MATEUS VIDIGAL DE CASTRO
“ESTUDO COMPARATIVO DO EMPREGO DE
SELANTE DE FIBRINA COMERCIAL E
DERIVADO DO VENENO DE CASCAVEL
PARA REIMPLANTE DE RAÍZES VENTRAIS
MEDULARES APÓS AVULSÃO”
Campinas, 2015.
À minha amada irmã Viviane.
“Para tudo há uma ocasião, e um tempo para
cada propósito debaixo do céu”
Eclesiastes 3:1 (NVI).
AGRADECIMENTOS
Primeiramente à Deus, pelo Dom da vida, e por estar vivendo o aqui e o agora.
À todos os animais que perderam suas vidas em prol da minha pesquisa.
Ao Prof. Dr. Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, orientador e incentivador no projeto de
mestrado, pela confiança e oportunidades de crescimento profissional e pessoal a mim
concedida. Obrigado também pelas discussões frutíferas e idéias inovadoras, que
frequentemente são colocadas em prática de forma extraordinária.
À Roberta Barbizan, que muito me ajudou na iniciação científica e com certeza contribuiu
muito para a minha formação como pesquisador;
À Juliana Nista, que muito me ajudou em experimentos;
À UNICAMP, por proporcionar o cenário e aos seus profissionais que contribuíram para
meu aprendizado; Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do
Instituto de Biologia, sua coordenação e à secretária Líliam por toda a ajuda concedida; Aos
professores do programa, por todos os ensinamentos; Aos técnicos do departamento por
todo o auxílio;
Ao CEMIB, por conceder os animais utilizados nesse trabalho;
Ao CEVAP, por conceder o selante de fibrina utilizado em meu trabalho, pela comunhão de
idéias e pela grande colaboração com nosso laboratório.
À Fapesp, pelo apoio financeiro.
À minha família, em especial à minha mãe Josalba (In memoriam) e meu pai Carlos; Fonte
de prosperidade, paz e harmonia.
Obrigado a todos os companheiros de trabalho: Simone, Patrícia, Gabriela, Júlio, André,
Matheus, Rodrigo, Sergiy, Roya, Gustavo, Luciana, Aline, Bruna, Danielle, Elisa, Marta,
Greice, Melissa, Giuliano, Natália, Carol, Felipe, Giuliana; Pela dedicação e ajuda, carinho
e respeito, que sempre tive de cada um.
Obrigado a todos os amigos que me acompanharam por esses longos dois anos, sempre
me apoiando: Leo e Mari, Andressa, Rob, Patrique, Lúcia, Rafaela, Henrique e Marina,
Mayara, Kyl.
RESUMO
Lesões axonais na interface do sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP), como a
avulsão de raízes ventrais (ARV), induzem importantes processos degenerativos
retrógrados, podendo resultar em morte neuronal e consequente perda da função motora.
Nesse tipo de lesão ocorre a separação de raízes nervosas com a medula espinal,
interrompendo o contato entre um motoneurônio e as fibras musculares por ele inervadas.
Um tratamento promissor seria a utilização de selantes de fibrina, para reimplantar as raízes
ventrais nos seus respectivos sítios de avulsão e assim, promover a reconexão do
motoneuronio ao órgão alvo e consequentemente, o retorno funcional. Atualmente os
selantes de fibrina são utilizados em uma vasta gama de procedimentos cirúrgicos,
incluindo cirurgia cardiovascular, torácica, plástica e reconstrutiva, dentária e neurocirurgia.
No presente estudo foram utilizados dois tipos de selantes de fibrina para reconectar as
raízes ventrais no local exato da lesão. Um deles, produzido a partir do veneno de Crotalus
durissus terrificus e outro produzido comercialmente, a fim de investigar a eficácia de
ambos na regeneração nervosa e recuperação motora após avulsão de raízes ventrais
medulares. Para isso, ratos Lewis fêmeas, com 10 semanas de idade, foram submetidos à
avulsão de raízes ventrais medulares (L4-L6). Esses animais foram divididos em 3 grupos:
1) Avulsão de raízes motoras, sem reimplante; 2) Avulsão e reimplante das raízes motoras
com selante de fibrina derivado do veneno de Crotalus durissus terrificus na superfície
medular; 3) Avulsão e reimplante das raízes motoras com selante de fibrina comercial
(Tissucol). A intumescência lombar e o nervo isquiático foram dissecados e os espécimes
processados para a investigação da sobrevivência neuronal e contagem de axônios
mielínicos, bem como análise de parâmetros histomorfométricos. A imunoistoquímica foi
empregada para avaliar a estabilidade sináptica, reatividade astroglial e reatividade
microglial, além da expressão de proteínas relacionadas ao processo regenerativo axonal.
Adicionalmente, a evolução da recuperação motora, foi investigada através do método
“walking track test” (CatWalk). Os resultados indicaram que o reimplante das raízes
avulsionadas com ambos selantes de fibrina melhoraram significativamente a recuperação
motora até 12 semanas pós-operatórias. Além disso, o número médio de axônios e a
sobrevivência neuronal foram igualmente aumentados nos grupos onde houve o reimplante.
Por fim, o reimplante promeveu preservacão parcial da cobertura sináptica e aumento da
expressão de proteínas relacionadas ao processo de regeneracão axonal. Por outro lado,
não houve diferenças na reatividade microglial e astrogliose reativa, na fase aguda pós-
lesão, entre os grupos experimentais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que o
selante de fibrina derivado do veneno de Crotalus durissus terrificus, bem como o selante
de fibrina comercial (Tissucol), utilizados para o reimplante de raízes medulares são
similarmente eficientes, reimplantando as raízes avulsionadas de forma estável e
duradoura, gerando efeitos neuroprotetores e promovendo melhora motora.
ABSTRACT
Axonal injury in the interface of central nervous system (CNS) and peripheral (PNS) such
as ventral roots avulsion (VRA) induce major retrograde degenerative processes which may
cause neuronal death and loss of motor function. By this type of injury occurs the separation
of nerve roots with the spinal cord, interrupting the contact between a motor neuron and the
innervated muscle fibers. One promising treatment would be to use of fibrin sealants to
redeploy the ventral root in their respective sites of avulsion, thereby promote the
reconnection of motor neuron to the target organ, and therefore, return of functional.
Currently fibrin sealants are used in a wide range of surgical procedures, including
cardiovascular, thoracic, plastic and reconstructive, dental and neurosurgery. In the present
research, we used two types of fibrin sealants to reconnect the ventral roots in the exact
location of the injury. One of them, produced from the venom of Crotalus durissus
terrificus other commercially produced to investigate the efficacy of both sealants to the
nerve regeneration and motor recovery after avulsion of ventral spine roots. For this, Lewis
rats female, 10 weeks old, were underwent to avulsion of ventral spinal root (L4-L6). These
animals were divided in 3 groups: 1) avulsion of motor roots without reimplantation; 2)
avulsion and reimplantation of motor roots with fibrin sealant derived from venom of
Crotalus durissus terrificus on the spinal cord surface; 3) avulsion and reimplantation of
motor roots with commercial fibrin sealant (Tissucol). The lumbar enlargement and sciatic
nerve were dissected and samples processed for the investigation of neuronal survival and
counting of myelinated axons as well as for analysis of histomorfometric parameters.
Immunohistochemistry was used to evaluate synaptic stability, reactivity astroglial and
microglial, beyond the expression of proteins related to axonal regeneration process.
Additionally, the evolution of motor recovery was investigated using the "walking track test"
(Catwalk). The results indicated that reimplantation of avulsion roots with both fibrin sealants
significantly improved motor recovery up to 12 weeks postoperative. Moreover, the average
number of axons and neuronal survival was also increased in the groups that received the
reimplantation. Finally, reimplantation promoted partial preservation of synaptic coverage
and increased expression of proteins related to axonal regeneration process. Furthermore,
no differences in microglial reactivity and reactive astrogliosis in the acute phase after injury,
among the experimental groups. Taken together, our results suggest that the derived fibrin
sealant from venom of Crotalus durissus terrificus, as well as the commercial fibrin
sealant (Tissucol), used for the reimplantation of spinal cord roots are similarly efficient,
reimplanting the avulsion roots effectively, are neuroprotective and promoting the motor
improvement.
Lista de figuras
Figura 1. Esquema de hemi-medula espinal. A imagem representa um corte
transversal da medula espinal em nível lombar, mostrando a formação do nervo espinal.
Fonte: Koeppen and Stanton: Berne and Levy Physiology, 6th Edition. Modificado.
Figura 2. Eletromicrografia obtida na região do terço médio do nervo isquiático em
microscópio eletrônico de transmissão, evidenciando as seguintes estruturas: CS) – Célula
de Schwann, M) – Axônio mielínico, A) Axônio amielínico.
Figura 3. Fotomicrografia de corte transversal do nervo isquiático, evidenciando as
seguintes estruturas: (T) – Nervo tibial; (F) – Nervo fibular, (S) – Nervo sural. A seta indica
o perineuro.
Figura 4. Esquema da medula espinal submetida à avulsão de raizes motoras. A
imagem representa um corte transversal da medula espinal, indicando o sítio exato da
lesão. Fonte: Koeppen and Stanton: Berne and Levy Physiology, 6th Edition. Modificado.
Figura 5. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal em
microscópio de luz (contraste de fase em campo claro), evidenciando as raízes ventrais. A)
– Raiz ventral do lado contralateral a lesão, B) – Raiz ventral reimplantada - lado ipsilateral.
Figura 6. Sistema ''CatWalk'’ (Walking Track Test). (A) - Imagem do equipamento
com a câmera de alta resolução em destaque no interior do círculo. (B) - Plataforma onde
os ratos realizaram as caminhadas. (D) e (E) - Sistema em funcionamento. Destaque para
as impressões plantares. (F) e (G) - Tela do software enquanto o teste está ocorrendo.
Destaque para os gráficos 3D e os resultados estatísticos fornecidos pelo sistema ao final
do teste. Fonte: http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/catwalk
Figura 7. Fotomicrografia de corte transversal do nervo isquiático. Em (A), após a
montagem das micrografias na objetiva de 10X, foi realizada a medida da área do nervo.
Em (B), utilizou-se a objetiva de 100X para realizar a quantificação das fibras.
Figura 8. Imagem do nervo isquiático previamente editada (transformada em preto
e branco), em objetiva de 100x. Observar a ferramenta limiar usada (círculo à esquerda),
bem como os parâmetros morfométricos obtidos pelo programa referente ao axônio
selecionado (seta central): Perímetro da figura (Perímetro); Área correspondente à bainha
de mielina (Área); e Diâmetro mínimo da fibra mielínica (Height). O background e fibras que
não apareciam inteiras na imagem original foram apagadas.
Figura 9. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal coradas
com cresil violeta (Coloração de Nissl), representando a sobrevivência neuronal, 4 semanas
após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo
avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) -
Lado ipsilateral do grupo implante com selante comercial, (E) – Gráfico da razão percentual
ipsi e contralateral da sobrevivência dos motoneurônios medulares após a avulsão. Note-
se maior sobrevivência neuronal após a avulsão das raízes nervosas nos grupos onde
houve o reimplante, não havendo diferença entre os tratamentos (** = p<0.01; n=5 para
cada grupo).
Figura 10. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal
coradas com cresil violeta (Coloração de Nissl), representando a sobrevivência neuronal,
12 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral
do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo
CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante comercial, (E) – Gráfico da
razão percentual ipsi e contralateral da sobrevivência dos motoneurônios medulares após
a avulsão. Note-se maior sobrevivência neuronal após a avulsão das raízes nervosas nos
grupos onde houve o reimplante, não havendo diferença entre os tratamentos (** = p<0.01;
n=5 para cada grupo).
Figura 11. Fotomicrografias de cortes transversais do nervo isquiático
representativas dos diferentes grupos experimentais, corados com Sudan Black, 4 semanas
após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo
avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) -
Lado ipsilateral do grupo implante com selante comercial, (E) - Gráfico da quantificação do
número de fibras mielínicas (*** = p< 0,001; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 10
µm.
Figura 12. Fotomicrografias de cortes transversais do nervo isquiático
representativas dos diferentes grupos experimentais, corados com Sudan Black, 12
semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do
grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP,
(D) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante comercial, (E) - Gráfico da quantificação
do número de fibras mielínicas (*** = p< 0,001; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 10
µm.
Figura 13. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo
das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4
semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do
grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo
CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
Figura 14. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo
das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12
semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do
grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo
CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
Figura 15. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo
dos axônios mielínicos dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4
semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do
grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo
CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
Figura 16. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo
dos axônios mielínicos dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12
semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do
grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo
CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
Figura 17. Histograma de distribuição de frequência referente a espessura da
bainha de mielina das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada
grupo), 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado
ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado
pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
Figura 18. Histograma de distribuição de frequência referente a espessura da
bainha de mielina das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada
grupo), 12 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado
ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado
pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
Figura 19. Histograma de distribuição de frequência referente a razão “g” das fibras
mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4 semanas após a
lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C)
- Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado
ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
Figura 20. Histograma de distribuição de frequência referente a razão “g” das fibras
mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12 semanas após a
lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C)
- Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado
ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
Figura 21. Análise da porcentagem da espessura da bainha de mielina, bem como
a razão “g”, nos diferentes grupos experimentais, ao longo do tempo. (A) - Porcentagem de
fibras mielínicas com bainha de mielina superior a 2µm de espessura, 4 semanas após
lesão. (B) - Porcentagem de fibras mielínicas com bainha de mielina superior a 2µm de
espessura, 12 semanas após lesão. (C) - Porcentagem de fibras mielínicas na faixa de 0,7-
0,9 de razão “g”, 4 semanas após lesão. (D) - Porcentagem de fibras mielínicas na faixa de
0,7-0,9 de razão “g”, 12 semanas após lesão.
