Aus dem Institut für Pflanzenernährung
Fachgebiet Pflanzenernährung (Düngung) Prof. Dr. Volker Römheld
und dem Institut für Botanik
Fachgebiet Biodiversität und pflanzliche Interaktion
Prof. Dr. Otmar Spring
Das Potenzial von Falschem Mehltau als Quelle von
Omega-3-Fettsäuren für die menschliche Ernährung
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Agrarwissenschaften (Dr. sc. agr.)
vorgelegt
der Fakultät Agrarwissenschaften
Universität Hohenheim
von
Ann-Marie Anderle
aus Mutlangen
2009
Die vorliegende Arbeit wurde am 10. Juli 2009 von der Fakultät Agrarwissenschaften
der Universität Stuttgart-Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Agrarwissenschaften“ angenommen.
Tag der mündlichen Prüfung: 30. Juli 2009
1. Prodekan: Prof. Dr. W. Bessei
1. Prüfer (Betreuer): Prof. Dr. O. Spring
2. Prüfer (Mitberichter): Prof. Dr. V. Römheld
3. Prüfer: Prof. Dr. K. Haas
Eingereicht am 28.01.2009
Mündliche Prüfung am 30. Juli 2009
Für meine Familie
Danksagung
Ich bedanke mich ganz herzlich bei meinen 3 hervorragenden Betreuern, die sich
gegenseitig optimal ergänzten. Zuallererst danke ich Herrn Professor Spring für die
Annahme als Doktorandin und die Vergabe des höchst interessanten Themas. Er
stand mir äußerst zuverlässig mit wissenschaftlichem und menschlichem Rat zur
Seite. Er war der Hauptbetreuer und Förderer dieser Arbeit und führte alle
notwendigen Korrekturen durch. Ganz herzlich bedanke ich mich auch bei Herrn
Professor Haas für das stets entgegengebrachte Vertrauen, das freundschaftliche
Arbeitsklima, seine praktischen Tipps sowie für die zur Verfügung gestellten
Sachmittel und Freiräume für meine Arbeiten am GC. Herrn Professor Römheld
danke ich ganz herzlich für seine Tätigkeit als Gutachter, die wissenschaftlichen
Anregungen, seine stets motivierende Art und für die zur Verfügung gestellte
Klimakammer während meiner Versuche am Institut für Pflanzenernährung.
Mein Dank gilt auch besonders meinen Projektpartnern im „Nahrungskettenversuch“.
Bei Herrn Professor Grashorn bedanke ich mich sehr herzlich für die Kooperation bei
der Umsetzung der Idee. Ebenso danke ich seinen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern
vom Unteren Lindenhof. Herrn Bässler von der Versuchsstation für Gartenbau danke
ich für die Überlassung der Versuchsfläche für die Salatanzucht, Frau Tina Schuster
und dem gesamten Gärtnerteam danke ich herzlich für ihre Arbeit und die sehr gute
Zusammenarbeit während der gesamten Zeit bis zur Ernte. Herrn Blauhorn von der
Staatsschule für Gartenbau danke ich für die vielen Fachgespräche über Salat und
die Überlassung des infizierten Roten Eichblatt Salats für Futterzwecke.
Ich bedanke mich herzlich bei Herrn Professor Müller und Herrn Dr. Heindl für die
Benutzung des Hordentrockners am Institut für Agrartechnik. Ganz besonders
bedanke ich mich bei Frau Amberg für die Trocknungsprozessführung und ihre
engagierte Hilfe.
Ich bedanke mich recht herzlich bei allen Kolleginnen und Kollegen der Institute für
Botanik und für Pflanzenernährung, ganz besonders danke ich Herrn Reinhard
Zipper, der mir stets zuverlässig mit praktischen Ratschlägen zur Seite stand und
Frau Dr. Kania danke ich für die vielen Fachgespräche.
Vor allem danke ich aber meinem Mann Marc Anderle, der psychologisch und
materiell stets hinter mir stand und mich stets in Allem förderte. Ich danke meiner
ganzen Familie, die mich immer bei meinen Vorhaben unterstützte.
I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ..................................... ......................................................................1
1.1. Omega-3-Fettsäuren in der menschlichen Ernährung und Nahrungsmittel-
produktion ...................................................................................................1
1.1.1. Chemische Definition der n-3-Fettsäuren.............................................2
1.1.2. Die medizinische Wirkung der n-3-Fettsäuren......................................3
1.2. Natürliche Quellen von n-3-Fettsäuren .........................................................5
1.2.1. Öle Höherer Pflanzen........................................................................... 6
1.2.2. Tierische Quellen .................................................................................7
1.3. Problematik natürlicher Quellen.................................................................... 8
1.4. Alternative Quellen für EPA und DHA...........................................................8
1.4.1. Öle Niederer Pflanzen als alternative Quellen für EPA und DHA.........8
1.4.2.Transgene Pflanzen ............................................................................10
1.5. Problematik alternativer Quellen.................................................................10
1.6. Aktueller Stand der Forschung und Zielsetzung der Arbeit.........................11
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrati onen in Sporan-
gien und infiziertem Pflanzengewebe .................. ..........................................13
2.1. Materialien und Methoden ..........................................................................13
2.1.1 Infektionstechniken und Ernte .............................................................13
2.1.1.1. Keimlingsinfektion bei P. halstedii............................................14
2.1.1.2. Blattinfektion bei B. lactucae.......................................................... 15
2.1.1.3. Ernte und Lagerung von Sporangien und Pflanzenmaterial.....16
2.1.2. Aufbereitung der Fettsäuren für die GC-Analyse................................16
2.1.2.1. Extraktion der Fettsäuren ........................................................17
2.1.2.2. Säure-katalysierte Veresterung der Fettsäuren für die GC-
Analyse ...................................................................................18
2.1.3. GC-FID Messtechnik ..........................................................................19
2.1.3.1. Kalibrieren des Messbereiches ...............................................19
2.1.3.2. Einspritztechnik/Probenaufgabe..............................................20
2.1.3.3. Säulen .....................................................................................20
2.1.3.4. Temperaturprogramme und Gassystem..................................22
2.1.4. Quantifizieren der FAMEs am GC-FID ...............................................23
2.1.5. DC-Technik.........................................................................................25
II
2.2. Ergebnisse..................................................................................................28
2.2.1. Qualitative Analyse der FS-Muster von P. halstedii und B. lactucae ..28
2.2.2. Lipidklassentrennung und FS-Zusammensetzung der einzelnen
