebb mennyiségű puffer felhasználására van lehetőség. A fehérjék membránra történő
átjutási ideje nagyon rövid, 0,5–0,75 mm gélvastagság esetén mintegy 30 perc.
Dot-blot immunteszt
Banttari és Goodwin (1985) nyolcszoros érzékenységnövekedést ért el azzal, hogy az ELISA-eljáráshoz nem
polisztirol lapot, hanem nitrocellulóz membránt használt. A membránt apró korongokra darabolva, vagy
műanyag sablonba szorított nagyobb membránszelet formájában használják. Utóbbi esetben a sablonból kivett
membránon színes foltok (dot) formájában láthatók a pozitív reakciók.
A dot-blot technika esetén a tisztított antigént vagy a szövetnedvet közvetlenül a nitrocellulóz membránhoz
kötik, a műveletet megelőző elektroforetikus szétválasztás nélkül (Banttari és Goodwin, 1985; Hibi és Saito,
1985; Dijkstra és De Jager, 1998). A BSA-val (bovin-szérumalbumin) történő telítés után a blottokat sorrendben
antitesttel, IgG-enzim konjugátummal, majd a szubsztrátummal inkubálják, mint a Western blot teszt során. A
technika monoklón és poliklón antitestek esetén is alkalmazható (Rocha-Pena et al., 1991). Ezzel az eljárással az
alkalmazandó reagensek kis mennyisége miatt fél pikogram-mennyiségű vírus is kimutatható.
• A szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) kimutatása dot-blot technikával (Moya et al., 1997)
a. Növényi minta előkészítése. Egy gramm levelet 40 ml Tris-HCl-ben homogenálunk (pH 6,8), amely 30 mM
aszkorbinsavat és 0,2% 2-merkaptoetanolt tartalmaz. A keveréket öt percig 100 °C-on történő felmelegítéssel
denaturáljuk.
b. A nitrocellulóz membránt óvatosan a TBS-puffer felszínére helyezve megnedvesítjük.
c. A membránt öt percig szűrőpapíron szárítjuk (ma már olyan membránok is léteznek, melyek használatánál a
b és a c művelet elvégzése nem szükséges).
d. 1 μl növényi mintát csepegtetünk a membránra, majd azt 5 percig szűrőpapíron szárítjuk.
e. A filtert blokkoló oldatban (5% sovány tejport tartalmazó PBS-oldat) egy órán keresztül rázatjuk, majd egy
pillanatra desztillált vízbe mártjuk.
f. Monoklón antitesttel kezeljük a szűrőt (0,1 g/ml PBS-oldatban).
g. Ezután desztillált vízbe történő bemártás, 2 × 10 percig TTBS-oldatban történő mosás, majd ismételten egy
pillanatra desztillált vízbe történő bemártás következik.
h. A szűrőt peroxidázzal jelzett „antiegér“ antiszérumban inkubáljuk.
i. Desztillált vizes bemártás, majd 10 percig TTBS-ben, és 10 percig TBS-ben történő gyenge rázatás
következik.
j. A membránt öt percig az előhívó oldatban előhívjuk.
k. Desztillált vizes öblítés után az értékelés következik.
TBS-puffer: 0,02M-os Tris-HCl; 0,5M-os NaCl (pH 7,5).
TTBS-puffer: 0,05%-os Tween 20 TBS pufferben.
Előhívó oldat: 6 ml dimetil-szulfoxid; 0,1 g 3 amino-9 etil-karbazol; 50 ml 0,02 M-os
nátrium-acetát-puffer (pH 5,1); 0,4 ml hidrogén-peroxid. Frissen készítendő!
Szöveti (tissue) blotting
Szerológiai vizsgálati módszerek
194 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Ez az eljárás a dot-blothoz hasonló, de nincsen szükség a növényi minta homogenálására. A friss növénymintát
egyszerűen rányomjuk a nitrocellulóz membránra, majd a dot-blot eljárás szerint „előhívjuk” (Lin et al., 1990).
5. A különböző szerológiai eljárások alkalmazása a vírusdiagnosztikában
Több mint két évtizede az ELISA-módszer a legszélesebb körben alkalmazott eljárás a vírusdiagnosztikában. A
monoklón antitesteket is használó ELISA-eljárás nagymértékben hozzájárult a burgonya vírusmentesítési
programjához és a gyümölcsfaiskolák vírusmentesítéséhez (Halk és De Boer, 1985). Az egyes monoklón
antitestek egy-egy vírus csak korlátozott számú szerotípusára alkalmazhatók. Ez a hátrány kiküszöbölhető a
különböző Mabs keverékének használatával. Bár az ELISA-módszer nem annyira érzékeny, mint pl. a vírusok
nukleinsav-tartalmának meghatározásán alapuló ún. nukleinsav-hibridizációs módszerek, nagyszámú minta
tömegteszteléshez jobban alkalmazható. A bioteszt- vagy tesztnövénymódszer szintén érzékenyebb, mint az
ELISA, de a tesztnövények felnevelése sokáig tart és csak kisszámú minta tesztelését teszi lehetővé (Horváth,
1993).
Az ELISA-eljárások mellett a kettős géldiffúzió, a dot-blot és a Western blot módszerek a legnépszerűbbek
(Banttari és Goodwin, 1985; Barnett, 1986; Salazar, 1996).
195 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
15. fejezet - A nukleinsavak jellemzésének módszerei
A vírusok genetikai információját hordozó nukleinsav típusa lehet ribonukleinsav (RNS) vagy
dezoxiribonukleinsav (DNS). Ezek egyszálúak (ssRNS, ssDNS) vagy kétszálúak (dsRNS, dsDNS) lehetnek, de
a virionképzésben csak egyféle nukleinsav vehet részt. A vírus-RNS-szál lehet pozitív vagy negatív. Pozitívnak
nevezzük akkor, ha róla közvetlenül transzláció valósul meg, azaz messenger RNS-ként (mRNS) funkcionál. A
növénypatogén vírusok túlnyomó többsége egyszálú pozitív RNS-genomot tartalmaz, az egy-, ill. kettős szálú
DNS vírusok száma csekély. A növényvírusok kisebb része negatív szálú RNS-vírus; ebben az esetben szükség
van egy kiegészítő szál szintézisére is, mielőtt a transzláció megindulna. A vírusokban a nukleinsavbázisok
sorrendje meghatározó, hiszen a nukleinsavakban foglalt információk felelősek a fertőzőképességért, a
vírusreplikációért, a fehérjék szintéziséért, beleértve a köpenyfehérje termelését is. A vírusgenom lehet
egykomponensű, azaz osztatlan és lehet többkomponensű, azaz osztott. A vírusgenom minősége, a nukleinsav-
molekulák száma, a genom szerveződése és kifejeződése alapvető jelentőségű a vírusok rendszerezésében
(Matthews, 1991, 1992).
A nukleinsav jellemzésére alkalmas első technikák kifejlesztését a viroidok felfedezése és későbbi vizsgálatai
motiválták, hiszen a viroidok esetében nincsen lehetőség fehérjék vizsgálatára. Mint ismert, a viroidok csupasz
(naked) RNS-ből állnak. A molekuláris biológia és a biotechnológia területén elért eredmények szintén
nagymértékben hozzájárultak ahhoz, hogy lehetővé vált a vírusnukleinsav mind diagnosztikai, mind
rendszertani célú jellemzése, a genomban kódolt fehérjék szerepének megértése és a genom génsebészeti
célokra történő felhasználása.
A nukleinsavak jellemzésének egyik legáltalánosabban használt technikája a gél-elektroforézis, amely lehetővé
teszi a nukleinsavak elválasztását, méretének meghatározását. A nukleinsav jellemzésére használt, ún.
hibridizációs módszerek különösen olyan növényvírusok vizsgálatában terjedtek el, ahol a szerológia nem ad
megbízható eredményt [pl. dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) esetében]. A nukleinsav-hibridizáció
gyors eljárása a dot-blot hibridizáció, amely azonban nem teszi lehetővé a nukleinsav méretének
meghatározását, ehhez DNS esetében Southern-, RNS esetében pedig Northern-hibridizációra van szükség.
A nukleinsav jellemzésének legfontosabb és legalaposabb módszere a teljes genom bázissorendjének, azaz
szekvenciájának meghatározása. A növényvírusok esetében erre azért van lehetőség, mert a genom kis méretű,
általában kisebb, mint 10 000 bázispár. A genom teljes szekvenciájának megismerése új szempontokat adott a
vírusok rendszerezéséhez, hiszen lehetővé tette a rendszerezésben az evolúciós összefüggések figyelembevételét
is. A molekuláris biológiában széles körben alkalmazott polimeráz-láncreakció (polimerase chain reaction,
PCR) használata a növényvírus-diagnosztikában és a molekuláris virológiában egyaránt ismert. A továbbiakban
a nukleinsav jellemzésére alkalmas technikák részletes ismertetésével foglalkozunk. Megemlítjük, hogy e
témával kapcsolatban a könyv kéziratának leadása után jelent meg Dijkstra és De Jager (1998) kitűnő könyve a
vírus-RNS vizsgálati módszereiről.
1. Gél-elektroforézis
A gél-elektroforézis lehetővé teszi a nukleinsavak elválasztását és méretének meghatározását. A technika
lényege az, hogy az elektromos térbe helyezett gélben a molekulák a gél pórusain keresztül az ellenkező töltés
irányába vándorolnak.
A negatív töltésű nukleinsavak gélben történő mozgását sok tényező befolyásolja, de megfelelően standardizált
körülmények között a vándorlás gyorsaságát a legnagyobb mértékben a molekula mérete határozza meg. Minél
kisebb a molekula, annál könnyebben, gyorsabban mozog. Megfelelő méretű ismert anyag (marker)
alkalmazásával a molekula pontos mérete is megállapítható. A technika egyszerű, gyors és olyan fragmentumok
elválasztására is alkalmas, amelyre más úton, pl. sűrűséggradiens-centrifugálással nincs mód.
A vizsgált molekulák a gélen könnyen láthatóvá tehetők egy alacsony koncentrációban használatos fluoreszcens
festék, az ehídium-bromid alkalmazásával. Ennek segítségével ultraibolya fényben már 1–10 ng DNS is
kimutathatóvá válik. A gél agarózból vagy poliakril-amidból készülhet, a feladatnak megfelelő alakban,
sűrűségben és méretben. Az agarózgéleket általában a magasabb mérettartományban alkalmazzák, mintegy 200
bázispártól (bp) egészen 50 kilobázisig (kb). A poliakril-amid gélek kiválóan alkalmasak kisebb méretű
A nukleinsavak jellemzésének
módszerei
196 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
molekulák (5–500 bp) elválasztására. Felbontóképességük olyan nagy, hogy különböző DNS-fragmentumok
összehasonlításakor már 1 bp-nyi különbség is észlelhető (Sambrook et al., 1989).
A gél-elektroforézisnek a növényvirológiában elsősorban a vírusgenom (RNS vagy DNS) méretének, illetve a
genom bázissorendjének meghatározásában van szerepe. A 83. ábra az agarózgél-elektroforézis vázlatát
mutatja.
83. ábra - A gél-elektroforézis vázlata [Brown, 1990 után]
2. Nukleinsav-hibridizáció
A hibridizáció egyszálú nukleinsavláncok specifikus bázispárosodását jelenti, a purin és pirimidin bázisok
egymásnak megfelelősége, a komplementaritás szabálya szerint. A kétszálú DNS két szálát hevítéssel vagy
lúgos kezeléssel eltávolítva egymástól (denaturálás) egy egyszálú DNS-molekulákat tartalmazó oldat keletkezik,
és az így kapott DNS-oldat lehűlésekor a kétszálú szerkezet újra kialakul (renaturálódás). Azt a hőmérsékletet,
amelyen a molekulák 50%-a denaturálódik, olvadási hőmérsékletnek (Tm) nevezzük. Az olvadási hőmérsékletet
alapvetően a következő faktorok befolyásolják: 1. a nukleinsav bázisösszetétele, azaz a magas G+C-tartalomnál
magasabb a Tm értéke; 2. a sókoncentráció, ugyanis a magas sókoncentráció növeli az olvadási hőmérsékletet;
3. a hidrogénkötést befolyásoló kémiai anyagok (pl. formamid) jelenléte csökkenti a Tm-et. A hibridizációs
tesztekhez olyan hőmérsékleti körülményeket kell választani, amelyek maximalizálják az asszociáció fokát a
komplementer szálak között. Ez általában 22–27 °C-kal kevesebb a Tm-nél, azaz kb. 65 °C (Matthews, 1991).
A már oldatban levő molekulákhoz komplementer RNS-t vagy DNS-t adva olyan molekulák is képződnek,
amelyeknek egyik szálát a hozzáadott komplementer RNS vagy DNS alkotja. Ha ezeket a molekulákat a
felismerhetőség érdekében radioaktív vagy más módon jelölik, akkor a kapott hibrid molekulák is kimutathatóvá
válnak. A jelölt RNS-t vagy DNS-t próbának nevezik, amely olyan molekulákhoz kapcsolódik (hibridizál),
amelynek vele azonos (homológ) a szekvenciája (Hames és Higgins, 1985).
A hibridizáció megvalósítható úgy is, hogy mindkét nukleinsav oldatban van (folyadék-hibridizáció), de jobban
elterjedt az a gyakorlat, amikor az egyik molekulát egy szilárd mátrixon, filteren immobilizálják (filter-
hibridizáció). A növényvirológiában általánosan alkalmazott dot-blot, Southern- és Northern-hibridizáció
A nukleinsavak jellemzésének
módszerei
197 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
mellett érdemes említést tenni az ún. szendvics-hibridizációról is. A nukleinsav-hibridizációs eljárásokról
nemrég Hull (1993) írt összefoglaló tanulmányt.
2.1. Dot-blot hibridizáció
A dot-blot hibridizáció a legáltalánosabban használt módszer nagyszámú minták elemzésére (Dijkstra és De
Jager, 1998). A hibridizáláshoz el nem választott nukleinsavmintát rögzítenek egy megfelelő hordozón
(nitrocellulóz vagy pozitív töltésű nejlonmembránon), és erre radioaktív próbát hibridizálnak. Fő lépései a
következők: 1. a vizsgálandó növényekből kis mennyiségű szövetnedv- vagy össznukleinsav-kivonás; 2. a
nukleinsav denaturálása hevítéssel; 3. a szövetnedvből, ill. a nukleinsavoldatból egy cseppnek a membránra
történő felvitele; 4. a nukleinsav membránhoz kötése; 5. a nem-specifikus kötőhelyek blokkolása a
prehibridizáció során; 6. hibridizálás radioaktívan jelölt nukleinsavpróbával; 7. a filter mosása a nem-, illetve
aspecifikusan hibridizált próba eltávolítására; 8. a filter szárítása, majd kazettában röntgenfilm fölé helyezése; 9.
a film előhívása.
A nukleinsav dot-blot hibridizáció (Hames és Higgins, 1985 után)
• Összes nukleinsav-kivonás
a. A vizsgálandó növényekből egy Eppendorf-tető nagyságú levélkorongot 400 µl kivonó-pufferrel [50 mM
Tris-HCl (pH 7,6); 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 0,5% SDS; 0,3% merkapto-etanol] dörzsmozsárban
homogenálunk.
b. A homogenátumot visszapipettázzuk egy Eppendorf-csőbe, hozzáadunk 400 µl fenolt és 30 mp-ig Vortexben
keverjük.
c. Vortexelés után a homogenátumot 5 percig centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C).
d. A felülúszót leszívjuk, hozzáadunk 150 µl fenolt és 150 µl kloroformot, majd 30 percig vortexeljük.
e. A fenolos oldatot 5 percig centrifugáljuk (14000 rpm, 4 °C).
f. A felülúszót leszívjuk, hozzáadunk 300 µl kloroformot, összerázzuk, majd 5 percig centrifugáljuk (14 000
rpm, 4 °C).
g. A felülúszót leszívjuk és a nukleinsavakat 200 µl ammónium-acetát jelenlétében 1 ml absz. etanollal
kicsapjuk, az oldatot 20 percig –70 °C-on tartjuk.
h. Az alkoholos oldatot 20 percig centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C), majd óvatosan leöntjük a felülúszót.
i. A csapadékban lévő nukleinsavakat 1,5 ml 70%-os etanollal mossuk (nem szuszpendáljuk).
j. Centrifugáljuk (14 000 rpm, 4 °C). A felülúszót leöntjük, és a csapadékot beszárítjuk.
k. A csapadékot 30–40 µl steril vízben szuszpendáljuk.
Megjegyzés: Az összes nukleinsav-kivonás során biztosítani kell, hogy az RNS ne degradálódjon, ezért
gondoskodni kell az oldatok és eszközök RNáz-mentességéről. A kivonás folyamán végig kesztyűt kell viselni.
A kivonópuffert, a fenolt és a kloroformot hűtőben (4 °C) tároljuk, a sterilezett Eppendorf-csöveket az egyes
lépések között jégen tartjuk. A kivont nukleinsav minőségét és mennyiségét agarózgélen futtatva
ellenőrizhetjük, illetve a mennyiségét spektrofotométerrel mérhetjük.
• A minták előkészítése és membránra vitele
a. A nukleinsavoldatból 3 µl-t kiveszünk, hozzáadunk 3 µl felvivőpuffert [50% (w/v) deionizált formamid; 6%
(w/v) formaldehid; 4,2% (w/v) glicerin; 0,035% brómfenolkék; 0,035% xiléncianol; 20mM HEPES pH 7,8; 1
mM EDTA pH 8,0].
b. A nukleinsavakat 65 °C-on 5 percig denaturáljuk, majd jég közé tesszük.
c. Az oldatból 4 µl-t pipettázunk a Hybond-N membránra, ügyelve arra, hogy a minták pontszerűen, egymástól
kellő távolságban (kb. 1 cm) helyezkedjenek el.
A nukleinsavak jellemzésének
módszerei
198 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
d. A membránt 2 percre UV-transzparensre helyezzük, hogy a nukleinsavakat irreverzibilisen a membránhoz
kössük.
• Előhibridizáció, hibridizáció, autoradiográfia
e. A filtert egy, az egyik oldaláról nyitott műanyag tasakba tesszük, és hozzáadunk 5 ml előhibridizációs oldatot
(5 × SSPE; 5 × Denhard oldat; 1,5% SDS; 50% formamid; 19% H2O; 1 mg élesztő-RNS).
f. A tasakot lezárjuk, és 42 °C-os vízfürdőben rázatva 30 percig előhibridizálunk.
g. A tasak egyik oldalát felnyitva, hozzáadjuk az elkészített próbát (80 µl), és egy éjszakán át 42 °C-os
termosztátban hibridizálunk.
h. A filtert mosófolyadékkal (1 × SSC; 0,1% SDS) 3 × 20 percig mossuk.
i. A filtert megszárítjuk, kazettába helyezzük, tetejére pedig röntgen-filmet teszünk.
j. A filmet 24–48 óra elteltével előhívjuk.
• Próbakészítés (T7 QuickPrime Kit, Pharmacia Biotech)
k. Mérjük össze a következő reakcióelegyet: 17 µl hődenaturált DNS (25–50 ng); 5 µl reagenskeverék (reagent
mix); 0,5 µl T7 polimeráz (Pharmacia, 10 u/µl); 2,5 µl [32P]dCTP (1 MBq).
l. A reakciót 5–15 percig 37 °C-on inkubáljuk.
m. A mintához hozzáadunk 75 µl 1,5%-os SDS-t, és az így kapott 100 µl próbából 25 µl-t használunk egy
hibridizációban, a többit –20 °C-on 2–3 hétig tárolhatjuk.
n. A felhasználandó 25 µl próbát 25 µl 0,5%-os SDS és 10 µl 1 n NaOH hozzáadásával 5 percig
szobahőmérsékleten denaturáljuk, majd 5 percre jégbe tesszük, és hozzáadunk 10 µl 1 n HCl-t és 10 µl 1 n
Tris-HCl-t (pH 7,6).
o. Az így elkészült próbát a prehibridizáló folyadékhoz adjuk.
2.2. Southern-hibridizáció
A Southern-hibridizáció lényege (84. ábra), hogy az agarózgél-elektroforézissel elválasztott DNS-
fragmentumokat változatlan mintázatban egy membránra viszik át. A szokásos módon készített gélt lúgban
áztatva a DNS-t denaturálják, majd savval semlegesítik. Az így előkezelt gélt egy megfelelő oldattal átitatott
szűrőpapírra fektetik, a gél felületére pedig ráhelyezik a membránt. Az egészet lefedik egy vaskos köteg
szűrőpapírral, amely szívni kezdi a nedvességet (blottolás, 85. ábra). Miközben a papír a gélen és a membránon
átszívja a folyadékot, a DNS is az oldattal együtt mozog, amikor azonban eléri a membránt, ott megkötődik,
rögzül. A membránhoz kötött DNS-molekulákhoz radioaktívan jelölt próbát hibridizálnak. A próbával homológ
DNS-molekulák autoradiográfiával kimutathatók (Sambrook et al., 1989). A Southern-hibridizáció a
növényvirológiában általánosan elterjedt a vírusok polimeráz láncreakciós vizsgálatával kapott, ún. PCR-
termékek végső azonosításában. A Southern-hibridizáció (PCR termékek azonosítására) lépései a következők:
polimeráz láncreakció (lásd a Polimeráz láncreakció (PCR) c. fejezetet), elektroforézis, blottolás,
előhibridizáció, próbakészítés, hibridizáció és autoradiográfia.
84. ábra - A Southern-hibridizáció vázlata [Sain és Erdei, 1985 után]
A nukleinsavak jellemzésének
módszerei
199 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
85. ábra - A blottolás [Sambrook et al., 1989 után]
• Elektroforézis
a. A vizsgálandó PCR termékeket 1–1,5%-os agarózgélben elektroforézissel elválasztjuk.
b. A gélt denaturáló oldatot (0,6 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl; pH 7,0) tartalmazó kádba helyezzük és 30 percig
inkubáljuk.
c. A denaturáló oldat helyére neutralizáló oldatot (1,5 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl, pH 7,0) teszünk, majd 30
perces inkubáció következik.
d. A gélt a 85. ábrán látható módon, egy éjszakán át blottoljuk, a blottoláshoz 20 x SSC-puffert kell használni.
e. A filtert szárítjuk, majd 2 percig az UV-transzparensre helyezve fixáljuk.
Az elektroforézis után a blottolás, előhibridizáció, próbakészítés, hibridizáció és autoradiográfia történik, a dot-
blot hibridizációnál leírtak szerint.
2.3. Northern-hibridizáció
A Northern-hibridizáció elve megegyezik a Southern-hibridizációval, de a vizsgálandó anyag itt nem DNS,
hanem RNS. Az RNS-sel való munka sokkal nagyobb elővigyázatosságot igényel, mint a DNS-sel történő
eljárások, mert az RNS nagyon bomlékony. Ezért gondoskodni kell arról, hogy a teszthez használt minden
eszköz és oldat RNáz-mentes legyen. A vizsgálatban az RNS-t olyan, ún. denaturáló agarózgélben választják el,
amely biztosítja az RNS másodlagos szerkezetének bontását. A leggyakrabban használt denaturáló ágensek a
formaldehid és a glioxál. A gélen történő szeparálás után ugyanazon lépések következnek, mint a Southern-
hibridizációban, azzal a különbséggel, hogy itt nincs szükség a gél futtatás utáni denaturálására és
neutralizálására.
A Northern-analízis alkalmazása különösen elterjedt a vírusgenom bizonyos részeivel transzformált
növényekben (transzgénikus növények) a transzgén expressziós szintjének meghatározására.
A nukleinsavak jellemzésének
módszerei
200 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A Northern-hibridizáció (Sambrook et al., 1989 után)
a. Az összes nukleinsav kivonásával nyert oldatból 8 µl-t használunk kiindulási anyagként.
b. Az RNS-mintához hozzáadunk 8 µl mintapuffert, majd a kapott oldatot 65 °C-on 5 percig denaturáljuk,
ezután pedig 2 percre jégbe tesszük.
c. A mintákat (mindig szerepeljen pozitív és negatív kontroll) denaturáló gélen, denaturáló futtató pufferben
elektroforetizáljuk.
d. Futtatás után a gélt 30 percig 10 x SSC-ben áztatjuk, majd a 85. ábra szerint blottoljuk.
e. A filtert szárítjuk, majd 2 percig UV-transzparensre helyezve az RNS-t rögzítjük.
Ezt követően a dot-blot hibridizációnál leírtak szerint következik a prehibridizáció, a hibridizáció és az
autoradiográfia.
2.4. Szendvics-hibridizáció
A szendvics-hibridizáció (86. ábra) során a vizsgálni kívánt vírus genomjából két egymással nem átfedő
szakaszt kiválasztanak, ezeket klónozzák, majd az egyik szakaszt csapdaként használják és egy, az ELISA-
módszernél használatos mikrotiterlemez falához kötik. Ha ilyen mintahelyekbe az adott vírust tartalmazó
szuszpenziót pipettáznak, akkor a csapda megköti a hibridizáló vírusrészecskéket. A nem kötődött anyagot
mosással eltávolítják. Ezután a másik klónt, a másik genomdarabot viszik a lyukakba, de ez a klón már jelölve
van (pl. alkalikus foszfatázzal), így a vírus-RNS koncentrációjával arányos hibridizációs szignál (színreakció)
megfelelő műszer segítségével mennyiségileg is értékelhető.
86. ábra - A szendvics-hibridizáció vázlata [Molnár János szívessége folytán]
2.5. Próbakészítés
A hibridizáció során alkalmazott próba egy olyan RNS- vagy DNS-fragmentum, amely homológ a vizsgálandó
molekulával. Az RNS-sel való bánásmód sok körültekintést igényel, ezért sokkal gyakoribb a DNS-próbák
használata. A virológiában a vírus egy részéről készült komplementer DNS-klón (cDNS) használatos
próbakészítéshez. A cDNS-klón készítésekor (87. ábra) vírus-RNS-ről reverz transzkripció segítségével
„elsőszál” cDNS készül. A keletkező elsőszál-cDNS RNS részét RNáz H segítségével részlegesen bontják, és a
megmaradó RNS-fragmentumok szolgálnak primerként a DNS-polimeráz I működéséhez, amely szintetizálja a
cDNS második szálát. A cDNS-t restrikciós enzimekkel vágva, az ugyanolyan restrikciós enzimmel hasított
vektorba (plazmidba) illesztik, majd a rekombináns plazmidot egy adott baktériumsejtbe transzformálják, és
abban felszaporítják. A plazmid a baktériumból bármikor tisztítható, és a kinyert DNS tetszőlegesen használható
próbakészítéshez, illetve bármely génsebészeti eljáráshoz. Az egyes DNS-fragmentumok in vitro körülmények
között is szaporíthatók polimeráz láncreakció segítségével. Azért, hogy a hibridizáció során keletkező hibridek
detektálhatók legyenek, a próbákat jelölni kell. A jelölés történhet radioaktív és nem radioaktív eljárással
(Brown, 1990).
87. ábra - A cDNS-készítés folyamata [Brown, 1990 után]
A nukleinsavak jellemzésének
módszerei
201 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A radioaktív jelölési módszerek közül a leggyakoribb a „nick”-transzláció és a primer meghosszabbítás. A nick-
transzláció (88. ábra) során a DNáz I-enzimmel kezelt DNS-szálakon nick-ek (nukleinsav-folytonossági
hiányok) jönnek létre, amelyeket az Escherichia coli DNS-polimeráz a komplementaritás elve szerint „befoltoz”
a négy dezoxiribonukleozid-trifoszfát felhasználásával, amelyek közül az egyik alfa helyzetben 32P izotópot
tartalmaz. A polimerizáció mellett az enzimnek 5‟–3‟exonukleáz-aktivitása is van, így az eredeti nick tovább
bővíthető, a polimeráz halad tovább a láncon, és közben beépíti a jelölt dezoxiribonukleozidokat is.
88. ábra - Próbakészítés nick-transzlációval. ↓: Eredeti nick pozíció, ⇓ : Végső nick
pozíció, →→→→ : Jelölt szál [Brown, 1990 után]
A nukleinsavak jellemzésének
módszerei
202 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az ún. véletlen (random) priming módszerénél a DNS-polimeráz I nagyobb egységét, a Klenow-fragmentumot
vagy a T7 DNS-polimeráz enzimet használják. A reakció során a jelölendő DNS-t denaturálják, majd random
hexanukleotidokat, polimeráz enzimet, alfa-32P dezoxiribonukleozid-trifoszfátokat adnak a reakcióelegyhez. A
hexanukleotidok a denaturált DNS-hez hibridizálnak, és primerként szolgálnak. A polimeráz enzim a
primerekhez kapcsolódik, és a jelölt bázisokat beépítve meghosszabbítja azokat. E módszerrel a nick-
transzlációhoz képest 2–5-szörös specifikus aktivitás érhető el. Napjainkban a PCR-technikával történő
próbakészítés is egyre gyakoribbá válik.
A nem radioaktív jelölési módok közül a legelterjedtebb a biotinálás (89. ábra). Ezekben a reakciókban a
biotint, mint haptént (biotin-II-dUTP) pl. nick-transzlációval beépítik a próbába, majd a szignált Southern-
hibridizáció után két lépésben előhívják. A filtert először a biotinhoz specifikusan kötődő olyan streptavidinnel
reagáltatják, amelyhez jelző (reporter) molekulaként alkalikus foszfatáz enzimet kötöttek. Így egy DNS-enzim
komplex jön létre. Ha az enzim szubsztrátjával inkubálják a nitrocellulóz filtert, színes csíkok mutatják a
hibridek helyét.
89. ábra - A biotinálás vázlata [Molnár, 1991 után]
3. Nukleinsav-szekvencia meghatározása
A nukleinsavak bázissorrendjének meghatározására a Maxam és Gilbert (1977)-féle kémiai degradáló és a
Sänger és Coulson (1975)-féle láncterminációs módszer ismert, amelyek közül jelenleg a láncterminációs
módszert használják. Ahhoz, hogy egy vírus teljes genomjának szekvenciáját meghatározzák, először cDNS-
klónokat kell készíteni, mégpedig úgy, hogy ezek a klónok a teljes vírusgenomot átfedjék. A vírusok esetében a
kisméretű genom megkönnyíti a szekvencia meghatározását. Nagyobb genomok bázissorrendjének
meghatározása már komolyabb feladat, de az automatizált (gépi) szekvenálás terjedésével egyre inkább
megvalósítható.
A láncterminációs módszer során a vizsgálandó DNS-t először egyszálúvá teszik. A folyamat kulcsenzime, a
DNS-polimeráz I alkalmas arra, hogy az egyszálú DNS kiegészítő szálát elkészítse, de ehhez szükség van egy
rövid kétszálas szakaszra is, amely az indító szerepét játssza. Az egyszálú DNS-hez tehát egy rövid
A nukleinsavak jellemzésének
módszerei
203 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
oligonukleotid primert hibridizálnak, amelytől kezdődően elindulhat a második szál szintézise. A
szekvenáláshoz négy reakció készül, ezek mindegyike tartalmazza a mintául szolgáló egyszálú DNS-t és a hozzá
hibridizált primert, valamint tartalmazzák a négyféle nukleozid-trifoszfátot (dATP, dCTP, dGTP és dTTP) is. A
nukleozid-trifoszfátok közül az egyiket radioaktívan jelölik, hogy a termék később kimutatható
legyen.Tartalmaznak az elegyek továbbá didezoxi-NTP-t (ddNTP), de mindegyik elegy csak egyfélét. A DNS-
lánc felépülését katalizáló polimeráz enzim jelenlétében megindul a mintának megfelelő komplementer szál
szintézise. Azok a mesterségesen felépülő szálak azonban, amelyekbe nem dezoxi-nukleozid-trifoszfát (dNTP),
hanem ddNTP épül be, nem tudnak tovább gyarapodni, mert a „rossz” nukleozid-trifoszfát ribóz részének 3‟-
helyzetű szénatomján nincs hidroxilcsoport, így ehhez nem tud kapcsolódni a következő nukleotid. Ha a ddNTP
és a dNTP aránya megfelelő, akkor a ddNTP beépülésekor létrejövő lánctermináció statisztikusan úgy oszlik el,
hogy az összes lehetséges vég képviselve lesz. A négyféle reakciót párhuzamosan végzik, és az elegyeket
poliakril-amid gélre viszik, ahol elektroforézist végeznek. A gél felbontóképessége maximális, azaz már egy
nukleotid különbséget is ki tud mutatni. A négy elegynek megfelelően négy oszlop fut párhuzamosan, s a kapott
csíkok magasságából megállapítható, hogy melyik szakasz zárult adeninnel, melyik guaninnal, melyik timinnel
és melyik citozinnal; ebből pedig összeállítható a vizsgált DNS bázissorendje. A szekvencia-adatokat
nemzetközi számítóközpontokban, ún. génbankokban helyezik el. A saját szekvencia gyors komputeres
programok segítségével összehasonlítható a génbankban levő ismert szekvenciákkal (Sain és Erdei, 1985).
A Maxam és Gilbert (1977)-féle szekvenálás során a radioaktív végjelölésű egyszálú DNS-mintát négyfelé
osztják, és négy roncsolási reakciót végeznek. Ezek során elbomlik a G-, az A- és a G-, a T- és a C-, illetve a C-
bázis. A roncsolási reakciót úgy végzik, hogy a reakció részleges, azaz minden lehetséges köztes termék
egyidejűleg jelen legyen. A keletkezett fragmentumokat elektroforézissel választják el, és a jelölt részeket
autoradiográfiával azonosítják (Sain és Erdei, 1985).
A nukleinsav-szekvencia meghatározásának módszertanát Sambrook et al. (1989) részletesen tárgyalja.
4. Polimeráz láncreakció (pcr)
A vizsgálandó nukleinsavmintát a polimeráz láncreakció segítségével in vitro körülmények között
szaporíthatjuk fel (amplifikálhatjuk). Ez azért alapvető jelentőségű, mert a vizsgálatokhoz sok esetben nem áll
rendelkezésre megfelelő mennyiségű kiindulási anyag, RNS vagy DNS. A szekvencia-specifikus amplifikáció
lehetőséget ad arra, hogy igen kis mennyiségben jelenlevő (vírus-)nukleinsavat is kimutathassunk (Saiki et al.,
1985; Dijkstra és De Jager, 1998). A PCR-reakció lényege (90. ábra) az, hogy a denaturált DNS két láncához
két ismert szekvenciájú, kb. 20 bázispár hosszúságú primert hibridizálunk, melyek a felszaporítandó szakasz két
végét jelölik ki, majd DNS-polimeráz segítségével megtörténik a primerek meghosszabbítása. Ez a reakciósor
ciklikusan ismétlődik, újabb és újabb minta-DNS-szekvenciák keletkeznek. A reakció tehát exponenciális lesz,
azaz 20–30 ciklus után a célszekvencia 106-szoros mennyiségi növekedése érhető el. Ezért az amplifikációhoz
pikogramm (10–12 g) mennyiségű vizsgálati anyag is elegendő lehet. A PCR fő lépései: 1. denaturáció általában
94 °C-on; 2. anel-lálás a primerek olvadási hőmérsékletétől kb. 5 °C-kal alacsonyabb hőmérsékleten (45–60 °C-
on); 3. polimerizáció 68 vagy 72 °C-on (Sambrook et al., 1989).
90. ábra - A polimeráz láncreakció. A és B: az eredeti DNS-szálak, A’ és B’: a két
oligonukleotid primer. A szaggatott vonal az in vitro szintetizált DNS-t jelöli [McInnes
és Symons, 1991 után]
A nukleinsavak jellemzésének
módszerei
204 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A reakció kulcsa a rendkívül hőstabil Taq-polimeráz enzim, amely lehetővé teszi a reakciósor automatizálását.
Az amplifikációra gyárilag előállított készüléket használnak, amelyekben a ciklus egyes lépéseinek paraméterei
előre programozhatók.
A felszaporított DNS-t általában agarózgélben, etídium-bromidos festés után teszik láthatóvá és hasonlítják
össze megfelelő méretmarkerrel, illetve a PCR-termék specifikus azonosítására a Southern-hibridizáció is
alkalmazható.
A PCR során keletkező termék kívánság szerint klónozható, illetve közvetlenül szekvenálható is.
Megjegyzés: A PCR-technika nagy előnyei az érzékenység, a fajlagosság és a gyorsaság. Magas fokú
érzékenysége miatt speciális laboratóriumi körülmények biztosítását igényli azért, hogy az idegen,
nemkívánatos szekvenciák felszaporítása elkerülhető legyen (egyszer használatos eszközök, reagensek
ellenőrzése, jól ismert pozitív és negatív kontrollok alkalmazása stb.). A vírusdiagnosztikában azért előnyös a
PCR használata, mert rendkívül specifikus, és a mintavételtől számított 4–6 órán belül eredményt ad. A
növényvírusok jelentős része RNS-genomot tartalmaz, ezért a polimeráz láncreakciót itt megelőzi egy reverz
transzkripciós lépés, amelynek terméke az az első szál komplementer DNS-e lesz, amely az ezt követő PCR
templátjául szolgál (91. ábra). A polimeráz láncreakció alkalmazását korlátozó tényező azonban az, hogy az
oligonukleotid primerek megtervezéséhez pontos szekvencia-adatokra van szükség.
A nukleinsavak jellemzésének
módszerei
205 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
91. ábra - Az RNS-vírusok detektálása RT-PCR reakcióval. Elsőszál komplementer
DNS (cDNS) készítése reverz transzkripcióval (RT) RNS templátról, majd a cDNS
felszaporítása polimeráz láncreakcióval (PCR) [McInnes és Symons, 1991 után]
A reverz transzkripció–polimeráz láncreakció (RT–PCR)
A reverz transzkripció–polimeráz láncreakció (RT–PCR) a dot-blot hibridizációnál említett összes nukleinsav-
kivonással kezdődik. Ezt követi a reverz transzkripció (elsőszál-cDNS-készítés) és a polimeráz láncreakció.
• Reverz transzkripció
a. Mérjük össze az alábbi reakcióelegyet mintánként, majd helyezzük a mintákat 1 órán át 42 °C-os vízfürdőbe:
2,0 µl nukleinsavoldat (össznukleinsav-kivonásból); 4,4 µl H2O; 2,0 µl 5 × M-MuLV-puffer; 0,1 µl 0,1 M
DTT; 0,1 µl RNáz-inhibitor; 1,0 µl 5mM dNTPk; 0,2 µl oligo dT (20 pmol) vagy 3‟-vég primer (20 pmol);
0,2 µl M-MuLV Promega (200 u/µl) reverz transzkriptáz.
b. Egy óra elteltével helyezzük a mintákat jégre, vagy tárolás esetén –20 °C-ra.
• Polimeráz láncreakció
c. Mérjük össze az alábbi reakcióelegyet mintánként egy-egy 0,5 ml-es Eppendorf-csőbe: 38,7 µl H2O; 2 µl
cDNS; 5µl 10 × Taq-puffer; 2µl 5mM dNTPk; 1 µl Primer 1 (100 ng); 1 µl Primer 2 (100 ng); 0,3 µl Taq
polimeráz Promega (5 u/µl); 30 µl paraffinolaj. Az olajat csak a végén kell rácseppenteni.
d. A reakciót egy előre programozott PCR-készülékbe helyezzük, amikor az már a 94 °C-ot elérte.
A nukleinsavak jellemzésének
módszerei
206 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
e. A reakció befejezése után az olaj alól óvatosan kipipettázzuk az oldatot, és az olajat kloroformos extrakcióval
eltávolítjuk.
f. A mintákból 6–6 µl-t 1%-os agarózgélen elektroforetizálunk.
Ajánlott program egy kb. 1000 bp hosszúságú DNS szakasz kiemelésére, ha a primerek olvadási hőmérséklete
kb. 60 °C:
Program Kezelés Hőmérséklet Időtartam Ciklusszám
a) denaturálás 94 °C 4 perc 1
b)
denaturálás
annelálás
polimerizálás
94 °C
55 °C
72 °C
1 perc
1 perc
1 perc
35
c) polimerizálás 72 °C 10 perc 1
d) tárolás 4 °C állandó
207 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
16. fejezet - Növényi vírusbetegségek és növekedést szabályozó anyagok
1. A növényi hormonok jellemzése
A növények növekedését szabályozó anyagok, más néven a fitohormonok élettani szerepük alapján két
csoportra oszthatók: juvenil- és szeneszcenciahormonokra. A növények élettani állapotát a növekedésszabályzó
anyagok közösen, egymásra is kölcsönhatást gyakorolva alakítják ki.
1.1. Juvenilhormonok
Hatásukra általában az jellemző, hogy a növény anyagcsere-folyamatait, sejtosztódását és a tápanyagok
felhalmozódását serkentik, a generatív fázisba történő átmenetet viszont késleltetik, tehát juvenilis (fiatal)
állapotban őrzik meg a növényt.
Auxinnak tekinthetünk minden olyan növekedésszabályozó anyagot, amelyek biológiai hatása az indol-3-
ecetsavéval megegyezik (pl. fenil-ecetsav, naftil-ecetsav, indol-vajsav). A felsorolásból kitűnik, hogy nem csak
indolszármazékok lehetnek auxinok, de a növényi szervezetben az indol-3-ecetsav (92. ábra) bizonyosan a
legáltalánosabb auxin hatású növekedésszabályozó. Ez a fejezet az auxin hatású vegyületek széles köréből
csupán az indol-3-ecetsav meghatározásának módszertani kérdéseivel foglalkozik.
92. ábra - Az indol-3-ecetsav szerkezeti képlete
Az indol-3-ecetsav szintézise a fiatal levelekben és hajtáscsúcsokban történik triptofánból, bazipetális
transzportja a floemben zajlik. Érdemes megjegyezni, hogy a növény szöveteiben található nagyszámú
indolvegyület egy részéről közismert, hogy az indol-3-ecetsav bioszintézisének köztes termékei (triptamin,
indol-3-piroszőlősav, indol-3-acetaldehid stb.), míg másoknak az indol-3-ecetsav raktározásában és
szállításában lehet szerepe. Így az indol-3-etanolnak, továbbá sok indol-3-ecetsav konjugátumnak (glükóz, mio-
inozit, cellulóz-glükán, glükoprotein és polipeptid észtereknek) hasonló szerepe van.
Az auxinok legnyilvánvalóbb hatása a megnyúlásos növekedés serkentése. A sejtek szintjén ez úgy valósul meg,
hogy a növényi sejtfal a hormon hatására fellazul, rugalmassá válik, majd a sejtekbe víz diffundál, ezáltal a
sejtek kiterjedése megnő.
A gibberellinek csoportjához sok hasonló szerkezetű (tetraciklikus diterpenoidsav) vegyület tartozik (93. ábra).
Az ismert gibberellinek száma meghaladja a 110-et (Kende és Zeevaart, 1997). Elsősorban az érett
kloroplasztiszokban képződnek. A gibberellinek két nagy csoportra oszthatók: a C19 és a C20 típusú
gibberellinekre (molekulavázuk 19, ill. 20 szénatomot tartalmaz). A C19 típusú gibberellinek biológiailag
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
208 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
aktívak, a C20 típusúak pedig – ismereteink szerint – a C19 gibberellinek metabolikus prekurzorai. A gibberellinek
bioszintézisének kiinduló vegyülete a mevalonsav.
93. ábra - A G3 gibberellinsav szerkezeti képlete
Hatásukat a merisztematikus szövetekre fejtik ki, egyrészt a sejtosztódás fokozásával, másrészt a már nem
osztódó, de még nem differenciálódott sejtek megnagyobbodásának indukálásával. Aktivitásuk eredménye sok
tekintetben az indol-3-ecetsavhoz hasonló, ami arra utal, hogy részben az auxinszintézis serkentésén keresztül
fejtik ki hatásukat.
A citokininek a sejtosztódás szabályozásáért elsősorban felelős növényi hormonok. A szabad citokininbázisok
többsége izopentenil oldalláncot viselő adeninszármazék. Két alaptípusuk a zeatin (Z) és az izopentenil-adenin
(iP) (94. ábra). A purinváz 9. nitrogénatomjához gyakran kapcsolódik ribóz vagy glükóz gyűrű, ilyen például a
9-zeatin-ribozid ([9R]Z), vagy a 9-izopentenil-adenin-ribozid ([9R]iP), amelyeket citokinin-nukleozidoknak
neveznek. A cukor-molekulához foszfátcsoport is kapcsolódhat, ezek a citokinin nukleotidok.
94. ábra - A: a citokininbázisok, B: nukleozidok és C: nukleotidok általános szerkezeti
képlete
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
209 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Szintézisük a gyökerek osztódó szöveteiben, csúcsirányú szállításuk a xylemben történik. A citokininek
sejtosztódást fokozó hatásuk mellett a sejtek differenciálódását is serkentik, továbbá indukálják a növényi
szövetben a tápanyagok felhalmozódását, viszszatartását.
1.2. Szeneszcenciahormonok
Jellemző élettani hatásuk a növény szintézisfolyamatának gátlása, a légzés fokozódása és a generatív fázisba
(virág- és termésképzésbe) történő átmenet serkentése, amelyek a növények szeneszcenciája (öregedése)
irányában hatnak. A növényt ért stresszek következtében aktivitásuk megnő.
Az etilén (95. ábra) a növekedést serkentő hormonok antagonistája, a megnyúlásos növekedés fékezője.
Szintézise a metioninciklusból vezethető le, de telítetlen zsírsavak peroxidációja során is képződik. További
élettani hatásai: a légzés fokozódása, a virágképzés indukciója, a termésérés serkentése és a levelek leválása. A
növényre ható biotikus és abiotikus stresszek szintén megnövekedett etiléntermelést okoznak.
95. ábra - Az etilén szerkezeti képlete
Az abszcisszinsav a növényi szintetikus folyamatok széles körének gátló hormonja, mely a gibberellinekhez
hasonlóan diterpenoid vegyület (96. ábra). A plasztidokban szintetizálódik, hatását az intenzív anyagcserét
folytató szövetekre fejti ki. A növekedés gátlása mellett szabályozza a levelek leválását, valamint a rügyek
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
210 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
nyugalmi állapotát. Szárazság- és hidegstressz hatására a növények abszcisszinsav-tartalma fokozódik, és így
emelkedik ezekkel a stresszekkel szembeni ellenálló képességük.
96. ábra - Az abszcisszinsav szerkezeti képlete
2. A vírusfertőzött növények hormonváltozásai
Vírusfertőzött növények auxinszintjét vizsgálva ellentétes eredmények születtek: bizonyos esetekben csökkent
az auxinszint, más esetekben viszont nőtt. További nehézséget jelent a vírusok által okozott auxinkoncentráció-
változás hatásának értékelésében az, hogy az auxin kis mennyiségű jelenléte serkenti a növekedést, nagyobb
töménységben pedig gátolja azt, sőt az egyes növényi szervek növekedése számára optimális
auxinkoncentrációk között is nagyságrendi különbségek vannak. Smith et al. (1968) szerint cukorrépa, bab és
paradicsom levélszöveteiben a répa levélgöndörödés vírus (beet leaf curl ? rhabdovirus) szisztemikus fertőzése
után az auxintartalom csökkent ugyan, de ez nem volt arányos a tünetek mértékével, mert a rezisztens
növényekben, ahol a vírus szaporodása korlátozott mértékű volt és a tünetek is csak minimálisan fejlődtek ki, az
auxin mennyisége ugyanúgy csökkent, mint a fogékony növényekben, ahol a tünetek súlyosak voltak. A dohány
mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) fertőzésére hiperszenzitíven reagáló dohánynövényekben Van Loon
(1979) vizsgálatai során az inokulált levelek auxinszintjének nagymérvű növekedését tapasztalta a léziók
kifejlődése alatt. A vírusfertőzés iránt szisztemikusan fogékony gazdanövény beteg leveleiben viszont a hormon
koncentrációjának csökkenését észlelték (Rajagopal, 1977).
Olyan esetekben, amikor a vírusfertőzést törpüléses tünet kíséri, a fertőzött növényekben a gibberellinek
tartalma gyakran csökkent. Ezt tapasztalták uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) fertőzött
uborkában (Bailiss, 1977). Ez a folyamat külsőleg adott gibberellinekkel visszafordítható (Fernandez és
Gáborjányi, 1976), bár számításba kell venni azt, hogy a gibberellines kezelés mindenképpen serkenti a szár
megnyúlását, akár fertőzött volt a növény, akár nem. Meg kell továbbá azt a tényt is említeni, hogy a törpüléssel
járó vírusbetegségek, így a paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus) fertőzése
paradicsomon (Bailiss, 1968) vagy az árpa sárga törpülés vírus (barley yellow dwarf luteovirus) árpán (Russel
és Kimmins, 1971) sejtszámcsökkenést (mitózisgátlást) indukálnak. A gibberellinek viszont inkább a sejtek
kiterjedését fokozzák (Russel és Kimmins, 1971), jóllehet egészséges növényekben a sejtosztódásra is hatásuk
van (Bailiss, 1968). Feltételezhető tehát, hogy a gibberellin-aktivitás gátlása nem az elsődleges oka a vírusok
által előidézett törpülésnek. A gibberellinek törpülést enyhítő hatása a peroxidáz jellegű auxin-oxidáz gátlásával
magyarázható (Gáborjányi et al., 1973).
A vírusfertőzött növények citokinin-tartalmára vonatkozó vizsgálatok eredményei az auxinokhoz hasonlóan
ellentmondásosak. A dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus) fertőzése csökkentőleg hat a
citokinin-tartalomra tehénborsó gyökérszöveteiben (Kuriger és Agrios, 1977) és Nicotiana glutinosa inokulált
leveleiben (Tavantzis et al., 1979). Ezzel ellentétben Balázs et al. (1977) dohány mozaik vírussal fertőzött
„Xanthi-nc‟ hiperszenzitív dohány félleveleiben az összcitokinin szintjének emelkedését mérték. Ugyanezt
tapasztalták olyan „Xanthi-nc‟ növények nem fertőzött felső leveleiben is, ahol az alsó leveleket előzőleg
dohány mozaik vírussal inokulálták. Ez a megfigyelés felveti azt a lehetőséget, hogy a megemelkedett citokinin-
aktivitás öszszefügg a szisztemikus szerzett rezisztencia kialakulásával. A citokininszint a dohány mozaik
vírussal szisztemikusan fertőzött ‟Samsun‟ dohánylevelekben is megemelkedett (Sziráki és Balázs, 1977).
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
211 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Vírusfertőzés esetén a hiperszenzitív dohányok fokozott etiléntermelését mutatták ki (Balázs et al., 1969). A
nekrózisok száma, nagysága és az etilénprodukció között egyenes összefüggés figyelhető meg (Nakagaki et al.,
1970). Tekintettel arra, hogy az etiléntermelés emelkedése csak néhány órával előzi meg a nekrózisok
megjelenését, ráadásul az eredetileg fertőzött sejtek elhalása már kissé előbb bekövetkezik, mint ahogy a látható
léziók kialakulnának, valószínűnek látszik, hogy az etilén nem kiváltó oka a lézióképződésnek. Ezt támasztja alá
az is, hogy a lokális klorózist okozó vírusfertőzés szintén megemelkedett etiléntermeléssel jár együtt
(Gáborjányi et al., 1971). A dohány mozaik vírussal szisztemikusan fertőzött dohánylevelekben az etilén
termelése nem növekszik (Balázs et al., 1969).
Az abszcisszinsav növekedést gátló tulajdonsága jól ismert, mégis viszonylag kevés vizsgálatot végeztek
vírusfertőzött növények abszcisszinsav-tartalmára vonatkozóan (Balázs et al., 1973). A legtöbb kísérletet
dohánynövényeken végezték, és azt tapasztalták, hogy vírusfertőzés hatására a hormon képződése fokozódik.
Whenham és Fraser (1981) a dohány mozaik vírus közönséges törzsével szisztemikusan fertőzött „White
Burley‟ dohányok szöveteiben hatszoros abszcisszinsav-koncentrációt mértek a kontrollnövényekhez képest.
Lokális léziót adó dohány–dohány mozaik vírus kapcsolatában a hormon koncentrációja szintén megnőtt. Az
abszcisszinsavszint az inokulált növények nem fertőződött leveleiben is megemelkedett, és a levelek növekedése
gátlást szenvedett. Tekintve, hogy mind az abszcisszinsav, mind a vírusfertőzés gátolja a sejtosztódást, a
tanulmány készítői arra a következtetésre jutottak, hogy a fertőzött levelek csökkent növekedését a
hormonaktivitás serkentése okozta.
3. A növényi hormonok meghatározása
A növényi hormonok meghatározása azért bonyolult feladat, mert 1. a szövetekben nagyon alacsony (ng)
koncentrációkban fordulnak elő, 2. a növények nagy változatossággal termelnek hasonló kémiai szerkezetű
molekulákat, amelyek nem rendelkeznek hormonaktivitással, 3. kis molekulatömegűek, kémiai szerkezetük nem
nagyon specifikus, 4. az extrakciós és a tisztítási lépések során könnyen bomlanak, 5. a hormonok több
csoportja nem egységes (pl. az izopentenil-adenin és a zeatin típusú citokininek két fajtája vagy a C19 és a C20
szénvázú gibberellinek nagy száma ismert), a meghatározásukra használt analitikai módszerek ezért többnyire
egy-egy adott kémiai szerkezettel bíró vegyületre irányulnak és nem az azonos biológiai aktivitással rendelkező
vegyületcsoport összes tagjára, továbbá 6. a növényen belül az egyes szervek hormontartalma igen eltérő.
A növényi hormonok kvantitatív meghatározásának alapjai
A növényi növekedésszabályozó anyagok meghatározása a biológiai aktivitáson alapuló biotesztekkel,
fizikokémiai módszerekkel vagy immunanalitikai módszerekkel történik (Brenner, 1981; Hedden, 1993). A
biotesztekre csak az etilén esetében térünk ki. A fizikai-kémiai módszerek lépései a következők: mintavétel,
kivonatkészítés v. extrakció, minta-előkészítés (tisztítás, elválasztás) és mennyiségi analízis.
• Mintavétel
Vírusfertőzött és egészséges növények összehasonlító vizsgálatakor a mintákat azonos körülmények között
nevelt, ugyanolyan élettani állapotú növények megfelelő szervéből és szövetéből kell venni.
• Kivonatkészítés vagy extrakció
A metanol 80%-os vizes oldata a legelterjedtebb extrahálószer. Lényeges, hogy a kivonás során a vizsgálni
kívánt hormonvegyületek ne hidrolizáljanak, más kémiai reakciókban vagy enzimes úton ne károsodjanak.
Célszerű nagy tisztaságú kivonószerrel dolgozni, érdemes továbbá egy olyan mintát is készíteni és a többivel
azonos módon tisztítani és mérni, amelybe növényi anyagot nem teszünk, csak extrahálószert.
• Minta-előkészítés (tisztítás, elválasztás)
Lehetséges lépései a folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás, a szilárd fázisú extrakció, a
hagyományos oszlopkromatográfiás, a vékonyréteg-kromatográfiás, a nagyhatékonyságú
folyadékkromatográfiás és a gázkromatográfiás elválasztás.
A folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás a különböző polaritású oldószerekben való eltérő
megoszláson alapul. Az oldószer kioldóképességének a megadott körülmények (pH stb.) mellett optimálisnak
kell lennie a megfelelő hormonra nézve. A két fázis elválását gátló anyagok (pl. foszfolipidek) rontják a
hormonok kioldásának hatékonyságát. A hormonokat kioldó szerves fázis (pl. 1-butanol, etilacetát) tartalmazhat
kismértékben vizes puffert, ami az oldószer elpárologtatása során töményebbé válik, és ez szélsőséges pH-
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
212 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
viszonyokat eredményezhet. Ezért érdemes a szerves fázist a bepárlás előtt vízzel extrahálni, vagy a pH-ját
semlegesíteni.
A szilárd fázisú extrakció lényege, hogy a nyers növényi kivonatot egy kisméretű, eldobható oszlopon tisztítják,
aminek töltetén a vizsgálni kívánt anyag, egyéb mintakomponensekkel együtt, megkötődik. A
szennyezőkomponenseket azután különféle oldószerekkel eltávolítják az oszlopról, majd egy alkalmas
oldószerrel a vizsgálandó mintaalkotót is kinyerik. A módszer előnyei a gyors és egyszerű kivitelezhetőség, a
kérdéses mintaösszetevő kedvezően magas kinyerhetősége (kicsi az elválasztási veszteség) és az alacsony
oldószerigény. Az oszlop töltete a leggyakrabban szilikagélhez kémiailag kötött oktadecil-szilán (= ODS vagy
C18), de kation- és anioncserélő töltetek, valamint egyszerű szilikagél-adszorpciós töltetek használata is elterjedt.
A hagyományos oszlopkromatográfiás elválasztás főként fenolszármazékok és pigmentek eltávolítására
alkalmas. Az oszlopok töltete lehet oldhatatlan polivinil-pirrolidon (PVP), Sephadex LH-20, DEAE-cellulóz,
továbbá Dowex-50, Duolit és cellulóz-foszfát ioncserélő töltetek, aktív szén, Cellit vagy szilikagél-adszorpciós
töltetek.
A vékonyréteg-kromatográfiás elválasztás mind hatékonyságában, gyorsaságában, mind mintakapacitásában
elmarad a nagyhatékonyságú folyadékkromatográf teljesítményétől, alkalmazását gazdasági megfontolások
tehetik indokolttá. Növényi hormonok elválasztására cellulóz- és szilikarétegek használatosak.
A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás elválasztás (HPLC) az előzetes tisztítási lépéseken átesett növényi
minta összetevőit nagy hatékonysággal elválasztó, gyors módszer. Az oszlop töltete fordított fázisú HPLC
esetén – aminek alkalmazása igen elterjedt – a legtöbbször oktadecil-szilán (ODS).
A gázkromatográfiás elválasztás (GC) hatékony, gyors kromatográfiás módszer. Korlátozott mintakapacitása
miatt többlépéses minta-előkészítési folyamat esetén általában az utolsó kromatográfiás művelet. A
hagyományos, töltött gázkromatográfiás kolonnákat a kapilláris oszlopok váltják fel. A növényi hormonok (az
etilén kivételével) nem eléggé illékonyak, ezért származékképzéssel alakítják át szerkezetüket, hogy
gázkromatográffal elválaszthatóak legyenek. Ilyen származékképző eljárás a metilezés vagy a trimetil-szililezés.
• Mennyiségi meghatározás
A növényi hormonok kvantitatív meghatározása hatékony elválasztást biztosító kromatográfhoz (HPLC, GC)
kapcsolt, megfelelő szelektivitású detektorokkal vagy immunanalitikai módszerekkel (RIA, ELISA) történhet. A
nagyhatékonyságú folyadékkromatográf detektorok két típusa terjedt el növényi hormonok mérésére: a
fluoreszcens detektorok és az elektrokémiai detektorok. A fluoreszcens detektorokat elsősorban in-dol-3-ecetsav
mérésére használják, mert az indolvegyületek mérésére minden kémiai származékká történő átalakítás nélkül
alkalmasak. Az elektrokémiai detektorok oxidatív üzemmódban használva szintén indol-3-ecetsav mérésére
alkalmasak, ha az aminocsoport nitrogénmolekulája nem kötött.
A növényi hormonok gázkromatográfiás meghatározása a következő detektorokkal történhet: elektronbefogásos
detektor, nitrogén–foszfor detektor és tömegspektrométer. Az első kettő alkalmazása szórványos, a
tömegspektrométer használata azonban széles körben elterjedt.
Az elektronbefogásos detektor erősen elektronegatív vegyületekre, tehát halogénezett származékokra és
bizonyos aromás molekulákra szelektív detektor. Az abszcisszinsav metil-észterének, illetve más növényi
hormonok halogénezett csoportot tartalmazó mesterséges származékainak meghatározására alkalmas. A
nitrogén–foszfor detektort nitrogén- vagy foszfortartalmú molekulák szelektív detektálására használják, tehát
indol-3-ecetsav- és citokinin-származékok mérésére. A tömegspektrométer a gázkromatográfhoz kapcsolható
legnagyobb szelektivitással rendelkező detektortípus. A minta elválasztott komponensei egy ionforrásban
ionizált töredékekre hasadnak. Minden vegyület egyedi szerkezetéből adódóan azonos ionizáló energia hatására
következetesen ugyanazokra az ionizált töredékekre hasad, és az egyes töredékek képződésének aránya is
állandó marad. A berendezés analizátora a töredékeket tömeg/töltés arányuk alapján elválasztja, a detektor pedig
érzékeli mennyiségüket, amelyet az ún. tömegspektrumban különböző magasságú függőleges vonalak
formájában láthatunk. A töredékek képződése (azonos ionizáló energia mellett) állandó, ezért egy bizonyos
komponens tömegspektrum-mintázata (a töredékek egymáshoz viszonyított intenzitása, azaz mennyiségük) is
azonos.
• Immunanalitikai vagy szerológiai módszerek
Kiváló szelektivitásuk mellett megfelelő érzékenységet biztosító módszerek, melyek alacsony tisztaságú
növényi minták esetében is alkalmazhatóak. A növényi növekedésszabályozók kis molekulatömegük miatt nem
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
213 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
immunogének, ezért nagyméretű fehérjékhez (marha-szérumalbumin vagy tojásfehérje) kötik őket, alkalmassá
téve melegvérű állatok (többnyire nyulak) immunizálására. A termelt antiszérum érzékenysége és egyéb
vegyületekkel szemben adott keresztreakciója nagymértékben függ az immunizálás során használt
hormonfehérje komplex kötésétől. Lényeges feltétel, hogy a fehérjemolekula ne a vizsgálni kívánt hormon
valamelyik fő funkcionális csoportjához kötődjék, ami az antitestképződés során epitópként szerepelne. Több
vizsgálati módszer ismert.
A radioaktív immunanalitikai módszerek (RIA) közös elve a radioaktív izotóppal jelzett hormonvegyületek és a
növényi mintában jelen lévő, azonos típusú hormonmolekulák versengése a specifikus antiszérum-
kötőhelyekért. Az elegyben mérhető radioaktív izotóp koncentrációja fordított arányban áll a minta
hormontartalmával.
Az enzimhez kötött immunanalitikai módszerek (ELISA) alapja az, hogy a vizsgálatok során a növényi
mintában lévő hormonmolekulák peroxidáz vagy alkalikus-foszfatáz enzimhez kötött hormonvegyületekkel
versengenek az antiszérum-kötőhelyekért. Az egyensúlyi állapot kialakulását követően az enzim szubsztrátját az
elegyhez adva színreakciót kapunk, amelynek intenzitása fordítottan arányos a minta hormontartalmával.
• Belső standardok használata
A növényi hormonok meghatározását többlépéses minta-előkészítési művelet előzi meg, ami a vizsgálni kívánt
vegyületre nézve veszteséggel jár. A folyadék–folyadék megoszlás tökéletlensége, a foszfolipidek vagy a
fehérjék általi megkötés, a kémiai átalakulás és az üvegeszközök felületén való megkötődés egyaránt rontja a
kinyerhetőség hatékonyságát. A kivonatkészítés során a mintához adott – ismert mennyiségű – standard
vegyület koncentrációja azonban az utolsó (analitikai) lépésnél visszamérhető, aminek ismeretében
következtethetünk a tisztítási-elválasztási lépcsők együttes kinyerési hatékonyságára és a növényi minta eredeti
hormontartalmára. A belső standardot célszerű úgy megválasztani, hogy kémiai szerkezete nagyon közel álljon
ahhoz a mintaalkotó vegyülethez (növényi hormonhoz), amit vizsgálni szeretnénk. A hozzáadott belső standard
mennyiségének megválasztásakor törekedni kell arra, hogy a mintaelegyben lévő koncentrációja a minta várható
hormontartalmával megközelítőleg egyezzen. A leggyakrabban használt belső standardok a 14C vagy 3H
radioaktív izotóppal jelzett abszcisszinsav, az indol-3-ecetsav, a G3-gibberellin vagy a zeatin, valamint
tömegspektroszkópiás detektálás esetén a 2H és 15N nem radioaktív nehéz izotópokkal egyszeresen vagy
többszörösen jelzett hormonvegyületek.