Figura 22. Relação da razão “g” com o diâmetro mínimo do axônio, dos diferentes
grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4 semanas após a lesão. (A) - Lado
contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral
do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante comercial.
Figura 23. Relação da razão “g” com o diâmetro mínimo do axônio, dos diferentes
grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12 semanas após a lesão. (A) - Lado
contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral
do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante comercial.
Figura 24. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-sinaptofisina, 4 semanas após a lesão. (A) -
Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado
ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do
grupo implante com selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão
ipsi/contralateral da média da densidade integrada de pixels. Note-se grande redução na
expressão de sinaptofisina, resultado de pequena cobertura sináptica nestes neurônios,
após a avulsão das raízes nervosas (** = p<0.01; n=5 para cada grupo). Barra de escala =
50µm.
Figura 25. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lâmina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-GFAP, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado
contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral
do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral
da média da densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, a forte presença
astrogliose reativa circunjacente aos motoneurônios, após a avulsão das raízes nervosas,
não havendo diferença entre grupos experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala
= 100µm.
Figura 26. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lamina IX do corno
ventral da medula espinal marcada com anti-Iba-1, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado
contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral
do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral
da média da densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, a forte presença
de microglia reativa próxima aos motoneurônios, após a avulsão das raízes nervosas, não
havendo diferença entre grupos experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala =
100µm.
Figura 27. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica de cortes longitudinais do
nervo isquiático marcado com anti-neurofilamento, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado
contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral
do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral
da média da densidade integrada de pixels. Não houve diferença entre grupos
experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.
Figura 28. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica de cortes longitudinais do
nervo isquiatico marcado com anti-S100, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral
do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo implante com
selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral da média da
densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, uma intensa marcação das
células de Schwann, após a avulsão das raízes nervosas (* = p<0.5; ** = p<0.01; n=5 para
cada grupo). Barra de escala = 100µm.
Figura 29. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica de cortes longitudinais do
nervo isquiatico marcado com anti-p75NTR, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado
contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral
do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral
da média da densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, uma intensa
marcação de pan receptores para neurotrofinas, após a avulsão das raízes nervosas
(p<0.01; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.
Figura 30. Análise da função motora dos animais com doze semanas após a lesão.
Observar a recuperação motora dos animais que, após sofrerem avulsão das raízes
ventrais, tiveram o reimplante das mesmas realizado com os selantes de fibrina. A) Gráfico
construído com a razão ipsi/contralateral referente aos valores do índice funcional do fibular
aferido até 12 semanas pós-operatórias (n=7; **=p<0.01). B) Gráfico construído com a
razão ipsi/contralateral referente aos valores da área da pegada aferida até 12 semanas
pós-operatórias (n=7; *= p<0.5). C) Gráfico construído com a razão ipsi/contralateral
referente aos valores do tempo da pegada aferida até 12 semanas pós-operatórias (n=7;
**=p<0.01).
Lista de tabelas
Tabela 1. Grupos experimentais e tempos de sobrevida após a avulsão das raízes
ventrais e técnicas utilizadas em cada grupo, bem como o objetivo de estudo de cada uma
delas.
Tabela 2. Anticorpos primários usados no ensaio de imunoistoquímica. Cada
anticorpo é seguido pelo fornecedor, animal hospedeiro, código do produto e concentração
utilizada.
Tabela 3. Valores médios do diâmetro mínimo das fibras mielínicas, diâmetro
mínimo do axônio, espessura da bainha de mielina e razão "g" nos diferentes grupos
experimentais, 4 semanas pós lesão. Os valores são apresentados como média ± erro
padrão.
Tabela 4. Valores médios do diâmetro mínimo das fibras mielínicas, diâmetro
mínimo do axônio, espessura da bainha de mielina e razão "g" nos diferentes grupos
experimentais, 12 semanas pós lesão. Os valores são apresentados como média ± erro
padrão.
Lista de abreviaturas
ARV – Avulsão de raiz ventral
BDNF - Fator neurotrófico derivado do cérebro
BSA - Albumina de soro bovino
CEMIB - Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica
CEUA – Comissão de ética no uso de animais
CS – Célula de Schwann
DA - Diâmetro mínimo dos axônios mielínicos
DF - Diâmetro mínimo das fibras mielínicas
EBM - Espessura da bainha de mielina
GFAP - Proteína fibrilar ácida glial
IBA-1 – Proteína adaptadora de ligacao de cálcio ionizado
NGF - Fator de crescimento do nervo
PB – Tampão fosfato
PFI - Índice funcional do nervo fibular
PL - Comprimento da pata
RZG - Razão "g"
SFB - Soro fetal bovino
SN - Sistema nervoso
SNC - Sistema nervoso central
SNP - Sistema nervoso periférico
TS - Largura da pata
Sumário
1. Introdução ...................................................................................................................................... 23
1.1 - MEDULA E NERVOS ESPINAIS................................................................................................. 24
1.2 - AVULSAO E RESPOSTA À LESÃO ............................................................................................. 27
1.3 - REIMPLANTE DE RAÍZES MEDULARES .................................................................................... 29
1.4 - SELANTES DE FIBRINA ............................................................................................................ 30
2. Justificativa ..................................................................................................................................... 34
3. Objetivos ........................................................................................................................................ 37
3.1 - OBJETIVOS GERAIS ................................................................................................................. 38
3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................................................... 38
4. Material e Métodos........................................................................................................................ 39
4.1 - GRUPOS EXPERIMENTAIS ....................................................................................................... 40
4.2 - OBTENÇÃO DO SELANTE DE FIBRINA DERIVADO DO VENENO DE CROTALUS DURISSUS
TERRIFICUS ..................................................................................................................................... 41
4.3 – OBTENÇÃO DO SELANTE DE FIBRINA COMERCIAL ................................................................ 42
4.4 - AVULSÃO DAS RAÍZES MOTORAS ........................................................................................... 42
4.5 - REIMPLANTE DAS RAÍZES MOTORAS ..................................................................................... 42
4.6 - AVALIAÇÃO MOTORA DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL ......................................................... 43
4.7 - SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS ...................................................................................................... 46
4.8 - ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA DO NERVO ISQUIÁTICO ..................................................... 46
4.9 – IMUNOISTOQUIMICA ............................................................................................................ 49
4.10 - SOBREVIVÊNCIA NEURONAL ................................................................................................ 51
4.11 - ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS ............................................................................. 51
5. Resultados ...................................................................................................................................... 52
5.1 - EFEITO NEUROPROTETOR DOS SELANTES DE FIBRINA - SOBREVIVÊNCIA NEURONAL ......... 53
5.2 - ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA DO NERVO ISQUIÁTICO - REGENERAÇÃO AXONAL ........... 57
5.2.1 – CONTAGEM DO NÚMERO DE AXÔNIOS MIELÍNICOS ..................................................... 57
5.2.2 – DIÂMETRO MÍNIMO DAS FIBRAS MIELÍNICAS (DF) ........................................................ 61
5.2.3 – DIÂMETRO MÍNIMO DOS AXÔNIOS MIELÍNICOS (DA) ................................................... 63
5.2.4 – ESPESSURA DA BAINHA DE MIELINA (EBM) ................................................................... 65
5.2.5 – RAZÃO “g” (RZG) ............................................................................................................ 67
5.2.6 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS POR MEIO DE DOTPLOT – RZG X DIÂMETRO MÍNIMO
DO AXÔNIO ................................................................................................................................ 70
5.3 - REDUÇÃO DO PROCESSO DE ELIMINAÇÃO SINÁPTICA, AVALIADA ATRAVÉS DA EXPRESSÃO
DE SINAPTOFISINA ......................................................................................................................... 73
5.4 - REATIVIDADE GLIAL ................................................................................................................ 75
5.5 - EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS AO PROCESSO REGENERATIVO AXONAL ......... 79
5.6 - AVALIAÇÃO MOTORA DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL ......................................................... 85
6. Discussão ........................................................................................................................................ 88
6.1 - REIMPLANTE E SOBREVIVÊNCIA NEURONAL ......................................................................... 89
6.2 - REIMPLANTE E A PLASTICIDADE SINÁPTICA .......................................................................... 90
6.3 - REIMPLANTE E REATIVIDADE GLIAL E PROCESSO REGENERATIVO AXONAL ......................... 90
6.4 - REIMPLANTE E REGENERAÇÃO NERVOSA E RECUPERAÇÃO FUNCIONAL ............................. 92
7. Conclusões ..................................................................................................................................... 95
8. Referências ..................................................................................................................................... 97
9. Anexo ........................................................................................................................................... 107
23
1. Introdução
24
1.1 - MEDULA E NERVOS ESPINAIS
O sistema nervoso (SN) é uma extensa e complicada organização de estruturas
pelas quais as reações internas do indivíduo são correlacionadas e integradas e pelo qual
são controlados seus ajustamentos ao meio ambiente. O SN é anatomicamente dividido em
Sistema Nervoso Central (SNC), que se localiza dentro do esqueleto axial (cavidade
craniana e canal vertebral) e pelo Sistema Nervoso Periférico (SNP), que se localiza fora
do esqueleto axial. O SNC é composto pelo encéfalo e pela medula espinal, enquanto o
SNP é composto por nervos, gânglios e terminações nervosas (Machado, 2000).
A medula espinal situa-se no interior do canal vertebral, apresentando forma
aproximadamente cilíndrica, sendo ligeiramente achatada no sentido ânteroposterior. Seu
calibre não é uniforme, pois apresenta algumas dilatações. O tecido nervoso presente na
medula espinal é morfologicamente dividido em substância branca e substância cinzenta.
A substância branca é formada por fibras nervosas, em sua maioria mielínica, agrupadas
em funículos. Por outro lado, a substância cinzenta localiza-se internamente à branca e
apresenta a forma de um ‘‘H’’, onde estão situados os corpos de neurônios. Levando-se em
consideração a organização dos neurônios na substância cinzenta medular, em 1952,
Rexed propôs a divisão da mesma em dez lâminas. A lâmina IX contém os núcleos motores,
que possuem diferentes dimensões de acordo com o segmento medular, caracterizando o
aparecimento das intumescências cervical e lombar, responsáveis pela inervação dos
membros inferiores e superiores, respectivamente, ao longo da medula espinal (Rexed,
1952).
Nos sulcos lateral anterior e posterior da medula, emergem filamentos radiculares,
que se unem para formar, respectivamente, as raízes ventrais e dorsais que, unidas, darão
origem a cada nervo espinal. A raiz ventral é formada por axônios que se originam em
motoneurônios situados nas colunas anterior e lateral da medula, enquanto a raiz dorsal é
formada por axônios que se originam em neurônios situados nos gânglios sensitivos da raiz
dorsal, que se apresenta como uma porção dilatada da própria raiz. Da união da raiz dorsal
sensitiva, com a raiz ventral motora, forma-se o tronco do nervo espinal, que funcionalmente
é misto. (Machado, 2000). (Figura 1).
Os nervos periféricos apresentam axônios mielínicos e amielínicos, dependendo de
suas relações com as células de Schwann (CS) (Figura 2). Em um axônio mielínico, que
em geral possui um diâmetro maior que 1µm, as CS, dispostas sequencialmente formam,
25
ao seu redor, uma estrutura tubular denominada bainha de mielina. As CS vizinhas estão
separadas umas das outras por intervalos destituídos de mielina e parcialmente cobertos
por digitações laterais do seu citoplasma. Estes espaços são denominados nodos de
Ranvier (Landon e Hall, 1976; Peters et al., 1976). Entretanto, nos axônios amielínicos, uma
CS, através de projeções citoplasmáticas, envolve total ou parcialmente entre 5 a 25
axônios, não havendo a formação da bainha de mielina. Dessa forma, os axônios
amielínicos encontram-se individualmente alocados no interior de sulcos ou canais
formados pelas expansões do citoplasma das CS (Peters et al., 1976).
Figura 1. Esquema de hemi-medula espinal. A imagem representa um corte transversal da
medula espinal, mostrando a formação do nervo espinal. Fonte: Koeppen and Stanton:
Berne and Levy Physiology, 6th Edition. Modificado.
O tecido de sustentação dos nervos é constituído por uma camada fibrosa mais
externa de tecido conjuntivo denso, o epineuro. Geralmente, os fascículos caminham de
forma relativamente organizada dentro do nervo, revestidos por bainha de várias camadas
de células achatadas, justapostas, compondo o perineuro. As células de bainha perineural
unem-se por junções oclusivas, constituindo uma barreia à passagem de muitas
macromoléculas e importante mecanismo de defesa contra agentes agressivos. Dentro da
bainha perineural encontram-se os axônios, cada um envolvido pela bainha de mielina, com
sua lâmina basal e um envoltório conjuntivo constituído principalmente por fibras reticulares
sintetizadas pelas células de Schwann, chamado endoneuro.
26
Figura 2. Eletromicrografia de transmissão obtida no terço médio do nervo isquiático,
evidenciando as seguintes estruturas: CS) – Célula de Schwann, M) – Axônio mielínico, A)
Axônios amielínicos.
O nervo isquiático do rato é formado pelos segmentos medulares L4, L5 e L6. Esses
segmentos também contribuem para formacão de outros nervos do plexo lombosacral. No
nível do trocânter maior do fêmur apresenta-se unifascicular e 5-7 milímetros distalmente,
o nervo divide-se em duas porções (porção tibial e porção fibular) e posteriormente, em
quatro fascículos. A porção tibial dá origem ao nervo tibial e ao nervo sural, enquanto a
porção fibular dá origem ao nervo fibular e ao ramo cutâneo. Em seu trajeto descedente,
perfura os músculos isquiotibiais, localizando-se lateralmente na face posterior da coxa, e
os dois maiores nervos, tibial e fibular, inervam as regiões dorsal e ventral da perna
(Schmalbruch, 1986).