Lipidklassen.......................................................................................29
2.2.3. EPA-Konzentrationen von Sporangien und Wirtsgewebe ..................32
2.3. Diskussion ..................................................................................................35
2.3.1. Qualitative FS-Zusammensetzung von P. halstedii und B. lactucae ..35
2.3.2. Lipidklassenzusammensetzung..........................................................35
2.3.3. EPA-Konzentrationen in Sporangien u. infiziertem Pflanzengewebe .37
2.4. Schlussfolgerungen ....................................................................................39
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeis piel P. halstedii .....40
3.1. Einleitung....................................................................................................40
3.2. Materialien und Methoden ..........................................................................40
3.2.1. Artinternes Screening auf EPA-Gehalte in Sporangien ......................40
3.2.2. Erfassen besonders EPA-reicher Sonnenblumensorten/-linien..........42
3.2.3. Variation des Infektionsdrucks............................................................42
3.2.4. Variation des Stickstoffangebotes ......................................................43
3.2.4.1. Etablieren der Nährlösungskultur ............................................43
3.2.4.2. Wachstum und Gewichte.........................................................45
3.2.4.3. Infektion und Befallsgrad.........................................................46
3.2.4.4. Gesamt-N Bestimmung im Sonnenblumengewebe.................46
3.2.4.5. Analyse der FS-Gehalte im Stickstoff-Steigerungsversuch .....48
3.2.5. Statistische Auswertung .....................................................................49
3.3. Ergebnisse..................................................................................................51
3.3.1. EPA-Gehalte verschiedener Sporangienstämme von P. halstedii......51
3.3.2. Besonders anfällige Sonnenblumensorten und –linien.......................51
3.3.3. Variation des Infektionsdrucks............................................................53
3.3.4. Variation des Stickstoffangebots ........................................................55
3.3.4.1. Wachstum und Gewichte.........................................................55
3.3.4.2. Infektion und Befallsgrad.........................................................57
3.3.4.3. Gesamt-N-Gehaltsbestimmung in Sonnenblumenpflanze.......58
3.3.4.4. EPA-Konzentrationen bei 3 N-Stufen ......................................59
3.4. Diskussion ..................................................................................................62
3.4.1. Optimierungspotenzial durch die Selektion von Pathogenstämmen...62
III
3.4.2. Optimierungspotenzial durch die Selektion von Wirtspflanzen...........62
3.4.3. Optimierungspotenzial durch variierten Infektionsdruck .....................63
3.4.4. Optimierungspotenzial durch variierte N-Düngung.............................63
3.5. Schlussfolgerungen ....................................................................................66
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3 FS aus B. lactucae in
Hühnereiern........................................ ..............................................................68
4.1. Hintergrund und Zielsetzung des Fütterungsexperiments...........................68
4.2. Materialien und Methoden...........................................................................68
4.2.1. Versuchsaufbau und Aufgabenverteilung..........................................68
4.2.2. FS-Konzentrationen der Salatextrakte, der Futterrationen und der
Dotterlipide ........................................................................................70
4.2.3. Salatproduktion..................................................................................72
4.2.4. Trocknung..........................................................................................74
4.2.5. Fütterungsversuch.............................................................................76
4.2.5.1. Leistungsdaten der Tiere ...........................................................78
4.2.6. Statistische Auswertung der Lipidgehalte in den Dotterproben .........80
4.3. Ergebnisse ..................................................................................................81
4.3.1. Befallsergebnis des Feldversuches zur Ernte....................................81
4.3.2. Temperaturstabilität und Trocknung ..................................................81
4.3.3. Fettsäureanalyse in der Nahrungskette.............................................82
4.3.4. Lipidoxidation und Sensorik...............................................................88
4.3.5. Leistungsdaten der Tiere ...................................................................89
4.4. Diskussion...................................................................................................94
4.4.1. Befallsergebnis vom Feldversuch......................................................94
4.4.2. Temperaturstabilität und Trocknung ..................................................95
4.4.3. FS-Analyse in der Nahrungskette......................................................96
4.4.4. Lipidoxidation und Sensorik...............................................................97
4.5. Zusammenfassung......................................................................................98
5. Bewertung des Potenzials von infizierten Nutzpflanze n als n-3-FS Quellen
für die menschliche Ernährung...................... ................................................99
5.1. Das Potenzial von Sporangien ....................................................................99
5.2. Das Potenzial von infiziertem, essbarem Pflanzengewebe.........................99
5.3. Das Potenzial von Bremia lactucae in der Nahrungskette.........................101
IV
6. Zusammenfassung................................. .......................................................103
7. Summary ......................................... ...............................................................105
8. Literatur ....................................... ...................................................................107
9. Anhang .......................................... .................................................................118
V
Abkürzungsverzeichnis
A Signalfläche
ALA Alpha-Linolensäure (18:3 n-3)
ANOVA Varianzanalyse
AOCS American Oils Chemists Society
ARA Arachidonsäure (20:4 n-6)
B. lactucae Bremia lactucae Regel (1843) (Falscher Mehltau auf Salat)
DC Dünnschichtchromatographie