3.1. Az auxin (indol-3-ecetsav) meghatározása
Az indol-3-ecetsav kivonása növényi mintákból
Az indol-3-ecetsav (IES) kivonása történhet hagyományos módon, metanol 80%-os vizes oldatával, vagy egyéb
IES kivonására alkalmas módszerekkel. Ilyen a növényi minta 65% i-propanolt tartalmazó 0,2 M-os imidazol-
pufferben (pH 7,0) történő homogenálása (4 ml kivonószer/g minta arányban). A belső standard hozzáadása
után a homogén növényi macerátumot 1 órán át 4 °C-on tartjuk, majd 10 000 g fordulatszámon 5 percig
centrifugáljuk, a továbbiakban pedig a felülúszóval dolgozunk (Chen et al., 1988).
Az indol-3-ecetsav elválasztása
• Folyadék–folyadék megoszláson alapuló elválasztás
Az IES oldékonysága, megoszlása a szerves és vizes fázis között a pH függvényében változik. Semleges vagy
lúgos kémhatású közegben a karboxilcsoport protonja disszociál, a molekula negatív töltést hordoz,
oldékonysága poláros oldószerekben (pl. desztillált vízben) sokkal jobb. Savas kémhatású közegben azonban a
hidrogénion nem disszo-ciál, a molekula töltés nélküli állapotban van, ezért ilyenkor apoláros oldószerekben
jobban oldódik. A kivonás során kapott minta IES-tartalmát tehát gyengén lúgos (pH 8,0), 0,1 M-os foszfát-
pufferben oldva, etilacetáttal szemben el lehet választani a semleges indolvegyületektől (pl. indol-3-etanol,
indol-3-metanol, indol-3-aldehid). Az oldat pH-ját csökkentve (pH 3,0) az IES oldékonysága megváltozik,
etilacetáttal kivonható a vizes fázisból. Az IES mellett a szerves oldószer tartalmazza majd az 5-hidroxil-indol-
ecetsavat, a 4-klór-indol-ecetsavat, az indol-piroszőlősavat, a fenil-ecetsavat és más savas karakterű
indolvegyületeket, míg a konjugált indolvegyületek és az amfoter összetevők (pl. triptofán) a vizes fázisban
maradnak. Az etil-acetát helyett dietil-éter is használható, mely még kevésbé poláros oldószer.
• Hagyományos PVP-oszlopkromatográfia
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
214 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Oldhatatlan polivinil-pirrolidonnal (PVP) töltött oszlopokat széles körben alkalmaznak IES tisztítására. Az
oszlop mérete a minta térfogatától függően igen változatos lehet. Hatásukat alacsony pH mellett a
fenolvegyületek visszatartása által fejtik ki, H-kötéseken keresztül. A pH csökkentésével fokozódik az oszlop
IES-megkötő képessége, az elválasztás időtartama azonban ezáltal nagyon kitolódik. Kompromisszumként
célszerű 4–5 közötti pH-tartományban, citromsav/0,1 M-os Na-foszfát-puffer mozgó fázissal végezni az
elválasztást.
• Az indol-3-ecetsav ioncsere-kromatográfiás elválasztása
A savas karakterű indolvegyületek anioncserélő oszlopokon megköthetőek. A DEAE cellulóz (OH–)
anioncserélő töltet előkészítése 30 percnyi vízzel való duzzasztással, azután 0,5 M-os H2SO4 oldatos mosással
kezdődik. Ezután vízzel mossák, majd 0,5 M-os NaOH-oldatban 10 percig inkubálják. A töltetet ezt követően
desztillált vízzel alaposan átmossák, míg a pH-ja tartósan 7,5 alatt nem marad. A nedves DEAE cellulóz
ioncserélő anyagot az ismertetett lépések után megfelelő méretű oszlopba töltik (30 g mintából származó
növényi kivonat elválasztására egy 100 mm × 20 mm-es oszlop alkalmas), majd rátöltik az IES-t tartalmazó
vizes oldatot, és 300 ml vízzel eluálják. Az IES a töltet kationos csoportjain megkötődik, a minta semleges és
bázikus összetevői az oszlopról az eluenssel eltávoznak. Az IES és egyéb savas indolszármazékok 200 ml 50
mM-os Na2SO4-oldattal átmosva választhatók le az oszlopról.
DEAE Sephadex A-25 (acetát–) anioncserélő oszlopot is használnak IES tisztítására. A gél típusú töltetet vízben
duzzasztva készítik elő; 0,5 M-os sósavoldattal, majd 0,5 M-os NaOH-oldattal mossák, azután 1 M-os nátrium-
acetát-oldatban inkubálják több órán keresztül. Ezt követően desztillált vízzel mossák mindaddig, amíg pH-ja
már nem változik. A töltetet ezután 2-propanol/víz (1:1 térfogatarányú) elegyébe áztatják, és nedvesen oszlopba
töltik. Az 50%-os propanolban oldott növényi kivonatot az oszlopra töltik, mozgó fázisként szintén 50%-os
propanolt használnak. Az elválasztás után a savas karakterű indolszármazékok oszlopról való leválasztása a 2-
propanol/víz mozgó fázishoz adott ecetsavoldattal történhet. Az ecetsav koncentrációja a mozgó fázisban
növekedhet lépcsőzetesen, vagy 0 és 10% között gradiens módon. Ez a preparatív célú elválasztás viszonylag
rövid, 100–200 mm-es oszlopokon elvégezhető. A szükséges oldószertérfogatok és az egyes indolvegyületek
retenciós ideje tapasztalati úton állapítható meg (Momonoki et al., 1983; Nonhebel és Bandurski, 1984).
• Az indol-3-ecetsav elválasztása szilárd fázisú extrakcióval
A különféle gyári kiszerelésű, egyszer használatos, eldobható oszlopok széles skálája szerezhető be poláros
szilikagél- vagy apoláros oktadecil-szilán- (ODS-) töltettel. HPLC- vagy GC-analízis előtt használják őket. Jó
hatékonyságuk alapvető feltétele, hogy a következő analitikai lépés elválasztási mechanizmusa eltérjen az itt
használt oszlopétól.
Az ODS-oszlopon történő mintatisztítás egyik lehetősége az oszlop aktiválása 2 ml 1%-os ecetsavval, majd a
növényi mintát 1% ecetsavat tartalmazó, 5-10%-os metanololdatban viszik az oszlopra. A mintában lévő
szennyezőanyagokat a minta oldószerének további részleteivel távolítják el az oszlopról. Az állófázison
megkötődött indolvegyületeket azután 1% ecetsavat tartalmazó, lépcsőzetesen növekvő koncentrációjú (max.
70%-os) metanololdat 2–2 ml-es részleteivel eluálják. Szilikagéltöltet esetében 5 ml 0,5 M-os ecetsavval, azután
5 ml 1% ecetsavat tartalmazó, n-hexán/etilacetát (99:1 térfogatarányú) elegyével kezelve tehetik aktívvá az
oszlopot. A minta felvitele után az indolszármazékok 1% ecetsavat tartalmazó, hexánban oldott növekvő
koncentrációjú (max. 60%-os) etilacetát-oldat 2–2 ml-es részleteivel nyerhetők vissza az oszlopról. Ezek az
oszlopok kevesebb mint 1 g töltetet tartalmaznak, ezért mintabefogadó képességük erősen korlátozott.
• Az indol-3-ecetsav elválasztása HPLC-vel
Fordított fázisú HPLC-rendszerekben az állófázis 5 mm átmérőjű gömb vagy szabálytalan alakú szilikagél
hordozószemcsékhez kémiailag kötött szénhidrogénlánc; alkil- (C2, C6, C8, C18) vagy fenilcsoport. Ezek közül az
oktadecil-szilán (ODS, ill. C18) terjedt el leginkább a gyakorlatban. Az elválasztás során a mozgó fázis lehet
izokratikus (állandó összetételű) és gradiens (az elúció alatt egyre töményebb). Ez utóbbi a csúcselhúzódás
kialakulását gátolja. Az eluens valamilyen szerves oldószer, többnyire metanol, etanol vagy acetonitril vízben,
illetve vizes pufferben oldva.
Az IES állófázishoz való kötődését a mozgó fázis pH-ja nagymértékben befolyásolja. Mivel savas pH-jú
közegben (pH 3,5) az IES karboxilcsoportján lévő hidrogénion nincs disszociált állapotban, tehát a molekula
nem hordoz töltést, jobban kötődik az apoláros állófázishoz és lassabban halad át az oszlopon. Az
indolvegyületeket ezért rendszerint savas pH-jú mozgó fázissal eluálják. Ezt a módszert ion-visszaszorításnak
nevezik. Ha a mozgó fázis pH-ja nem eléggé alacsony, az IES mennyiségének jelentős része ionos állapotba
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
215 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
kerül. Ilyenkor a nem-disszociált és disszociált molekulák retenciós ideje nem egyforma, ami csúcselhúzódást
okoz.
Az IES meghatározását fordított fázisú HPLC-ionpár változatával is végezhetik. Ennél a módszernél a mozgó
fázis pH-ját pufferrel kb. 6,5-re állítják, és hozzáadnak egy lipofil elleniont, pl. tetrabutil-ammonium-ot (TBA+),
amelynek töltése ellentétes az elválasztani kívánt molekula töltésével. Semleges pH mellett az IES disszociált
állapotban van és a poláros mozgó fázishoz kötődik. A TBA+ ellenion jelenlétében azonban IES––TBA+
ionpárok alakulnak ki, amelyek eltérő polaritásuk miatt inkább az apoláros ODS állófázishoz kötődnek, ezáltal
az oszlop IES-visszatartó képessége nagymértékben megnő.
• Az indol-3-ecetsav gázkromatográfiás elválasztása
A gázkromatográfiás elválasztást megelőző lépés a származékképzés. Az IES éterben diazometánnal
metilezhető. A diazometán sárga, erősen mérgező, robbanékony gáz! Éteres oldata N-metilén-N-nitrozo-p-
toluénszulfonamidból Schlenk és Gellerman (1960) módszerével, a Cohen (1984) által kifejlesztett egyszerű
berendezéssel állítható elő. A mintát teljesen megszárítják, azután metanolban feloldják, majd az éteres
diazometánból annyit adnak hozzá, amennyi az oldatot tartósan sárgára színezi. A származékképzés ideje alatt
az éter mennyisége legalább ötszöröse kell, hogy legyen a metanol mennyiségének. A reakció igen rövid idő
alatt végbemegy, tehát 5 perc múlva a reagenst nitrogéngáz átáramoltatása közben eltávolítják.
Az indolvegyületek másik gyakori származékképzési típusa a trimetil-szililezés (TMS), ami többféleképpen
végezhető, ezek közül Badenoch-Jones et al. (1982) módszerét ismertetjük. A száraz mintát kevés metanolban
feloldották, majd üvegfiolába töltötték, amelyben szárazra párolták. Ezután diklór-metánt adva a mintához
azeotropos bepárlással szárították tovább. A származékképző lépésben az előkészített száraz anyagot 30 μl
acetonitril/BSTFA (bisz-trimetilszilil-trifluoracetamid) (1:1 térfogatarányú) elegyében feloldották, a fiolát
lezárták, és 70 °C-on tartották 10 percig. A mintát ezután közvetlenül vizsgálhatták gázkromatográffal, vagy
nitrogén átáramoltatása mellett megszárították és apoláros oldószerben (hexán, etilacetát) feloldották. A TMS-
származékképzés legfőbb nehézségét a mintában nyomnyi mennyiségben jelenlévő víz okozza. Ez gátolja a
származék képződését, valamint elősegíti a szililezett termék bomlását. A TMS-származékokat ezért nem lehet
HPLC-vel tovább tisztítani.
GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: Az indolvegyületek gázkromatográfiás elválasztása két különböző
típusú megosztó fázison történhet; a gyakorlatilag apoláros dimetil-szilikon alapú SE-30, OV-101 és DB-1
nedvesítő folyadékokon, valamint a kissé polárosabb OV-7, OV-17, DC-550 és SP-2250 folyadékfázisokon,
amelyek fenil-metil-szilikon és dimetil-szilikon keverékén alapulnak. Mindkét nedvesítőfolyadék-típus alkalmas
szinte az összes indolszármazék vizsgálatára. Nagy csúcskapacitásuk (a kromatográfia során elválasztható
komponensek nagyobb száma) és nagy érzékenységük miatt a kapilláris kolonnák egyre inkább tért hódítanak az
indolvegyületek minőségi és menynyiségi meghatározása terén.
Az IES gázkromatográfiás elválasztására példaként egy Dunlap és Binzel (1996) által közölt módszert
ismertetünk. A megtisztított növényi mintából 2 μl mennyiséget automatikus, megosztás nélküli (splitless)
módszerrel egy 10 m-es, 0,18 mm belső átmérőjű kapilláris oszlopba injektáltak. Az oszlop belső felületét 0,4
μm vastagságú DB-1701 nedvesítőfolyadék-film borította. Az elválasztást 1 ml/perc hélium vivőgáz térfogati
sebesség mellett, 70 kPa oszlopnyomással végezték. Az elválasztás alatt az oszlop hőmérsékleti programja a
következő volt: 0,5 percig 65 °C, majd 15 °C/perc ütemben az értékét 225 °C-ra emelték, amit 3 percig tartottak,
azután 250 °C-ra emelve a hőmérsékletet 5 percig tartották ezt az értéket. Az elválasztás összesen mintegy 20
percet vett igénybe, az IES retenciós ideje ilyen körülmények mellett 11 perc volt.
Az indol-3-ecetsav kvantitatív meghatározása
• Az indol-3-ecetsav meghatározása HPLC-vel
Az IES meghatározása HPLC-vel különböző detektorok (fluoreszcens és elektrokémiai detektorok) segítségével
történhet. A két detektortípus közül a fluoriméterek IES-sel szemben mutatott érzékenysége a jobb (Sandberg et
al., 1987).
A különféle növényi szövetekben az egyes indolvegyületek mennyisége nagymértékben eltérhet. Nagy
különbségek lehetnek az egyéb összetevők koncentrációjában is, amelyektől az elválasztás során meg kell
tisztítani a mintát. Egy új növényi szövet IES-tartalmának meghatározásakor ezért célszerű a tisztítási lépések
több kombinációjának kipróbálása, majd egy HPLC-vel való elválasztás és detektálás után a kérdéses
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
216 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
csúcsokhoz tartozó komponensek felfogása és más független HPLC-módszerrel történő újraelválasztása és
mérése.
Az előkészített növényi minta IES-tartalmát a HPLC-vel történő elválasztás után határozzuk meg, ún. belső
standard hígulási módszerrel. A belső standard radioaktív izotóp atomot tartalmaz, amely vagy az indolváz
ötödik szénatomján lévő trícium (3H) izotóp, vagy a karboxi-metil csoport első vagy második szénatomját
helyettesítő 14C radioaktív izotóp lehet. Először ismert mennyiségű tiszta belső standardot analizálunk HPLC-
vel. A detektor által képzett csúcsot kalibrációs görbéhez hasonlítjuk, a csúcshoz tartozó belső standard IES-t
összegyűjtjük, és folyadékszcintillációs számlálóval megmérjük az oldat radioaktív sugárzásának mértékét. A
következő lépésben az extrahált növényi mintához ismert mennyiségű belső standardot adunk. Az előző
fejezetekben leírt módszereket alkalmazva a mintát tisztítjuk, HPLC-vel elválasztjuk, az IES-t detektáljuk, végül
ennek is mérjük a radioaktív sugárzását, mely kisebb lesz, mint a tiszta belső standardban mért érték. Azért lesz
ez az érték kisebb, mert a minta természetes IES-tartalma és a sugárzó belső standardként hozzáadott indol-3-
ecetsav a HPLC-oszlopon nem válik el egymástól, közös csúcsot képez, mely összegyűjtve, a nem sugárzó,
természetes IES-tartalom miatt, alacsonyabb egységnyi IES-re jutó radioaktív tevékenységet mutat. A növényi
kivonat eredeti, endogén IES-tartalma a következő képlettel számítható ki (Sandberg et al., 1987):
Y = [(Ci /Cf) – 1]X
amelyben
Y: a növényi kivonat IES-tartalma (ng),
X: a mintához adott belső standard mennyisége (ng),
Ci: a tiszta belső standardban mért radioaktív sugárzás (dpm/ng); dpm: percenkénti hasadások száma (=
disintegrations per minute),
Cf: a minta természetes IES-tartalmával hígított belső standard radioaktív sugárzása (dpm/ng).
• Az indol-3-ecetsav meghatározása gázkromatográfhoz kapcsolt tömegspektrométerrel (GC-MS)
A GC-MS hatékony és elterjedten használt eszköz indolvegyületek minőségi és menynyiségi meghatározására.
A kapilláris GC-kolonnák közvetlenül kapcsolhatók tömegspektrométerhez, a töltött kolonnákból kiáramló gázt
azonban előzőleg egy gázelválasztón kell keresztülvezetni, ami a vivőgázt (rendszerint héliumot) eltávolítja a
mintából. Az IES-t és származékait leggyakrabban elektronütköztetéssel ionizálják, 70 eV ionizációs potenciál
energiaszinten. Ilyen ionizáló energia hatására a bázision következetesen a 130 m/z értékkel rendelkező
kvinolínium-ion lesz, mely az oldallánc lehasadásával képződik. A legtöbb szerves molekula ionizálásához
szükséges energiamennyiség mindössze 10 eV (kb. 1000 kJ/mol). Ezen az energiaszinten pozitív molekulaionok
keletkeznek. Ennél nagyobb ionizáló energia következtében a molekula különféle hasadásokat szenved. A
gyakorlatban elterjedt 70 eV hatására a különböző indolvegyületekből a töredékek széles skálája képződik,
amely jellemző az eredeti molekula szerkezetére. Maga az eredeti molekula azonban ilyen magas ionizációs
energiaszinten a töredékképződés miatt gyakran nem is jelenik meg a tömegspektrumban. Ezért olyan
tömegspektroszkópiás vizsgálatokban, amelyekben a molekulaion detektálása is szükséges (pl. egy ismeretlen
vegyület molekulatömegének meghatározása), kíméletesebb ionizációs módszert kell alkalmaznunk. Ez lehet
pozitív vagy negatív kémiai ionizáció, mely érzékenyebb az elektronütköztetéses ionizációs eljárásnál.
Indolszármazékok kémiai ionizálása pozitív töltésű metánionokkal vagy negatív töltést hordozó
ammóniaionokkal 5–10-szer erősebb ionintenzitást eredményez, mint az elektronütköztetéses módszer (Rivier
és Saugy, 1986). A 21. táblázat az IES és származékai tömegspektrumában megjelenő molekula- és
bázisionokat, valamint jellemző töredékeiket tartalmazza.
21. táblázat - Az indol-3-ecetsavnak és különböző származékainak tömegspektrumában
előforduló jellegzetes ioncsúcsok m/z értékei és a bázisionhoz viszonyított relatív
intenzitásuk (zárójelben). IES = = indol-3-ecetsav, Me = metil, TMS = trimetil-szilil,
Mi+(Mi-) = molekulaion, Bi+(Bi-) = bázision.
Elektronütköztetéses ionizáció (70 eV)
IES és A tömegspektrum jellegzetes Irodalom
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
217 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
származékai ioncsúcsai
IES Mi+ 175 (36), 131 (12), Bi+ 130
(100), 103 (11), 77 (13). Vebrel et al.
(1983)
IES Mi+ 175 (33), 131 (12), Bi+ 130
(100), 103 (12), 77 (17). Wurst et al.
(1984)
IES Mi+ 175 (63), 131 (25), Bi+ 130
(100), 103 (19), 77 (26). Feung et al.
(1975)
Me IES Mi+ 189 (30), 131 (12), Bi+ 130
(100), 103 (9), 77 (13). Vebrel et al.
(1983)
Me-TMS IES Mi+ 261 (28), Bi+ 202 (100), 200
(5), 170 (2), 145 (3), 130 (4). Sandberg et
al. (1987)
di-TMS IES Mi+ 319 (47), Bi+ 202 (100), 130
(9), 129 (6), 75 (12), 73 (38). McDougall
és Hillman
(1980)
Pozitív kémiai ionizáció
IES
származékai Reagens
gáz A tömegspektrum
jellegzetes ioncsúcsai Irodalom
Me IES amónia 208 (7), 207 (61), 191
(13), Mi+(Bi+) 190
(100), 130 (10).
Rivier és
Saugy
(1986)
Me IES metán 218 (11), Mi+ 190 (84),
189 (20), 158 (18),
Bi+130 (100).
Rivier és
Saugy
(1986)
Me IES i-bután 228 (3), 191 (12),
Mi+(Bi+) 190 (100), 189
(8), 130 (5).
Rivier és
Saugy
(1986)
di-TMS IES ammónia 393 (4), 392 (16), 323
(7), 322 (25), Mi+(Bi+)
321 (100)
Rivier és
Saugy
(1986)
di-TMS IES metán 348 (17), Mi+(Bi+) 320
(100), 304 (15), 230
(1), 202 (3).
Badenoch-
Jones et al.
(1984)
Negatív kémiai ionizáció
IES
származékai Reagens
gáz A tömegspektrum
jellegzetes ioncsúcsai Irodalom
Me IES ammónia 189 (15), Mi–(Bi–) 188
(100), 175 (3), 174 (1),
161 (29).
Rivier és
Saugy
(1986)
Me IES metán Mi–(Bi–) 188 (100). Rivier és
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
218 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Saugy
(1986)
Me IES i-bután 194 (60), Mi–(Bi–) 188
(100), 178 (48), 162
(50), 150 (67).
Rivier és
Saugy
(1986)
di-TMS IES ammónia 389 (12), Mi–(Bi–) 319
(100), 299 (11), 289
(9), 213 (8).
Rivier és
Saugy
(1986)
3.2. A gibberellinek meghatározása
A gibberellinek meghatározásakor a fő nehézséget az jelenti, hogy a növényekben nagyon sok gibbánvázas
vegyület fordul elő, amelyek egymástól csak kis szerkezeti eltéréseket mutatnak, a szövetekben lévő összes
koncentrációjuk mégis igen alacsony. A gibberellinek többségének molekulaszerkezetére az erősen oxidált
funkcionális csoportok nagy száma jellemző, ami stabilitásukat lényegesen csökkenti. Ezért tisztításuk és
elválasztásuk során célszerű a 2,5–8,5 pH tartományon belül maradni és vizes oldatban 40 °C alatti
hőmérsékleten dolgozni. A gibberellintartalmú növényi kivonatok és a különböző tisztítási lépéseken átesett
minták mélyhűtőben lefagyasztva, –20 °C-on tárolhatók.
A gibberellinek kivonása növényi mintákból
A különböző növényi szervek és szövetek gibberellintartalma nagy különbségeket mutathat. A termésekben lévő
magok gibberellintartalma például 1000-szerese is lehet a vegetatív részek hormontartalmának, amit a
gibberellinek tisztítása során figyelembe kell venni.
A gibberellinek kivonását leggyakrabban tiszta hideg metanollal vagy metanol 80%-os vizes oldatával végzik.
Egységnyi tömegű növényi mintát 4–5-szörös térfogatú kivonószerrel homogenálnak, majd 4 °C-on több órán át
állni hagynak. A folyadék és szilárd fázist ezután szűréssel szétválasztják és a szilárd növényi maradékot újra
extrahálják. A két extrahálószer-részletet egyesítik, a metanolt azután vákuumban 40 °C alatti hőmérsékleten
bepárolják.
A gibberellinek tisztítása
• Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló tisztítás
Az extrakciót követő bepárlás maradékát, a gibberellint tartalmazó vizes fázist 0,1 M-os foszfátpufferben oldják.
A pH értékét 2,5-re kell beállítani. Az első oldószeres kirázási lépésben a vizes fázissal megegyező térfogatú
etil-acetáttal háromszor kirázzák a gibberellintartalmú oldatot, ami a legtöbb gibberellin típusú molekulát átoldja
a szerves fázisba ezen a pH értéken. A következő lépésben gyengén lúgos (pH 8,5) foszfátpuffer egyenlő
térfogatú egységeivel ismét háromszor rázzák ki a szerves gibberellintartalmú oldatot, ez a lúgos pH miatt
disszociációra készteti a gibberellineket, ami poláros jelleget kölcsönöz a molekuláknak, tehát poláros-vizes
fázisba viszi a gibberellinsavakat. A vizes gibberellinoldat pH-ját ezután ismét 2,5-re állítják, és etil-acetát
egyenlő térfogatú mennyiségeivel újra szerves fázisba viszik a gibberellineket. Végül a szerves fázisban
nyomokban előforduló foszforsav eltávolítása érdekében 2,5-ös pH-érték mellett, négyszer 5 térfogat% vízzel
mossák a gibberellint tartalmazó etilacetát-fázist, mert az elkövetkező bepárlás során az oldatban maradt
foszforsav betöményedik és szélsőséges pH-viszonyokat eredményez.
• Fenolok eltávolítása polivinil-pirrolidonnal
A folyadék–folyadék-megoszlásos módszerrel nyert gibberellintartalmú oldatot leggyakrabban szennyező
vegyületek a zsírsavak, a fenolok és a cukrok. A fenolok (főleg pigmentek) stabil komplexet képeznek a
gibberellinekkel. A polivinil-pirrolidon (PVP) azonban jó hatékonysággal köti meg a fenolokat, ezért hormonok
tisztítása során gyakran használják. Az etil-acetátban oldott, majd bepárolt frakciót 0,1 M-os foszfátpufferben
(pH 8,5) feloldják, azután egy 0,5–1,0 g PVP-vel töltött rövid oszlopra töltik. Az elúciót az oszloptérfogat
kétszeresének megfelelő mennyiségű oldószerrel (foszfát-pufferrel) végzik. A fenolok kötődése fokozható a
töltet savanyú (pH 3,0) pufferrel való előmosásával.
• A gibberellinek tisztítása szilárd fázisú extrakcióval
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
219 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A gibberellintartalmú növényi kivonatok kis mennyiségeinek gyors és jó minőségű elválasztása valósítható meg
egyszer használatos, eldobható oktadecil-szilán (fordított fázisú) oszlopokon. Az oszlop előkészítését 5 ml
metanollal, majd 5 ml 5%-os ecetsavval mosva (fecskendővel injektálva) végzik. A növényi kivonatot 0,1 M-os
foszfát-pufferben (pH 2,5) juttatják az oszlopra, ezt is injektálva. A rendszert ezután 5 ml 5%-os ecetsavval,
majd 5 ml desztillált vízzel mossák. A gibberellineket végül 80%-os metanollal viszik ismét oldatba és
távolítják el az oszlopról.
• A gibberellinek tisztítása anioncsere-kromatográfiával
Anioncserélő oszlopon (DEAE-Sephadex A-25, Dowex 1X1-100) a gibberellinek csoportja hasonló
saverősségük miatt egyöntetűen elválasztható. Az egyik lehetőség a 0,2 M-os ecetsav-metanol 1:1
térfogatarányú elegyében feloldott növényi mintát acetát típusú Sephadex anioncserélő oszlopra vinni, az
oszlopot az oldószer azonos térfogatú mennyiségeivel négyszer mosni, majd a gibberellineket 2
térfogategységnyi 2 M-os ecetsav/metanol 1:1 arányú elegyével eluálni (Crozier és Durley, 1983). A másik
bevált módszer a Dowex 1X1-100 anioncserélő gyantával töltött oszlopon való elválasztás (Browning és
Saunders, 1977). A vizes növényi kivonatot (pH 8,0) az oszlopra viszik, amit azután vízzel mosnak, végül
etanol/1M-os hangyasav (4:1 térfogatarányú) elegyével eluálják a gibberellineket. Az anioncsere-kromatográfiát
követő szilárd fázisú extrakció (ODS-oszlopon) két lépésben jobb megoldás, mint a folyadék–folyadék-
megoszláson alapuló kirázás.
A gibberellinek elválasztása
A gibberellineket tisztításuk során hasonló szerkezetük miatt egy csoportként kezeltük, elválasztásukkor
azonban az egyes gibberellinvegyületeket különválasztjuk egymástól.
• Vékonyréteg-kromatográfia
A kereskedelmi forgalomban kapható kész szilikagélrétegek, pontosan beállított oldószerek használata mellett,
megfelelnek a gibberellinek elválasztására (MacMillen és Suter, 1963). Felbontóképességükben és a
szétválasztott gibberellinek visszanyerhetősége tekintetében azonban elmaradnak a HPLC-től. A
szilikagélrétegen való elválasztás rendszerint savas kémhatású oldószerben (ecetsav- vagy hangyasavoldatban)
történik, ami biztosítja a gibberellineken lévő karboxilcsoport protonált állapotát. Ezáltal javul a gibberellinek
mobilitása és a komponensek élesebb sávban válnak el egymástól. A gibberellinek etil-acetát telített vizes
oldatával vagy acetonnal eluálhatók a rétegről.
• A gibberellinek elválasztása HPLC-vel
A HPLC a mintaösszetevők elválasztásának igen jó hatékonysága mellett, a retenciós értékek pontos
megismételhetőségében és az elválasztás kis időigényében is felülmúlja az egyéb kromatográfiás módszereket.
Az oszlop töltete rendszerint 5–10 μm nagyságú szabálytalan vagy gömb alakú szilikagél hordozószemcsékből
áll, amelyhez valamilyen funkciós csoportot kötnek állófázisként. A funkciós csoport lehet poláros karakterű
(normál fázisú HPLC), vagy egy hosszabb, apoláros szénhidrogénlánc (fordított fázisú HPLC). A minta a
mozgó fázisban feloldva jut az oszlopra, 40 MPa körüli magas nyomáson, amit egy pumpa biztosít. A preparatív
célra használt HPLC-oszlopok általában 5–10 mm belső átmérőjűek, de nagy mennyiségű mintákhoz nagyobb
méretű kolonnák is szóba jöhetnek.
A mozgó fázis rendszerint metanol vagy etanol vizes oldata, amely kis mennyiségben (kb. 50 μl/l) tartalmaz
valamilyen savat (foszforsavat, ecetsavat vagy hangyasavat), biztosítva a gibberellinek protonált állapotát.
Jensen et al. (1986) a gibberellinek széles skáláját választották el, és mérték a retenciós idejüket egy 250 x 4,6
mm belső átmérőjű 5 μm szemcseméretű Supercosil LC18 fordított fázisú HPLC-oszlopon. A mozgó fázis 1
ml/perc folyadékáramlási sebességű izokratikus metanololdat volt, kémhatását foszforsavval állították be (pH
3,0).
• A gibberellinek gázkromatográfiás elválasztása
Származékképzés: A gibbánvázon lévő karboxilcsoport(ok) diazometánnal metil-észterré alakítható(k). A
diazometánnal veszélyessége miatt csak elszívófülke alatt lehet dolgozni. A metilezésre szánt mintát metanolban
oldják, majd az éteres diazometán-oldatot cseppenként adagolva végbemegy a metileződés folyamata. A
reagenscseppek hozzáadását akkor hagyják abba, amikor az elegyből nem szabadul már fel további nitrogén, és
az oldat megtartja sárga színét. A felesleges diazometán néhány perc elteltével eltávolítható az oldat szárazra
párlásával nitrogén alatt. Nagy mintamennyiség esetén a felesleges diazometán ecetsavval elbontható és az oldat
szárazra párolható. A metil-észterré alakított gibberellinek kevésbé polárosak, mint a szabad gibberellinsavak,
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
220 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
ezért a nem metileződött frakció eltávolítható, ha a kivonatot valamilyen viszonylag apoláros oldószerben (pl.
diklórmetánban) feloldjuk, majd egy tiszta üvegcsébe töltjük. A minta ebben a formában is használható
gázkromatográfiás elválasztásra, de a gyakorlatban többnyire még egy származékképző lépést beillesztenek,
trimetil-szilil-éterré alakítva a hidroxilcsoportot tartalmazó gibberellineket. Ez a lépés a gibberellin-metil-
észterek polaritását tovább csökkenti, valamint a tömegspektrométer által képzett spektrumban javítja a
molekulacsúcsok intenzitását. A trimetil-szililezésre használt két leggyakoribb reagens a BSTFA (bisz-trimetil-
szilil-trifluoracetamid) és az MSTFA (N-metil-O-trimetil-szilil-trifluoracetamid). A növényi mintakivonat kis
mennyiségeit üvegcsébe töltik és nitrogén alatt vagy deszikkátorban alaposan szárazra párolják. Ez azért
elengedhetetlenül szükséges, mivel mind a reagensek, mind a kész trimetil-szilil-származékok nedvesség
hatására bomlanak. Az üvegcsék lezárása után a reakcióelegyek hőmérsékletét 90 °C-ra emelik, és ezen tartják
30 percig. A BSTFA és az MSTFA egyaránt illékony vegyületek, ezért a GC-kolonnán jól elválnak a
meghatározni kívánt gibberellinektől, de vákuum alatt deszikkátorban is elpárologtathatók és más illékony,
nedvességnyomoktól mentes oldószerrel helyettesíthetők.
GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: A gibberellinek elválasztására leginkább a kvarc kapilláris
oszlopok felelnek meg. Hedden (1987) metil-TMS gibberellinszármazékokat analizált kapilláris kolonnán (25 m
× 0,2 mm i.d.), ami kb. 0,3 μm vastagságú BP-1 – kémiailag kötött – apoláros megosztó fázissal volt bevonva.
A kolonna az injektálást követő 1 percig 60 °C-os volt, majd 240 °C-ig 20 °C/perc, 300 °C-ig 4 °C/perc
intenzitással emelték a hőmérsékletet. A hélium-vivőgáz nyomása 90 kPa volt. Az ilyen típusú oszlop
mintakapacitása erősen korlátozott (kb. 0,1 μg). A gibberellinek gázkromatográfiás analízisére a hagyományos
GC-detektorok nem alkalmasak, tömegspektroszkópiás detektálásuk terjedt el.
A gibberellinek mennyiségi meghatározása
• A gibberellinek GC-MS analízise
A gibberellinek GC-MS mennyiségi vizsgálatát többszörös ionmegfigyeléssel (multiple ion monitoring; MIM)
végzik, amelyben a tömegspektrométer a teljes spektrum felvétele helyett csak néhány, az adott vegyületre
nagyon jellemző töredékion intenzitását méri. Két mintában lévő azonos gibberellinvegyület relatív mennyisége
a molekulacsúcsok abszolút értékeinek összehasonlításával kapható meg, ha azonban a molekulacsúcs
intenzitása nagyon kicsi, az összehasonlítás valamelyik jellegzetes töredékion értéke alapján is elvégezhető. A
gibberellinek extrakciós, tisztítási és elválasztási veszteségeit belső standardok felhasználásával lehet korrigálni,
amit rögtön a szövet eldörzsölése után kell a mintához adni. Célszerű olyan standard vegyületet választani, ami
kémiailag nagyon hasonló a vizsgált gibberellinmolekulához. A tömegspektrométer a részecskéket tömegük
alapján választja szét, ezért GC-MS vizsgálathoz használhatunk (nem radioaktív) nehéz izotóppal jelzett
gibberellin-analógokat, amik a növényben lévő gibberellin molekuláktól mindössze annyiban különböznek,
hogy vázukban egy, illetve néhány H-, C- vagy O-atomot 2H-, 13C- vagy 18O-izotóp helyettesít. Megbízható
eredményt kalibrációs görbe segítségével kaphatunk. Ennek lényege az, hogy a belső standardként használt
szintetikus gibberellin-analóg vegyületből és magából a vizsgált gibberellinhormonból olyan oldatsorozatot
készítenek, amelynek tagjai a két komponenst különböző arányban tartalmazzák. (Például 0,0; 0,05; 0,1; 0,25;
0,5; 1,0; 2,0 mól gibberellin/mól belső standard gibberellin-analóg sorrendben.) Az oldatsor tagjait ezután
tömegspektrométerrel analizálják, megkapva így az egyes mólarányokhoz tartozó csúcsintenzitás-arányokat,
majd az értéksorhoz görbét illesztenek. A belső standardot tartalmazó minták mérése során kapott
csúcsintenzitás-arány alapján a kalibrációs görbe segítségével meghatározható a minta gibberellin/belső
standard gibberellin-analóg mólaránya, amiből a kérdéses gibberellin fiziológiás mennyisége kiszámítható, mert
a hozzáadott belső standard mennyisége általunk választott, ismert érték.
• A gibberellinek kvantitatív szerológiai meghatározása
A növényekben található gibberellinek széles skálája miatt szerológiai meghatározásuk nagy körültekintést
igényel. A vizsgálathoz használt antiszérum szelektivitása alapvető fontosságú. Atzorn és Weiler (1983) a
gibberellinek (G3, G4 és G7) rendkívül érzékeny mennyiségi meghatározására alkalmas (0,2–0,5 pg
küszöbértékű!) kompetitív ELISA-módszert fejlesztettek ki. A liofilezett antiszérumokat 50 mM NaHCO3-t
tartalmazó oldatba (pH 9,3) vitték, a G3-ra specifikus IgG-antiszérumot 10 mg/l hígításban, a G4 és G7-re
specifikus IgG-t pedig 25 mg/l hígításban alkalmazták. A mikrotálca üregeibe 0,2 ml antiszérumoldatot mértek,
majd 3 napon keresztül, 4 °C-on inkubálták. Az IgG-oldatot ezután leöntötték, az üreg falához nem kötődött
IgG-molekulák maradékát háromszori desztillált vizes mosással távolították el, az így érzékenyített
mikrotálcákat legalább két hétig lehetett tárolni 4 °C-on. Az érzékenyített üregekbe a következőkben bemérték a
kompetíciós elegyet, ami 50 μl TBS- (Tris-buffered saline) puffert [50 mM 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-
propándiol (=Tris), 1 mM MgCl2, 0,01 M NaCl, pH 7,5], 100 μl standard gibberellinoldatot vagy megfelelően
hígított növényi extraktumot és 50 μl TBS-pufferben oldott gibberellin-alkalikus-foszfatáz konjugátumot
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
221 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
tartalmazott. A kompetíciós elegyben vetélkedés folyt az alkalikus-foszfatáz jelzőenzimhez kötött
gibberellinmolekulák és a mintában, ill. a standard oldatban található gibberellinek között az IgG-kötőhelyekért.
Amennyivel magasabb volt a növényi mintában a kérdéses gibberellinvegyületek (G3, valamint G4 és G7) szintje,
annyival több kötődött belőlük az üreg falán található specifikus helyekre, visszaszorítva az alkalikus-
foszfatázzal jelölt gibberellinmolekulák megtapadását. Az ELISA-tálcákat ezután 16 órán át 4 °C-on inkubálták,
majd a folyadékot leöntötték és a lapokat desztillált vízzel ismét háromszor mosták. Az utolsó lépésben a
jelzőenzim szubsztrátját, a p-nitrofenil-foszfátot – üregenként 0,2 ml oldatot – mértek az egyes reakcióterekbe
(1 mg/ml szubsztrát 50 mM-os NaHCO3 oldatban, pH 9,6). A mikrotálcákat ezt követően 6 órán át 37 °C-on
tartották, míg az enzim által katalizált színreakció – ami sárga színt eredményez – ki nem fejlődött. Az
üregekben lévő folyadék színintenzitása arányos a reakcióterek falához kötött alkalikus-foszfatáz-gibberellin
konjugátum mennyiségével és fordítottan arányos a növényi minta, ill. standard oldat gibberellintartalmával. A
reakciót 50 μl 5 M-os KOH-oldattal állították le, abszorbanciáját (A: 405 nm) ELISA-mikrotálcák mérésére
használt spektrofotométerrel állapították meg. A gibberellin standard hígítási sorának abszorbanciaértékei
alapján kalibrációs görbe szerkeszthető, ami lehetővé teszi a növényi minták gibberellintartalmának
meghatározását.
3.3. A citokininek meghatározása
A citokininek kivonása növényi mintákból
A citokininek extrakciójának hagyományos módszere szerint a növényi mintát 80%-os hideg metanolban
homogenálják, majd a citokinineket tartalmazó oldószert bepárolják. Ez a kivonási módszer azonban magas
foszfatáz-aktivitással jár együtt, ezért a citokinin-nukleotidok nagy része elbomlik. Bieleski (1964) extrakciós
módszerével a növényi foszfatázok aktivitása gátolható: a mintát folyékony nitrogénben megfagyasztjuk, majd
metanol/kloroform/90%-os hangyasav/desztillált víz (12:5:1:2 térfogatarányú) elegyében 18 órán keresztül –15
°C-on tartjuk. A kivonószert többrétegű gézen leszűrjük, és a növényi szövetet hideg metanol/90%-os
hangyasav/desztillált víz (6:1:4) elegyében homogenáljuk, azután –15 °C-on, 4 órán át tároljuk. A felülúszót
többrétegű gézen, majd szűrőpapíron leszűrjük és egyesítjük az előző extrakciós lépés kivonószer-elegyével. A
minta kezdeti folyékony nitrogénben való megfagyasztása fontos része a kivonási módszernek.
A citokininek elválasztása
• Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás
A bázikus citokininek (szabad bázisok, ribozidok és glükozidok) 1-butanollal kirázva a szerves fázisba oldódnak
át, miközben a citokinin-nukleotidok a vizes fázisban maradnak. A pH-t 7,0 és 8,2 közötti értékre kell beállítani,
hogy a bázisok a kevésbé poláris protonált állapotban legyenek. Lehetséges, hogy 1-butanol esetében az első
kirázás alkalmával a két fázis nem válik el rögtön, akár egy éjszakát is igénybe vehet a szerves és vizes fázis
kialakulása.
• A citokininek ioncsere-kromatográfiás elválasztása
Kationcserélő oszlopon a bázikus citokininek eredményesen tisztíthatók. A vizes növényi kivonatok pH-ját
ecetsavval beállítjuk (pH 3,0), majd azonos pH-jú NH4+ típusú cellulóz-foszfát-oszlopon tisztítjuk. Az oszlopot
pH 3,0-ra beállított ecetsavoldattal mossuk, amely a citokinin-nukleotidokat eltávolítja az oszlopról. A
következő lépésben a pozitív töltésű molekulákat (így a bázikus citokinineket is) 2 M-os ammónium-hidroxid-
oldattal választjuk le az oszlopról.
• A citokininek elválasztása HPLC-vel
Számos kvantitatív vizsgálati módszer előtt (tömegspektrometria, immunanalitikai mérések stb.) jó
hatékonysággal alkalmazható, nagy mintakapacitással rendelkező citokinintisztítási eljárás. Az oktadecil-szilán-
(ODS) töltetek elterjedése nagymértékben hozzájárult a HPLC-citokininek elválasztása terén elért sikeréhez. A
citokininek preparatív célú elválasztására egy 150 × 10 mm i.d., fordított fázisú HPLC-oszlop, 1 ml injektálható
mintakapacitással jól megfelel. Mozgó fázisként 5 ml/perc áramlási sebességű acetonitril (7–11%-os)
egyenletesen növekvő koncentrációjú, gradiens oldata vált be, előzetesen TEAB-bal (trietil-ammónium-
hidrogénkarbonát) a pH-ját semlegesre állítva.
• A citokininek gázkromatográfiás elválasztása
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
222 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Származékképzés: A bisz-(trimetil-szilil)acetamid (BTMSA) kétszeres mennyiségű acetonitrilben feloldva 60
°C-on, 5 perc alatt trimetil-szilil (TMS)-származékká alakítja a vizsgált citokinineket (izopentenil-adenin,
zeatin, izopentenil-adenin-ribozid, zeatin-ribozid). Elterjedtebb azonban a bisz-(trimetil-szilil)trifluoracetamid
(BSTFA) származékképző reagens alkalmazása. Számos oldószerben (piridin, dimetil-formamid, acetonitril)
feloldva használják, szobahőmérséklettől 120 °C-ig, 30 perc reakcióidő-tartamtól több óráig, a
reakciókörülmények széles skáláját alkalmazva. A TMS-származékképzés legfőbb hátránya, hogy az egyes
citokininek gyakran többféle származékot is képeznek a reakció során – pl. a zeatin kétszeresen és
háromszorosan, a zeatin-ribozid négyszeresen és ötszörösen szubsztituált származékok képzésére is hajlamos –,
a reakció körülményeitől függően. Úgy tűnik, hogy a szobahőmérsékleten (néhány órán keresztül) végzett TMS-
származékképzés és a minta gondos kiszárítása (hogy vizet még nyomokban se tartalmazzon) következetesen a
legkevésbé szubsztituált származék képződését eredményezi.
A permetil-citokinin-származékok képzése jóllehet bonyolultabb, mint a TMS-származékoké, mégis számos
előnyük van azokkal szemben: nem bomlékonyak, ezért HPLC-vel vagy más elválasztási módszerrel tovább
tisztíthatók, és nem képeznek többféle szubsztituált származékot. A permetilezés folyamata során a
citokinineket egy erős bázissal, azután metil-jodiddal reagáltatjuk. A bázisok közül a metil-szulfinil anion vált
be, melyet kálium-t-butoxid és száraz dimetil-szulfoxid reakciójával állítunk elő. A kálium-t-butoxid hozzáadása
után az elegyet nitrogén alatt 10 percig kevertetjük, majd centrifugálással tisztítjuk. A szulfinil-anion-
koncentrációt sósavval titrálva – fenolftalein indikátor jelenlétében – határozzuk meg. A gyakorlatban leginkább
bevált aniontartalom kb. 0,1 M, amihez 20 mg kálium-t-butoxid szükséges 1ml dimetil-szulfoxidban feloldva. A
néhány μg tisztított és szárazra bepárolt mintát 50 μl metil-szulfinil aniont tartalmazó reagenssel visszük ismét
oldatba. Ezután 10 μl metil-jodidot adunk az oldathoz, szobahőmérsékleten 30 percig inkubáljuk, majd 50 μl
desztillált vízzel hígítjuk, végül a permetilezett citokinineket átoldjuk 100 μl kloroformba. A mintát nitrogéngáz
átáramoltatása mellett szárazra pároljuk, szükség esetén vákuumdeszikkátor alatt tovább szárítjuk.
GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: A citokinin-származékok gázkromatográfiás elválasztására
apoláros, magas hőmérsékleten is stabil megosztó fázissal rendelkező oszlopokkal dolgoznak (pl. SE-30, SE-52,
OV-1, OV-17). A tapasztalatok szerint egy 1,5 m × 4 mm i.d., 100–120 mesh szemcseméretű, 3%-os OV-1
nedvesítőfolyadék-filmmel bevont Gas Chrom Q hagyományos töltött kolonna jól bevált. Az elválasztás
hatékonysága tovább fokozható, ha kapilláris kolonnát használunk (pl. SGE 25QC2/BP 10–0,25), amelynek
mérete 25 m × 0,2 mm i.d.. Ez az oszloptípus kiválóan bontja fel a TMS és a permetilezett citokinin-
származékokat. Használatakor az ajánlott felső hőmérsékleti határ: 270 °C. A citokinin-származékok
elválasztásának mindennapi gyakorlatához jól megfelel egy rövidebb, szélesebb kapilláris kolonna is (12 m ×
0,3 mm i.d.), nagyobb hőstabilitású nedvesítő folyadékkal párosítva (SGE BP-1 vagy BP-5). Ez a kolonna a
citokininek gyorsabb elválasztását teszi lehetővé, és felbontóképessége is még elég jó. Az oszlop 80 kPa
héliumvivőgáz-nyomás mellett működtethető, de nagy molekulasúlyú anyagok gyorsabb elválasztására a
nyomást, legfeljebb 200 kPa-ig, emelni lehet (Horgan és Scott, 1987).
A citokininek mennyiségi meghatározása
• A citokininek GC-MS analízise
A gázkromatográffal elválasztott különféle citokininek (citokinin-származékok) a tömegspektrométer ionizációs
kamrájában töredékekké (fragmentumokká) alakulnak. A különböző citokininek azonos körülmények között
végzett ionizáció hatására, egyedi molekulaszerkezetüknek megfelelően, következetesen ugyanazokra az
ionizált töredékek-re hasadnak, az egyes töredékek képződésének arányát is megőrizve. Tehát egy adott
szerkezetű citokinin-molekula azonos ionizáló energia hatására megismételhető módon ugyanazt a
tömegspektrumot adja.
Az elválasztott vegyületek ionizálását többnyire gáz halmazállapotban, elektronok-kal ütköztetve végzik.
Változtatva az ütköző elektronok energiáját, különböző energiamennyiséget közölhetünk a vizsgálandó
molekulákkal, aminek következtében azok hasadásokat szenvednek (különféle töredékeket képezve). Az
ionizálás további lehetősége a kémiai ionizáció, ami kíméletesebb az elektronütköztetésnél. Citokininek kémiai
ionizálására leginkább megfelelő reagens ion az NH4+, amely csak fokozatosan veszít energiájából a minta
molekuláival való sokszoros ütközés során. Így nem a minta egyetlen molekulája veszi fel a teljes
energiamennyiséget, ezért a vizsgált molekulák kevésbé töredeznek.
A tömegspektrumot koordináta-rendszerben ábrázolva a vízszintes tengelyen szerepel az ionizált molekula,
illetve a molekulatöredékek tömegének és töltésének hányadosa (m/z érték). Rendszerint egyszeres töltéssel
rendelkező ionok keletkeznek, ezért a különböző molekula- és molekulatöredék-ionok m/z értékét csak a
tömegük befolyásolja. A függőleges tengelyen az ionizált részecskék előfordulásának egymáshoz viszonyított
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
223 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
relatív gyakoriságát, intenzitását ábrázoljuk (0 és 100% között). Így egy citokinin-vegyület tömegspektrumát
tekintve (97. ábra) az egymást követő függőleges vonalak az egyes töredékekre vonatkoznak – növekvő
részecsketömegüknek megfelelő sorrendben elhelyezkedve –, a vonalak magassága pedig az ionizált töredékek
egymáshoz viszonyított relatív mennyiségét jelöli. A vízszintes tengelyen az origótól legtávolabbra eső vonal az
eredeti molekula ionizációjával képződő (tehát hasadást nem szenvedő) molekulaiont ábrázolja, amelynek
tömege egyenlő a minta nem ionizált molekulájának tömegével. Azt az iont (töredéket), amely a fragmentumok
között a legnagyobb mennyiségben van jelen, tehát amely a legintenzívebb (legmagasabb) spektrumvonalat
mutatja, bázisionnak nevezzük, és a függőleges tengelyen feltüntetett skála alapján ezt jelöljük 100%-kal. Az
összes többi fragmentum mennyiségét ehhez viszonyítjuk.
97. ábra - A zeatin (Z) elektronütköztetéses tömegspektruma (a spektrumban csak a
legjellegzetesebb fragmentumok szerepelnek). Bi+ = bázision; Mi+ = molekulaion; R.I.
= relatív intenzitás; m/z = tömeg/töltés arány
Egy adott citokinin (pl. zeatin) különböző mintákban vizsgálva azonos ionizáló energia hatására ugyanazt a
spektrumot hozza létre. Két minta zeatinkoncentráció különbségét a bázision vagy más megfelelő töredékion
abszolút intenzitásának összehasonlításával kaphatjuk meg. Mivel elvileg minden ion abszolút intenzitása
arányos a mintában jelen lévő vegyület mennyiségével, ezért az ismert m/z érték alapján akár mindössze egy
töredékion (vagy a molekulaion) mérésével is meghatározhatjuk a vizsgálni kívánt hormonvegyület
koncentrációját (tehát nincs szükség teljes tömegspektrumra). Ezt a módszert szelektív ionmegfigyelésnek
(selective ion monitoring; SIM) nevezzük. Különösen kisebb tömegű töredékek esetében előfordulhat azonban,
hogy egyéb – szennyező anyagból származó – azonos tömegű töredékion jelenléte torzítja (látszólagosan növeli)
a kiválasztott ion intenzitását, és ez egyéb fragmentumok vizsgálata hiányában rejtve marad. Ezért SIM-
vizsgálatkor igyekeznek minél nagyobb tömegű és minél egyedibb (csak az adott citokininre jellemző) töredéket
kiválasztani. Ez a hibaforrás kiküszöbölhető úgy, hogy egyszerre több jellemző töredékion intenzitását mérik
(multiple ion monitoring; MIM), így a normális hasadási aránytól esetleg eltérő, relatív töredékion-intenzitásra
rögtön fény derül.
Akár teljes tömegspektrumot vizsgálunk, akár SIM- vagy MIM-módszerrel dolgozunk, a mintában egy adott
citokinin tényleges koncentrációját kalibrációs görbe segítségével állapíthatjuk meg. Célravezetőbb azonban, ha
a tisztítási műveletek megkezdése előtt ismert mennyiségű hormon-analóg vegyületet, belső standardot mérünk
a mintához. Erre a célra 2H vagy 15N izotóppal egyszeresen vagy többszörösen jelzett citokinin-vegyületeket
használnak. A meghatározás utolsó lépésében – a tömegspektroszkópiás detektálás során – a tömegspektrométer
analizátora, az izotópatomok nagyobb tömege miatt, elválasztja egymástól a mintában természetesen jelenlévő
citokinin-vegyületből származó töredékeket és az izotóppal jelzett belső standard töredékeit. A
tömegspektrumban így számos fragmentumnak megtalálható lesz az izotóppal jelzett párja. Egy töredéknek és
izotóppal jelzett párjának a relatív intenzitáskülönbsége alapján – a bemért belső standard ismert koncentrációja
miatt – kiszámíthatjuk a minta fiziológiás hormontartalmát, kiküszöbölve a minta-előkészítés során bekövetkező
veszteségeket is! A leggyakrabban használt belső standardok az N6 oldallánc első szénatomján két 2H-atomot
vagy a két terminális szénatomon öt 2H-atomot hordozó deutériummal jelzett, illetve a purin váz négy
nitrogénatomját 15N izotóppal helyettesítve kapott szintetikus citokininek. A SIM-módszer nyilvánvalóan nem
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
224 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
alkalmas arra, hogy egyszerre vizsgáljuk egy természetes citokinin-vegyület töredékének és izotóppal jelzett
analógjának mint belső standardnak az intenzitását.
A trimetil-szilil- és permetilszármazékok képzése nem befolyásolja a belső standardok alkalmazását. Az
izotópos belső standardok használata során két tényezővel számolnunk kell, amelyek zavarhatják a
tömegspektrométerrel való mennyiségi meghatározást. Egyrészt a növényi minta természetes citokinin-
vegyületei is tartalmazhatnak izotópatomokat, amelyek a tömegspektrumban látszólagos növekedést okozhatnak
a belső standard intenzitásában. Célszerű ezért minél több izotópatomot tartalmazó hormon-analógot választani,
tehát például két 2H helyett inkább öt 2H-t tartalmazó szintetikus citokinineket használni, mert ezek tömege több
egységgel haladja meg a nehéz izotópot nem tartalmazó, illetve egy-két nehézizotóp-atomot tartalmazó
természetes citokininek tömegét, tehát a spektrumban jobban elkülöníthetőek.
Hasonló problémát okoz az is, ha a belső standardként használt, jelzett vegyületünk számottevő mennyiségben
tartalmaz izotóppal nem jelzett hormonmolekulákat, amelyek a tömegspektrometriás vizsgálat során nem
választhatók el a mintában jelen lévő (meghatározni kívánt) citokininektől. A belső standard kiváló minősége
tehát alapvető feltétele a megbízható kvantitatív vizsgálati eredményeknek.
A citokininek és származékaik elektronütköztetéssel nyert fontosabb töredékeit a 22. táblázat tartalmazza
(Horgan és Scott, 1987).
22. táblázat - Citokininvegyületek és származékaik elektronütköztetéses
tömegspektrumát alkotó fontosabb ioncsúcsok m/z értékei és relatív intenzitásuk a
bázision százalékában (zárójelben). iP = izopentenil-adenin, [9R]iP = izopentenil-
adenin-ribozid, Z = zeatin, [9R]Z = zeatin-ribozid, TMS = trimetil-szilil, perMe =
permetil, Mi+ = molekulaion, Bi+ = bázision.
Citokinin vagy
citokinin-
származék típusa A tömegspektrumban megjelenő jellegzetes ioncsúcsok
iP Mi+ 203 (54), 188 (65), 161 (13), 160 (96), 148 (17),
136 (15),
Bi+ 135 (100), 119 (22), 108 (33), 93 (10), 84 (18).
[9R]iP Mi+ 335 (22), 203 (60), 202 (22), 188 (51), 161 (12),
160 (80), 148 (23),
136 (27), Bi+ 135 (100), 119 (21), 108 (27).
Z Mi+ 219 (20), Bi+ 202 (100), 201 (41), 188 (75), 186
(28), 160 (50),
136 (53), 135 (37), 120 (25), 119 (39), 108 (32).
[9R]Z Mi+ 351 (8), 201 (95), 200 (61), 199 (86), 198 (50), 188
(53), 160 (60),
148 (40), 136 (60), Bi+ 135 (100), 119 (46).
di-TMS iP Mi+ 347 (24), 332 (38), 305 (22), 304 (83), 274 (20),
264 (30), 247 (22),
207 (30), 192 (15), 160 (14), 135 (15).
tri-TMS [9R]iP Mi+ 551 (13), 245 (21), 232 (51), 230 (25), 217 (24),
204 (10), 203 (27),
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
225 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
202 (25), 188 (10), 160 (15), 147 (15), 103 (30).
di-TMS Z Mi+ 363 (6), 348 (15), 274 (39), 273 (51), 272 (26), 260
(70), 258 (17),
232 (28), 192 (21), 188 (17), 156 (36).
tri-TMS Z Mi+ 435 (6), 420 (14), 347 (20), 346 (72), 332 (27), 306
(11), 305 (16),
304 (61), 272 (15), 264 (19), 156 (11).
tetra-TMS [9R]Z Mi+ 639 (3), 536 (17), 320 (16), 245 (14), 230 (16), 217
(18), 201 (30),
188 (24), 156 (32), 147 (13), 103 (29).
di-perMe iP Mi+ 231 (70), 216 (57), Bi+ 188 (100), 176 (16), 163
(18), 162 (34),
135 (21), 134 (38), 133 (30), 107 (25), 98 (26).
tetra-perMe
[9R]iP Mi+(Bi+) 391 (100), 348 (20), 218 (28), 217 (76), 216
(83), 202 (80),
175(32), 174 (95), 148 (30), 101 (29), 98 (25).
tri-perMe Z Mi+ 261 (7), Bi+ 230 (100), 216 (6), 188 (22), 176 (4),
162 (7), 134 (8),
107 (7), 67 (7), 42 (11), 41 (10).
penta-perMe
[9R]Z Mi+ 421 (6), 390 (71), 348 (6), Bi+ 216 (100), 174 (17),
148 (6), 101 (11),
71 (10), 67 (8), 45 (45), 41 (17).
• A citokininek kvantitatív szerológiai meghatározása
Vonk et al. (1986) nőszirom szöveteiben mérték kompetitív, indirekt ELISA-módszerrel a Z, a [9R]Z, az iP és a
[9R]iP koncentrációját. A növényi kivonatot anioncsere-kromatográfiával, majd szilárd fázisú extrakcióval
(oktadecil-szilán oszlopon) tisztították. A szabad citokinin-bázisokat (Z, iP) HPLC-vel választották el a
ribozidszármazékoktól ([9R]Z, [9R]iP). Az elválasztást követően a frakciókat bepárolták, majd PBS-Tween-
pufferrel ismét oldatba vitték a komponenseket, ezt használva az ELISA-vizsgálatokhoz [PBS-Tween-puffer
(Phosphate-buffered saline + Tween): 0,01 M-os foszfát puffer, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20; pH 7,4]. A 96-
lyukú ELISA-mikrotálca érzékenyítését üregenként 200 μl [9R]Z- és [9R]iP- KHLH-konjugátumoldattal
végezték [KHLH (keyhole limpet hemocyanin) = egy tengeri kagylóból származó fehérje], aminek töménysége
20 μg/ml coating puffer volt. (Coating puffer: 0,05 M Na2CO3/NaHCO3; pH 9,6). Az érzékenyített lemezeket
hűtőszekrényben, 4 °C-on, egy éjszakán keresztül inkubálták. Felhasználás előtt a lapokat egyszer desztillált
vízzel, ötször PBS-Tween-pufferrel mosták. A különböző hígításban elkészített mintákat és a citokinin-
standardokat PBS-Tween-ben oldva mérték az üregekbe (100 μl). Azután a [9R]Z-vel és a [9R]iP-vel szemben
termelt antiszérumot PBS-Tween-ben megfelelően hígítva hozzáadták az üregekhez (100 μl). Az így elkészített
kompetíciós elegyben a növényi anyagból származó citokininek és az érzékenyítéssel az üregek falához kötött
citokinin-konjugátumok vetélkednek egymással az elegyhez adott antiszérum-kötőhelyekért. Az
immunkomplexek kialakulása egy éjszakát igényel, 4 °C-on inkubálva az ELISA-tálcákat. Ezután a lemezeket
PBS-Tween-nel ötször mosták, amivel eltávolították a lemez falához nem kötődött antigén-antitest komplexeket.
Az ELISA-rendszer antitestkötő kapacitásának felső határát (B0) olyan üregek beállításával vizsgálták, amelyek
nem tartalmaztak mintát, csak antiszérumot és PBS-Tween-t, tehát nem jött létre kompetíció. Az antitestkötő
képesség alsó határát (Bu) olyan kompetíciós elegyben határozták meg, ami a nem kötött antigént (Z, iP, stb.)
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
226 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
nagy túlsúlyban tartalmazta, gyakorlatilag megakadályozva ezzel, hogy az antitestek az üreg falához kötődjenek.
A következő lépésben alkalikus-foszfatáz jelzőenzimmel konjugáltatott, nyúl-IgG-re specifikus antiszérumot
adtak az üregekhez PBS-Tween-ben oldva (200 μl; 1500 ×-os hígításban), amely hozzákötődött az üregekben
maradt, citokininekre specifikus nyúl-IgG- (antitest-) molekulákhoz. A tálcákat 3 órán át, 35 °C-on inkubálták,
PBS-Tween-nel ötször mosták, végül szubsztrát-pufferben oldva (coating puffer + 0,5 mM MgCl2) az üregekhez
mérték az enzim szubsztrátját, a p-nitrofenil-foszfátot (200 μl; 1 mg/ml). A tálcákat 35 °C-on inkubálva a
szubsztrátból színes termék képződött az alkalikus-foszfatáz katalitikus hatására. A színintenzitást 405 nm-en
mérték ELISA-lapok leolvasására kifejlesztett spektrofotométerrel. A kalibrációs görbét a következő képlet
segítségével szerkesztették meg:
amelyben
B: az üreg falához kötődött antiszérum-jelzőenzim konjugátum mennyisége,
B0: a bemért antiszérum-jelzőenzim konjugátum mennyisége,
AB: a standardot (ill. mintát) tartalmazó üregben mért extinkció-érték,
ABu: a minimális antitestkötődés mellett mért extinkció-érték,
AB0: a maximális antitestkötődés mellett mért extinkció-érték.