Em um estudo prévio sobre a composição de fibras nervosas do nervo isquiático de
ratos, conduzido por Schmalbruch em 1986, verificou-se que este nervo apresenta cerca
de 7.800 fibras mielínicas, das quais 4.500 compõem o nervo tibial (1000 são motoras),
1.900 o nervo fibular (600 são motoras), 1.100 o nervo sural, e 400 o ramo cutâneo. Deste
total, apenas 1.600 axônios são motores, aproximadamente 20% do total de axônios
mielínicos presentes no nervo.
27
Figura 3. Fotomicrografia de corte transversal do nervo isquiático, evidenciando as
seguintes estruturas: (T) – Nervo tibial; (F) – Nervo fibular, (S) – Nervo sural. A seta indica
o perineuro.
1.2 - AVULSAO E RESPOSTA À LESÃO
Lesões próximas da interface entre o Sistema Nervoso Central (SNC) e periférico
(SNP) desencadeiam uma extensa degeneração de motoneurônios medulares (Novikov et
al., 1995; Kishino et al., 1997; Oliveira e Langone, 2000), acarretando permanente perda
das respectivas funções motoras. Os neurônios motores afetados apresentam,
adicionalmente, no período agudo pós-lesão, perda significativa de sinapses (Kuno e
Llina´s, 1970; Purves, 1975; Takata e Nagahama, 1983; Delgado-Garcia et al., 1988),
dentre outras alterações no microambiente medular.
Experimentalmente, tal degeneração neuronal e alterações medulares podem ser
induzidas através da avulsão de raízes nervosas ventrais (motoras), a qual consiste na
abrupta separação dessas raízes da medula espinal, causando uma interrupção do contato
entre o motoneurônio e as fibras musculares alvo, com mínima interferência na integridade
do tecido próximo à raiz lesada e seu sistema vascular (Livesey e Fraher, 1992), sendo as
causas mais comuns da avulsão de raízes nervosas, em pacientes, acidentes de
motocicleta e em severa tração durante partos complicados, resultando em perdas motoras,
sensitivas e autônomas da extremidade afetada (Carlstedt, 2009).
28
Figura 4. Esquema da medula espinal submetida à avulsão de raizes motoras. A imagem
representa um corte transversal da medula espinal, indicando o sítio exato da lesão. Fonte:
Koeppen and Stanton: Berne and Levy Physiology, 6th Edition. Modificado.
Esse tipo de lesão resulta na retração de botões sinápticos da superfície da célula
axotomizada (Purves e Lichtman, 1978; Brannstrom e Kellerth, 1998) levando à perda de
80% das células nervosas lesadas até a segunda ou terceira semanas após o trauma
(Koliatsos et al., 1994). No caso de a reinervação do órgão alvo não ocorrer, tais alterações
sinápticas podem se tornar irreversíveis (Brannstrom e Kellerth, 1998). Para a função ser
restaurada, as células nervosas devem sobreviver à lesão e deve haver crescimento axonal
ao longo de sua trajetória, através das raízes nervosas.
Existe uma relação direta entre a transecção de raiz nervosa e alteração da função
neuronal (Yamaguchi et al., 1999). Após o trauma de raízes nervosas, mudanças axonais
indicativas de disfunção e degeneração se iniciam proximal e distalmente à lesão
(Kobayashi et al., 2004). A lesão da raiz nervosa pode resultar em isquemia e formação de
edema, extravasamento de fluidos intracelulares e desencadear, distalmente à lesão, a
degeneração Walleriana (Kobayashi et al., 2004).
Durante a degeneração Walleriana, ocorre a fragmentação da bainha de mielina dos
axônios lesados. Concomitantemente, ocorre o recrutamento dos macrófagos em direção
29
ao local da lesão, bem como a multiplicação das células de Schwann. Ambos os tipos
celulares atuam na fagocitose dos fragmentos de mielina e de neurofilamentos dos axônios
em degeneração (Sunderland, 1990), criando assim, um microambiente favorável ao
crescimento e orientação axonal em direção ao órgão alvo, fundamental ao sucesso do
processo regenerativo (Frisen, 1997). Adicionalmente, as células de Schwann são cruciais
para o processo de regeneração axonal, por realizarem a mielinização dos axônios em
brotamento e proverem um substrato rico para o crescimento dos novos axônios, pois
sintetizam vários fatores de crescimento, como o fator neurotrófico de crescimento do nervo
(NGF), o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), entre outros, fundamentais ao
desenvolvimento, manutenção e regeneração das células nervosas (Garbay et al., 2000).
Adicionalmente, induzem e orientam o crescimento axonal em direção ao órgão alvo
através da síntese de moléculas neurotróficas (Frisen, 1997).
Quanto mais tempo levar a reinervação do alvo, maior a chance de atrofia
permanente por denervação dos tecidos alvo, no caso o músculo estriado esquelético.
Portanto, a regeneração acelerada é crucial para a obtenção de resultados funcionais
satisfatórios.
1.3 - REIMPLANTE DE RAÍZES MEDULARES
A implantação cirúrgica das raízes ventrais lesadas se mostrou uma estratégia
eficaz e pode servir como um modelo de regeneração na interface do SNC/SNP, (Cullheim
et al., 1999), pela proximidade dessa lesão com o corpo celular dos motoneurônios. Em
humanos, esta técnica é atualmente considerada um tratamento relativamente promissor
para restaurar parcialmente funções motoras, bem como reduzir a ocorrência de dor
neuropática intratável. Para reimplantar a raiz e mantê-la em posição na medula, sutura-se
a raiz na pia-máter (Carlstedt, 2009). Entretanto, nem sempre a sutura direta é viável,
podendo ser utilizados selantes de fibrina como alternativa para reconectar a raiz no ponto
exato onde essa foi avulsionada. Outras formas de implante, alternativamente àquela
proposta no presente estudo, utilizam enxerto de outros nervos ou, ainda, fazendo-se uma
pequena abertura na medula (Pintér et al, 2010).
O reimplante de raízes ventrais tem caráter neuroprotetor, permitindo a
regeneração axonal, além de resultar em reinervação anatômica e funcional dos músculos
30
esqueléticos (Cullheim et al., 1989; Hoang et al., 2006; Chang e Havton, 2008),
possibilitando a passagem de fatores neurotroficos. Com a avulsão da raiz, a perda de
conexão do motoneurônio com seu alvo periférico gera uma interrupção de fornecimento,
aos motoneurônios, de fatores neurotróficos produzidos pelo alvo, que juntamente com o
trauma vascular levam a à excitoxidade, o que drasticamente reduz o número de
motoneurônios até cerca de 80% da população normal, dentro das primeiras duas semanas
após a lesão (Koliatsos et al, 1994).
Fatores neurotróficos são moléculas que tem têm um impacto profundo e
significativo em eventos de desenvolvimento, como a sobrevivência celular, diferenciação
e crescimento (Snider e Johnson, 1989; Chu e Wu, 2009). Proporcionar substâncias
neurotróficas aos pacientes com lesão de raízes nervosas pode ser uma opção para
resgatar neurônios da medula espinal, antes que a conectividade com a periferia seja
estabelecida. Fatores tróficos que podem melhorar o brotamento em motoneurônios
aumentam a probabilidade de um axônio se associar com células de Schwann na periferia.
Idealmente, os fatores que proporcionam efeitos quimiotáticos ou neurotróficos para os
axônios podem orientá-los em direção ao alvo (Chu e Wu, 2009). Adicionalmente, Vejsada
et al. (1995) demonstraram que, caso a conexão entre o corpo celular e o alvo não seja
restabelecida no animal adulto, os fatores neurotróficos não são capazes de manter a
sobrevivência de motoneurônios lesados por longos períodos.
1.4 - SELANTES DE FIBRINA
Os selantes de fibrina comerciais são produtos originários de proteínas do plasma
humano, formados por dois componentes principais: fibrinogênio e trombina, que, uma vez
combinados, formam uma matriz de fibrina bioativa com propriedades hemostática e de
adesão, mimetizando a via final da cascata de coagulação (Busuttil, 2003). Nesses
produtos, o fibrinogênio é clivado e convertido em polímeros de fibrina pela ação da
trombina. Alguns selantes são complementados com o fator XIII, o que pode aumentar a
resistência à tração, a estabilidade do coágulo e melhorar a hemostasia. O Fator XIII,
quando ativado pela trombina na presença de íons de cálcio, reage com os polímeros de
fibrina resultando um coágulo insolúvel. (Alving et al., 1995; Martinowitz e Spotnitz, 1997;
Radosevich et al., 1997). Este componente desempenha um papel bem estabelecido na
coagulação natural e estabilização do coágulo, sendo a enzima final ativada na cascata de
31
coagulação do sangue, facilitando assim, a formação de ligações cruzadas covalentes
dentro da rede de fibrina. Forma-se então uma malha, após a ativação pela trombina,
melhorando seu desempenho no uso clínico (Phillips et al., 2003). Alguns selantes
apresentam também inibidores da fibrinólise (aprotinina), os quais estão relacionadas com
a manutenção prolongada do coágulo no sítio (Tock et al., 1998; Albala et al., 2003).
Geralmente, a trombina utilizada na produção dos selantes de fibrina é de origem bovina
(Spotnitz, 2001) mas, atualmente, tem sido substituída pela trombina humana submetida à
inativação viral, para reduzir o risco de transmissão de doenças e ocorrência de reações
imunológicas.
Embora todos os selantes de fibrina contenham fibrinogênio e trombina,
qualitativamente e quantitativamente a exata composição varia, o que pode afetar a
velocidade da obtenção de hemostase e a formação de coágulos, alterando as
propriedades do coágulo de fibrina resultante, o que pode influenciar na sua utilização em
diversos procedimentos cirúrgicos (Albala, 2003). Selantes de fibrina com altas
concentrações de fibrinogênio tendem a produzir coágulos mais fortes e promovem, de
forma mais rápida, a formação de coágulos de trombina (Albala, 2003). Propriedades que
variam entre os diferentes selantes de fibrina, tais como a taxa de coagulação, a
viscosidade, a adesividade, a resistência do coágulo e a resistência à proteólise, são
importantes considerações para diferentes aplicações (Wozniak, 2003).
Atualmente, os selantes de fibrina são utilizados em uma vasta gama de
intervenções cirúrgicas, principalmente como agentes hemostáticos, indutores de processo
de cicatrização, selador de cavidades, estimulador do processo de reparação tecidual, além
de veículo de liberação lenta de drogas ou agentes de crescimento em sítios cirúrgicos.
Esses selantes têm sido utilizados em diferentes estudos experimentais para avaliação de
sua influência na reparação tecidual (Stechison, 1992; Toma et al., 1992; Tawes et al., 1994;
Sirieix et al., 1998; Jackson, 2001; Alabama, 2003; Chan e Boisjoly, 2004; Prabhu e
Spotnitz, 2005). Os selantes são utilizados em suas fórmulas originais ou como veículos de
introdução de outros elementos que possam interferir no processo cicatricial. Além disso,
há também resultados promissores para o remodelamento ósseo e cartilagíneo,
associando-se a cola de fibrina à condrócitos (Homminga et al., 1998 e Gille et al., 2005),
lascas ósseas (Sawamura et al., 1999) e células tronco (Baumgartiner et al., 2009 e Kang
et al., 2009).
32
Entre os diversos procedimentos cirúrgicos que os selantes de fibrina têm sido
utilizados destacam-se: cirurgia cardiovascular (Kim, 1988), cirurgia torácica, (Mouritzen,
1993) cirurgias vasculares (Kim, 1988), cirurgia abdominal (Athanasiadis, 1984) e
neurocirurgia (Gnjidic, 1994; Van Velthoven, 1991; Lee, 1991). Nesta última, a cola de
fibrina vem sendo utilizada há mais de 20 anos e não induz danos ao sistema nervoso (de
Vries, et al., 2002). O selante de fibrina tem boa tolerância e poucas reações adversas têm
sido relatadas (Alving et al., 1995; Dunn e Goa, 1999). Portanto, os selantes podem reduzir
complicações em cirurgias, como hemorragias e deiscência, reduzir os tempos de operação
e reduzir a necessidade de operações adicionais resultantes de pós-operatório, como
complicações hemorrágicas.
Interessantemente, o veneno de serpentes Crotalus durissus terrificus contém
uma fração trombina-like ou trombina-símile demonstrada por Nahas et al. (1964) e isolada
por Raw et al. (1986). A fração trombina-símile possui a habilidade de transformar o
fibrinogênio diretamente em fibrina, produzindo afibrinogenemia em pacientes picados por
estas serpentes, aumentando o tempo de coagulação sanguínea. Assim, envenenamentos
causados por serpentes deste gênero podem causar grandes desordens na coagulação
sanguínea. (Thomazini, et al., 1991; Pereira, et al., 1995). Nesse âmbito, pesquisadores do
CEVAP- Unesp/Botucatu, produziram um selante de fibrina derivado do veneno da
cascavel.
A possibilidade de se produzir uma cola de fibrina, cujo fator polimerizador é
derivado do veneno de serpente, abre uma importante opção para utilização clínica, no
reparo de nervos periféricos e de lesões medulares. Têm-se como vantagens à cola
disponível no mercado, a possibilidade de formulação personalizada à necessidade da
cirurgia, levando-se em conta o tempo de coagulação necessário, bem como se pode
controlar o tempo de degradação do selante. Adicionalmente, seu custo de produção é mais
baixo, visto que a tecnologia é totalmente nacional. A possibilidade de obtenção de
formulações com variadas características também abre a possibilidade da associação do
selante de fibrina nacional com diferentes células potencialmente benéficas para o processo
regenerativo do sistema nervoso.
Apesar da cirurgia de reimplantação das raízes avulsionadas serem realizadas,
mesmo que de forma limitada na prática médica, ainda há a necessidade de
aperfeiçoamento cirúrgico, do desenvolvimento de estratégias que resultem em diminuição
33
de morte neuronal pós-lesão e direcionamento dos neuritos para repovoar as raízes
reimplantadas (Cullheim et al., 1999).