DG Dottergewicht
DGE Deutsche Gesellschaft für Ernährung
DHA Docosahexaensäure (22.6 n-3)
DP Depositionsrate
EPA Eicosapentaensäure (20:5 n-3)
F-Wert Statistisches Maß zur Bestimmung der Signifikanz
FA Futteraufnahme
FAME(s) Fettsäuremethylester
FE Flächeneinheiten
FG Frischgewicht(e)
FID Flammenionisationsdetektor
FS Fettsäure(n)
GC Gaschromatograph(ie)
GC-MS Gaschromatograph(ie)-Massenspektrometrie
GLA Gamma-Linolensäure (18:3 n-6)
ID Innendurchmesser
IS Interner Standard
LA Linolsäure (18:2 n-6)
LC-PUFAs Langkettige, mehrfach ungesättigte Fettsäuren
LL Legeleistung
m Einwaage
MW Mittelwert
N Stickstoff
n.s. nicht signifikant
N1 Stickstoffkonzentration 0,1 mmol/l Ca(NO3)2
N2 Stickstoffkonzentration 1,0 mmol/l Ca(NO3)2
N3 Stickstoffkonzentration 5,0 mmol/l Ca(NO3)2
VI
n-3-FS Omega-3-Fettsäure(n)
n-6-FS Omega-6-Fettsäure(n)
p p-Wert, statistische Teststärke
P. halstedii Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. & DeToni (1888)
p.a. pro analysi (chem. Reinheit)
PUFAs Mehrfach ungesättigte Fettsäuren
Rf Retentionsfaktor bei der Dünnschichtchromatographie
rQ relative Quantität
RT Raumtemperatur
TBARS Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen
TBME Tertiärer Butylmethylether
TG Trockengewicht(e)
U Umdrehungen
v/v Volumenanteil
WHO Weltgesundheitsorganisation
1. Einleitung
1
1. Einleitung
1.1. Omega-3-Fettsäuren in der menschlichen Ernähru ng und Nahrungsmittel-
produktion
Derzeit stößt man in den Regalen von Supermärkten auf Margarinen, Fette und
Pflanzenöle, die dafür werben, besonders reich an Omega-3-Fettsäuren (n-3-FS) zu
sein. Es gibt einige Lebensmittel auf dem Markt, die mit n-3-FS angereichert werden
(TRAUTWEIN 2001), unter anderem n-3-FS-Eier und n-3-FS-Brot (KOLANOWSKI &
LAUFENBERG 2006) und als „Funktionelle Lebensmittel“ bzw. „Functional Food“
(HASLER 2002) bezeichnet werden. In Margarinen kommen n-3-FS-reiche Öle von
Höheren Pflanzen zum Einsatz, wie Rapsöl oder Leinöl. Mit einer jährlichen
Produktion von etwa 100 Mio Tonnen haben n-3-FS-reiche Pflanzenöle den größten
Marktanteil als funktionelle Lebensmittel für die menschliche Ernährung (DREXLER et
al. 2003). Als Nahrungsergänzungsmittel in Form von Fischölkapseln, Algen-
ölkapseln oder Pflanzenölkapseln sind n-3-FS in Drogeriemärkten und Apotheken
erhältlich. Doch die Marktbedeutung der n-3-FS geht weit darüber hinaus. Spezielle
n-3-FS aus Algen, Pilzen, Oomyceten, Fischen oder Hühnereiern werden in
manchen Ländern der Kinder- und Säuglingsnahrung zugesetzt (WARD & SINGH
2005). Da der Markt noch Expansionspotenzial besitzt, forschen namhafte Firmen
wie die BASF AG, Abott S.A., Aventis S.A., Nestle S.A. oder Novartis S.A. derzeit
intensiv an neuartigen Organismen, die n-3-FS produzieren und Produkten, denen n-
3-FS zugesetzt werden (WARD & SINGH 2005). Einen weiteren Markt für n-3-FS aus
Algen und Oomyceten stellen Meeres-Aquakulturen dar. Normalerweise nehmen
Larven und Fische im Meer Plankton und Algen auf, welche reich an n-3-FS sind. Die
n-3-FS reichern sich über die Nahrungskette im Fisch stark an, was diesen für den
menschlichen Verzehr so wertvoll macht. In heute üblichen Aquakulturen zur
Anzucht von Lachsen erfolgt die Fütterung meist über Kraftfutter, dem n-3-FS aus
der Nahrungskette fehlt. Daher werden neuerdings zusätzlich n-3-FS-haltige Algen
und Oomyceten für die Aufzucht der Fischlarven eingesetzt (BARCLAY & ZELLER
1996; WARD & SINGH 2005). Auch für den Tierfuttermarkt sind n-3-FS ein aktuelles
Thema. n-3-FS-haltige Öle Höherer Pflanzen, Oomyceten-Präparate sowie Fischöl
und Algenöl werden beispielsweise zu Hühner- und Putenfutter gemischt, um den n-
3-FS-Anteil in Fleisch und Eiern zu erhöhen (SIMOPOULOS & SALEM 1992; WARD &
SINGH 2005).
1. Einleitung
2
1.1.1. Chemische Definition der n-3-Fettsäuren
n-3-Fettsäuren sind Bestandteile der sehr umfangreichen Stoffgruppe der Lipide,
innerhalb derer FS ein zentrales, Struktur gebendes Element darstellen. Als FS
werden Kohlenwasserstoffe bezeichnet, die aus mindestens 4 C-Atomen bestehen
und mit einer Carboxylgruppe enden. Dabei werden in der Natur Kettenlängen von
bis zu 28 C-Atomen gebildet, inzwischen sind über 1000 verschiedene Strukturen
beschrieben (BELITZ et al. 2001; THURNHOFER 2007). Die hohe Variabilität entsteht
nicht nur durch die Anzahl der C-Atome, sondern auch durch die die Bildung von C-
C-Doppelbindungen, Verzweigungen und H-Substitutionen mit anderen funktionellen
Gruppen. Oft sind solche Veränderungen charakteristisch für bestimmte Organis-
mengruppen, da sie besondere Enzyme erfordern.
Abb. 1.1.: Schematische Darstellung der Eicosapentaensäure (20:5 n-3). Die Methylgruppe stellt die
n-Position in n-Schreibweise dar, die Carboxylgruppe enthält das C-1-Atom der Delta-Schreibweise.
Nomenklatorisch wird die strukturelle Vielfalt der FS durch die Angabe der
Kettenlänge (Zahl der C-Atome) und die Anzahl der Doppelbindungen ausgedrückt.
Eine Fettsäure mit 20 C-Atomen und 5 Doppelbindungen wird daher als 20:5
bezeichnet. Nach den Regeln der „International Union of Pure and Applied Chemis-
try“ (IUPAC-IUB 1978) wird das C-Atom der Carboxylgruppe als C1 gezählt. Damit ist
die Position von Doppelbindungen im Molekül eindeutig definiert. Für das Beispiel
der erwähnten FS 20:5 (Eicosapentaensäure) sind das die Positionen 5, 8, 11, 14,
17. Dies wird bei ausführlicher Benennung dem Namen der FS vorangestellt und
durch die Isomerie der Doppelbindungen in cis-(Z)- oder trans-(E)-Form ergänzt, hier
also (5Z, 8Z, 11Z, 14Z, 17Z)-Eicosapentaensäure (vgl. Abb.1.1.).
Verwirrung stiftet mitunter die Verwendung der unterschiedlichen Schreibweisen, die
sich vor allem auf die funktionell wichtige Position der letzten Doppelbindung
Methylende, n-Nomenklatur
H3C
COOH
Carboxylende, C-1-Position
17Z bzw. n-3 Position
14Z bzw. n-6- Position
1. Einleitung
3
n-3 Fettsäuren Haupt-Vorkommen n-6 Fettsäuren Haupt-Vorkommen 18:3 n-3 (ALA)* Leinöl, Walnussöl, 18:2 n-6 (LA)* Sonnenblumenöl, Rapsöl Distelöl 20:5 n-3 (EPA)* Fisch, Algen, Eumy- 18:3 n-6 (GLA) Borretsch, Nachtkerze, ceten, Moose, Oomyceten Eumyceten, Oomyceten, 22:6 n-3 (DHA)* Fisch, Algen, Eumyceten 20:4 n-6 (ARA) Tierische Fette, Eumycet-
Oomyceten, Eidotter en, Muskelfleisch , Algen,
beziehen. Liegt diese, wie bei Eicosapentaensäure, zwischen dem viert- und dritt-
letzten C-Atom der Kette, so wird die FS als n-3-FS oder ω-3-FS bezeichnet. Diese
Schreibweise ist besonders im medizinischen und pharmakologischen Bereich
gebräuchlich, da FS mit Doppelbindung in der n-3-Position besondere physiologische
Funktionen zugeordnet werden. Ähnliches gilt für die n-6- (ω-6)-Position der letzten
Doppelbindung im Molekül. Die ω-Symbolik ist zwar populär, jedoch veraltet. Im
wissenschaftlichen Bereich wird sie schon länger durch die n-Symbolik ersetzt.