A B/B0 értékeket egy koordináta-rendszer y-tengelyén vették fel (0–100%), aminek x-tengelyén az egyes B/B0
értékekhez tartozó Z, iP, [9R]Z és [9R]iP értékeket ábrázolták (pmol, pg). Az ismeretlen citokinintartalmú minta
extinkcióját ismerve a B/B0-t kiszámították, és a szigmoid kalibrációs görbével egybevetve leolvasták a minta
hormontartalmát.
3.4. Az etilén meghatározása
Az etilén biológiai aktivitását ismereteink szerint 0,1–10 nl/ml koncentrációtartományban fejti ki, ezért
analitikai meghatározása során legalább 0,01 nl/ml érzékenységű módszerrel célszerű dolgoznunk. Az etilén gáz
halmazállapotú, ezért növényi szövetből történő kivonása lényegesen egyszerűbb, mint a többi növényi
növekedésszabályzóé: a szövetekből vett gázminta vagy a szövetek által kibocsátott gáz felfogva közvetlenül
vizsgálható. A vizsgálati eredmények értékelésekor azonban figyelembe kell vennünk azt, hogy a növényi
szövetek különböző mértékben megkötik a termelődő etilén egy részét. Ez a pufferhatás főként a gyors
etilénkoncentráció-változások mérését zavarja.
Etilén-mintavételi módszerek
• Mintavétel növényi szövetekből
Olyan növényi mintákból, melyek belső üregeket, gáztereket tartalmaznak (pl. almatermések, paprikabogyó),
fecskendőre illesztett injekciós tűvel közvetlenül vehetünk gázmintát. A mintavétel ideje alatt a vizsgálni kívánt
növényi részt tarthatjuk folyadék alatt, vagy a mintavevő tűt bevonhatjuk zsírral, nehogy a minta külső légköri
gázokkal szennyeződjön. A gázmintát óvatosan vegyük a fecskendővel, mert a hirtelen nyomáscsökkenés
szintén külső gázok bejutását okozhatja a mintavételi térbe. Ez a módszer ismételt mintavételre nem alkalmas.
A különböző termések és gumók által termelt etilént vákuummal is kivonhatjuk. Olaj- vagy vízlégszivattyúra
köthető deszikkátort 2/3-ig feltöltünk vízzel vagy telített sóoldattal (amely gátolja a minta által kibocsátott,
valamint egyéb, levegőből származó gázok oldódását). Egy felfordított tölcsért vagy a tetején nyitott harangot a
folyadékba süllyesztünk, ügyelve arra, hogy a tölcsér csúcsa is a folyadékréteg színe alatt legyen, de alul ne
tapadjon a deszikkátor fenekéhez (esetleg súlyokkal rögzíthetjük). A harang, illetve tölcsér belső felülete
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
227 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
buborékmentes kell, hogy legyen. A tölcsér nyakába belül vízszintesen egy rácsot erősítünk, amely a folyadék
felhajtóerejével szemben leszorítja a mintát, megakadályozva, hogy az, alulról nekinyomódva a tölcsér
szárának, elzárja a gázok útját. Végül a mintát behelyezzük a harang alá, amelynek tetejét, illetve tölcsér
esetében a tölcsér szárának végét gumimembránnal lezárjuk, és vákuumot hozunk létre az edényben. A
szövetekből kiszabaduló gázok a tölcsér szárának csúcsában gyűlnek össze. Rövid idő múlva a szivattyút
leállítjuk, az edényt felnyitjuk, és a gumimembránon keresztül fecskendővel gázmintát veszünk. A minta a
kivonás során folyadékba merül, ezért légzése, etiléntermelése fokozódik, tehát a kibocsátott gázok összetétele
változik. A felsoroltak miatt a lehető legrövidebb ideig és a legkisebb vákuummal dolgozzunk. Tekintettel kell
arra is lennünk, hogy túl erős vákuum esetén a folyadékban oldott gázok felszabadulnak, keveredve a minta által
termelt gázeleggyel, ami teljesen eltorzíthatja a mintavétel eredményét.
• Mintavétel a növény által kibocsátott gázokból
Ezek a módszerek alkalmasak a teljes növény etiléntermelésének a mérésére is. A mintavétel típusa és az általa
nyert adat információtartalma alapján a módszerek két fajtáját különböztetjük meg: a statikus és a dinamikus
módszereket. A statikus módszerek esetében a meghatározás egy adott időtartam alatt kibocsátott gázok összes
mennyiségéből történik. A folyamatos módszerek esetében a növényi mintát tartalmazó gáztéren folyamatosan
ismert összetételű gázkeverék vagy levegő áramlik át. Mind a bemenő, mind a kimenő gázkeverékből mintát
veszünk, és etiléntartalmukat összehasonlítjuk.
Statikus módszerek: Előnyük, hogy felépítésük és működtetésük egyszerű, rövid időtartamú mérésekre, alacsony
mintaszám mellett, jól alkalmazhatóak. A teljes növényt vagy a növény egy eltávolított részét légmentesen
lezárható tárolóedénybe helyezzük. Az edény tartalmazhat akár levegőt, akár egy általunk beállított, ismert
gázkeveréket. Az edény lezárása után mintát veszünk a gáztérből, ezt az időpontot tekintjük a vizsgálat
kezdetének. A vizsgálat végén ismét mintát veszünk a gáztérből. A termelt etilén menynyiségét a következő
képlettel számítjuk ki:
amelyben
A: a gáztér kezdeti és végső etilénkoncentrációjának a különbsége (nl),
B: a bemért növényi anyag (g),
C: a vizsgálat ideje (h).
A növényi anyag által termelt etilén mennyiségének kiszámításához ismernünk kell a méréshez használt edény
térfogatát. Kisméretű edényeket vízzel megtöltve mérhetjük tömegnövekedésüket. Nagyobb tartályok esetében
ismert térfogatú gázt befecskendezve és koncentrációját visszamérve, a hígulás mértéke alapján
meghatározhatjuk térfogatukat. A gáztér valódi térfogatát jobban közelíthetjük azonban, ha figyelembe vesszük
a minta által kitöltött teret, számolva azzal is, hogy a növényi szövetek szintén tartalmaznak gáztereket. A
legtöbb friss növényminta 1 g-ja mintegy 1 ml szilárd-folyékony fázist tartalmaz (a többi gáz) (Saltveit és Yang,
1987). Pontosabb eredményt kapunk tehát, ha 1 g növényi mintát 1 ml térfogattal számítunk, és az így kapott
térfogatértéket levonjuk az edény térfogatából.
Dinamikus (átáramló rendszerű) módszerek: Felépítésük és működtetésük bonyolultabb a statikus
módszereknél, de hosszú távú vizsgálatok esetében, sorozatos mintavétel mellett szükséges az alkalmazásuk. A
dinamikus berendezésekre általában jellemző, hogy az etilénvizsgálatra szánt növényt vagy növényrészt
tartalmazó zárt edényen ismert összetételű gázkeverék áramlik át, ismert mennyiségben. A berendezés alapvető
része a gázkeverő cső, amelynek bevezető csonkjaihoz kapcsolódnak a különböző gáztartályok (levegő, N2, O2,
CO2, C2H2). Minden csonkba beépítenek két szelepet, az egyik a beáramló gázok mennyiségének pontos
beállítására, a másik az adott gáz áramlásának gyors megszakítására való, a beállított értékek megőrzése mellett.
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
228 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A beállított gázkeverék teljes átáramló mennyiségét is mérik. A vizsgálati eredményeket befolyásoló szennyező
gázok (etilén, széndioxid) eltávolítására gáztisztítókat építenek be a rendszerbe. A levágott növényrészek vagy
szövetdarabok kiszáradását a rendszerbe iktatott gáznedvesítő küszöböli ki. Dinamikus módszerek esetében a
termelt etilén mennyiségét a következő képlet segítségével számíthatjuk ki:
amelyben
A: az átáramló gáz mennyisége (ml/h),
B: a bemenő és kimenő gázkeverék etilénkoncentrációjának különbsége (nl/ml),
C: a bemért növényi anyag mennyisége (g).
A fenti egyenlet azonban csak akkor érvényes, ha a növényminta etiléntermelése egyenletesen állandó és a
rendszerünk egyensúlyi állapotban van. Az egyensúlyi állapot kialakulásának időigénye a tárolóedény
térfogatától és a gázáram sebességétől függ. A rendszer állapotát (egyenletes etiléntermelés mellett) akkor
tekinthetjük egyensúlyinak, ha az edény össztérfogatának a háromszorosát kitevő gázmennyiség áramlott már át
rajta (ilyenkor a bemenő gázkeverék és a növény által kibocsátott gáz keveredése tökéletes). Amennyiben a
növényminta etiléntermelése gyorsan változik, értékének kiszámítása nem egyensúlyi rendszerekre kidolgozott
matematikai módszerekkel történhet (Marynick és Marynick, 1975).
Az etilén mennyiségi meghatározása
• Biotesztek
Bizonyos növényfajok igen érzékenyek a levegő etiléntartalmára: adott etilénkoncentráció hatására jellegzetes
tüneteket mutatnak. Sötétben nevelt borsó-csíranövények (7 napos korban) 0,1–1,0 nl/ml levegő-etiléntartalom
mellett szárrövidülést, szárvastagodást, a szár meggörbülését és vízszintes növekedést mutatnak (Knight et al.,
1910). A tünetek magasabb etilénkoncentráció mellett kifejezettebbé válnak. Fiatal (5–6) leveles
paradicsomnövények 0,1 nl/ml etilénkoncentráció hatására levélhervadást és levélhullást mutatnak.
Ismeretlen összetételű gázminta etiléntartalmát biotesztek segítségével úgy becsülhetjük meg, ha a gázmintába
helyezett tesztnövények reakcióját összehasonlítjuk olyan növények tüneteivel, amelyeket előzetesen standard
etiléntartalmú gázsorozatban tartottunk.
• Az etilén gázkromatográfiás meghatározása
A gázkromatográfia messze a legelterjedtebb módszer az etilén mérésére. Az oszlop töltete lehet egyszerű,
szilárd Al-oxid vagy Porapak, illetve gáz-folyadék kromatográfia esetében szinte bármilyen nedvesítő folyadék
– Chromosorb, Porapak vagy egyéb szilárd hordozószemcse-felületen. Az etilén elválasztására megfelel egy 0,5
m × 3,0 mm i.d. rézkolonna, 40–60 mesh szemcseméretű Al-oxid töltettel. Az oszlop 30–80 °C hőmérsékleten,
20 ml/perc nitrogén vivőgáz térfogati sebesség mellett működtethető. Gyakran szükséges lehet az oszlop egy
éjszakán keresztül történő hevítése 150–180 °C körüli hőmérsékleten, alacsony intenzitású vivőgáz-
átáramoltatás mellett, így fokozva az oszlop hatékonyságát. Ez a lépés megismételhető, ha az oszlop
szennyezetté válik, és az etilén már nem megfelelően válik el más gázoktól (például az etántól). Kvarc kapilláris
oszlop (15 m × 0,2 mm i.d.), apoláros szilikonolaj típusú nedvesítő folyadékkal (pl. SE-30) párosítva szintén jól
használható etilén meghatározására. Ezen az oszlopon az etilén retenciós ideje 0–10 °C között mintegy 4,5 perc;
ilyen körülmények között más gázoktól jól elválasztható csúcsot ad. A kolonnán elválasztott etilén detektálására
három detektortípus terjedt el: a lángionizációs, a fényionizációs és a félvezető detektor.
3.5. Az abszcisszinsav meghatározása
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
229 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az abszcisszinsav kivonása növényi mintákból
Az abszcisszinsav (ABS) kivonása friss növényi anyagból vagy folyékony nitrogénben mélyhűtött, majd –20
°C-on tárolt növényi mintából egyaránt elvégezhető. Egy vizsgálathoz kb. 5–10 g anyagra van szükség.
Legelterjedtebb extrahálószerei a 80%-os metanol, vagy a 80% acetont és 20% 0,1 M-os ecetsavat tartalmazó
oldószerelegy, de más szerves oldószerek, így etanol, etil-acetát, kloroform, hangyasav, illetve ezek különböző
arányú keverékei is használhatók (egységnyi tömegű növényi anyaghoz 5–10 térfogategységnyi oldószert adva).
Antioxidáns vegyület jelenléte javítja a kivonatkészítés hatékonyságát. A növényi szövet oldószeres extrakcióját
porcelánmozsárban eldörzsölve vagy géppel homogenálva végzik, majd a felülúszót centrifugálással választják
el a szilárd szövetmaradványoktól. A kivonatot a következő tisztítási lépés előtt (folyadék–folyadék-
megoszlásos, ill. kromatográfiás elválasztás) a vizes fázis térfogatára vagy teljesen szárazra párolják.
Az abszcisszinsav elválasztása
• Folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztás
Az ABS gyenge sav. Savas közegben, pH 3,0 alatt disszociálatlan állapotban van, és apoláros oldószerekben (pl.
éter) nagyságrendekkel jobban oldódik, mint vízben. Lúgos kémhatású közegben (pH 9,0) viszont disszociációja
csaknem teljes, vízben való oldékonysága ekkor sokkal jobb, mint szerves oldószerekben. Ezek ismeretében
tehát lúgos közegben (pH 8,0) éterrel rázatva a vizes növényi extraktumot, megtisztíthatjuk a mintát a bázikus és
semleges – éterben oldódó – komponensektől, miközben az ABS a vizes fázisban marad. Ha az oldat
kémhatását ezután megváltoztatjuk (pH 3,0), éterrel szerves fázisba vihetjük az ABS-t, egyéb éterben oldódó
szerves savakkal együtt (ilyenkor az erősen poláros komponensek a vizes fázisban maradnak).
• Hagyományos oszlopkromatográfia és szilárd fázisú extrakció
A legelterjedtebb – ABS elválasztására használt – oszlopkromatográfiás töltet a polivinil-pirrolidon (PVP),
amely jó hatékonysággal köti meg a mintában lévő fenolvegyületeket, és az ABS kevés veszteséggel nyerhető
vissza az elúció végén. A mintát legtöbbször közel semleges (pH 6,0) foszfát-pufferrel nyerik vissza az
oszlopról.
Az ABS-tartalmú növényi kivonat szilárd fázisú extrakciója különféle gyári kiszerelésű (Sep-Pak, Waters
Associates stb.) előre töltött, egyszer használatos oszlopokkal végezhető. Leggyakoribb a fordított fázisú,
oktadecil-szilán töltet alkalmazása. Az elúció metanol és ecetsav, vagy metanol és foszforsav keverékével
történhet.
• Az abszcisszinsav vékonyréteg-kromatográfiás elválasztása
A folyadék–folyadék-megoszláson alapuló elválasztási lépés eredményeként az ABS az éteres fázisba kerül,
amelyet szárazra párolva egy, még viszonylag heterogén kivonatot nyernek, amit vékonyrétegen, vagy HPLC-
vel tisztíthatnak tovább. Vékonyréteg esetében a száraz extraktumot kb. 100 μl metanolban feloldják, és ezt
viszik fel a rétegre. Az ABS vékonyréteg-kromatográfiás elválasztására fluoreszcens indikátort tartalmazó, 0,5
mm vastag szilikagélrétegek terjedtek el. Az ABS foltja a vékonyrétegen elnyeli az UV-sugárzást, így UV-fény
alatt kimutatható. A vékonyréteget használat előtt célszerű metanol/ecetsav (98:2 térfogatarányú) elegyével
mosni a szennyeződések eltávolítása érdekében. A rétegre a minták mellett tiszta abszcisszinsav markert is el
kell helyezni, gondosan ügyelve arra, nehogy a minták valamelyikével érintkezzen. Mintafelvitel előtt érdemes
az egyes sávokat tűvel megkarcolva elválasztani. A futtatáshoz több oldószerkombináció használható:
toluol/etil-acetát/ecetsav (különböző arányú elegyei), kloroform/ecetsav (98:2) vagy kloroform/metanol/víz
(75:22:3). Kifejlesztés után az abszcisszinsav markerrel egy magasságban futó foltokat 1–2 ml etil-acetát telített
vizes oldatával, vagy aceton/metanol (1:1) elegyével eluálják a rétegről. Az eluátumból a szilikagélszemcséket
centrifugálással vagy szűréssel távolítják el.
• Az abszcisszinsav elválasztása HPLC-vel
A folyadék–folyadék-megoszlásos elválasztással, illetve a szilárd fázisú extrakcióval nyert, félig tisztított
növényi mintát szárazra párolják, majd 1 ml 20% metanol/80% 0,1 M-os ecetsav elegyében feloldják, ezt
injektálják a HPLC-oszlopra. A HPLC-oszlopok közül a fordított fázisú oktadecil-szilán (ODS) töltetű oszlopok
használata gyakori eleme az ABS-elválasztásnak. Nagyméretű (150 x 10 mm i.d.), tipikus szemipreparatív
ODS-oszlopra 100 mg éteres kivonat (Horgan, 1981), illetve 5 g friss növényi anyagból készített tisztítatlan
extraktum injektálható (Neill és Horgan, 1987). Kisebb, analitikai célra használt oszlopok (150 × 4,5 mm i.d.)
mintakapacitása jóval kevesebb, de felhasználási területük is alapvetően más: részben már megtisztított növényi
minták további szétválasztására alkalmasak. Ez utóbbi oszloptípusra vonatkoznak a következő konkrét
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
230 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
elválasztási paraméterek (Neill és Horgan, 1987): a gradiens-elúciót 0,1 M-os ecetsavban oldott metanollal
végezték (0–100% között, lineárisan növekvő koncentrációban), 30 percen keresztül, 2 ml/perc eluensáramlási
sebesség mellett. Ebben az esetben az abszcisszinsav retenciós ideje 10–13 perc között változott.
• Az abszcisszinsav gázkromatográfiás elválasztása
Származékképzés: Az ABS metil-észterének előállításához szükséges diazometánt Schlenk és Gellerman (1960)
módszerével állítják elő. A diazometán nemcsak robbanékony, de rákkeltő is, előállítását és a metilezés
folyamatát elszívófülke alatt kell végezni! A diazometánból kis mennyiséget (max. 20 ml-t) fejlesztve, felfogják
éter/metanol (4:1 térfogatarányú) elegyében, és így, oldott állapotban tárolják –20 °C-on tárolják. A metilezésre
szánt száraz mintához kevés, (kb. 1 ml) diazometán-oldatot adnak, amelyben a mintát mintegy 10 percig
hagyják állni. Ha a diazometán sárga színe hamar eltűnik, akkor további reagens hozzáadása szükséges.
GC-kolonnák és az elválasztás körülményei: Apoláros és poláros megosztó fázisú oszloptöltetek egyaránt
elterjedtek metilezett ABS GC-analízisére. Apoláros nedvesítő folyadékok például a metil-szilikon OV-1, SE-
30, DC-200 vagy SP-2100. Poláros megosztó fázisként az Epon-1001, az XE-60, az Ultrabond-PEGS és a
Carbowaxok használata javasolható. Neill és Horgan (1987) az abszcisszinsav és két metabolitjának
gázkromatográfiás elválasztását egy 1 m × 4 mm i.d. töltött kolonnán végezték, 3% OV-1 megosztó fázissal,
210 °C oszlophőmérsékleten. A nitrogén vivőgáz térfogati sebessége 40 ml/perc volt. Az oszlopból távozó
komponensek mennyiségét elektronbefogásos detektorral mérték. A hagyományos töltött kolonnák mellett kvarc
kapilláris kolonnák alkalmazása is gyakori (pl. BP-1 kémiailag kötött megosztó fázissal). Mintakapacitásuk
azonban lényegesen kisebb, mint a töltött kolonnáké. Rosher et al. (1985) az abszcisszinsav metilezett
származékát mérték GC-MS-sel, kapilláris GC-kolonnán választva el az egyes mintaösszetevőket. A metilezett
mintákat metanolban oldva injektálták (1 μl mennyiségben) a 40 °C-os oszlopba, (50:1 arányú) megosztásos
módszerrel. Az oszlop hőmérsékletét az injektálás után 1 perccel kezdték el növelni, 200 °C-ig ballisztikus
görbét követve, majd 5 °C/perc intenzitással 250 °C-ig. Az injektor hőmérséklete 250 °C, a hélium vivőgáz
nyomása 0,2 MPa volt. Az elválasztott, oszlopból kiáramló komponenseket tömegspektrométer ionforrásába
vezették.
Az abszcisszinsav mennyiségi meghatározása
• Az abszcisszinsav GC-MS analízise
A tömegspektrométer gázkromatográfhoz kapcsolva rendkívül érzékeny és sokoldalú mérési lehetőséget nyújt.
Teljes tömegspektrum felvétele helyett – más növényi növekedésszabályzók méréséhez hasonlóan – az ABS
esetében is csak egy vagy néhány, adott m/z értékű töredékion intenzitását követik nyomon (SIM- és MIM-
módszer). Szelektív ion megfigyeléskor (SIM) a készülék csak azt az intenzitást méri, amit az ABS
metilészterének egy bizonyos töredékionja ad. Erre leginkább a 190 m/z értékű részecske alkalmas. A Me-
abszcisszinsav – elektronütköztetéssel ionizálva – a következő m/z értékeken ad jellemző fragmentumokat (70
eV ionizációs potenciál hatására): 190, 162, 146, 134, 125, 112, 91. Az ionok által adott jel intenzitása arányos a
beinjektált ABS mennyiségével, ezért kalibrációs görbe készíthető, ami lehetővé teszi ismeretlen abszcisszinsav-
tartalmú minták mennyiségi vizsgálatát.
• Az abszcisszinsav kvantitatív szerológiai meghatározása
Rosher et al. (1985) gyenge vízellátással stresszelt almafacsemeték és csemegepaprikatövek leveleiben
radioaktív szerológiai módszerrel (RIA) határozták meg az ABS menynyiségét. A növényi extraktumokat
először folyadék–folyadék-megoszlással (éterrel), azután PVP-oszlopon, majd szilárd fázisú extrakcióval (ODS-
oszlopon) tisztították, végül a mintákban lévő komponenseket HPLC-vel választották szét. A RIA-vizsgálatokat
5 ml-es polietilén szcintillációs csövekben végezték. A csövekbe 400 μl 0,2 M-os Na-acetát/ecetsav-puffert (pH
4,0) pipettáztak. Hozzáadtak 100 μl tríciummal jelölt ABS-t (kb. 670 Bq; 0,635 TBq/mmol), továbbá 100 μl
ABS standard oldatot, megfelelő hígításban (0,19–100 pmol tartományban; 2-szeres hígítási lépésekben), vagy
100 μl mintát, továbbá 100 μl 1,5%-os PVP-oldatot, vagy ugyanennyi desztillált vizet. Az elegyet Vortex-szel
kevertették, végül hozzámérték a 100 μl ABS-antiszérumot (250-szeres hígításban). Az említett kompetíciós
elegyek mellett olyan csövet is beállítottak, amellyel a maximális izotóppal jelölt ABS-kötődést (Bmax-ot)
mérhették (nem adtak hozzá sem mintát, sem ABS-standardot). A nem specifikus kötődés mértékét olyan
elegyben határozták meg, ami nem tartalmazott antiszérumot, ezt az értéket minden mérési eredményből
levonták. Az így elkészített csöveket 4 °C-on 90–120 percig tartották. Az antitestekhez (immunglobulinokhoz)
specifikusan kötődött ABS-molekulákat az IgG-fehérjék kicsapásával választották el a nem kötődött frakciótól.
Ezt telített ammónium-szulfát 90%-os oldatával (1 ml) végezték, majd 30 perc inkubációs idő után a kicsapódott
szilárd fázist centrifugálták (10 percig, 2500 g-vel) és a felülúszót leöntötték. A precipitátumot telített
Növényi vírusbetegségek és
növekedést szabályozó anyagok
231 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
ammónium-szulfát 50%-os oldatával (1 ml) ismét elegyítették, centrifugálták és a kicsapott fehérjefrakciót 150
μl vízbe visszaoldották. Az oldathoz ezek után hozzáadták a szcintillációs koktélt (ezt kereskedelmi
forgalomban árusítják), ami segít elkerülni azt, hogy az oldat fázisokra váljon szét. Ez alapvető feltétele a
megbízható szcintillációs számlálásnak. A szcintillációs számlálóval végül megállapították az oldat által
kibocsátott radioaktív sugárzás mértékét, amely minél kisebb volt, annál kevesebb tríciummal jelölt ABS
kötődött, tehát a minta (ill. a standard) annál több ABS-t tartalmazott. Az ABS-standardsor alapján kalibrációs
görbét szerkesztettek, ami lehetővé tette ismeretlen ABS-tartalmú növényminták kvantitatív vizsgálatát. A
számítást a következő (logit transzformációs) képlettel végezték:
amelyben
B: az egyes minták vagy standardok esetében mért radioaktivitás,
Bmax: kompetíciómentes – mintát, ill. standard oldatot nem tartalmazó – elegy radioaktivitása.
Az adatokat koordináta-rendszerben ábrázolva az x-tengelyre került az ABS mennyisége (pmol), az y-tengely
mutatta a logit(B/Bmax) értéket.
232 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
17. fejezet - Aktív oxigénformák és antioxidáns enzimrendszerek
A növények, mint ahogyan minden élőlény, életük során számos környezeti hatásra (szárazság, hőmérséklet-
változás, légszennyeződés, kórokozókkal történő fertőződés stb.) reagálnak. E környezeti hatások gyakran az
optimális életkörülmények megváltozását okozzák, ezzel alkalmazkodásra kényszerítik a növényeket. A hatás
erősségétől függően látható vagy mérhető stressz-szimptómák jelennek meg a növényen. A „stressz” a Selye
János által megfogalmazott definíció szerint nem más, mint a szervezet nem fajlagos válasza különböző
stresszorok károsító hatása ellen. A stresszor hatására jelentkező tünetegyüttes pedig a generális adaptációs
szindróma, amely magában foglalja a vészreakciót, a rezisztencia és a kimerülés szakaszát (Selye, 1975). Ezt a
definíciót azonban manapság nem követik a kutatók, ma a stressz a stresszor fogalmával azonos fogalom. A
stressz tehát a károsító tényező, a növény nem fajlagos válaszreakciója pedig a stressz-szimptóma. A
növényekben fellépő stressz pontos meghatározása azonban igen nehéz. A különböző genetikai arculattal
rendelkező organizmusok más-más módon reagálnak a környezet változásaira. Nehéz meghatározni az egyes
környezeti tényezők (98. ábra) hatásának a stressz kiváltásához elegendő szintjét, ahol az anyagcsere-
folyamatok stressz-anyagcsere-folyamatokba váltanak át (Elstner és Osswald, 1994).
98. ábra - A növényeket befolyásoló hét „stresszhatás” [Schlee, 1992 után]
A számos stressz közül a kórokozók (gomba, baktérium, vírus) fertőzése a legváltozatosabb és legbonyolultabb
hatású. A behatoló mikroorganizmus érzékelésén és azonosításán túl a növény képes koordinált rendszerben egy
vagy több védekező mechanizmust felmutatni, amelyek segítségével megpróbálja megakadályozni a kórokozó
behatolását, szaporodását, és végül annak elpusztítására törekszik.
A védekezés lehetőségei egyrészt adottak, másrészt indukálhatók. Az indukálható védekező reakciók két típusát
különböztetjük meg: a) specifikusan, valamint b) nem specifikusan indukálható védekező reakciók. Ez utóbbiak
előidézésére számos biotikus és abiotikus stresszor (stressz) képes. A többnyire összetett védekezés során a
növény egyrészt kémiai „fegyverzettel” (fitoalexinek, aktív oxigénformák és antimikrobiális fehérjék termelése)
rendelkezik, másrészt szerkezeti gátak kialakítására (sejtfal megszilárdítása, ligninképződés és a sejtfalfehérjék
immobilizációja) képes (Dixon et al., 1994).
A gazda–parazita kapcsolat kimenetelét jelentősen befolyásolja a specifikus felismerés, amely specifikus
elicitor–receptor kölcsönhatáson keresztül történhet. A gazda–parazita kapcsolat kimenetelét azonban gyakran
nem specifikus, hanem általánosan aktiválható reakciók döntik el.
A védekezési folyamatok egy része a növényi sejt felületén játszódik le, de itt történik egyéb folyamatok
indukálása is, amelyek tagjai annak a folyamatláncolatnak, amely mint jelátadó rendszer működik. A
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
233 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
válaszreakciók egy része rezisztenciát idéz elő, míg többségük inkább a kórokozó sikeres fertőzésének a
kísérőjelensége, esetleg az abiotikus stresszhatás által kiváltott stressz-anyagcserefolyamat része [aktív
oxigénformák (AOF) termelődése, az exocelluláris és intracelluláris pH-változás, a membránpotenciál
megváltozása, az ion-kiáramlás, a fehérjék foszforiláltsági mintázatának a változása stb].
A fent említett AOF termelődése a gazda–parazita kapcsolatok, valamint számos abiotikus stressz által
előidézett folyamat során fokozódik. Ez a reakció az állatvilágban és a humán patológiában több mint 30 éve
ismert. A növényekben később fedezték fel. Az azóta született biokémiai és genetikai kutatási eredmények
alátámasztják az AOF-nak a sejthalálban betöltött kulcsszerepét, bár a mai napig vitatott, hogy vajon az AOF
közvetlen hatása mennyire irányul a növény és mennyire a kórokozó ellen. Az is kérdés, hogy jelmolekulaként
szerepet játszanak-e az egyes védelmi szerepet kódoló gének transzkripciójának indukálásában (Dangl et al.,
1996).
1. Az aktív oxigénformák
A legtöbb látható vagy mérhető stressztünet kapcsolatos az oxigénanyagcsere-folyamatok megváltozásával,
melynek során a heterolitikus (két elektron átvitelével járó) folyamatok helyett megnövekszik a homolitikus
(egy elektron átvitelével járó) folyamatok mennyisége, és emiatt ún. szabad gyökök keletkeznek. Az AOF
részben szabad gyökök, mint a szuperoxid (•O2–) és a hidroxil gyök (•OH), amelyek párosítatlan (extra)
elektronnal rendelkeznek, részben olyan molekulák, amelyek reakcióik során szabad gyök képzésére képesek,
mint pl. a hidrogén-peroxid (H2O2) és a szinglet oxigén (1O2).
Ezek a gyökök és molekulák a molekuláris oxigénből sorozatos redukcióval keletkeznek.
Képzésükre így minden aerob sejt képes, kis mennyiségű termelődésük az egészséges növényi szövetek
sejtjeiben természetes folyamat. AOF keletkeznek kloroplasztiszokban a fotoszintetikus elektrontranszport
során, mitokondriumokban, ahol az oxigén 4%-a alakul át szuperoxiddá, továbbá a citoplazmában lejátszódó
enzimreakciók során. Az így keletkező AOF semlegesítésére a sejt antioxidáns-kapacitással rendelkezik,
amelyet antioxidáns enzimek és nem enzimatikus antioxidánsok képviselnek.
A molekuláris oxigén önmaga nem nagyon reakcióképes, a fent említett redukciók során elektronszerkezete
azonban megváltozik, s ezáltal rendkívül reakcióképessé válik. Számos, élettani szempontból jelentős
makromolekulát képes károsítani (membránokat, fehérjéket, aminosavakat, nukleinsavakat stb.). Ha a sejt
antioxidáns-kapacitását felülmúlja az AOF gyors, nagy mennyiségű átmeneti képződése, ún. „oxidatív
robbanás” (oxidative burst) következik be. Ez utóbbi jelentős károsításokat okozhat, és bekapcsolódhat a sejt
jelátviteli rendszerébe, ezáltal szerves részévé válik számos folyamatnak.
1.1. Szuperoxid gyök (•O2–)
Molekuláris oxigénből egyelektronos redukcióval szuperoxid (•O2–) anion keletkezik. Ennek a reakciónak a
végbemeneteléhez csekély energiabevitelre van szükség. Ezt az energiát az élő rendszerekben legtöbbször a
redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH) szolgáltatja. A további redukciókhoz már nincs
szükség extra energiára, a megfelelő reakciópartner jelenlétében spontán módon is lejátszódnak. Az élő
sejtekben a szuperoxid (•O2–) sav–bázis egyensúlyt alkot protonált formájával, a hidroperoxil gyökkel (•O2H),
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
234 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
ez utóbbi forma lipofil, könnyebben behatol a membránok lipid kettősrétegébe, és így képes a káros lipid-
peroxidáció előidézésére.
A szuperoxid (•O2–) jelenléte a növényi szövetekben pH-függő (fiziológiás pH esetén a szuperoxid nem nagyon
reaktív). Az 1,0 × 10–6 M-os szuperoxid (•O2–) oldatban a molekula felezési ideje (t1/2) 6,5 pH esetén 0,5
másodperc, míg 8,5 pH esetében 50 másodperc. Vizes oldatban annak kissé savas és semleges pH-ja esetén a
szuperoxid (•O2–) és protonált formája
hidrogén-peroxiddá (H2O2) és oxigénné (O2) alakul át (Sutherland, 1991). Ez a reakció lejátszódhat spontán
dizmutáció útján, vagy szuperoxid-dizmutáz enzim katalizációja segítségével. Az enzim gyorsan katalizálja a
reakciót, jelenlétében 1010-szer gyorsabb a reakció. Megjegyzendő, hogy a spontán dizmutáció is nagyon gyors,
mégis csaknem minden szervezet rendelkezik olyan speciális enzimmel vagy rendszerrel, amely a dizmutációért
felelős. Az enzim megtalálható a citoplazmában, a kloroplasztiszokban, a mitokondriumokban, sőt a
plazmamembránon kívül is. A szuperoxid (•O2–) keletkezését jelentős mennyiségű hidrogén-peroxid (H2O2)
keletkezése kíséri:
1.2. Hidrogén-peroxid (H2O2)
A hidrogén-peroxid (H2O2) aránylag stabil AOF. Elektromosan semleges és kevésbé reaktív, képes tehát
áthatolni a membránokon, így a keletkezési helyéről más sejtekbe vándorolhat. A sejtekben keletkezett
hidrogén-peroxid (H2O2) spontán módon vagy kataláz segítségével
átalakulhat vízzé (H2O) és molekuláris oxigénné (O2), vagy szubsztrátja lehet különböző peroxidázoknak,
amelyek segítségével a ligninszintézis alapjául szolgáló fenoxil gyökök keletkeznek,
de átalakulhat a Halliwell-Asada-cikluson (lásd az Aszkorbát c. alfejezetet) keresztül is. A hidrogén-peroxid
(H2O2) közvetlen oxidálására képes néhány átmeneti fém, ilyen a Fe2+ és a Cu2+ is.
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
235 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1.3. Hidroxil gyök (•OH)
A legaktívabb az itt tárgyalt formák közül a hidroxil gyök (•OH), amely hidrogén-peroxid (H2O2) és a szuperoxid
(•O2–) direkt reakciójával (Haber-Weiss-reakció) keletkezhet:
A növényi sejtben, a sejt természetes állapota mellett ez a reakció lassan játszódik le, és nem termelődik általa
jelentős mennyiségű hidroxil gyök (•OH), 4,8-as pH-optimuma miatt gyakorisága elhanyagolható.
Jelentős mennyiségű hidroxil gyök keletkezik átmeneti fémek – Fe2+ és Cu2+ – oxidációja
során (Fenton-reakció). Ez olyan ciklusreakció, ahol az oxidált ionok redukáló formájukat szuperoxiddal (O2-)
való reakció útján visszanyerik.
A hidroxil gyökök (•OH) sejten belüli keletkezését elsősorban az átmeneti fémek hozzáférhetősége határozza
meg (Gutteridge és Halliwell, 1994). A hidroxil gyök (•OH) az egyik legerősebb redukáló ágensként
irreverzíbilis változásokat idéz elő a sejt makromolekuláiban és megtámadja az organellumokat. Felezési ideje
10–9 másodperces tartományba esik, így meghatározása és szerepének vizsgálata nem sok sikerrel járt ez idáig. A
hidroxil gyök (OH) jelenléte a növény–kórokozó kapcsolatokban feltételezhető.
1.4. Egyéb aktív oxigénformák
A biológiai membránokhoz kapcsolt elektrontranszport-láncok és a szolubilis fázis kémiai reakciói révén
számos más, az előző fejezetekben nem említett AOF keletkezik. Ezek részben gyökök, mint pl. a szerves
ligandumot (R) tartalmazó fenoxil gyökök (RO2•), alkoxil gyökök (RO•), nitrogén-monoxid gyökök (NO•),
nitrogén-dioxid gyökök (NO2•), részben pedig molekulák, pl. szinglett oxigén (1O2), ózon (O3), hipoklórossav
(HOCl), szerves peroxidok (ROOH), salétromossav (HNO2) stb. Az utóbbi évek kutatási eredményei a nitrogén-
monoxid gyök (NO•) kiemelkedő szerepét bizonyítják. A nitrogén-monoxid szintáz által termelt nitrogén-
monoxid gyök (NO•)
szuperoxid gyökkel reagálva további AOF-at hoz létre (Millar és Day, 1997):
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
236 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Delledonne et al. (1998) és Durner et. al. (1998) munkáikban a nitrogén-monoxid gyök (NO•) hiperszenzitív
reakcióban, valamint az egyes védelmi szerepet betöltő gének transzkripciójának aktiválásában betöltött
szerepét bizonyítják.
2. Antioxidáns folyamatok, enzimek, enzimrendszerek és nem enzimatikus antioxidánsok
Az egészséges növény szöveti sejtjeiben aktív oxigénformák keletkeznek, amelyek akkumuláció folytán
toxikussá válhatnak a sejt számára. A sejtek azonban több antioxidáns tulajdonságú molekulával és jellegű
folyamattal rendelkeznek. Ide tartoznak a kismolekulájú, nem enzimatikus antioxidánsok (aszkorbát, glutation,
E-vitamin stb.), az egyes enzimek (aszkorbát-peroxidáz, dehidroaszkorbát-reduktáz, glutation-S-transzferáz,
glutation-reduktáz, szuperoxid-dizmutáz, kataláz, peroxidáz stb.), valamint több összetett enzimrendszer, amely
képes hatékonyan védelmezni azokat a sejtalkotókat, amelyekben lokalizáltak.
2.1. Szuperoxid-dizmutáz (SOD)
A szuperoxid-dizmutáz fémtartalmú enzim. A növényvilágban három alapvető formáját azonosították. Attól
függően, hogy milyen fémet tartalmaz és hol fordul elő, megkülönböztetünk Cu/Zn-SOD-t, Mn-SOD-t, Fe-
SOD-t. A Cu/Zn-SOD elsősorban az eukarióta szervezetek citoplazmájában és/vagy a kloroplasztisz
sztrómájában található. A Mn-SOD a prokarióta szervezetekre jellemző, de megtalálható az eukarióta
szervezetek mitokondriális mátrixában is. A Fe-SOD a prokariótákon kívül néhány eukarióta család
kloroplasztiszában is megtalálható.
Az enzim a szuperoxid (•O2–) dizmutációját katalizálja. Az így keletkezett hidrogén-peroxid (H2O2) az előbb leírt
módokon, pl. kataláz segítségével alakul át vízzé (H2O) és oxigénné (O2). A szuperoxid dizmutázt jelentős
antioxidánsnak tekintik. Azonban állati és baktérium-sejtekben, ahol megemelkedett aktivitását észlelték, a
sejtek halálát okozta, ha a kataláz nem volt képes semlegesíteni a keletkezett hidrogén-peroxidot (H2O2). Egyes
feltételezések szerint a SOD képes a hidrogén-peroxidból (H2O2) hidroxil gyök (•OH) keletkezését is katalizálni;
feltehetően ez a mechanizmus magyarázza a hidroxil gyöknek a membránkötött átmeneti fémektől távol eső
károsítását (Yim et al., 1990).
2.2. Aszkorbát
Jelentős antioxidáns, az egész sejten belül megtalálható. Képes közvetlenül reakcióba lépni a szuperoxiddal (•O2–
) és a hidroxil gyökkel (•OH), valamint képes a hidrogén-peroxidot (H2O2) aszkorbát-peroxidáz segítségével –
Halliwell-Asada-ciklus – átalakítani.
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
237 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az oxidált aszkorbát dehidroaszkorbát-reduktáz segítségével, glutation terhére regenerálódik; ez utóbbi
regenerálódását a glutation-reduktáz és a NADPH biztosítja.
2.3. Glutation, α-tokoferol, flavonoidok
A glutation redukált (GSH) és oxidált (GSSG) formája, valamint a glutation-reduktáz (GR) jelentős szerepet
játszik a hidrogén-peroxid (H2O2) lebontásában a citoszolban és a kloroplasztiszban szerveződött összetett
rendszerben, a Halliwell-Asada-ciklusban. A glutation-S-transzferáz a xenobiotikumok méregtelenítésében vesz
részt. Hasonlóan az aszkorbáthoz, a glutation is képes közvetlen reakciókra.
Fontos még megemlíteni mint nem enzimatikus antioxidánst, az E-vitamint (α-tokoferol), amely a membránok
kettős lipidrétegében található, és védelmet nyújt a lipid-peroxidáció ellen. Az oxidált vitamin az aszkorbát-
glutation ciklusban nyeri vissza redukáló képességét.
Az alábbi antioxidáns-rendszereken kívül számos flavonoid komplex képes antioxidánsként működni, gátolva a
lipid-peroxidációt.
2.4. Kataláz
A hidrogén-peroxidot (H2O2) vízzé (H2O) és oxigénné (O2) katalizáló vasporfirin prosztetikus csoportot
tartalmazó enzim megtalálható a legtöbb aerob élő szervezetben. Jelentős szerepet játszik a peroxiszómák és a
glioxiszómák hidrogén-peroxid- (H2O2) szintjének csökkentésében. Szerepe a növény–kórokozó
kölcsönhatásokban is jelentős. A kataláz disszociációs állandója magas, így kis mennyiségű hidrogén-peroxid
(H2O2) átalakításának katalizálásánál nem túl hatékony, pl.: ha 1 mg katalázt elegyítünk 10 mM-os hidrogén-
peroxid- (H2O2) oldattal, akkor 4000 mol H2O2/perc teljesítménnyel katalizálja a reakciót, míg ugyanennyi
kataláz 10 μM-os hidrogén-peroxid- (H2O2) oldatban csak 2 μmol/perc. Ebben az esetben az előzőleg leírt
rendszer jóval hatékonyabb, mint a kataláz. Az is lehetséges, hogy bizonyos stresszhelyzetekben, amikor a
NADPH-igény nagy, a kataláz szerepe megnövekedik.
3. Az aktív oxigénformák lehetséges keletkezési helye és módja
Miután számos tudományos dolgozat született az AOF kémiájáról, keletkezésükről és a sejt antioxidáns-
folyamatairól, kézenfekvővé vált a kérdés, hogy hol és hogyan keletkezik nagy mennyiségben az AOF.
A legvitatottabb dolgozatok a mai napig az AOF eredetének tanulmányozása során születnek. A részben
bizonyított és részben feltételezéseken alapuló modellek közül a részleteiben legjobban ismert „NADPH-
oxidáz” rendszer számos analógiát mutat az állati fagocita sejtekben található rendszerrel. Egy másik, részben
hipotetikus modell, a pH-függő „sejtfal-peroxidáz” rendszer. AOF-termelő képességet tulajdonítanak a
„csíra/oxalát oxidáz” rendszernek, amely hidrogén-peroxidot termel a behatoló kórokozó ellen, de nem történik
oxidatív robbanás, valamint a xantin-oxidáznak, amely enzim oxigént használ fel a xantin oxidálására,
szuperoxid és húgysav keletkezése közben. A „lipoxigenázt” szintén lehetséges AOF-forrásnak tekintették,
azonban kiderült, hogy az AOF termelődése megelőzi a lipoxigenáz aktiválódását.
Az oxidatív robbanás során keletkező aktív oxigénformákat képző NADPH-oxidáz rendszer a
plazmamembránban található (99. ábra), aktiválódását számos egyéb folyamat előzi meg. Ezek a folyamatok
részei a jelátadási rendszernek, amelyen keresztül a NADPH-oxidáz is aktiválódik. Az így keletkező aktív
oxigénformák egyéb anyagcsere-folyamatokat aktiválnak, amelyek bizonyos rezisztenciagének
transzkripciójának aktiválásához és sejthalálhoz is vezethetnek. A modell hipotetikus, leegyszerűsített működési
elve a következő: a plazmamembránban található receptormolekula (Rp) egy elicitor- molekulát ismer fel, ezt a
guanozin-trifoszfát (GTP)-kötött ún. „G-fehérje” aktiválása, az ioncsatornák megnyitása (a Ca2+ és a H+
beáramlása, valamint a K+ kiáramlása és ezáltal a citoplazma savasodása) követi. A protein-kinázok és protein-
foszfatázok, valamint a foszfolipázok is valószínűsíthetően részt vesznek az aktív oxigénformákat létrehozó
NADPH-oxidáz rendszer aktiválásában.
99. ábra - Az aktív oxigénformák szerepe a növényben lejátszódó folyamatok
aktiválásában. RP = receptormolekulák, G = G-protein, SA = szalicilsav, SA• = szalicilát
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
238 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
gyök, BA2H = benzoesav-2-hidroxiláz, + = pozitív hatás, – = negatív hatás [Hammond-
Kosack és Jones, 1996 után módosítva]
A hidrogén-peroxid (H2O2) keletkezésének egy másik lehetősége, a pH-függő sejtfal peroxidáz-modellje, bár
ellentmond az előbbinek, ugyanúgy nem zárja ki a jelátadási ösvényen keresztüli aktiválódást, hangsúlyozva a
plazmamembrán és a sejtfal közötti felület komponenseinek fontosságát. Összegezve megállapítható, hogy az
elicitormolekulát itt is ugyanúgy egy receptor molekula érzékeli, ezt követi az ionoknak az ioncsatornákon
keresztüli áramlása (Ca2+, K+, H+, Cl–), ami a plazmamembrán külső felületének átmeneti alkalizációját
eredményezi, ezt pedig már a sejtfal kötött peroxidáz-aktiválódása követi.
Az AOF termelődéséről szóló első növénybiológiai tanulmány 1983-ban látott napvilágot, ahol egy
burgonyagumó szövetében végbemenő hiperszenzitív reakció (HR) során észlelték a szuperoxid (•O2–)
termelődését. Továbbá megállapították, hogy az ilyen reakció csak az inkompatibilis gazda–parazita kapcsolatra
jellemző (Doke, 1983).
Az AOF keletkezésének módját növény–baktérium sejtszuszpenzióban sikerült vázolni, egy inkompatibilis és
egy kompatibilis gazda–parazita kapcsolat összehasonlításával. Megállapították, hogy az AOF keletkezésének
két fázisát, hullámát lehet megkülönböztetni. Az első fázis egy aránylag rövid, nem specifikus reakció
következtében jön létre, mind a kompatibilis, mind az inkompatibilis gazda–parazita kapcsolatban, míg a
második fázis hosszabb és specifikusan jellemző az inkompatibilis kapcsolatra (100. és 101. ábra). Az inokulum
baktériumszámának növelése (107 ⇒ 108 cfu/ml) maga után vonta az AOF mennyiségének növekedését az első
fázisban, ugyanakkor a második fázisban azok csökkenése következett be (Baker et al., 1991). Ez a
ellentmondás az első fázisban megnövekedő antioxidáns-kapacitás következménye.
100. ábra - Az aktív oxigénformák kétfázisú termelődése kórokozó–növény
kapcsolatban [Baker és Orlandi, 1995 után]
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
239 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
101. ábra - Az AOF termelődése (A, B) és sejthalál (C, D) a P.s. tabaci (Pseudomonas
syringae pv. tabaci) és P.s. gly. (Pseudomonas syringae pv. glycinea) 4-es és 6-os
rasszával fertőzött dohány- és szója-sejtkultúrákban. Inkompatibilis (teli szimbólumok)
és kompatibilis (üres szimbólumok) gazda–parazita kapcsolatok [Baker és Orlandi,
1995 után]
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
240 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
4. Az aktív oxigénformák kórfolyamatban betöltött szerepe
4.1. Antimikrobiális aktivitás
Az AOF antimikrobiális aktivitása régóta ismert (lásd fagocitózis). A növényi sejtek képtelenek mozgást
végezni, körülvenni és beburkolni a kórokozót, ellenben AOF termelésére képesek. A szuperoxid és a hidrogén-
peroxid baktériumok és gombák elleni antimikrobiális aktivitása in vitro kísérletekben igazolt, in vivo betöltött
szerepük azonban nem bizonyított (Király et al., 1997).
A stacionáris fázisban lévő baktériumok több katalázt termelnek, mint a log fázisban lévő baktériumok, ezáltal
ellenállóbbak a hidrogén-peroxid magas koncentrációjával szemben. Baker és Orlandi (1995) munkájából
kitűnik, hogy magas hidrogénperoxid-koncentráció mellett (1,0–50 mM) a baktériumpopuláció túlélését a
baktériumsejtek koncentrációja határozza meg, nem pedig az egyes baktériumsejtek antioxidáns-aktivitása.
4.2. Fitoalexinek termelődése
Az AOF és a fitoalexinek termelődése között számos összefüggést találtak az elmúlt évtizedben. A
szójanövények hipokotiljában a hidrogén-peroxid hatására keletkező zsírsav-hidroperoxidok gliceollin-
akkumulációt váltottak ki (Apostol et al., 1989). Ezek az adatok közvetlen ok-okozati összefüggésre utaltak, ám
ugyanezen laboratóriumban később arra a következtetésre jutottak, hogy a növényben két különböző
elicitormolekula van jelen, amelyek képesek mindkét reakció párhuzamos és független indukciójára. Más
dolgozatok is megkérdőjelezik az összefüggést. Pl. dohánysejteket tisztított fehérje-elicitorral kezelve fitoalexin-
termelődést észleltek, azonban AOF termelődését nem. Az utóbbi évek eredményei azt valószínűsítik, hogy ez a
két jelenség párhuzamosan indukálható, feltehetőleg különböző felismerő és jelátadó rendszer által.
4.3. Hiperszenzitív reakció
A hiperszenzitív reakció (HR), mint a növényi rezisztenciával kapcsolatos válaszreakció, régóta vizsgált
növény-kórélettani jelenség (Klement, 1982). Levine et al. (1994) tanulmányában az AOF termelődését mind a
virulens, mind az avirulens baktériumtörzsek előidézték. A gazdasejtek halála azonban csak az avirulens
törzsnél észlelhető. A HR előidézésében a hidrogén-peroxidnak tulajdonították a kulcsszerepet. Glazener et al.
(1996) mutáns baktérium alkalmazásával bizonyították, hogy bár a baktérium képtelen HR-t előidézni a növényi
sejtekben, az AOF kétfázisú termelődése mégis megtörténik. A hozzáadott (exogén) hidrogén-peroxid, bár
valóban képes sejthalál előidézésére, csak jóval nagyobb mennyiség esetén (2–10 mM) hatásos, mint amennyi in
vivo a növényben az AOF keletkezésekor termelődik. Egyes mutánsokkal végzett kísérletek a hidrogén-peroxid
helyett a szuperoxidnak tulajdonítanak iniciáló szerepet a sejthalál indukálásában.
4.4. Szisztemikus szerzett rezisztencia
A szisztemikus szerzett rezisztencia és az AOF termelődésének összefüggését több dolgozat részleteiben
vizsgálja. Léon et al. (1995) megállapították, hogy a hidrogén-peroxid növeli a benzoesav-2-hidroxiláz enzim
aktivitását, amely enzim benzoesavból szalicilsav (SA) képződését katalizálja, mindez SA-akkumulációhoz
vezet. Bizonyított tény, hogy a SA elengedhetetlen a szisztemikus szerzett rezisztencia kialakulásához. Fodor et
al. (1997) vizsgálatai szerint a SA különböző antioxidánsokat aktivál és ezzel alapvetően hozzájárul a nekrotikus
tünetek visszaszorításához, vagyis a szisztemikus szerzett rezisztencia kialakulásához.
A hidrogén-peroxid mennyisége jelentősen megnő a fertőzési helyeken, feltételezhető a SA mellett egy
másodlagos hírvivő szerepe a jelátadási rendszerben, amely során szisztemikus szerzett rezisztencia alakul ki,
valamint kórfolyamat-függő fehérjék génjei aktiválódnak. Ez utóbbi szerepét számos szerző megkérdőjelezi
(Klessig és Malamy, 1994).
4.5. Indukált sejtfal-megszilárdítás
Régóta ismert és bizonyított jelenség a kórfolyamat kezdetén bekövetkező sejtfal-megszilárdítás, amely során a
sejtfalfehérjék peroxidáz által katalizált keresztkötődéssel megszilárdítják a sejtfalat, és lassíthatják a kórokozó
behatolását. Ez az oxidatív robbanás során keletkező hidrogén-peroxid által befolyásolt folyamat. A sejtfal
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
241 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
megszilárdításában részt vevő egyéb folyamatok létezésére utal az is, hogy indukálására képes pl. a glutation is,
ami köztudottan antioxidáns.
5. Mérési módszerek és értékelésük
Az aktív oxigénformák instabil természetűek, spontán és enzim katalizálta reakcióik nagyon gyorsak, felezési
idejük a másodperces időintervallumba esik. Mindez megnehezíti közvetlen mérésüket a növényben. Ugyan a
leegyszerűsített gazda–parazita kapcsolatok, pl. a növényi sejtkultúra-szuszpenzió és baktérium-szuszpenzió,
esetleg a kórokozóból izolált elicitor-molekula és a növényből izolált organellumok áthidalják a módszertani
nehézségeket, de vajon mennyire tükrözik a növényben lejátszódó eseményeket?
Az AOF kórélettani szerepéről eddig felgyülemlett ismeretanyag többsége, pl. a védekezési folyamatok,
bizonyos gének expressziójának, valamint a sejtfal megszilárdításának indukálása, a hiperszenzitív reakcióban
betöltött szerepük stb. főleg a fent említett modell-kapcsolatokból származik. Az AOF meghatározására szolgáló
mérési módszereket és indikátorokat, valamint előnyeiket és bizonyos hátrányaikat a 23. táblázat foglalja össze
(Schroeder et al., 1996).
23. táblázat - Az AOF mérési módszereinek összefoglalása (Schroeder et al., 1996 után
módosítva)
Jelzőanyag Alkalmazott
módszer Kimutatot
t anyag Kimutatás
i határ Módszerek előnyei (+),
hátrányai (–)
Keményítő/KI agarlemezek
szövetlenyomat
H2O2 500 µM + lokalizácó
– szükséges a mért anyag
kiválasztódása a növényből
– a háttér elszíneződése a
levegő okozta
oxidáció miatt
– nehéz alkalmazhatóság az
ún.
„száraz” szövetrészeknél,
mint pl. a levelek
CeCl3 elektronmikros
z-
kópos vizsgálat
H2O2
+ sejtszintű és szubcelluláris
lokalizáció
– anyag- és eszközigény
(IV)Cl4 növényi
kivonattal
végzett kolori-
metriás mérés
H2O2 50 µM + mennyiségi meghatározás
+ növényi pigmentek zavarják
a
meghatározást; aktív szénnel
vagy
erős anioncserélővel
színteleníteni
kell a mérést megelőzően
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
242 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
4-nitro-tetrazó-
lium-kék (NBT)
infiltráció •O2–
+ lokalizáció
+ •O2–-ra specifikus
Diamino-benzidin
(DAB)
infiltráció
lumineszcencia
H2O2
+ lokalizáció
Luminol növényi
kivonatokban
H2O2 l 1 µM + mennyiségi meghatározás
5.1. KJ / keményítő módszer
A H2O2 termelődésének megállapítására szolgáló legkönnyebb módszerek közé tartozik. A módszer a jodidionok
H2O2 általi oxidációjára épül, a keletkezett jód komplexképződés közben reagál a keményítővel és színes,
kékeslila elszíneződést okoz. Ez az egyszerű reakció több módszer alapja. A módszerek előnye, hogy anyag- és
műszerigénye kicsi, valamint lehetővé teszik a H2O2 lokalizációját. Hátrányaik: a degradálódási folyamatok, a
háttér elszíneződése, amely a jódnak a levegő általi oxidációjából fakad, valamint a kiválasztási folyamatok
fizikai akadályai, így a kis víztartalmú szöveteknél, mint pl. a levelek, nehezen alkalmazható, másrészt
érzékenysége csak az 500 μM-os érték körül mozog.
A H2O2 meghatározása növényi szövetben (agarlemezes módszer)
A növényi szövet H2O2-tartalmának meghatározása Olson és Varner (1993) módszere alapján történik. A fiatal
növények gyökereit vagy a levelekből kivágott korongokat (esetleg burgonyagumó-szeleteket) 1%-os
agarózlemezre helyezzük, amely 50 mM KI-ot és 2–5% keményítőt tartalmaz. A mintákat az elszíneződés
megjelenéséig (függ a H2O2 mennyiségétől) szobahőmérsékleten tároljuk (102. ábra).
102. ábra - A H2O2 kimutatása agarlemezes módszerrel. A: gyökereken a baloldali
növény a kontroll, B és C: burgonya-levélkorongokon felül a kontroll látható mindkét
esetben [Wu et al., 1995 után]
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
243 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A H2O2 meghatározása növényi szövetben (szövetlenyomat-készítéssel)
a. A „H2O2-nyomtató papír” elkészítése nitrocellulózmembrán- (0,2 μm) darabkák áztatásával történik.
b. Az áztató oldatot desztillált vízből 100 g/l oldható keményítő és 0,5 mol/l KI hozzáadásával készítjük. A
keményítő oldása forralással történik, a KI-ot csak kihűlés után adjuk az oldathoz.
c. A nitrocellulóz-darabkákat 30 °C-on megszárítjuk, használat előtt sötétben tároljuk, ezzel is megelőzve az
esetleges oxidációt. Az áztató oldat tárolhatósága 5 óra, a lenyomatkészítő papíré pedig 2 óra.
d. A szövetlenyomatok készítése szobahőmérsékleten történik (18–20 °C) Cassab és Varner leírása alapján
(1989).
e. A H2O2-nyomtató papír darabkáit öt réteg vastagságú kromatográfiás papírra helyezzük.
f. A szövetmetszeteket steril borotvapengével, kézzel metsszük (vastagságuk 0,5–1,0 mm) és azonnal a
lenyomatkészítő papírra helyezzük. A műveletet 15 másodpercen belül végezzük, egy papírra 3–6
szövetmetszetet helyezünk.
g. Ezt követően a metszeteket 16-rétegű steril gézzel betakarjuk, és finoman 60 másodpercig ujjal nyomjuk (a
leghatásosabb terhelés 200–300 g között van).
h. A szeleteket óvatosan (csipesszel) eltávolítjuk, a lenyomatokat 5–10 perces szárítást követően (103. ábra)
sztereomikroszkóppal vizsgáljuk (16-szoros nagyítás). A lenyomatok megjelenése a papírokon 5–10 percet
igényel, ez elsősorban a H2O2 mennyiségétől függ. Mivel a lenyomatok idővel erősödnek,
összehasonlíthatóságuk érdekében az értékelést azonos időközönként végezzük. A lenyomatok 2 óráig
tárolhatók sötétben (bár így is látható kevés háttérelszíneződés).
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
244 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
i. A hozzávetőleges mennyiségi meghatározáshoz kalibrációs sort készítünk. A H2O2-oldat 2,5 μl-es cseppjeit
0–0,125–0,25–0,5–1–2–4–8 mmol/l-es koncentrációban helyezzük a papírra. Minden értékeléshez friss
kalibrációt készítünk (ügyeljünk az azonos időközökre).
j. Az eredményeket mikroszkópra szerelhető fényképezőgéppel rögzítjük.
103. ábra - H2O2 szöveti meghatározása csíranövényből szövetlenyomatok készítésével
[Schopfer, 1994 után]
5.2. CeCl3 módszer
A CeCl3 elektronsűrű nehézfém, vizes közegben oldott állapotú, a H2O2 cérium-peroxiddá oxidálja. Amíg más
módszerek segítségével az AOF jelenlétének meghatározása csak szöveti és sejtszinten lehetséges, addig ezen
módszer lehetővé teszi az egyes sejtorganellumokban történő meghatározást. A módszer hátránya, hogy műszer-
és költségigényes.
A H2O2 meghatározása növényi szövetben (transzmissziós elektronmikroszkóppal)
A minták előkészítése hagyományos módon történik: fixálás, beágyazás, metszés és festés (Bestwick et al.,
1995) alapján. A H2O2 lokalizálására szolgáló módszer a cérium-peroxid keletkezésén alapul.
a. Az inokulált szövetből 1–2 mm2-es darabokat vágunk, ezeket 1 órán keresztül a frissen készített 5 mM-os
CeCl3-oldatban (pH-ja 7,2) inkubáljuk.
b. A CeCl3-ot 50 mM-os 3-(-morfolino) propán-szulfonsavban (MOPS) oldjuk.
c. Ezt követően a szöveteket 50 mM-os nátrium-kakodilát- (CAB) pufferben 1 órán keresztül fixáljuk, a puffer
1,25% (v/v) glutár-aldehidet és 1,25% (v/v) p-formaldehidet is tartalmaz (pH-ja 7,2).
d. A fixáció után a szöveteket 2 × 10 percen át mossuk CAB-pufferben, és 45 percen keresztül utófixálást
végzünk 1% (v/v) ozmium-tetroxidot tartalmazó CAB-pufferben.
e. A szöveteket újra 2 × 10 percig CAB-pufferben mossuk.
f. Növekvő töménységű etanol-sorozatban dehidratálást végzünk 30, 50, 70, 80, 90% (v/v). A mintákat minden
etanololdatban 15 percig tartjuk, majd 3 × 20 percre 100%-os etanolba helyezzük (a dehidratálást esetleg
acetonnal is végezhetjük, ebben az esetben aceton–gyanta keverékbe ágyazzuk a mintákat).
g. A további eljárás során a mintákat 2 × 20 percre propilén-oxidba helyezzük, majd folyamatosan beágyazzuk
Eponaralditba.
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
245 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
h. A szövet 12 órára tiszta gyantába, majd újabb 4 órára friss gyantába helyezzük.
i. Ezt követően 48 órára a 60 °C-os polimerizáló blokkokba kerül.
j. A mikrotómos metszést gyémántkéssel végezzük (70–90 nm).
k. A metszeteket bevonatlan rézrácsra (Cu-grid, 300 mesh) helyezzük és transzmissziós elektronmikroszkóppal
vizsgáljuk (75 kV-os gyorsító áram).
5.3. Ti(IV)Cl4 módszer
A módszer perhidroxid komplex képződésén alapul. Bár a növény levélszövetének számos pigmentje ugyanazon
a hullámhosszon abszorbeál, mint a titániumkomplex, a módszer mégis alkalmazható, de csak aktív szenes
derítés, esetleg anioncserélő gyanta alkalmazása mellett. A levelek folyékony nitrogénben való fagyasztása, az
5%-os triklór-ecetsav, az aktív szén alkalmazása és az ammónium-hidroxiddal való semlegesítés megfelelő
elszíntelenítést eredményeznek. A módszer hátránya a pigmentek interferenciáján kívül az, hogy bár kvantitatív
meghatározásra nyújt lehetőséget, érzékenysége csak 50 μM-os határ körül mozog, ennél ugyanis jóval
érzékenyebb módszerek is léteznek.
