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Ação do hormônio tireoidiano e de seu receptor sobre o promotor do
fator de necrose tumoral alfa
Nome: Fellipe Erick Campos Orientadora: Angélica Amorin Amato
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Eixo hipotálamo-hipófise-tireoide
Tireoide
Hipófise
T4 + T3
Circulação
Tecidos
Hipotálamo
Tecidos
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• Desenvolvimento• Homeostase• Proliferação e diferenciação celular
Efeitos fisiológicos do hormônio tireoidiano
SNC
Temperatura corporal
Consumo de oxigênio
Frequência cardíaca
Metabolismo de nutrientes
Sistema Nervoso Central
Atividade de outros hormônios
SNCFunção
reprodutiva
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Histonas desacetiladas
Histonas acetiladas
Transcrição
- T3
+ T3
Mecanismo de ação do hormônio tireoidiano
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HIPOTIREOIDISMO
• Bradicardia
• Pele ressecada e fria
• Hipoglicemia
• Hipercolesterolemia
• Redução da taxa metabólica basal
HIPERTIREOIDISMO
• Taquicardia
• Pele quente e úmida
• Hiperglicemia
• Hipocolesterolemia
• Aumento da taxa metabólica basal
Deficiência x excesso de hormônio tireoidiano
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• Hipotireoidismo franco e aparelho cardiovascular
– frequência e contratilidade cardíaca
– expressão de genes que codificam enzimas que regulam
contratilidade e relaxamento cardíaco
• Thyroid hormone and the cardiovascular system: from theory to practice. J Clin Endocrinol Metab 1994; 78:1026.
• Biochemical basis of thyroid hormone action in the heart. Am J Med 1990; 88:626.
Hipotireoidismo x doença cardiovascular
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• Subclinical hypothyroidism is an independent risk factor for atherosclerosis and myocardial infarction in elderly women: the Rotterdam Study. Ann Intern Med 2000: 132:270.
• Risk for ischemic heart disease and all-cause mortality in subclinical hypothyroidism. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 3365.
• Subclinical hypothyrodism is associated with a low-grade inflammation, increased triglyceride levels and predicts cardiovascular disease in males below 50 years. Clin Endocrinol (Oxf) 2004; 61:232.
• Impaired endothelium-dependent vasodilation in subclinical hypothyroidism: beneficial effect of levothyroxine therapy. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88:3731
• Hipotireoidismo subclínico e aparelho cardiovascular
– incidência de doença aterosclerótica
– mortalidade cardiovascular
Hipotireoidismo x doença cardiovascular
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• resistência vascular periférica piora de hipertensão arterial
sistêmica
• Hipercolesterolemia
• Hiperhomocisteinemia
Doença cardiovascular aterosclerótica x inflamação sistêmica
O hormônio tireoidiano e seu receptor poderiam influenciar o processo inflamatório?
Por que o hipotireoidismo aumenta o risco de doença cardiovascular?
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Há outras condições que compartilham
alterações do eixo HHT e alterações
inflamatórias?
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Síndrome do T3 baixo
• Função tireoidiana em doenças não tireoidianas– T3– TSH normal ou baixo
• Correlação T3 e marcadores inflamatórios
• Association between serum interleukin-6 and serum 3,5,3’-triiodothyronine in nonthyroidal illness. J Clin Endocrinol Metab 1993;77(6):1695–9.
• Relationship of the increased serum interleukin-6 concentration to changes of thyroid function in nonthyroidal illness. J Endocrinol Invest 1994;17:269–74.
• Role of cytokines in the pathogenesis of the euthyroid sick syndrome. Eur J Endocrinol 1998; 138:603–14.• Relating circulating thyroid hormone concentrations to serum interleukins-6 and -10 in association with
non-thyroidal illnesses including chronic renal insufficiency. BMC Endocr Disord 2008;8:1.