1.1.2. Die medizinische Wirkung der n-3-Fettsäuren
n-3-FS und n-6-FS sind für den Menschen essenziell, d.h. sie können nicht selbst
produziert werden und müssen über die Nahrung aufgenommen werden.
Die Deutsche Gesellschaft für Ernährung (DGE) empfiehlt aktuell eine tägliche
Aufnahme von n-6- und n-3-FS im Verhältnis von 5:1 (DGE 2007) Da in unserer
Nahrung n-6-FS im Anteil sehr stark überwiegen, liegt das Verhältnis von n-6:n-3-FS
oft bei 10:1, 20:1 und schlechter.
Tab. 1.1.: Einige wichtige n-6- und n-3-FS und ihr Haupt-Vorkommen in unterschiedlichen Organis-men. *=essenzielle Fettsäuren für Menschen. Die n-6-und n-3-FS Höherer Pflanzen sind blau darge-stellt.
Dies kann unsere Gesundheit auf Dauer negativ beeinträchtigen, da n-6-FS und n-3-
FS auf molekularer Ebene in einem komplizierten Zusammenspiel immunologische
Vorgänge im Körper regulieren (STULNIG 2003). Das n-6/n-3-FS-Verhältnis ist für die
meisten Körperfunktionen wichtiger als der absolute Gehalt dieser Fettsäuren
(STULNIG 2003; WILLIAMS 2000).
n-6-FS fördern entzündliche und gefäßschädigende Prozesse, n-3-FS steuern
solchen Prozessen entgegen (SANDERS et al. 2006; SIMOPOULOS 1999; SIRTORI 1994).
Daher wird von Gesundheitsbehörden vieler Staaten empfohlen, mehr n-3-FS über
1. Einleitung
4
die Nahrung aufzunehmen, um das n-6/n-3-Verhältnis zu verbessern und Gesund-
heitsrisiken vorzubeugen (KRIS-ETHERTON et al. 2000).
Einige wichtige n-6- und n-3-FS und ihr Vorkommen werden in Tab. 1.1. aufgeführt.
Für die menschliche Ernährung sind besonders die 3 Fettsäuren der n-3-Reihe
Alpha-Linolensäure (ALA, 18:3 n-3), Eicosapentaensäure (EPA, 20:5 n-3) und
Docosahexaensäure (DHA, 22:6 n-3) von Bedeutung. Zur Reihe der n-6-FS gehören
Linolsäure (LA, 18:2 n-6), die seltene Gamma-Linolensäure (GLA, 18:3 n-6) und
Arachidonsäure (ARA, 20:4 n-6).
Da sie mehr als eine Doppelbindung enthalten, werden sie auch als „mehrfach
ungesättigte FS“ („polyunsaturated fatty acids“ bzw. „PUFAs“) bezeichnet. Beträgt
die Kettenlänge der Fettsäuren dabei mehr als 18 C-Atome, so spricht man von
„langkettigen, mehrfach ungesättigten FS“ („long-chain poly unsaturated fatty acids“,
bzw. „LC-PUFAs“) (SIMOPOULOS & SALEM 1992).
Alpha-Linolensäure muss als essenzielle FS vom Menschen über die Nahrung
aufgenommen werden. Aus ALA als Vorstufe können vom Menschen EPA und DHA
gebildet werden (Tab. 1.1.). Diese n-3-FS sind daher im engeren Sinne nicht
essenziell. Die Fettsäuren der n-6- und n-3-Reihe konkurrieren bei der Biosynthese
jedoch um dieselben Enzymsysteme (CLARKE 2001). Wir nehmen im Verhältnis zu
viele n-6-FS zu uns, so dass LA gegenüber ALA stark im Vorteil ist und dadurch
weder EPA noch DHA in ausreichender Menge gebildet werden können. Da dies zu
Mangelerscheinungen führt, werden EPA und DHA ebenfalls als essenziell eingestuft
(BROWNING 2003).
Die wichtigen medizinischen Funktionen der n-3-FS werden nicht ALA selbst sondern
den längerkettigen FS EPA und DHA zugeordnet (FINNEGAN et al. 2003; SANDERSON
et al. 2002). Weil unter Grönland Eskimos, trotz fettreicher Ernährung, Herzkrank-
heiten sehr selten waren, wurden in den 70er Jahren Studien zu den Gründen dieses
Phänomens durchgeführt. Die Herzgesundheit dieser ethnischen Gruppe wurde auf
die hohe Aufnahme von EPA und DHA aus Robben- und Fischöl zurückgeführt
(BANG et al. 1971). EPA und DHA steuern Stoffwechselprozesse, welche die
Blutfettwerte senken, was in der Infarktprophylaxe eine wesentliche Rolle spielt
(KRIS-ETHERTON et al. 2002; SANDERS et al. 2006; WOLFRUM & SPENER 2000). LC-
PUFAs werden daher in der Schlaganfall- und Herzinfarktprophylaxe sowie für die
1. Einleitung
5
Folgetherapie nach einem Infarkt eingesetzt (CALDER 2004). Da Fettsäuren in
Phospholipiden wichtige Membran-Bestandteile von Zellen sind, beeinflussen sie die
Elastizität von Gefäßen (WILLIAMS 2000). Je höher der Anteil an hoch ungesättigten
Fettsäuren ist, desto beweglicher und belastbarer werden die Membranen von
Blutkörperchen und Gefäßen (MEAD 1984). Herzinfarkt und Schlaganfall sind
Konsequenzen von Ablagerungsprozessen, bei denen ein Thrombus die Gefäße
verstopft und die Blutzirkulation verhindert (MARTIN et al. 2005). Sind nur gesättigte
Fettsäuren in die Gefäßmembranen eingebaut, so entstehen aufgrund der starren
Strukturen und in Kombination mit LDL-Cholesterin („low denstiy lipoprotein“)
Ablagerungen an den Gefäßwänden (ERKKILÄ et al. 2008). EPA und DHA sorgen für
eine elastische Struktur der Blutzellen und Gefäßmembranen und verhindern
dadurch Ablagerungen (LICHTENSTEIN et al. 2006). Sie haben zusätzlich vasodila-
tatorische (gefäßerweiternde), sowie Cholesterin senkende (HARRIS 1989;
SIMOPOULOS 1989) und Blutdruck senkende Eigenschaften (MORRIS et al. 1993).
EPA ist außerdem die Vorstufe von Gewebshormonen, den sogenannten Eicosa-
noiden. Zu ihnen gehören Prostaglandine, Leukotriene, Prostacycline und Thrombo-
xane (FUNK 2001). Diese Gewebshormone steuern Prozesse der Immunabwehr.
Eicosanoide wirken Entzündungsprozessen im Körper entgegen (CALDER 2001),
weshalb EPA in der Therapie gegen Psoriasis, Asthma, Allergien und andere
Autoimmunkrankheiten eingesetzt wird (BROWNING 2003; SIMOPOULOS 2002; STULNIG
2003).