A H2O2 meghatározása növényi szövetben (spektrofotometriásan)
Az itt részletezett két mérési módszer kolorimetrián alapuló spektrofotometriás mérés. Az A-módszer Patterson
et al. (1984), míg a B-módszer Okuda et al. (1991) nevéhez fűződik.
A-módszer
Az első módszer a semlegesített TCA-s kivonáson és a Ti(IV)-PAR komplexképződésen alapul.
a. A leveleket (2 g) folyékony nitrogénben fagyasztjuk, majd 1 ml 5%-os triklór-ecetsavval és 0,7 g aktív
szénnel együtt eldörzsöljük.
b. Az extraktumot centrifugáljuk (18 000 g, 10 perc, 0 °C-on) és egyben szűrjük (0,45 μm). Mindaddig
ismételjük a szűrést, amíg az összes aktív szenet és kicsapott fehérjét el nem távolítottuk.
c. A szűrlethez a 8,4-es pH eléréséig 7 M-os NH4OH-oldatot adunk.
d. Újabb szűrést végzünk, és az így kapott szűrletet 1 ml-es egyenlő részekre osztjuk, a minták felébe 1 μg
katalázt teszünk.
e. Az összes mintát 20 °C-on 10 percig inkubáljuk, majd kolorimetriás reagenst adunk hozzá.
f. A mintákhoz ismert mennyiségben és egyenlő arányban 4-(2-piridilazo)-rezorcinol (PAR) és kálium-
titánium-oxalát komplexét adjuk hozzá.
g. Mindkét oldatot 6 × 10–4 töménységben készítjük, és úgy elegyítjük, hogy pH-ja 8-as legyen.
h. A szín 45 °C-on egy óra múlva jelenik meg. A spektrofotometriás méréseket 508 nm-en végezzük.
B-módszer
a. A leveleket (0,2 g) előhűtött (0 °C) dörzsmozsárban 2 ml 0,2 N-os HClO4-ban 0,1 g kvarchomokkal
eldörzsöljük.
b. A mintákat 5 percig 20 000 g-n centrifugáljuk, majd a felülúszót 4 N-os KOH-dal 7,5-ös pH eléréséig
lúgosítjuk.
c. Az így kapott oldatot 1 percig 1000 g-n centrifugáljuk.
d. A felülúszó 200 μl-ét 1 ml-es anioncserélő oszlopra (0,8 × 2 cm, AG-1) visszük fel.
e. Az oszlopot 800 μl desztillált vízzel mossuk, és az így nyert oldatot alkalmazzuk a H2O2 meghatározására.
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
246 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
f. A reakcióelegy 1,5 ml végtérfogatában 1 ml felülúszót, 400 μl 12,5 mM-os 3-N,N-dimetil-amino-
benzoesavat (0,375 M-os foszfát-pufferben oldva, pH-ja 6,5), 80 μl 3-metil-2-benzotiazolin-hidrazont és 20
μl peroxidázt (0,25 egység) tartalmaz.
g. A peroxidáz hozzáadása után az abszorbancia változását 25 °C-on, 590 nm-en (két fényutas)
spektrofotométerben követjük nyomon.
h. A mért értékeket korrigáljuk 15 percig 20 °C-on inkubált 10 egység kataláz hozzáadásával készült minta
abszorbanciájával.
5.4. 4-nitro-tetrazóliumkék (NBT) módszer
Amíg az indikátorok egy része a H2O2-ra specifikus, addig az NBT a •O2–-ra szelektív. A redukción kívül a sárga
NBT lilás-barnás formazánná csapódik ki. A növényi szövetekbe történő bejuttatásának több lehetősége van. A
szukkulens szövetekbe felszívással juttatható be, de vákuminfiltrálni is lehetséges. A felszívás során a xilém és a
floém azonban jelentős mennyiségű festéket emészt, valamint az ott felhalmozódott csapadék elzárhatja a
transpiráció útját. Ez a bejuttatási módszer amellett, hogy anyagigényes, a csapadék feltorlódása miatt sem
tökéletes. Ezért a vákuminfiltrálással történő bejuttatás jobban ajánlható. A módszer előnye, hogy sejtszintű
lokalizációt tesz lehetővé.
A •O2– meghatározása növényi szövetekben (specifikus indikátor alkalmazásával)
A •O2– szöveti festése tehát az NBT-vel való speciális reakción alapszik (Doke és Ohashi, 1988).
a. 10 mM-os kálium-foszfát-pufferben (pH 7,8) 0,5% (w/v) NBT-t, 10 M NADPH-t és 10 M EDTA-t oldunk.
Az oldat fényérzékeny, készítésekor a lombikot fóliával takarjuk, oldás után szűrjük.
b. A növényi részt (pl. levélkorongokat) az oldattal vákuminfiltráljuk.
c. Ezt követően 25 °C-on inkubáljuk, 15 perc múlva a szövet azon részeiben, ahol •O2- termelődés észlelhető,
megjelenik a formazán lilás-barnás elszíneződése.
d. A szöveteket mikroszkóppal vizsgáljuk, bár a reakció szabad szemmel is jól látható. Mikroszkópra szerelhető
fényképezőgéppel felvételeket készítünk (104. ábra).
104. ábra - Nekrotikus léziók körül keletkező szuperoxid és a NBT reakciója során
keletkező formazán elszíneződése, dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic
tobamovirus) inokulált Nicotiana tabacum cv. Samsun NN dohány levélkorongjain
[Doke és Ohashi, 1988 után]
5.5. Diaminobenzidin (DAB) módszer
A H2O2-ra specifikus reakció elsősorban keletkezési helyének meghatározására alkalmas. Bár az irodalomban
elsősorban gomba–gazda kapcsolatoknál alkalmazták ezt a módszert (Thordal-Christensen et al., 1997),
egyszerű és nem túl műszerigényes volta révén vírus–gazda kapcsolatra is átdolgozható.
A H2O2 meghatározása növényi szövetben (specifikus indikátorral)
a. A levágott inokulált leveleket 8 órán át 3,3‟-diaminobezidin-HCl 1 mg/ml-es 3,8-as pH-jú oldatában
inkubáljuk (az alacsony pH a DAB oldódásához szükséges). A DAB-oldatot készíthetjük aszkorbinsav
(10mM) hozzáadásával is.
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
247 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
b. A H2O2 keletkezésének helyén vörösesbarna elszíneződés jelenik meg. A minták vizsgálata különböző
időpontban történik.
c. A reakció megjelenését követően a vizsgált epidermisznyúzatokat fixáljuk, ami történhet 30%-os glicerin és
30%-os tejsav oldatával vagy 96%-os forró etanol-oldatban (10 perc).
d. A szöveteket mikroszkóppal vizsgáljuk, majd fényképezőgéppel felvételeket készítünk.
5.6. Kemilumineszcenciás módszer
A módszer H2O2 növényiszövet-kivonatokban történő meghatározására alkalmas. Amellett, hogy specifikus,
igen érzékeny. Összehasonlítva a Ti(IV)Cl4-os módszerrel, érzékenysége legalább 50-szeres (l 1 μM).
Ugyanazon kísérleti beállítás során a két módszert összehasonlítva ez utóbbival, szignifikáns eltérések
mutathatók ki, míg Ti(IV)Cl4-dal nem. A H2O2 mennyisége luminométerrel mérhető és a kibocsátott fény
intenzitásával arányos. A növényi kivonat készíthető HClO4-val is (Chen et al., 1993). A lumineszcenciás
módszerek (peroxidáz katalizálta lumineszcencia) jól alkalmazhatók sejtszuszpenzióban is, mind az AOF
képződésének, mind a H2O2-elbontó aktivitás meghatározására (Glazener et al., 1991). Az itt részletezett
módszer Warm és Laties (1982) munkájából származik.
A H2O2 meghatározása növényi szövetben (luminol segítségével)
a. A H2O2 meghatározásához vett növényi mintákat (egyenként 5 g-ot) folyékony nitrogénben fagyasztjuk.
b. 20 ml 5%-os, 4 °C-os triklór-ecetsavban (TCA) előhűtött dörzsmozsárban homogenáljuk.
c. A növényi kivonatot tartalmazó minták mellett belső standardot és vakmintát is készítünk. A belső
standardhoz és a vakmintához 3 μmol H2O2-ot (1–5 μmol H2O2) adunk a homogenálást megelőzően. A
vakminta 25 ml 5%-os TCA, amely nem tartalmaz növényi kivonatot.
d. A mintákat 30 percig 12 000 g-n centrifugáljuk.
e. A felülúszók 1 ml-ét, a növényi kivontaban lévő színes vegyületek kiszűrése érdekében, anioncserélő
oszlopon engedjük át, mintánként kétszer (0,7 × 4 cm, 100 mg Dowex AG 1-X8).
f. A vak- és standard mintákkal ugyanígy járunk el.
g. Az így kapott kivonatok 50 μl-ének H2O2-tartalmát 50 μl 0,5 mM-os luminol (3-aminoftálsav-hidrazid)
segítségével mérjük. A luminolt 0,2 M-os NH4OH-ban oldjuk (pH 9,5).
h. A kemilumineszcenciát 100 μl 0,5 mM-os K3Fe(CN)6 (0,2 M-os NH4OH-ban oldva) injektálásával
indukáljuk.
i. Az emittált fotonokat 5 másodpercig pulzusintegrátorral számláljuk.
j. A H2O2-specifikus kemilumineszcencia megállapítására az elszíntelenített növényi kivonat 1 ml-éhez (Tris-
HCl-pufferben, pH-ja 7) 500 egység katalázt adunk, ezt 10 percig 30 °C-on inkubáljuk, majd ismételten
mérést végzünk. A két mérés különbsége (ΔCL) a H2O2-specifikus kemilumineszcencia.
k. A H2O2 egyéb lebomlásának, esetleg más komponensek interferenciájának kiszűrésére szolgál a belső
standard és a vakminta, a levonásuk után kapott kemilumineszcencia, a nettó kemilumineszcencia (net CL)
arányos a minta H2O2 mennyiségével, amit kalibrációs görbe segítségével határozunk meg.
5.7. Egyéb mérési módszerek
Az aktív oxigénformákat fluoreszcenciás és elektronspínrezonanciás módszerekkel is mérhetjük; ezek igen
gyakori mérésformák. A fluoreszcenciás módszerek kitűnően alkalmazhatók sejtkultúrákban az AOF
keletkezésének detektálására, elsősorban a H2O2 meghatározására. A H2O2 keletkezése szkopoletin fogyásával
határozható meg, spektrofluoriméter (460/350 nm) segítségével (Levine et al., 1994). Fluoreszcenciás módszer
alkalmazható a membrán-lipidfázisok változásának meghatározására. A fluoreszcein-diacetát apoláros
molekula, amely könnyen áthatol a membránok lipidfázisán, ott elveszíti acetát részét, és poláros fluoreszcein
keletkezik, amely már nem tud a membránokon áthatolni. Így a plazmamembránok permeabilitásának változása
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
248 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
jól nyomon követhető a fluoreszcein-diacetát akkumulációjával, a sejtek észterázaktivitásával, valamint a
fluoreszcein kiáramlásával (Keppler et al., 1988).
Fluoreszcens mikroszkópia is alkalmazható a sejthalál detektálására, ahol az élő sejteket fluoreszcens festékkel,
neutrálvörössel festjük (Koga et al., 1988). Ez utóbbi két módszer az egyéb közvetett mérési lehetőségek közé
tartozik.
Az elektonspínrezonancia-spektroszkópia (ESR) paramágneses tulajdonságú anyagok tanulmányozására
alkalmas spektroszkópiás módszer. Ilyenek a párosítatlan elektronú atomok, szabad gyökök, néhány molekula,
mint pl. NO, O2– , olyan féminok, amelyek d és f elektronhéja csak részlegesen betöltött stb. A módszer többek
között alkalmas paramágneses anyagok koncentrációjának meghatározására, 10–9–10–10 mol/l határokig. Ez az
intervallum lehetőséget nyújt az AOF mennyiségének pontos megállapítására. A módszer az AOF-nak izolált
membránban és mikroszómafrakcióban történő meghatározására alkalmas.
Egyéb (közvetett) mérési lehetőségek
A fertőzött növényi szövetekben az AOF mérésén kívül számos más mérési lehetőség is van, amely mérések
eredményei közvetve utalnak az AOF megnövekedett mennyiségű, a természetestől eltérő jelenlétére. Ide
tartoznak az enzimatikus és nem enzimatikus antioxidánsok meghatározásai. Az enzimaktivitások és a nem
enzimatikus antioxidánsok változásának mérésére több módszer is lehetőséget nyújt. Mérhetők
spektrofotometriásan, gélelektroforézis segítségével és kemilumineszcenciásan.
Az AOF által okozott és befolyásolt kórélettani folyamatok szintén számos alternatívát nyújtanak. A nekrotikus
foltok megjelenésével járó gazda–parazita kapcsolatok esetében egyszerű indikátoros festéssel meghatározhatók
az elhalt sejtek, akár az egysejt-nekrózisok is. A nekrózisok során bekövetkező sejthalál egyik jellemző
folyamata a sejtmembránok szétesése, amely a membránpotenciál változásával, valamint elektrolit- (ion-)
kiáramlással jár. Az ilyenkor lejátszódó lipidperoxidáció az egyik legjellemzőbb folyamat. Mérése mind
spektrofotometriásan, mind termolumineszcenciásan elvégezhető.
Enzimaktivitások mérése spektrofotometriás módszerrel
A Halliwell-Asada-ciklus antioxidáns enzimeinek mérése spektrofotometriásan történik.
• Mintavétel
A mintavétel során ügyelni kell arra, hogy a fertőzött növény folyamataira jellemző mintát vegyünk. Az egyes
folyamatok erőssége levélszintenként különbözhet, mint ahogy a vírussal való fertőzhetőség is változó
levélszintenként. A különböző vírus–gazda kapcsolatok tüneti megnyilvánulása befolyásolja a mintavétel
időpontját és helyét. Az enzimaktivitások a lokális nekrotikus és klorotikus tünetek esetében a fertőzési
helyekhez közel eső szövetrészekben változnak jelentősebben, így a foltokat közvetlenül körülvevő, még zöld
szövetrészekből vegyük a mintát. Az egészséges növény példányai között is lehetnek jelentős eltérések az
élettani folyamatokban, ezért a nagyszámú mintavétel ajánlott.
• Nyers enzimkivonatok készítése
a. A levélszövetet, mintánként 0,5 g-ot, 3 ml hideg homogenáló pufferben, előhűtött dörzsmozsárban
eldörzsöljük. A homogenáló puffer 0,05 M-os TRIS-HCl-puffer (7,8 pH), amely 7,5% (w/v) polivinil-
pirrolidont (vízoldható) és 1 mM EDTA-Na2-t tartalmaz.
b. A homogenizátumot centrifugáljuk (5000 g, 20 perc, 4 °C), és a felülúszót alkalmazzuk az aktivitások
méréséhez.
• Aktivitások meghatározása
A spektrofotometriás méréseket ellenőrzött hőmérsékletű küvettaházban, 25 °C-on végezzük (Shimadzu-
CPS240A spektrofotométer).
• Aszkorbát-peroxidáz (AP) aktivitásának mérése
Az AP aktivitásának mérése Nakano és Asada (1981) módszere alapján történik.
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
249 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
a. Az aktivitásmérő elegy 2,25 ml végtérfogatában 2 ml 0,2 M-os TRIS-HCl-puffert (7,8 pH), 100 μl 5,625
mM-os aszkorbinsav-oldatot, 50 μl nyers növényi enzimkivonatot és 100 μl 11,25 mM-os hidrogén-peroxid-
oldatot tartalmaz.
b. Az abszorpcióváltozást kvarc küvettában 290 nm-en 3 percig mérjük.
c. Ezt követően újabb aktivitásmérő elegyet készítünk, amely nem tartalmaz hidrogén-peroxidot, és újabb 3
percig követjük az aszkorbinsav fogyását. Az aszkorbinsav moláris extinkciós koefficiense 290 nm-en 2,8
mM–1 cm–1. Az aktivitás kiszámolásánál a két mérés különbségét alkalmazzuk:
• Dehidroaszkorbinsav-reduktáz (DHAR) aktivitásának mérése
A DHAR aktivitásának mérése Asada (1984) módszere alapján történik.
a. Az aktivitásmérő elegy 2,3 ml végtérfogatában 2 ml 0,05 M-os nátrium-foszfát-puffert (a puffer tartalmaz
0,1mM EDTA-Na2-t, pH 6,5), 100 μl 0,5 mM-os dehidroaszkorbinsav-oldatot (a dehidroaszkorbinsavat és a
glutationt pufferben oldjuk), 100 μl 1 mM-os redukált glutationoldatot és 100 μl nyers növényi
enzimkivonatot tartalmaz.
b. Az abszorpcióváltozást 3 percig 265 nm-en kvarc küvettában mérjük, majd újabb aktivitásmérő elegyet
készítünk növényi enzimkivonat nélkül, és újabb mérést végzünk. Az aszkorbinsav moláris extinkciós
koefficiense 14 mM–1cm–1. Az aktivitás számításánál a két mérés különbségét alkalmazzuk.
• Glutation-reduktáz (GR) aktivitásának mérése
A GR aktivitásának mérését Halliwell és Foyer (1978) módszere alapján végezzük, figyelembe véve Klapheck
et al. (1990) módosításait.
a. Az aktivitásmérő elegy 2,5 ml végtérfogatában 2 ml 0,2 M-os TRIS-HCl-puffert (7,8 pH), 100 μl 2,4 mM-os
NADPH-t, 300 μl 5 mM-os oxidált glutationoldatot és 100 μl nyers növényi enzimkivonatot tartalmaz.
b. Az abszorpcióváltozást 3 percig 340 nm-en mérjük, majd új reakcióelegyet készítünk, melyhez nem adunk
glutationt, és ismételjük a mérést. A glutation moláris extinkciós koefficiense 6,2 mM–1cm–1. Az aktivitást itt
is a két mérés különbségéből számoljuk.
Elhalt sejtek festése Evans-kék indikátorral
Aktív oxigénformák és antioxidáns
enzimrendszerek
250 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A fertőzött növény leveleiből levélkorongokat vágunk, amelyeket Evans-kék biológiai indikátor 1%-os
desztillált vizes oldatával infiltrálunk, és 15 percig inkubáljuk. Az infiltrálást a gazda-parazita kapcsolattól
függően különböző időközönként végezzük. Az Evans-kék csak az elhalt sejteket festi meg. A szöveteket
fénymikroszkóppal vizsgáljuk, fényképezőgéppel felvételeket készítünk.
Az ionkiáramlás mérése levélkorongokból
A sejthalál jól jellemezhető az ionkiáramlás mérésével. A módszer az oldatok vezetőképességének változásán
alapul. A fertőzött növény leveleiből az egyes mérésekhez 5–5 levélkorongot vágunk (∅ = 9 mm). A
levélkorongokat fonákjukkal felfelé, 5 ml desztillált vízben úsztatva, szobahőmérsékleten 3 órán át inkubáljuk.
Ezt követően konduktivitásmérővel mérjük az úsztatóoldat vezetőképességét (Mittler et al., 1996).
A lipidperoxidáció mérése
A lipidperoxidáció mérését spektofotometriásan végezzük Heath és Packer (1968) módszere alapján, figyelembe
véve Dhindsa et al. (1981) módosításait. A módszer elve a malondialdehid (MDA) mérésén alapul, amely a
lipidperoxidáció során keletkező korai termék.
a. Mintánként 0,5 g levelet folyékony nitrogénben fagyasztunk, majd dörzscsészében elporítunk.
b. Az így előkészített mintákat 2 ml 0,2 M-os citrát-foszfát-pufferben (6,5 pH) – ami tartalmaz 0,5% Triton-X
100 detergenst is – szuszpendáljuk, majd a homogenátumot centrifugáljuk (20 000 g, 15 perc).
c. A felülúszó 1 ml-ét 2 ml, hűtött, 0,5%-os (v/v) 2-tiobarbitursavat (TBA) tartalmazó 20%-os (w/v) triklór-
ecetsavval elegyítjük, és 95 °C-os vízfürdőn 45 percig inkubáljuk, végül 15 percig olvadó jégben hűtjük.
d. Centrifugáljuk, s az így kapott felülúszó abszorbanciáját 532 nm-en mérjük.
e. A nem specifikus abszorbanciát 600 nm-en mérjük, és a kapott adatot kivonjuk az előző mérésből. Az így
kapott adatot használjuk az MDA extinkciójának számításánál. Az MDA moláris extinkciós koefficiense 155
mM–1cm–1.
251 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
18. fejezet - A vírus-ellenállóságra nemesítés hagyományos módszerei
A nemesítés évezredes tudatos emberi tevékenység, amelynek során valamely kedvező tulajdonságot homogén
populációkban alakítanak ki. Erre a tradicionális nemesítésben két lehetőség van: (1) keresztezés, amely a
mendeli öröklődés ismeretében a megfelelő szülőpárok kiválasztásán alapuló szexuális hibridizálás és (2)
kiválogatás, amely megadott szempontok szerinti elkülönítést jelent. A nemesítés fő célja a piacképes, jó
minőségű, kórokozókkal és kártevőkkel szemben ellenálló, jó termőképességű fajták előállítása. A növényi
kórokozók terméscsökkentő és minőségrontó hatásának felismerésével a betegség-ellenállóság kialakítása egyre
fokozottabb elvárás lett. A vírusbetegségek elleni kémiai védekezés eredménytelensége miatt a vírus-
ellenállóságra nemesítés különösen nagy jelentőségű (Kappert és Rudorf, 1958; Wiersema, 1972; Horváth,
1983, 1984, 1988; Spaar és Kleinhempel, 1985; Burton, 1989; Ross, 1986; Huisman et al., 1992; Foxe, 1992;
Kegler és Friedt, 1993; Kyle, 1993; Bradshaw and MacKay, 1994).
1. A rezisztenciára nemesítés fő irányai
A rezisztencia formáit a növényben meglévő természetes ellenálló képesség szerint csoportosíthatjuk aszerint,
hogy a rezisztencia a kórokozó megtelepedése vagy a betegség kialakulása ellen hat (Gáborjányi és Tóbiás,
1984). Az így kialakított ellenálló képesség lehet nem specifikus (horizontális), ami egy adott kórokozó minden
törzse ellen védettséget ad, és lehet törzsspecifikus (vertikális), ahol az ellenálló képesség a kórokozó egy-egy
törzsével szemben eredményes. A genetikailag ellenőrzött vírusrezisztencia két csoportba osztható: 1. a
monogének vagy poligének által szabályozott kvalitatív lokalizált rezisztencia, és 2. a többnyire poligének által
szabályozott kvantitatív, nem lokalizálódó rezisztencia (Fraser, 1986; Spaar et al., 1992).
1.1.
1.1.1.
1.1.1.1.
1.1.1.1.1. Fertőzéssel szembeni ellenálló képesség
A fertőzéssel szembeni ellenállóság kialakításának célja a kórokozó távol tartása az egyébként fogékony
növénytől. A növény fertőzés előtti tulajdonságán (axenia) alapul: vastag kutikula, szőrözöttség stb. (ezek
meggátolják a fertőzést és a vektorok tevékenységét). Ez a képesség ugyan nem nyújt tartós védelmet, de
gyakran az ún. „szabadföldi ellenállóságot” eredményezi. Többnyire vad fajokkal való keresztezés útján
alakítható ki. Jelentősége alárendelt.
1.1.1.1.2. Túlérzékenységre (hiperszenzitivitásra) irányuló nemesítés
Mint ismert, a növények egy része a fertőzéssel szemben túlérzékeny, azaz hiperszenzitív. A fertőzést követő
túlérzékenységi reakció (HR) nyomán gyors lokális nekrózis fejlődik ki, ami az esetek nagyobb részében a
biotróf kórokozó lokalizálását is eredményezi. A HR-t a fertőzött levelek szeneszcenciája követheti, és a
leválasztó szövetréteggel rendelkező növényfajoknál a levelek lehullanak (amputációs rezisztencia). Mindez azt
jelenti, hogy a HR-rel rendelkező növények nem fertőzött részei egészségesek maradnak (sőt, bizonyos
mértékben egy újabb fertőzés elleni indukált szisztemikus rezisztenciára tesznek szert). A hiperszenzitivitásra
irányuló nemesítés igen elterjedt, általában egy gén által szabályozott. Eredményessége nagyrészt a környezeti
tényezőktől befolyásolt, és új, a rezisztenciát áttörő patotípusok, vírustörzsek kialakulását eredményezi. Ismert a
szisztemikus nekrózisképzés is (Foxe, 1992). Ebben az esetben a fertőzött növény elpusztul.
1.1.1.1.3. A betegséggel szembeni ellenálló képesség kialakítása
Szintén örökletes tulajdonságon alapul. Kialakítása szempontjából a vírus replikációja és növényen belüli
elterjedése, azaz transzlokációja a döntő tényező, ezekre összpontosul a nemesítés fő iránya. Célja a teljes és
tartós ellenálló képesség (extrém rezisztencia vagy immunitás) kialakítása minden ismert törzs fertőzésével
szemben. Az öröklődés általában egy (vagy kevés) gén jelenlétén alapul.
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
252 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1.1.1.1.4. Toleranciára nemesítés
A legtöbbször, kultúrnövényekhez közel álló vad fajokból származó rezisztenciát biztosító gének hiányában,
meg kell elégedni a toleranciával. A toleráns fajok ugyanarra a fertőzésre gyengébb tünetekkel vagy kisebb
termésveszteséggel válaszolnak, tehát hasznos tulajdonságok hordozói. Ugyanakkor a kórokozó a toleráns
növényben is replikálódik, ezért másodlagos fertőzési forrást jelent.
2. A rezisztenciagének működése egyes növényfajokban
Jelenlegi ismereteink szerint 101 vírusrezisztencia-gén ismert a potyvirusokkal és 24 gén a cucumovirusokkal
szemben. A legtöbb ismert gén a Solanum fajokban (25) és a Nicotiana fajokban (22) található (Kegler és Spaar,
1993).
A dohány N-gén működése és a hiperszenzitivitás
A vírusfertőzéssel kapcsolatos hiperszenzitivitás felfedezése Holmes (1929) nevéhez fűződik. Amikor az enyves
dohányt (Nicotiana glutinosa) a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) közönséges (U1) törzsével
fertőzte, akkor az inokulált leveleken lokális léziók képződését (HR) figyelte meg. A helyi nekrózisok a
fertőzést teljesen lokalizálták, a rezisztencia minőségi jellegű, azaz teljes volt. A N. glutinosa és a kultúr
dohányfajták (N. tabacum) keresztezésével olyan hibrideket állított elő, amelyek szintén hiperszenzitivitáson
alapuló rezisztenciát mutattak a vírus fertőzésével szemben. A hiperszenzitív rezisztenciát biztosító „nekrotikus”
N-gén dominánsan öröklődik. Az N-gén hőmérsékletfüggő, 32 °C felett nem működik, és a korábban lokalizált
fertőzés szisztemikussá válik. A hiperszenzitív rezisztenciagén nemcsak dohány–dohány mozaik vírus (tobacco
mosaic tobamovirus) kapcsolatban hőmérsékletfüggő, hanem ismert az is, hogy pl. 32 °C felett a Gomphrena
globosa vagy a Capsicum chinense (PI 152225) hiperszenzitív reakciója (nekrotikus lokális léziók) a
paradicsom bokros törpülés vírussal (tomato bushy stunt tombusvirus), ill. a paradicsom bronzfoltosság vírussal
(tomato spotted wilt tospovirus) szemben szisztemikussá válik, tehát a magas hőmérséklet képes a
hiperszenzitív rezisztencia áttörésére (Redolfi et al., 1977; Roggero et al., 1996). Az N-gén rezisztenciáját a
virulensebb tobamovirusok (pl. paprikáról izolált Ob törzs) áttörik (Csilléry et al., 1983). A legtöbb
információval az N-gén működésével kapcsolatosan rendelkezünk. Számos dohányfaj és vad Nicotiana faj
(közöttük legjelentősebb a N. sylvestris, N. suaveolens) tartalmazza az N’-gént (105A ábra). Két dohány mozaik
vírus törzsből készített hibrid nukleinsavak fertőzésével izolálni lehetett a vírus azon nukleotid szekvenciáit,
amelyek a nekrózis kialakulását szabályozzák, és a dohány genomjában is sikerült már azonosítani HR-felelős
géneket.
105. ábra - Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc (A), Nicotiana suaveolens (balról fertőzött,
jobbról egészséges, kontroll növény) (B) és Datura stramonium (C) hiperszenzitív
rezisztenciája a dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) szemben.
Burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) fertőzött Capsicum annuum cv. Bogyiszlói
szisztemikus tünetei (D)
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
253 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az N-gén eredményessége a sejtfaltól függ. Az N-gént tartalmazó dohányok protoplasztjai ugyanúgy
fertőzhetők vírussal, mint a fogékony fajták protoplasztjai, bennük a vírusreplikáció azonos mértékű, bár a
rezisztens növény protoplaszt-kultúrszűrletéből vírusreplikációt gátló anyagot (IVR) izoláltak (Loebenstein és
Gera, 1981). Ma már számos vírusrezisztencia-hordozó dohányfajta, ill. -törzs ismert (24. táblázat).
24. táblázat - Nicotiana tabacum fajták és törzsek vírusrezisztenciája
Rezisztenciahordozó
növények
Vírusok1
TMV PVY CMV TSW
V TEV TNV
TVM
V
CV + +
Zlatolist + + +
Bulgáriai törzs +
+
Kentucky-hibrid
(71698) +
+
Ky 15 + +
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
254 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
T1 245 + +
+
Trapezond + +
TI1 406 +
+
1 TMV, tobacco mosaic tobamovirus (dohány mozaik vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus);
CMV, cucumber mosaic cucumovirus (uborka mozaik vírus); TSWV, tomato spotted wilt tospovirus
(paradicsom bronzfoltosság vírus); TEV, tobacco etch potyvirus (dohány karcolatos vírus); TNV, tobacco
necrosis necrovirus (dohány nekrózis vírus); TVMV, tobacco vein mottling potyvirus (dohány érfoltosság
vírus).
A paradicsom Tm-gén és a kvantitatív rezisztencia
A paradicsom mintegy negyven vírussal szemben fogékony. A paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic
tobamovirus) tüneteit paradicsomon a Tm-gének szabályozzák. A Tm-O típusú izolátumokkal szemben a Tm-1
gén nyújt bizonyos fokú ellenálló képességet. A rezisztencia nem a fertőzés blokkolásán (HR), hanem a
replikáció visszaszorításán és ezáltal a szisztemikus tünetek kifejlődésének gátlásán alapul. Ilyen szempontból
tehát toleranciagén, mennyiségi jellegű. Ilyen esetben a kórokozó – csökkent mértékben – a rezisztens fajtákban
is szaporodhat. A Tm-1 gén az O típusú izolátumok replikációját homozigóta fajtákban 95%-ban gátolta, míg a
heterozigótáknál ez az érték csak 70% volt (Fraser és Loughlin, 1980, 1982). Ez a körülmény kedvez az új
vírustörzsek kialakulásának, annál is inkább, mert a magas hőmérséklet a rezisztenciát megszünteti.
Magasabb fokú, extrém rezisztenciát adnak a Lycopersicon peruvianum növényből származó Tm-2 és a Tm-22
gének. A rezisztens növények normális hőmérsékleten tünetmentesek, vagy alig látható nekrózissal reagálnak a
fertőzésre. Jelenlegi ismereteink szerint hatvan olyan paradicsomfajta, ill. hibrid ismert, amely tartalmazza a
Tm-1 és Tm-22 rezisztenciagéneket. A Tm-22 gént eddig még egyetlen vírustörzs sem volt képes áttörni.
Vírusokkal szemben az alábbi rezisztenciahordozók ismertek (25. táblázat).
25. táblázat - A paradicsom vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után
módosítva)
Vírusok1 Lycopersicon spp. rezisztenciahordozók
CMV2 L. cheesmanni, L. hirsutum, L. penelli
TMV Craigella-vonalak
TMV + CMV L. esculentum, L. peruvianum
PVY L. esculentum cv. Angela, L. pimpinellifolium, L.
peruvianum var. dentatum,
L. peruvianum var. humifusum
TMV L. peruvianum
PVX Lycopersicon-vonalak
PVY P.I. 13782-46-I-I-m, L. chilense
TSWV3 L. pimpinellifolium, L. peruvianum, L. esculentum cvs Rey
de los Tempranos,
Pearl Harbour, Manzana
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
255 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1 TMV, tobacco mosaic tobamovirus (dohány mozaik vírus); CMV, cucumber mosaic cucumovirus (uborka
mozaik vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus); PVX, potato X potexvirus (burgonya X-vírus);
TSWV, tomato spotted wilt tospovirus (paradicsom bronzfoltosság vírus).
2 A CMV [cucumber mosaic cucumovirus (uborka mozaik vírus)] rezisztenciahordozóinak meddőségi problémái
miatt a rezisztencia öröklődése biztonságosan nehezen tanulmányozható.
3 A TSWV [tomato spotted wilt tospovirus (paradicsom bronzfoltosság vírus)] L. peruvianum növény esetében
módosító gének jelenlétében fő domináns génnel öröklődik (Watterson, 1993).
A paprika inkomplett rezisztenciáját biztosító L1-gének
A paprikát fertőző vírusok száma 40 felett van, és eddig több mint 20 vírus spontán előfordulását állapították
meg (Horváth, 1986a). A paprika vírusokkal szembeni affinitására jellemző, hogy a virológiai irodalomban a 8
új Capsicum faj számos vírusra fogékony (Horváth, 1986b) (105D ábra). A paprikapatogén vírusok közül az
egyik legveszélyesebb vírus a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus). A dohány mozaik vírus
ellenállóságát a Li-gének (inkomplett) szabályozzák (Lippert et al., 1965). Ezek a gének a vírusfertőzést elvileg
hiperszenzitív reakcióval lokalizálják, de ez nem nyújt teljes körű védelmet minden tobamovirus fertőzés ellen.
A vírus U1 törzsével szemben a L1 rezisztenciagént hordozó fajták (L1/L1) lokális rezisztenciát nyújtanak, amit
más tobamovirusok [paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus), paprika enyhe foltosság vírus
(paprika mild mottle tobamovirus)] áttörnek. A Capsicum frutescens növényből származó L2 gén a paradicsom
mozaik vírussal szemben nyújt ellenálló képességet, míg a teljesebb védelmet a Capsicum chinense L3 génje
jelenti (Csilléry et al., 1983; Gáborjányi és Tóbiás, 1984; Moór és Zatykó, 1995; Zatykó és Moór, 1995). A
Capsicum chacoense L4 rezisztenciagén átvitele paprikafajtákba is eredményesnek ígérkezik. Már van olyan
paprikafajta (Himes), amely a legnagyobb rezisztenciával tűnik ki (Csilléry, 1995; Sági és Salamon, 1998). A
26. táblázat a Capsicum genotípusok és a tobamovirus patotípusok közötti kapcsolatot mutatja be.
26. táblázat - A Capsicum genotípusok rezisztenciája és a tobamovirus patotípusok
közötti kapcsolat (Boukema, 1984 után)
Capsicum fajták és
származékok Rezisztenci
a genotípus
Tobamovirus patotípusok1
P0 P1 P1, 2 P1, 2, 3
C. annuum cv. Early
Calwonder L+ L+ + + + +
C. annuum cv. Bruinsma
Wonder L1 L1 – + + +
C. frutescens cv. Tabasco L2 L2 – – + +
C. chinense PI 159236 L3 L3 – – – +
C. chacoense PI 260429,
SA 185 L4 L4 – – – –
1 + = Fogékony (szisztemikus mozaik), – = lokális léziók (nem szisztemikus), rezisztens.
Újabb kutatások során megállapítást nyert, hogy a Capsicum annuum (C. annuum cvs Avelar, Criollos de
Morelos, Jupiter, RNaky), C. annuum var. minimum, C. annuum var. piramidale, a Capsicum chinense (PI
152225, PI 159234, PI 159236), a C. frutescens (BG2814-6) fajtákban, ill. fajokban és származékaiban
rezisztenciát állapítottak meg néhány potyvirussal, a paradicsom bronzfoltosság vírussal (tomato spotted wilt
tospovirus), az uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) és a dohány nekrózis vírussal (tobacco
necrosis necrovirus) szemben (Horváth, 1986c; Valkonen et al., 1996; Grube et al., 1998). Hiperszenzitív
rezisztenciát állapítottak meg néhány fajban: Capsicum annuum var. longum [uborka mozaik vírus (cucumber
mosaic cucumovirus)], C. barbatum var. pendulum [burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), paradicsom
magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus)], C. praetermissum [paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
256 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
tobamovirus)], C. pubescens [uborka mozaik vírus, burgonya Y-vírus, paradicsom mozaik vírus, dohány mozaik
vírus (tobacco mosaic tobamovirus)] (Horváth, 1986c).
Figyelemre méltó a Capsicum annuum növényekben kimutatott komplex vírusrezisztencia (27. táblázat).
27. táblázat - A paprika komplex vírusrezisztenciája (Spaar és Kleinhempel, 1985 után)
Vírusok1 Rezisztenciahordozók
CMV + TMV C. annuum – K 2002 törzsek 97, 157, 187
PVY + TEV C. annuum – P 11, S.C. 46252, C. chinense
PVY + TMV Agronomico 9, 10, 11, 12
CMV + TMV + PVY C. annuum – Yolo Y, Agronomico 8,
Quadrato d‟ Asti,
Corno di Bue
PVY + TMV + TEV C. annuum – Florida VR-2, S.C. 46252,
C. frutescens – Tabasco
PVY + TEV + PepMoV C. annuum – Avelar 234, Delray Bell
TRSV + PVBV + PVMV C. annuum – DH 2-4, DH II-5
PVY + TEV + TMV +
PepMoV C. annuum – Tam mild Jalapeno I
PVY + PVBV + PepMoV +
TRSV C. annuum – Byadgi × Puri Orange
1 CMV, cucumber mosaic cucumovirus (uborka mozaik vírus); TMV tobacco mosaic tobamovirus (dohány
mozaik vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus); TEV, tobacco etch potyvirus (dohány karcolatos
vírus); PepMoV, pepper mottle potyvirus (paprika foltosság vírus); TRSV, tobacco ringspot nepovirus (dohány
gyűrűsfoltosság vírus), PVBV, pepper vein banding virus (paprika érszalagosodás vírus); PVMV, pepper veinal
mottle potyvirus (paprika érfoltosság vírus).
A Capsicum annuum cv. CM 334 (mexikói paprika vonal) növény genetikai szegregációs analízise során
megállapították, hogy a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) és a paprika foltosság vírussal (pepper mottle
potyvirus) szembeni rezisztenciájáért két gén felelős. A pr4 gén a domináns, és mindkét vírus eddig ismert
patotípusaival szemben aktív. A pr5 gén recesszív, és csak a burgonya Y-vírussal szemben érvényes (Dogimont
et al., 1996). Legújabban uborka mozaik vírussal (cucumber mosaic cucumovirus) szembeni rezisztenciát
mutattak ki a Capsicum annuum cv. French Perennial és a C. frutescens BG 2814-6 fajtában (Grube et al., 1996,
1998).
Az ellenőrzés módszere
• Paprikafajták tobamovirus-ellenállóságának vizsgálata mechanikai inokulációval
a. Kifejlett szikleveles paprikanövények szikleveleit mechanikai módszerrel különböző patotípusú
tobamovirusokkal (28. táblázat) inokuláljuk. Az inokulumforrás leveleit 1:5 arányban (g/cm3), 0,1 M
Sörensen-féle foszfát-pufferrel (pH 7,0) hígítjuk, a leveleket celittel vagy karborundumporral finoman
beszórjuk. A levelek inokulációját üvegspatulával végezzük. Az inokulációt követő két hétig a növényeket
ellenőrzött hőmérsékleten (25 °C), termosztátszobában tartjuk (Anonymous, 1994).
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
257 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
28. táblázat - Paprikafajták tobamovirus-ellenállósága
Fajták
Vírusok1
Rezisztenci
a jellege
TMV-U1
P0
ToMV-
Ob P1, 2 PMMV-
SL P1, 2, 3
Tünetek2
Fecske –/SMo –/SMo –/SMo L+
Keszthelyi
rezisztens NLL/– –/SMo –/SMo L1
Greygo NLL/– –/SMo –/SMo L2
Novares NLL/– NLL/– –/SMo L3
Himes NLL/– NLL/– NLL/– L4
1 TMV-U1, dohány mozaik vírus U1 törzse (U1 strain of tobacco mosaic tobamovirus); ToMV-Ob, paradicsom
mozaik vírus Ob törzse (Ob strain of tomato mosaic tobamovirus); PMMV-SL, paprika enyhe foltosság vírus SL
törzse (SL strain of pepper mild mottle tobamovirus).
2 A tünetek rövidítései és magyarázata A biotesztek virológiai alkalmazása c. fejezetben található
b. A fertőzött növényeket rovarmentes üvegházban neveljük legalább két hétig. A lokális tüneteket az első
héten naponta, majd a szisztemikus tüneteket hetenként egyszer értékeljük.
Megjegyzés: A legalacsonyabb, P0 patotípusú dohány mozaik vírus U1 törzs (tobacco mosaic tobamovirus U1
strain = TMV-U1) (Siegel és Wildman, 1954) fertőzésére fogékony (L+ genotípusú) Fecske fajta inokulált
levelein nincsenek tünetek, de a fertőzést követő két hét múlva szisztemikus mozaikfoltosság alakul ki a csúcsi
leveleken. Ez a fajta minden paprikapatogén tobamovirus fertőzésére fogékony. A Rezisztens Keszthelyi fajta
már a P0 patotípusú TMV-U1 törzs fertőzésével szemben rezisztens, az inokulált leveleken a lokális nekrózisok
gátat szabnak a kórokozó szisztemizálódásának, ugyanakkor fogékony a magasabb patogenitású vírustörzsekkel
(P1, P1, 2, P1, 2, 3) szemben (L1 rezisztenciatípus). A Greygo fajta már magasabb rezisztenciaszintet mutat (L2), de
rezisztenciáját elveszti egy magasabb patogenitású törzs (P1) fertőzésével szemben. A Novares már az L3
rezisztenciagént is hordozza, tehát reziszens a P1, 2 patotípusú paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic
tobamovirus) Ob törzs (Csilléri et al., 1983) fertőzésére, de fogékony a P1, 2, 3 patotípusú paprika enyhe foltosság
vírus (paprika mild mottle tobamovirus) SL-törzs (McKinney, 1952; Wetter et al., 1984) fertőzésével szemben.
Az L4 gén védettséget ad az eddig ismert valamennyi patotípus fertőzésére. Eltérő patogenitású törzsek
inokulációjával elvileg minden paprikafajta tobamovirus-rezisztenciaszintje megállapítható.
2.1.
2.1.1.
2.1.1.1.
2.1.1.1.1. A burgonya rezisztenciagénjeinek szerepe a vírusellenállóságban
A burgonya biológiai leromlása – amelyet a kedvezőtlen környezeti feltételek is elősegítenek – az egyre inkább
fokozódó vírusfertőzésekre vezethető vissza. A leromlásban mintegy 30 vírus vesz részt, de ismert, hogy a
burgonyát mintegy 266 kórokozó és kártevő károsítja (Mendoza, 1986). A fontosabb vírusok a következők:
burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), burgonya X-
vírus (potato X potexvirus), burgonya S-vírus (potato S carlavirus), burgonya M-vírus (potato M carlavirus),
burgonya A-vírus (potato A potyvirus), dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus). E kórokozókkal szemben
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
258 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
a különböző vad Solanum fajok eltérő magatartást mutatnak. Jelenlegi ismereteink szerint ma már több mint 150
vad gumós Solanum faj ismert, és mintegy 5 ezerre becsülhető a primitív burgonyaklónok száma (Huaman,
1986; Ochoa, 1990). Igen jelentős azoknak a fajoknak a szerepe, amelyek vírusrezisztencia-tulajdonságaiknál
fogva az európai burgonyafajtákban mint keresztezési partnerek vesznek részt. A Solanum demissum 335, a S.
tuberosum ssp. andigena 298, a S. stoloniferum és a S. vernei 41–41, a S. acaule 39, a S. phureja 27, a S.
spegazzini 11, a S. chacoense 10 fajtában található meg (Hermsen, 1989). A legfontosabb genetikai anyagok
(vad Solanum fajok) rezisztenciatulajdonságát a 29. táblázatban foglaltuk össze.
29. táblázat - A genetikai bázis (Solanum fajok) vírusrezisztenciája (Horváth, 1988
után) 1, 2, 3
Solanum fajok/fajták Fertőzéssel
szembeni
rezisztencia
Túlérzékenys
égi
rezisztencia
(HR-rezi
sztencia)
Immunitás
Solanum acaule PLRV PVX, PVY PVX
S. cardiophyllum PVM
S. demíssum PLRV, PVY PVA, PVX,
PVY
S. megístacrolobum,
EBS 1787
PVM, PVS
S. microdontum PVM, PVS
S. phureja PVY
S. stoloniferum PVY, PVA PVY, PVA
S. tuberosum ssp.
andigena
PVS PVX, PVY
S. tuberosum ssp.
tuberosum
PVX
S. vernéi PVY PVY, PVA
S. tuberosum cv. Arran
Pilot
TRV
1 PLRV, potato \safro\\polerovirus (burgonya levélsodródás vírus); PVA, potato Apotyvirus (burgonya
A-vírus); PVM, potato M carlavirus (burgonya M-vírus); PVS, potato S carlavirus (burgonya S-vírus); PVX,
potato X potexvirus (burgonya X-vírus); PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus);TRV, tobacco rattle
tobravirus (dohány rattle vírus).
2 A Solanum phureja rezisztens a Pseudomonas solanacearum baktériummal szemben is.
3 Barker (1996) újabban a Solanum stoloniferum vad fajból származó dr. Macintosh és Maris Piper
burgonyafajtákban - amelyek immunitást (Ry-gén) mutattak a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) törzseivel
(PVY°, PVYN, PVYNTN) szemben - egy korábban nem ismert Ra-gént is kimutatott; ez a gén a burgonya A-vírus
(potato Apotyvirus) rezisztenciájáért felelős.
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
259 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A burgonya vírusrezisztenciáját szabályozó fő géneket a 30. táblázat tartalmazza.
30. táblázat - Fontosabb rezisztenciaszabályozó gének (Foxe, 1992 után)
Vírus1 A rezisztencia típusa Gén
PLRV intolerancia NI
PVY lokális hiperszenzitivitás
extrém rezisztencia Ny
Rysto
Ryadg
PVX lokális hiperszenzitivitás
extrém rezisztencia Nx,
Nb
Rx
PVS lokális hiperszenzitivitás Ns
PVM lokális hiperszenzitivitás
extrém rezisztencia Na
Rysto
TRV intolerancia Nt
1 PLRV, burgonya levélsodródás vírus (potato \eafro\\polerovirus); PVY, burgonya Y-vírus (potato Y
potyvirus); PVX, burgonya X-vírus (potato X potexvirus); PVS, burgonya S-vírus (potato S carlavirus); PVM,
burgonya M-vírus (potato M carlavirus); TRV, dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus).
• A burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni ellenálló képesség kialakítása
A vírusnak négy törzstípusa ismert: PVYN = PVYO, PVYR = PVYN, PVYC = PVYC és PVYAn = PVYAn (Horváth,
1966a,b, 1967a,b). A leggyakoribb a közönséges PVYO vagy normál törzs, amely mozaikfoltossággal, a levelek
elszáradásával vagy lehullásával jellemezhető. A nekrotikus PVYN törzs fertőzése ugyan enyhébb tünetekkel jár,
de dohányon érnekrózist okoz. A vírus legújabb törzse (PVYNTN) pedig a burgonyán gumónekrózist vált ki
(Beczner et al., 1984). A PVYC törzs levéltetű-átviteli képességét elveszítette. Ez utóbbi fertőzését az Nc gén
jelenlétében a hiperszenzitív reakció legyőzi. A rezisztenciára nemesítés iránya egyrészt az N és az R fő gének
bevitelén, másrészt a Solanum chacoense, S. demissum, S. microdontum, S. stoloniferum vad burgonyafajok
hibridizálásán alapul. Az Ny gén expressziója változó, és a domináló vírustörzstől függő, míg az Ry gén stabil és
nem vírustörzs-specifikus. Az extrém rezisztenciát adó gént a Solanum stoloniferum és a S. tuberosum spp.
andigena vadburgonyában találták meg. A rezisztenciát egyetlen domináns gén biztosítja az összes törzs
fertőzésével szemben. Ma már a legtöbb burgonyafajtában jelen van az Ry gén, amely egyéb vírusellenálló
képességgel kombinálódik (Horváth és Wolf, 1991; Barker, 1996). A kvantitatív, nem lokalizálódó és extrém
rezisztenciáért (immunitás), valamint a HR-reakcióért, ill. a kvalitatív lokalizált rezisztenciáért felelős gének a
Solanum alandiae (BGRC 27326), Solanum stoloniferum (Ryston2, Rystorna, Rystona) növényben találhatók
meg a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) és a burgonya A-vírussal (potato A potyvirus) szemben (106A
ábra). A burgonya Y-vírussal szemben további rezisztenciagének vannak a Solanum andigenum (Ryadg), S.
chacoense (Nychc), S. hougashi (Ryhou), S. pinnatisectum, S. polytrichon, S. simplicifolium, S. vernei, S. tuberosum
(Ntbr) növényekben.
106. ábra - A: a burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni hiperszenzitív
reakció (az inokulált leveleken kialakuló nekrotikus léziók) Solanum tuberosum
növényen. B: Solanum venturi (BGRC 8237) vad faj reakciója (szisztemikus mozaik) a
burgonya X-vírussal (potato X potexvirus) szemben
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
260 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
• A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) rezisztenciára nemesítés eredményei
A vírusrezisztenciát nyújtó fő gének a következők: Nb, Nx, Rx, Rxacl és Rxadg. A vírustörzsek csoportosítása annak
megfelelően történik, hogy mely rezisztenciagéneket képesek áttörni (31. táblázat).
31. táblázat - A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) törzsek csoportosítása (Foxe,
1992 után)
Gén Törzstípus1
1 2 3 4
nxnb + + + +
Nxnb – + – +
nxNb – – – +
NxNb – – – +
Rx – – - –
1 + = Fogékony; – = Rezisztens.
A leggyakoribbak a 3. csoportba tartozó törzsek, a legritkábbak a 4. típusúak. Az Rx gén minden vírustörzs ellen
hatásos, kivéve a HB bolíviai törzset. Ezeket a géneket már több fajtába sikeresen beépítették. A
vírustörzscsoportok eltérő földrajzi elhelyezkedésének nagy jelentősége van (Valkonen et al., 1994).
• A burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) szembeni ellenállóság kialakítása
Némely fajta esetében a vírusrezisztenciát adó NI fő gén jelenlétében (amit kisebb gének módosíthatnak) a
növények szisztemikus hiperszenzitivitás miatt elpusztulnak. Emiatt a nemesítési programok jó részében ez a fő
gén nem szerepel. A betegség-ellenállóság kialakítása poligénikus úton történik, amelynek kifejeződése
mennyiségi jellegű, nehezen, csak évekig tartó, magas infekciós nyomásnak kitett szabadföldi kísérletekkel
ellenőrizhető. Az ellenálló képesség kialakítása részben a fertőzés elleni védelemre, részben a vírusszintézis
csökkentésére, részben a transzlokáció megakadályozására irányul. A vírusszintézis gátlásáról több diploid
burgonyafaj (Solanum etuberosum és S. brevidens) esetén beszámoltak. Ez utóbbi fajokat a biotechnológiai
védekezés során fel is használták protoplasztfúziókra, tekintettel arra, hogy szexuális úton nem keresztezhetők a
kultúr burgonyafajtákkal. Ezek a fajok burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus), burgonya A-vírus (potato A
potyvirus) és burgonya X-vírus (potato X potexvirus) ellenállósággal is rendelkeznek (Fehér et al., 1990;
Valkonen et al., 1991, 1992; Horváth et al., 1993b, 1996).
• Egyéb burgonyapatogén vírusok
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
261 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A burgonya A-vírus (potato A potyvirus), a burgonya M-vírus (potato M carlavirus) és a burgonya S-vírus
(potato S carlavirus) gazdaságilag kevésbé jelentősek, ennek ellenére a nemesítési programokban szerepel a
rezisztencia kialakítása. Ismert, hogy a burgonya A-vírussal szemben hiperszenzitív az Na gén, míg az Ry gén
extrém ellenálló képességet nyújt (Barker, 1996). A burgonya M-vírus fertőzését a Gm domináns gén
szabályozza, amelynek működését kisebb gének kontrollálják. A burgonya S-vírus ellen az Ns gén nyújt
védelmet. A dohány rattle vírus (syn.: burgonya szártarkulás vírus; tobacco rattle tobravirus) elleni védelmet
egyetlen fő gén (Nt) adja (Foxe, 1992; Swiezynski, 1994).
3. Az extrém rezisztencia kialakítása és ellenőrzési módszerei
A burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szembeni extrém rezisztencia
• A szülőpartnerek kiválasztása és vizsgálata
A nemesítési cél meghatározását követően ki kell választani azokat a keresztezési partnereket, amelyekkel a
kitűzött cél várhatóan a leghatékonyabban és a leggyorsabban érhető el (Horváth, 1968; Ross, 1986; Foxe,
1992). Rendszerint meglévő fajtába vagy értékes nemesítési vonalba próbálják bevinni a kiválasztott
rezisztenciagént. A burgonya Y-vírussal (potato Y potyvirus) szemben extrém rezisztenciát nyújtó, dominánsan
öröklődő Ry gént Solanum stoloniferum (Rysto) és S. tuberosum ssp. andigenum (Ryadg) növényekben
azonosították. Az Rysto extrém rezisztenciát ad a burgonya A-vírussal (potato A potyvirus) szemben is, míg az
Ryadg nem. A S. stoloniferum növénnyel történő keresztezés eredményeként citoplazmatikus hímsterilitás (CMS)
lép fel az utódokban, ami a S. tuberosum sejtmagi és a S. stoloniferum citoplazmai genetikai állománya
összeférhetetlenségének a következménye. Ennek eredményeként az extrém rezisztenciát hordozó utódok csak
anyaként használhatók fel, ami a visszakeresztezési programok hatékonyságát csökkenti. A vad, illetve primitív
fajokkal történő keresztezés esetén számítani kell arra, hogy a felhasznált genotípusok kedvezőtlen tulajdonságai
(egyes morfológiai bélyegek, a kívánatosnál több gumókötés, sérülésérzékenység, rossz íz, magas
alkaloidtartalom stb.) megjelenhetnek az utódokban, ezért ha mód van rá, kultúr genotípusokat kell használni.
Ma már számos, kiváló kultúrtulajdonsággal rendelkező burgonyafajta tartalmazza az Ry gént. A nemesítési
programot a CMS figyelembevételével célszerű megtervezni. Meg kell azonban jegyezni, hogy a
fajtaszabadalom bevezetése óta a szabadalmaztatott fajták genetikai állományának felhasználásához a nemesítő,
illetve fajtatulajdonos hozzájárulása szükséges. Amennyiben valamilyen fontos ok miatt a nemesítési
programban vad fajokat használunk fel, azok különböző nemzetközi génbankokban hozzáférhetők (Horváth,
1988). Itt azonban figyelembe kell venni, hogy a vad Solanum fajok különböző származékainak rezisztenciája
eltérő lehet, ezért pontosan azonosítható vonalakat kell használni, vagy a nemesítő csoport virológusának kell
megvizsgálnia a rezisztenciaszintet (Horváth és Hoekstra, 1989; Bősze et al., 1996). A nemesítési alapanyag
külföldről, különösen más kontinensről történő beszerzése komoly veszélyeket rejt magában (Howell, 1981;
Horváth et al., 1993a). Éppen a burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) dohány érnekrózis törzsének (PVYN)
nemesítési alapanyaggal Dél-Amerikából Európába kerülése igazolja ezt a veszélyt. Ezért alapvető
követelmény, hogy a beérkezett genotípusok kórokozó-mentességét karantén körülmények között – e könyv más
fejezeteiben ismertetett – in vitro és in vivo módszerekkel igazoljuk. Mielőtt egy kiterjedt nemesítési
programban szülőpartnerként felhasználnánk valamely fajt vagy fajtát, célszerű vele megfelelő számú
tesztkeresztezést végezni, a kombinálni kívánt tulajdonságok öröklődése, valamint a fertilitási viszonyok
megállapítása céljából. Az apai vonalak pollenjének fertilitása kárminecetsavas festéssel egyszerűen
megállapítható.
• Kárminecetsavas festés
a. 5 g kármint horzsakő jelenlétében, 100 ml 45%-os ecetsavban 30 percig forralunk.
b. A festékoldatot kihűlés után leszűrjük.
c. A vizsgálandó pollenből vett mintát (min. 200 pollen) tárgylemezre helyezzük, és 2 perces kárminecetsavas
festést követően megvizsgáljuk a megfestődött pollenszemek arányát.
d. Ha a mintában 10%-nál kevesebb pollen festődik meg, akkor a vizsgált fajt (fajtát) apai szülőpartnerként
alkalmatlannak kell tekinteni.
Megjegyzés: A módszer gyors és egyszerű, megbízhatósága azonban nem minden esetben kielégítő.
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
262 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
• Fluoreszcein-diacetátos (FDA) festés
a. 0,5 ml szacharózoldathoz 1 ml acetonban feloldott 2 mg FDA-t kell adni.
b. A pollenmintát 30 percig inkubálni kell az oldatban, majd vízzel kimosni.
c. Az enzim hatására keletkezett fluoreszcinmennyiséget UV-lámpa alatt lehet vizsgálni.
Megjegyzés: Ez a módszer a legbiztonságosabb.
A partner-előállító (genetikai) vagy a közvetlen fajta-előállító program céljainak megfelelő szülőpartnerek
kiválasztása során figyelembe kell venni, hogy a keresztezés során előállított magoncokat és azok utódait
mintegy 50 tulajdonságra kell vizsgálni. Ehhez megfelelő számú magonc előállítása és megfelelő számú
keresztezési kombináció alkalmazása szükséges. A jelenleg elfogadott álláspont szerint a keresztezési
kombinációk számának növelése hatékonyabb megoldás, mint egy keresztezési kombináción belül a magoncok
számának növelése. Az egy nemesítési program (nemesítő intézet) számára évenként javasolt keresztezési
kombinációk száma 150–300, az egy kombinációban előállított magoncok száma pedig 400–500.
3.1.
3.1.1.
3.1.1.1.
3.1.1.1.1. Keresztezési technikák
A nemesítési tervnek megfelelő számú magonc előállításához mindenekelőtt a szülőpárok felneveléséről kell
gondoskodni. A szülőpartnerek mind üvegházban, mind szabadföldön felnevelhetők. A virágzás szempontjából
a környezeti tényezők közül a fénynek és a hőmérsékletnek van jelentős szerepe. A burgonya (S. tuberosum ssp.
tuberosum) a virágfejlődés szempontjából hosszúnappalos növény. A fajták között a megvilágítás időtartama
iránti érzékenység szempontjából különbségek vannak, azonban általánosan elfogadott, hogy az optimális
virágfejlődéshez legalább 16 órás megvilágítás szükséges. A túl magas és túl alacsony hőmérséklet szintén
gátolja a virágzást. Az optimális hőmérséklet 16–22 °C között van. A virágzás jelentős csökkenéséhez vezet, ha
az elültetett gumó fiziológiailag öreg (a nyugalmi időszak letelte és az ültetés között túl hosszú idő telik el).
Vannak olyan fajok és fajták, amelyek megfelelő környezeti feltételek biztosítása mellett is csak gyenge
virágzási hajlamot mutatnak. Ilyen esetben alkalmazhatók a különböző, virágzást indukáló módszerek.
A vegyszeres kezelések kivételével – amelyek hatékonyságáról eltérőek a vélemé-nyek – a módszerek többsége
a képződő fiatal gumók eltávolításán vagy a gumóképződés megakadályozásán alapul. A „téglára ültetés”
módszere esetén a téglára helyezett gumóból fejlődő növény gyökereit a mélyebb talajrétegbe vezetik. A növény
gumó feletti részéről a talajréteget lemosva a képződő fiatal gumók folyamatosan eltávolíthatók. Az
asszimiláták gumóképződéshez történő felhasználását azzal is akadályozhatjuk, ha a burgonya hajtását
paradicsom alanyra oltjuk. A keresztezések végrehajtására alkalmazott egyszerű módszer az, amikor a
szántóföldön begyűjtött, még ki nem nyílt virágzatot a kasztrálást és beporzást követően antibiotikumot
tartalmazó vízzel töltött edényekbe helyezik és üvegházi körülmények között nyerik a bogyótermést.
A szülőpartnerként kiválasztott anyai és apai vonalak virágzásának szinkronizálása nehéz feladat. Célszerű az
apai vonalak pollenjét előre begyűjteni és a keresztezésig tárolni.
• A pollen begyűjtése és tárolása
a. Az érett, de még fel nem nyílt portokokat tartalmazó virágokat szitára helyezzük és 24–48 óráig szárítjuk
szobahőmérsékleten.
b. A pollenszemek a szita rázogatásával a portokokból kinyerhetők.
c. A pollenszemek a portokokból vibrátorral frissen is kinyerhetők.
d. A pollen hűtőszekrényben, 4 °C-on 10 napig tárolható. Hosszabb tárolás estén a pollenszemeket 24–48 óráig
30 °C-on szárítjuk, majd fiolákban légmentesen lezárva –20 °C-on tároljuk. Az így tárolt pollenszemek
csírázóképességüket hosszú ideig megőrzik (a vizsgálatok szerint 19 hónap után a pollenszemek 87%-a még
csírázóképes).
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
263 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A nemesítők véleménye megoszlik abban a kérdésben, hogy szükséges-e a kiválasztott anyai szülőpartner
éretlen portokjainak eltávolítása (kasztrálás) a keresztezés előtt. Egyesek véleménye szerint az önmegporzás,
valamint a rovar- és szélmegporzás valószínűsége olyan kicsi, hogy a kasztrálás elhagyható, míg mások a biztos
keresztezési kombináció létrejötte érdekében javasolják elvégezni. A kasztrálás akkor végezhető el káros
következmények nélkül, amikor a még ki nem nyílt bimbóból a bibe kibújik.
A keresztezéseket a biztosabb megtermékenyülés érdekében célszerű a délelőtti órákban elvégezni, mert a
környezeti feltételek ebben az időszakban a legkedvezőbbek.
• Keresztezés
a. A pollen felvitelének egyszerű módja egy olyan cső alkalmazása, amelybe a bibe belefér (pl. szívószál). A
csövet a végétől néhány mm-re lezárjuk.
b. A csövet a pollenbe mártva a pollenszemek berakódnak és a bibére húzva azon megtapadnak.
c. A keresztezéskor a nem megtermékenyített (éretlen vagy elöregedett) virágokat lecsípjük, és a virágzatot a
keresztezési kombináció azonosítására alkalmas jelöléssel látjuk el.
d. A bogyók érés után gyorsan leválhatnak a kocsányról, ezért időben kell begyűjteni őket, vagy hálóból
készült, megfelelő szellőzést biztosító zacskót kell kötni köréjük.
e. A magokat keresztezési kombinációként a bogyóból kiszedjük, és mosással a bogyóhús-maradványokat
eltávolítjuk (a bogyóhús csírázásgátló anyagokat tartalmazhat). A magok a mosás és szárítás után
gyakorlatilag csírázóképesek.
f. A magokat jó nedvességtartó képességű szaporítóközegbe vetjük, 1–2 cm mélyen. A talajt folyamatosan
nedves állapotban kell tartani, esetleg a csíranövények megjelenéséig a kiszáradás ellen le lehet takarni. Ha
az elsődleges nemesítési célok között a burgonya Y-vírus elleni rezisztencia szerepel ebben a fázisban, a
magoncok 4–6 leveles fejlettségénél a tömeges inokulációt szórópisztollyal elvégezhetjük.
g. A magoncokat ezt követően olyan térállásba ültetjük ki, hogy a gumótermés tövenként elkülöníthető legyen.
