METAGENÔMICA
Ana Sofia OliveiraCarolina SilveiraCaroline AmurimKatielle BraunerMaitê Becker
Universidade Federal de PelotasCentro de Desenvolvimento
TecnológicoDisciplina de Genômica II
Abordagens...Histórico
Conceito e objetivo
Biblioteca genômica
Metagenômica Viral
Extração de DNA e contaminantes
Ferramentas
Aplicações biotecnológicas
Histórico
O termo “metagenômica” foi utilizado pela primeira vez por Jo Handelsman,
professora de biologia molecular e celular, em 1998.
John Craig Venter foi o pioneiro em pesquisas de metagenômica, realizou importantes coletas de amostras ambientais, com o objetivo de mostrar comunidades bacterianas presentes no mar de Sargaços.
O que é?
Análise genômica das comunidades de microrganismos de um
determinado ambiente por técnicas independentes de cultivo
Genômica Microbiana X Metagenômica
GenômicaMicrobiana
• Os microrganismos podem ser estudados individualmente;
• Apenas 1% dos microrganismos podem ser cultivados em laboratório;
Metagenômica
• Pode identificar uma espécie, ou a comunidade como um todo;
• Identificação de novas espécies, genes ou moléculas;
Objetivo: Identificar genes funcionais e novas vias
metabólicas; Estimar a diversidade microbiana, permitindo o
estudo dos genomas em uma comunidade como um todo;
Compreender a dinâmica de uma população inteira;
Identificar biomarcadores úteis para classificar um tipo de processo ocorrido em ambientes específicos, como um ambiente poluído, por exemplo;
Montar o genoma de um organismo não cultivado;
Biblioteca Metagenômica
Conjunto de clones recombinantes que contém parte do DNA presente
em determinado ambiente ou amostra, não sendo possível garantir que todo o DNA de todas as espécies
estejam presentes na biblioteca.
Construção:
Pequenos insertos (<10kb): plasmídeos
Grandes insertos (25-40kb): cosmídeos
Maiores insertos ( 200kb): BAC
Análise:
Sequência
Atividade funcional
Sequência
Vantagem: não depende da
expressão dos genes clonados.
Desvantagem: quando quer analisar o gene completo, pode obter genes já conhecidos.
Análise funcional
Quando não encontra similaridade entre sequências.
Indicada para identificação de clones que expressem uma característica desejada.
Metagenômica Viral
Início em 2002.
Sequênciamento foi rápido pelo motivo que os tamanhos dos DNAs virais eram de 50kb.
Comparação:
3 amostras Sequenciamento GenBank (65%)
Conclusão: Enquanto as comunidades
bacterianas são bem conhecidas, as virais mostram ser relativamente não caracterizadas.
Clonagem da metagenômica viral:
Isolamento do DNA viral :
Filtragem Tratamento com DNAse Centrifugação com cloreto de césio
DNA viral é clonado em vetores e inserido em células hospedeiras.
CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA
Análise de impacto
O comprimento das subsequências
A métrica de distância usada para medir a similaridade das sequências
A estratégia de classificação (Normal ou hierárquica)
Classificação de sequenciamento
Sequenciamento pelo método de Sanger (Primeira geração):
Necessidade de clonar fragmentos Problema de clonagem Maior tempo e custo
Sequenciamento de genomas: Mascara a sequencia do vetor usado na
clonagem, todos os fragmentos de DNA são do mesmo organismo
Sequenciamento de Segunda geração: Direto, sem a necessidade de clonar os
fragmentos de DNA Menor tempo e custo Grande quantidade de sequência por
corrida
Extração da amostra
SOLO
ÁGUA SALGADA
MICROBIOTA HUMANA
Métodos para o isolamento de DNA
Indireta ou de fracionamento: Microrganismos separados do substrato
anteriormente a lise Estratégia usada para solos contendo
uma grande quantidade de contaminante Estresse mecânico no DNA genômico é
reduzido Possível perda de microrganismos Clonados em vetores como cosmídeos e
BAC
Direto: Adequados para vários tipos de solos Menos trabalhosos Maior rendimento de DNA de alto peso
molecular Microrganismos lisados no contexto do
substrato Clonagem em vetores plasmídeos ou fago Promotores fortes para facilitar a
expressão genica do fragmento clonado
Contamimantes
Co-extração de DNA (ácidos húmicos,...)
DNA extracelular de fungos, bactérias e células de plantas mortas
Propriedades de solubilidade similares ao DNA
Interferem negativamente na atuação da taq DNA polimerase
Afetam na eficiência de hibridização DNA-DNA
Afetam em processos de transformação do DNA
Ferramentas
Mudanças na variedade e estrutura de uma comunidade microbiana permite a identificação dos microrganismos de um certo ambiente.
• mRNA expressos.Metatranscriptoma
• proteínas expressas.Metaproteômica
Metaproteômica
Fornece a evidencia da expressão do gene sob uma determinada condição.
Exemplo: Genes devem ter sido transcritos e
traduzidos para produzir um produto da proteína para uma melhor avaliação da função microbiana.
Metatranscriptoma
Utiliza-se de microarrays para explorar a atividade bacteriana das espécies;
Correlaciona a presença de um gene e as características de um determinado ambiente;
Utilizada para descobertas de regiões do gene onde podem codificar produtos de interesse biotecnológico.
Metatranscriptoma
Exemplo: Enzimas utilizadas como biorreatores.
Arrays
São os arranjos filogenéticos, sequenciamentos de regiões gênicas conservadas que podem possibilitar a identificação dos gêneros estudados.
Microarrays
Consiste em um arranjo pré-definido de
moléculas de DNA, quimicamente ligados a uma base sólida.
Os microarrays são utilizados na detecção e quantificação de ácidos nucléicos provenientes de amostras biológicas, as quais são postas para hibridar com o DNA fixado no array.
Luz = Hibridização
Microarrays
Microarrays
São usados para:
Quantificar a diversidade ambiental bacteriana;
Monitorar a expressão gênica;
Categorizar genes envolvidos em determinados processos.
Bioinformática
Gerenciamento, interpretação e distribuição do grande volume de
informações obtidas a partir de projetos genoma.
Taxonomia e filogenia.
Bioinformática
As sequencias de nucleotídeos serão comparadas com sequencias existentes no GenBank (principal banco de dados), que são acessadas através do NCBI
utilizando a ferramenta BLAST que auxilia na identificação da espécie do
DNA sequenciado.
Bioinformática
O NCBI foi criado para desenvolver ferramentas de bioinformática para armazenar e analisar todo o conhecimento sobre a biologia molecular, bioquímica e genética.
Áplicações da metagenomica
Aplicações biotecnológicas
Saúde Humana
com esta técnica pode localizar as bactérias nos nossos intestinos e descobrir a sua função, o que pode ajudar-nos a estudar algumas condições, tais como a obesidade e a diabetes.
Biorremediação
Agricultura
Interação entre bactérias e o solo;
Condução dessas comunidades para
um melhor aproveitamento e redução
de impactos ambientais.
Enzimas e biocombustíveis
Obrigada!