DHA ist wesentlich an der Entwicklung von Augen und Neuronalsystem bei
Embryonen beteiligt und wird schwangeren Frauen von Ärzten zur Ergänzung der
Nahrung empfohlen (UAUY & CASTILLO 2003).
1.2. Natürliche Quellen von n-3-Fettsäuren
Als natürliche Quellen von n-3-FS werden in dieser Arbeit Nahrungsmittel
bezeichnet, die vom Menschen in ihrer ursprünglichen Form verzehrt werden können
und nicht genetisch oder technisch in ihrer Zusammensetzung verändert wurden.
Dazu zählen pflanzliche und tierische Öle, Meeresfisch und Hühnereier.
1. Einleitung
6
1.2.1. Öle Höherer Pflanzen
Die wichtigsten Lieferanten der essenziellen n-3-FS sind Öle Höherer Pflanzen.
Höhere Pflanzen produzieren n-3-FS allein in Form von ALA sowie n-6-FS in Form
von LA und GLA, da Enzyme zur weiteren Desaturierung (Einfügen von Doppel-
bindungen) und Elongation (Kettenverlängerung) der n-3-FS fehlen (SAYANOVA &
NAPIER 2004). Die seltene FS GLA wird als taxonspezifisches Merkmal nur von
wenigen Gattungen wie z.B. Oenothera (Nachtkerze) und Borago (Borretsch)
produziert (FROHNE & JENSEN 1992; VELASCO & GOFFMAN 1999).
Da Höhere Pflanzen n-3-FS ab der Kettenlänge von 20 C-Atomen nicht
synthetisieren können (BROOKS & STUMPF 1966), wird im Zusammenhang mit natür-
lichen Pflanzenölen und n-3-FS ausschließlich von ALA gesprochen. Zu den Ölen,
die besonders reich an n-3-FS sind gehören Leinöl, welches in seinem Fettsäure-
muster bis zu 60% ALA enthält, Rapsöl mit Gehalten von 6 bis 14% und Walnussöl
mit 9-15 % ALA (BUNDESMINISTERIUM FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ 2006; FUSSENEGGER
& WINDHALM 2003). Zu den Ölen, die von Natur aus sehr reich an n-6-FS sind,
gehören Distelöl mit 68-83% LA, Sonnenblumenöl mit 48-74% LA, Maiskeimöl mit
39-66% LA und Walnussöl mit 54-65% LA. Wiederum spielt das n-6:n-3 Verhältnis
eine Rolle. Bei Rapsöl und Walnussöl ist das Verhältnis recht ausgewogen und liegt
etwa bei 5:1. Distelöl und Sonnenblumenöl enthalten dagegen kaum n-3-FS und
haben daher Verhältniswerte sehr zu Gunsten der n-6-FS. Es gibt allerdings
sogenannte „high oleic“ Sonnenblumensorten auf dem Markt, die so gezüchtet
wurden, dass anstatt hohen Mengen an LA sehr hohe Mengen an Ölsäure (18:1 n-9,
engl.: oleic acid) produziert werden (COLE et al. 1998), was das Verhältnis zu
Gunsten von n-3-FS verbessert. Ölsäure ist mit 60% auch Hauptbestandteil in
Olivenöl, einer Hauptkomponente der „Mittelmeerdiät“, welches mit einem n-6:n-3-
Verhältnis von 5:1 ebenfalls als physiologisch wertvoll gilt (SIMOPOULOS 2001). Nicht
nur Öle sondern auch grüne Pflanzengewebe enthalten hohe Konzentrationen an
ALA. So gilt z.B. Portulak (Portulaca oleracea L.) mit 3-4 mg ALA pro g Frischgewicht
als guter ALA Lieferant (EZEKWE et al. 1999; SIMOPOULOS 1995), auf Verpackungen
von französischem Feldsalat wird aktuell mit der n-3-FS Konzentration von 2,5 mg
pro g Frischgewicht geworben.
1. Einleitung
7
1.2.2. Tierische Quellen
Der Begriff n-3-FS wird selten mit tierischen Produkten in Verbindung gebracht, da
damit meist gesättigte, feste Fette (ERKKILÄ et al. 2008) wie Schweineschmalz, Butter
oder Rinderfett assoziiert werden. Es gibt jedoch auch Tiere wie Meeresfische und
Hühner, die n-3-FS in Form von LC-PUFAs (EPA und DHA) anreichern können.
Meeresfische
Über die natürliche Nahrung nehmen Meeresfische Phytoplankton auf, welches zu
einem erheblichen Anteil von Mikroalgen aus der Gruppe der Heterokontophyta
gebildet wird. Diese Mikroalgen produzieren nennenswerte Mengen an EPA und
DHA (TONON et al. 2002), die sich über die Nahrungskette in Fleisch und Fettgewebe
von Fischen anreichern. Bereits 1-2 Portionen Meeresfisch pro Woche können so
den menschlichen Bedarf an PUFAs decken (KRIS-ETHERTON et al. 2002). Wo Fisch
in unzureichender Menge auf dem Speiseplan steht, werden Nahrungsergänzungs-
mittel wie Fischölkapseln empfohlen (KRIS-ETHERTON et al. 2000). Diese enthalten
EPA und DHA in angereicherter Form, je nach Hersteller in Konzentrationen von
100-300 mg EPA/g ÖL und 100-300 mg DHA/g ÖL (ACKMAN et al. 1989).
Hühnereier
Hühnereier genießen den Ruf, den Cholesterinspiegel im Blut in die Höhe zu treiben
und daher ungesund zu sein. Hühnervögel produzieren jedoch im Eidotter, welches
zu 33% aus Lipiden besteht, etwa 4% DHA (SIMOPOULOS & SALEM 1989). Mit dem
Verzehr eines Eies mit einem Eigewicht von 40 g kann damit fast der komplette
Tagesbedarf an DHA gedeckt werden. Das n-6/n-3-Verhältnis bei Eiern liegt bei
konventionellen Eiern etwa bei 8-10:1, bei „Omega-3-Eiern“ liegt es bei oder unter
5:1, was den Empfehlungen der DGE entspricht. Der mäßige Verzehr von Eiern wird
daher als gesund und empfehlenswert eingestuft (NOBLE et al. 1990; SIMOPOULOS &
SALEM 1992). Der DHA- und Cholesteringehalt von Eiern kann durch die Fütterung
der Hühner, und damit über die Nahrungskette, stark beeinflusst werden (CHUNG et
al. 1965; GRASHORN 1994; OH et al. 1991; SCHOLTYSSEK 1991). Für die Herstellung
von „Omega-3-Eiern“ bekommen Hühner ALA-reiche Pflanzenöle wie z.B. Leinöl
zugefüttert (RICHTER & KÖHLER 1998). Diese werden bei genügend hoher Dosis im
Organismus des Huhnes in DHA umgewandelt und reichern sich als ALA und DHA
im Eidotter an (STEINHILBER 2003). Auch Fischöl, Fischmehl und Robbenöl haben
1. Einleitung
8
einen positiven Effekt auf den EPA und DHA Gehalt im Eidotter und werden dem
Hühnerfutter zugemischt, um „Omega-3-Eier“ zu erhalten (SCHREINER et al. 2004).