Minden magonc alól 1 gumót gyűjtünk be anyatő céljára.
h. Az anyatövek, valamint a további nemzedékek (A, B és C klónok) között erős szelekciót végzünk a kívánatos
tulajdonságokra (32. táblázat).
32. táblázat - Új burgonyafajták nemesítésének vázlata (Ross, 1986 után módosítva)
Év1 Klónok
száma
Gumószá
m
klónonkén
t
Feladatok2
1
400–500 keresztezési kombináció előállítása,
legalább az egyik szülőpartner Ro-1- és
PVY-rezisztens
2 140 000
Tömeges magvetés és korlátozott negatív
szelekció
3 100 000 1 Erős szelekció a növények között
vírusfertőzésre, a gumók között termésre,
alakra, rügymélységre, hússzínre. Téli
vizsgálat Ro-1- és vírusrezisztenciára. A
késői érésű genotípusok kiszűrése érdekében
kémiai szártalanítás csak augusztus elején
végezhető
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
264 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
4 7000 7 A klónok számozása. A növekedési típus, az
érésidő és a betegségek felvételezése. Téli
vizsgálat ízre, főzési típusra,
keményítőtartalomra, elszíneződésre és
feldolgozási alkalmasságra. Ismételt vizsgálat
fonálféreg-rezisztenciára
5 1400 50 Ugyanaz, mint a negyedik évben
6
7
7
500
(100)
10
250
250
1250
Kisparcellás kísérletek. Rezisztenciavizsgálat
varasodásra, rákra, vírusokra és mindkét
nematóda faj patotípusaira. A hetedik év
végén döntés a megfelelő hivatalos
intézményeknél történő bejelentésekről
8 4 5000 Hivatalos vizsgálatok
9 4 0,75 ha Hivatalos vizsgálatok. Vetőburgonya-
termelés indítása
10 1 5 ha Hivatalos vizsgálatok. Vetőburgonya-
termesztés
1 A 6. évtől kezdve a kétséges klónok ismételt vizsgálata.
2 Ro-1, Globodera rostochiensis rassza; PVY, potato Y potyvirus (burgonya Y-vírus).
• Extrém rezisztencia ellenőrzése burgonyafajtákon (Wiersena, 1972)
Az extrém rezisztencia megléte mesterséges körülmények között is lehetővé teszi a fajták vizsgálatát már
palántakorban.
a. Magról nevelt fiatal burgonyapalántákat burgonya X-vírussal (potato X potexvirus) vagy burgonya Y-
vírussal (potato Y potyvirus) – esetleg mindkettővel – inokulálunk, felső festéktartályos magasnyomású
festékszóró pisztoly segítségével. A távolság 2–5 cm, a nyomás 1,5–2 kg/cm3.
b. A fertőzött növényeket 20–22 °C-os fóliaházban tartjuk legalább három hétig. A tünetes növényeket
eltávolítjuk, a tünetmenteseket kiválogatjuk, átültetjük. A módszer a hiperszenzitivitás ellenőrzésére kevésbé
alkalmas. A túlélő, tünetmentes növényeket szerológiailag ellenőrizzük.
c. Ha a kiválasztott növényanyag rezisztenciájáról két- vagy több év után is meg akarunk győződni, a
burgonyanövényekről hajtást szedünk, és azt burgonya X-vírussal vagy burgonya Y-vírussal (vagy
mindkettővel) fertőzött paradicsomnövényekre oltjuk kertészeti oltással. Az ellenőrzést ELISA-
vizsgálatokkal egészítjük ki.
Megjegyzés: A vírusfertőzésekhez célszerű a nekrózist okozó törzseket használni, ami a fiatal, fogékony
növényeket egy hét múlva elpusztítja, illetve azokon három héten belül tüneteket okoz. Az inokulumot használat
előtt nejlonszűrőn átszűrjük, vagy centrifugáljuk. Az inokulumhoz karborundumport keverünk, de az abrazívum
ülepedését a szórópisztoly tartályának enyhe kevergetésével meg kell akadályozni.
Multiplex rezisztenciával rendelkező genotípusok kiválasztása és tesztelése
A multiplex tulajdonságot tesztkeresztezésekkel lehet megállapítani. Ennek során a vizsgálandó genotípust
ismerten fogékony (nulliplex) partnerrel keresztezik. Az utódokat mesterségesen fertőzik, és a fertőződött
egyedek számából következtetni lehet arra, hogy a rezisztenciagént a genotípus hány lokuszon hordozza.
Számos burgonya-kórokozó, különösen a Phytophthora infestans esetében a rezisztenciát áttörő rasszok
megjelenésének nagyobb a jelentősége, mint a vírusoknál. Ilyen törzsek megjelenésének lehetősége, mint
A vírus-ellenállóságra nemesítés
hagyományos módszerei
265 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
számos példa mutatja, a vírusoknál sem zárható ki (Jones, 1985; Van den Heuvel et al., 1994; Feigelstock et al.,
1995). Ezért inkább a nemesítési program hatékonyságának növelése szempontjából van jelentősége olyan
szülőpartnerek előállításának és felhasználásának, amelyek a rezisztenciagéneket több lokuszon hordozzák. A
tetraploid burgonya esetében az érzékeny genotípusokat (rrrr) nulliplexnek, a rezisztenciagént egy lokuszon
hordozót (Rrrr) simplexnek, a két lokuszon hordozót (RRrr) duplexnek, a három lokuszon hordozót (RRRr)
triplexnek, míg a négy lokuszon hordozót (RRRR) quadriplexnek nevezik. Szülőpartnerrel történő keresztezés
esetén az utódok között az ellenálló:fogékony genotípusok aránya simplex esetén 1:1, duplex esetén 5:1. Triplex
és quadriplex szülőpartner esetén a mendeli szabályok szerint valamennyi utód rezisztens, de ennél kisebb
mértékű eltérés is lehetséges. A multiplex szülőpartnerek felhasználása lehetővé teszi, hogy az előállított
genotípusok szelekcióját más, lényeges tulajdonságra végezzük el, így a nemesítési program gyorsítható,
hatékonysága növelhető.
266 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
19. fejezet - A vírus-ellenállóságra nemesítés biotechnológiai módszerei
A vírusbetegségek elleni védekezés leghatékonyabb módja a vírusmentes szaporítóanyag előállítása és a
rezisztenciára történő nemesítés. A korszerű biotechnológiai módszerek alkalmazása mindkét területen igen
sikeres és kifizetődő. Ide szűkebb értelemben azokat az eljárásokat sorolják, amelyekben a növényi sejt
genetikai programját az ember megváltoztatja az így kialakított tulajdonságok technológiai felhasználása
érdekében. Tágabb értelemben azonban ide tartoznak a különböző szövettenyésztési módszerek is.
A laboratóriumokból kikerülő növényfajtajelölteknek természetesen a szabadföldi kísérletekben is sikeresen kell
szerepelniük, hogy azokból engedélyezett növényfajta lehessen. 1987 és 1994 között az Amerikai Egyesült
Államokban 1700 helyen végeztek szabadföldi kísérleteket genetikailag módosított, transzgénikus növényekkel.
Ezek 31%-a herbicidrezisztens (toleráns), 21%-a rovarrezisztens, 14%-a vírusrezisztens, 3%-a gombarezisztens
volt (Schiemann és Casper, 1995). Európában az ilyen szabadföldi kísérletek száma lényegesen kisebb. 1992–
1994 között Franciaországban 95, Belgiumban 59, Angliában 58, Hollandiában 51, Olaszországban 23,
Németországban 22, Spanyolországban 13, Dániában 11 és Portugáliában 4 szabadföldi kísérletet végeztek
transzgénikus növényekkel (Landsmann és Shah, 1995).
Napjainkra már több génsebészeti úton előállított, engedélyezett növényfajtát hoztak forgalomba. Az európai
piacon hímsteril (kukorica, olajrepce), herbicid- és rovarrezisztens (dohány, szója, kukorica), valamint
vírusrezisztens (burgonya, cukorrépa, dohány, paradicsom) fajták vannak. Hazánkban magyar nemesítésű
transzgénikus fajta, ill. fajtajelölt nincs (Heszky et al., 1999).
Általában elmondható, hogy a biotechnológiai módszerekkel olcsóbban és rövidebb idő alatt lehet előállítani
egy adott betegséggel szemben toleráns vagy rezisztens fajtát, mint a hagyományos, „klasszikus”,
növénynemesítési eljárásokkal (Tepfer és Balázs, 1997; Foster és Taylor, 1998). Fontos azonban megállapítani,
hogy a rezisztenciára nemesítés a modern és látványos eredményeket jelentő módszerek bevonásával is csupán
versenyfutás marad a növénynemesítő és a kórokozók újonnan megjelenő törzsei, biotípusai vagy rasszai között.
1. Szomatikus hibridizáció
Termesztett növényeink vad rokonai és ezek különböző származékai számos, jelentős gazdasági károkat okozó
vírussal szemben rezisztenciát mutatnak. Ezek a növényfajok és származékaik értékes alapanyagot jelentenek a
növénynemesítők számára. Ilyen értékes nemesítési alapanyag pl. a Solanum stoloniferum dél-amerikai vad faj
több származéka (PI. 255548, 275245, 275247, 545800 stb.), amelyek extrém rezisztenciát (immunitást)
mutatnak a rezisztenciaáttörő képességgel (resistance breaking) rendelkező burgonya Y-vírus (potato Y
potyvirus) NTN törzsével szemben (Horváth és Wolf, 1995; Bősze et al., 1996). A hagyományos nemesítési
eljárás során a kultúrnövényeket ivaros úton keresztezik a vad fajokkal (származékokkal), hogy a betegség-
ellenállóságot a kultúrfajba (fajtába) bevigyék. Az ivaros keresztezés azonban számos faj között nem lehetséges.
A protoplasztfúzió új utat nyitott a rezisztenciára nemesítésben, mert lehetővé tette, hogy a szexuális szaporodás
megkerülésével olyan fajok egyedeit is keresztezzük, amelyek ivaros módon nem hibridizálódnak és nem
hibridizálhatók egymással (Puite et al., 1988; Filippone et al., 1992; Marchant et al., 1993). A módszer azokban
az esetekben alkalmazható, melyekben protoplasztokból növényegyedeket tudnak regenerálni. A protoplaszt a
növényi sejtfal kíméletes eltávolítása után megmaradó „csupasz” – sejtfal nélküli – sejt. A protoplasztfúzió a
(szomatikus eredetű) protoplasztsejtek egyesítését jelenti. Ennek során – ellentétben a szexuális
rekombinálódással – a szülői sejtek citoplazmája is egyesül. Mivel a kórokozókkal szembeni rezisztenciát
néhány esetben a plasztidok genomja kódolja, a fúziós technikák utat nyitottak olyan egyedek létrehozására,
amelyek a citoplazmás genetikai determinánsok új kombinálódásai (cibridek) (Wenzel, 1985). A szomatikus
hibridizáció előnye, hogy a többgénes öröklődésű reziszten-ciák is átvihetők a vad fajból a termesztett fajtába. A
módszer hátránya azonban szintén abból adódik, hogy egyszerre nagy mennyiségű örökítő anyag kerül át, így
azokkal nem kívánt tulajdonságok jelenhetnek meg a nemesített fajtában. A szomatikus hibridek előállítása
három lépésben történik: 1. a protoplasztok izolálása, 2. a sejtek egyesítése (fúzió), 3. regeneráció és szelekció.
1.1.
1.1.1.
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
267 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
1.1.1.1.
1.1.1.1.1. A protoplasztok izolálása
A növények szomatikus sejtjeiről eltávolítják a sejtfalat. Ez úgy történik, hogy egy növényi szervdarabot egy
sejtfalbontó enzimeket (pektináz, celluláz, hemicelluláz – Trichoderma, ill. Rhizopus gombákból) tartalmazó
folyékony ozmotikum (általában mannitol- vagy szorbitololdat) felszínére helyeznek, és steril körülmények
között inkubálják. A sejtfaluktól megfosztott sejteket, a protoplasztokat elválasztják a törmeléktől, és
tápanyagokat tartalmazó tápoldatba helyezik.
A sejtek egyesítése (fúzió)
Jelenleg erre kétféle módszert alkalmaznak: a protoplaszt-szuszpenziókat összekeverik, és ehhez polietilén-
glikolt (PEG) adnak, vagy pedig elektromos impulzussal kezelik a sejteket. Ezekre a lépésekre azért van
szükség, hogy a negatív töltéssel rendelkező plazmalemma töltésviszonyait megváltoztassák, és így
létrejöhessen a protoplasztok összetapadása, illetve egyesülése.
A PEG-gel történő kezelés úgy történik, hogy Petri-csésze aljára csöppentett protoplaszt-szuszpenzióhoz lassan,
2–3 lépésben adják hozzá a PEG-oldatot. A végső PEG-koncentráció 15–20%, de ez növényfajoktól függ. A
PEG-es inkubálás időtartama általában 20–30 perc. Ezután a Petri-csésze felületére ülepedett protoplasztokról
óvatosan leszívják a PEG-oldatot, és a tenyészetet többször átmossák a táptalajjal. Végül ebben a táptalajban
veszik fel a sejteket.
Az elektrofúzióhoz a kis vezetőképességű mannitol- vagy glükóz-ozmotikumban szuszpendált protoplasztokat
elektromos küvettába helyezik. Ebben a technikában váltóáramnak és egyenáramnak egyaránt szerepe van.
Váltóáram hatására a sejtek – összetapadva – láncot alkotnak az elektródok közötti elektromos erővonalak
mentén, egyenáramú impulzus hatására pedig szakadások jönnek létre az érintkező membránokon. A
protoplasztok fúziója a membránok újrarendeződésekor jön létre.
1.1.1.1.2. Regeneráció és szelekció
A sejtfúziót követően a hibrid sejteket kiemelik a vad típusú protoplasztok közül. Ez mikroszkópos technikák
segítségével, illetve antibiotikumok alkalmazásával történhet. A hibrid sejtvonalakból azután hormonkezeléssel
növényeket regenerálnak. In vitro szövetkultúrákban a növényi sejtekből – a totipotenciának köszönhetően –
teljes növények regenerálódnak. A regenerált növények között nagyok lehetnek a különbségek (szomaklonális
variabilitás). Az öntermékenyülő homozigóta kultúrfajoknál a transzgénikus növények szaporítása
önbeporzással vagy az eredeti fajtával történő visszakeresztezéssel lehetséges. Az ilyen keresztezések
eredményeképpen a szomaklonális variabilitás előfordulási esélye csökken. A vegetatív úton szaporított
növényfajoknál – amelyek általában idegentermékenyülők és heterozigóták – a szomaklonális variabilitás
előfordulását a minimálisra csökkenthetjük, ha az elsődleges transzgén növények közül szelektáljuk a
fajtaazonos transzgén növényeket. A burgonya a szövettenyésztés során magas szomaklonális variabilitásra
képes. Ezért e faj esetében azokat a transzformánsokat kell szelektálni, amelyekben a szomaklonális variabilitás
nem fordul elő (Huisman et al., 1992).
A protoplasztfúzióval előállított szomatikus hibridek sokszor a további ivaros szaporításra alkalmatlannak
bizonyulnak, illetve nemkívánatos tulajdonságok is átkerülhetnek a vad fajokból. A szomatikus sejtgenetika
számos biztató eredménye ellenére is a rezisztenciára nemesítés legígéretesebb útja jelenleg mégis a
transzgénikus növények előállítása.
Protoplasztok izolálása és növények regenerálása dohányból [Nagy (1992) által módosítva]
a. Dohány (Nicotiana tabacum) hajtáskultúráit hormonmentes MS táptalajon, 26 °C-on, 2000 lux fényintenzitás
mellett, 16 órai megvilágítási idő után 8 óráig sötétben tartjuk.
b. Steril Petri-csészébe 8 ml sejtfalbontó enzimoldatot (lásd Táptalajok és oldatok) teszünk.
c. A 4–6 hetes növényekről kifejlett leveleket szedünk.
d. A leveleket fonákukkal fölfelé steril Petri-csészébe helyezzük.
e. A levelekre kevés Cellitet szórunk, és ecsettel óvatosan kenegetve megsértjük az epidermiszréteget.
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
268 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
f. A levelet sértett felületével lefelé az enzimoldat felszínére helyezzük.
g. A Petri-csészét lezárjuk, és egy éjszakán át 26 °C-on, sötétben inkubáljuk.
h. A protoplasztokat enyhe, keverő mozdulatokkal szuszpendáljuk, majd 80 μm-es nejlon szűrőn átszűrjük. A
szűrőre a sejtszuszpenziót széles szájú pipettával átvisszük.
i. A szuszpenziót 10 ml-es centrifugacsőbe helyezzük.
j. A 10 percig történő centrifugálás (60 g) után az intakt protoplasztok a folyadékoszlop felszínén sötétzöld
gyűrűt képeznek.
k. A protoplasztokat Pasteur-pipettával 8 ml-es W5 ozmotikumot tartalmazó centrifugacsőbe visszük át úgy,
hogy a táptalajból minél kevesebbet szívjunk fel, majd két percig centrifugáljuk.
l. A leülepedett protoplasztokról leszívjuk az ozmotikumot és a sejteket 1 ml K3-as táptalajban
reszuszpendáljuk.
m. Egy csepp szuszpenziót Fuchs-Rosenthal- vagy Bürker-kamrába teszünk, és mikroszkóp alatt megszámoljuk
a protoplasztokat. Ha a szuszpenzióban túl sok a sejttörmelék, a W5-tel történő mosási lépést meg kell
ismételni. Optimális esetben a protoplasztkinyerés 2–3 millió sejt/g friss növényanyag. A protoplasztfúzió
vagy a transzformálás PEG-es kezelés, illetve elektromos impulzus hatására következik be.
n. A protoplasztokat a táptalajjal 105 sejt/ml koncentrációra higítjuk. Ebből a keverékből 4 cm-es átmérőjű
Petri-csészékbe 2,5–2,5 ml-t mérünk, majd a Petri-csészéket lezárjuk és 26 °C-ra, sötétbe helyezzük.
o. A protoplaszttenyésztés, illetve a növényregenerálás a 33. táblázatban leírtak szerint történik.
33. táblázat - Protoplaszt-tenyésztés és a növényregenerálás körülményei
Idő
(nap) Táptalaj
Ozmotik
um Növekedésszab
ályzó Kezelés Fejlődési állapot
0–5 K3 0,4 M 2 mg/1 NAA,
1 mg/1 BAP
tenyésztés sötétben protoplasztok,
sejtfal-
regenerálódás,
első sejtosztódás
6–14 K3 0,4 M 1 mg/1 BAP,
0,1 mg/1 NAA
átoltás új táptalajba
10-szeres hígítással
(fény)
fejlődő kolóniák
(50–70 sejtesek)
15–28 K3 0,2 M 0,5 mg/1 BAB,
0,05 mg/1
NAA
átoltás 5-szörös
hígítással (fény) 1–2 mm-es, zöldes
kolóniák
28–50 B5
0,8% agár
3%
szaharóz
– 0,5 mg/1 BAP,
0,01 mg/1
NAA
kolóniák átoltása
agár táptalajra (fény) hajtásprimordia
40–60 MS
0,8% agár
– 0,1 mg/1 BAP,
vagy
hormonmentes
fejlődő hajtások
áthelyezése
zöld hajtások,
gyökérkezdeménye
k
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
269 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2%
szaharóz új táptalajra
60-tól MS
0,8% agár
2%
szaharóz
hormonmentes fejlődő hajtások
áthelyezése új
táptalajra
10-15 naponként
gyökeres
növénykék
1.1.1.1.3. Táptalajok és oldatok
a. Sejtfalbontó enzimoldat: 0,7% celluláz és 0,25% macerozim (Sigma) 0,4 M szaharóz-tartalmú K3
táptalajban.
b. K3-as táptalaj: Makroelemek: 2500 mg/l KNO3; 250 mg/l NH4NO3; 250 mg/l MgSO4 × 7 H2O; 300 mg/l
CaCl2 × 2 H2O; 150 mg/l NaH2PO4 × H2O; 134 mg/l (NH4)2SO4; 50 mg/l CaHPO4; 27,8 mg/l FeSO4 × H2O;
37,3 mg/l Na2EDTA. Mikroelemek: 2 mg/l ZnSO4 × 4 H2O; 3 mg/l H3BO3; 0,75 mg/l KI; 0,25 mg/l Na2MoO4
× 2 H2O; 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O; 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O. Vitaminok: 10 mg/l tiamin-HCl; 1 mg/l
piridoxin-HCl; 1 mg/l nikotinsav; 100 mg/l inozit. Cukrok: 250 mg/l xilóz; 0,4 M szaharóz (protoplaszt-
izoláláshoz); 0,4 M glükóz (sejtkultúrához). Hormonok: lásd 33. táblázat.
c. B5 táptalaj: Makroelemek: 2500 mg/l KNO3, 150 mg/l CaCl2 × 2 H2O, 250 mg/l MgSO4 × 7 H2O, 134 mg/l
(NH4)2SO4, 150 mg/l NaH2PO4 × H2O. Mikroelemek: 2 mg/l ZnSO4 × H2O, 3 mg/l H3BO3, 0,75 mg/l KI, 0,25
mg/l Na2MoO4 × 2 H2O, 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O, 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O, 13,2 mg/l MnSO4 × H2O,
27,8 mg/l FeSO4 × 7 H2O, 37,3 mg/l Na2EDTA × 2 H2O. Vitaminok:1 mg/l nikotinsav, 1 mg/l piridoxin HCl,
10 mg/l tiamin HCl, 100 mg/l mio-inozit. Hormonok: lásd 33. táblázat.
d. W5 ozmotikum: 9000 mg/l NaCl, 18 400 mg/l CaCl2 × H2O, 400 mg/l KCl, 1000 mg/l glükóz (pH 5,8).
1.2. A burgonya és a Solanum brevidens szomatikus hibridjeinek sajátosságai
A Solanum brevidens, nem gumóképző vad burgonyafaj egyes származékai ellenállóak a különböző
burgonyavírusokkal [burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll luteovirus), burgonya Y-vírus (potato Y
potyvirus), burgonya X-vírus (potato X potexvirus), burgonya andeszi látens vírus (potato Andean latent
tymovirus), burgonya A-vírus (potato A potyvirus), burgonya M-vírus (potato M carlavirus), burgonya S-vírus
(potato S carlavirus)] szemben (Jones, 1979; Austin et al., 1985; Horváth et al., 1987; Gibson et al., 1988, 1990;
Pehu et al., 1990; Fehér et al., 1990; Valkonen et al., 1991, 1992, 1995; Horváth et al., 1993, 1996). A S.
brevidens ivaros úton nem keresztezhető a Solanum tuberosum kultúrnövény fajtáival. A két faj
protoplasztfúzióval előállított vegetatív sejthibridjeiből életképes, gumóval rendelkező fajhibridek nevelhetők
fel (Austin et al., 1985; Gibson et al., 1988; Fehér et al., 1990; Pehu et al., 1990). A vegetatív hibridek még
természetesen nem rendelkeznek a kultúrburgonya-fajták összes jó tulajdonságával, de már alkalmasak arra,
hogy további keresztezési partnerek legyenek és új, vírusnak ellenálló burgonyafajtákat lehessen belőlük
előállítani (Dudits és Heszky, 1990).
Austin et al. (1985) után Helgeson (1992) szintén a S. brevidens (PI 218228) és a S. tuberosum (PI 203900)
származékaival állított elő sejthibrideket. A S. brevidens fenti származéka fertilis diploid, és rezisztens a
burgonya levélsodródás vírussal szemben, viszont rendkívül fogékony a Phytophthora infestans 0 és 4-es
rasszára. A S. tuberosum fenti származéka tetraploid, és fogékony a burgonya levélsodródás vírusra, valamint a
P. infestans 4-es rasszára, viszont rezisztens a gomba 0 rasszával szemben. A szomatikus hibridizáció olyan
fertilis hibrideket eredményezett, amelyek mindkét szülő rezisztenciáját magukban foglalták. A rezisztencia a
szexuális úton létrejövő utódokban is megnyilvánult, és a gumók minőségében is javulás következett be.
2. Molekuláris genetikai módszerek
Molekuláris genetikai módszerek segítségével olyan tulajdonságok vihetők be a növényekbe, amelyekért
egyetlen gén vagy géncsoport a felelős. E beavatkozás attól függetlenül végezhető, hogy mi az eredete
(származási helye) a beültetni kívánt gén(ek)nek. Ily módon egészen új típusú rezisztenciák alakíthatók ki,
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
270 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
mégpedig irányítottan, azaz anélkül, hogy számunkra kedvezőtlen tulajdonságok jelennének meg a fajtában. A
védettséget kialakító gén vagy gének örökíthető módon történő bejuttatása egy növénybe – mind a szomatikus
hibridizáció, mind pedig az itt tárgyalandó növénytranszformálások esetében – akkor lehetséges, ha annak
sejtjeiből egész egyedeket tudunk regenerálni.
A transzgénikus növények előállításával történő vírusok elleni védekezést a bevitt gének forrása alapján
csoportosítjuk: 1. növényi eredetű, természetes vírusellenállóság-gének, 2. vírus eredetű gének, 3. egyéb
vírusellenállóság-gének.
2.1. Védekezés növényi eredetű rezisztenciagének beépítésével
Mivel egy betegségre nézve számos fajta ellenálló, az e tulajdonságért felelős gének legkézenfekvőbb forrását
maguk a növények jelentik. E gének megtalálása és izolálása a 102–104 Mbp (megabázispár) méretű növényi
genomból nem könnyű feladat. A molekuláris genetikai módszerek (PCR alapú technikák, genomtérképezés)
rohamos fejlődése azt eredményezte, hogy napjainkban mind több rezisztenciagén azonosításáról és
klónozásáról számolnak be a szakirodalomban. Ez, elsősorban a korábbi években, a transzpozon „tagging”
módszer (transzpozon nyomon követés) (Osborne és Baker, 1995), míg újabban a molekuláris térképezési
eljárások (Tanksley et al., 1995; Paterson, 1996) sikeres alkalmazásának köszönhető. Az azonosított
rezisztenciagén-családok növekvő számának, valamint azok konzervatív régióinak köszönhetően (Ronald, 1998)
legújabban ún. degenerált oligonukleotidok felhasználásával, PCR technika segítségével emelik ki a
rezisztenciagéneket a különböző növényfajokból.
2.1.1. Transzpozon mutagenezisen alapuló génizolálás
A prokarióta és az állati sejtekhez hasonlóan a növényekben is találhatók ugráló genetikai elemek, úgynevezett
transzpozonok (Shepherd, 1988). Ezeknek az a tulajdonságuk, hogy bizonyos gyakorisággal megváltoztatják a
genomon belüli helyüket. Az integrálódott transzpozon „knock out” mutációt okoz az adott lókuszon, azaz a
gén, amelybe az elem épült, elveszti funkcióját. Az egyes növényfajokban fölfedezett transzpozonrendszerek
jelentős része két elemből áll: egy autonóm és egy nem-autonóm elemből. (Ilyen például a kukoricában
fölfedezett Ac/Ds rendszer.) A nem-autonóm elem csupán akkor képes a helyváltoztatásra, ha az autonóm elem
is egyidejűleg jelen van a genomban. A transzlokáció további feltétele, hogy a sejtben a genom replikációja
végbemenjen (S fázis). Ez csak az osztódó – merisztematikus, illetve embrionális – sejtekre jellemző. Az ugráló
genetikai elemek széleskörű felhasználását az tette lehetővé, hogy azok más növényfajokba átvihetők anélkül,
hogy tulajdonságaikat elvesztenék.
A transzpozon „tagging” módszerrel olyan gének izolálása lehetséges, amelyek fenotípusos hatása egyértelműen
nyomon követhető. Ez a rezisztenciagének esetében általában lehetséges, mivel e tulajdonságok sokszor
egygénes, domináns öröklődésűek. Ilyenek a Tm-1 és Tm-2 gének a paradicsomban, a Rx és Ry gének a
burgonyában, az N és N‟ gének a dohányban. A módszer előnye, hogy nem szükséges a keresett gén
fehérjetermékének az előzetes ismerete, illetve a magas szintű génexpresszió. Az eljárás során a transzpozonok
segítségével mutánsokat állítanak elő, majd a betegséggel szemben érzékennyé vált növényeket szelektálják.
A mutagenezis kétféle genotípusú növény keresztezésével történik (107. ábra). Az egyik a rezisztenciagénre
nézve homozigóta-domináns és nem-autonóm transzpozont tartalmaz, a másik homozigóta-recesszív és a
transzpozon autonóm párját hordozza. A két növény keresztezése után minden utódnövény heterozigóta lesz a
rezisztenciagénre nézve. Mivel azonban az utódok embrionális fejlődése során megtörténik a transzpozonok
áthelyeződése, azok a növények, melyekben az ugráló genetikai elem a keresett gén domináns alléljába
integrálódott, fogékony fenotípust mutatnak. Mivel a transzpozont molekuláris térképezés segítségével, DNS-
hibridizációs és PCR alapú módszerekkel meg tudják keresni az ilyen növények genomjában, az általuk mutált
gén velük együtt kiemelhető. Ez a DNS-fragmentum baktériumvektor-plazmidba klónozva már „kézben van”,
azaz felhasználható a legkülönfélébb molekuláris biológiai alkalmazásokra. Ilyen például a génnek, illetve a
betegséggel szembeni ellenállóképességnek más növénybe történő átvitele (növénytranszformálás).
Transzpozon nyomon követéses módszerrel izolálták a Nicotiana glutinosa növényből származó N gént, mely a
dohány mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) szembeni rezisztenciagén (Dinesh-Kumar et al., 1995).
107. ábra - A transzpozon nyomon követés lépései. Az első lépésben a domináns
rezisztenciagént (R gén) homozigóta formában tartalmazó, nem-autonóm transzpozont
hordozó növényt olyan növénnyel keresztezik, amely a transzpozon autonóm párját
tartalmazza. A nem-autonóm elem az „A” marker gént hordozza annak érdekében,
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
271 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
hogy biztosítsák jelenlétét a növényekben. Az F1 hibridben a nem-autonóm elem
transzlokációját a „B” marker gén meginduló expressziója jelzi. Ezután további
keresztezésekkel eliminálják a riporter gént és az autonóm elemet tartalmazó
kromoszómarészt, illetve szelektálják a mutáns, vírusfogékony növényeket. P =
promóter régió
2.1.2. Térképezésen alapuló génizolálás
A növényi genomtérképezés szédítő fejlődése lehetővé tette, hogy ma már ún. pozicionális vagy genomtérkép
alapú klónozással keressék a rezisztenciagéneket. Ez az eljárás gyorsabb és kevésbé fáradtságos a transzpozon
„tagging” módszernél. Az ugráló elemek ugyanis véletlenszerűen integrálódnak a genomba, így annak
valószínűsége igen csekély, hogy éppen az általunk keresett rezisztenciagént inaktiválják.
A pozicionális klónozás ezt a nehézséget küszöböli ki. Az eljárás a növényfajták egyre részletesebb genomi
térképeit használja fel. E térképeken molekuláris markereknek (jellemző DNS-szekvenciarészleteknek) a
kromoszómákon elfoglalt helyét tüntetik fel. A pozicionális klónozás során a keresett vírusellenállóság-génnek
az azonos kromoszómán lévő markerekhez viszonyított helyét állapítják meg. Ennek érdekében sokszoros
keresztezéseken keresztül nyomon követik és összevetik az utódok betegség-ellenállóságát, valamint a
molekuláris markerek pozícióit (108. ábra). Az utóbbit elsősorban olyan nagy hatékonyságú (nagyszámú
polimorf jelet előállító) „marker-technológiák” alkalmazásával végzik, mint a „random amplified polymorphic
DNAs” (RAPD) vagy az „amplified fragment length polymorphisms” (AFLP). A rezisztenciagéneket azután
molekuláris „környezetük” ismeretében genomi könyvtárakból izolálják. E módszer segítségével azonosították
Arabidopsis thaliana növényből a tarlórépa göndörödés vírussal (turnip crinkle carmovirus), illetve a dohány
karcolatos vírussal (tobacco etch potyvirus) szembeni rezisztenciáért felelős géneket (Dempsey et al., 1997;
Mahajan et al., 1998).
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
272 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
108. ábra - Rezisztenciagén-izolálás molekuláris térképezés segítségével. A: majdnem
izogén vonalak analízise (Nearly Isogenic Lines – NIL). A domináns rezisztenciagént
hordozó, vírusellenálló növényt (P1) keresztezik a fogékony fenotípusú fajtával (P2). A
heterozigóta F1 hibridet a fogékony (P2) szülővel visszakeresztezik. Az utódnövények
közül kiválogatják a rezisztens fenotípusúakat (heterozigóták), majd azokat újból a
homozigóta recesszív (P2) szülővel keresztezik. Ezt a visszakeresztezést több generáción
keresztül ismétlik, és mindig a domináns, vírusellenálló fenotípusra szelektálnak. A
kromoszómapárok rekombinációja („crossing over”) következtében a hetedik
nemzedékben szinte a teljes genom – a rezisztenciagént tartalmazó szűk régió
kivételével – a fogékony szülőtől (P2) származik. Ezek tehát majdnem tökéletesen izogén
vonalak. B: hasadópopuláció-analízis (Bulked Segregant Analyzis – BSA). A domináns
(rezisztens), illetve recesszív (fogékony) homozigóta szülők keresztezéséből származó F1
hibridet önmagával keresztezik. A hasadó F2 nemzedék egyedeit fenotípusuk alapján
két csoportra osztják. A kromoszómapárok rekombinációja („crossing over”)
következtében a rezisztenciagénnel azonos kromoszómán lévő molekuláris markerek
átrendeződnek. C: a molekuláris markereket (polimorfizmusokat) összehasonlítják a
hibrid vonalak fenotípusával, és megkeresik a rezisztenciával együtt hasadó
markereket. Ezek a keresett lókusz közvetlen környezetéből származó
szekvenciarészletek, amelyek segítségével a genomi könyvtárból izolálhatók a
rezisztenciagének
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
273 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
2.2. A kórokozótól származtatott rezisztencia
A patogéntől származtatott rezisztencia (pathogen derived resistance, PDR) felfedezését a keresztvédettség
jelenségének a felismerése tette lehetővé. Viszonylag régóta ismeretes a növényvirológiában, hogy ha egy
növényt megfertőznek egy vírussal, majd később ugyanannak a vírusnak egy súlyosabb tüneteket okozó
törzsével inokulálják a leveleket, akkor a súlyosabb tünetek már nem alakulnak ki; a második vírussal a növény
már nem fertőzhető meg. Ez a jelenség a keresztvédettség (cross protection) (McKinney, 1929; Horváth, 1969;
Matthews, 1992; Fraser, 1998). Feltételezték, hogy a második vírustörzszsel szembeni rezisztencia annak
köszönhető, hogy a sejtekben már jelen van az első vírustörzs köpenyfehérjéje. Az 1980-as évekre lehetővé vált,
hogy ez utóbbit ne vírusfertőzéssel biztosítsák, hanem a növények transzformálásával. Olyan transzgénikus
növényeket állítottak elő, amelyek a vírus köpenyfehérjét kódoló génjét megfelelő promóter mögött hordozták.
Ezek a növények saját maguk „termelték” a vírus köpenyfehérjéjét. A keresztvédettséggel kapcsolatos kísérleti
feltételezés 1986-ban beigazolódott. Powell et al. (1986) beszámoltak arról, hogy a dohány mozaik vírus
(tobacco mosaic tobamovirus) köpenyfehérjegénjét hordozó transzgénikus dohánynövények a vírussal szemben
rezisztensekké váltak. Az ilyen típusú ellenállóságot patogéntől származtatott rezisztenciának nevezik, mivel a
jelenséget kiváltó gén a kórokozóból származik. Az RNS-genommal rendelkező vírusok esetén (a legtöbb
növénypatogén vírus ilyen) ahhoz, hogy a kívánt gén a növénybe építhető legyen, a vírus cDNS klónjait készítik
el. A dohány mozaik vírussal kapcsolatos fenti kísérlet vezette be azokat a vizsgálatokat, melyek eredménye ma
már számos betegség-ellenálló növényfajtához vezetett.
2.2.1. A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
274 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A vírusoktól származtatott ellenállóság legelterjedtebb és legsikeresebben alkalmazott formája a vírus
köpenyfehérjéje által közvetített rezisztencia (coat protein mediated resistance) (Fauquet és Beachy, 1992;
Stiekema et al., 1993; Wassenegger, 1998). Ez olyan típusú rezisztencia, amelyet a növényi genomba épített
köpenyfehérjegén vált ki. Ezek a növények ellenállóak az adott vírussal és – bizonyos mértékig – a rokon
vírusokkal szemben is (Stark és Beachy, 1989; Ling et al., 1991). A Powell és munkatársai által 1986-ban közölt
kísérlet (loc. cit.) óta külföldi és hazai kutatók hasonló sikereket értek el a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic
alfamovirus), az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), a burgonya X-vírus (potato X
potexvirus), a dohány csíkosság vírus (tobacco streak ilarvirus), a burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll
polerovirus) és a különböző potyvirusok köpenyfehérjegénjével. Ma már több mint 20 vírussal szemben
állítottak elő köpenyfehérje-transzgénikus, rezisztens növényeket (Fauquet és Beachy, 1992; Stiekema et al.,
1993; Tepfer és Balázs, 1997; Miller és Hemenway, 1998). Ezek mindegyike valamilyen pozitív vagy negatív
RNS-genommal rendelkező vírus köpenyfehérjéjét termelte (34. táblázat).
34. táblázat - A köpenyfehérjegénnel indukált vírusrezisztencia a transzgénikus
növényekben (Miller és Hemenway, 1998)
Vírus-köpenyfehérjegén1 Transzgénikus növény
Arabis mozaik vírus (Arabis mosaic nepovirus) Nicotiana tabacum
Borsó enációs mozaik vírus (pea enation mosaic
enamovirus) Pisum sativum
Burgonya levélsodródás vírus (potato
\eafro\\polerovirus) Solanum tuberosum
Burgonya aukuba mozaik vírus (potato aucuba mosaic
potexvirus) Nicotiana tabacum
Burgonya M-vírus (potato M carlavirus) Solanum tuberosum
Burgonya S-vírus (potato S carlavirus) Solanum tuberosum
Burgonya X- vírus (potato X potexvirus) Solanum tuberosum,
Nicotiana tabacum
Burgonya Y- vírus (potato Y potyvirus) Solanum tuberosum,
Nicotiana tabacum
Cukkini sárga mozaik vírus (zucchini yellow mosaic
potyvirus) Nicotiana tabacum,
Cucurbita pepo
Cymbidium gyűrűsfoltosság vírus (Cymbidium ringspot
tombusvirus) Nicotiana tabacum
Dohány csíkosság vírus (tobacco streak ilarvirus) Nicotiana tabacum
Dohány karcolata s vírus (tobacco etch potyvirus) Nicotiana tabacum
Dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) Nicotiana tabacum,
Lycopersicon esculentum
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
275 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) Nicotiana tabacum
Görögdinnye mozak vírus (watermelon mosaic
potyvirus) Nicotiana tabacum,
Cucurbita pepo
Kukorica csíkos mozaik vírus (maize dwarf mosaic
potyvirus) Zea mays
Lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) Nicotiana tabacum,
Medicago sativa,
Lycopersicon esculentum
Papaya gyűrűsfoltosság vírus (papaya ringspot
potyvirus) Nicotiana tabacum,
Carica papaya
Paprika enyhe foltosság vírus (paprika mild mottle
tobamovirus) Nicotiana tabacum
Paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt
tospovirus) Nicotiana tabacum
Paradicsom mozaik vírus (tomato mosaic tobamovirus) Lycopersicon esculentum
Répa nekrotikus sárgaerűség vírus (béét necrotic yellow
vein benyvirus) Beta vulgáris
Rizs csíkosság vírus (rice tripe tenuivirus) Oryza sativa
Saláta mozaik vírus (lettuce mosaic potyvirus)1 Lactuca sativa
Szilva himlő vírus (plum pox potyvirus) Nicotiana tabacum
Szójabab mozaik vírus (soybean mosaic potyvirus) Nicotiana tabacum
Szőlő króm mozaik vírus (grapevine chrome mosaic
nepovirus) Nicotiana tabacum
Uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) Nicotiana tabacum,
Cucurbita pepo,
Capsicum annuum,
Lycopersicon esculentum
1 Lásd Dinant et al. (1997)
2.2.1.1.
2.2.1.1.1. A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia megjelenési formája
A betegséggel szembeni rezisztenciát a vírusfertőzés után az infekciós helyek számának és/vagy a
betegségszimptómák kialakulásának összehasonlításával értékeljük a köpenyfehérjegént tartalmazó (CP+) és a
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
276 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
köpenyfehérjegént nem tartalmazó (CP–) növényekben. Az elsődlegesen transzformált növényeket és az F1
utódnemzedék rezisztenciáját is értékelik. A rezisztenciára történő tesztelés szempontjából előnyösebb a
növényi populációk vizsgálata, mert a populációkban az egyes egyedek korban, növekedési ütemben és
méretben is egységesek, ezért általában az F1 utódnemzedékben és a következő generációkban értékelik a
rezisztenciát.
A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia vizuálisan is megnyilvánul. A rezisztencia első megnyilvánulási
formája az, hogy az inokulált leveleken kevesebb lesz a fertőzési helyek száma. A dohány mozaik vírus
fertőzése következtében a köpenyfehérjegént tartalmazó Nicotiana tabacum cv. Xanthi levelein a lokális
nekrotikus léziók száma 95–98%-kal csökkent a köpenyfehérjegént nem tartalmazó növényekhez képest
(Nelson et al., 1987).
A köpenyfehérjegént tartalmazó növényekben a rezisztencia másik megnyilvánulási formája a szisztemikus
szimptómák kialakulásának akadályozása. Az ilyen típusú növényekben jóval kisebb a valószínűsége annak,
hogy a lokális szimptómák kialakulása után a fertőzés szisztemizálódik.
A rezisztencia harmadik megnyilvánulási formája az, hogy a köpenyfehérjegént tartalmazó növényekben a vírus
jóval kisebb mennyiségben akkumulálódik a fertőzés után, mint a köpenyfehérjegént nem tartalmazó
növényekben. Azok a transzgénikus növények, amelyek a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus),
az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) és a
burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) köpenyfehérjéjét termelték, a fertőzés után igen alacsony
koncentrációban, vagy pedig egyáltalán nem akkumulálták a vírusokat (Lawson et al., 1987; Nelson et al., 1987;
Cuozzo et al., 1988; Hemenway et al., 1988). A makroszimptómák megjelenésének hiánya és a
vírusakkumuláció elmaradása között szoros pozitív korreláció áll fenn.
Az inokulum koncentrációjának növelése megszüntetheti a rezisztenciát. A dohány mozaik vírus
inokulumkoncentrációjának a növelésével csökkent a transzgénikus növények közül a rezisztens egyedek száma
(Powell et al., 1986). Ezzel ellentétben azonban a burgonya X-vírus, a burgonya Y-vírus és a dohány karcolatos
vírus (tobacco etch potyvirus) köpenyfehérjegénjét tartalmazó növények a rendkívül magas (50 μ/ml)
inokulumkoncentrációval szemben is immunisnak bizonyultak (Hemenway et al., 1988; Stark és Beachy, 1989;
Lawson et al., 1990).
A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) köpenyfehérjegénje által közvetített rezisztencia
A burgonya X-vírus a Potexvirus nemzetség típustagja. Hemenway et al. (1988) és Lawson et al. (1990)
létrehozták a burgonya X-vírus köpenyfehérjegén komplementer DNS-ét (cDNS). A létrehozott génkimérákat
agrobaktériumos transzformálással a Bintje és az Escort (Hoekema et al., 1989), valamint a Russet Burbank
(Lawson et al., 1990) burgonyafajtákba építették be. A regenerálódott burgonyanövényekben az összes növényi
protein 0,05–0,3%-a a burgonya X-vírus (potato X potexvirus) köpenyfehérje volt. A burgonya X-vírus
köpenyfehérjegénjét tartalmazó növények vírussal szembeni rezisztenciáját gyökeres dugványokon
tanulmányozták. A vírussal történő fertőzés után a transzgénikus Bintje és Escort fajták 20–50-szer kevesebb
vírust tartalmaztak, mint a nem transzgénikus növények, és a transzgénikus növényekben a betegség szimptómái
is később jelentek meg (Hoekema et al., 1989). Szoros pozitív korrelációt állapítottak meg az akkumulálódott
köpenyfehérje mennyisége és a rezisztencia erőssége között.
A burgonya vírusrezisztenciára történő nemesítése csak akkor eredményes, ha a fajta rezisztenciatulajdonságai
stabilan kifejeződnek, és a fajta egyéb hasznos tulajdonságai is megmaradnak a szabadföldi termesztés során.
Ezért a kérdést úgy kell feltenni, hogy a transzgénikus, burgonya X-vírussal szemben ellenálló burgonyák
hordozzák-e az eredeti fajták, a Bintje és az Escort fontos, egyéb értékmérő tulajdonságait. Ezen kérdés
megválaszolására a transzgénikus klónok szabadföldi viselkedését tanulmányozták 52 fontos, értékmérő
tulajdonság tekintetében. Azt találták, hogy a Bintje fajta transzgén klónjainak mindössze 17,9%-a, míg az
Escort fajta transzgén klónjainak 81,8%-a volt fajtaazonos.
A burgonya Y-vírus (potato Y potyvirus) köpenyfehérjegénje által közvetített rezisztencia
A burgonya Y-vírus a Potyvirus nemzetség típustagja. Lawson et al. (1990) elkészítették a burgonya Y-vírus
köpenyfehérjéjét kódoló gén cDNS-ét, majd azt Russet Burbank burgonyafajtába építették olyan formában,
hogy a gén a növényben kifejeződhessen. Azok a növényi vonalak, melyek a burgonya X-vírus (potato X
potexvirus) és a burgonya Y-vírus köpenyfehérjegénjét egyaránt tartalmazták, egyidejűleg mindkét vírus
fertőzésével szemben rezisztensek voltak. 20 μg/ml burgonya Y-vírus inokulumkoncentráció esetében a
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
277 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
transzgénikus növények rezisztenciát mutattak, míg ez az inokulumkoncentráció a nem transzgénikus növények
80%-át megfertőzte.
Stark és Beachy (1989) a szójabab mozaik vírus (soybean mosaic potyvirus) N törzsének köpenyfehérjét kódoló
génjét építették be a „Xanthi” dohányfajtába. Azok a dohányvonalak, melyek a szójabab mozaik vírus
köpenyfehérjegénjét tartalmazták, az összes kivonható protein 0,001–0,23%-ában akkumulálták a vírus-
köpenyfehérjét. Mivel a szójabab mozaik vírus nem patogén a dohányra, a vonalakat a dohány karcolatos
vírussal (tobacco etch potyvirus) és a burgonya Y-vírussal inokulálták; ezek a vírusok sem egymással, sem a
szójabab mozaik vírussal nem mutattak szerológiai rokonságot. Mégis számos vonal a burgonya Y- és a dohány
karcolatos vírusokkal szemben is bizonyos mértékű rezisztenciát mutatott, néhány vonal esetében azonban még
rendkívül magas (50 g/ml) inokulumkoncentráció esetén is erős rezisztenciát figyeltek meg.
A burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) köpenyfehérjegénje által közvetített
rezisztencia
A burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus) a Polerovirus nemzetség gazdasági szempontból
igen veszélyes tagja. Kawchuk et al. (1991) e vírus köpenyfehérjegénjét építették Russet Burbank
burgonyafajtába. Bár több rezisztens vonalat is találtak a regeneránsok között, egyetlen transzgénikus klónban
sem tudták a köpenyfehérje jelenlétét kimutatni. Ugyanakkor a köpenyfehérjét kódoló messenger RNS (mRNS)
szintje igen magas volt. Ebből arra lehetett következtetni, hogy a rezisztenciát a mRNS, és nem a köpenyfehérje
közvetíti.
2.2.2. A replikáz génnel indukált rezisztencia
A replikázoktól származtatott vírusellenállóság Golemboski et al. (1990) nevéhez fűződik. Amikor a dohány
mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) 54 kD méretű replikáz fehérjéjét transzgénikus növényben
expresszálták, a növények ellenállóak lettek a vírusfertőzéssel szemben. Azóta számos esetben alakítottak ki
betegség-ellenállóságot vírusok replikáz génjeinek növényekbe építésével (Baulcombe, 1994; Palukaitis és
Zaitlin, 1997). A paprika enyhe foltosság vírus (pepper mild mottle tobamovirus) 54 kD-os protein génjének a
növényi genomba történő beépítésével ellenállóságot sikerült kialakítani. Az ellenállóság a paprika enyhe
foltosság vírus magas inokulumkoncentrációja esetén sem szűnt meg, más tobamovirusok (pl. dohány mozaik
vírus) azonban áttörték azt. Az 54 kD-os fehérje megcsonkított változata is ellenállóságot indukált a paprika
enyhe foltosság vírus fertőzéssel szemben, amiből azt a következtetést lehet levonni, hogy az ellenállóság
létrejöttéhez nem szükséges a teljes fehérje jelenléte.
A Cymbidium gyűrűsfoltosság vírus (Cymbidium ringspot tombusvirus) elleni, replikáz által közvetített
rezisztencia akkor volt erősebb, amikor a fehérje kisebb mennyiségben termelődött. Az ellenállóság a rokon
vírusok fertőzésével szemben nem nyilvánult meg. A burgonya X-vírus (potato X potexvirus) elleni, replikáz
által kiváltott ellenállóság tekintetében csupán az enzimet kódoló RNS megjelenése is elegendőnek bizonyult.
Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) nem transzlálódó kettős RNS-szála magas szintű
rezisztenciát indukált. A fenti esetekben tehát az ellenállóságot minden bizonnyal nem a fehérje, hanem az RNS
közvetítette. A lucerna mozaik vírussal (alfalfa mosaic alfamovirus) szembeni rezisztencia esetében azonban az
a transzlációs termékhez volt köthető.
A replikáz génekkel kialakított rezisztenciák mechanizmusairól keveset tudunk. A legtöbb esetben nincs
közvetlen kapcsolat a protein kifejeződése és a rezisztencia mértéke között. Az uborka mozaik vírus (cucumber
mosaic cucumovirus) RNS-polimeráz gén-jét expresszáló dohánynövényekben a vírus sejtről sejtre történő
mozgása, valamint a floémbe lépése is gátolva volt. A legújabb megfigyelések szerint pedig az uborka mozaik
vírus helikáz génjét hordozó dohánynövény egyszerre volt képes gátolni a vírus szisztemikus terjedését,
valamint az inokulált levélben komplementálni a helikáz gént nem tartalmazó mutáns vírust. A replikáz gének
által közvetített rezisztenciákra általánosan elmondható, hogy szűk védettséget eredményeznek, azaz csupán a
legközelebbi rokon vírustörzsek ellen hatékonyak.
2.2.3. A mozgásfehérjegénnel indukált rezisztencia
A vírusok mozgásfehérjéje azok sejtről sejtre történő terjedését teszi lehetővé a fertőzött növényben. A
mozgásfehérje mutált változatainak beépítésével számos esetben vírussal szemben ellenálló növényvonalakat
állítottak elő. Az ilyen transzgéneket hordozó növények mutatták a legszélesebb, patogéntől származtatott
rezisztenciát; azok számos vírustörzzsel, sőt fajjal szemben ellenállónak bizonyultak.
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
278 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) mozgásfehérjegénjének mutált szekvenciájával sikeresen
váltottak ki ellenállóságot transzformált dohánynövényekben.
A fehérhere mozaik vírus (white clover mosaic potexvirus) mutáns 13 kD méretű fehérjéjének beépítésével
olyan dohánynövényeket állítottak elő, melyek nem csupán az eredeti vírusra nézve voltak ellenállóak, hanem
két további, a Potexvirus nemzetségbe tartozó, valamint egy Carlavirus nemzetségbe tartozó vírussal szemben
is. Szintén több génusz képviselőire terjedt ki a védettség azokban az esetekben, amelyekben
burgonyanövényeket transzformáltak burgonya levélsodródás vírus (potato leafroll polerovirus), illetve
burgonya X-vírus (potato X potexvirus) módosított mozgásfehérjéivel. Az előbbi esetben a védettség burgonya
X-vírusra, valamint burgonya Y-vírusra, míg az utóbbiban egy Potexvirus és két Carlavirus nemzetségbe tartozó
vírusra is kiterjedt.
A mozgásfehérjét kódoló vírusgénnel transzformált növényekben ez a fehérje (vagy ennek mutációs változata)
elfoglalhatja a plazmodezmákon található kötődési helyeket, ezáltal kompetitív módon gátolhatja a vírus
eredetű, funkcióképes mozgásfehérje kötődését, amivel megakadályozza a kórokozó sejtről sejtre történő
terjedését. Hordozhat a növénybe épített mozgásfehérjét kódoló gén olyan mutációt is, ami azzal jár, hogy ez a
fehérje verseng a normális mozgásfehérjével, ami szintén gátolja a kórokozó terjedését.
2.2.4. A szatellit RNS (sat-RNS) által közvetített rezisztencia
A szatellit RNS-ek olyan kisméretű molekulák, melyek egyes vírustörzsekkel együtt fertőznek. Jellemző rájuk,
hogy csak a segítő (helper) vírus jelenlétében replikálódnak. Maga az RNS nem mutat homológiát a segítő vírus
genomjával (rövid szakaszoktól eltekintve), és fehérjét nem kódol. A szatellit RNS-ek néhány gazdanövényen
módosítják (erősítik vagy gyengítik) a segítő vírus tüneteit. Ebből ered a szatellit RNS-ek felhasználásának
lehetősége, de kockázata is.
A szatellit RNS jelenléte sok esetben enyhíti az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus) fertőzés
tüneteit. A szatellit RNS-szekvenciákat kifejező transzgénikus dohánynövények rezisztensek az uborka mozaik
vírus, valamint a vele rokonságban álló paradicsom magtalanság vírus (tomato aspermy cucumovirus)
fertőzéssel szemben (Harrison et al., 1987). A dohány gyűrűsfoltosság vírus (tobacco ringspot nepovirus)
szatellit RNS-szekvenciáit kifejező dohányok ellenállónak bizonyultak a vírusfertőzéssel szemben (Gerlach et
al., 1987). Ennek a módszernek a kockázata részben abból ered, hogy előfordulhatnak a szatellit RNS és a segítő
vírus olyan kombinációi is, amelyek a tünetek súlyosságát fokozzák. Másrészt a gyenge, illetve a súlyos
tüneteket okozó kombinációk gyakran csak néhány nukleotidban különböznek egymástól. Mivel a szatellit RNS
gyakran szenved mutációt, fennáll a veszélye annak, hogy a transzgénikus növényben esetleg új, virulensebb
törzs keletkezik (Harrison, 1992).
2.2.5. A defektív interferáló (DI) RNS által közvetített rezisztencia
A defektív interferáló (DI) RNS-ek a vírusgenom deléciós származékai. A szatellit RNS-ekhez hasonlóan a DI-
RNS-ek is csak a segítő (helper) vírus jelenlétében replikálódnak, nukleotidsorrendjük azonban szinte teljes
egészében megegyezik a vírusgenom egyes szakaszaival. A DI-RNS-ek jelenléte gyakran gyengített
betegségtüneteket okoz az adott gazdanövényen.
Kollár et al. (1993) új típusú vírusellenállóságot értek el Nicotiana benthamiana növényekben a Cymbidium
gyűrűsfoltosság vírus (Cymbidium ringspot tombusvirus) DI RNS-ének beépítésével. A transzgénikus növények
genomjába integrálódott vírusszekvenciáról DI-RNS transzkriptumok íródtak át, ami azt eredményezte, hogy a
vírussal történt felülfertőzés után teljesen elmaradtak a betegségre egyébként jellemző súlyos tünetek, a csúcsi
nekrózis és az azt követő teljes növénypusztulás.
2.2.6. A köpenyfehérje által közvetített rezisztencia mechanizmusa
Ha a lucerna mozaik vírus (alfalfa mosaic alfamovirus) köpenyfehérjéből néhány aminosavat lehasítottak, akkor
az így „megcsonkított” fehérje alkalmatlan volt a rezisztencia indukálására a transzgénikus növényekben (van
Dun et al., 1988). A dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) köpenyfehérjegén az AUG transzlációs
start kodon nélkül szintén nem közvetített vírusellenállóságot (Powell et al., 1990). Ezekből a megfigyelésekből
azt a következtetést vonták le, hogy nem a messenger RNS (mRNS), hanem annak transzlációs terméke, a
fehérje felelős a rezisztencia kialakításáért. A köpenyfehérjegén magasabb szintű kifejeződése a rezisztencia
magasabb szintű állapotához vezetett (Hemenway et al., 1988; Powell et al., 1990). Újabban azonban egyre több
bizo-nyíték utal arra is, hogy a köpenyfehérjegén által transzformált növényekben a rezisztenciát nem mindig a
fehérje közvetíti. A burgonya levélsodródás vírussal (potato leafroll polerovirus) szembeni rezisztencia a
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
279 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
transzgénikus burgonyavonalakban úgy nyilvánult meg, hogy a fehérjét a növényekben nem sikerült kimutatni.
Néhány esetben a köpenyfehérjegén antiszensz orientációban beültetve is védelmet nyújtott (Kawchuk et al.,
1991; van der Wilk et al., 1991). Ezek a tanulmányok azt igazolják, hogy a vírus köpenyfehérjegénjei különböző
típusú rezisztenciát indukálhatnak a transzgénikus növényekben.
Számos vizsgálat utal arra, hogy a köpenyfehérjegén megnyilvánulása gátolja a fertőzés korai eseményeit. A
rezisztencia a dohány mozaik, a lucerna mozaik és a dohány csíkosság (tobacco streak ilarvirus) vírusok
esetében megszűnt akkor, ha a fertőzéseket a vírus nukleinsavával és nem a komplett virionokkal végezték
(Loesch-Fries et al., 1987; Nelson et al., 1987; van Dun et al., 1988). Ezen megfigyelésekre alapozva azt a
következtetést lehetett levonni, hogy a köpenyfehérje által közvetített rezisztencia esetében a fertőzött sejtekben
a virionok szétválása (dekapszidáció) gátlódik. A csak nukleinsavat tartalmazó inokulum azért törte át a
rezisztenciát, mert ezekben az esetekben a fertőzéshez nem volt szükség a dekapszidációra (Register és Beachy,
1988). Ezzel ellentétben a burgonya X-vírus RNS-ével történő inokulálás nem szüntette meg a transzgénikus
növények rezisztenciáját (Hemenway et al., 1988). A fertőzés korai eseményeinek gátlása három módon
lehetséges: 1. a vírus nem tudja „levetni” a fehérjeburokját, ezért nem indulhat el a vírusgének transzlációja. Az
is elképzelhető, hogy a transzgén által kódolt köpenyfehérje blokkolja azokat a növényi sejtben meglévő
receptorokat, amelyekhez a vírus a fertőzés során kötődik; 2. a köpenyfehérjétől megszabadult nukleinsav a
transzgénikus növényben termelődött köpenyfehérjével újra beburkolódik (enkapszidálódik), ezáltal nem tud
fertőzni; 3. a köpenyfehérje a vírus RNS-replikációját befolyásolja (Baulcombe, 1996).
A legtöbb köpenyfehérjegén által közvetített rezisztencia esetén a fertőzés után a szisztemikus tünetek később
jelennek meg, vagy egyáltalán ki sem alakulnak. Ez a vírus sejtről sejtre történő terjedésének, a vírussal
inokulált levélből a szállítószövet-rendszerbe történő áramlásának, a nem inokulált levelekbe történő
behatolásának vagy ezekben a levelekben a fertőzés kezdetének a gátlásából adódhat (Beachy et al., 1990).
Wisniewski et al. (1990) a dohány mozaik vírus (tobacco mosaic tobamovirus) RNS-ével történő fertőzés után
összehasonlította a vírus terjedését a transzgénikus és a nem transzgénikus növényekben. A vírus terjedése a
fertőzési hely szűk környezetében (1–3 mm) mindkét típusú növény esetében hasonló volt, míg azoktól nagyobb
(5–10 mm) távolságokra, illetve más levelekbe a vírus csak a nem transzgénikus növények esetében jutott el. A
nem transzgénikus növényben a dohány mozaik vírus részecskék a szállítószövet-rendszerben és a csúcsi
szövetekben hét nappal korábban jelentek meg, mint a transzgénikus növényekben. Egyes megfigyelések szerint
a köpenyfehérjegénnel transzformált növényekben a víruspartikulumok nem léptek be a szállítószövet-
rendszerbe (Cassab és Varner, 1987).
2.2.7. Az RNS által közvetített rezisztencia mechanizmusa
A vírusszekvenciákkal transzformált növényekben fellépő ellenállóság lehet fehérjék vagy RNS által közvetített
rezisztencia; az előbbi általában széles spektrumú, több vírus ellen érvényesül, de gyengébb hatékonyságú, az
utóbbi a vírusok szűkebb körére terjed ki, ám nagy inokulumtömeg ellen is hatékony (Király és Hornok, 1996a,
b). Az RNS közvetítette ellenállóság annak köszönhető, hogy specifikus, a megcélzott vírus RNS-ét érintő
degradációs mechanizmus működik a transzgénikus növények sejtjeiben (Baulcombe 1996). Ezt a specificitást
áltatában a transzgén nukleinsavsorrendje biztosítja. Újabban azonban olyan eseteket is leírtak, melyekben
caulimo- és nepovirusok elleni rezisztencia homológ nukleáris gén (transzgén) hiányában alakult ki.
Feltételezik, hogy az említett citoplazmatikus RNS-degradáló folyamatot rövid, a célszekvenciával
komplementer RNS-ek de novo szintézise és anellálása (hibridizációja) váltja ki (Goodwin et al., 1996). Az
RNS által közvetített rezisztencia tanulmányozása nagymértékben hozzájárult a transzkripciót követő gén-
lecsendesítés (posttranscriptional gene silencing) felfedezéséhez. Ez az adaptív mechanizmus nem csupán az
inokulált levélben indukálódik, hanem az egész növényben elterjed, ami valamilyen jelátvivő rendszert
feltételez (Voinnet and Baulcombe, 1997). Bár a növényeknek ez az – úgy tűnik – általános, adaptív védekező
rendszere mind jobban jellemzett, az abban részt vevő biokémiai folyamatokról ma még keveset tudunk. Azt,
hogy a gén-lecsendesítésnek valóban fontos szerepe lehet a vírusok elleni védelemben, az is megerősíti, hogy
azok különböző mechanizmusokat fejlesztettek ki a növényi válaszreakció elkerülésé-re. A potyvirusok segítő
komponens fehérjéjéről (HCPro), valamint a cucumovirusok 2b fehérjéjéről kimutatták, hogy azok aktívan
visszaszorítják a gén-lecsendesítést (Kasschau and Carrington, 1998; Brigneti et al., 1998). E jelenségek
vizsgálata ma a növényi molekuláris biológia legintenzívebben kutatott területei közé tartozik.