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Insuficiência cardíaca
• Correlação negativa T3 x IL-6, TNF- e proteína C reativa
Controle T3L > 2 T3L < 2
TNFa (pg/mL)
T3L
(pg
/mL)
P < 0,05, r = -0,14
• Relationship between triiodothyronine and proinflammatory cytokines in chronic heart failure. Biomedicine & Pharmacotherapy 2010; 64:165-169.
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Doença renal crônica
• Função tireoidiana na doença renal crônica
– T3
– TSH normal, T3 reverso normal
• Correlação T3 x marcadores inflamatórios (IL-6, TFN-alfa)e sobrevida
• Clinical and biochemical implications of low thyroid hormone levels (total and free forms) in euthyroid patients with chronic kidney disease. J Intern Med 2007; 262:690–701.
• Low triiodothyronine: a new facet of inflammation in end-stage renal disease. J Am Soc Nephrol 2005; 16: 2789–2795.
• Low triiodothyronine and survival in end-stage renal disease. Kidney Int 2006; 70:523–528.
• Subclinical hypothyroidism is linked to micro-inflammation and predicts death in continuous ambulatory peritoneal dialysis. Nephrol Dial Transplant 2007; 22:538–544.
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Hormônio tireoidiano x inflamação
T3 Inflamação
Relação causa – efeito?
Direcionalidade?
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Receptores Nucleares
• O que são?
– Uma superfamília 48 genes 75 proteínas
– São complexos de sinalização que atuam de várias maneiras, modulando a ativação e a repressão de sinais.
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Ligação ao DNA
Ligante
Transativação
Ligação ao ligante
A/B C D E F
Domínio amino - terminal
Dobradiça (Hinge)
Domínio carboxi - terminal
AF - 1 DBD LBD
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Histonas desacetiladas
Histonas acetiladas
Transcrição
- T3
+ T3
Mecanismo de ação do hormônio tireoidiano
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Modelo de estudo
• Fator de necrose tumoral alfa (TNF-)
Macrófagos e monócitos
Adipócitos, células mesangiais
Receptor de membrana
Inflamação sistêmica
Indução de apoptose e inibição de
tumorigênese
Inibição da replicação viral
Doenças humanas
Resistência insulínica, síndrome metabólica, doença cardiovascular aterosclerótica
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Objetivo
• Objetivo Geral: – Estudar o efeito do T3 e de seu receptor sobre a atividade
transcricional no promotor do gene do TNF-α e esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos na regulação desse gene.
• Objetivos Específicos:– Estudar o efeito do T3 na regulação da atividade transcricional do receptor do hormônio
tireoidiano no promotor do gene do TNFα.
– Estudar o efeito das diferentes isoformas de TR (TRα e TRβ).– Avaliar a importância da interação direta de TR com o promotor do
TNFα.– Avaliar o efeito do T3 na síntese de proteína TNFα.
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Construções de plasmídeos repórteres contendo promotor do TNF (inteiro ou fragmentos)
-125LUC
-82
TNF RE
LUC
-1044
(-125/-82) 3X
+93
LUC
TK LUC
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0
5
10
15
20
Veículo VeículoT3 100 nM T3 100 nM
TR TR
*
Tax
a d
e at
ivaç
ão
Receptor 1 mcg + (-1044)TNF-Luc 4 mcg
0
25
50
75
100
125
150
175
vetor vazio
TR alfa
TR beta
LBDTR beta
T3 100 mM + + + +- - - -
a
a
bb
a
a
c
a
Tax
a d
e a
tiv
aç
ão
Células U937
TR e (-1044) TNF-Luc
LUC
-1044 +93
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Transfecção
• O que é?– Introdução de moléculas exógenas em células – DNA plasmidial
• Em geral, a transfecção é seguida pela expressão de um ou mais genes presentes no DNA introduzido– Ensaio de gene repórter
• Métodos– Precipitação do fosfato de cálcio– Lipossomos– Eletroporação
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Ensaio Gene Repórter
• Pra que serve o ensaio?– Para estudar a expressão dos genes – Avaliando o efeito de uma seqüência regulatória de um determinado
gene
• O que podemos realizar com o ensaio?– Delimitar os elementos regulatórios– Avaliar os efeitos de agentes hormonais– Estudar impactos em mutações gênicas
![Page 23: Ação do hormônio tireoidiano e de seu receptor sobre o promotor do fator de necrose tumoral alfa Nome: Fellipe Erick Campos Orientadora: Angélica Amorin](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062700/552fc12c497959413d8d151e/html5/thumbnails/23.jpg)
Procedimento
Processos: Lavagem (PBS 1x); Tripsina (0,5%);DMEN inibir a Tripsina
Centrifugar: 5 min a 2000 rpm.