Diese Produkte können allerdings den negativen Nebeneffekt haben, dass die Eier
nach Fisch schmecken (MARSHALL et al. 1994).
1.3. Problematik natürlicher Quellen
Die Fischbestände im Meer sinken rapide, da global Überfischung betrieben wird
(NAYLOR et al. 2000). Hinzu kommt die Verschmutzung der Gewässer mit
Industrieabfällen und Schwermetallen, welche sich im Fisch anreichern, was diesen
ungenießbar machen kann. Die beiden Alternativen Hühnereier und Öle Höherer
Pflanzen haben ebenfalls entscheidende Schwachpunkte. So enthalten Hühnereier
von Natur aus viel DHA, sie enthalten jedoch äußerst wenig EPA und auch viele
gesättigte FS, die als nicht so gesund gelten. Die Öle Höherer Pflanzen sind
dagegen reich an ungesättigten Fettsäuren. Mit Hilfe von Ölen Höherer Pflanzen
können Menschen zwar ihren Bedarf an ALA decken, nicht jedoch den Bedarf an LC-
PUFAs der n-3-Reihe, also EPA und DHA. Diese gelten jedoch wegen ihrer
pharmakologischen Eigenschaften als besonders wertvoll und sollten deshalb
zusätzlich über die Nahrung aufgenommen werden.
1.4. Alternative Quellen für EPA und DHA
In Anlehnung an die Definition der geltenden Fassung der „Novel Food Verordnung“
der EU von 1997 (EU 1997) werden in dieser Arbeit solche Organismen als
alternative n-3-FS-Quellen bezeichnet, die in dieser Form in Europa noch nicht
verzehrt werden. Dazu gehören technisch gewonnene Produkte Niederer Pflanzen
und gentechnisch veränderte Pflanzen.
1.4.1. Öle Niederer Pflanzen als alternative Quellen für EPA und DHA
Niedere Pflanzen sind im Gegensatz zu Höheren Pflanzen dazu in der Lage, EPA
und DHA zu produzieren und können uns als alternative Quellen für diese FS dienen.
Zu ihnen zählen marine Mikroalgen der Heterokontophyta, Oomyceten, Eumyceten
und Moose. Oomyceten sind mit den heterokontophyten Algen phylogenetisch eng
verwandt und sind als Saprophyten oder als Krankheitserreger von Tieren und
Pflanzen bekannt. Zur den Oomyceten gehören z.B. die Gattungen Thraustochytrium
und Schizochytrium, die saprophytisch von abgestorbenen Pflanzenteilen im
1. Einleitung
9
Brackwasser leben. Die auf lebende Wirte angewiesenen Falschen Mehltaupilze
(Peronosporaceae), sind dagegen hoch spezialisiert und auf künstlichen Nährmedien
bisher nicht kultivierbar.
Thraustochytrium und Schizochytrium sind bereits wirtschaftlich relevant für die
Produktion von DHA und ARA und werden großtechnisch in Bioreaktoren mit Nähr-
medium gezüchtet, wobei sie, je nach Nährmedium, Stamm und Biomasse, bis zu 10
g DHA pro L und Tag produzieren (WARD & SINGH 2005). Schizochytrium-Arten
werden als Futter für Aquakulturen verwendet und aktuell als Ersatz für Fischmehl im
Futter für Meerbrassen in Aquakultur diskutiert (BARCLAY & ZELLER 1996; GANUZA et
al. 2008).
Mikroalgen mehrerer Gattungen werden bereits wirtschaftlich zur EPA und DHA
Gewinnung in Bioreaktoren gezüchtet und für die Gewinnung von sogenanntem
„Algenöl“ herangezogen. Dabei handelt es sich um einen Lipidextrakt aus
Algenbiomasse, der in lipophilem Lösungsmittel angereichert und aufgereinigt (nur
die gewünschten FS bleiben enthalten) wurde. Es sind sowohl heterotrophe als auch
phototrophe Algen im Einsatz. Die heterotrophe Mikroalge Ulkenia wird z.B. für die
Produktion von Algenöl der Firma Lichtwer (Berlin) verwendet, welches in der
Apotheke in Form von Algenölkapseln (Ameu® Alge) erhältlich ist. DHA ist darin in
aufgereinigter Form enthalten und erreicht Konzentrationen von ca. 300 mg/g ÖL.
Dies entspricht der Menge in konzentrierten Fischölkapseln. Die phototrophe Alge
Phaeodactylum tricornutum wird in Photobioreaktoren gezüchtet und zur EPA
Gewinnung herangezogen, wobei bis zu 40 mg pro L und Tag produziert werden
können (MEISER et al. 2004). Die phototrophe, marine Mikroalge Monodus
subterraneus (HSIAO & BLANCH 2006) wird neben vielen anderen Gattungen ebenfalls
zur EPA Produktion eingesetzt und kommt unter optimalen Bedingungen auf
ähnliche Gehalte wie Phaeodactylum tricornutum (WARD & SINGH 2005). DHA aus
Oomyceten- und Mikroalgenkulturen wird als „Einzelleröl“ bzw. „single cell oil“ in den
USA bereits großtechnisch produziert und Babynahrung zugesetzt (WARD & SINGH
2005), da DHA an der Entwicklung des Nervensystems und des Immunsystems vom
Menschen beteiligt ist. Es wird momentan intensiv nach neuen Organismen gesucht
und es werden laufend neue Gattungen gefunden, die DHA und EPA produzieren
und als Genbank oder auch als Produzenten für LC-PUFAs genutzt werden können
(QI et al. 2002; SANINA et al. 2008). Eumyceten der Gattung Mortierella und
1. Einleitung
10
Oomyceten der Gattung Pythium sind ebenfalls als EPA und DHA Lieferanten
beschrieben, manche Stämme produzieren 25 mg EPA pro g Trockenmasse
(O´BRIEN et al. 1993; SINGH & WARD 1998). Kulturen von Mortierella- und Pythium
werden Rapsöl und Rapsschrot zugesetzt, so dass die Organismen, aus LA und ALA
als Vorstufen, die FS ARA und EPA produzieren (DONG & WALKER 2008).
Auch Moose der Gattung Physcomitrella sind in der Lage EPA und ARA zu
produzieren (SENGER et al. 2005). Sie spielen daher momentan für die Erforschung
der Fettsäurebiosynthese für EPA und ARA eine Rolle (KAEWSUWAN et al. 2006)
1.4.2. Transgene Pflanzen
Für Zwecke der industriellen Nutzung und Ernährung werden derzeit jährlich ca. 100
Mio Tonnen Pflanzenöl produziert (DREXLER et al. 2003). Höhere Pflanzen sind
natürliche „Ölfabriken“, die effizient mit reinem Sonnenlicht arbeiten. In den letzten
Jahren wurde intensiv an den Biosynthesewegen von LC-PUFAs geforscht
(GALANINA & KONOVA 1998; MICHAELSON et al. 1998; SPERLING & HEINZ 2001) und die
DNA- Sequenzen der verantwortlichen Enzyme für die Synthese von DHA und EPA
aus Niederen Pflanzen wurden aufgeklärt (BEAUDOIN et al. 2000a; BEAUDOIN et al.