Ma már nyilvánvaló, hogy nem csak a vírus köpenyfehérjéje közvetítheti a rezisztenciát. 1990 óta növekszik
azon ellenálló vonalak száma, amelyek a vírusok nem strukturális génjeit (nem köpenyfehérje-gént) hordozzák
és expresszálják. Ilyen sikeresen alkalmazott gének a replikáz enzim és a mozgásfehérje (movement protein)
génjei. Ezen túlmenően a vírusgenom számos, fehérjét nem kódoló részével (DI-RNS-ek, szatellit RNS-ek,
mutáns, nem transzlálható genomi szekvenciák) sikerült betegség-ellenállóságot kiváltani. Ebből az az általános
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
280 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
következtetés vonható le, hogy elméletileg bármely vírus eredetű szekvencia alkalmas arra, hogy valamilyen
szintű ellenállóságot váltson ki a transzgénikus növényben (Lomonossoff, 1995).
2.3. Egyéb rezisztenciagének
A rezisztenciagének termékei valamilyen módon blokkolják a vírus szaporodását, növényen belüli mozgását,
vagy csökkentik patológiai hatásait. Korlátozott eredményekkel járó kísérleteket végeztek abból a célból, hogy
ezeket a hatásokat megtervezett módon, mesterségesen (nem természetes rezisztenciagénekkel, ill.
vírusgénekkel) váltsák ki (Wilson, 1993). Ezeket a kísérleteket a növényi genomba ültetett gének alapján a
következők szerint csoportosítjuk:
a. Ribozimokat kódoló gének. A ribozimok olyan RNS-molekulák, melyek endonukleáz enzimekhez hasonló
tulajdonságokkal rendelkeznek. Képesek egy másik RNS-molekulát specifikusan felismerni, és azt adott
helyen elhasítani. Több esetben olyan előre megtervezett ribozimokat ültettek a növényekbe, amelyek egy
adott vírus fertőzése esetén, annak RNS-genomját elhasították, gátolva így a vírus replikációját. A módszer
hátránya, hogy a ribozim és a vírus nukleinsavsorrendjének szinte tökéletesen egymást kiegészítőnek
(komplementernek) kell lennie, így ez a hatás csak a vírusok szűk körére vonatkozhat. A védettség
ugyanakkor csak kismértékű, mivel a sejtben gyorsan replikálódó vírus-RNS-ek invázióját a ribozimok csak
korláto-zott mértékben tudják közömbösíteni. A tünetek kialakulásának enyhe késését figyelték meg dohány
mozaik vírussal (tobacco mosaic tobamovirus) szemben terve-zett ribozimot kifejező dohánynövényeken,
amikor azokat híg koncentrációban fertőzték.
b. Antitesteket kódoló gének. Az antitestek az állati immunrendszer elemei, olyan proteinek, melyek egy másik
makromolekulát, annak jellemző részeit (epitópjait) specifikusan felismerik és megkötik. Ha egy
növénykórokozó vírus ellen előállított antitestet a növényi sejtbe juttatnak (a növényben expresszáltatják), az
nagy valószínűséggel ott is képes lesz az adott vírus megkötésére. Ez a kapcsolódás pedig gátolhatja a
kórokozó szaporodását vagy elterjedését. Tavladoraki et al. (1993) ezzel a megoldással alakított ki
rezisztenciát a Nicotiana benthamiana növényekben az articsóka tarka fodrosodás vírus (artichoke mottled
crinkle tombusvirus) ellen. Mindazonáltal az e területen folyó kutatások még kezdeti stádiumban vannak. A
módszer gyakorlati értékét egyelőre megkérdőjelezi az antitestek összeépülésének bizonytalansága és
alacsony koncentrációja a növényi citoplazmában.
c. Antiszensz vírusszekvenciák. Ebben az eljárásban, akárcsak az antitestek növényben történő felhasználása
esetében, úgy kívánják gátolni a kórfolyamatot, hogy a vírus makromolekuláit megkötik. Ha egy RNS-
genomú vírus cDNS klónjai rendelkezésre állnak, azokat promóter mögé építve, negatív orientációban is
integrálni lehet a növény genomjába. Az ilyen, úgynevezett „antiszenz” transzgénekről keletkező
transzkriptumok, szekvencia-komplementaritásuk következtében, hibridizálnak a citoplazmában a vírus
RNS-kel, ami – valószínűleg többirányú mechanizmusokon keresztül – blokkolja az RNS működését. Azok a
kísérletek, amelyeket az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic cucumovirus), a burgonya X-vírus (potato X
potexvirus) és a dohány rattle vírus (tobacco rattle tobravirus) valamely genomrészletének antiszensz RNS-
ével végeztek, csekély eredménnyel jártak. Néhány esetben azonban gyenge védelmet sikerült elérni a
vírusfertőzéssel szemben.
d. „Öngyilkos gének”. Az ebben az eljárásban használt gének rendkívül erős fitotoxinokat kódolnak (például
ricin vagy diftéria toxin). Az „öngyilkos” elnevezés onnan ered, hogy e gének mindaddig
működésképtelenek, míg egy adott vírus meg nem jelenik a sejtben. Ezeket a toxin géneket ugyanis negatív
(antiszensz) orientációban építik be a növénybe, így a róluk átírt RNS-transzkriptum „értelmetlen”. E
transzkriptumok azonban tartalmazzák egy adott vírus RNS-polimeráz enzimje promóter régióját is.
Vírusfertőzés esetén ez az enzim átírja a toxin-RNS „értelmes” szálát, amelyről azonnal megindul a
fehérjeszintézis. A keletkező, erősen toxikus fehérjék pedig az egész sejtet – gyakran a környező szöveti
régiókkal együtt – elpusztítják, mielőtt a kórokozó továbbterjedne a növényben. Diftéria toxint és burgonya
X-vírus szubgenomi promóter régiót tartalmazó konstrukcióval transzformált növényekben a vírus
koncentrációja 1/20-a volt a negatív kontrollnövényekben lévőhöz képest.
2.3.1.
2.3.1.1.
2.3.1.1.1. Nem növénykórokozó mikroorganizmusok génjeivel indukált rezisztencia
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
281 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Sok olyan mikroszkopikus gombafaj ismert, amelynek egyedeiben több-kevesebb gyakorisággal találhatunk
vírusszerű partikulumokat (virus-like particles, VLP), kettős szálú RNS- (double stranded, dsRNS) genommal.
A legtöbb gomba látszólag alkalmazkodott ehhez az állapothoz, mások viszont védekeztek a VLP-k ellen. A
Schizosaccharomyces pombe fajból klónozták a pac1 gént, amely dsRNS molekulákat bontani képes RNázt
kódol (Iino et al., 1991). Amikor ezt a gént átvitték dohányba, a transzformált növények fokozottan ellenállóvá
váltak a paradicsom mozaik vírussal (tomato mosaic tobamovirus) szemben, de az uborka mozaik vírussal és a
burgonya Y-vírussal fertőzött növényeken is késleltetve jelentek meg a tünetek (Watanabe et al., 1995). A
meglepő védettséget a szerzők azzal magyarázták, hogy az egyszálú növényvírusok szaporodása során kettős
szálú replikációs intermedierek is keletkeznek, és az említett gomba eredetű RNáz ezeket támadja meg.
2.3.1.1.2. Riboszóma-inaktiváló fehérjék által indukált rezisztencia
Vírusok ellen biztosítanak védelmet a riboszóma-inaktiváló fehérjék (ribosome inactivating proteins, RIP).
Közülük a Phytolacca americana fajból származó komponens, a PAP igen hatékony inhibítora számos növényi
vírusnak. Az egyes RIP-ek specifitása nagyon eltérő. Amikor a P. americana PAP génjét dohányba vitték, sok
növényegyed súlyosan károsodott, másokban viszont csekély mértékű volt a transzgén expressziója, így ezeken
nem jelentkeztek látható tünetek. Ez utóbbiak ugyanakkor ellenállóaknak bizonyultak a burgonya X-vírus, a
burgonya Y-vírus, valamint az uborka mozaik vírussal szemben (Lodge et al., 1993).
2.3.1.1.3. Magasabb rendű állatok génjeivel indukált rezisztencia
Egészen különleges lehetőséget kínálnak a magasabb rendű állatokból származó, növényvírusok ellen védelmet
nyújtó gének. Truve et al. (1993) a patkány 2–5A szintetázát kódoló génjével transzformálták a burgonyát, és
ezzel szabadföldi körülmények között is megnyilvánuló ellenállóságot értek el a burgonya X-vírussal (potato X
potexvirus) szemben. Ismert, hogy a 2–5A szintetáz az emlőssejtek interferon által indukált antivirális
védekezési reakciójában vesz részt oly módon, hogy aktiválja a vírus eredetű RNS-molekulák bontását végző
RNázt.
3. A rezisztenciagének beépítése a növényi genomba
A rezisztenciagének forrásától (például természetes rezisztenciagének, vírusgének, „öngyilkos” gének)
függetlenül szükség van azok bevitelére a növényi genomba. Ezt az eljárást növénytranszformációnak nevezzük,
mivel általa örökíthető módon új tulajdonságot lehet bevinni a növénybe. A transzformációs módszerek két
csoportba sorolhatók: 1. indirekt transzformáció és 2. direkt transzformáció. Amennyiben a génbevitel hordozó
(vektor) organizmus alkalmazásával történik, indirekt transzformációról beszélünk. Direkt transzformáció során
a DNS passzív módon (mechanikai, kémiai úton vagy elektroporációval) jut a sejtbe. E sejtekből azután egész
növényeket regenerálnak, melyekben tehát a sejtek mindegyike tartalmazza a bevitt DNS-szekvenciát. A
növénytranszformálás előfeltétele a jól működő regenerációs rendszer, amelynek segítségével növényegyedek
állíthatók elő.
3.1. Az agrobaktériumos transzformálás
A kétszikűeknél a legáltalánosabb, de újabban az egyszikű növényeknél is megjelent az Agrobacterium
tumefaciens (illetve az Agrobacterium rhizogenes) vektor felhasználásával történő génbevitel. Ezek a Gram-
negatív talajbaktériumok a kétszikű növényeket sebzési helyeken fertőzik és tumorokat okoznak rajtuk. A
baktériumok patogenitása öszszefügg a tumorindukáló (Ti) plazmid jelenlétével. A Ti plazmid egy része
(transzfer DNS = T-DNS) a kórfolyamat során átkerül a növényi sejtbe és a sejtmag DNS-állományába
integrálódik (Süle, 1985; Filippone és Penza, 1992). A T-DNS régióban helyezkednek el a tumorok
kialakulásáért felelős gének, míg a T-DNS átvitelét szabályozó gének mindvégig a baktériumsejtben
lokalizáltak. Ha a tumorindukálók helyére más géneket építenek be, azok éppúgy integrálódnak a növényi
genomba. E rendszer felhasználásával a növények gyakorlatilag bármely génnel transzformálhatók (109. ábra).
109. ábra - A növény idegen génnel történő transzformálásának főbb lépései [Salazar,
1996 után]
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
282 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A T-DNS szakaszt hordozó plazmidot, amelybe a kívánt gén egyszerűen beépíthető, klónozó plazmidnak
nevezik. A növénytranszformálás gyakorlatában a T-DNS a következő régiókat tartalmazza (110. ábra):
a. Szelekciós marker gén (antibiotikum- vagy herbicid-rezisztenciagén) megfelelő promóter és terminációs
régiók között, melyek a gén működését, expresszióját (kifejeződését) teszik lehetővé.
b. A hasznos gén (például rezisztenciagén, vírus-cDNS-szekvencia) szintén promóter- és terminációs régió
között.
c. Határoló régiók. Ezek a T-DNS „jobb és bal oldali” végei, amelyek a szakasz integrálódásához
nélkülözhetetlenek.
110. ábra - A pGA 482 alapú plazmid. Az uborka mozaik vírus (cucumber mosaic
cucumovirus – CMV) Trk7-es törzse cDNS klónjáról származó, 1200 bázispár
hosszúságú régiót, mely a vírus köpenyfehérje génjét (CP) hordozza, az ábrán jelölt
XbaI helyre klónozták 35S promóter és NOS transzkripciós terminál régió közé. BR =
(right border) a T-DNS jobb oldali határszekvenciája; BL = (left border) a T-DNS bal
oldali határszekvenciája; NptII = neomicin-foszfotranszferáz II NOS promóter és
terminál régió között; Tet = tetraciklin-rezisztenciagén baktériumpromóter mögött
A marker gén (leggyakrabban a kanamicinrezisztenciát eredményező neomicin-foszfotranszferáz gén-nptII)
bevitele azért szükséges, hogy segítségével a regenerálás során a transzformáns növények szelektálhatók
legyenek. A növénytranszformálás folyamán alkalmazott lépések növényi rendszerenként eltérőek. Az általános
lépések azonban a következők:
A klónozó plazmidot (rajta a beépíteni kívánt génnel) tartalmazó Agrobacterium sejteket egy éjszakán keresztül
folyékony táptalajban fölszaporítják. A plazmidok hordoznak olyan antibiotikum-rezisztenciagéneket is,
amelyek baktériumpromóter mögött vannak. Így, ha a folyékony táptalajhoz megfelelő antibiotikumot is adnak,
akkor csak azok a sejtek szaporodnak föl, amelyek a kívánt plazmidot tartalmazzák. Ebbe a
baktériumszuszpenzióba mártják néhány másodpercre a megsebzett levél- vagy szárrészt. Ekkor megy végbe az
Agrobacterium fertőzés és a génátvitel. Ezt az explantumot aztán szilárd regeneráló táptalajra helyezik, ahol
megindul a kalluszképződés, majd a hajtásregenerálás. A gyökérregeneráláshoz a fiatal hajtásokat általában
gyökereztető táptalajra helyezik. Ez már kétféle antibiotikumot tartalmazó szelektív táptalaj. Az egyik
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
283 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
antibiotikum az augmentin, vagy cefotaxim, mely a növénykék felületén esetleg átvitt Agrobacterium sejteket
pusztítja el, a másik a T-DNS-en bevitt marker génnek megfelelő antibiotikum (általában kanamicin), melynek
hatására csak a transzformáns (a marker gént, tehát a T-DNS-t hordozó és expresszáló) hajtások gyökereznek
meg.
A fentiekben csupán nagy vonalakban ismertettük a rutinszerű dohánytranszformálás főbb lépéseit. Sok esetben
például nem differenciálódott levélszöveteket, hanem kalluszt transzformálnak, és a kalluszsejteket órákig
együtt tenyésztik az Agrobacterium sejtekkel. Többszöri átoltási lépések után organo- vagy embriogenezis útján
regenerálják az utódnövényeket. Az agrobaktériumos transzformálásban egységes protokoll nincs, a tenyésztési
lépések növényfajoktól és -fajtáktól, valamint laboratóriumoktól függően mások és mások.
A burgonyanövények (Solanum tuberosum) transzformálása (Dietze et al., 1995)
a. Transzformálásra alkalmas növények előállítása. Vírusmentes steril növények 15-15 mm-es hajtáscsúcsait 90
ml 2MS (0,7% Bitec agar, Difco) táptalajra oltjuk félliteres befőttesüvegekben. Négy héttel később 5–6 db,
sötétzöld levelet gyűjtünk be.
b. Az Agrobacterium tumefaciens-t 5 ml (a vektorplazmidnak megfelelő antibiotikumot tartalmazó) YEB
táptalajba oltjuk le 25 ml-es Erlenmeyer-lombikban, és egy éjszakán át 28 °C-on rázatjuk (130 rpm).
c. A leveleket üres Petri-csészébe helyezzük, levágjuk a levélalapi részt és egy éles zsilettpengével két, 1–2 mm
hosszúságú vágást végzünk egymástól 4–5 mm távolságra úgy, hogy a vágások keresztezzék a levél főerét.
d. Tíz ilyen levelet fonákával fölfelé 10 ml 2 MS (folyékony) táptalajt tartalmazó Petri-csészébe, a tápoldat
felszínére helyezünk, anélkül hogy a leveleket alámerítenénk. Ehhez 50 μl késői, logaritmikus fázisban lévő
Agrobacterium kultúrát adunk, és az elegyet óvatosan összekeverjük. A Petri-csészét két napra 22–24 °C-ra
helyezzük.
e. A leveleket fonákukkal lefelé kallusz-indukáló táptalajra (CIM) tesszük úgy, hogy a teljes levélfelület
érintkezzen a táptalajjal. A vágási helyeken először kisméretű kalluszok jelennek meg.
f. Hét nap elteltével a leveleket hajtás-indukáló táptalajra helyezzük (SIM), ahol megjelennek az első hajtások.
g. Amikor a hajtások elérték az 1–1,5 cm-es hosszúságot, azokat gyökereztető táptalajra (RIM) helyezzük át.
Ehhez a lépéshez célszerű 250 ml-es, 70 ml táptalaj tartalmú üveget használni. Három vagy négy héttel
később a gyökerekkel és levelekkel rendelkező növénykék tovább szaporíthatók, illetve üvegházba
ültethetők.
Dietze et al. (1995) a szövettenyésztés során a 16 órai megvilágítást követően 22 óráig tartó sötét periódust és
3000 lux fényintenzitást alkalmaztak. A transzformáns növényekre a kallusz-indukáló (CIM) és a hajtás-
indukáló (SIM) táptalajon a riporter génnek megfelelő antibiotikummal (kanamicin vagy higromicin stb.)
szelektáltak. Az itt ismertetett eljárás segítségével levelenként két-három transzformáns regenerálható.
Táptalajok
a. YEB: 0,1% élesztőextraktum; 0,5% marhahúsextraktum; 0,5% pepton; 0,5% szaharóz; 0,49 g/l MgSO4 ×
H2O. A megfelelő antibiotikumot sterilezés után a már szobahőmérsékletre lehűlt táptalajhoz adjuk.
b. MS táptalaj: Makroelemek: 1650 mg/l NH4NO3; 1900 mg/l KNO3; 440 mg/l CaCl2 × 2 H2O; 370 mg/l MgSO4
× 7 H2O; 170 mg/l KH2PO4. Mikroelemek: 6,2 mg/l H3BO3; 16,9 mg/l MnSO4 × H2O; 10,6 mg/l ZnSO4 × 7
H2O; 0,83 mg/l KI; 0,25 mg/l Na2MoO4 × 2 H2O; 0,025 mg/l CuSO4 × 5 H2O; 0,025 mg/l CoCl2 × 6 H2O; 37,3
mg/l Na2EDTA × 2 H2O; 27,5 mg/l FeSO4 × 7 H2O. Vitaminok: 0,5 mg/l nikotinsav; 0,5 mg/l piridoxin HCl;
0,1 mg/l tiamin HCl; 2,0 mg/l glicin; 100 mg/l mio-inozit. Szilárd táptalaj esetén szükséges még 0,7% agar
hozzáadása. A táptalaj pH-ját 5,7–5,8 értékre 1 M KOH-oldattal állítjuk be. A táptalaj sterilezése 121 °C-on
20 percig történik.
c. Kallusz-indukáló táptalaj (CIM): MG táptalaj (MS táptalaj 1,6% glükózzal); 5 mg/l naftolecetsav (NAA); 0,1
mg/l benzilaminopurin (BAP); 250 mg/l klaforán; 50 mg/l kanamicin vagy 1 mg/l higromicin.
d. Hajtás-indukáló táptalaj (SIM): MG táptalaj (MS táptalaj 1,6% glükózzal); 2 mg/l zeatin; 0,02 mg/l
naftilecetsav (NAA); 0,002 mg/l gibberellinsav (GA3); 250 mg/l klaforán; 50 mg/l kamicin vagy higromicin.
A vírus-ellenállóságra nemesítés
biotechnológiai módszerei
284 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
e. Gyökereztető táptalaj (RIM): MS táptalaj; 250 mg/l klaforán.
3.2. DNS-bevitel polietilén-glikollal (PEG) és elektromos impulzussal
Az Agrobacterium segítségével végzett növénytranszformálás az egyszikű növényeknél általában nem
alkalmazható. Alternatív eljárás a protoplasztok transzformálása polietilén-glikol- (PEG) oldatban. A PEG képes
megbontani a sejtmembrán folyamatosságát, és a keletkező pórusokon a DNS passzív módon bejuthat a sejtbe,
ahol a genomba integrálódhat. Makropórusok ugyanakkor elektromos impulzussal is létrehozhatók. Ez utóbbi
módszerrel nemcsak protoplasztokba, hanem intakt növényi sejtekbe is képesek DNS-t juttatni. Ma mindkét
eljárást széleskörűen alkalmazzák.
3.3. Génátvitel biolisztikus módszerrel
E módszer alkalmazható a legszélesebb körben intakt sejtek transzformációjára. A bejuttatni kívánt DNS-t 1–2
μm átmérőjű wolframrészecskékre rögzítik, majd ezeket nagy sebességre gyorsítják – általában nagynyomású
He-, illetve N2 gázzal. A részecskék eltalálják a célszövetet, és behatolnak a részlegesen sérült sejtekbe. A
részecskék felületén bevitt DNS azután integrálódhat a növény genomjába.
A „génpuskával” történő növénytranszformálás valójában óriási előrelépést jelentett a transzgénikus növények
előállításában, mivel számos gazdaságilag jelentős fajta transzformációját tette lehetővé.
3.3.1.
3.3.1.1.
3.3.1.1.1. A biotechnológia mint új és hatékony eszköz
Az elmúlt évtized biológiai, biokémiai és molekuláris biológiai felfedezései egyre közelebb vitték az
emberiséget ahhoz, hogy az egyes szervezetek működését ellenőrző géneket megismerjék és az adott keretek
között szinte korlátlan módon megváltoztassák. A génsebészet, ill. a génátültetés módszereinek felhasználásával
forradalmi változások következtek be a mezőgazdaságban és a növényvédelemben is (Balázs és Gáborjányi,
1984; Monti, 1992a, b). 1998-ban a transzgénikus növényfajták termesztési területe csaknem elérte a 40 millió
hektárt. Ewe (1998) szerint 1-2 évtized múlva a világ élelmezésében szerepet játszó 29 fő tápnövény 80%-a
transzgénikus növény lesz. A tendenciára jellemző, hogy az Amerikai Egyesült Államokban 2154, Japánban
2055, Németországban 629 géntechnológiai úton előállított növényre jelentettek be szabadalmat (Janositz,
1998).
Új, transzgénikus fajták termesztésbe vétele azonban bizonyos kockázatokkal is jár. Vírusellenálló növények
esetében ezek sokkal kevésbé egészségügyi, mint inkább ökológiai jellegű kockázatok (Bartsch et al., 1996a, b;
Parker és Bartsch, 1996; Bartsch és Pohl-Orf, 1996; Tepfer és Balázs, 1997). Rendkívül fontos ezért az ilyen
fajták kontrollált engedélyezése és termesztésbe vétele. E rendelkezéseket Magyarországon a géntechnológiai
tevékenységről szóló 1998. Évi XXVII. Törvény tartalmazza. Úgyszintén fontos feladat a nyilvánosság pontos
tájékoztatása a biotechnológia eredményeiről a megalapozatlan félelmek eloszlatása érdekében (Jones, 1994;
Deshayes, 1994; Balázs, 1997).
285 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
20. fejezet - Függelék
1. A vírusok, a vírusszerű organizmusok és a viroidok nemzetközi forgalmának (terjedésének) ellenőrzése és megakadályozása
A növényvírusok okozta igen jelentős gazdasági károk csökkentésére az elmúlt években szükség volt a
külföldről behozott, az országon keresztülhurcolt és az országból kivitt vírusokkal kapcsolatos intézkedésekre.
Ezeket a megnövekedett nemzetközi árucsere-forgalom, valamint az Európai Gazdasági Közösség Tanácsának
határozata is indokolta. A növényvédelmi intézkedések szigorú betartásában ezért alapvetően érdekeltek
vagyunk (Kalmár et al., 1994).
1.1. Vírusokra és vírusszerű kórokozókra vonatkozó növény-egészségügyi határozatok
Az Európai Gazdasági Közösség Tanácsának Növény-egészségügyi Határozatai részletesen megtalálhatók a
Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás által szerkesztett kiadványban (Szemessy és
Szőnyegi, 1993). A terjedelmes rendelkezések minden részletre kiterjedően intézkednek a növények vagy
növényi termékek károsítóinak az Európai Közösségbe történő behurcolásával, valamint a Közösségen belüli
elterjedésével kapcsolatban. A „Növényvírusok és virológiai vizsgálati módszerek” c. egyetemi tankönyvben
csak a vírusokra, ill. a vírusszerű kórokozókra vonatkozó ismereteket tárgyaljuk. A „Növény-egészségügyi
határozat” olyan kifejezéseket tartalmaz (pl. növények; növényi termékek; ültetés (telepítés), vetés; ültetésre
(telepítésre), vetésre szánt növények; károsítók; növényútlevél; hivatalos növényvédelmi szolgálat; bármely
állami hatóság; védett zóna; nyilatkozat vagy intézkedés), amelyek jelentésének egyértelmű meghatározása
feltétlen kívánatos.
1.1.1.
1.1.1.1.
1.1.1.1.1. Növények
Ide tartoznak az élő növények és azok élő részei, beleértve a vetőmagvakat is. Élő növényeknek és azok
részeinek tekinthetők a termések (a fagyasztással tartósított gyümölcsök kivételével); a zöldségfélék
(fagyasztottak kivételével); a gumó, hagyma, hagymagumó, rizóma; a vágott virágok; a leveles ágak; a leveleit
megtartó vágott fa és a növényi szövettenyészet.
1.1.1.1.2. Növényi termékek
Ide tartoznak a fel nem dolgozott vagy csak egyszerű előkészítésnek alávetett növényi eredetű termékek.
1.1.1.1.3. Ültetés (telepítés)/vetés
A növények talajba (termesztő közegbe) helyezése, amellyel biztosítani lehet fejlődésüket, szaporodásukat.
1.1.1.1.4. Ültetésre (telepítésre)/vetésre szánt növények
Azok a növények, amelyeket már kiültettek vagy elvetettek, vagy az eredeti közegben maradtak, vagy
hazahozataluk után újratelepítettek. Ide tartoznak azok a növények is, amelyeket behozatalukkor nem ültettek ki
és nem vetettek el, hanem azt később kívánják megtenni.
1.1.1.1.5. Károsítók
A növények vagy növényi termények károsítói azok, amelyek az állat- vagy növényvilághoz tartoznak, vagy
amelyek vírusok, fitoplazmák vagy egyéb kórokozók.
1.1.1.1.6. Növényútlevél
Függelék
286 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Hivatalos címke, amely azt bizonyítja, hogy a jelen határozat növény-egészségügyi követelményekre és
különleges előírásokra vonatkozó rendelkezéseit betartották, és amelyet az Európai Közösségi szinten a
különböző növény- vagy növényi terméktípusokra egységesítettek, és amelyet bármely tagország hivatalos
testülete készített elő, állított ki a növényútlevél kiállítási eljárásának részleteit szabályozó végrehajtási
rendelkezések szerint.
1.1.1.1.7. Hivatalos, felelős testület
Növényvédelmi Szolgálat, vagy bármely más állami hatóság, amelyet országos vagy regionális szinten állítottak
fel az országos hatóság felügyelete alatt, az érintett tagország alkotmányos keretein belül.
1.1.1.1.8. Védett zóna
Védett zónának az a terület tekintendő, amelyben a határozatban említett egy vagy több károsító még nem
honos, vagy nem telepedett meg a kedvező körülmények ellenére sem, jóllehet az Európai Közösség egy vagy
több részén már megtelepedett. Továbbá védett zónának tekintendő az a terület is, amelyen fennáll a veszélye
annak, hogy bizonyos károsítók megtelepednek az adott növények számára kedvező ökológiai viszonyok
mellett, annak ellenére, hogy ezek a károsítók nem honosak vagy nem telepedtek még meg az Európai
Közösségben. Megjegyzés: egy károsító akkor tekinthető megtelepedettnek, ha az ott előfordul, és ha
hivatalosan nem intézkedtek megsemmisítéséről, vagy az intézkedések legalább két egymást követő éven át
hatástalannak bizonyultak.
1.1.1.1.9. Nyilatkozat vagy intézkedés
A nyilatkozat vagy intézkedés akkor tekinthető hivatalosnak, ha azt a tagország hivatalos növényvédelmi
szervezetének a képviselője – vagy annak felelőssége mellett más köztisztviselő – hozza (teszi meg). Egyéb
esetekben a már említett képviselő vagy köztisztviselő vagy a meghatározott hivatalos felelős testület egyike
által alkalmazott „kvalifikált ügynök” (ha nincs személyes érdekeltsége az általa hozott intézkedések
kimenetelében, és megfelel a képesítés minimális követelményeinek) nyilatkozik (intézkedik). E tekintetben a
tagországoknak kell biztosítani, hogy köztisztviselőik és ügynökeik kvalifikáltak legyenek.
1.1.2. Az Európai Közösségben (EU) elő nem forduló, és az EU-ra nézve fontos vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok
Az e csoportba tartozó károsítókat a 35. táblázat tartalmazza. A károsítók (kórokozók) között vírusok (27),
fitoplazmák (5), viroid (1) és rickettsia (1) kórokozók vannak. A karantén vírusok 14 nemzetségbe tartoznak:
Begomovirus, Bigeminivirus, Bromovirus, Carlavirus, Caulimovirus, Comovirus, Crinivirus, Ilarvirus,
Luteovirus, Nepovirus, Potexvirus, Potyvirus, Rhabdovirus, Tymovirus. Két vírus [paradicsom Florida vírus
(tomato Florida virus), őszibarack mozaik vírus (amerikai), peach (American) mosaic virus] rendszertani helye
pontosan még nem ismert. A 35. táblázatban felsorolt burgonyapatogén vírusok (burgonya A-vírus, burgonya
M-vírus, burgonya S-vírus, burgonya V-vírus, burgonya X-vírus, burgonya Y-vírus, burgonya levélsodródás
vírus) és a burgonya orsósgumójúság viroid nem európai izolátumai tekintendők karantén kórokozóknak.
35. táblázat - Az Európai Közösségben elő nem forduló kórokozók1
A kórokozók magyar neve A kórokozók angol neve
Burgonyapatogén kórokozók
Burgonya andeszi látens vírus
Burgonya andeszi foltosság vírus
Arracacha B-vírus
Burgonya fekete gyűrűsfoltosság
vírus
Burgonya A-vírus*
Potato Andean latent tymovirus
Potato Andean mottle comovirus
Arracacha B ? nepovirus
Potato black ringspot nepovirus
Potato A. potyvirus
Potato M carlavirus
Függelék
287 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Burgonya M-vírus*
Burgonya S-vírus*
Burgonya V-vírus*
Burgonya X-vírus*
Burgonya Y-vírus*
Burgonya levélsodródás vírus*
Burgonya orsósgumójúság
viroid*
Potato S carlavirus
Potato V potyvirus
Potato üpotexvirus
Potato Y potyvirus
Potato leafroll polerovirus
Potato spindle tuber viroid
Egyéb vírusok és fitoplazma
Szilfa floem nekrózis fitoplazma
Dohány gyűrűsfoltosság vírus
Paradicsom gyűrűsfoltosság
vírus
Bab aranysárga mozaik vírus**
Lóbab enyhe foltosság vírus**
Saláta fertőző sárgaság vírus**
Paprika enyhe „tigré” vírus**
Tök levélgöndörödés vírus**
Euphorbia mozaik vírus**
Paradicsom Florida vírus**
Elm phloem necrosis
phytoplasma
Tobacco ringspot nepovirus
Tomato ringspot nepovirus
Bean golden mosaic
begomovirus
Broad bean mild mottle
bromovirus
Lettuce infectious yellows
crinivirus
Pepper mild tigré ? bigeminivirus
Squash leaf curl bigeminivirus
Euphorbia mosaic bigeminivirus
Tomato Florida virus
Cydonia, Fragaria, Malus, Prunus, Pyrus, Ribes, Rubus, Vitis spp.
vírus, fitoplazma
és rickettsia kórokozói és minden nem Európában előforduló
kórokozói
Áfonya levélfoltosság vírus
Cseresznye érdeslevelűség vírus
(amerikai)
Őszibarack (amerikai) mozaik
vírus
Őszibarack ál-rickettsia
Őszibarack rozettás fitoplazma
Őszibarack X-betegség
fitoplazma
Blueberry leaf mottle nepovirus
Cherry rasp \eafnepovirus
Peach (American) mosaic virus
Peach phony rickettsia
Peach rosette phytoplasma
Peach X-disease phytoplasma
Peach yellows phytoplasma
Függelék
288 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Őszibarack sárgaság fitoplazma
Szilva amerikai vonalas
mintázottság vírus
Málna levélgöndörödés vírus
(amerikai) Földieper látens C-
vírus
Földieper érszalagosodás vírus
Földieper boszorkányseprűsödés
fitoplazma
Plum American line pattern
ilarvirus
Raspbery leaf curl ? luteovirus
Strawberry latens C ?
rhabdovirus Strawberry vein
banding ? caulimovirus
Strawberry witches‟broom
phytoplasma
1 A *-gal megjelölt vírusok nem európai törzsei (izolátumai). A **-gal megjelölt vírusok Bemísia tabaci
vektorral terjednek.
1.1.3. Az Európai Közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos fitoplazma kórokozók
Az ide tartozó kórokozók a következők: alma sarjburjánzás fitoplazma (apple proliferation phytoplasma), kajszi
klorotikus levélsodródás fitoplazma (apricot chlorotic leafroll phytoplasma), körte pusztulás fitoplazma (pear
decline phytoplasma).
1.1.4. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése a meghatározott védett zónákban tilos
Két vírus behurcolása és terjedése tilos négy védett zónában (országban). Ezek a következők: a répa nekrotikus
sárgaerűség vírus (beet necrotic yellow vein benyvirus) behurcolása tilos Dániába, az Egyesült Királyságba
(Észak-Írország) és Portugáliába, valamint a paradicsom bronzfoltosság vírus (tomato spotted wilt tospovirus)
behurcolása tilos Dániába.
1.1.5. Kórokozók, amelyeknek a behurcolása és terjedése valamennyi tagországban tilos, ha azok egyes növényeken és növényi termékeken előfordulnak
Az ide tartozó vírus, fitoplazma és viroid kórokozókat a 36. táblázat tartalmazza.
36. táblázat - Az Európai Közösségben elő nem forduló, de az Európai Közösségre nézve
fontos vírus, vírusszerű és viroid kórokozók
A kórokozók magyar neve A kórokozók angol neve Növények
Répa levélcsúcs fodrosodás vírus
(nem európai izolátumok) Beet curly top
curtovirus Beta vulgaris
Fekete málna látens vírus Black raspberry latent
ilarvirus Rubus spp.
Kókuszdió cadang-cadang viroid Coconut cadang-cadang
viroid Pálmáé spp. (európai országokon
kívüli növények) telepítése esetén
(magvak kivételt képeznek)
Cseresznye levélsodródás vírus* Cherry leafroll
nepovirus Rubus spp.
Függelék
289 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Citrus mozaik vírus Citrus mosaic
badnavirus Citrus, Fortunella Swingle és Poncirus
spp. és hibridjeik (termés és magvak
kivételt képeznek)
Citrus tristeza vírus Citrus tristeza
dosterovirus (nem
európai izolátumok)
Citrus, Fortunella Swingle és Poncirus
spp. és hibridjeik (termés és magvak
kivételt képeznek)
Citrus leprózis vírus Citrus leprosis ?
rhabdovirus Citrus, Fortunella Swingle és Poncirus
spp. és hibridjeik (termés és magvak
kivételt képeznek)
Cseresznye aprógyümölcsűség vírus
(nem európai izolátumok) Cherry little cherry virus Prunus cerasus, P. avium, P. insica,
P. sargentii, P. serrula, P. serrulata,
P. speciosa, P. subhirtella, P.
yedoensis hibridjei és fajtái (magvak
kivételével)
Citrus psorozis vírus (természetes
úton terjedő) Citrus psorosis virus Citrus, Fortunella Swingle,
Poncirus növényfajok és hibridek
(termés és magvak kivételével)
Pálma letális sárgaság fitoplazma Palm lethal yellowing
phytoplasma Pálma spp. (nem európai országból
származó) telepítése esetén (magvak
kivételt képeznek).
Barack nekrotikus gyűrűsfoltosság
vírus* Prunus necrotic ringspot
ilarvirus Rubus spp.
Satsuma törpülés vírus Satsuma dwarf ?
nepovirus Citrus, Fortunella Swingle,
Poncirus növények és hibridjeik
(termés, magvak kivételt képeznek)
Citrus rongyoslevelűség vírus Citrus tatter leaf
capillovirus Citrus, Fortunella Swingle,
Poncirus növények és hibridjeik
(termés, magvak kivételt képeznek)
Citrus boszorkányseprűsödés
fitoplazma Citrus witches‟broom
phytoplasma Citrus, Fortunella Swingle,
Poncirus növények és hibridjeik
(termés, magvak kivételt képeznek)
* A megnevezett vírusok az Európai Közösségben, Rubus-fajokon nem fordulnak elő.
1.1.6. Az Európai közösségben (EU) előforduló és az EU-ra nézve fontos vírus, vírusszerű, viroid és spiroplaza kórokozók
E csoportba 11 vírus, 1 viroid, 2 fitoplazma és 1 spiroplazma tartozik (37. táblázat).
37. táblázat - Az Európai Közösségben előforduló és az Európai Közösségre nézve
fontos károsítók
Függelék
290 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A kórokozók magyar neve A kórokozók angol neve Növények
Arabis mozaik vírus
Répa levélgöndörödés
vírus
Arabis mosaic nepovirus
Beet leaf curl ?
rhabdovirus
Fragaria és Rubus spp.
Beta vulgáris
(vetőmag kivételével)
Krizantém törpülés viroid Chrysanthemum stunt
viroid Dendranthema spp.
(magvak kivételével)
Citrus tristeza vírus
(európai törzsek) Citrus tristeza
closterovirus Citrus, Fortunella Swingle, Poncirus
spp.
(termés és magvak kivételével)
Citrus ér-enációs vírus Citrus vein enation virus Citrus, Fortunella Swingle, Poncirus
spp.
(termés és magvak kivételével)
Szőlő aranyszínű sárgaság
fitoplazma Grapevine Flavescence
dorée phytoplasma Vitis spp.
(termés és magvak kivételével)
Szilva himlő vírus Plum ponpotyvirus Prunus spp.
(magvak kivételével)
Burgonya sztolbur
fitoplazma Potato slolbw
phytoplasma Solanaceae családba tartozó növények
(vetőmagvak kivételével)
Málna gyűrűsfoltosság
vírus Raspberry ringspot
nepovirus Fragaria, Rubus spp. (magvak
kivételével)
Spiroplasma citri Spiroplasma citri Citrus, Fortunella Swingle, Poncirus
spp.
(termés és magvak kivételével)
Földieper göndörödés
vírus Strawberry crinkle
cytorhabdovirus Fragaria spp.
(magvak kivételével)
Földieper látens
gyűrűsfoltosság vírus Strawberry latent ringspot
nepovirus Fragaria és Rubus spp.
(magvak kivételével)
Földieper enyhe sárga
levélszélűség vírus Strawberry mild yellow
edge-associated ?
potexvirus
Fragaria spp.
(magvak kivételével)
Paradicsom fekete gyűrűs
vírus Tomato black ring
nepovirus Fragaria és Rubus spp.
(magvak kivételével)
Függelék
291 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Paradicsom
bronzfoltosság vírus Tomato spotted wilt
tospovirus Apium graveolens, Capsicum annuum,
Cucumis melo, Dentran-hema
növények.
Az Impatiens New Quinea hibridek
összes fajtája. Mindazok a Lactuca
sativa, Lycopersicon esculentum és
Nicotiana növények, amelyekről
bizonyított, hogy a növénytermesztés
számára értékesítik őket. Ültetésre
szánt Solanum melongena és S.
tuberosum
1.2. Egyéb határozatok
A „Növény-egészségügyi Határozat” (lásd Szemessy és Szőnyegi, 1993) I. és II. Függelékében a vírusokon és
vírusszerű kórokozókon kívül kitér azokra az ismeretekre is, amelyek a baktériumokkal, gombákkal, rovarokkal,
atkákkal, fonálférgekkel kapcsolatosak.
A „Növény-egészségügyi Határozat” III. Függeléke (A. rész) azokkal a növényekkel és növényi termékekkel,
valamint más anyagokkal foglalkozik, amelyek behozatala a tagországokba tilos. A B. rész azokkal a
növényekkel és növényi termékekkel, valamint más anyagokkal foglalkozik, amelyek behozatala a védett
zónákba tilos.
A IV. Függelék A. része a növények, növényi termékek és egyéb anyagok tagországokba történő behozatalakor
és a tagországokon belüli szállításakor valamennyi tagország által kötelezően alkalmazandó előírásokat foglalja
magában. Az I. Szekcióban vannak felsorolva az Európai Közösségen kívüli területekről származó növények,
növényi termékek és más anyagok is. A II. Szekcióban vannak felsorolva az Európai Közösség országaiból
származó növények és a velük kapcsolatos intézkedések. A IV. Függelék B. része azokat a különleges
eljárásokat tárgyalja, amelyeket valamennyi tagország köteles elrendelni a növények, növényei termékek és más
anyagok meghatározott védett zónákba történő bevitelével és a védett zónákon belüli szállításával kapcsolatban.
Az V. Függelék arról rendelkezik, hogy azokat a növényeket, növényi termékeket és más anyagokat, amelyeket
növény-egészségügyi ellenőrzésnek kell alávetni, az Európai Közösségből származók esetében a termőhelyen, a
Közösségen belüli szállítást megelőzően, az Európai Közösségen kívül eső országok esetében pedig a
származási országban vagy a feladó országban, az Európai Közösségbe hozatal engedélyezése előtt kell
ellenőrizni. A Függelék A. részének I. pontja azokkal az Európai Közösségből származó növényekkel, növényi
termékekkel és más anyagokkal foglalkozik, amelyek az egész Közösségre nézve fontos károsítók potenciális
hordozói, és amelyekhez növényútlevelet kell csatolni. Az A. rész II. pontja azokat a növényeket, növényi
termékeket és más anyagokat sorolja fel, amelyek bizonyos védett zónákra nézve fontos károsítók potenciális
hordozói, és amelyekhez az adott zónába történő behozatalkor vagy az adott zónán belüli szállításkor a
megfelelő zónákra érvényes útlevelet kell csatolni. A Függelék B. része az A. részben felsoroltaktól eltérő
területekről származó növényeket, növényi termékeket és más anyagokat sorolja fel.
2. Karantén és veszélyes vírusok, vírusszerű organizmusok és viroidok Európában
A „karantén károsító” a nemzetközileg elfogadott „Növényegészségügyi terminusok szótára” szerint olyan
károsító, amelynek potenciális gazdasági jelentősége van azon a területen, ahol eddig még nem fordult elő, vagy
ha elő is fordul, széles körben még nem terjedt el, és hivatalos ellenőrzés alatt van. A károsító magában foglalja
a faj, törzs, biotípus fogalmát is. Az Európai és Mediterrán Növényvédelmi Szervezet (EPPO, European and
Mediterranean Plant Protection Organization) a karantén károsítókat két csoportba sorolja: 1. azok a károsítók,
amelyek nem fordulnak elő az EPPO-régióban; ezek az A1 csoportba tartoznak, és 2. azok a károsítók, amelyek
az EPPO-régió néhány területén előfordulnak; ezek az A2 csoportba tartoznak. Az EPPO-régió tagállamai
kötelesek minden intézkedést megtenni az A1 csoportba tartozó károsítókkal szemben, míg az A2 csoportba
tartozó károsítókkal szembeni eljárásokat szabadon megválaszthatja. A követelmények igen szigorúak az ún.
„egzotikus”, A1 csoportba tartozó károsítókkal szemben. Ez a specifikus és „károsítócentrikus” szemlélet az
EPPO központi koncepciója.
Függelék
292 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Az Európai Unió (EU) tizenöt tagállama mind aktív tagja az EPPO-nak. Az EU Növényegészségügyi Direktívái
(EU Plant Health Directive) (lásd Függelék előző fejezete) igen kis mértékben eltérnek az EPPO
követelményeitől, de alapvető kérdésekben megegyeznek. Az EPPO-tagállamok szoros kapcsolatban vannak az
EPPO titkárságával az A1 és A2 károsítók adatlapjainak összeállításában. Ezek az információk a szervezet
folyóiratában (Bulletin OEPP/EPPO Bulletin) jelennek meg, amelyek többnyire az alábbi adatokat tartalmazzák:
károsító neve, fő gazda, földrajzi elterjedés, biológia, gazdasági jelentőség, belépés módja, identifikálás,
egészségügyi vizsgálat, irodalom. A tudományos publikációkat többnyire színes ábrák egészítik ki.
Az EU, az EPPO, a CABI, a Nemzetközi Entomológiai Intézet, a Nemzetközi Mikológiai Intézet és a
Nemzetközi Parazitológiai Intézet nemrég összeállította és közzétette a „Quarantine Pests for Europe” (Európa
Karantén Károsítói) c. könyvet (Smith et al., 1997), amely a legújabb adatokat tartalmazza a karantén rovarokra,
atkákra, fonálférgekre, gombákra, baktériumokra, vírusokra, vírusszerű organizmusokra, viroidokra és parazita
növényekre vonatkozóan. A jelen fejezetben a vírusokra, vírusszerű organizmusokra és viroidokra – mint
karantén károsítókra – vonatkozóan közöljük az aktuális adatokat (38. táblázat).
38. táblázat - Európai karantén károsítók (vírusok, vírusszerű kórokozók és viroidok)
az EPPO-régióban (Smith et al., 1997 után)
A károsító neve Előfordulás
a a
régióban2 Magyar név Angol név1
Alma mozaik vírus Apple mosaic ilarvirus* A2
Arabis mozaik vírus Arabis mosaic nepovirus A2
Arracacha B-vírus Arracacha B ? nepovirus** A1
Árpa csíkos mozaik vírus Barley stripe mosaic hordeivirus A2
Bab aranysárga mozaik vírus Bean golden mosaic begomovirus A1
Répa levélcsúcs fodrosodás vírus Beet curly top curtovirus A2
Répa levélgöndörödés vírus Beet leaf curl ? rhabdovirus A2
Répa nekrotikus sárgaerűség vírus Beet necrotic yellow vein
benyvirus A2
Fekete málna látens vírus Black raspberry latent ilarvirus A2
Áfonya levélfoltosság vírus Blueberry leaf mottle nepovirus A2
Cseresznye levélsodródás vírus Cherry leafroll nepovirus* A2
Cseresznye aprógyümölcsűség vírus Cherry little cherry virus A1
Cseresznye nekrotikus rozsdaszínű
foltosság betegség Cherry necrotic rusty mottle
disease A2
Cseresznye érdeslevelűség vírus Cherry rasp leaf nepovirus A1
Krizantém törpülés viroid Chrysanthemum stunt viroid A2
Citrus sárgulás betegség Citrus blight disease A1
Függelék
293 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Citrus leprózis vírus Citrus leprosis ? rhabdovirus A1
Citrus mozaik vírus Citrus mosaic badnavirus A1
Citrus gyűrűsfoltosság vírus Citrus ringspot virus A1
Citrus rongyoslevelűség vírus Citrus tatter leaf capillovirus A1
Citrus tristeza vírus Citrus tristeza closterovirus A2
Citrus ér-enációs vírus Citrus vein enation virus A2
Kókuszdió cadang-cadang viroid Coconut cadang-cadang viroid A1
Tehénborsó enyhe foltosság vírus Cowpea mild mottle carlavirus A1
Euphorbia mozaik vírus Euphorbia mosaic bigeminivirus A1
Saláta fertőző sárgaság vírus Lettuce infectious yellows
crinivirus A1
Őszibarack látens mozaik viroid Peach latent mosaic viroid*** A1
Őszibarack rozettás mozaik vírus Peach rosette mosaic nepovirus A1
Szilva (amerikai) vonalas mintázottság
vírus Plum (American) line pattern
ilarvirus A1
Szilva himlő vírus Plum pox potyvirus A2
Burgonya andeszi látens vírus Potato Andean latent tymovirus A1
Burgonya fekete gyűrűsfoltosság vírus Potato black ringspot nepovirus A1
Burgonya andeszi foltosság vírus Potato Andean mottle comovirus A1
Burgonya orsósgumójúság viroid Potato spindle tuber viroid A2
Burgonya T-vírus Potato T vitivirus A1
Burgonya sárga törpülés vírus Potato yellow dwarf
nucleorhabdovirus A1
Burgonya sárgaerűség betegség Potato yellow vein disease A1
Burgonya sárgaság vírus Potato yellowing alfamovirus A1
Málna levélgöndörödés vírus Raspberry leaf curl ? luteovirus A1
Málna gyűrűsfoltosság vírus Raspberry ringspot nepovirus A2
Satsuma törpülés vírus Satsuma dwarf ? nepovirus A1
Függelék
294 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Tök levélgöndörödés vírus Squash leaf curl bigeminivirus A1
Földieper göndörödés vírus Strawberry crinkle
cytorhabdovirus A2
Földieper látens C-vírus Strawberry latent C ? rhabdovirus A1
Földieper látens gyűrűsfoltosság vírus Strawberry latent ringspot
nepovirus A2
Földieper enyhe sárga levélszélűség vírus Strawberry mild yellow edge
disease
associated ? potexvirus
A2
Földieper érszalagosodás vírus Strawberry vein banding ?
caulimovirus A2
Dohány gyűrűsfoltosság vírus Tobacco rinsgpot nepovirus A2
Paradicsom fekete gyűrűs vírus Tomato black ring nepovirus A2
Paradicsom foltosság vírus Tomato mottle bigeminivirus A1
Paradicsom gyűrűsfoltosság vírus Tomato ringspot nepovirus A2
Paradicsom bronzfoltosság vírus Tomato spotted wilt tospovirus A2
Paradicsom sárga levélgöndörödés vírus Tomato yellow leaf curl
bigeminivirus A2
1 * = Rubus növényen; ** = Oca-törzs; *** = Az EPPO (European and Mediterranean Plant Protection
Organization = Európai és Mediterrán Növényvédelmi Szervezet) karanténlistára vett egy új károsítót
[őszibarack látens mozaik viroid (peach latent mosaic viroid, PLMVd)], amely Olaszországban 20–50%-os
előfordulást és súlyos károkat okoz őszibarackon, nektarinon, szilván, sárgabarackon és cseresznyén (Barba és
Faccioli, 1998).
2 A1 = A károkozó (vírus) nem fordul elő az EPPO-régióban (European and Mediterranean Plant Protection
Organization = Európai és Mediterrán Növényvédelmi Szervezet); A2 = A károkozó előfordul az EPPO-régió
bizonyos területein.
3. Az ábrák eredete
Almási Asztéria (Budapest): 56.
Baker, C.J. és Orlandi, E.W.: 100., 101. Academic Press, London (1995) engedélyével.
Brandes, J. (Braunschweig, Németország): 6., 13B, C., 14A szívessége folytán.
Brown, T.A.: 83., 87., 88. Stanley Thornes (Publ.) Ltd., Cheltenham (1990) engedélyével.
Brunt, A. et al.: 20. CAB International, Wallingford (1990) engedélyével.
Chiykowski, L.N. (Ottawa, Kanada): 28A, B, C, D szívessége folytán.
De Bokx, J.A. (Wageningen, Hollandia): 23A szívessége folytán.
Függelék
295 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Doke, N. és Ohashi,Y.: 104. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell, Rockville (1988)
engedélyével.
Esau, K.: 54., 57., 58. The University of Wisconsin Press, London (1968) engedélyével.
Érsek Tibor és Gáborjányi Richard: 67. ELTE Eötvös Kiadó, Budapest (1998) engedélyével.
Francki, R.I.B. és McLean, G.D.: 63. Van Nostrand Reinhold Co., New York (1968) engedélyével.
Francki, R.I.B. et al.: 55., 60A, B. CRC Press, Boca Raton (1985) engedélyével.
Fritzsche, R. (Aschersleben, Németország): 43 szívessége folytán.
Gáborjányi Richard (Budapest): 66.
German, T.L. et al.: 75. Ann. Rev. Inc., Palo Alto (1992) engedélyével.
Gibbs, A.J.(Harpenden, Herts, Nagy-Britannia): 15D, 18B, 53 szívessége folytán.
Hammond-Kosack, K.E. és Jones, J.D.G.: 99. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell,
Rockville (1996) engedélyével.
Hampton, R. et al.: 78., 79., 80., 81., 82. The American Phytopath. Soc., St. Paul, Minnesota (1990)
engedélyével.
Harrison, B.D. (Dundee, Skócia): 17A, B szívessége folytán.
Horváth József (Keszthely): 1A, B, C., 2A, B., 4A, B, C., 7A., 8A, B., 11A, B, C, D., 12A, B, C., 13A., 14B.,
16A, B., 17C., 22A, B., 23B., 24A, B., 26A, B., 33., 34A, B, C, D, E, F., 44., 45A, B., 46A, B., 47A, B, C, D.,
48A, D., 49A., 50A, B., 52A, B, C., 59A, B., 61A, B, C., 62A, B., 64A, B, C., 65A, B., 105A, B, C, D., 106A,
B.
Hull, R. és Covey, S.: 72. Elsevier Trends Journals, Cambridge (1983) engedélyével.
Kado, C.I. (Berkeley, Amerikai Egyesült Államok): 15A, B, C szívessége folytán.
Kunkel, H.: 35., 36. Academic Press, London (1977) engedélyével.
Lázár János (Kecskemét): 51 szívessége folytán.
Mamula, D. (Zagreb, Horvátország): 18A szívessége folytán.
Matthews, R.E.F.: 69., 70., 71. Academic Press, Orlando (1985), (1991) engedélyével.
McInnes, J.L. és Symons, R.H.: 90., 91. CRC Press, Boca Raton, Florida (1991) engedélyével.
Miller, A. (Ames, Amerikai Egyesült Államok): 27 szívessége folytán.
Molnár János (Szeged): 86, 89 szívessége folytán.
Mullineaux, P.M. et al.: 91. Oxford University Press, Oxford (1984) engedélyével.
Murant, A.F. (Dundee, Skócia): 10 szívessége folytán.
Murphy, F.A. et al.: 3. Springer Verlag, Wien und New York (1995) engedélyével.
Nakasuyi, F. (Okayama, Japán): 7B, C szívessége folytán.
Noordam, D.: 37., 38., 39., 40A, B, C; 41. PUDOC, Wageningen (1973) engedélyével.
Paliwal, Y.C. és Slykhuis, J. (Ottawa, Kanada): 29A szívessége folytán.
Peters, D. (Wageningen, Hollandia): 5., 9 szívessége folytán.
Függelék
296 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Pfeifer, P. és Hohn, T.: 73. Cell Press, Cambridge (1983) engedélyével.
Pintér Csaba (Keszthely): 48B, C., 49B szívessége folytán.
Pogány Miklós (Budapest): 92., 93., 94A, B, C., 95., 96., 97.
Proeseler, G. (Aschersleben, Németország): 31 szívessége folytán.
Riechmann, J.L. et al.: 68. Kluwer Academic Publ., Dordrecht (1993) engedélyével.
Sain, B. és Erdei, S.: 84. Gondolat Könyvkiadó Kft., Budapest (1985) engedélyével.
Salazar, L.F. (Lima, Peru): 19., 109 szívessége folytán és az International Potato Center, Lima, Peru (1996)
engedélyével.
Sambrook, J. et al.: 85. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor (1989) engedélyével.
Schlee, D.: 98. Gustav Fischer Verlag, Jena (1992) engedélyével.
Schmelzer, K. (Aschersleben, Németország): 21. Akademie Verlag, Berlin (1980) engedélyével.
Schopfer, P.: 103. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell, Rockville (1994) engedélyével.
Slykhuis, J.T. (Ottawa, Kanada): 29B szívessége folytán.
Smith, K.M. (Austin, Amerikai Egyesült Államok): 30 szívessége folytán.
Szalay-Marzsó László (Budapest): 32 szívessége folytán.
Szilassy Dénes (Gödöllő): 107., 108., 110.
Taylor, C.E. és Robertson, W.M.: 42. Plenum Publ. Company, London (1975) engedélyével.
Teakle, D.S. (Brisbane, Ausztrália): 25A, B, C szívessége folytán.
Washio, O. et al.: 37. [módosítva Kunkel, H.: Academic Press, London (1977) engedélyével].
Wu, G. et al.: 102. The Amer. Soc. Plant Physiol., Plant Physiol., The Plant Cell, Rockville (1995)
engedélyével.
297 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Irodalom
Principles of molecular organization, expression, and evolution of closteroviruses: over the barriers.
Agranovsky, A.A. Adv. Virus Res. 47 1996 119–157
Methods of virus classification. Andrewes, C.H. Academie Press In: Maramorosch, K. and Koprowski, H.
(eds.), Methods in Virology. Vol. IV., , ppNew York and London 1968 593–613
Orvosi virológia. Bakács, T. és Farkas E. Medicina KönyvkiadóBudapest 1965 444 pp
A növényi RNS-vírusok bioszintézise. Balázs, E. Medicina Könyvkiadó In: Csaba Gy. (szerk.), A biológia
aktuális problémái 23Budapest 1981 77–93
Potyvirus Taxonomy. Barnett, O.W. Springer Verlag Arch. Virol. Suppl. 5Wien and New York 1992
Plant Viruses and Virus Diseases. Bawden, F.C. Waltham Mass 3rd Edit. Chronica Botanica Co 1950
Állatorvosi mikrobiológia, bakteriológia, virológia, immunológia. Belák S., Tuboly S. és Varga J.
Mezőgazdasági KiadóBudapest 1983 449 pp
Introduction to Plant Virology. Bos, L. PUDOCWageningen 1983 160 pp
Virus Identification Data Exchange. Boswell, K.F. and Gibbs, A.J. Viruses of Legumes. Austr. Nat. Univ.,
Canberra 1983 139 pp
The VIDE (Virus Identification Date Exchange) Boswell, K.F., Dallwitz, M.J., Gibbs, A.J. and Watson, L.
Project: A Date Bank for Plant Viruses. Rev. Plant Pathol. 65 1986 221–231
Some properties of a phloem-limited non–mechanically transmissible grapevine virus. Boulila, M., Boscia, D.,
Di Terlizzi,B., Castellano, M.A., Minafra, A., Savino, V. and Martelli, G.P. J. Phytopathol. 129 1990
151–158
Gross morphology and serology as a basis for classification of elongated plant viruses. Brandes, J. and Bercks,
R. Adv. Virus Res. 11 1965 1–24
Klassifizierung und Nomenklatur pflanzenpathogener Viren. Brandes, J. Akademie Verlag In: Klinkowski, M.
(Ed.), Pflanzliche Virologie. Band 1. Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1967 237–243
Viruses of Tropical Plants. Brunt, A A., Crabtree, K. and Gibbs, A. CAB International Descriptions and Lists
from the VIDE DatabaseWallingford 1990 707 pp
Viruses of Plants. Brunt, A.A., Crabtree, K., Dallwitz, M.J., Gibbs, A.J. and Watson, L. CAB International
Description and Lists from the VIDE DatabaseWallingford 1996a 1484 pp
Plant Virus Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Brunt, A.A., Crabtree, K., Dallwitz, M.J.,
Gibbs, A.J., Watson, L. and Zurcher, E.J. Index to Viral Genera, Index to Virus Species and Index to
Virus Acronyms. Version 20th August 1996b
Sinaloa tomato leaf curl virus, a newly described geminivirus of tomato and pepper in West Coastal Mexico.
Brown, J.K., Idris, A.M. and Fletcher, D.C. Plant Dis. 77 1993 1262
Phylogenetic relationships reveal recombination among isolates of cauliflower mosaic virus. Chenault, K.D.
and Melcher, U. J. Mol. Evol. 39 1994 496–505
Fully biologically active in vitro transcripts of the Eriophid mite–transmitted wheat streak mosaic tritimovirus.
Choi, Il-R., French, R., Hein, G.L. and Stenger, D.C. Phyto. pathol. 89 1999 1182–1185
A new Bemisia tabaci (Gennadius) biotype in southwestern United States and its role in silverleaf of squash and
transmission of lettuce infectious yellows virus. Cohen, S., Duffus, J.E. and Liu, H.-Y. Phytopathology
82 1992 86–90
Irodalom
298 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Proposals for changes in luteovirus taxonomy and nomenclature. D‟Arcy, C.J. and Mayo, M. Arch. Virol. 142/6
1997 1285–1287
Cassava vein mosaic virus (CsVMV), type species for a new genus of plant double stranded RNA viruses. de
Kochko, Verdaguer, B., Taylor, N., Carcamo, R., Beachy, R.N. and Fauquet, C. Arch. Virol. 143 1988
945–962
Maize white line mosaic virus. de Zoeten, G.A. and Reddick, B.B. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses 283
1984 1–4
Molecular biology and evolution of closteroviruses: Sophisticated build-up of large RNA genomes. Dolja, V.V.,
Karasev, A.V. and Koonin, E.V. Ann. Rev. Phytopathol. 32 1994 261–285
Variation of rice tungro viruses: further evidence of two rice tungro bacilliform virus strains and possibly
several rice tungro spherical virus variants. Druka, A. and Hull, R. J. Phytopathol. 146 1998 175–178
A novel subrival agent associated with a geminivirus. Dry, I. B., Krake, L. R., rigden, J. E. and Rezaian, M. A.
The first report of a DNA satellite. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 1997 7088–7093
Lettuce infectious yellows virus – A new type of whitefly-transmitted virus. Duffus, J.E., Larsen, R.C. and Liu,
H.Y. Phytopathology 76 1986 97–100
Handbook of Viruses Infecting Legumes. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. CRC PressBoca Raton, Florida
1991a 504 pp
The Potyvirus Group. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. Vol. I-IV. Florida Exp. Stat. Monograph. 16 1991b
Inclusion in diagnosing plant virus diseases. Edwardson, J.R., Christie, R.G., Purcifull, D.E. and Petersen, M.A.
CRC Press In: Matthews, R.E.F. (ed.), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton, Florida 1993
101–127
Növénykórokozó mikroorganizmusok. Érsek, T. és Gáborjányi R. ELTE Eötvös KiadóBudapest 1998 288 pp
The nomenclature and classification of viruses the international committee on nomenclature of viruses. Fenner,
F. Virology 46 1971 979–980
Classification and nomenclature of viruses. Fenner, F. Intervirol. 7 1976 1–115
Plant virus satellites. Francki, R.I.B. Ann. Rev. Microbiol. 39 1985a 151–174
The Plant Viruses. Vol. 1. Francki, R.I.B. Plenum Press Polyhedral Virions with Tripartite GenomesNew York
and London 1985b 309 pp
Classification and nomenclature of viruses. Francki, R.I.B., Fauquet, C.M., Knudson, D.L. and Brown, F.