Nesse contexto, o presente estudo propõe o implante, com selantes de fibrina, para
o tratamento da avulsão de raízes ventrais, em busca de uma possível alternativa para
resgatar os motoneurônios lesados, com vistas à recuperação da função motora e o retorno
funcional.
34
2. Justificativa
35
Um dos grandes desafios da medicina e da neurologia atualmente tem sido vencer
a falta de regeneração espontânea do Sistema Nervoso Central (SNC) após a perda de
células nervosas e/ou a interrupção de seus prolongamentos. Sendo assim, a
impossibilidade de reparo eficiente de lesões no SNC é um importante problema médico e
motivo de preocupação no que se refere à recuperação morfológica e funcional. Embora
possa haver recuperação parcial das manifestações comportamentais, as melhoras
funcionais observadas após as lesões, são decorrentes de fenômenos de plasticidade
sináptica e não de reparo estrutural. Além disso, essa recuperação geralmente se mostra
incompleta e imperfeita. Esse fato tem contribuído e motivado um grande número de
investigações científicas sobre as inúmeras variáveis envolvidas no processo de
regeneração nervosa. Nesse âmbito, modelos experimentais de lesões têm sido estudados a fim de
melhor compreender os mecanismos envolvidos na sobrevivência neuronal e na
plasticidade sináptica. A utilização de modelos bem estabelecidos permite testar o potencial
de diferentes tratamentos a fim de prevenir as alterações induzidas por tais lesões. Neste
contexto, a avulsão de raízes motoras tem se mostrado um modelo experimental
reprodutível de degeneração de neurônios motores em ratos, em que se observa a morte
de cerca de 80% dos motoneurônios duas semanas após a lesão (Koliatsos et al., 1994; Li
et al., 1998). Por outro lado, os motoneurônios que sobrevivem à avulsão têm potencial
regenerativo após o reimplante das raízes, direcionando os neuritos para seu alvo correto
(Cullheim, 1999), no qual ocorre reinervação parcial.
A grande maioria dos esforços atuais, tanto científicos quanto clínicos, têm se
concentrado no desenvolvimento e na aplicação de estratégias visando à amenização das
consequências do dano ao SNC e a ampliação do potencial regenerativo dos neurônios
lesados. Nesse aspecto, o reimplante das raízes avulsionadas com o selante de fibrina tem
sido proposto e avaliado.
A utilização do selante de fibrina comercial na prática clínica já é conhecida e
bastante discutida. Por outro lado, o selante de fibrina, derivado de veneno de serpente e
fibrinogênio animal, tem se tornado uma ferramenta útil na prática médica devido a seu
rápido, fácil e barato processo de produção. Tendo-se em vista que a tecnologia empregada
na produção do referido selante é totalmente nacional e que a sua formulação pode ser
adequada às necessidades cirúrgicas específicas da avulsão, acreditamos que haverá
maior preservação do microambiente medular. Por ser um produto biológico bioativo, não
36
causa reações adversas nos pacientes, não usa sangue humano em sua constituição, não
transmite doenças infecciosas, não representa riscos toxicológicos para utilização interna,
reduz o tempo cirúrgico e melhora o pós-operatório, é altamente adesivo e pode ser
utilizado como adjuvante em procedimentos de sutura convencional e liberação de
fármacos (Barros et al., 2009).
Acreditamos que os presentes resultados servirão de base para o uso dos selantes
de fibrina na aceleração da reparação nervosa em geral, indicando a viabilidade de futuro
emprego clínico desta abordagem terapêutica, preenchendo uma importante lacuna nos
procedimentos reparativos, após este tipo de lesão.
37
3. Objetivos
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3.1 - OBJETIVOS GERAIS
Investigar a eficácia do selante de fibrina derivado do veneno de serpente Crotalus
durissus terrificus, em comparação com o selante comercial, para o reimplante das raízes
motoras avulsionadas em ratos LEW/HsdUnib.
3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar a sobrevivência neuronal nos períodos agudo e crônico, após avulsão e reimplante
das raízes com os selantes comercial e o produzido pelo CEVAP;
- Avaliar o número e parâmetros morfométricos referentes as fibras mielinicas em
regeneração do nervo isquiático de ratos, após avulsão de raízes motoras e seu reimplante.
- Avaliar, por imunoistoquímica, a integridade dos circuitos sinápticos, reatividade astroglial
e reatividade microglial, além da expressão de proteínas relacionadas ao processo
regenerativo axonal: neurofilamentos (presentes no citoesqueleto dos axônios), p75NTR
(pan receptor para neurotrofinas) e S100 (marcador de células de Schwann), nos animais
submetidos à avulsão e reimplante;
- Analisar a recuperação funcional dos animais avulsionados e reimplantados, através do
walking track test (Catwalk), até 12 semanas pós-cirúrgicas.
39
4. Material e Métodos
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4.1 - GRUPOS EXPERIMENTAIS
Para este estudo foram utilizadas fêmeas adultas de ratos LEW/HsdUnib com dez
semanas de idade e peso corporal de aproximadamente 200g, obtidos do Centro
Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de
Campinas. Os experimentos foram conduzidos seguindo-se as normas de ética na
experimentação animal e foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais
(CEUA-Unicamp – protocolo 3064-1). Todos os animais tiveram suas raízes nervosas
ventrais (L4, L5 e L6), na região da intumescência lombar do lado direito, avulsionadas
(n=5, por grupo experimental) e analisados com 4 e 12 semanas após a cirurgia. O lado
não avulsionado de cada animal foi utilizado como controle interno para análise dos
resultados. Foram utilizados os seguintes grupos experimentais:
1. Avulsão de raízes ventrais, sem reimplante;
2. Avulsão e reimplante de raízes ventrais com selante de fibrina derivado do veneno de
Crotalus durissus terrificus, na superfície da medula espinal;
3. Avulsão e reimplante de raízes ventrais com selante de fibrina comercial na superfície da
medula espinal.
As técnicas utilizadas nesse trabalho, bem como os grupos experimentais e tempos
de sobrevida após a lesão são indicado na tabela 1.
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Tabela 1: Grupos experimentais e tempos de sobrevida após a avulsão das raízes ventrais
e técnicas utilizadas em cada grupo, bem como o objetivo de estudo de cada uma delas.
Grupos
experimentais
Sobrevida
após a lesão Técnica utilizada Objetivo de estudo
Avulsão
Avulsão +
Reimplante (CEVAP)
Avulsão +
Reimplante
(Comercial)
4 semanas
Imunoistoquimica - Sinaptofisina;
GFAP e Iba-1; Neurofilamento, S100
e p75NTR
Integridade dos circuitos sinápticos;
reatividade glial; expressão de
proteínas relacionadas ao processo
regenerativo axonal
Coloração de Nissl Sobrevivência Neuronal
Contagem e morfometria de fibras
mielínicas do nervo isquiático por
microscopia de luz
Regeneração nervosa
12 semanas
Coloração de Nissl Sobrevivência Neuronal
Contagem e morfometria de fibras
mielínicas do nervo isquiático por
microscopia de luz
Regeneração nervosa
Walking Track Test (Catwalk)* Recuperação funcional após a lesão
* A técnica em questão se extendeu por 12 semanas, até o sacrifício dos animais, para avaliar a recuperação funcional após
lesão.
4.2 - OBTENÇÃO DO SELANTE DE FIBRINA DERIVADO DO VENENO DE CROTALUS
DURISSUS TERRIFICUS
O selante de fibrina derivado de veneno de serpente foi gentilmente cedido pelo
Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos da UNESP (CEVAP), cujos
componentes e fórmula de aplicação constam das suas patentes (Números do registro:
BR1020140114327 e BR1020140114360). No momento do uso os componentes foram
previamente descongelados, reconstituídos, misturados e aplicados de acordo com o
protocolo do presente projeto (Thomazini-Santos et al., 2001; Barros et al., 2010 e 2011;
Gasparotto et al. 2014; Ferreira Junior 2014).
42
4.3 – OBTENÇÃO DO SELANTE DE FIBRINA COMERCIAL
O selante de fibrina comercial utilizado foi o Tissucol, produzido pela Baxter AG
(Viena – Áustria), seguindo-se a orientação de uso conforme bula.
4.4 - AVULSÃO DAS RAÍZES MOTORAS
Os animais de todos os grupos experimentais foram anestesiados com uma
combinação de xilazina (Kensol, 10mg/Kg, Koning, Argentina) e quetamina (Vetaset,
50mg/Kg, Fort Dodge, USA), na proporção 1:1, aplicada por via intraperitoneal na dose de
0,10 ml/100g de peso corporal e tricotomizados na região média do dorso. Uma incisão
paramediana à coluna vertebral foi realizada na região torácica. A musculatura eretora da
coluna vertebral foi afastada para exposição das últimas vértebras torácicas e primeiras
lombares. Foi feita a laminectomia de aproximadamente três vértebras para que a
intumescência lombar fosse exposta. A dura-máter foi aberta através de incisão longitudinal
e, após dissecção do ligamento denticulado, a medula espinal foi cuidadosamente
movimentada até que as raízes ventrais associadas à intumescência lombar fossem
identificadas e avulsionadas. A avulsão foi realizada nas raízes lombares ventrais
referentes aos segmentos espinais L4, L5 e L6 do lado direito, com o auxílio de uma pinça
tipo relojoeiro (№4). Após os procedimentos cirúrgicos, a medula espinal foi recolocada na
posição original e a musculatura, a fáscia e a pele foram suturadas em camadas. Os
animais foram mantidos em biotério por um período de 4 a 12 semanas, dependendo do
experimento.
4.5 - REIMPLANTE DAS RAÍZES MOTORAS
Os animais dos grupos experimentais II e III, tiveram as raízes ventrais
reimplantadas na medula espinal nos seus respectivos sítios de avulsão com a utilização
de um dos selantes de fibrina (Figura 5).
43
BA
Figura 5. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal em
microscópio de luz (contraste de fase em campo claro), evidenciando as raízes ventrais. A)
– Raiz ventral do lado contralateral a lesão, B) – Raiz ventral reimplantada - lado ipsilateral.
Observar as diferenças morfológicas da raiz reimplantada em comparação a raiz intacta
contralateral.
4.6 - AVALIAÇÃO MOTORA DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL
Foram realizadas avaliações motoras, duas vezes por semana, em todos os animais
dos grupos experimentais, antes da avulsão, até a 12° semana pós avulsão, através do
“walking track test” (CatWalk) (Figura 6). Os animais foram colocados para andar ao longo
de uma passarela com um assoalho de vidro (100 cm comprimento x 15 cm largura x 0.6
cm espessura) localizado em uma sala escura, com uma luz vermelha ambiente.
Uma luz fluorescente verde entra na borda longa do assoalho e é totalmente refletida
internamente. A luz realça apenas as áreas nas quais as patas dos animais entram em
contato com a placa de vidro. Devido à tecnologia de pegadas iluminadas, as patas são
capturadas por uma câmera de vídeo de alta velocidade (Fujinon DF6HA-1B) que está
posicionada embaixo da passarela. A câmera de vídeo transforma cada cena em uma
imagem digital. As imagens digitais são transferidas para o computador através de uma
conexão Ethernet. O brilho de um pixel depende da quantidade de luz recebida de tal área
pela câmera. Assim, a tecnologia de pegadas iluminadas permite que sejam detectadas até
mesmo diferenças de pressão, como resultado de como o animal distribui o seu peso
corporal nas quatro patas. Esta câmera digital possui uma taxa de amostragem de 100
quadros por segundo. Já a combinação da luz verde na placa de vidro e a luz vermelha no
44
teto iluminado torna o contorno do corpo do animal visível quando ele atravessa a placa de
vidro.
As capturas fornecidas pela câmera foram digitalizadas pelo PCImage-SG quadro à
quadro (Matrix vision GmH, Oppenheimer, Alemanha). O programa CatWalk adquiriu,
armazenou e analisou os vídeos dos animais caminhando pelo corredor. As medições
foram feitas de acordo com diferentes parâmetros:
1- Áreas compreendidas pela pegadas e tempo desprendido pelas pegadas.
2- Índice de recuperação motora (Índice funcional do nervo fíbular). As medições foram
feitas de acordo com os seguintes parâmetros: a distância entre o primeiro e o quinto
dedo (toe spread, TS), a distância entre o terceiro dedo e o calcanhar (print length,
PL). Estes parâmetros foram utilizados para a medição das pegadas das patas
posterior direita (lesada) e posterior esquerda (normal) e os valores foram plotados
na seguinte fórmula descrita por Bain et al. (1982): (E= lado lesionado, N=lado
normal). Onde PFI = Índice funcional do nervo fíbular.
45
Figura 6. Sistema ''CatWalk'’ (Walking Track Test). (A) - Imagem do equipamento com a
câmera de alta resolução em destaque no interior do círculo. (B) - Plataforma onde os ratos
realizaram as caminhadas. (D) e (E) - Sistema em funcionamento. Destaque para as
impressões plantares. (F) e (G) - Tela do software enquanto o teste está ocorrendo.
Destaque para os gráficos 3D e os resultados estatísticos fornecidos pelo sistema ao final
do teste. Fonte: http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/catwalk
46
4.7 - SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS
Após os períodos de sobrevida pré-determinados, os animais foram sacrificados.
Todos foram anestesiados com uma combinação de xilazina (Kensol, 10mg/Kg, Koning,
Argentina) e quetamina (Vetaset, 50mg/Kg, Fort Dodge, USA), na proporção 1:1, aplicada
por via intraperitoneal na dose de 0,10 ml/100g de peso corporal. Em seguida foram
submetidos à toracotomia. O sistema vascular foi perfundido transcardiacamente com
tampão fosfato de sódio (Salina; pH 7,38) seguido de solução fixadora, a qual dependeu da
técnica de avaliação dos resultados. Assim, os espécimes destinados à quantificação e
morfometria das fibras mielínicas, presentes no nervo isquiático, foram fixados com
glutaraldeído (2%) e paraformaldeído (1%) em tampão fosfato de sódio, pH 7,38 (Fixador
Karnovsky). Já os espécimes destinados à quantificação de motoneurônios sobreviventes,
bem como imunoistoquimica, foram fixados com formaldeído 10% em tampão fosfato de
sódio, pH 7,38 (Fxador Formalina).