2000b; DOMERGUE et al. 2002; NAPIER & MICHAELSON 2001; SAYANOVA & NAPIER
2004). Es gibt aktuell mehrere Forschergruppen, die versuchen, über den
Gentransfer von Enzymen aus Niederen Pflanzen (Pilzen, Algen oder Moosen) in
Raps und Soja EPA und DHA zu produzieren (NAPIER et al. 2004; QI 2004; ROBERT
2006; TONON et al. 2005). Ins Genom eingebaute Elongasen und Desaturasen sollen
aus ALA die FS EPA und DHA produzieren (URSIN 2003; WU et al. 2005). Auf diese
Weise wird es bald Landpflanzen geben, die LC-PUFAs synthetisieren können
(GRAHAM et al. 2007; URSIN 2003).
1.5. Problematik alternativer Quellen
Niedere Pflanzen sind, was die Quantitäten von DHA angeht, zwar sehr gute
Alternativen zu Meeresfisch. Die Produktion in Bioreaktoren sowie die Aufreinigung
des Öls kosten jedoch sehr viel Energie und setzen ein Höchstmaß an Technik
voraus. Mikroalgen und Oomyceten produzieren vorwiegend nur eine LC-PUFA, d.h.
es wird entweder viel EPA oder viel DHA produziert. Ölkapseln sind zudem keine
Form natürlicher Ernährungsweise und nicht jeder kann sich Ölkapseln aus der
Apotheke leisten, da eine teure Produktion auch teure Produkte hervorbringt.
1. Einleitung
11
Die Biosynthese von EPA oder DHA in Ölen Höherer Pflanzen ist bisher noch im
Forschungsstadium. Das gezielte Einbringen der Gene an die Orte, wo später die
Fettsäurebiosynthese und Speicherung stattfindet, stellt immer noch eine große
Herausforderung dar (CSIRO 2005; DREXLER et al. 2003).
In der Bevölkerung gibt es zudem für gentechnisch modifizierte Nahrungsmittel
wenig Akzeptanz, da die Folgen für Mensch und Umwelt nicht abschätzbar sind.
1.6. Aktueller Stand der Forschung und Zielsetzung d er Arbeit
Der Falsche Mehltau der Sonnenblume Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. & DeToni
(1888) und der Falsche Mehltau auf Salat Bremia lactucae Regel (1843) gehören,
wie die bereits erwähnten Taxa Schizochytrium oder Thraustochytrium, ebenfalls zu
den Oomycota. Sie sind jedoch nicht heterotroph im Reaktor kultivierbar sondern
wirtsspezifisch und von der lebenden Wirtspflanze abhängig (obligat biotroph). Sie
schädigen die Pflanze nur begrenzt und bilden keine Toxine. Die Fettsäure-
zusammensetzungen dieser Gattungen sind taxonspezifisch und können zu
systematischen Zwecken benutzt werden (SPRING & HAAS 2002; SPRING & THINES
2004; SPRING et al. 2005). Sowohl B. lactucae als auch P. halstedii produzieren die
Fettsäure EPA zu einem erheblichen Anteil ihres Fettsäuremusters, lassen sich
jedoch wegen ihrer biotrophen Lebensweise nicht direkt zur Gewinnung von EPA
nutzen.
Bei der bisherigen Suche nach alternativen Quellen zur Produktion von LC-PUFAs
wurden die Organismen isoliert betrachtet. Es wurde nicht berücksichtigt, dass
obligat-biotrophe Oomyceten zusammen mit ihrem Wirt ein mögliches Potenzial für
die menschliche Ernährung mit LC-PUFAs besitzen könnten.
Das Ziel dieser Arbeit war es, die Nutzungsmöglichkeit der Falschen Mehltaupilze
von Sonnenblume und Salat in Kombination mit ihren Wirten als n-3-FS-Lieferanten
zu erforschen. Hintergrund dafür war der Gedanke, eine alternative und gentechnik-
freie Quelle für LC-PUFAs zu finden, deren Produktion durch ein natürliches,
energetisch günstiges, System geschieht. Dabei war der Blick besonders auf die FS
EPA gerichtet. Eventuell konnte mit Hilfe spezieller, optimierter Kultivierungs-
techniken genügend EPA produziert werden, um in der menschlichen Ernährung
genutzt zu werden.
1. Einleitung
12
Als Basis für die Bewertung des Nutzungspotenzials infizierter Nutzpflanzen dienten
die Anwendung und die Weiterentwicklung von Infektions- und Anzuchtmethoden für
genetisch homogenes Sporangienmaterial von P. halstedii und B. lactucae sowie
vergleichende Fettsäureanalysen. Um zusätzlich zum bisherigen Forschungsstand
die Fettsäurezusammensetzung verschiedener Lipidklassen zu untersuchen, wurden
für diese Arbeit für die Aufbereitung von Oomycetenlipiden kombinierte Methoden
der Dünnschichtchromatographie (DC) und Gaschromatographie (GC) angewandt.
Die Fettsäuremuster und -konzentrationen der Modellsysteme Sonnenblume/ P.
halstedii und Salat/B. lactucae wurden mit Hilfe der Gaschromatographie (GC)
qualitativ erfasst und quantifiziert (Kapitel 2), mit dem Ziel, diese für die menschliche
Ernährung qualitativ und quantitativ zu bewerten.
Es wurde angenommen, dass die produzierten EPA-Gehalte von Sporangien und
infiziertem Pflanzengewebe beeinflusst und erhöht werden konnten. Um dies zu
zeigen, wurden verschiedene Versuche zur Erhöhung des EPA-Gehaltes von
Sporangien und infiziertem Blattmaterial in Kapitel 3 durchgeführt. Das Wirt-
/Pathogen-System Sonnenblume/P. halstedii diente als Modellbeispiel, da die
Kultivierungstechnik bekannt und mit vielen Isolaten und Stämmen am Institut für
Botanik etabliert war (ROZYNEK 2000; SPRING et al. 1997). Zunächst wurden über
artinternes Screening zwischen Sporangienstämmen genotypische Unterschiede in
der EPA-Konzentration erforscht. Dann wurde nach besonders anfälligen
Wirtspflanzen gesucht und über die Variation des Infektionsdrucks versucht, den
EPA-Gehalt im infizierten Blattmaterial zu optimieren. Ebenso galt es, die
Auswirkungen von Stickstoff auf Wachstum und EPA-Konzentration infizierter
Pflanzen zu untersuchen.