Springer VerlagWien and New York 1991 450 pp
Atlas of Plant Viruses. Vol. II. Francki, R.I.B., Milne, R.C. and Hatta, T. CRC PressBoca Raton, Florida 1985
284 pp
Tierische Vektoren pflanzenpathogener Viren. Fritzsche, R., Karl, E., Lehmann, W. und Proeseler, G. VEB
Gustav Fischer VerlagJena 1972 521 pp
A gabonafélék vírusbetegségei, gabonavírusok. Gáborjányi, R. Akad. Dokt. Ért 1990 Budapest
Bevezetés a növényvirológiába. Gáborjányi, R. JATE PressSzeged 1991 101 pp
A vírusfertőzés inhibitorai és vírusbioszintézist gátló anyagok. Gáborjányi, R. és Tóbiás I. Növénytermelés 35
1986a 139–146
A növényi vírusok elleni kémiai védekezés lehetőségei. Indukált antivirális anyagok és kemoterápiás szerek.
Gáborjányi, R. és Tóbiás I. Növénytermelés 35 1986b 341–350
What’s in a virus name? Gibbs, A.J., Harrison, B.D., Watson,D.H. and Wildy, P. Nature 209 1966 450–454
Irodalom
299 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Plant Virology. Gibbs, A. and Harrison, B. The Principles. Edward Arnold, London 1976 1976 292 pp
Plant virus classification. Gibbs, A.J. Adv. Virus Res. 14 1969 263–328
Molecular evolution of plant RNA viruses. Goldbach, R.W. Ann. Rev. Phytopathol. 24 1986 289–310
A History of Experimental Virology. Grafe, A. Spinger VerlagBerlin 1991 343 pp
Plant Virus Disease Control. Hadidi, A., Khetarpal, R.K. and Koganezawa, H. APS PressSt. Paul, Minnesota
1998 704 pp
Guidelines for the identification and characterization of plant viruses. Hamilton, R.I., Edwardson, J.R., Francki,
R.I.B., Hsu, H.T., Hull, R., Koenig, R. and Milne, R.G. J. Gen. Virol. 54 1981 223–241
Chemotherapy of Plant Virus Infections. Hansen, A.J. Plenum Publ. Corp In: Kurstak, E., Marusyk, R.G. and
Murphy, F.A. (Eds), Applied Virology Research. Vol. 1. New Vaccines and ChemotherapyNew York
1988 285–299
Antiviral Chemicals for Plant Disease Control. Hansen, A.J. CRC Critical Rev.Pl. Sci. Vol. 8., Issue 1., Boca
Raton 1989 45–86
Advances in Disease Vector Research. Vol. 9 and 10. Harris, K.F. Springer VerlagNew York 1992–1994 367
and 442 pp
Vectors of Plant Pathogens. Harris, K.F. and Maramorosch, K. Academic PressNew York 1980 467 pp
Usefulness and limitations of the species concept for plant viruses. Harrison, B.D. Intervirol. 24 1985 71–78
Separation and properties of tobacco rattle virus with different lenghts. Harrison, B.D. and Nixon, H.L. J. Gen.
Microbiol. 21 1959 569–581
Sixteen groups of plant viruses. Harrison, B.D., Finch, J.T., Hollings, M., Shepherd, R.J., Valenta, V. and
Wetter, C. Virology 45 1971 356–363
Virus structure: high resolution perspectives. Harrison, S.C. Adv. Virus Res. 28 1983 175–240
Methods in Plant Virology. Hill, S.A. Blackwell Sci. PublOxford 1984 1984 67 pp
Handbook of Phytopathogenic Viruses. Holmes, F.O. BurgessMinneapolis 1939
Növényvírusok, vektorok, vírusátvitel. Horváth, J. Akadémiai KiadóBudapest 1972 515 pp
A szántóföldi növények betegségei. Horváth, J. (szerk.) Mezőgazda KiadóBudapest 1995 328 pp
New artificial hosts and non-hosts of plant viruses and their role in the identification and separation of viruses.
I. Horváth, J. Historical review. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 12 1977 177–214
Hosts and Non-Hosts of Plant Viruses. Horváth, J. Internat. Biosci. Monograph. No. 12. Today and Tomorrow‟s
Printers and Publishers, New Delhi 1982 77 pp
New artificial hosts and non-hosts of plant viruses and their role in the identification and separation of viruses.
Horváth, J. XVIII. Concluding remarks. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 18 1983 121–161
Host Plants in Diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (eds.), Diagnosis of Plant Virus
DiseasesBoca Raton, Florida 1993a 15–47
A list of proposed letter codes for hosts and non-hosts of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol.
Hung. 28 1993b 21–58
Hosts and non-hosts in the diagnostic strategy of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. Hung.
28 1993c 257–354
Növényvírusok. Horváth, J. Egyetemi jegyzet, PATE, Keszthely 1999 237 pp
Irodalom
300 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Molecular characterization of peanut stunt virus (PSV) strain BV-15, a natural reassortant between subgroups I
and II of PSV strains. Hu, C.C. and Ghabriel, S.A. Phytopathology 86, 17 (Abstr.) 1996
A list of proposed standard acronyms for plant viruses and viroids. Hull, R., Milne, R.G. and Van Regenmortel,
M.H.V. Archs. Virol. 120 1991 151–164
Sinaloa tomato leaf curl geminivirus: biological and molecular evidence for a new subgroup III virus. Idris,
A.M. and Brown, J.K. Phytopathology 88 1998 648–657
Pflanzliche Virologie. Klinkowski, M. Akademie Verlag Band 2–4Berlin 1977a 434 pp., 389 pp., 528 pp
Pflanzliche Virologie. Klinkowski, M. Akademie Verlag Registerband. Verzeichnisse und Übersichten zu den
Virosen in EuropaBerlin 1977b 337 pp
Pflanzliche Virologie. Klinkowski, M. Akademie Verlag Band 1. Einführung in die allgemeinen
ProblemenBerlin 1980 658 pp
Studies on the use of antiphytoviral compounds in potato stem cutting cultures considering the quantitative virus
resistance of cultivars. Kluge, S., Möschke, M. and Schulze, S. Arch. Phytopath. Pflanzenschutz. 26
1990 353–358
The Plant Viruses. Vol. 3. Koenig, R. Plenum Press Polyhedral Virions with Monopartite RNA GenomesNew
York and London 1988 294 pp
Arthropodenviren. Krieg, A. Georg Thieme VerlagStuttgart 1972 328 pp
Handbook of Plant Virus Infections. Kurstak, E. Elsevier/North-Holland Biomedical Press Comparative
DiagnosisAmsterdam 1981 943 pp
Applied Virus Research. Vol. 1 Kurstak, E., Marusyk, R.G. and Murphy, F.A. Plenum Publ. Corp New Vaccines
and ChemotherapyNew York 1988
Nematode Vectors of Plant Viruses. Lamberti, F., Taylor, C.E. and Seinhorst, J.W. Plenum PressLondon and
New York 1974 460 pp
Cytopathological effects induced by maize chlorotic mottle virus in infected maize. Lesemann, D.-E. VIIIth
Conf. Virus Diseases of Graminaceae in Europe., Goslar 1998
Vírusok, fertőző gének. Lomniczi, B. Gondolat KiadóBudapest 1978 326 pp
Characterization, nucleotide sequence and genome organization of leek white stripe virus, a putative new
species of the genus Necrovirus. Lot, H., Rubino, L., Delecolle, B., Jacquemond, M., Turturo, C. and
Russo, M. Arch. Virol. 141 1996 2375–2386
The classification of viruses. Lwoff, A. and Tournier, P. Ann. Rev. Microbiol. 20 1966 45–74
A system of viruses. Lwoff, A., Horne, R. and Tournier, P. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 27 1962 51–
55
Plant Viruses. Vol I. Mandahar, C.L. CRC Press Structure and ReplicationBoca Raton 1989 366 pp
Leafhopper Vectors and Plant Disease Agents. Maramorosch, K. and Harris, K.F. Academic PressNew York
1979 654 pp
Methods in Virology. Vol. I–VIII. Maramorosch, K. and Koprowski, H. Academic PressNew York and London
1967–1984
Trichovirus, a new genus of plant viruses. Martelli, G.P., Candresse, T. and Namba, S. Arch. Virol. 134 1994
451–455
Oleavirus, a new genus in the family Bromoviridae. Martelli, G.P. and Grieco, F. Arch. Virology 142 1997
1933–1936
Irodalom
301 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Foveavirus, a new plant virus genus. Martelli, G.P. and Jelkmann, W. Arch. Virology 143 1998 1245–1249
Vitivirus, a new genus of plant viruses. Martelli, G.P., Minafra, A. and Saldarelli, P. Arch. Virology 142 1997
1929
Aureuvirus, a novel genus in the family Tombusviridae. Martelli, G.P., Russo, M., Rubino, L. and Sabanadzovic,
S. Arch. Virology 143 1998 1847–1851
Plant Virology. 3rd ed. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1991 835 pp
Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego 1992 403 pp
Diagnosis of Plant Virus Diseases. Matthews, R.E.F. CRC PressBoca Raton 1993 374 pp
Angewandte Pflanzenvirologie. Mayer-Kahsnitz, S. B. Thalacker VerlagBraunschweig 1993 218 pp
Recent revision of the rules of virus classification and nomenclature. Mayo, M.A. Arch. Virol. 141 1996 2479–
2484
Molecular biology of luteoviruses. Mayo, M.A. and Ziegler-Graf, V. Adv. Virus Res. 46 1996 413–460
Virus taxonomy – 1997. Mayo, M.A. and Pringle, C.R. J. Gen. Virology 79 1998 649–657
Family Luteoviridae: A reclassification of luteovirus. . Mayo, M.A. and D‟Arcy, C. J. CAB International In:
Smith, H. G. and Barker, H. (Eds.): The Luteoviridae CABI PublWallingford 1999 15–22
Taxonomy of viruses, 1975. Melnick, J.L. Progr. med. Virol., 20 1975 208–211
Alternatives to the species concept for virus taxonomy. Milne, R.G. Intervirol. 24 1985 94–98
The Plant Viruses. Vol. 4. Milne, R.G. Plenum Press The Filamentous Plant VirusesNew York and London 1988
423 pp
Ophioviruses, an emerging cluster of plant viruses. Milne, R.G., Accotto, G.P., Lisa, V. and Vaira, A.M. Xth
International Congr. Virology. Jerusalem 1996 84
CMI/AAB (now AAB) Descriptions of Plant Viruses. Murant, A.F. and Harrison, B.D. Sets 1–22. Assoc. Appl.
Biol., Wellesbourne 1970-1989
Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Murphy, F.A., Fauquet, C.M., Bishop, D.H.L.,
Ghabrial, S.A., Jarvis, A.W., Martelli, G.P., Mayo, M.A. and Summers, M.D. Springer VerlagWien
and New York 1995 586 pp
A vírusok biológiája. Nász, I. Medicina Kiadó In: Csaba, Gy. (szerk.): A biológia aktuális problémáiBudapest
1975 9–67
Vírusrendszertan. Nász, I. Biológia 27 1979 3–43
Álatalános virológia. Nász, I. Medicina Könyvkiadó In: Nász, I., Klinikai mikrobiológiaBudapest 1988 49–95
Az adenovírusok és kórokozó szerepük. Nász I., Béládi I. és Lengyel A. Akadémiai KiadóBudapest 1967
Vírus, Mycoplasma and Rickettsia Diseases of Fruit Trees. Németh, M. Akadémiai KiadóBudapest 1986 841 pp
Viren, Mykoplasmosen und Rickettsien. Nienhaus, F. UlmerStuttgart 1985 264 pp
Identification of Plant Viruses. Noordam, D. Methods and Experiments. PUDOC.: Wageningen 1973 207 pp
Taxonomy of several tobamoviruses from China as determined by molecular hybridization analysis with
complementary DNA. Palukaitis, P., Randles, J.W., Tian Ying-tuan, Kang, Liang-yi and Tien, Po
Intervirology 16 1981 136–141
Irodalom
302 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Yield losses in virus-infected crops. Pennazio, S., Roggero, P. and Conti, M. Arch. Phytopath. Pflanz. 30 1996
283–296
Virus nomenclature. Pereira, H.G. Nature 210 1966 149–150
Recent Progress in Tospovirus and Thrips Research. Peters, D. and Goldbach, R. 4th Internat. Symp.
Tospoviruses and Thrips in Floral and Vegetable Crops. Wageningen 1998 110 pp
Strawberry vein banding virus – definitive member of the genus caulimovirus. Petrzik, K., Benes, V., Mráz, I.,
Honetlegrová-Fránová, J., Ansorge, W. and ¹pak, J. Virus Genes 16 303–305
The universal system of virus taxonomy of the International Committee on Virus Taxonomy (ICTV), including
new proposals ratified since publication of the Sixth ICTV Report in 1995. Pringle, C.R. Arch. Virol.
142/1 1998 203–208
The emergence of whitefly-transmitted geminiviruses in tomato in the Western Hemisphere. Polston, J.A. and
Anderson, P.A. Plant Dis. 81 1997 1358–1359
Nucleotide sequence and taxonomy of maize chlorotic dwarf virus within the familie Sesquiviridae. Reddick,
B.B., and Habera, L.F. J. Gen. Virol. 78 1997 1165–1174
Mechanisms of plant virus evolution . Roossinck, M.J. Ann. Rev. Phytopathol. 35 1997 191–209
A phylogenetic and evolutionary justification for three genera of Geminiviridae. Rybicki, E.P. Arch. Virol. 139
1994 49–77
Virologisches Praktikum. Schmelzer, K., Schmidt, H.E. und Wolf, P. Akademie Verlag In: Klinkowski, M.
(Ed.), Pflanzliche Virologie. Band 1, Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 531–610
Synthetic Antiphytoviral Substances. Schuster, G. Plenum Publ. Corp In: Kurstak, E., Marusyk, R.G. and
Murphy, F.A. (Eds), Applied Virology Research. Vol. 1. New Vaccines and ChemotherapyNew York
1988 265–283
Isolation and characterization of a rodshaped, whitefly transmissible, DNA-containing plant virus. Sela, I.,
Assouline, I., Tanne, E., Cohen, S. and Marco, S. Phytopathology 70 1980 226–228
The Potyviridae. Shukla, D.D., Ward, C.W. and Brunt, A.A. CAB InternationalWallingford 1993 516 pp
The Luteoviridae. Smith, H.G. and Baker, H. CABI Publ. CAB InternationalWallingford 1999 297
Insect Virology. Smith, K.M. Academic PressNew York and London 1997 256. pp
Phylogenetic relationships within the family Potyviridae: Wheat streak mosaic virus and brome streak mosaic
virus are not members of the genus Rymovirus. Stenger, D.C., Hall, J.S., Choi, Il-R. and French, R.
Phytopathology 88 1998 782–787
Az L333, az azadihidrouracil (DHT) és a cianoguanidin (CG) gátló hatása az árpa csíkos mozaik vírus (BSMV)
ellen. Tallóczy, Zs. és Gáborjányi R. Növénytermelés 39 1990 245–253
Proposed re-classification of furoviruses. Torrance, L. and Mayo, M.A. Arch. Virol. 142/2 1997 435–439
Gyümölcsfák vírusos, mikoplazmás és rickettsiás betegségei. V., Németh M. Mezőgazdasági KiadóBudapest
1979 629 pp
Applying the species concept to plant viruses. Van Regenmortel, M.H.V. Arch. Virol. 104 1989 1–17
Virus species, a much overlooked but essential concept in virus classification. Van Regenmortel, M.H.V.
Intervirol. 31 1990 241–254
Viral species. Van Regenmortel, M.H.V. Chapman and Hall Ltd In: Claridge, M.F., Dawah, H.A. and Wilson,
M.R. (Eds), Species: The Units of BiodiversityLondon 1997 17–24
Irodalom
303 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
The Plant Viruses. Van Regenmortel, M.H.V. and Fraenkel-Conrat, H. Plenum PressNew York and London
1986 424 pp
The concept of virus species. Van Regenmortel, M.H.V., Maniloff, J. and Calisher, C. Arch. Virol. 120 1991
313–314
Applied Plant Virology. Walkey, D.G.A. Heinemann LtdLondon 1986 329 pp
Interspecific reassortment in the evolution of a cucumovirus. White, P.S., Morales, F.J. and Roossinck, M.J.
Virology 207 1995 334–337
Classifying viruses at higher levels: symmetry and structure of virus particles as criteria. Wildy, P. Symp. Soc.
Gen. Microbiol. 12 1962 145–163
Classification and Nomenclature of Viruses. Wildy, P. In: Melnick, J.L. (ed.), Monographs in Virology. Vol. 5.
S. Karger, Basel, München, Paris, London, New York, Sydney 1971 450 pp
Ecology and epidemiology of whitefly-transmitted closteroviruses. Wisler, G.C., Duffus, J.E., Liu, H.-Y. and Li,
R.H. Plant Disease 82 1998a 270–280
Tomato chlorosis virus: a new whitefly-transmitted, phloem-limited, bipartite closterovirus of tomato. Wisler,
G.C., Li, R.H., Liu, H.-Y., Lowry, D.S. and Duffus, J.E. Phytopathol. 88 1998b 402–409
Antiphytoviral activity of 1-morpholinomethyl-tetrahydro-2(1H)-pyrimidinone (DD13). Yordanova, A.,
Karparov, A., Stoimenova, E. and Starcheva, M. Plant Pathology 45 1996 547–551
Plant Pathology. Agrios, G. N. Academic PressNew York 1988
Kertészeti növények fonálféreg-kártevői. Andrássy, I. és Farkas K. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1988 419 pp
Plant regeneration from seedling derived callus of dodder (Cuscuta trifolii Bab. et Gibbs). Bakos, Á., Fári, M.,
Toldi, O. and Lados, M. Plant Science 109 1995 95–101
Basky, Zs. (1993) Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 28 71–121 Identification key for alate aphids caught in
yellow pan traps.
A szilvahimlő vírust terjesztő levéltetvek rajzása és a természetes fertőzés összefüggései. Basky, Zs. és
Gáborjányi R. Növényvédelem 30 1994 201–206
Adsorption of tobacco mosaic virus (TMV) in five soils of Cuba. Blanco-Sanches, N., Crespo, J. and Gonzales,
G. Ciencias de la Agr. 29 1986 9–14
Nematode transmission of plant viruses – a 30 year perspective. Brown, D.J.F. and Trudgill, D.L. Scottish Crop
Research Institute. Ann. Rep. 1997/1998. Invergowrie 1998. pp 1988 121–125
Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcercisesBerlin–
Heidelberg 1998 458 pp
Methoden der Übertragung pflanzenpathogener Viren durch Nematoden. Fritzsche, R. Biol. Zbl. 86 1967 753–
759
Tierische Vektoren pflanzenpathogener Viren. Fritzsche, R., Karl, E., Lehmann, W. und Proeseler, G. VEB
Gustav Fischer VerlagJena 1972 521 pp
Bevezetés a növényvirológiába. Gáborjányi, R. JATE PressSzeged 1991
Adatok a sztolbur vírus magyarországi elterjedéséhez. Gáborjányi, R. és Lönhard M. Növényvédelem 3 1967
176–180
A paradicsom bronzfoltosság vírus (TSWV) járványtani kérdései. Gáborjányi R., Jenser G. és Nagy Gy.
Növényvédelem 29 1993 543–547
Irodalom
304 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Characterization and natural spread of tomato spotted wilt virus isolated in Hungarian tobacco plantations.
Gáborjányi, R., Jenser, G. and Vasdinyei, R. Horticultural Science 26 1994 91–94
A paradicsomot, a paprikát és a dohányt fertőző paradicsom bronzfoltosság vírus hazai izolátumainak tünettani
és szerológiai jellemzése. Gáborjányi R., Vasdinyei R., Almási A., Csilléry G. és Ekés M.
Növényvédelem 31 1995 533–540
Plant Virology. Gibbs, A. and Harrison, B. The Principles. Edward Arnold, London 1976
Evidence that a component other than the virus particle is needed for aphid transmission of potato virus Y.
Govier, D. A. and Kassanis, B. Virology 57 1974 285–286
Partial purification and characterization of the potato virus Y helper component. Govier, D. A., Kassanis, B.
and Pirone, T. P. Virology 78 1977 306–314
Vectors of Plant Pathogens. Harris, K. F. and Maramorosch, K. Academic PressNew York 1980 467 pp
Transmission of tobacco ratte virus isolate PpK20 by its nematode vector requires one of the two nonstructural
genes in the viral RNA2. Hernández, C., Visser, P. B., Brown, D.J.F. and Bol, J.F. J. Gen. Virology 78
1997 465–467
Methods in Virology. Hill, S. A. Blackwell Sci. PublOxford 1984 167 pp
The water-culture method for growing plants without soil. Hoagland, D.R. and Arnon, D.J. Coll. Agr. Univ.
CalifBerkeley 1950
A levélsodródás vírus (Corium solani Holmes) kimutatására alkalmazott Igel-Lange teszt megbízhatósága.
Horváth, J. Növénytermelés 3 1962 257–266
A burgonya levélsodródás vírus (Corium solani Holmes) átvitele indikátornövényekre. Horváth, J.
Növénytermelés 1 1963 57–64
Green petal – a new disease of rape in Hungary. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 4: 1969 363–367
A sárgaság típusú növénybetegségeket okozó mikoplazmák tulajdonságai és a növényi mikoplazmózisok.
Horváth, J. Növénytermelés 19 1970 327–337
Növényvírusok, vektorok, vírusátvitel. Horváth, J. Akadémiai KiadóBudapest 1972 515 p
Újabb adatok a mikoplazmák és mikoplazmózisok tulajdonságairól és előfordulásáról. Horváth, J. A
Növényvéd. Korszerűsítése 8 1974 103–148
Host Plants in Diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: R.E.F. Matthews (Eds), Diagnosis of Plant Virus
DiseasesBoca Raton, Florida 1993a 15–47
Hosts and non-hosts in the diagnostic strategy of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. Hung.
28 1993b 257–354
Isolation of cucumber mosaic virus from a water plant living in the Lake Balaton. Horváth, J. Malhotra Publ.
House In: Rishi, N., Ahuja, K. L. and Singh, B. P. (Eds), Virology in the TropicsNew Delhi 1994 211–
216
Növényvirológia. Horváth, J. Egyetemi jegyzet. Pannon Agrártudományi Egyetem, Keszthely 1999 237 pp
Solanum demissum-Hybride A6 als neue Testpflanze für den Nachweis des Gurkenmosaik-Virus (cucumber
mosaic virus). Horváth, J. and Pocsai, E. Z. Pfl-Krankheiten 78 1971 695–699
Tobacco mosaic virus in Danube water in Hungary. Horváth, J., Juretiæ, N., Krajaæiæ M. and Mamula, D. Acta
Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986 337–340
Transmission of plant viruses by dodder. Hosford, R. M. Bot. Rev. 33 1967 387–406
Irodalom
305 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Molecular biology of plant virus-vector interaction. Hull, R. Springer-Verlag In: Harris, K.F. (Ed), Advances in
Disease Vector ResearchNew York 1994 361–383
Kis nematologia. Jávor, I. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1974 142 pp
A tripszek szerepe a paradicsom bronzfoltosság vírus terjedésében. Jenser, G. Növényvédelem 31 1995 541–
545
Seed transmission of viruses: current perspectives. Johansen, E., Edwards, M.C. and Hampton, R.O. Ann. Rev.
Phytopathol. 32 1994 363–386
Experimental transmission of viruses in diagnosis. Jones, A.T. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis
of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993a 49–72
Virus transmission through soil and by soil-inhabiting organisms in diagnosis. Jones, A.T. CRC Press In:
Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993b 73–99
Some data on adsorption of two plant viruses to soil. Juretiæ, N. and Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol.
Hung. 26 1991 423–426
Occuring of ribgrass mosaic virus in water of Hungarian river Zala. Juretiæ, N., Horváth, J. and Krajaèiæ, M.
Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986 291–295
Pflanzliche Virologie. Band I. Klinkowski, M. Akademie Verlag Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin
1958
Plant viruses in rivers and lakes. Koenig, R. Adv. Virus Res. 31 1986 321–333
Plant viruses in German rivers and lakes. I. Koenig, R. and Lesemann, D. E. Tombusviruses, a potexvirus and
carnation mottle virus. Phytopath. Z. 112 1985 105–116
Isolation of carnation ringspot virus from a canal near a sewage plant: cDNA hybridization analysis, serology
and cytopathology. Koenig, R., Lesemann, D. E. and Burgermeister, W. J. Phytopathology 121 1988
346–356
Membran feeding systems aphids research. Kunkel, H. Academic Press In: Harris, K. F. and Maramorosch, K.
(Eds), Aphids as Virus VectorLondon 1977 311–339
Molecular biology of the tobravirus genome. MacFarlane, S., Brown, D.J.F., Vassilakos, N., Mooney, A.,
Schmitt, C., Mueller, A-M., Prior, D. and Oparka, K. Scottish Crop Research Institute. Ann. Rep.
1997/1998. Invergowrie, pp 1998 129–131
Angewandte Pflanzenvirologie. Meyer-Kahsnitz, S. Bernhard Thalacker VerlagBraunschweig 1993 218. pp
Pollen- and seed-transmitted viruses and viroids. Mink, G.I. Ann. Rev. Phytopath. 31 1993 375–402
Aseptic cultivation of four virus transmitting species of leafhoppers (Cicadellidae). Mitsuhashi, J. and
Maramorosch, K. Contrib. Boyce Thompson Inst. 22 1963 165–173
Notes on aphid transmission of potato leafroll virus. Miyamoto, S. and Miyamoto, Y. Scient. Rep. Hyogo Univ.
Agric., Ser. Plant Protection 7 1966 51–66
The Vpg of tobacco etch virus RNA is the 49-Kda proteinase or the N-terminal 2,4-Kda part of the proteinase.
Murphy, J.F., Rhoads, R.E., Hunt, A.G. and Shaw, J.G. Virology 178 1990 285–288
Übertragung der Gelbsuchtviren durch die Zwergzikade Euscelis plebejus (Fallén). Musil, M. Biol. Práce 1
1965 1–86
Identification of Plant Viruses. Methods and Experiments. Noordam, D. Centre for Agricultural Publishing and
Documentation (Pudoc), Wageningen 1973
First report on the multiplication of tomato spotted wilt tospovirus in tobacco thrips, Frankliniella fusca. Pappu,
H.R., Todd, J.W., Culbreath, A.K., Bandla, M. and Sherwood, J.L. Plant Disease 82 1998 1282
Irodalom
306 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A Manual of Entomological Techniques. Peterson, A. 7th Ed. Edwards, Ann. Arbor, Michigen 1953
Efficiency and selectivity of the helper-component-mediated aphid transmission of purified potyvirus. Pirone,
T.P. Phytopathology 71 1981 922–924
Viral genes and gene products that determine insect transmissibility. Pirone, T.P. Virology 2 1991 81–87
Nematode transmission. Raski, D. J. and Hewitt, W. B. Academic Press In: Maramorosch, K. and Koprowski,
H. (Eds): Methods in Virology. Vol. INew York 1967 309–345
Loss of aphid-transmissibility of turnip mosaic virus. Sako, N. Phytopathology 70 1980 647–649
A helper factor essential for aphid transmissibility of turnip mosaic virus. Sako, N. and Ogata, K. Ann.
Phytopath. Soc. Japan 47 1981 68–70
Beiträge zur Kenntnis der Übertragbarkeit von Viren durch Cuscuta-Arten. Schmelzer, K. Phytopath. Z. 28
1956 1–56
Übertragungsmöglichkeiten. Schmelzer, K. Akademie Verlag Übertragung unter Ausschluss tierischer
Vektoren. In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band. 1. Einführung in die allgemeinen
ProblemeBerlin 1980 111–133
Virologisches Praktikum. Allgemeines, Übertragung, Nachweis. Schmelzer, K., Schmidt, H.E. und Wolf, P.
Akademie Verlag In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band 1., Einführung in die
allgemeinen ProblemeBerlin 1980 531–610
Samenübertragbare Viren bei Gemüsekulturen. Schmidt, H.E. Vortr. Pflanzenzüchtung 29 1994 109–136
Immunological detection and mutational analysis of the RNA2-encoded nematode transmission proteins of pea
early browing virus. Schmitt, C., Mueller, A-M., Mooney, A., Brown, D. and MacFarlane, S. Virology
79 1998 1281–1288
The quantitative extraction of nematodes from soil. Seinhorst, J. W. Nematologica 1 1956 249–267
Aphid transmission of cucumber mosaic virus affected by temperature and age of infection in diseased plants.
Stimmann, M. W. and Swenson, K. G. Phytopathology 57 1967 1074–1076
Virus transmission by aphids. Sylvester, E. S. Interscience Publishers A viewpoint. In: Maramorosch, K. (Ed),
Viruses, Vectors and VegetationNew York 1969 159–173
Aquisition, retention and transmission of viruses by nematodes. Taylor, C. E. and Robertson, W. M. Plenum
Press In: Lamberti, F., Taylor, C. E., and Seinhorst, J. W. (Eds), Nematode Vectors of Plant
VirusesLondon 1975 253–276
Fungus transmission of plant viruses. Teakle, D. S. Academic Press In: Maramorosch, K. and Koprowski, H.
(Eds), Methods in Virology. Vol. INew York 1967 369–391
Purification and characterization of potyvirus helper component. Thornbury, D. W., Hellmann, G. M., Rhoads,
R. E. and Pirone, T. P. Virology 144 1985 260–267
Criteria for host plant acceptance by aphids. Tjallingii, W. F. and Mayoral, A. Kluwer Academic Press In:
Menken, S. B. J., Visser, J. H. and Harrewijn, P. (Eds). Proc. 8th Internat. Symp. Insect Plant
RelationshipsDordrecht 1992 280–282
Virus diseases of cucumbers. Van Dorst, H. J. M. Ann. Rep. Glasshouse Grops Res. and Exp. Stat., Naaldwijk
1961 75
Exclusivity and complementarity in the association between nepo- and tobraviruses and their respective vector
nematodes. Vassilakos, N., MacFarlane, S. A., Weischer, B. and Brown, D. J. F. 1997. Med. Fac.
Landbouww. Univ. Gent, 62/3a 1997 713–720
Irodalom
307 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Loss of potyvirus transmissibility and helper component activity correlates with non-retention of virions in
aphid stylet. Wang, R. Y., Ammar, E. D., Thornbury, D. W., Lopez-Moya, J. J. and Pirone, T. P. J.
Gen. Virology 77 1996 861–867
Role of helper component in vector-specific transmission of potyviruses. Wang, R. Y., Powel, G., Hardie, J. and
Pirone, T. P. J. Gen. Virology 79 1998 1519–1524
Testing methods for, genetics of and breeding for resistance to rice stripe disease. Washio, O., Ezuka, A.,
Toriyama, K. and Sakurai Y. Bull. Chugoku Agr. Exp. Stn. 16 1968 39–197
A szaporítóanyag certifikációs rendszere és követelményei. Bach, I. és Szőnyegi S. OMMI, BFNTÁBudapest
1996
Grapevine disease in Hungary caused by alfalfa mosaic virus infection. Beczner, L. and Lehoczky, J. Acta
Phytopath. Acad. Sci. Hung. 16 1981 119–128
Symptoms of Virus Diseases in Plants. Bos, L. Centre Agr. Publ. DocWageningen 1970 1970 206 pp
Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin–
Heidelberg 1998 458 pp
The Potyvirus Group. Vol. 1–4. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. Univ. of Florida, Gainesville 1991
Anatomy of plant virus infections. Esau, K. Ann. Rev. Phytopath. 5 1967 45–76
Effects of light and temperature on symptom development and virus content of tobacco leaves inoculated with
potato mop-top virus. Harrison, B. D. and Jones, R.A.C. Ann. Appl. Biol. 67 1971 377–387
Methods in Plant Virology. Hill, S.A. Blackwell Sci. PublOxford 1984 167 pp
Inoculating methods in tobacco mosaic studies. Holmes, F. O. Bot Gaz. 87 1929 56–63
A comparison of the experimental host ranges of tobacco-etch and tobacco-mosaic viruses. Holmes, F. O.
Phytopathology 36 1946 643–659
Studies on strains of potato virus Y. 1. Horváth, J. Strain C. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1 1966a 125–138
A burgonyát fertőző vírusok differenciálásának módszerei és a burgonya Y-vírustörzsek (Marmor upsilon
Holmes) tulajdonságai. Horváth, J. Kandidátusi Ért. Rostock-Budapest 1966b 231 pp
Separation and determination of viruses pathogenic to potatoes with special regard to potato virus Y. Horváth,
J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 2 1967 319–360
Die Anfälligkeit von Chenopodium amaranticolor Coste et Reyn. gegenüber dem Kartoffel-Y-Virus im Hinblick
auf die Blattsequenz. Horváth, J. Acta Bot. Acad. Sci. Hung. 15 1969a 71–77
Die Anfälligkeit und Symptomausprägung der Blätter von Nicotiana tabacum L. cv. Hicks Fixed A2-426 nach
Infection mit dem tobacco mosaic virus in Abhängigkeit von ihrer Sequenz am Spross. Horváth, J. Acta
Phytopath. Acad. Sci. Hung. 4 1969b 131–137
Trennung und Nachweis des Kartoffel-X- und Kartoffel-Y-Virus mittels Chenopodium murale Horváth, J. L. Z.
PflKrankh. PflSchutz 76 1969c 9–11
Növényvírusok, vektorok, vírusátvitel. Horváth, J. Akadémiai KiadóBudapest 1972 515 pp
A hőmérséklet és a fotoperiódus hatása a Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi-nc dohány-levélkorongok lokális
érzékenységére a dohány mozaik vírussal szemben. Horváth, J. és Pocsai E. A Növényvéd.
Korszerűsítése 6 1972 65–82
Vírus-gazdanövénykörök és vírusdifferenciálás. Horváth, J. Akadémiai Doktori Ért., Budapest-Keszthely 1976
607 pp
Irodalom
308 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Preservation of some plant viruses by dehydration over anhydrous calcium chloride (CaCl2). Horváth, J. and
Besada, W.H. Z. PflKrankheiten 87 1980 463–472
New artificial hosts and non-hosts of plant viruses and their role in the identification and separation of viruses.
XVIII. Concluding remarks. Acta Phytopath. Horváth, J. Acad. Sci. Hung. 18 1983 121–161
Újabb adatok a növények vírusfogékonyságáról. 5. Horváth, J. Chenopodiaceae (Chenopodium fajok). Bot.
Közlem. 73 1986 229–242
Potato gene centres, wild Solanum species, viruses and aphid vectors. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol.
23 1988 423–448
A burgonyavírus-kutatás helyzete Magyarországon: Múlt, jelen, jövő. Horváth, J. Burgonyatermesztés 2 1990
36–66
Hosts and non-hosts in the diagnostic strategy of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomo 28 1993a
257–354
A list of proposed letter codes for hosts and non-hosts of plant viruses. Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol.
28 1993b 21–58
Host plants in diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (ed), Diagnosis of Plant Virus
DiseasesBoca Raton 1993c 15–48
The role of Nicotiana species in plant virology with special regard to Nicotiana benthamiana Domin: A review.
Horváth, J. Acta Phytopath. et Entomol. 28 1993d 355–377
A szántóföldi növények betegségei. Horváth, J. Mezőgazda KiadóBudapest 1995 428 pp
Potato virus research in Hungary. Horváth, J. and Kazinczi, G. Global Conf. Potato, New Delhi, p 1999 267
Transmission of viruses from apperently healthy potatoes. Johnson, J. Wisc. Agr. Exp. Stat., Res. Bull. No. 63
1925
Szaporítóanyagok EU-minősítési rendszere és meghonosítása Magyarországon. Kiss, P. Agroinform Kiadó és
Nyomda Kft FM EU-Integrációs Sorozat. 17Budapest 1998 1–34
Untersuchungen über die Viruskrankheiten der Kartoffel. 1. Köhler, E. Versuche mit Viren aus der
Mosaikgruppe. Phytopath. Z. 5 1933 567–591
Szőlővírusokkal kapcsolatos újabb hazai kutatások eredményei. Lázár, J. Egyetemi Doktori Értekezés. Budapest
1996
A hazai szőlő-vírusmentesítési program történeti előzményei, jelene és megoldásra váró problémái. Lázár, J.
Növényvédelem 35 1998 415–418
A szőlő virológiai szűrésének mai gyakorlata és a vírusmentes egészségi állapot megőrzésének kilátásai a termő
üzemi szőlőültetvényekben. Lehoczky, J. Kertgazdaság 13 1981 59–77
Szőlőtőkék korai elhalásának etiológiája. Lehoczky, J. Doktori Ért., Budapest 1992
Szőlőbetegség a lucerna mozaik vírus fertőzésétől. Lehoczky, J. és Beczner L. Vírusátvitel fás szárú
indikátorokra (indexelés). Kertgazdaság 12 1980 59–66
A paradicsom fekete gyűrűs vírus előfordulása szőlőben Magyarországon. Lehoczky, J. és Burgyán J.
Kertgazdaság 18 1986 47–57
A szőlő krómmozaik vírusbetegségének elterjedése hazánkban és vírusának kimutatása ELISA technikával a
szabadföldi tőkék leveléből. Lehoczky J., Kölber M., Beczner L. és Pácsa S. Kertgazdaság 16 1984 41–
52
Isolation of Arabis mosaic virus from Hungarian grapevines. Martelli, G.P. and Lehoczky, J Phytopath. Medit.
7 1968 129–133
Irodalom
309 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Über die Mosaikkrankheit des Tabaks. Mayer, A. Landwirtsch. Versuchsstat. 32 1886 451–467
CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses. Murant, A. F. and Harrison, B. D. Assoc. Appl. Biol., Wellesbourne,
Warvick 1970-1988
Gyümölcsfák vírusos, mikoplazmás és rickettsiás betegségei. Németh, M. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1979
629 pp
Vírus, mycoplasma and rickettsia diseases of fruit trees. Németh, M. Akadémiai KiadóBudapest 1986 1986 841
pp
A vírusmentes gyümölcs szaporítóanyag-előállítás rendszerének hazai kialakulása, jelenlegi problémái és
kutatási feladatai. Németh, M. és Kölber M. Növényvédelem 35 1998 409–414
Identification on Plant Viruses. Noordam, D. Methods and Experiments. Centre for Agr. Publ. Doc.,
Wageningen 1973
Yield losses in virus-infected crops. Pennazio, S., Roggero, P. and Conti, M. Arch. Phytopath. Pflanz. 30 1996
283–296
Recovery of plants from viral diseases: historical and new perspectives. Pennazio, S., Roggero, P. and Conti, M.
Z. Pflanzenkrankh. Pflschutz 106 1999 128–139
A szántóföldi növények vírusmentesítési rendszere. Pocsai, E. Növényvédelem 35 1998 419–428
Comparative host ranges of six plant viruses. Price, W. C. Amer. J. Botany 17 1940 694–702
Äussere Symptome. Schmelzer, K. Akademie Verlag In: Klinkowski, M., Pflanzliche Virologie. Band 1.
Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 21–83
Virologisches Praktikum. a, Allgemeines, Übertragung, Nachweis. Schmelzer, K., Schmidt, H. E. und Wolf, P.
Akademie Verlag In: Klinkowski, M., Pflanzliche Virologie. Band 1., Einführung in die allgemeinen
ProblemeBerlin 1980 531–610
Pathologische Zytologie und Anatomie. Schmidt, H.B. Akademie Verlag In: Klinkowski, M., Pflanzliche
Virologie. Band 1. Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 84–110
On the composite nature of certain potato virus diseases of the mosaic group as revealed by the use of plant
indicators and selective methods of transmission. Smith, K.M. Proc. Roy. Soc. B109 No. 251 1931
Arabis mosaic virus. Thomas, B. J. In: Hammond, J. and Lawson, R. H. (Eds), Diagnostic Methods for Viruses
of Ornamental Crops. Florist and Nursery Crops Laboratory, USDA, BARC-West, Beltsville, USA
1983 3–4
A vírusmentes gyümölcsszaporító-anyag előállítás bázisültetvényeinek kialakítása, fenntartása az Érdi GyDKF
Kft-nél. Voigt, E. és Kállay T. Növényvédelem 34 1998 688–692
Procedures to increase virus yield from infected plants. Yarwood, C.E. Academic Press, New York In:
Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. V 1971 451–479
Leaf-dip serology. In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. V. Ball, E.M.
Academic Press, New York 1971 445–450
Elektronmikroskopische Untersuchungen am Kartoffel-X- und Tabakmosaik-Virus. Bode, O. und Köhler, E. Z.
Naturf. 7b 1952 598–600
Identifizierung von gestreckten pflanzenpathogenen Viren auf morphologischer Grundlage. Brandes, J. Mitt.
biol. BundAnst. Ld-u. Forstw. 110 1964 1–130
Classification of elongated plant viruses on the basis of particle morphology. Brandes, J. and Wetter, C.
Virology 8 1959 99–115
Atlas of Plant Viruses . Vol. I-II. Francki, R.I.B., Milne, R.G. and Hatta, T. CRC PressBoca Raton 1985
Irodalom
310 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin-
Heidelberg 1998 458 pp
The relationship between barley stripe mosaic and lychnis ringspot viruses. Gibbs, A.J., Kassanis, B., Nixon,
H.L. and Wood, R.D. Virology 20 1963 194–198
The use of negative staining in the electron microscopic examination of plant viruses in crude extracts.
Hitchborn, J.H. and Hills, G.J. Virology 27 1965 528–540
Techniques for Electron Microscopy. Kay, D. Blackwell Scientific Publications Oxford 1961 1961
Use of thin sectioning for visualization and identification of plant viruses. Martelli, G.P. and Russo, M.
Academic Press In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol.
VIIIOrlando 1984 143–224
Immunosorbent electron microscopy in plant virus studies. Milne, R.G. and Lesemann, D.-E. In Academic
Press: New YorkMaramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. VIII 1984 85–
101
Electron microscopy for the identification of plant viruses in in vitro preparations. Milne, R.G. Academic Press
In: Maramorosch, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. VIINew York 1984 87–112
Electron microscopy of in vitro preparations. Milne, R.G. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of
Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993 215–251
Elektronenmikroskopie. Schmidt, H.B. Akademie Verlag In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band
1. Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980a 329–353
Die Darstellung des Virus im Elektronmikroskop. In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche Virologie. Band 1.
Schmidt, H.B. Akademie Verlag Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980b 599–610
Localization of the 34 kDa polyhedron envelope protein in Spodoptera frugiperda cells infected with
Autographa californica nuclear polyhedrosis virus. Van Lent, J.W.M., Groenen, J.T.M., Klinge-Roede,
E.C., Rohrmann, G.F., Zuidema, D. and Vlak, J.M. Arch. Virol. III 1990 103–114
Comparison of ultrastructural changes of Nicotiana benthamiana infected with three different viruses. Almási,
A., Ekés, M. and Gáborjányi, R. Acta Phytopath. et Entomol. 31 1996 181–190
Association of virions and coat protein of tobacco vein mottling potyvirus with cylindrical inclusions in tobacco
cells. Ammar, E.D., Rodríguez-Cerezo, E., Shaw, J.G. and Pirone, T.P. Phytopathology 84 1994 520–
524
Chlorophyll, chloroplast ribosomal RNA, DNA are reduced by barley stripe mosaic virus systemic infection.
Brakke, M.K., White, J.L., Samson, R.G. and Joshi, J. Phytopathology 78 1988 570–574
Light and Electron Microscopy of Plant Virus Inclusion. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Florida
Agricultural Experiment Stations. Monograph Ser. Nr. 9., Institute of Food and Agricultural Sciences,
University of Florida, Gainesville 1977
Light microscopic techniques for detection of plant virus inclusion. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Plant
Dis. 70 1986 271
Cell to cell movement of tobacco ringspot virus. Davison, E.M. Virology 37 1969 694
Practical Plant Virology. Protocols and Excercises. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer VerlagBerlin-
Heidelberg 1998 458 pp
Assembly of Enveloped RNA Viruses. Dubois-Dalcq, M., Holmes, K.V. and Rentier, B. Springer-VerlagWien
1984
Handbook of Viruses Infecting Legumes. Edwardson, J.R. and Christie, R.G. CRC PressBoca Raton 1991
Irodalom
311 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Inclusions in diagnosing plant virus diseases. Edwardson, J.R., Christie, R.G., Purcifull, D.E. and Petersen,
M.A. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993 101–
128
Viruses in Plant Hosts. Esau, K. The University of Wisconsin PressMadison 1968
Cauliflower mosaic virus gene II product forms distinct inclusion bodies in infected plant cells. Espinoza, A.M.,
Medina, V., Hull, R. and Markham, P.G. Virology 185 1991 337–344
Barley yellow mosaic virus: purification, electron microscopy, serology, and other properties of two types of the
virus. Huth, W., Lesemann, D.-E. and Paul H.-L. Phytopath. Z. 111 1984 37–54
Electron microscopy of developmental stages of tomato spotted wilt virus in plant cells. Ie, T.S. Virology 2 1971
468–479
Plant virions in plasmodesmata. Kitajima, E.W. and Lauritis, J.A. Virology 37 1969 681
Comparative cytological and immunogold labelling studies on different isolates of tomato spotted wilt virus.
Kitajima, E.W., Ávila, de A.C., Resende, R. de O., Goldbach, R.W. and Peters, D. J. Submicrosc.
Cytol. Pathol. 24 1992 1–14
Peripheral vesicles of barley stripe mosaic virus-infected wheat cells contain double-stranded RNA. Lin, N.-S.
and Langenberg, W.G. Virology 142 1985 291–298
Coat protein-related polypeptides from in vitro tobacco mosaic virus coat protein mutants do not accumulate in
the chloroplasts of directly inoculated leaves. Lindbeck, A.G.C., Dawson, W.O. and Thomson, W.W.
Molecular Plant-Microbe Interactions 4 1991 89–94
Plant virus inclusion bodies. Martelli, G.P. and Russo, M. ( Adv. Virus Res. 21 1977 175
Host plant responses to virus infection. In: Fraenkel-Konrat, H. and Wagner, R.R. (Eds), Comprehensive
Virology. Vol. 16. Matthews, R.E.F. Plenum Press Virus-Host InteractionsNew York 1980 297–359
Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1981
Ultrastructure of cell-wall thickenings and paramural bodies induced by barley stripe mosaic virus. Mc Mullen,
C.R., Garden, W.S. and Myers, G.A. Phytopathology 67 1977 462–467
Aberrant plastids in barley leaf tissue infected with barley stripe mosaic virus. Mc Mullen, C.R., Garden, W.S.
and Myers, G.A. Phytopathology 68 1978 317–325
Some effects of systemic infection by tomato spotted wilt virus on chloroplasts of Nicotiana tabacum leaves.
Mohamed, N.A. Physiological Plant Pathology 3 1973 509–516
Association of TMV coat protein with chloroplast membranes in virus-infected leaves. Reinero A. and Beachy,
R. Plant Molecular Biology 6 1986 291–301
Reduced photosystem II activity and accumulation of viral coat protein in chloroplasts of leaves infected with
tobacco mosaic virus. Reinero A. and Beachy, R. Plant Physiol. 89 1989 111–116
The Potyviridae. Shukla, D.D., Ward, C.W. and Brunt A.A. CAB InternationalCambridge 1994
Light and Electron Microscopy of Plant Virus Inclusions. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Florida
Agricultural Experiment Stations. Monograph Series. Nr. 9. Institute of Food and Agricultural
Sciences, University of Florida, Gainesville 1977
Light microscopic techniques for detection of plant virus inclusions. Christie, R.G. and Edwardson, J.R. Plant
Dis. 70 1986 273
Cytology of virus infection and virus transport. de Zoeten, G.A. Springer-Verlag In: Heitefuss, R. and Williams,
P.H. (Eds), Physiological Plant PathologyBerlin 1976 129–149
Irodalom
312 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin-
Heidelberg 1998 458 pp
Viruses in Plant Hosts. Esau, K. The University of Wisconsin PressMadison 1968
Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1981
Pathologische Zytologie und Anatomie. Schmidt, H.B. Akademie Verlag In: Klinkowski, M. (Ed), Pflanzliche
Virologie. Band 1., Einführung in die allgemeinen ProblemeBerlin 1980 84–110
Néhány fontosabb növényi vírus tisztítási módszere. Balázs, E. és Vassányi, R. Növényvédelmi Kutató
IntézetBudapest 1984 34 pp
Virus degradation and nucleic acid isolation. Bruening, G.E. In: Kado, C.I. and Agrawal, H.O. (Eds), Principles
and Techniques in Plant Virology. Van Nostrand Reinhold, Princeton 1972. pp 1972 444–465
Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcercisesBerlin–
Heidelberg 1998 458 pp
The potential for using double stranded RNAs as diagnostic probes for plant viruses. Dodds, J.A. In: R.A.C.
Jones and L. Torrance. (Eds), Developments in Applied Biology 1. Developments and Applications in
Virus Testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, UK 1986 71–86
Serological comparison of tospoviruses with polyclonal antibodies against the main structural proteins of
TSWV. Feldhoff, A., Kikkert, M., Kormelink, R., Krczal, G., Goldbach, R. and Peters, D. X. Intern.
Congr. Virology, Jerusalem, p 1996 119
Plant Virology Protocols. Foster, G.D. and Taylor, S.C. Humana Press From Virus Isolation to Transgenic
ResistanceTotowa, New Jersey 1998 571 pp
Degradation of tobacco mosaic virus with acetic acid. Fraenkel-Conrat, H. Virology 4 1957 1–4
Purification of potato virus X and preparation of infectious ribonucleic acid by degradation with lithium
chloride. Francki, R.I.B. and McLean, G.D. Australian J. Biol. Sci. 21 1968 1311–1318
A simple technique for purification of tobacco mosaic virus in large quantities. Gooding, G.W., Jr. and Hebert,
T.T. Phytopathol. 57 1967 1285
Methods in Enzymology. Vol. 12A and 12 B. Grossman, L. and Moldave, L. Nucleic Acids. Academic PressNew
York 1967-1968
Propagation of DNA viruses. Methods in Enzymology. Vol. 118. Guilfoyle, T.J. Academic PressNew York 1986
696–704
Növényvírusok, vektorok, vírusátvitel. Horváth, J. Akadémiai KiadóBudapest 1972 515 pp
Application of double-stranded RNA analysis of plants to detect viruses, virus-like agents, virus satellites and
subgenomic viral RNAs. Jones, A.T. In: J.M. Duncan and Torrance, L. (Eds), Techniques for the Rapid
Detection of Plant Pathogens. Blackwell Scientific Publications, Oxford 1992 115–128
Propagation and Purification of RNA Viruses. Lane, L. Academic Press Methods in Enzymology. Vol. 118New
York 1986 687–696
Estudio de la transmisión por áfidos del virus de la sharka, „plum pox virus” (PPV). López-Moya, J.J. Thesis
Doctoral, Univ. Politécnica de Madrid 1993 32–34
The use of hot phenol in preparing DNA. Massie, H.R. and Zimm, B.H. Proc. Natl. Acad. Sci. US. 54 1965
1641–1643
Isolation and analysis of double-stranded RNA from virus-infected plant and fungal tissue. Morris, T.J. and
Dodds, J.A. Phytopathology 69 1979 854–858
Irodalom
313 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Viral specific dsRNA: diagnostic value for plant virus disease identification. Morris, T.J., Dodds, J.A., Hillman,
B., Jordan, R.L., Lommel, S.A. and Tamaki, S.J. Plant Molecular Biology Rep. 1 1983 27–30
CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses. Murant, A.F. and Harrison, B.D. Assoc. Appl. Biol., Wellesbourne,
Warwick 1970-1988
Transmission of several plant viruses by phenol-water extracts of diseased tissues. Schlegel, D. Phytopathology
50 1960 156–158
DNA in cauliflower mosaic virus. Shepherd, R.J., Wakeman, R.J. and Romanko, R.R. Virology 36 1968 150–
152
Double stranded DNA from cauliflower mosaic virus. Shepherd, R.J., Bruening, G.E. and Wakeman, R.J.
Virology 41 1970 339–347
Purification and serological analysis of tomato spotted wilt virus. Tas, P.W. L., Boerjan, M.L. and Peters, D.
Neth. J. Pl. Path. 83 1977 61–72
Isolation and properties of virus proteins. Tsugita, A. and Hirashima, A. In: Kado, C. I. and Agrawal, H. (Eds),
Principles and Techniques in Plant Virology. Van Nostrand Reinhold Co. New York 1972 413–443
Double-stranded RNA analysis of strawberry plants affected by June yellows. Watkins, C.A., Jones, A.T. Mayo,
M.A. and Mitchell M.J. Ann. Appl. Biol. 117 1990 73–83
Isolation and characterization of a protein subunit of broadbean mottle virus. Yamazuki, H. and Kaesberg, P. J.
Mol. Biol. 6 1963 465–673
Molecular biology and molecular genetics of plant bromoviruses. Ahlquist, P. Plenum Press In: von Wettstein.
D. and Chua, N.H (Eds), Plant Molecular BiologyNew York 1987 419–431
Nucleotide sequence of brome mosaic virus genome and its implications for virus replication. Ahlquist, P.,
Dasgupta, R. and Kaesberg, P. J. Mol. Biol. 172 1984 369–383
Complete nucleotide sequence of brome mosaic virus RNA3. Ahlquist, P., Luckow, V. and Kaesberg, P. J. Mol.
Biol. 153 1981 23–38
Nucleotide sequence of DNA from an altered-virulence isolate D/H of the cauliflower mosaic virus. Balázs, E.,
Gulley, H., Jonard, G. and Richards, K. Gene 19 1982 239–249
A defective interfering RNA molecule in Cymbidium ringspot virus. Burgyán, J., Grieco, F. and Russo, M. J.
Gen. Virol. 70 1989 235–239
Non-geminated single stranded DNA plant viruses. Chu, P. Boevink, P., Surin, B., Larkin, P., Keese, P. and
Waterhouse, P. Pergamon Press In: Singh, R., Singh, U. and Kohmoto, K. (Eds), Pathogenesis and
Host Specificity in Plant Diseases. Vol. 3. Viruses and ViroidsOxford 1995 311–341
Genom expression of plant positive-strand RNA viruses. Davies, J.W. and Hull, R. J.Gen. Virol. 61 1982 1–14
Translation of mRNA: Protein synthesis directed by several virus RNAs in a cell-free extract from wheat germ.
Davies, J.W. and Kaesberg, P. J. Gen. Virol. 25 1974 11–20
Tospoviruses. de Haan, P. Academic Press In: Webster, R.W. and Granoff, A. (Eds), Encyclopedia of
VirologyLondon, Vol. 3 1994 1459–1464
Geminiviruses. Dhar, A.K. and Singh, R.P. Pergamon Press In: Singh, R., Singh, U. and Kohmoto, K. (Eds),
Pathogenesis and Host Specificity in Plant Diseases. Vol. 3. Viruses and ViroidsOxford 1995 289–309
The cowpea mosaic virus RNA replication complex and the host-encoded RNA-dependent RNA polymerase-
template complex are functionally different. Dorssers, L., van der Meer, J., van Kammen, A. and Zabel,
P. Virology 125 1984 155–174
Irodalom
314 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Translation of potyvirus RNA in a rabbit reticulocyte lysate: Reaction conditions and identification of capsid
protein as one of the products in vitro translation of tobacco etch and pepper mottle viral RNAs.
Dougherty, W.G. and Hiebert, E. Virology 101 1980 466–474
A novel subviral agent associated with a geminivirus. Dry, I.B., Krake, L.R., Rigden, J.E. and Rezaian, M.A.
The first report of a DNA satellite. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 1997 7088–7093
Translation of TMV-RNA in a cell-free wheat embryo system. Efron, D. and Marcus, A. Virology 53 1973 343–
348
Növénykórokozó mikroorganizmusok. Érsek, T. és Gáborjányi, R. ELTE Eötvös KiadóBudapest 1998 288 pp
Plant Virology Protocols. Foster, G.D. and Taylor, S.C. Humana Press From Virus Isolation to Transgenic
ResistanceTotowa, New Jersey 1998 571 pp
Nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus DNA. Franck, A., Gullley, H., Jonard, I.G., Richards, K. and
Hirth. L. Cell 21 1980 285–294
Plant virus satellites. Francki, R.I.B. Ann. Rev. Microbiol. 39 1985 151–174
The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun
sequencing. Gardner, R.C., Howarth, A., Hahn, P., Brown-Leudi, M., Shepherd, R.J. and Messing, J.
Nucleic Acid Res. 9 1981 2871–2888
Tospoviruses. Diagnosis, molecular biology, phylogeny and vector relationship. German, T.L., Ullman, D.E.
and Mayer, J.W. Annu. Rev. Phytopathol. 30 1992 315–348
Goelet, P., Lomonosoff, G.P., Butler, P.J.G., Akam, M.E., Gait, M.J. and Karn, J. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 79 5818–5822 Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA.
Molecular evolution of plant RNA viruses. Goldbach, R.W. Ann. Rev. Phytopathol. 24: 1986 289–310
Structure, replication, and expression of the bipartite genome of cowpea mosaic virus. Goldbach, R. and van
Kammen, A. CRC Press In: Davies, J.W. (Ed.). Molecular Plant Virology. Vol. 2Boca Raton, Florida
1985 83–120
Cucumber mosaic virus replication in cowpea protoplasts: Time course of virus, coat protein and RNA
synthesis. Gonda, T.J. and Symons, R.H. J. Gen. Virol. 45 1979 723–736
Observations concerning the discontinuous DNAs of cauliflower mosaic virus. Gulilley, H., Richards, K.E. and
Jonard, G. EMBO J. 2 1983 277–282
Advances in geminivirus research. Harrison, B.D. Ann. Rev. Phytopathol. 23 1985 55–82
Virus resistance in transgenic plants that express cucumber mosaic virus satellite RNA. Harrison, B.D., Mayo,
M.A. and Baulcombe, D.C. Nature 328 1987 799–802
A defective interfering RNA that contains mosaic of a plant virus genome. Hillman, B.I., Carrington, J.C. and
Morris, T.J. Cell 51 1987 427–433
Replication of cauliflower mosaic virus and transcription of its genome in turnip leaf protoplasts. Howell, S.H.
and Hull, R. Virology 86 1978 468–481
Does the cauliflower mosaic replicate by reverse transcription? Hull, R. and Covey, S.N. Trends Biochem. Sci.
8 1983 119–121
Structure and replication of caulimovirus genomes. Hull, R., Covey, S.N. and Maule, A.J. J. Cell Sci., Suppl. 7
1987 213–229
Infection of protoplasts from soybean cell culture with southern bean mosaic and cowpea mosaic viruses. Jarvis,
N.P. and Murakishi, H.H. J. Gen. Virol. 48 1980 365–376
Irodalom
315 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Cucumber mosaic virus-associated RNA5. Kaper, J.M. and Waterworth H.E. Causal agent for tomato necrosis.
Science 196 1977 429–431
Cucumoviruses. Kaper, J.M. and Waterworth, H.E. Elsevier-North Holland Biomedical Press In: Kurstak, E.
(Ed), Handbook of Plant Infections and Comparative DiagnosisAmsterdam 1981 257–332
The nucleic acid sequence of cowpea mosaic virus B RNA. Lomonossoff, G.P. and Shanks, M. EMBO J. 2 1983
2253–2258
Viral taxonomy for the nonvirologist. Matthews, R.E.F. Ann. Rev. Microbiol. 39 1985 451–474
Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego, London 1991 835 pp
Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego 1992 403 pp
The nucleotide sequence of maize streak virus DNA. Mullineaux, P. M., Donson, J., Morris-Krsinich, B.A.M.,
Boulton, M.I. and Davies, J.W. EMBO J. 3 1984 3063–3069
Satellites of plant viruses Murant, A.F. and Mayo, M.A. Ann. Rev. Phytopathol. 20 1982 49–70
Efficient system of homologous RNA recombination in brome mosaic virus: sequence and structure requirement
and accuracy of crossovers. Nagy, P.D. and Bujarski, J.J. J.Virol. 69 1995 131–140
Time course of alfalfa mosaic virus RNA and coat protein synthesis in cowpea protoplasts. Nassuth, A.,
Bruggencate, G. and Bol, J.F. Virology 125 1983 75–84
A szilvahimlő vírus molekuláris klónozása, új diagnosztikai módszer kifejlesztése és transzgénikus
vírusrezisztens növények előállítása. Palkovics, L. Ph.D. értekezés, Gödöllő 1996 1–113
Comparative sequence analysis of four complete primary structures of plum pox virus strains. Palkovics, L.,
Burgyán, J. and Balázs, E. Virus Genes 7 1993 339–247
Involvement of reverse transcription in the replication of cauliflower mosaic virus: A detailed model and test of
some aspects. Pfeifer, P. and Hohn, T. Cell (Cambridge, Mass.) 33 1983 781–789
Expression of cowpea mosaic virus M RNA in cowpea protoplasts. Rezelman, G., Goldbach, R. and van
Kammen, A. J. Virol. 36 1980 366–373
Expression of cowpea mosaic virus M RNA in cowpea protoplasts. Rezelman, G., van Kammen, A., and
Wellink, J. J. Gen. Virol. 70 1989 3043–3050
Highlights and prospects of potyvirus molecular biology. Riechmann, J.L., Lain, S. and Garcia, J.A. J. Gen.
Virol. 73 1992 1–16
Mechanisms of plant virus evolution. Roossinck, M. J. Annu. Rev. Phytopathol. 35 1997 191–209
Effects of defective interfering viruses on virus replication and pathogenesis in vitro and in vivo. Roux, L.,
Simon. A.E. and Holland J.J. Adv. Virus Res. 40 1991 181–211
The molecular biology of geminiviruses. Stanley, J, Adv. Virus Res. 30 1985 139–177
Structure and function of the DNA geminiviruses. Stanley, J. and Davies, J.W. CRC Press In: Davies, J.W. (Ed),
Molecular Plant Virology. Vol. 2Boca Raton, Florida 1989 191–218
The use of protoplasts in plant virology. Takebe, I. Annu. Rev. Phytopathol. 13 1975 105–125
Monoclonal antibodies against tomato spotted wilt virus: Characterization and application. Adam, G.,
Lesemann, D. E. and Vetten H. J. Ann. Appl. Biol. 118 1991 87–104
Immunochemical studies of tobacco mosaic virus. VI. Altschuh, D., Al Moudallal, Z., Briand, J. P. and Van
Regenmortel, M. H. V. Attempts to localize viral epitopes with monoclonal antibodies. Mol. Immunol.
22 1985 329–337
Irodalom
316 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Three-dimensional structure of an antigen-antibody complex at 2.8 A resolution. Amitt, A. G., Marinzza, R. A.,
Phillips, S. E. V. and Poljak, R. J. Science 233 1986 747–753
Coupling of enzymes to proteins with glutaraldehyde. Avrameas, S. Use of the conjugates for the detection of
antigens and antibodies. Immunochemistry 6 1969 43–52
Plant Dis. 69, 202–205. Banttari, E. E. and Goodwin, P. H. (1985) Detection of potato viruses S, X, and Y by
enzyme-linked immunosorbent assay on nitrocellulose membranes (Dot-ELISA).
A simple indirect ELISA using F(ab’)2 fragments of immunoglobulin. Barbara, D. J. and Clark, M. F. J. Gen.
Virol. 58 1982 315–322
Application of new test procedures to surveys: merging the new with the old. Barnett, O. W. In: Jones, R. A. C.
and Torrance, L. (Eds), Developments and Applications in Virus Testing. Association of Applied
Biologists, Wellesbourne, pp 1986 247–268
Textbook of Immunology. Barrett, J. T. C. V. Mosby CoSt. Louis, MO 1988 455 pp
Preparation of antigens, viruses. Brakke, M. K. APS Press In: Hampton, R., Ball, E. and De Boer, S. H. (Eds),
Serological Methods for Detection and Identification of Viral and Bacterial Plant PathogensSt. Paul,
Minnesota 1990 15–26
Serological differentiation of tobamoviruses by means of monoclonal antibodies. Briand, J. P., Al Moudallal, Z.
and Van Regenmortel, M. H. V. J. Virol. Meth. 5 1982 293–300
Cross-protection and multiplication of mild and severe strains of TMV in tomato plants. Burgyán, J. and
Gáborjányi, R. Phytopath. Z. 110 1984 156–167
Monoclonal Antibody Technology: The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas.