4.8 - ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA DO NERVO ISQUIÁTICO
Após a perfusão (Salina + Karnovsky), os nervos isquiáticos direito e esquerdo dos
animais de todos os grupos foram expostos e dissecados. O terço médio do nervo, na região
posterior da coxa, foi retirado e mantido na mesma solução fixadora por 24 horas a 4ºC. Os
fragmentos foram, então, lavados em salina tamponada e pós fixados por um período de 3
horas em solução de tetróxido de ósmio a 1%, diluído em tampão fosfato de sódio, pH 7,38.
Seguindo-se à pós-fixação, os fragmentos foram lavados em água destilada e desidratados
em série crescente de álcool e acetona, sendo incluídos em resina (Durcupan, Fluka). Os
blocos foram desbastados e secções semifinas (0,5μm) foram obtidas e analisadas após
coloração com Sudan black em microscopia de luz. Cada secção (n=5 por grupo) foi
digitalizada em microscópio óptico (NIKON DXM 1200i), sendo escolhida a objetiva de 10x
para a observação da totalidade do nervo (determinação da área do nervo). Em seguida,
imagens sequenciais foram digitalizadas na objetiva de 100x, em um total de 12 a 18 fotos
por nervo de cada animal, de modo que fosse atingida uma área superior à 30% da
totalidade do nervo. As análises quantitativas foram realizadas em um sistema analisador
de imagens, com o software Adobe Photoshop CS5 (Figura 7), sendo que o número total
de axônios em cada nervo foi calculado a partir da somatória do número de axônios obtidos
47
no total de campos descritos acima. Para isso, foi estabelecida uma proporção entre este
valor e a área total do nervo, obtida em objetiva de 10x.
Figura 7. Fotomicrografia de corte transversal do nervo isquiático. Em (A), após a
montagem das micrografias em aumento de 100X, foi realizada a medida da área do nervo.
Em (B), utilizou-se aumento de 1000X para realizar a quantificação das fibras.
Para análise morfométrica, dois campos amostrados em cada nervo (objetiva de
100x) foram empregados para obtenção das medidas da morfometria, que foi realizada
48
utilizando-se o programa Adobe Photoshop CS5. As imagens foram transformadas em
preto e branco e então foi aplicado aplicada a ferramenta “limiar”. O background que não
seria medido, bem como as fibras que não apareciam inteiras na figura foram apagadas
(Figura 8). Todos os axônios foram selecionados de uma só vez através da ferramenta de
seleção apropriada e as medidas foram feitas automaticamente pelo programa, após
calibração do mesmo. As medidas que o programa forneceu foram: área da bainha de
mielina, perímetro da fibra e largura e altura da fibra. O menor diâmetro (altura) medido de
cada fibra foi utilizado para a determinação do diâmetro da fibra, uma vez que valores
maiores poderiam refletir ser distorcidos pela inclinação do corte. O diâmetro do axônio
(DA) foi calculado a partir da área da bainha de mielina. A diferença entre o DF e o DA
dividido por 2 foi empregada para obtenção da espessura da bainha de mielina (EBM) e a
razão entre DA e DF, foi usada para calcular a razão "g" (RZG) (RZG = DA/DF).
Figura 8. Imagem do nervo isquiático previamente editada (transformada em preto e
branco), em objetiva de 100x. Observar a ferramenta limiar usada (círculo à esquerda), bem
como os parâmetros morfométricos obtidos pelo programa referente ao axônio selecionado
(seta central): Perímetro da figura (Perímetro); Área correspondente à bainha de mielina
(Área); e Diametro mínimo da fibra mielínica (Height). O background e fibras que não
apareciam inteiras na imagem original foram apagadas.
49
4.9 – IMUNOISTOQUÍMICA
Após a perfusão (Salina + Formalina), a intumescência lombar, conjuntamente com
as raízes reimplantadas (quando houve reimplante), bem como os nervos isquiáticos ipsi e
contralaterais à lesão, foram expostos, dissecados e pós-fixados por 12 horas à 4ºC, na
mesma solução fixadora. Em seguida, foram incluídos em Tissue-Tek (Miles Inc., USA) e
congelados à temperatura de -33°a -40°C. Secções transversais da medula espinhal e
raízes, bem como cortes longitudinais dos nervos, com 12μm de espessura, foram obtidos
em criostato (Micron HM25) e posteriormente armazenados a –20ºC até o momento da
utilização.
Para a realização da imunohistoquímica, as lâminas foram inicialmente
climatizadas, lavadas com PB 0,1M (tampão fosfato) (3 lavagens de 5 minutos) e
posteriormente tratadas com BSA (albumina de soro bovino) 3% no mesmo tampão por 45
minutos. Em seguida, as lâminas foram incubadas por 4 horas, com os anticorpos (anti-
sinaptofisina, anti-GFAP, anti-Iba1, anti-neurofilamento, anti-p75NTR e anti-s100), todos
em BSA 1% e Triton 0,2% diluídos em PB 0,1M, e mantidas em câmara úmida à
temperatura ambiente. Após lavagens com PB 0,1M (3 x 5 minutos), foram adicionados os
anticorpos CY3 (Jackson Lab., USA), de acordo com a espécie onde foi produzido o
anticorpo primário, na proporção de 1:250, diluído em BSA 1% e Triton 0,2% em PB 0,1M
por 45 minutos em câmara úmida à temperatura ambiente. As lâminas foram novamente
lavadas em PB 0,1M, montadas em glicerol/PB 0,1 M (3:1) sendo posteriormente
analisadas.
50
Tabela 2: Anticorpos primários usados no ensaio de imunoistoquímica. Cada anticorpo é
seguido pelo fornecedor, animal hospedeiro, código do produto e concentração utilizada.
Anticorpo Fornecedor Hospedeiro Código do produto Concentração
Sinaptofisina Millipore Camundongo MAB5258 1/1500
GFAP Abcam Coelho AB779 1/250
Iba-1 Wako Coelho 019-19741 1/2000
Neurofilamento Millipore Coelho Ab1989 1/2000
S-100 Dako Coelho Z0311 1/2000
p75NTR Santa Cruz Cabra Sc6188 1/200
CY3 (Anti-Camundongo)
– secundário. Jackson Burro 715-165-150 1/250
CY3 (Anti-Coelho) –
secundário. Jackson Burro 711-165-152 1/250
CY3 (Anti-Cabra) –
secundário. Jackson Burro 705-165-003 1/250
As lâminas imunomarcadas foram observadas em microscópio de fluorescência
(Nikon, eclipse TS 100) utilizando-se os filtros de rodamina (CY3). Foi capturada uma
imagem representativa de cada lado (ipsi e contralateral) por corte (total de 3 cortes por
animal experimental, obtidos ao longo dos segmentos lesados) da coluna ventral da medula
espinal e do nervo isquiático, utilizando-se uma câmera de alta sensibilidade (Nikon, DXM
1200F).
Para a quantificação, a densidade integrada de pixels, que representa a intensidade
da imunomarcação das proteínas, foi medida utilizando-se o software IMAGEJ (versão
1.33u, National Institutes of Health, USA). A proporção de densidade integrada de pixels foi
51
calculada para cada animal e então estabelecida à média das proporções para cada grupo
± erro padrão.
4.10 - SOBREVIVÊNCIA NEURONAL
Para contagem de motoneurônios foram utilizadas as secções transversais da
intumescência lombar coradas com cresil violeta (coloração de Nissl). Os motoneurônios
presentes no núcleo motor lateral do corno anterior no lado ipsilateral (lesado) e
contralateral (não lesado) foram contados em cortes alternados de cada espécime em
aproximadamente 20 secções, na área lesada da intumescência lombar, sendo o intervalo
entre elas de 240μm. Apenas as células com núcleo visível foram contadas.
Para corrigir eventuais contagens duplas de neurônios, devido ao fato da mesma
célula poder estar presente em duas secções, foi utilizada a fórmula de Abercrombie e
Johnson (1946): N=nt/(t+d). Onde N é o número corrigido de neurônios contados, n é o
número de células contadas, t é a espessura das secções (48μm) e d é o diâmetro médio
do neurônio. Como a diferença no tamanho afeta significativamente o número de células, o
valor de d foi calculado especificamente para cada grupo experimental (ipsilateral e
contralateral). Neste sentido, o diâmetro de motoneurônios para cada grupo foi mensurado
(Image Tool software, versão 3.00) e a média calculada.
4.11 - ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS
A partir dos resultados numéricos resultantes de todas as análises, foram calculados
a média, o desvio padrão e o erro padrão para cada grupo. Os dados de sobrevivência
neuronal, imunoistoquimica e quantificação de fibras mielínicas foram avaliados pelo
método de análise da variância – ANOVA de uma via. Enquanto os dados da análise
funcional (walking track test) foram avaliados pelo método da análise da variância – ANOVA
de duas vias. Nos dois casos foi realizado o pós-teste Bonferroni. Assumiu-se um nível de
significância igual a *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001.
52
5. Resultados
53
5.1 - EFEITO NEUROPROTETOR DOS SELANTES DE FIBRINA - SOBREVIVÊNCIA
NEURONAL
O efeito neuroprotetor da técnica de reimplante de raízes avulsionadas foi analisado
determinando-se a porcentagem de sobrevivência neuronal, sendo esta a taxa percentual
entre o número de motoneurônios presentes no núcleo motor lateral do corno anterior no
lado ipsilateral (lesado) e contralateral (não lesado), utilizando-se a fórmula descrita por
Abercrombie e Johnson (1946), afim de corrigir eventuais contagens duplas de neurônios.
Nas figuras 9 e 10, é possível observar qualitativamente os motoneurônios do grupo
dorsolateral da medula espinal (A-D), em animais que sofreram avulsão; com 4 e 12
semanas pós lesão, respectivamente. Em (E) está representada quantitativamente a razão
ipsi e contralateral de todos os grupos experimentais.
Após 4 semanas (Figura 9), foi possível observar efeito neuroprotetor nos animais
avulsionados dos grupos onde houve reimplante, refletindo significativamente numa menor
perda neuronal em relação ao grupo onde houve somente a avulsão das raízes, apesar de
existir degeneração neuronal decorrente da lesão. Calculou-se então a razão percentual,
obtendo-se os seguintes resultados: avulsão (36,43% ± 1,82%; média±EP), implante com
selante fabricado pelo CEVAP (69,02% ± 4,77%; média±EP) e implante com selante
comercial (68,17% ± 6,37%; média±EP). Dados apresentados como média
(ipsilateral/contralateral) da porcentagem de sobrevivência neuronal e erro padrão.
Esse padrão neuroprotetor se manteve após 12 semanas da lesão (Figura 10),
onde a sobrevivência neuronal dos grupos com reimplante foi estatisticamente maior
quando comparados ao grupo somente avulsão. Calculou-se então a razão percentual,
obtendo-se os seguintes resultados: avulsão (29,69% ± 2,91%; média±EP), implante com
selante fabricado pelo CEVAP (61,74% ± 4,67%; média±EP) e implante com selante
comercial (54,06% ± 5,72%; média±EP). Dados apresentados como média
(ipsilateral/contralateral) da porcentagem de sobrevivência neuronal e erro padrão.
54
55
Figura 9. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal coradas com
cresil violeta (Coloração de Nissl), representando a sobrevivência neuronal, 4 semanas
após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo
avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) -
Lado ipsilateral do grupo implante com selante comercial, (E) – Gráfico da razão percentual
ipsi e contralateral da sobrevivência dos motoneurônios medulares após a avulsão. Nota-
se uma maior sobrevivência neuronal após a avulsão das raízes nervosas nos grupos onde
houve o reimplante, não havendo diferença entre os tratamentos (** = p<0,01; n=5 para
cada grupo).
56
57
Figura 10. Fotomicrografias obtidas na região dorsolateral da medula espinal coradas com
cresil violeta (Coloração de Nissl), representando a sobrevivência neuronal, 12 semanas
após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo
avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) -
Lado ipsilateral do grupo implante com selante comercial, (E) – Gráfico da razão percentual
ipsi e contralateral da sobrevivência dos motoneurônios medulares após a avulsão. Nota-
se uma maior sobrevivência neuronal após a avulsão das raízes nervosas nos grupos onde
houve o reimplante, não havendo diferença entre os tratamentos (** = p<0,01; n=5 para
cada grupo).
5.2 - ANÁLISE HISTOMORFOMÉTRICA DO NERVO ISQUIÁTICO - REGENERAÇÃO
AXONAL
5.2.1 – CONTAGEM DO NÚMERO DE AXÔNIOS MIELÍNICOS
Imagens de microscopia de luz de cortes transversais de nervos isquiáticos corados
com Sudan black, dos diferentes grupos experimentais, 4 e 12 semanas após a lesão, estão
representadas nas Figuras 11 e 12, respectivamente. A quantificação do número de
axônios mielínicos está representada pelos gráficos respectivos (Figura 11F e 12F).
Após 4 semanas (Figura 11), foi possível observar que o número de axônios
mielínicos foi significativamente menor nos grupos onde houve a lesão, quando comparado
ao grupo controle, não havendo diferença significativa entre os tratamentos e o grupo
somente avulsão (contralateral – 9232 ± 204; média±EP; implante com selante fabricado
pelo CEVAP - 6765 ± 365; média±EP; implante com selante comercial - 7238 ± 274;
média±EP; avulsão - 6238 ± 166; média±EP). Dados apresentados como média do número
de fibras mielínicas e erro padrão.