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Procedimento
Pellet: célulasSobrenadante: meio
de cultura
1. Suspensão das células em solução tampão(PBS, cálcio, glicose)
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Mistura da suspensão de células ao DNA plasmidial
Transferência da suspensão de células + DNA plasmidial para cuvetas de 0,4 cm
Eletroporação
DNA plasmidialTR
TRE-luciferase
+ 500 L suspensão de células
(10 x 106 células)
500 L /cuveta(10 x 106 células)
950 F e 0,3 kV
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Ressuspensão das células eletroporadas em meio de cultura
Distribuição da suspensão de células em placas de 12 poços e tratamentos
1 mL/poço
Veículo T3 10-
5MT3 10-
6MT3 10-
7M
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Avaliação da expressão do gene repórter
37oC e 5% CO2 24h
10 μL do lisado celular +
10 μL do substrato da enzima luciferase
Luminômetro
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LUC
-1044 +93
Células U-937
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Transfecção TRb e (-1044)TNFLuc 1:2
0
20
40
60
80
100
120
Veículo
TR (g)+ T3 100 nM
0,5 1,0 2,0 4,0 8,0
*
*** *
* p < 0,001 vs veículo
Ta
xa
de
ati
vaç
ão
x v
eíc
ulo
(1
00
%)
LUC
-1044 +93
Células U-937
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Células U-937
-125 LUC-82
TNF RE
LUC-1044
(-125/-82) 3X
+93
LUC
TK LUC
0
20
40
60
80
100
120
TR e -125 TNFLuc (1:2)
Veículo
T3 100 nM
+ + +
+ + +
pCMX
TR
TR*
*T
axa
de
ativ
ação
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Transfecção: TR 1 mcg, TNFRE-Luc 2 mcg
0
25
50
75
100
TR alfaTR beta
Veículo VeículoT3 100 nM T3 100 nM
Tax
a d
e at
ivaç
ão
Células U-937
-125 LUC-82
TNF RE
LUC-1044
(-125/-82) 3X
+93
LUC
TK LUC
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O TR interage diretamente com o promotor do TNF-?
• Ensaio de anisotropia de fluorescência
wtTNFRE(CACTACCGCTTCCTCCAGATGAGCTCATGGGTTTCTCCACCAAG)
DBD-TR+
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Próximos passos…
• Ensaios de gene repórter com mutantes do TRb– Papel da dimerização na repressão do promotor do TNFa: L422R– Papel da superfície de interação com correpressores na repressão do
promotor do TNFa: G345R e F451X.
• Avaliação da expressão do TNFa em resposta ao tratamento com T3– Cultura de células: células mesangiais humanas
• Interação TR e promotor do TNFa in vitro (gel shift)
L422R (Mutante do TR beta – Leucina 422 trocada por uma
Arginina) – diminuição da capacidade de dimerização
G345R (Mutante no domínio de Ligação ao Ligante – LBD –
Glicina 355 trocada por uma Arginina) – perda da afinidade
do TR ao T3, não afetando ligação de dímeros ao TREs.
F451X (Mutante TR beta – 10 ultimos aa apartir da
Fenilalanina 451, foram deletados – Hélice 12 foi
eliminado, superfície de ligação ao correpressor foi exposta. )
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Obrigado!!!