Campbell, A. M. ElsevierNew York 1984 265 pp
Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant
viruses. Clark, M. F. and Adams, A. N. J. Gen. Virol. 34 1977 475–483
Enzyme immunosorbent assays in plant virology. Clark, M. F. and Bar-Joseph, M. Academic Press In:
Maramorosh, K. and Koprowski, H. (Eds), Methods in Virology. Vol. VIIOrlando 1984 51–85
Three-dimensional structure of a complex of antibody with influenza virus neuraminidase. Colman, P. M.,
Laver, W. G., Varghese, J. N., Baker, A. T., Tulloch, P. A., Air, G. M. and Webster, R. G. Nature 326
1987 358–365
Practical Plant Virology. Dijksra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcersiesBerlin-
Heidelberg 1998 458 pp
Plant virus detection using a new form of indirect ELISA. Edwards, M. L. and Cooper, J. I. J. Virol. Methods 11
1985 309–319
T cell receptors: Structure and genetics. Ezquerra, A. and Coligan, J. E. Current Opinion in Immunol. 1 1988
77–83
Interaction of major histocompatibility complex molecules with immunogenic peptides. Fox, B. S. Current
Opinion in Immunol. 1 1988 103–106
Monoclonal antibodies: Principles and Practice. Goding, J. W. Academic Press Production and Application of
Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and ImmunologyNew York 1983 276 pp
Serological identification of potato Y virus and tobacco etch virus using immunodiffusion plates containing
sodium dodecyl sulfate. Gooding, G. V. and Bing, W. W. Phytopathology 60 1970 1293
Rocket immunelectrophoresis assay for cauliflower mosaic virus. Hagen, T. J., Taylor, D. B. and Meagher, R.
B. Phytopathology 72 1982 239–242
Irodalom
317 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Monoclonal antibodies in plant-disease research. Halk, E. L. and De Boer, S. H. Ann. Rev. Phytopathol. 23
1985 321–350
APS Press: St. Paul, Minnesota Hampton, R., Ball, E. and De Boer, S. (Eds) (1990) 387 pp Serological Methods
for Detection and Identification of Viral and Bacterial Plant Pathogens.
Antibodies. A laboratory manual. Harlow, E. and Lane, D. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor,
NY 1988 726 pp
A quantitative theory of the precipitin reaction. II. Heidelberger, M. and Kendall, F. E. A study of an azoprotein
– antibody system. J. Exp. Med 1935 62, 467
Herstellung und Charakterisierung von poly- und monoklonalen Antikörpern gegen fünf Stämme des
Wasserrübenmosaikvirus (Turnip mosaic virus, TuMV). Herscheid, R. Inaugural Dissertation zur
Erlangung des Grades Dr. agr. Bonn 1992 122 pp
A dot immunobinding assay for the detection of tobacco mosaic virus in infected tissues. Hibi, T. and Saito, Y. J.
Gen. Virol. 66 1985 1191–1194
Host plants in diagnosis. Horváth, J. CRC Press In: Matthews, R. E: F. (Ed), Diagnosis of Plant Virus
DiseasesBoca Raton 1993 15–48
Towards a network theory of the immune system. Jerne, N. K. Ann. Immunol. (Inst. Pasteur). 125C 1974 373–
389
Serological properties of viruses and their fragments. Kleckowski, A. In: Beemster, A. B. R. and Dykstra, J.
(Eds), Viruses of Plants. North-Holland, Amsterdam 1966 196 pp
Applications of immuno-blotting in plant virus diagnosis. Koenig, R. and Burgermeister, W. In: Jones, R. A. C.
and Torrance, L. (Eds), Developments and Applications in Virus Testing. Developments in Applied
Biology. Association of Applied Biologists. Wellesbourne, pp 1986 121–138
Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity. Kohler, G. és Milstein, C. Nature
256 1975 495–497
Electroimmunoassay. Laurell, C. B. and McKay, E J., Academic Press In: Langone, J. J. and van Vunakis, H.
(Eds), Methods in Enzymology. Part B. Immunochemical Techniques. Vol. 73New York 1981 339–
369
Immunological detection of plant viruses and a mycoplasmalike organism by direct tissue blotting on
nitrocellulose membranes. Lin, N. S., Hsu, Y. H. and Hsu, H. T. Phytopathology 80 1990 824–828
Evaluation of indirect enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Lommel, S. A.,
McCain, A. H. and Morris, T. J. Phytopathology 72 1982 1018–1022
Antigen recognition overwiev. Long, E. O. and Kindt, T. J. Current Opinion in Immunol. 1 1988 71–72
Plant Virus Serology. Matthews, R. E. F. University PressCambridge 1957 128 pp
Serological characterization of Hungarian plum pox virus isolates. Moya, J. L., Abella, D. L., Rúiz, J. R.,
Garcia, B. M. and Gáborjányi, R. Z. Naturforsch. 52 1997 1–5
Identification of Plant Viruses: Methods and Experiments. Noordam, D. Center Agric. Publ. Document,
Wageningen 1973 207 pp
Handbook of Immunodiffusion and Immunoelectrophoresis. Ouchterlony, O. Ann. Arbor Science Publishers,
Inc. Ann Arbor 1968 215 pp
Specific precipitation in gels and its application to immunochemical analysis. Oudin, J. Year Book Publishers
Inc In: Corcoran, A. (Ed), Methods in Medical Research. Vol. 5Chicago 1952 335–378
Immunodiffusion tests with sodium dodecyl sulfate (SDS)-treated plant viruses and plant viral inclusions.
Purcifull, D. E. and Batchelor, D. L. Fla. Agric. Exp. Stn. Tech. Bull. 788 1977). 1–39
Irodalom
318 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Improvements in the passive hemagglutination technique for serological detection of plant viruses. Rajeshwari,
R., Reddy, D. V. R. and Izuka, N. Phytopathology, 71 1981 306–308
Development of a dot-immunobinding assay for detection of citrus tristeza virus. Rocha-Pena, M. A., Lee, R. F.
and Niblett, C. L. J. Virol. Meth. 34 1991 297–309
Potato Viruses and Their Control. Salazar, L. F. IPC PessLima 1996 214 pp
Gel-Diffusion Methods for the Serological Detection of Potato Viruses X, S and M. Shepard, J. F. Montana State
Univ. Bull. 662 1972 1–71
Immunochemical cross-reactivity between the dissociated capsid proteins of PVY group plant viruses. Shepard,
J. F., Secor, G. A. and Purcifull, D. E. Virology 58 1974 464–475
Three dimensional structure of an antobody-antigen complex. Sheriff, S., Silverton, E. V., Padlam, E. A.,
Cohen, G. H., Smith-Gill, S. J., Finzel, B. C. and Davies, D. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 1987
8075–8079
Detection of viral antigens by direct one-incubation time-resolved fluoroimmunoassay. Siitari, H., Lovgren, T.
and Halonen, P. In: Jones, R. A. C. and Torrance, L. (Eds), Developments and Applications in Virus
Testing. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, pp 1986 155–164
Hybridoma Technology in Agricultural and Veterinary Research. Stern, N. and Gamble, H. R. Rowman and
AllenheldNew Yersey 1984 318 pp
The use of rocket immunoelectrophoresis to detect tobacco mosaic virus in infected pepper tissues. Tóbiás, I.,
Hornok, L. and Balázs, E. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung 14 1979 231-237
Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some
applications. Tobwin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 1979 4350–4354
Use of protein A to improve sensitisation of latex particles with antibodies to plant viruses. Torrance, L. Ann.
Appl. Biol. 96 1980 45–50
Single radial immunodiffusion. Vaerman, J. P. Methods Enzymol. 73 1981 291–305
Detection of a wide spectrum of tobacco mosaic virus strains by indirect enzyme immunoassay (ELISA). van
Regenmortel, M. H. V. and Burckard, J. Virology 106 1980 327–334
Serology and Immunochemistry of Plant Viruses. van Regenmortel, M. H. V. Academic PressNew York 1982
302 pp
Molecular dissection of protein antigens and the prediction of epitopes. van Regenmortel, M. H. V. Elsevier
Science Publ. Co. Inc In: Burdon, R.H. and van Kippenberg, P. H. (Eds), Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular BiologyNew York 1988 1–40
Serological procedures. van Regenmortel, M. H. V. and Dubs, M. C. CRC Press In: Matthews, R. E. F. (Ed),
Diagnosis of Plant Virus DiseasesBoca Raton 1993 159–214
Serology in virus disease diagnosis. Wetter, C. Ann. Rev. Phytopathol. 3 1965 19–42
Gene Cloning. Brown, T.A. An introduction. Chapman and Hall 1990
Practical Plant Virology. Dijkstra, J. and De Jager, C.P. Springer Verlag Protocols and ExcercisesBerlin-
Heidelberg 1998 458 pp
Nucleic Acid Hybridisation. Hames, B.D. and Higgins, S.J. IRL Press A Practical ApproachOxford 1985
Nucleic acid hybridization procedures. Hull, R. CRC Press In: Matthews, R.E.F. (Ed), Diagnosis of Plant
VirusesBoca Raton 1993 254–271
Plant Virology. Third Edition. Matthews, R.E.F. Academic PressNew York 1991
Irodalom
319 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R.E.F. Academic PressSan Diego 1992 1992. 403 pp
A new methode of sequencing DNA. Maxam, A. and Gilbert, W. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74 1977 560–564
Comparative stucture of viroids and their rapid detection using radioactive and nonradioactive nucleic acid
probes. McInnes, J.L. and Symons, R.H. CRC Press In: Maramorosch, K. (Eds), Viroids and Satellites:
Molecular Parasites at the Frontier of LifeBoca Raton 1991
Orvosi biológia. I. Genom, gének, sejtfunkciók. Molnár, J. Egyetemi jegyzet, SZOTE, Szeged 1991
Enzymatic amplification of α-globulin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle
cell anemia. Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K.B., Horn, G.T., Erlich, H.A. and Arnheim,
N. Science 230 1985 1350–1354
Génsebészet. Sain, B. és Erdei S. Gondolat KiadóBudapest 1985
A rapid method for determining sequences in DNA by primer synthesis with a DNA polimerase. Sänger, F. and
Coulson, A.R. J. Molecular Biol. 94 1975 441
Molecular Cloning. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1989
The immunoassay of gibberellins II. Quantitation of GA3, GA4 and GA7 by ultra-sensitive solid-phase enzyme
immunoassay. Atzorn, R. and Weiler, E. W. Planta 159 1983 7–11
Mass spectrometric identification of indole compounds produced by Rhizobium strains. Biomed. Badenoch-
Jones, J., Summons, R. E., Entsch, B., Rolfe, B. G., Parker, C. W. and Letham, D. S. Mass Spectrom. 9
1982 429–437
Phytohormones, Rhizobium mutants, and nodulation in legumes. Badenoch-Jones, J., Summons, R., Rolfe, B. G.
and Letham, D. S. Auxin metabolites in pea root nodules. J. Plant Growth Regul. 3 1984 23–39
Gibberellins and the early disease syndrome of aspermy virus in tomato (Lycopersicon esculentum [Mill.]).
Bailiss, K. W. Ann. Bot. 32 1968 543–551
Gibberellins, Abscisic Acid and Virusinduced Stunting. Bailiss, K. W. Akadémiai Kiadó In: Király, Z. (Ed.),
Current Topics in Plant PathologyBudapest 1977 361–373
Ethylene production in Xanthi tobacco after systemic and local virus infections. Balázs, E., Gáborjányi, R.,
Tóth, A. and Király, Z. Acta Phytopath. Hung. 4 1969 355–358
Leaf senescence and increased virus susceptibility in tobacco. Balázs, E., Gáborjányi, R. and Király, Z. The
abscisic acid. Physiol. Plant. Path. 3 1973 341–346
The role of cytokinins in the systemic acquired resistance of tobacco hypersensitive to tobacco mosaic virus.
Balázs, E., Sziráki, I. and Király, Z. Physiol. Plant Path. 11 1977 29–37
The problem of halting enzyme action when extracting plant tissues. Bieleski, W. J. Anal. Biochem. 9 1964
431–442
Modern methods for plant growth substance analysis. Brenner, M. L. Ann. Rev. Plant Physiol. 32 1981 511–
538
Membrane localised gibberellins A9 and A4 in wheat chloroplasts. Browning, G. and Saunders, P. F. Nature
265 1977 375–377
A rapid and simple procedure for purification of indole-3-acetic acid prior to GC-SIM-MS analysis. Chen, K-
H., Miller, A. N., Patterrson, G. W. and Cohen, J. D. Plant Physiol. 86 1988 822–825
Convenient apparatus for the generation of small amounts of diazomethane. Cohen, J. D. J. Chromatogr. 303
1984 193–196
Irodalom
320 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Modern methods of analysis of gibberellins. Crozier, A. and Durley, R. C. Praeger In: Crozier, A. (Ed.), The
Biochemistry and Physiology of the Gibberellins. Vol. INew York 1983 485–560
NaCl reduces indole-3-acetic acid levels in the roots of tomato plants independent of stress-induced abscisic
acid. Dunlap, J. R. and Binzel, M. L. Plant Physiol. 112 1996 378–384
Reversion of dwarfing induced by virus infection; effect of polyacrylic gibberellic acids. Fernandez, T. F. and
Gáborjányi, R. Acta Phytopath. Hung. 11 1976 271–275
Indole-3-acetic acid. Mass spectra and chromatographic properties of amino acid conjugates. Feung, C. S.,
Hamilton, R. H. and Mumma, R. O. J. Agric. Food Chem. 23 1975 1120–1124
Ethylene production, tissue senescence and local virus infections. Gáborjányi, R., Balázs, E. and Király, Z. Acta
Phytopath. Hung. 6 1971 51–56
Growth inhibition of virus-infected plants: Alterations of peroxidase enzymes in compatible and incompatible
host-parasite relations. Gáborjányi, R., Sági, F. and Balázs, E. Acta Phytopath. Hung. 8 1973 81–90
Gibberellins. Hedden, P. Academic Press In: Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles and Practice of Plant
Hormone Analysis. Vol. ILondon 1987 9–110
Modern methods for the quantitative analysis of plant hormones. Hedden, P. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant
Mol. Biol. 44 1993 107–129
Modern methods for plant hormone analysis. Horgan, R. Pergamon In: Rheinhold, L., Harborne, J. B. and
Swain, T. (Eds.), Progress in Phytochemistry. Vol. VIIOxford 1981 137–170
Cytokinins. In: Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. II.
Horgan, R. and Scott, I. M. Academic PressLondon 1987 303–365
Analysis of gibberellins and gibberellin conjugates by ion-supression reversed-phase high-performance liquid
chromatography. Jensen, E., Crozier, A. and Monteiro, A. M. J. Chromatogr. 367 1986 377–384
The five „classical” plant hormones. Kende, H. and Zeevart, J. A. D. Plant Cell 9 1997 1197–1210
New method of detecting traces of illuminating gas. Knight, L. I., Rose, R. C. and Crocker, W. Science 31 1910
635
Cytokinin levels and kinetin-virus interactions in tobacco ringspot virus-infected cowpea. Kuriger, W. E. and
Agrios, G. N. Phytopathology 67 1977 604–609
Thin layer chromatography of gibberellins. MacMillen, J. and Suter, P. J. Nature 197 1963 790
A mathematical treatment for rate data obtained in biological flow systems under nonsteady state conditions.
Marynick, D. S. and Marynick, M. C. Plant Physiol. 56 1975 680–683
Derivatives of indole-3-acetic acid for SIM GC-MS studies. McDougall, J. and Hillman, J. R. Z.
Pflanzenphysiol. 98 1980 89–93
Effect of deseeding on the indole-3-acetic acid contents of shoots and roots of Zea mays seedlings. Momonoki,
Y. S., Schulze, A. and Bandurski, R. S. Plant Physiol. 72 1983 526–529
Ethylene production by detached leaves infected with tobacco mosaic virus. Nakagaki, Y., Hirai, T. and
Stahmann, M. A. Virology 40 1970 1–9
Abscisic acid and related compounds. Neill, S. J. and Horgan, R. Academic Press In: Rivier, L. and Crozier, A.
(Eds.), Principles and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. ILondon 1987 111–167
Oxidation of indole-3-acetic acid and oxindole-3-acetic acid to 2,3-dyhidro-7-hydroxy-2-oxo 1 H indole-3-
acetic acid-7’-O-b-D-glucopyranoside in Zea mays seedlings. Nonhebel, H. M. and Bandurski, R. S.
Plant Physiol. 76 1984 979–983
Irodalom
321 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Effect of tobacco mosaic virus infection on the endogenous levels of indoleacetic, phenylacetic and abscisic
acids of tobacco leaves in various stages of development. Rajagopal, R. Z. Pflanzenphysiol. 83 1977
403–409
Chemical ionization mass spectrometry of IAA and ABA: evaluation of negative ion detection and quantification
of ABA in growing maize roots. Rivier, L. and Saugy, M. J. Plant Growth Regul. 5 1986 1–16
Validation of a radioimmunoassay for (+)-abscisic acid in extracts of apple and sweet-pepper tissue using high-
pressure liquid chromatography and combined gas chromatography-mass spectrometry. Rosher, P. H.,
Jones, H. G. and Hedden, P. Planta 165 1985 91–99
Growth regulators and the effect of barley yellow dwarf virus on barley (Hordeum vulgare L.). Russel, S. L. and
Kimmins, W. C. Ann. Bot. 35 1971 1037–1043
Ethylene. Saltveit, M. E., Jr. and Yang, S. F. Academic Press In: Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles
and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. IILondon 1987 367–401
Indole-3-acetic acid and related compounds. Sandberg, G., Crozier, A. and Ernstsen, A. Academic Press In:
Rivier, L. and Crozier, A. (Eds.), Principles and Practice of Plant Hormone Analysis. Vol. IILondon
1987 169–301
Esterification of fatty acids with diazomethane on a small scale. Schlenk, H. and Gellerman, J. Anal. Chem. 32
1960 1412–1414
Alterations in the auxin levels of resistant and susceptible hosts induced by the curly-top virus. Smith, S. H.,
McCall, S. R. and Harris, J. H. Phytopathology 58 1968 575–577
The effect of infection by TMV on cytokinin level of tobacco plants, and cytokinin in TMV-RNA. Sziráki, I. and
Balázs, E. Akadémiai Kiadó In: Király, Z. (Ed.), Current Topics in Plant PathologyBudapest 1977
345–352
The influence of kinetin on tobacco ringspot virus infectivity and the effect of virus infection on the cytokinin
activity in intact leaves of Nicotiana glutinosa L. Tavantzis, S. M., Smith, S. H. and Witham, F. H.
Physiol. Plant Path. 14 1979 227–233
Effects of auxin on the localization of tobacco mosaic virus in hypersensitively reacting tobacco. Van Loon, L.
C. Physiol. Plant Path. 14 1979 213–226
Etude spectroscopique (IR, NMR1H, masse) comparée des acides indolyl-1 acétique (AIA-1), indolyl-2 acétique
(AIA-2), et indolyl-3 acétique (AIA-3) et de leurs esters méthyliques (masse). Vebrel, J., Laude, B.,
Seguin, A. and Dubouchet, J. Spectrochim. Acta 39 1983 887–894
The role of cytokinins in relation to flower-bud blasting in Iris cv. Ideal: Cytokinin determination by an
improved enzyme-linked immunosorbent assay. Vonk, C. R., Davelaar, E. and Ribot, S. A. Plant
Growth Regul. 4 1986 65–74
Effect of systemic and local-lesion-forming strains of tobacco mosaic virus on abscisic acid concentration in
tobacco leaves: Consequences for the control of leaf growth. Whenham, R. J. and Fraser, R. S. S.
Physiol. Plant Pathol. 18 1981 267–278
High-performance liquid chromatography of plant hormones. II. Wurst, M., Pikryl, Z, and Vokoun, J.
Determination of plant hormones of the indole type. J. Chromatograph. 286 1984 237–245
Rapid stimulation of an oxidative burst during elicitation of cultured plant cells. Apostol, I., Heinstein, P.F. and
Low, P.S. Plant Physiol. 90 1989 109–116
Chloroplast: formation of active oxygen and its scavenging. Asada, K. Acad. Press In: Colowick, S.P. and
Kaplan, N.O. (Eds), Methods in Enzymology. Vol. 105New York 1984 422–429
Early responses during plant-bacteria interactions in tobacco cell suspensions. Baker, C.J., O‟Neill, N.R.,
Keppler, L.D. and Orlandi, E.W. Phytopathology 81 1991 1504–1507
Active oxigen in plant pathogenesis. Baker, C.J. and Orlandi, E.W. Annu. Rev. Phytopathol. 33 1995 299–321
Irodalom
322 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Localization of hydrogen-peroxide accumulation during the hypersensitive reaction of lettuce cells to
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Bestwick, C.S., Brown, I.R., Benett, M.H.R. and Mansfield,
J.W. Plant Cell 9 1995 209–221
Tissue printing on nitrocellulose paper: a new method for immunolocalization of proteins, localization of
enzyme activities and anatomical analysis. Cassab, G.I. and Varner, J.E Cell Biol. Int. Rep. 13 1989
147–152
Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid. Chen, Z., Silva, H.
and Klessig, D.F. Science 262 1993 1883–1886
Death don’t have no mercy: cell death programs in plant-microbe interactions. Dangl, J.L., Dietrich, R.A. and
Richberg, M.H. Plant Cell 8 1996 1793–1807
Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance. Delledonne, M., Xia, Y., Dixon, R.A. and Lamb,
C.J. Nature 394 1998 585–588
Leaf senescence: Correlated with increased levels of membrane permeability and lipid peroxidation, and
decreased level of superoxide dismutase and catalase. Dhindsa, R.S., Plumb-Dindsa, P.and Thrope,
T.A. J. Exp. Bot. 32 1981 93–101
Early events in the activation of plant defense responses. Dixon, R.A., Harrison, M.J. and Lamb, C.J. Annu.
Rev. Phytopathol. 32 1994 479–501
Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissue to infection
with an incompatibile race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Doke, N.
Physiol. Plant Pathol. 23 1983 345–357
Involvement of an O2 generating system in the induction of necrotic lesions on tobacco leaves infected with
tobacco mosaic virus. Doke, N. and Ohashi Y. Physiol. Mol. Plant Pathol. 32 1988 163–175
Defense gene induction in tobacco by nitric oxide, cyclic GMP, and cyclic ADP-ribose. Durner, J.,
Wendehenne, D. and Klessig, D.F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 1998 10328–10333
Mechanisms of oxygen activation during plant stress. Elstner, E.F. and Osswald, W. In: Crawford, R.M.M.,
Hendry, G.A.F. and Goodman, B.A. (Eds) Oxygen and enviromental stress in plants. Royal Society of
Edinburgh, Edinburgh, pp 1994 131–154
Local and systemic responses of antioxidants to tobacco mosaic virus infection and to salicylic acid in tobacco.
Fodor, J., Gullner, G., Ádám, A.L., Barna, B., Kőmíves, T. and Király, Z. Role in systemic acquired
resistance. Plant Physiol. 114 1997 1443–1451
An improved method for monitoring active oxygen in bacteria-treated suspension cells using luminol-dependent
chemiluminescence. Glazener, J.A., Orlandi, E.W. Harmon, G.L. and Baker, C.J. Physiol. Mol. Plant
Pathol. 39 1991 123–133
The active oxygen response of cell suspensions to incompatible bacteria is not sufficient to cause hypersensitive
cell death. Glazener, J.A., Orlandi, E.W. and Baker, C.J. Plant Physiol. 110 1996 759–763
Antioxidants in nutrition, health, and disease. Gutteridge, J.M.C. and Halliwell, B. Oxford University PressNew
York, pp 1994 10–13
Properties and physiological function of a glutathione reductase purified from spinach leaves by affinity
chromatography. Halliwell, B. and Foyer, C.H. Planta 139 1978 9–7
Resistance gene-dependent plant defense responses. Hammond-Kosack, K.E. and Jones, J.D.G. Plant Cell 8
1996 1773–1791
Photoperoxidation in isolated chloroplasts. 1. Heath, R.L. and Packer, L. Kinetics and stochiometry of fatty
acid peroxidation. Arch. Biochem. Biophys. 125 1968 189–198
Irodalom
323 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Plasma membrane alteration during bacteria-induced hypersensitive reaction in tobacco suspension cells as
monitored by intracellular accumulation of fluorescein. Keppler, L.D., Atkinson, M.M. and Baker, C.J.
Physiol. Mol. Plant Pathol. 32 1988 209–219
Role of extracellular polysaccharide (EPS) slime of plant pathogenic bacteria in protecting cells to reactive
oxygen species. Király, Z., El-Zahaby, H.M. and. Klement, Z. J. Phytopathology 145 1997 59–68
Scavenging of hydrogen peroxide in the endosperm of Ricinus communis by ascorbate peroxidase. Klapheck, S.,
Zimmer, I. and Cosse, H. Plant Cell Physiol. 31 1990 1005–1013
Hypersensitivity. Klement, Z. Academic Press In: Mount, M.S. and Lacy, G.H. (Eds), Phytopathogenic
ProcaryotesNew York 1982 149–177
The salicylic acid signal in plants. Klessig, D.F. and J. Malamy Plant Mol. Biol. 26 1994 1439–1458
Hypersensitive cell death, autofluorescence, and insoluble silicon accumulation in barley leaf epidermal cells
under attack by Erysiphe graminis f. sp. hordei. Koga, H., Zeyen, R.J., Bushnell, W.R. and Ahlstrand,
G.G. Physiol. Mol. Plant Pathol. 32 1988 395–409
Hydrogen peroxide stimulates salicylic acid biosynthesis in tobacco. Léon, J., Lawton, M.A. and Raskin, I.
Plant Physiol. 108 1995 1673–1678
H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Levine, A.,
Tenhaken, R., Dixon, R. and Lamb, C. Cell 79 1994 583–593
Alternative solutions to radical problems. Millar, A.H. and Day, D.A. Trends in Plant Science 2 1997 289–290
Inhibition of programmed cell death in tobacco plants during a pathogen-induced hypersensitive response at
low oxygen pressure. Mittler, R., Shulaev, V., Seskar M. and Lam, E. Plant Cell 8 1996 1991–2001
Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Nakano, Y and
Asada, K. Plant Cell Physiol. 22 1981 867–880
Abrupt increase in the level of hydrogen peroxide in leaves of winter wheat is caused by cold treatment. Okuda,
T., Matsuda, Y., Yamanaka, A. and Sagisaka, S. Plant Physiol. 97 1991 1265–1267
Hydrogen peroxide and lignification. Olson, P.D. and Varner, J.E. Plant J. 4 1993 887–892
Estimation of hydrogen peroxide in plant extracts using Titanium(IV). Patterson, B.D., MacRae, E.A. and
Ferguson, I.B. Anal. Biochem. 139 1994 487–492
Bonckés alatt a kutatás. Selye, J. Kriterion könyvkiadóBukarest 1975
Ökologische Biochemie (2 Auflage). Schlee, D. Gustav Fischer VerlagJena 1992
Histochemical demonstration and localization of H2O2 in organs of higher plants by tissue printing on
nitrocellulose paper. Schopfer, P. Plant Physiol. 104 1994 1269–1275
A comparison of methods for determination of the oxidative burst in whole plants. Schroeder, A.T., Martin, G.
and Low, P.S. In: Stacey, G., Mullin, B. and Gresshoff, P.M. (Eds), Biology of Plant-Microbe
Interactions, Proc. 8th International Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions. International
Society for Molecular Plant-Microbe Interactions St. Paul, pp 1996 15–20
The generation of oxygen radicals during host plant responses to infection. Sutherland, M.W. Physiol. Mol.
Plant Pathol. 39 1991 79–93
Subcellular localization of H2O2 in plants. H2O2 accumulation in papillae and hypersensitve response during
the barley-powdery mildew interaction. Thordal-Christensen, H., Zhang, Z., Wei, Y. and Collinge, D.
B. Plant J. 11 1997 1187–1194
Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Warm,
E. and Laties, G.G. Phytochemistry 21 1982 827–831
Irodalom
324 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H2O2-generating glucose oxidase in transgenic
potato plants. Wu, G., Shortt, B.J., Lawrence, E.B., Levine, E.B. and Fitzsimmons, K.C. Plant Cell 7
1995 1357–1368
Copper, zinc superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radical production from hydrogen peroxide. Yim, M.B.,
Chock, P.B. and Stadtman, E.R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 1990 5006–5010
Guidelines for the conduct of tests for distinctness uniformity and stability. Anonymous, Sweet pepper. UPOV
Internat. Union for the Protection of New Varieties of Plants. TG6/7. Geneve 1994 22 pp
Inheritance of resistance to potato viruses Y and A in progeny obtained from potato cultivars containing gene
Ry: evidence for a new gene for extreme resistance to PVA. Barker, H. Theor. Appl. Genet. 93 1996
710–716
Studies on the etiology of tuber necrotic ringspot disease in potato. Beczner, L., Horváth, J., Romhányi, I. and
Förster, H. Potato Res. 27 1984 339–352
Resistance to TMV in Capsicum chacoense Hunz is governed by on allele of the L-locus. Boukema, I.W.
Capsicum Newsl. 3 1984 47–48
Reaction of unknown Solanum stoloniferum Schlechtd. et Bche and Solanum demissum Lindl. accessions to the
tuber necrosis strain of potato Y Potyvirus (PVYNTN). Bősze, Z., Kazinczi, G. and Horváth, J. Acta
Phytopath. et Entomol. 31 1996 169–174
Potato Genetics Bradshaw, J.E. and MacKay, G.R. CAB InternationalWellesbourne 1994 552 pp
The Potato. (3rd ed.) Burton, W.G. Longman GroupUK 1989
A new pepper strain of tomato mosaic virus. Csilléry, G., Tóbiás, I. and Ruskó, J. Acta Phytopat. Acad. Sci.
Hung. 18 1983 195–200
Szóbeli közlés. Csilléry, G. – 1995
Genetic analysis of broad spectrum resistance to potyviruses using doubled haploid lines of pepper (Capsicum
annuum L.). Dogimont, C., Palloix, A., Daubze, A.M., Marchoux, G., Selassie, K.G. and Pochard, E.
Euphytica 88 1996 231–239
Characterization of somatic hybrids between tetraploid potato Solanum tuberosum L. cultivars and S. brevidens
Phil. Fehér, A., Preiszner, J., Horváth, J., Gáborjányi, R., Dudits, D. and Király, Z. 7th International
Congr. Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam, p 1990 209
Coat protein sequence of a resistance-breaking strain of potato virus X isolated in Argentina. Feigelstock, D.A.,
Tozzini, A.C. and Hopp, H.E. Virus Genes 10 1995 289–292
Breeding for resistance: conventional methods. Foxe, M.J. Neth. J. Pl. Path. 98 (Suppl. 2.) 1992 13–20
Genes for resistance to plant viruses. Fraser, R.S.S. CRV/Critical Rev. Plant Sci. 3 1986 257–294
Resistance to tobacco mosaic virus in tomato: Effects of the Tm-1 gene on virus multiplication. Fraser, R.S.S.
and Loughlin, S.A.R. J. Gen. Virol. 48 1980 87–96
Effects of temperature on the Tm-1 gene for resistance to tobacco mosaic virus in tomato. Fraser, R.S.S. and
Loughlin, S.A.R. Physiol. Plant Pathol. 20 1982 109–117
A növények vírus-ellenállóságának és fogékonyságának kórélettani kérdései. Gáborjányi, R. és Tóbiás, I.
Kertgazdaság 4 1984 61–79
Breeding for cucumber mosaic virus resistance in pepper: Phenotypic and molecular marker-assisted
approaches. Grube, R.C., Zhang, Y., Lackney, V., Prince, J., Murphy, J., Huang, B., Paran, I. and
Kyle, M. Nat. Pepper Conf., Naples, FL 1996 1996
Irodalom
325 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Molecular mapping, tagging and inheritance of virus resistance loci in Capsicum. Grube, R.C., Zhang,Y.,
Radwanski, E.R., Paran, I., Livingstone, D.,Blauth, J. and Kyle Jahn, M.M. 10th EUCARPIA Meeding
on Genetics and Breeding of Capsicum and eggplant. Avignon, pp 1998 137–140
Current use of potato collections. Hermsen, J.G.Th. Cambridge Univ. Press In: Brown, A.H.D., Frankel, O.H.,
Marshall, D.R. and Williams, J.T. (Eds), The use of plant genetic resourcesCambridge 1989 68–75
Local lesions in tobacco mosaic. Holmes, F.O. Botan. Gaz. 87 1929 39–55
Studies on strains of potato virus Y. 1. Strain C. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1 1966a 125–138
Studies on strains of potato virus Y. 2. Normal strain. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 1 1966b
333–352
Studies on strains of potato virus Y. 3. Strain causing browning of midribs in tobacco. Horváth, J. Acta
Phytopath. Acad. Sci. Hung. 2 1967a 95–108
Studies on strains of potato virus Y. 4. Anomalous strain. Horváth, J. Acta Phytopath. Acad. Sci. Hung. 2 1967b
195–210
A vírusrezisztenciára nemesítés eredményei és a dohánymozaik vírus rezisztenciára nemesítés lehetőségei
burgonyánál. Horváth, J. Növénytermelés 17: 1968 225–238
The role of resistant plants in virology and plant breeding. Horváth, J. Tag.-Ber. Akad. Landwirtsch.-Wiss.
DDR, Berlin, 216 1983 201–216
Burgonyagéncentrumok: A rezisztenciagének és víruspatogének forrásai. Horváth, J. Medicina Könyvkiadó In:
Csaba Gy.(szerk.). A biológia aktuális problémáiBudapest 1984 153–185
Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. I. Review. Horváth, J. Acta
Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986a 35–49
Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. II. Horváth, J. New compatible
host-virus relations (susceptible plants). Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21 1986b 51–58
Compatible and incompatible relations between Capsicum species and viruses. III. Horváth, J. New
incompatible host-virus relations (resistant and immune plants). Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 21
1986c 59–62
Horváth, J. (1988) Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 23 423–448 Potato gene centres, wild Solanum species,
viruses and aphid vectors.
Reaction of some new Bolivian tuber-bearing Solanum species to different potato pathogenic viruses. Horváth,
J. and Hoekstra, R. Acta Phytopath. et Entomol. Hung. 24 1989 351–362
Reaction of Solanum stoloniferum accessions to potato virus Y and henbane mosaic virus. Indian Horváth, J.
and Wolf, I. J. Virology 7 1991 176–178
Detection of a tymovirus from Solanum hannemannii. Horváth, J., Lesemann, D.E., Koenig, R., Weidemann, H.
L. and Hoekstra, R. Newsl. Eur. Community Potato Quarantine Stats. 1 1993a 2–3
Resistance of somatic hybrids between Solanum tuberosum and S. brevidens to potato leaf roll Luteovirus.
Horváth, J., Wolf, I., Fehér, A., Preiszner, J., Dudits, D. and Horváth, S. 12th Triennial Conf. EAPR,
Paris, France, pp 1993b 455–456
Serological investigations on the symptomless accessions of Solanum brevidens infected by the NTN strain of
potato Y Potyvirus (PVYNTN). Horváth, J., Francsics, I., Bősze, Z., Wolf, I. and Pocsai, E. 13th
Triennial Conf. EAPR, Veldhoven, The Netherlands 1996. pp 1996 166–167
The risks from exotic potato viruses. Howell, P.J. EPPO Bull. 11 1981 243–249
Conservation of potato genetic resources at CIP. Huaman, Z. Circular 14 1986 1–10
Irodalom
326 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Molecular breeding for virus resistant potato plants. Neth. Huisman, M.J., Jongedijk, E., Posthumus-Lutke
Willink, D., Van der Wilk, F. and Cornelissen, B.J.C. J. Pl. Path. 98 (Suppl. 2) 1992 29–36
Further studies on resistance-breaking strains of potato virus X. Jones, R.A.C. Plant Pathol. 34 1985 184–189
Handbuch der Pflanzensüchtung. 2. Aufl., III. Band. Kappert, H. und Rudorf, W. Verlag Paul PareyBerlin und
Hamburg 1958
Resistenz von Kulturpflanzen gegen pflanzenpathogene Viren. Kegler, H. und Friedt, W. Gustav Fischer
VerlagJena 1993 408 pp
Types of and genes for resistance to plant pathogenic viruses. Kegler, H. and Spaar, D. Arch. Phytopath. Pflanz.
28 1993 95–107
Resistance to Viral Diseases of Vegetables. Kyle, M.M. Timber PressPortland, Oregon 1993 278 pp
Gene list of pepper. Lippert, L.F., Bergh, B.O. and Smith, P.G. J. Heredity 56 1965 30–34
Inhibitor of virus replication released from tobacco mosaic virus-infected protoplasts of a local lesion-
responding tobacco cultivar. Loebenstein, G. and Gera, A. Virology 114 1981 132–139
Two strains of tobacco mosaic virus, one of which is seed borne in an etch immune pungent pepper. McKinney,
H.H. Plant Dis. Rep. 36 1952 184–187
Advances in population breeding and its potential impact on the efficiency of breeding potatoes for developing
countries. Mendoza, H.A. Cambridge Univ. Press In: Jellis, G.J. and Richardson, D.E. (Eds), The
Production of New Potato Varieties. Technological AdvancesCambridge 1986
Results of pepper breeding in Hungary. Moór, A. and Zatykó, L. Acta Horticulturae 412 1995 88–91
The Potatoes of South America. Ochoa, C.M. Cambridge Univ. PressCambridge 1990 512 pp
Systemic infection of tomato bushy stunt virus in Gomphrena globosa induced by high temperature and long
photoperiod. Redolfi, P., Pennazio, S., Appiano, A. and Martin, C. Phytopath. Z. 90 1977 43–50
Continous high temperature can break the hypersensitivity of Capsicum chinense ’PI 152225’ to tomato spotted
wilt tospovirus (TSWV). Roggero, P., Lisa, V., Nervo, G. and Pennazio, S. Phytopath. Medit. 35 1996
117–120
Potato Breeding. Ross, H. Verlag Paul Parey Problems and PerspectivesBerlin and Hamburg 1986 132 pp
Breeding white sweet pepper hybrids armed with the tobamovirus resistance allele L4. Sági, Zs. and Salamon,
P. Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant. Avignon, p 1998
173
Some natural relationships among strains of tobacco mosaic virus. Siegel, A. and Wildman, S.G.
Phytopathology 44 1954 277–282
Bekämpfung von Viruskrankheiten der Kulturpflanzen. Spaar, D. und Kleinhempel, H. VEB Deutscher
LandwirtschaftsverlagBerlin 1985 440 pp
Typen genetisch kontrollierter Virusrezistenz der Pflanzen. Spaar, D., Kegler, H. and Schenk, G. Zbl. Mikrobiol.
147 1992 157–171
Inheritance of resistance to viruses. Swiezynski, K.M. CAB International In: Bradshaw, J.E. and MacKay, G.R.
(Eds), Potato GeneticsWallingford 1994 338–363
Resistance in Solanum brevidens to both potato virus Y and potato virus X may be associated with slow-to-cell
spread. Valkonen, J.P.T., Pehu, E., Jones, M.G.K. and Gibson, R.W. J.Gen. Virol. 72 1991 231–236
Interactions of the Solanum spp. of the Etuberosa group and nine potato-infecting viruses and viroid. Valkonen,
J.P.T., Brigneti, G., Salazar, L.F., Pehu, E. and Gibson, R.W. Ann. Appl. Biol. 120 1992 301–313
Irodalom
327 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Use of the virus strain group concept to characterize the resistance to PVX and PVYO in the potato cv.
Valkonen, J.P.T., Slack, S.A. and Plaisted, R.L. Allegany. Amer. Potato J. 71 1994 507–516
Comparison of resistance to potyviruses within Solanaceae: infection of potatoes with tobacco etch potyvirus
and peppers with potato A and Y potyviruses. Valkonen, J.P.T., Kyle, M.M. and Slack, S.A. Ann. Appl.
Biol. 129 1996 025–038
Characteristics of a resistance-breaking isolate of potato virus Y causing potato tuber necrotic ringspot disease.
Eur. Van den Heuvel, J.F.J.M., Van der Vlugt, R.A.A., Verbeek, M., De Haan, P.T. and Huttinga, H. J.
Plant Pathol. 100 1994 347–356
Development and Breeding of Resistance to Pepper and Tomato Viruses. Watterson, J.C. Timber Press In: Kyle,
M.M. (Ed.), Resistance to Viral Diseases of VegetablesPortland, Oregon 1993 80–101
Pepper mild mottle virus, a tobamovirus infecting pepper cultivars in Sicily. Wetter, C., Conti, M., Altschuh, D.,
Tabillon, R. and Van Regenmortel, M.H.V. Phytopathology 74 1984 405–410
Breeding for resistance. Wiersema, H.T. In: de Bokx, J.A. (Ed.), Viruses of Potatoes and Seed-Potato
Production. Puduc, Wageningen, pp 1972 174–187
New results of pepper breeding in Hungary. Zatykó, L. and Moór, A. IXth EUCARPIA Meeting on Genetics
and Breeding on Capsicum and Eggplant. Budapest, pp 1995 1–4
Tranfer of resistance to potato leaf roll virus from Solanum brevidens into Solanum tuberosum by somatic
fusion. Austin, S., Baer, M. A. and Helgeson, J. P. Plant Sci. 39 1985 75–82
A növényvédelem új feladata a géntechnológiai úton módosított szervezetekről alkotott törvény végrehajtása.
Balázs, E. Növényvédelem 33 1997 582–584
A génátültetés alkalmazása: A korszerű növényvédelem új lehetősége. Balázs, E. és Gáborjányi, R.
Növényvédelem 20 1984 145–151
Ecological aspects of transgenic sugarbeet: transfer and expression of herbicide resistance in hybrids with wild
beets. Bartsch, D. and Pohl-Orf, M. Euphytica 91 1996 55–58
Competitiveness of transgenic sugarbeet resistant to beet necrotic yellow vein virus and potential impact on
wild beet populations. Bartsch, D., Schmidt, M., Pohl-Orf, M., Haag, C. and Schuphan, I. Molecular
Ecol. 5 1996a 199–205
How will transgenic sugarbeets behave in natural plant communities? Bartsch, D., Edmonds, A., Gluth, H.,
Haag, C., Morak, C., Pohl-Orf, M. and Schmidt, M. Springer-Verlag In: Schmidt, E. R. and Hankeln,
T. (Eds), Transgenic Organisms and BiosafetyBerlin and Heidelberg 1996b 319–329
Replicase-mediated resistance: a novel type of virus resistance in transgenic plants. Baulcombe, D. C. Trends
Microbiol. 2 1994 60–63
Mechanisms of pathogen-derived resistance to viruses in transgenic plants. Baulcombe, D. C. The Plant Cell 8
1996 1833–1844
Coat protein mediated resistance against virus infection. Beachy, R. N., Loesch-Fries, S. and Tumer, N. E. Ann.
Rev. Phytopathol. 28 1990 451–474
Reaction of unknown Solanum stoloniferum Schlechtd. et Bche and Solanum demissum Lindl. accessions to the
tuber necrosis strain of potato Y potyvirus (PVYNTN). Bősze, Z., Kazinczi, G. and Horváth, J. Acta
Phytopath. et Entomol. 31 1996 169–174
Viral pathogenecity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. Brigneti,
G., Voinnet, O., Li, W., Ji, L., Ding, S., and Baulcombe, D. The EMBO J. 17 1998 6739–6746
Immunocytolocalization of extensin in developing soybean seed coats by immunogold-silver staining and by
tissue printing on nitrocellulose paper. Cassab, G. and Varner, J. E. J. Cell Biol. 105 1987 2581–2588
Irodalom
328 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Bio/Technology 6, 549–557. Couzzo, M., O‟Conell, K. M., Kaniewski, W., Fang, R. X., Chua, N. H. and
Tumer, N. E. (1988) Viral protection in transgenic tobacco plants expressing the cucumber mosaic
virus coat protein or its antisense RNA.
Identification of an Arabidopsis locus required for resistance to turnip crinkle virus. Dempsey, D A., Pathirana,
M. S., Wobbe, K. K. and Klessig, D. F. The Plant J. 11 1997 301–311
Deshayes, A. F. (1994) Environmental, and social impacts of GMO‟s In 5–19Jones, D. D. (Ed), The Biosafety
Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms. Univ. California, Oakland,
pp What have we learned from the past few years?
Agrobacterium-mediated transformation of potato (Solanum tuberosum). Dietze, J., Blau, A. and Willmitzer, L.
Springer Verlag, Berlin In: Spangenberg, G. (Ed.), Gene Transfer to Plants 1995 24–29
Coat protein gene-mediated protection in Lactuca sativa against lettuce mosaic potyvirus strains. Dinant, S.,
Maisonneuve, B., Albony, J., Chupeau, Y, M.C., Bellec, Y., Gaudefroy, F., Kusiak, C., Souche, S.,
Robaglia, C. and Lot, H. Molecular Breeding 3 1997 75–86
Transposon tagging of tobacco mosaic virus resistance gene N: Its possible role in the TMV-N- mediated signal
transduction pathway. Dinesh-Kumar, S. P., Whitham, S., Choi, D., Hehl, R., Corr, C. and Baker, B.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 1995 4175–4180
Növénybiotechnológia. Dudits, D. és Heszky L. Mezőgazdasági KiadóBudapest 1990 309 pp
Transgenes Saatgut und Biomedizin. Ewe, T. Deutschland 1 1998 28–30
Virus-engineered resistance: Concepts, efficacy, and stability. Fauquet, C. and Beachy, R. N. In: Thottappilly,
G., Monti, L. M., Mohan Raj, D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on
Tropical Crops in Africa. CTA/IITA Co-Publ., IITA Ibadan, pp 1992 273–286
Characterization of somatic hybrids between tetraploid potato Solanum tuberosum L. cultivars and S. brevidens
Phil. Fehér, A., Preiszner, J., Horváth, J., Gáborjányi, R., Dudits, D. and Király, Z. 7th Internat. Congr.
Plant Tissue and Cell Culture. Amsterdam, p 1990 209
Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer. Filippone, E. and Penza, R. In: Thottappilly, G., Monti, L.
M., Mohan Raj, D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops
in Africa. CTA/IITA Co-Publ., Ibadan, pp 1992 197–202
Isolation of protoplasts and genetic manipulation. Filippone, E., D‟Ambrosio, F. and Cardi, T. In: Thottappilly,
G., Monti, L. M., Mohan Raj, D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on
Tropical Crops in Africa. CTA/IITA Co-Publ., Ibadan, pp 1992 127–134
Plant Virology Protocols. From Virus Isolation to Transgenic Resistance. Foster, G.D. and Taylor, S.C.
Humana Press, Totowa, New Jersey 1998 571 pp
Introduction to classical crossprotection. Fraser, R.S.S. Humana Press In: Foster, G.D. and Taylor, S.C. (Eds),
Plant Virology Protocols. From Virus Isolation to Transgenic ResistanceTotowa, New Jersey 1998 13–
24
Construction of a plant disease resistance gene from the satellite RNA of tobacco ringspot virus. Gerlach, W. L.,
Lewellyn, D. and Haseloff, J. Nature 328 1987 802
Resistance to potato leaf roll virus and potato virus Y in somatic hybrids between dihaploid Solanum tuberosum
and S. brevidens. Theor. Gibson, R. W., Jones, M. G. K. and Fisch, N. Appl. Genet. 76 1988 113–117
Gibson, R. W., Pehu, E., Woods, R. D. and Jones, M. G. K. (1990) Ann. Appl. Biol. 116 151–156 Resistance to
potato virus Y and potato virus X in Solanum brevidens.
Plants transformed with a tobacco mosaic virus nonstructural gene sequence are resistant to the virus.
Golemboski, D. B., Lomonossoff, G. P. and Zaitlin, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 1990 6311–
6315
Irodalom
329 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Genetic and biochemical dissection of transgenic RNA-mediated virus resistance. Goodwin, J., Chapman, K.,
Swaney, S., Parks, T.D., Wernsman, E.A., and Dougherty, W.G. Plant Cell 8 1996 95–105
Advances and prospects in potato virology with special reference to virus resistance. Harrison, B. D. Neth. J. Pl.
Path. 98 1992 1–12
Virus resistance in transgenic plants that express cucumber mosaic virus satellite RNA. Harrison, B. D., Mayo,
M. A. and Baulcombe, D. C. Nature 328 1987 799–802
New genes for disease resistances through somatic hybridization. Helgeson, J. P. Neth. J. Pl. Path. 98 1992
223–229
Hemenway, C., Fang, R. X., Kaniewski, W. K., Chua, N. H. and Turner, N. E. (1988) EMBO J. 7 1273–1280
Analysis of the mechanism of protection in transgenic plants expressing the potato virus X coat protein
or its antisense RNA.
A kultúrflóra biodiverzitása Magyarországon. Heszky L., Bódis L. és Kiss E. Növénytermelés 48 1999 435–443
The genetic engineering of two commercial potato cultivars for resistance to potato virus X. Hoekema, A.,
Huisman, M. J., Molendijk, L., van den Elzen, P. J. M. and Cornelissen, B. J. C. Bio/Technology 7
1989 273–278
Cross protection test with four strains of potato virus Y in Nicotiana tabacum L. cv. Samsun. Horváth, J. Zbl.
Bakt. II. Abt. 123 1969 249–252
Extreme and complex resistance to infection by NTN strain of potato Y potyvirus and other viruses in genotypes
of tuber bearing Solanum stoloniferum. Horváth, J. and Wolf, I. 9th EAPR Virology Section Meeting.
Bled, pp 1995 29–30
Serological investigations on the symptomless accessions of Solanum brevidens infected by the NTN strain of
potato Y potyvirus (PVYNTN). Horváth, J., Francsics, I., Bősze, Z., Wolf, I. and Pocsai, E. 13th
Triennial Conf. EAPR., Veldhoven, pp 1996 166–167
Resistance to potato leafroll luteovirus in four accessions of Solanum brevidens Phil. Horváth, J., Király, Z.,
Föglein, F. and Balogh, J. 10th Triennial Conf. EAPR, Aalborg, pp 1987 321–322
Resistance of somatic hybrids between Solanum tuberosum and S. brevidens to potato leaf roll luteovirus.
Horváth, J., Wolf, I., Fehér, A., Preiszner, J., Dudits, D. and Horváth, S. 12th Triennial Conf. EAPR,
Paris, pp 1993 455–456
Molecular breeding for virus resistant potato plants. Huisman, M. J., Jongedijk, E., Willink, D. P., van Der
Wilk, F. and Cornelissen, B. Neth. J. Pl. Path. 98 1992 29–36
S. pmbe pacl+, whose overexpression inhibits sexual development, encodes a ribonuclease III-like RNase. Iino,
Y., Sugimoto, A. and Yamamoto, M. EMBO J. 10 1991 221–226
Die Bioregionen-Zellen des Wachtums. Janositz, P. Deutschland 1 1998 26–28
The Biosafety Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms. Jones, D.D. The
Univ.Calif., Division of Agr. and Natural Resources, Oakland 1994 558 pp
Resistance to potato leaf roll virus in Solanum brevidens. Jones, R. A. C. Potato Res. 22 1979 149–152
A counterdefensive strategy of plant viruses: suppression of posttranscriptional gene silencing. Kasschau, K.D.,
and Carrington, C.J. Cell 95 1998 461–470
Sense and antisense RNA-mediated resistance to potato leafroll virus in Russet Burbank potato plants.
Kawchuk, L. M., Martin, R. R., and McPherson, J. Molecular Plant-Microbe Interact. 4 1991 254–261
A gazda-patogén kapcsolatok molekuláris hátterének tanulmányozása új távlatokat nyit a
rezisztencianemesítésben. I. Király, Z. és Hornok, L. Mikroorganizmusokból klónozott gének.
Növénytermelés 45 1996a 195–206
Irodalom
330 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
A gazda-patogén kapcsolatok molekuláris hátterének tanulmányozása új távlatokat nyit a
rezisztencianemesítésben. II. Király, Z. és Hornok, L. Rezisztenciagének, transzgénikus növények.
Növénytermelés 45 1996b 307–316
Defective interfering RNA-mediated resistance against cymbidium ringspot tombusvirus in transgenic plants.
Kollár, Á., Dalmay, T. and Burgyán, J. Virology 193 1993 313–318
Biosearch: Gentechnik-Datenbank der BBA Landsmann, J. und Shah, A. 3. Mitteilung. Nachrittenbl. Deut.
Pflanzenschutzd. 47 1995 135
Engineering potato virus Y in transgenic Russet Burbank. Lawson, C., Kaniewski, W., Haley, L., Rozman, R.,
Newell, C., Sanders, P. and Tumer, N. E. Bio/Technology 8 1990 127–134
Expression of a soybean b-conglycinin gene under the control of the cauliflower mosaic virus 35S and 19S
promoters in transformed petunia tissues. Lawson, M. A., Tierney, M. A., Nakamura, I., Anderson, E.
and Komeda, Y. Plant Mol. Biol. 9 1987 315–324
Protection against detrimental effects of potyvirus infection in transgenic tobacco plants expressing the papaya
ringspot virus coat protein gene. Ling, K., Namba, S., Gonsalves, C., Slightom, J. L. and Gonsalves, D.
Bio/Technology 9 1991 752–758
Broad-spectrum virus resistance in transgenic plant expressing pokeweed antiviral protein. Lodge, J. K.,
Kaniewski, W. K. and Tumer, N. E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 1993 7089–7093
Expression of alfalfa mosaic virus RNA 4 in transgenic plants confers virus resistance. Loesch-Fries, L. S.,
Merlo, D., Zinnen, T., Burhop, L. and Hall, K. EMBO J. 6 1987 1845–1851
Pathogen-derived resistance to plant viruses. Lomonossoff, G. P. Ann. Rev. Phytopathol. 33 1995 323–343
Identification and characterization of a locus (RTM1) that restricts long-distance movement of tobacco etch
virus in Arabidopsis thaliana. Mahajan, S. K., Chisholm, S. T., Whitham, S. A. and Carrington, J. C.
The Plant J. 14 1998 177–186
Protoplast fusion. Marchant, R., Davey, M. R. and Power, J. B. Academic Press In: Dey, P. M. and Harborne, J.
B. (Eds), Methods in Plant Biochemistry. Vol. 10. Molecular BiologyLondon 1993 187–205
Fundamentals of Plant Virology. Matthews, R. E. F. Academic PressSan Diego 1992 403 pp
Mosaic diseases in the Canary Islands McKinney, H. H. West Africa and Gibraltar. J. Agr. Res. 39 1929 557–
558
History of coat protein-mediated protection. Miller, E.D. and Hemenway, C. Humana Press In: Foster, G.D. and
Taylor, S.C. (Eds), Plant Virology Protocols. From Virus Isolation to Transgenic ResistanceTotowa,
New Jersey 1998 25–38
The use of wild species in crop improvement. Monti, L. M. In: Thottappilly, G., Monti, L. M., Mohan Raj, D. R.
and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops in Africa. CTA/IITA
Co-Publ., IITA Ibadan, pp 1992a 55–62
The role of biotechnology in agricultural research. Monti, L. M. In: Thottappilly, G., Monti, L. M., Mohan Raj,
D. R. and Moore, A. W. (Eds), Biotechnology: Enhancing Research on Tropical Crops in Africa.
CTA/IITA Co-Publ., IITA Ibadan, pp 1992b 1–10
Isolation and culture of tobacco mesophyll protoplast. Nagy, I. Int. Symp. and Training Course in Plant
Biotechnology. Gödöllő, pp 1992 15–29
Lesions and virus accumulation in inoculated transgenic tobacco plants expressing the coat protein gene of
tobacco mosaic virus. Nelson, R. S., Powell, P. and Beachy, R. N. Virology 158 1987 126–132
Movers and shakers: Maize transposons as tools for analyzing other plant genomes. Osborne, B. I. and Baker,
B. Curr. Opin. Cell Biol. 7 1995 406–413
Irodalom
331 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Replicase-mediated resistance to plant virus disease. Palukaitis, P. and Zaitlin, M. Adv. Virus Res. 48 1997
349–377
Recent advances in ecological biosafety research on the risks of transgenic plants: A trans-continental
perspectives. Parker, I. M. and Bartsch, D. Birkhuser Verlag In: Tomink, J., Wöhrmann, K. and
Sentker, A. (Eds), Transgenic Organisms-Biological and Social ImplicationsBasel 1996 147–161
Genome Mapping in Plants. Paterson, A. H. R.G. Landes Company Austin, Texas, USA, 1996 1996
Studies on the genetic basis of resistance to potato leaf roll virus, potato virus Y and potato virus X in Solanum
brevidens using somatic hybrids of Solanum brevidens and Solanum tuberosum. Pehu, E., Gibson, R.
W., Jones, M. G. K. and Karp, A. Plant Sci. 69 1990 95–101
Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene.
Powell, P. A., Nelson, R. S., Hoffman, N. and Rogers, S. G. Science 232 1986 738–743
Protection against tobacco mosaic virus infection in transgenic plants requires accumulation of coat protein
rather than coat protein RNA sequences. Powell, P. A., Sanders, P. R., Tumer, N., Fraley, R. T. and
Beachy, R. N. Virology 175 1990 124–130
Progress in Plant Protoplast Research. Puite, K. J., Dons, J. J. M., Huizing, H. J., Kool, A. J., Koornnef, M. and
Kreus, S. A. Kluwer Acad. PublBoston 1988
Resistance to TMV in transgenic plants results from interference with an early event in infection. Register, J. C.
and Beachy, R. N. Virology 166 1988 524–532
Resistance gene evolution. Ronald, P.C. Curr. Opin. Plant Biol. 1 1998 294–298
Freilandversuche mit gentechnisch vernderten Pflanzen im Jahr 1994. Schiemann, J. und Casper, R.
Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 47 1995 100–101
Transposable elements and gene-tagging. Shepherd, N.S. IRL Press In: Shaw, C.H. (Ed), Plant Molecular
Biology. A Practical ApproachOxford 1988
Protection against potyvirus infection in transgenic plants: evidence for broad spectrum resistance. Stark, D.
M. and Beachy, R. N. Bio/Technology 7 1989 1257–1262
Is durable resistance against viruses and bacteria attainable via biotechnology? Stiekema, W. J., Visser, B. and
Florack, D. E. A. Kluwer Acad. Publ In: Jacobs, Th. and Parlevliet, J. E. (Eds), Durability of Disease
ResistanceDordrecht 1993 71–81
A növénykórokozó baktériumok plazmidjai, különös tekintettel az Agrobacterium tumefaciensre. Süle, S.
Akadémiai Kiadó In: Érsek, T. és Hornok, L. (Szerk.), Kórokozók és a fertőzött növényBudapest 1985
34–46
Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes. Tanksley, S. D.,
Ganal, M. V. and Martin, G. B. Trends in Genetics 11 1995 63–68
Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack.
Tavladoraki, P., Benvenuto, E., Trinca, S., Martinis, D., Cattaneo, D. and Galeffi, P. Nature 366 1993
4649–472
Virusresistant Transgenic Plants: Potential Ecological Impact. Tepfer, M. and Balázs, E. Springer VerlagBerlin
1997 126 pp
Transgenic potato plants expressing mammalian 2’ - 5’ oligoadenylate synthase are protected from potato virus
X infection under field conditions. Truve, E., Aaspollu, A., Honkanen, J., Puska, R., Mehto, M., Hassi,
A., Teeri, T. H., Kelve, M., Seppnen, P. and Saarma, M. Bio/Technology 11 1993 1048–1052
Interactions of the Solanum spp. of the Etuberosa group and nine potato-infecting viruses and a viroid.
Valkonen, J. P. T., Brigneti, G., Salazar, L. F., Pehu, E. and Gibson, R. W. Ann. Appl. Biol. 120 1992
301–313
Irodalom
332 Created by XMLmind XSL-FO Converter.
Resistance to viruses in F1 hybrids produced by direct crossing between diploid Solanum series Tuberosa and
diploid S. brevidens (series Etuberosa) using S. phureja for rescue pollination. Valkonen, J. P. T.,
Orillo, M., Slack, S. A., Plaisted, R. L. and Watanabe, K. N. Plant Breeding 114 1995 421–426
Resistance in Solanum brevidens to both potato virus Y and potato virus X may be associated with slow cell-to-
cell spread. Valkonen, J. P. T., Pehu, E., Jones, M. G. K. and Gibson, R. W. J. Gen. Virology 72 1991
231–236
Expression of the potato leafroll luteovirus coat protein gene in transgenic potato plants inhibits viral infection.
van der Wilk, F., Willink, D., Huisman, M. J., Huttinga, H. and Goldbach, R. Plant Molecular Biol. 17
1991 431–439
Transgenic tobacco expressing tobacco streak virus or mutated alfalfa mosaic virus coat protein does not cross-
protect against alfalfa mosaic virus infection. van Dun, C. M., Overduin, B., van Vloten-Doting, L. and
Bol, J. F. Virology 164 1988 383–389
Systemic signalling in gene silencing. Voinnet, O., and Baulcombe, D.C. Nature 389 1997 553–555
Application of PCR to transgenic plants. Wassenegger, M. Humana Press In: Meltzer, S.J. (Ed), PCR in
BioanalysisTotowa, New Jersey 1998 153–164
Resistance against multiple part viruses in plants mediated by a double stranded-RNA specific ribonuclease.
Watanabe, Y., Ogawa, T., Takahashi, H., Ishida, I., Takeuchi, Y., Yamamoto, M. and Okada, Y. FEBS
Letters 372 1995 165–168
Strategies in unconventional breeding for disease resistance. Wenzel, G. Ann. Rev. Phytopathol. 23 1985 149–
172
Strategies to protect crop plants against viruses: pathogen derived resistance blossoms. Wilson, A.M.T. Proc
Natl. Acad. Sci. USA 90 1993 3134–3141
Local and systemic movement of tobacco mosaic virus (TMV) in tobacco plants that express the TMV coat
protein gene. Wisniewski, L. A., Powell, P. A., Nelson, R. S. and Beachy, R. N. Plant Cell 2 1990 559–
567
Karantén és veszélyes növényi károsítók diagnosztikai kézikönyve. I. kötet. Kalmár K., Szőnyegi S. és Németh
M. Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1994 1–180
Az Európai Gazdasági Közösség Tanácsának Növény-egészségügyi határozatai. Szemessy, Á. és Szőnyegi S.
Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1993 96
Karantén és veszélyes növényi károsítók diagnosztikai kézikönyve. I. kötet. Kalmár K., Szőnyegi S. és Németh
M. Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1994 1–180
Az Európai Gazdasági Közösség Tanácsának Növény-egészségügyi határozatai. Szemessy, Á. és Szőnyegi S.
Budapest Fővárosi Növény-egészségügyi és Talajvédelmi Állomás, Budapest 1993 96
Latent mosaic, an emerging disease of peach. Barba, M. and Faccioli, F. Inf. Agr. 54 1998 71–72
Quarantine Pests for Europe. Smith, I.M., McNamara, D.G., Scott, P.R. and Holderness, M. CAB
InternatWallingford 1997 1997 1425 pp