Entretanto, após 12 semanas (Figura 12), foi possível observar que o número de
axônios mielínicos foi significativamente maior nos grupos onde houve o reimplante, quando
comparado ao grupo somente avulsão, evidenciando uma intensa regeneração axonal, não
havendo diferença significativa entre os tratamentos (contralateral – 7746 ± 357; média±EP;
implante com selante fabricado pelo CEVAP - 7625 ± 244; média±EP; implante com selante
comercial - 7570 ± 142; média±EP; avulsão – 5573 ± 355; média±EP). Dados apresentados
como média do número de fibras mielínicas e erro padrão.
58
Figura 11. Fotomicrografias de cortes transversais do nervo isquiático representativas dos
diferentes grupos experimentais, corados com Sudan Black, 4 semanas após a lesão. (A) -
Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado
ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do
59
grupo implante com selante comercial, (E) - Gráfico da quantificação do número de fibras
mielínicas (*** = p< 0,001; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 10 µm.
60
Figura 12. Fotomicrografias de cortes transversais do nervo isquiático representativas dos
diferentes grupos experimentais, corados com Sudan Black, 12 semanas após a lesão. (A)
61
- Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado
ipsilateral do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do
grupo implante com selante comercial, (E) - Gráfico da quantificação do número de fibras
mielínicas (*** = p< 0,001; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 10 µm.
No estudo morfométrico dos nervos, foram considerados os seguintes parâmetros:
Diâmetro mínimo das fibras mielínicas (DF), o qual corresponde ao axônio e a sua bainha
de mielina; Diâmetro mínimo dos axônios mielínicos (DA), correspondendo somente ao
axônio; Espessura da bainha de mielina (EBM) e Razão "G" (RZG), a qual foi obtida a partir
do quociente DA/DF.
Nota-se que no modelo de lesão utilizado nesse trabalho, somente as fibras motoras
do nervo isquiático são lesadas. No entanto, no momento de fazer as análises
morfométricas não é possível diferenciar as fibras motoras das sensitivas, o que diminui a
diferença entre os grupos uma vez que todas as fibras sensitivas estão intactas. Portanto,
a distribuição de frequência foi essencial para análise dos resultados, uma vez que as
médias poderiam mascarar os resultados.
O estudo de distribuição de frequência dos parâmetros mencionados, são descritos
nas Figuras 13-23, enquanto as médias e respectivos erros-padrão de cada grupo foram
colocadas em anexo, ao final da tese. (Tabelas 3 e 4).
5.2.2 – DIÂMETRO MÍNIMO DAS FIBRAS MIELÍNICAS (DF)
Com 4 semanas após a lesão, podemos observar que os grupos com reimplante e
o grupo somente avulsão, apresentaram histograma de distribuição de frequência do
diâmetro mínimo das fibras mielínicas, divergente em relação ao grupo controle, em
decorrência da lesão, onde notamos uma diminuição da quantidade de fibras de maior
calibre nesses grupos experimentais.
Os nervos do grupo contralateral, apresentaram fibras mielínicas com diâmetros
mínimos variando entre 1µm e 16µm, distribuídas de forma bimodal. Já o grupo somente
avulsão possui uma predominância de fibras com menores dimensões, entre 1 e 13 μm.
Quanto ao grupo reimplante com selante de fibrina do CEVAP, as fibras mielínicas
apresentaram o diâmetro variando entre 2µm e 15µm. Por fim, no grupo reimplante com
selante comercial, o DF variou entre 2µm e 14µm.
62
Figura 13. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo das
fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4 semanas
após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo
avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo CEVAP, (D)
- Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
No entanto, com 12 semanas após a lesão, podemos observar que o grupo somente
avulsão, ainda apresentou histograma de distribuição de frequência do diâmetro mínimo
das fibras mielínicas, distinta em relação ao grupo controle, em decorrência da lesão, onde
notamos uma predominância de fibras de menor calibre (provavelmente sensitivas – não
afetadas pela lesão) nesse grupo experimental.
Os nervos do grupo contralateral, apresentaram fibras mielínicas com diâmetros
mínimos variando entre 2µm e 16µm, distribuídas de forma bimodal. Quanto ao grupo
reimplante com selante de fibrina do CEVAP, as fibras mielínicas apresentaram o diâmetro
variando entre 2µm e 16µm. Já no grupo reimplante com selante comercial, o DF variou
entre 2µm e 14µm. Por fim, no grupo somente avulsão, as fibras mielínicas apresentaram
o diâmetro variando entre 2µm e 16µm.
63
Figura 14. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo das
fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12 semanas
após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo
avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo CEVAP, (D)
- Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
5.2.3 – DIÂMETRO MÍNIMO DOS AXÔNIOS MIELÍNICOS (DA)
Com 4 semanas após a lesão, podemos observar que o grupo somente avulsão,
bem como os grupos com reimplante, apresentaram histograma de distribuição de
frequência do diâmetro mínimo dos axônios mielínicos, divergente em relação ao grupo
controle, em decorrência da lesão. Notamos uma leve tendência com deslocamento para a
esquerda nesses histogramas, com predominância de axônios de menor calibre
(provavelmente sensitivos – não afetados pela lesão) nesses grupos experimentais.
64
Os nervos do grupo contralateral, apresentaram axônios mielínicos com diâmetros
mínimos variando entre 1µm e 14µm. Quanto ao grupo reimplante com selante de fibrina
do CEVAP, os axônios mielínicos apresentaram o diâmetro variando entre 1µm e 12µm. Já
no grupo reimplante com selante comercial, o DA variou entre 1µm e 11µm. Por fim, no
grupo somente avulsão, os axônios mielínicos apresentaram o diâmetro variando entre 1µm
e 14µm.
Figura 15. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo dos
axônios mielínicos dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4 semanas
após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo
avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo CEVAP, (D)
- Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
Entretanto, com 12 semanas após a lesão, podemos observar que o grupo somente
avulsão, bem como os grupos com reimplante, apresentaram histograma de distribuição de
65
frequência do diâmetro mínimo dos axônios mielinizados, divergente em relação ao grupo
controle, em decorrência da lesão. Notamos uma leve tendência com deslocamento para a
esquerda nesses histogramas, com predominância de axônios de menor calibre
(provavelmente sensitivos – não afetados pela lesão) nesses grupos experimentais.
Todos os grupos experimentais apresentaram axônios mielínicos com diâmetros
mínimos variando entre 1µm e 13µm.
Figura 16. Histograma de distribuição de frequência referente ao diâmetro mínimo dos
axônios mielínicos dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12 semanas
após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo
avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo CEVAP, (D)
- Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
5.2.4 – ESPESSURA DA BAINHA DE MIELINA (EBM)
Com 4 semanas após a lesão, os histogramas de distribuição de frequência da
espessura da bainha de mielina, revelaram que todos os grupos avulsionados, apresentam
66
semelhança entre si e se diferenciam do grupo controle. Esses histogramas mostram-se
desviados para a esquerda, com pico em torno de 1µm. A mudança no padrão do
histograma é bastante sugestiva, indicando perda de fibras de grande calibre, compatíveis
com axônios dos motoneurônios avulsionados.
Figura 17. Histograma de distribuição de frequência referente a espessura da bainha de
mielina das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4
semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do
grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo
CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
Interessantemente, os histogramas de distribuição de frequência da espessura da
bainha de mielina, 12 semanas após a lesão, revelaram que o grupo somente avulsão
permanece diferente do controle, tendo seu histograma desviado para a esquerda, com
pico em torno de 1µm. No entanto, os grupos com reimplante tendem a se assemelhar ao
grupo controle, principalmente o grupo reimplante com selante de fibrina produzido pelo
CEVAP.
67
Figura 18. Histograma de distribuição de frequência referente a espessura da bainha de
mielina das fibras mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo),
12 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral
do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo
CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
5.2.5 – RAZÃO “g” (RZG)
A RZG é um parâmetro morfométrico que expressa à regeneração funcional do
nervo (Smith e Koles, 1970) e corresponde ao quociente DA/DF.
Com 4 semanas após a lesão, os histogramas de distribuição de frequência da RZG,
revelaram que todos os grupos avulsionados têm seus histogramas desviados para a
direita, com pico em torno de 0,8. A mudança no padrão do histograma é bastante
sugestiva, indicando que há predominância de fibras com bainha de mielina delgada.
68
Figura 19. Histograma de distribuição de frequência referente a razão “G” das fibras
mielínicas dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 4 semanas após a
lesão. (A) - Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C)
- Lado ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado
ipsilateral do grupo reimplante com selante comercial.
Entretanto, após 12 semanas de lesão, os histogramas de distribuição de frequência
da RZG, revelaram que todos os grupos avulsionados mantiveram seu padrão. Houve
aumento das frequências de RZG maiores que 0,8 indicando eventual brotamento
compensatório de fibras, no grupo somente avulsão, e um grande número de fibras em
regeneração axonal, nos grupos com reimplante.
69
Figura 20. Histograma de distribuição de frequência referente a RZG das fibras mielínicas
dos diferentes grupos experimentais (n=5 para cada grupo), 12 semanas após a lesão. (A)
- Lado contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado
ipsilateral do grupo reimplante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do
grupo reimplante com selante comercial.
Por fim, nossos resultados mais relevantes são mostrados nos gráficos abaixo. De
modo geral, ao analisarmos a porcentagem de fibras mielínicas com bainha de mielina
superior a 2µm de espessura, bem como o conjunto das distribuições da RZG na faixa de
0,7-0,9 e compararmos com evolução da lesão (4 semanas X 12 semanas), observamos
que o grupo somente avulsão, mantém seu padrão histomorfométrico, onde há um aumento
acentuado da porcentagem de fibras mielínicas com bainha de mielina fina, em decorrência
da lesão.
Interessantemente, no grupo reimplante com selante produzido pelo CEVAP, 12
semanas após lesão, nota-se um aumento da porcentagem de fibras mielínicas com bainha
mais espessa, sugerindo uma possível regeneração axonal.
70
Figura 21. Análise da porcentagem da espessura da bainha de mielina, bem como a RZG,
nos diferentes grupos experimentais, ao longo do tempo. (A) - Porcentagem de fibras
mielínicas com bainha de mielina superior a 2µm de espessura, 4 semanas após lesão. (B)
- Porcentagem de fibras mielínicas com bainha de mielina superior a 2µm de espessura, 12
semanas após lesão. (C) - Porcentagem de fibras mielínicas na faixa de 0,7-0,9 de RZG, 4
semanas após lesão. (D) - Porcentagem de fibras mielínicas na faixa de 0,7-0,9 de RZG,
12 semanas após lesão.
5.2.6 – PARÂMETROS MORFOMÉTRICOS POR MEIO DE DOTPLOT – RZG X
DIÂMETRO MÍNIMO DO AXÔNIO
A distribuição dos valores do diâmetro mínimo dos axônios no grupo contralateral obteve
um padrão heterogêneo. Nos grupos lesionados, os axônios apresentaram diâmetros
menores e foram pouco mielinizados (observar a razão “G”). Esses dados podem ser
71
melhor visualizados nas figuras 22 e 23, na qual foi representada a razão “G” relacionada
ao diâmetro mínimo do axônio.
Figura 22. Relação da razão “G” com o diâmetro mínimo do axônio, dos diferentes grupos
experimentais (n=5 para cada grupo), 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do
grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo implante com
selante comercial.
72
Figura 23. Relação da razão “G” com o diâmetro mínimo do axônio, dos diferentes grupos
experimentais (n=5 para cada grupo), 12 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do
grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo implante com
selante comercial.
73
5.3 - REDUÇÃO DO PROCESSO DE ELIMINAÇÃO SINÁPTICA, AVALIADA ATRAVÉS
DA EXPRESSÃO DE SINAPTOFISINA
Para avaliar as alterações na atividade sináptica, após avulsão das raízes ventrais,
foi feita análise imunoistoquímica da presença da proteína sinaptofisina, no núcleo motor
lateral da coluna anterior da medula espinal, 4 semanas após a lesão.
A imunomarcação revelou maior densidade sináptica no lado contralateral dos
animais avulsionados, em relação ao ipsilateral. Destaca-se a marcação adjacente à
superfície celular dos grandes motoneurônios que compõem o núcleo motor. Observou-se
uma intensa reatividade nessa área, a qual foi atribuída ao grande número de inputs aos
motoneurônios não lesados (contralaterais) em relação aos lesados. Em contraste ao lado
contralateral, a intensidade da expressão de sinaptofisina foi drasticamente reduzida na
superfície dos motoneurônios axotomizados dos animais sem implante, indicando uma
grande diminuição do número de terminais em aposição a estes neurônios. Porém,
observou-se significativa diferença na expressão de sinaptofisina entre os lados ipsilateral
dos grupos que tiveram a raiz avulsionada reimplantada, quando comparados aos grupos
avulsão (Figura 24). Foi feita uma avaliação quantitativa, onde se calculou a razão
percentual da densidade integrada de pixels entre os lados ipsi e contralateral de cada
grupo: (implante com selante fabricado pelo CEVAP – 66,98% ± 5,81%; média±EP;
implante com selante comercial – 72,02% ± 3,81; média±EP; avulsão – 41,53% ± 3,85%;
média±EP). Dados apresentados como média da razão ipsi/contralateral da densidade
integrada de pixels (intensidade da imunomarcação) e erro padrão.
74
75
Figura 24. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lamina IX do corno ventral da
medula espinal marcada com anti-sinaptofisina, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado
contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral
do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral
da média da densidade integrada de pixels. Note-se grande redução na expressão de
sinaptofisina, resultado de pequena cobertura sináptica nestes neurônios, após a avulsão
das raízes nervosas (** = p<0.01; n=5 para cada grupo). Barra de escala = 50µm.
5.4 - REATIVIDADE GLIAL
Para avaliação da reativiade glial após 4 semanas do reimplante, foram utilizados
anticorpos anti-GFAP, para análise da astrogliose reativa (Figura 25), bem como anti-Iba-
1, para análise da reatividade microglial (Figura 26). A imunomarcação revelou reatividade
basal para o lado contralateral de todos os grupos.
A marcação com GFAP demonstrou aumento significativo na atividade dos
astrócitos após a lesão, visto pela presença de astrogliose reativa e pelo incremento de
GFAP concentrada, particularmente, ao redor dos neurônios avulsionados (Figura 25). Foi
feita uma avaliação quantitativa, onde se calculou a razão percentual da densidade
integrada de pixels entre os lados ipsi e contralateral de cada grupo: (implante com selante
fabricado pelo CEVAP – 185,4% ± 31,27%; média±EP; implante com selante comercial –
199,7% ± 23,47%; média±EP; avulsão – 254,0% ± 21,59%; média±EP). Dados
apresentados como média da razão ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels
(intensidade da imunomarcação) e erro padrão. A análise estatística não revelou diferenças
entre os grupos experimentais.
76
77
Figura 25. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lamina IX do corno ventral da
medula espinal marcada com anti-GFAP, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral
do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo implante com
selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral da média da
densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, a forte presença astrogliose
reativa circunjacente aos motoneurônios, após a avulsão das raízes nervosas, não havendo
diferença entre grupos experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.
Paralelamente, a reatividade da microglia mostrou aumento da imunomarcação para
anti-Iba-1 no lado lesado, mostrando células microgliais reativas em íntimo contato com
motoneurônios avulsionados (Figura 26). Foi feita uma avaliação quantitativa, onde se
calculou a razão percentual da densidade integrada de pixels entre os lados ipsi e
contralateral de cada grupo: (implante com selante fabricado pelo CEVAP – 357,9% ±
65,0%; média±EP; implante com selante comercial – 302,9% ± 88,73%; média±EP; avulsão
– 481,7% ± 56,90%; média±EP). Dados apresentados como média da razão
ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels (intensidade da imunomarcação) e erro
padrão. A análise estatística não revelou diferenças entre os grupos experimentais.
78
79
Figura 26. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica da lamina IX do corno ventral da
medula espinal marcada com anti-Iba-1, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral
do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo implante com
selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral da média da
densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, a forte presença de microglia
reativa próxima aos motoneurônios, após a avulsão das raízes nervosas, não havendo
diferença entre grupos experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.
5.5 - EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS AO PROCESSO REGENERATIVO
AXONAL
Para avaliação da expressão de proteínas relacionadas ao processo regenerativo
axonal, após 4 semanas da lesão, foram utilizados anticorpos anti-Neurofilamento
(presentes no citoesqueleto dos axônios), anti-p75NTR (pan receptor para neurotrofinas) e
anti-S100 (marcador de células de Schwann), nos animais submetidos à avulsão e
reimplante. A imunomarcação revelou reatividade basal para o lado contralateral de todos
os grupos.
A marcação anti-neurofilamento não demonstrou diferenças significativas na
expressão de neurofilamento presente no axônio, após a lesão, entre os grupos
experimentais (Figura 27). Foi feita uma avaliação quantitativa, onde se calculou a razão
percentual da densidade integrada de pixels entre os lados ipsi e contralateral de cada
grupo: (contralateral – 5125% ± 405,1%; média±EP; implante com selante fabricado pelo
CEVAP – 4287% ± 440,0%; média±EP; implante com selante comercial – 3608% ± 86,95%;
média±EP; avulsão – 4393% ± 403,4%; média±EP). Dados apresentados como média da
razão ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels (intensidade da imunomarcação)
e erro padrão.
80
Figura 27. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica de cortes longitudinais do nervo
isquiático marcado com anti-neurofilamento, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado
contralateral do grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral
do grupo implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral
81
da média da densidade integrada de pixels. Não houve diferença entre grupos
experimentais (n=5 para cada grupo). Barra de escala = 100µm.
Por outro lado, a marcação anti-S100 revelou um aumento da atividade das células
de Schwann após a lesão, em todos os grupos experimentais (Figura 28). Foi feita uma
avaliação quantitativa, onde se calculou a razão percentual da densidade integrada de
pixels entre os lados ipsi e contralateral de cada grupo: (contralateral – 3913% ± 443,2%;
média±EP; implante com selante fabricado pelo CEVAP – 6237% ± 754,8%; média±EP;
implante com selante comercial – 4579% ± 510,4%; média±EP; avulsão – 8882% ± 1362%;
média±EP). Dados apresentados como média da razão ipsi/contralateral da densidade
integrada de pixels (intensidade da imunomarcação) e erro padrão.
82
Figura 28. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica de cortes longitudinais do nervo
isquiatico marcado com anti-S100, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do
grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo
implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo implante com
selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral da média da
densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, uma intensa marcação das
83
células de Schwann, após a avulsão das raízes nervosas (* = p<0.5; ** = p<0.01; n=5 para
cada grupo). Barra de escala = 100µm.
Por fim, a marcação anti- p75NTR, demonstrou um aumento de pan receptores para
neurotrofinas, em todos os grupos experimentais e significativamente no grupo reimplante
com selante commercial (Figura 29). Foi feita uma avaliação quantitativa, onde se calculou
a razão percentual da densidade integrada de pixels entre os lados ipsi e contralateral de
cada grupo: (contralateral – 464,5% ± 146,1%; média±EP; implante com selante fabricado
pelo CEVAP – 2286% ± 788,1%; média±EP; implante com selante comercial – 3266% ±
403,9%; média±EP; avulsão – 1509% ± 626,5%; média±EP). Dados apresentados como
média da razão ipsi/contralateral da densidade integrada de pixels (intensidade da
imunomarcação) e erro padrão.
84
Figura 29. Fotomicrografias e análise imunoistoquímica de cortes longitudinais do nervo
isquiatico marcado com anti-p75NTR, 4 semanas após a lesão. (A) - Lado contralateral do
grupo avulsão, (B) - Lado ipsilateral do grupo avulsão, (C) - Lado ipsilateral do grupo
85
implante com selante fabricado pelo CEVAP, (D) - Lado ipsilateral do grupo implante com
selante comercial, (E) – O gráfico indica a diferença da razão ipsi/contralateral da média da
densidade integrada de pixels. Note-se nos lados ipsilaterais, uma intensa marcação de
pan receptores para neurotrofinas, após a avulsão das raízes nervosas (p<0,01; n=5 para
cada grupo). Barra de escala = 100µm.
5.6 - AVALIAÇÃO MOTORA DA RECUPERAÇÃO FUNCIONAL
A avaliação motora da recuperação funcional dos grupos experimentais foi estudada
através do aparelho “walking track test” (CatWalk), até a 12° semana após a lesão.
A figura 30A demonstra os valores médios quanto ao índice funcional do fibular nos
diferentes grupos experimentais e momentos da avaliação funcional. Para calcular o índice
funcional do fibular, utilizamos dois parâmetros: a distância entre o primeiro e o quinto dedo,
bem como entre o terceiro dedo e o calcanhar. Na análise intergrupos verifica-se que, no
pré-operatório, todos os grupos apresentam função normal, porém, a partir da 1° semana
pós-operatório, esses valores diminuíram significativamente, indicando perda funcional em
ambos os grupos. No grupo no qual só ocorreu avulsão esses valores permaneceram
baixos e estáveis até a última semana de experimentação, não indicando nenhuma
melhora, quando comparado ao pré-operatório. Já no grupo onde houve o reimplante
utilizando os selantes de fibrina, os valores foram subindo gradativamente ao longo do
tempo, indicando uma melhora funcional. Após 12 semanas pós-lesão, os grupos onde
houve o reimplante, apresentaram médias significativamente mais altas (implante com
selante fabricado pelo CEVAP: -144.58 ± 24,38; média±EP e implante com selante
comercial: -134,74 ± 21,03; média±EP) quando comparado com o grupo somente avulsão
(-242,14 ± 12,42; média±EP), usando-se a fórmula descrita por Bain et al. (1989). Dados
apresentados como média (ipsilateral/contralateral) e erro padrão.
Por outro lado, também foi analisada a área compreendida pela pegadas, bem como
o tempo disposto por elas (Figuras 30B e 30C). Neste caso, foi feita a análise dos registros
das pegadas das patas normal (N) e experimental (E), observando-se também uma
evolução positiva dos grupos onde houve o reimplante quando comparado com o grupo
somente avulsão, durante os diferentes períodos de avaliação. Na comparação dos
registros das pegadas no período pré-operatório, pode-se observar que não houve
diferença significativa entre os grupos. Por outro lado, após 12 semanas, nota-se uma
86
diferença entre as pegadas neste diferente período de avaliação, mostrando significativo
grau de recuperação funcional nos grupos com reimplante. Nesse sentido, os grupos onde
as raízes foram reimplantadas mostraram suportar melhor o peso do corpo sobre a pata
lesada. Com relação a área das pegadas, obtivemos os seguintes resultados: (Somente
avulsão = 3,08 ± 2,14; média±EP; implante com selante fabricado pelo CEVAP – 30,71 ±
9,69; média±EP; implante com selante comercial - 30,62 ± 10,22; média±EP). Já em
relação ao tempo disposto ao apoio, obtivemos os seguintes resultados: (Somente avulsão
= 8,51 ± 4,56; média±EP; implante com selante fabricado pelo CEVAP – 51,32 ± 7,78;
média±EP; implante com selante comercial - 50,53 ± 9,03; média±EP). Dados
apresentados como média (ipsilateral/contralateral) e erro padrão.
Figura 30: Análise da função motora dos animais com doze semanas após a lesão.
Observar a recuperação motora dos animais que, após sofrerem avulsão das raízes
87
ventrais, tiveram o reimplante das mesmas realizado com os selantes de fibrina. A) Gráfico
construído com a razão ipsi/contralateral referente aos valores do índice funcional do fibular
aferido até 12 semanas pós-operatórias (n=7; **=p<0,01). B) Gráfico construído com a
razão ipsi/contralateral referente aos valores da área da pegada aferida até 12 semanas
pós-operatórias (n=7; *= p<0,5). C) Gráfico construído com a razão ipsi/contralateral
referente aos valores do tempo da pegada aferida até 12 semanas pós-operatórias (n=7;
**=p<0,01).
88
6. Discussão
89
6.1 - REIMPLANTE E SOBREVIVÊNCIA NEURONAL
A degeneração de motoneurônios medulares e alterações medulares podem ser
induzidas experimentalmente através da avulsão de raízes ventrais medulares (ARV), onde
ocorre uma abrupta separação dos filamentos radiculares, com a superfície da medula
espinal (Carlstedt, 2008 e 2009), levando os axônios motores, a serem axotomizados na
interface entre o SNC e SNP (Livesey e Fraher, 1992). Sabe-se que a ARV, desencadeia
morte de aproximadamente 80% dos motoneurônios durante as duas primeiras semanas
após a lesão, segundo Koliatsos et al. (1991) e Piehl et al. (1995 e 1998). Nesse aspecto,
nosso estudo permite concluir que o reimplante das raízes, utilizando os selantes de fibrina,
teve grande importância na neuroproteção.
Em nosso trabalho, após quatro semanas da lesão, obtivemos um menor índice de
morte neuronal nos grupos com reimplante, onde cerca de 70% dos motoneurônios
sobreviveram à lesão, evidenciando a significativa eficiência do reimplante no resgate
desses neurônios acometidos pela lesão. Nossos resultados mostraram que o reimplante
das raízes com os selantes de fibrina propostos, preservaram um número significativo de
motoneurônios quando comparado ao grupo somente avulsão, nos tempos de experimento
propostos (4 e 12 semanas). Ressaltamos que não houve diminuição significativa em
relação ao número de motoneurônios, quando se compara a 12ª semana com a 4ª semana,
indicando que ambos os efeitos neuroprotetores agudos se mantém ao longo do tempo,
refletindo na manutenção de elevada sobrevivência neuronal.
Interessantemente, ratos Wistar analisados 16 semanas após ARV demonstraram
sobrevivência de 27% dos motoneuronios no grupo avulsionado e de 53% no grupo que foi
realizado implante (Eggers et al., 2010). No entanto, esse autor demonstra que o implante
retarda, porém não previne completamente a neurodegeneração. Hallin e colaboradores
(1999) sugeriram que a sobrevivência de motoneurônios após reimplante ventral de C4-C5
em macacos foi devido aos fatores neurotróficos pela raiz implantada e pela persistente
abertura da barreira hemato-encefálica que permite substâncias tróficas nos motoneuronios
lesados (Risling et al., 1989; Sjögren et al., 1991; Frisén et al. 1993). Esse dado é
corroborado por Vejsada et al. (1995) que demonstraram que, caso a conexão entre o corpo
celular e o alvo não seja restabelecida em animal adulto, os fatores neurotróficos não são
capazes de manter a sobrevivência de motoneurônios lesados por longos períodos.
90
6.2 - REIMPLANTE E A PLASTICIDADE SINÁPTICA
A maioria dos motoneurônios injuriados axotomizados proximalmente reduzem o
tamanho dos ramos dendríticos (Linda et al., 1992; Chu e Wu, 2009) e conexão neurônios
vizinhos, por sinapses excitatórias (Linda et al., 2000; Chu e Wu, 2009). Essas mudanças
morfológicas deixam a célula em situação de pausa funcional, visando e reparo (Cullheim
et al., 2002; Chu e Wu, 2009).
Em nosso estudo,
A perda de inputs sinápticos no corpo neuronal acontece preferencialmente para os
inputs excitatórios, deixando as células sob influência inibitória durante o processo de
reparo. Esses eventos mostram uma mudança no metabolismo nos motoneurônios
injuriados, passando este do papel de elemento final para a atividade via motora para o
estado onde o principal objetivo é sobreviver e produzir novos axônios (Carlstedt, 2009).
Os motoneurônios que sofreram injúrias estão destinados à morte como resultado
do aumento de sensibilidade às influências excitatórias, assim, pode-se resgatar um
significativo número de motoneurônios através da redução de efeitos excitatórios (Mentis
et al., 1993; Greensmith e Vrbová, 1996). Em nosso caso, onde as fibras aferentes primárias
permanecem intactas, a recuperação de inputs inibitórios mostra-se essencial, para
minimizar os efeitos tóxicos do glutamato. Através dos resultados de sobrevivência obtidos,
somados à significativa preservação da imunomarcação anti-sinaptofisina, podemos
concluir que o reimplante com cola de fibrina é adequado para o reparo da ARV, mantendo
os circuitos medulares estabilizados e numa proporção inibição/excitação compatível com
a preservação dos neurônios em regeneração.
6.3 - REIMPLANTE E REATIVIDADE GLIAL E PROCESSO REGENERATIVO AXONAL
Na avulsão, ocorre degeneração de axônios motores, perda de sinapses,
deterioração de conexões locais segmentares, morte de células nervosas e reações em
células não neuronais, com a formação de cicatriz inibidora do crescimento axonal, a
chamada cicatriz glial (Carlstedt, 2008).
Um obstáculo provável para a regeneração advém do desenvolvimento da cicatriz
astroglial, que possui papel fundamental na falha dos axônios centrais regenerarem
91
eficientemente após a lesão. Isso difere do SNP, cujos axônios, dadas condições do
microambiente, regeneram com relativa facilidade (Kandel, 2000). No caso da avulsão de
raízes nervosas, o axônio deve regenerar inicialmente dentro do SNC, atravessando a
cicatriz glial formada na margem da medula até encontrar a saída do SNC através da raiz
ventral e então regenerar seu axônio rumo à reinervação do alvo através do SNP. Isso
contrasta com axônios periféricos que não encontram obstáculos à regeneração, desde que
a continuidade entre os cotos esteja preservada ou seja restaurada cirurgicamente
(neurorrafias associadas ou não a enxertos).
Adicionalmente, processos astrocitários no local da injúria também impedem a
regeneração (Fraher, 1998). Regeneração, sem intervenção externa, parece ocorrer em
certa medida, pelo menos em situações específicas. Um exemplo são os próprios axônios
dos motoneurônios medulares que, mesmo em pequena porcentagem conseguem
atravessar o funículo anterior, em direção à zona de transição (Fraher, 1998). Após a
transecção experimental no gato, alguns destes axônios se regeneraram através da cicatriz
glial, no SNC e repovoam raízes ventrais (Risling et al 1983, 1992, 1993; Carlstedt et al
1988; Fraher, 1998).
Dado que axônios motores têm que transpor uma longa distância para reinervar seu
alvo, a sobrevivência à longo prazo é essencial. Assim, manter o nível de fatores tróficos é
crucial para a sobrevivência do motoneurônio durante a regeneração. Fatores tróficos que
podem melhorar o brotamento em motoneurônios e aumentam a probabilidade de um
axônio se associar com células de Schwann na periferia. Idealmente, os fatores que
proporcionam efeitos quimiotáticos ou neurotróficos para os axônios podem orientá-los para
regenerar em direção ao alvo (Chu e Wu, 2009).
Adicionalmente aos fatores neurotróficos, um grupo de moléculas essenciais para o
crescimento de neuritos e, consequentemente para a sobrevivência dos motoneurônios
após uma lesão proximal, são os componentes da matriz extracelular. No nervo periférico,
tem sido atribuído à laminina um importante papel na aderência do cone de crescimento,
durante a elongação do axônio. Desta forma, a presença da laminina é um fator
preponderante para a capacidade regenerativa do neurônio. Interessantemente, ocorre
uma regulação positiva da produção de receptores para as lamininas (integrinas) no caso
da avulsão de raízes ventrais (Hammarberg et al., 2000).
92
6.4 - REIMPLANTE E REGENERAÇÃO NERVOSA E RECUPERAÇÃO FUNCIONAL
Além de concluirmos que o reimplante teve grande importância na neuroproteção,
também demonstramos que o reimplante utilizando os selantes de fibrina propostos,
também possibilitaram a regeneração axonal e, consequentemente, a recuperação
funcional, mostrando mais uma vez, a eficácia de tais selantes.
A análise com quatro semanas após o reparo das raízes avulsionadas, revelou que
em todos os grupos experimentais (exceto o grupo controle), houve diminuição acentuada
do número de axônios mielínicos, indicando morte neuronal retrógrada e degeneração
Walleriana acarretada pela lesão (Koliatsos et al., 1994). Entretanto, na análise com doze
semanas pós lesão, obtivemos um maior número de axônios mielínicos, nos grupos onde
houve o reimplante, quando comparado ao grupo somente avulsão. Os dados sugerem a
ocorrência de regeneração das fibras motoras, nos grupos experimentais onde houve o
reimplante, diferentemente do grupo somente avulsão, que apresentou um significativo
menor número de axônios mielínicos, decorrente da lesão, quando comparado aos demais
grupos. É importante ressaltar, nesse contexto, que os valores obtidos referentes ao
número de axônios mielínicos presentes no nervo isquiático, para o grupo controle, coincide
com a literatura (Schamalbruch, 1986).
Adicionalmente à contagem de axônios mielínicos, analisamos diferentes
parâmetros morfométricos; diâmetro das fibras nervosas (DFM), diâmetro dos axônios
(DAM), espessura da bainha de mielina (EBM) e a razão “g” (RZG).
Em relação ao DFM e DAM, nossos resultados indicaram que o grupo avulsão
apresentou fibras nervosas e axônios com menores dimensões, comparativamente àqueles
do grupo controle e implantado, representados na distribuição de frequência. Já em relação
ao grupo controle, os diâmetros médios das fibras nervosas e axônios, foram compatíveis
com a literatura (Schamalbruch, 1986). Foi importante analisar principalmente as fibras de
maiores dimensões, tendo-se em vista que nosso modelo de lesão, a avulsão ventral,
somente acomete os axônios motores (de grande calibre). Neste sentido, o grupo com
implante mostrou-se intermediário e o grupo somente avulsão apresentou o padrão mais
destoante em relação ao normal.
A EBM é um parâmetro relacionado à recuperação funcional do nervo, tendo sido
utilizada na avaliação da evolução do processo regenerativo axonal por diversos autores
93
(Levi e Bunge, 1994; Oliveira, 2000; Oliveira e Langone, 2000; Pierucci et al.,2008). A
espessura da bainha de mielina é uma indicação direta da recuperação funcional do nervo,
já que está relacionada com o nível de atividade fisiológica das células de Schwann. Por
outro lado, a RZG é um parâmetro que reflete a relação entre o diâmetro do axônio e o
diâmetro da fibra nervosa e está relacionado à condução do impulso nervoso, refletindo a
maturação das fibras regeneradas, sendo que os valores de normalidade, comumente
descritos estão na faixa 0,5-0,7. Razões abaixo de 0,5 indicam uma super mielinização do
axônio, enquanto razões acima de 0,7 indicam submielinização axonal. Essa razão é
utilizada como parâmetro morfométrico que expressa a relação da célula de Schwann e
axônio, bem como reflete uma maior ou menor distância entre os nós de Ranvier (Rushton,
1951; Smith e Koles, 1970; Waxman, 1980).
Nossos resultados indicaram uma distribuição desigual em relação a todos os
grupos, embora a média da EBM não tenha diferido significativamente entre os grupos. Isso
pode ser justificado pelo fato que a lesão feita (avulsão de raiz ventral), afeta somente as
fibras motoras, sendo que as fibras sensitivas estão intactas. Desse modo, a média poderia
mascarar o resultado (Schamalbruch, 1986). Em nosso trabalho, todos os grupos
apresentam, na média, a RZG dentro da normalidade (0,5-0,7). Sendo assim, os dados de
RZG obtidos para o grupo avulsão+implante, sugerem que a velocidade da condução
nervosa estaria próxima da normalidade. Embora haja diferenças entre o grupo implantado
ao se comparar com o controle, essas estão respectivamente menores do que o grupo que
somente sofreu avulsão.
Por fim, em nosso estudo, os grupos que utilizaram os selantes de fibrina,
apresentaram melhora significativa da função motora, ao longo das 12 semanas após a
lesão, além de um diferente padrão funcional intergrupos ao longo do tempo, pela avaliação
das áreas das pegadas, tempo de apoio das mesmas, além do cálculo do índice funcional
do nervo fibular. Esses dados foram obtidos através do “walking track test” (CatWalk).
A avaliação da área da pegada e do tempo disposto a ela, mostrou um diferente
padrão funcional intergrupos ao longo do tempo. No grupo somente avulsão, os valores
diminuíram e se mantiveram baixos, enquanto nos grupos onde houve reimplante, houve
um aumento significativo ao longo do tempo, indicando melhora.
A comparação entre os grupos apontou que os valores do índice funcional fibular,
no período pré-operatório, estiveram dentro dos padrões de normalidade, caracterizando a
94
funcionalidade normal. A partir da 1ª semana pós-lesão, houve queda desses valores,
tornando-se inferiores à -200, em ambos os grupos, caracterizando perda funcional total do
membro posterior ipsilateral à lesão. Em nosso trabalho, somente os grupos onde houve o
reimplante, apresentaram melhora significativa do índice funcional do nervo fibular, ao longo
das 12 semanas após a lesão.
Essas análises nos fornecem dados confiáveis sobre a recuperação funcional de
animais com alterações de motricidade (Dijkstra et al., 2000) e é um método não invasivo,
de baixo custo e quantitativo (Dijkstra et al., 2000; Varejão et al., 2001; Monte-Raso et al.,
2006).
A melhora motora observada nos animais é importante, pois a locomoção é
necessária para a restauração de unidades motoras, sensibilidade e córtex cerebral. Além
disso, mostra que a estratégia de reimplantação foi bem sucedida, promovendo condições
para o retorno funcional do músculo (Monte-raso, 2006).
Como achado fundamental de nosso estudo, destacamos a eficácia do selante de
fibrina do CEVAP, que demonstra sua qualidade e aplicabilidade médica, com todas as
vantagens que o mesmo apresenta. Dentre elas, ser um produto nacional, reflexo de
intensos anos de pesquisa, é fator de destaque, pois é um dos poucos exemplos bem
sucedidos de desenvolvimento de drogas brasileiras. Sua natureza não hemoderivada
também é relevante, pois facilita a obtenção de seu componentes, bem como afasta a
possibilidade de importantes contaminações virais.
Acreditamos fortemente que a técnica de reimplante de raízes medulares com o
selante de fibrina do CEVAP possa ser futuramente transferida para a clínica, o que será
de um ganho significativo para os pacientes portadores dessa lesão, otimizando a
recuperação funcional e minimizando eventos de dor neuropática e excitotoxicidade.
95
7. Conclusões
96
- Em conjunto, nossos resultados indicam que o selante de fibrina derivado do
veneno de Crotalus durissus terrificus, bem como o selante de fibrina comercial
(Tissucol), utilizados para o reimplante de raízes medulares são similarmente eficientes,
reimplantando as raízes avulsionadas de forma eficaz, sem deiscência, sendo
neuroprotetores e promovendo melhora motora.
Os resultados aqui apresentados sugerem que o implante das raízes ventrais com
os selantes de fibrina, resultaram em:
- Neuroproteção, observada pela sobrevivência neuronal.
- Regeneração axonal, observada pela quantificação de axônios.
- Melhor recuperação funcional
Como os selantes possuem características próprias, seu manuseio foi diferenciado.
O selante produzido nacionalmente, devido ao tempo de coagulação personalizado,
mostrou-se mais prático, sendo possível reconectar as raízes no ponto exato onde foram
avulsionadas, mais facilmente. O selante comercial, por não ter tempo de coagulação
personalizado, tem seu manuseio mais complicado.
Os presentes resultados podem ajudar na prática clínica, com uma técnica mais
eficiente para o reparo de lesões por avulsão de raízes nervosas. A utilização de ambos os
selantes trouxe resultados inéditos e promissores, contribuindo para o futuro emprego
clínico de ambos, nessa abordagem terapêutica.
97
8. Referências
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107
9. Anexo
108
Tabela 3: Valores médios do diâmetro mínimo das fibras mielÍnicas, diâmetro
mínimo do axônio, espessura da bainha de mielina e razão "G" nos diferentes grupos
experimentais, 4 semanas pós lesão. Os valores são apresentados como média ± erro
padrão. Grupos DF (µm) DA (µm) EBM (µm) Razão “G”
Controle 6,62 ± 0,50 4,10 ± 0,53 1,26 ± 0,08 0,60 ± 0,03
Avulsão 6,31 ± 0,46 4,34 ± 0,52 0,98 ± 0,06 0,68 ± 0,03
Cevap 7,02 ± 0,28 5,12 ± 0,21 0,95 ± 0,11 0,71 ± 0,02
Comercial 6,54 ± 0,12 4,46 ± 0,14 1,04 ± 0,06 0,68 ± 0,02
Tabela 4: Valores médios do diâmetro mínimo das fibras mielÍnicas, diâmetro
mínimo do axônio, espessura da bainha de mielina e razão "G" nos diferentes grupos
experimentais, 12 semanas pós lesão. Os valores são apresentados como média ± erro
padrão. Grupos DF (µm) DA (µm) EBM (µm) Razão “G”
Controle 7,67 ± 0,36 5,00 ± 0,43 1,33 ± 0,06 0,64 ± 0,03
Avulsão 7,81 ± 0,17 5,70 ± 0,17 1,05 ± 0,05 0,72 ± 0,01
Cevap 7,53 ± 0,32 5,15 ± 0,38 1,20 ± 0,05 0,68 ± 0,02
Comercial 6,95 ± 0,46 4,83 ± 0,50 1,06 ± 0,11 0,68 ± 0,04
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