Um die praktische Relevanz des Systems Wirt/Falscher Mehltaupilz für die
Nahrungskette zu erforschen (Kapitel 4), wurde mit Salat/B. lactucae und Hühnern
ein Versuch zur Anreicherung von EPA über die Nahrungskette durchgeführt. Es
wurde getestet, ob eine 10%ige Futterbeimischung von infiziertem Salat dazu
geeignet ist, über den Stoffwechsel des Huhnes den n-3-FS Gehalt im Eidotter zu
verbessern. Die spezielle Frage war, ob sich EPA aus B. lactucae infiziertem Salat
als Zusatz in Hühnerfutter im Eidotter als EPA oder DHA anreichern würde.
Abschließend wurde das Potenzial von infizierten Nutzpflanzen als n-3-FS-Quellen
für die menschliche Ernährung bewertet (Kapitel 5).
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
13
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrati onen in Spo-
rangien und infiziertem Pflanzengewebe
Mit Hilfe spezieller Anzucht- und Infektionstechniken sollten infiziertes Pflanzen-
gewebe sowie genetisch homogenes Sporangienmaterial produziert werden, um die
enthaltenen EPA-Konzentrationen erfassen zu können. Die Fettsäuremuster der
Gesamtlipidextrakte von Sporangien von B. lactucae und P. halstedii wurden für
taxonomische Zwecke am Institut für Botanik bereits qualitativ und prozentual
aufgeklärt und beschrieben (SCHÄUFFELE 2005). Um genaue Angaben zu den EPA-
Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflanzengewebe machen zu können,
musste für diese Arbeit zusätzlich ein GC-Verfahren erarbeitet werden, mit dem eine
verlässliche Quantifizierung möglich war.
Ergänzend zum bisherigen Forschungsstand wurden Untersuchungen darüber
durchgeführt, wie die Fettsäuren in den einzelnen Lipidklassen von P. halstedii und
B. lactucae verteilt sind. Für Mikroalgen werden solche Analysen auf Grund
chemotaxonomischer und ökonomischer Interessen aktuell durchgeführt (CHEN et al.
2008; SANINA et al. 2008). Am Ende des Kapitels konnte so ein Vergleich der
qualitativen Beschaffenheiten der FS-Muster sowie der FS-Zusammensetzungen der
einzelnen Lipidklassen stattfinden. Zudem wurden die EPA-Produktivitäten verschie-
dener Systeme miteinander verglichen.
2.1. Materialien und Methoden
2.1.1. Infektionstechniken und Ernte
Feldisolate genetisch homogener Einzelsporenisolate von P. halstedii standen am
Institut für Botanik zur Verfügung. Die Stämme BL-11.06-02-A4z, GG-16.10.07-A25,
He-10.01.06-A8, LS-13.12.05-C6 wurden für taxonomische Zwecke mit Einzel-
sporangien oder Einzelsporen aus Feldisolaten generiert und vermehrt (SPRING et al.
1998). Die Inokulation der Pflanzen erfolgte im Keimlingsstadium nach der WSI
(whole seedling infection)- Methode (COHEN & SACKSTON 1973; ROZYNEK 2000). Zur
Anzucht und Vermehrung von P. halstedii wurde die Sonnenblumensorte Giganteus
verwendet, die als besonders anfällig gilt.
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
14
Ein Feldisolat von B. lactucae konnte im Rahmen dieser Arbeit von Salatpflanzen der
Versuchsstation für Gartenbau (Hohenheim) isoliert werden. Die Salatsorte Cobham
Green diente der Anzucht und Vermehrung von B. lactucae (DATNOFF et al. 1994).
2.1.1.1. Keimlingsinfektion bei P. halstedii
Für die Infektion wurden 20 Sonnenblumensamen verschiedener Sorten bzw. Linien
mit dest. Wasser gewaschen und in Petrischalen auf feuchtem Filterpapier bei 25 °C
im dunklen Wärmeschrank für 24 h angekeimt. Gleichzeitig standen ca. 14 Tage alte,
stark infizierte Sonnenblumen zur Verfügung, deren Keimblätter voll entwickelt
waren.
Abb. 2.1.: P. halstedii. Links: Sporangien mit schlüpfenden Zoosporen. Rechts: Infizierte Sonnenblu-
me nach induzierter Sporulation.
Der Erreger, der sich 14 Tage lang latent im Sonnenblumengewebe vermehrt hatte,
wurde über Nacht in einer nassen, geschlossenen Styroporbox zur Sporulation
gebracht, so dass am nächsten Tag ein weißer Rasen frischer, infektionsfähiger
Sporangien auf den Keimblättern zu sehen war (Abb. 2.1.).
Die angekeimten Sonnenblumensamen wurden mit einer Pinzette von ihren Schalen
befreit, unter dest. Wasser in einem Sieb abgespült und in ein Becherglas mit 20 ml
dest Wasser überführt. Zwei bis vier infizierte Keimblätter der sporulierenden
Sonnenblumen wurden in das Becherglas gegeben und die Sporangien gründlich mit
Wasser vom Blatt gespült. Die Konzentration der Sporangien/ml Inokulum wurde
lichtmikroskopisch mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer bestimmt und durch
entsprechende Verdünnung auf den gewünschten Wert eingestellt. Die Keimlinge
wurden ca. 4 h abgedunkelt bei 16°C im Infektionsinoku lum belassen, damit die
Zoosporen schlüpfen konnten (Abb. 2.1.). Die Schlüpfrate der Zoosporen wurde
mikroskopisch kontrolliert und lag meist zwischen 70 und 100 %. Die Zoosporen
10 µm
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
15
bildeten Keimschläuche, die in das Wirtsgewebe eindrangen. Nach 4 h Inkubation
wurden die Keimlinge in eine Pflanzschale mit Einheitserde gepflanzt und mit dest.
Wasser und dem restlichen Inokulum gleichmäßig bewässert. Die Pflanzschalen
wurden eine Nacht abgedunkelt und 14 Tage offen in den Klimaschrank gestellt (16/8
h Tag/Nacht, 16°C, 80% relative Luftfeuchte, Lichtint ensität (Photonenfluss) 30
µmol/m²•s). Nach 14 Tagen waren die Keimlinge bereits voll infiziert und reif für das
nächste Sporulationsereignis.
2.1.1.2. Blattinfektion bei B. lactucae
Für die Infektion mit B. lactucae wurde gesunder Salat im Klimaschrank angezogen,
bis er im 4-6 Blattstadium war (ca. 8 Wochen). B. lactucae wurde dann auf diesen
Salatblättern vermehrt, indem die Methode der Blattscheibeninfektion für Sonnen-
blumen (ROZYNEK & SPRING 2001; SPRING et al. 1997) etwas abgewandelt wurde.
Im Abstand von 3 Wochen wurde Salat der Sorte Cobham Green in 2 Schalen mit
Einheitserde gepflanzt und 8 bis 10 Wochen angezogen, so dass immer frische und
infektionsfähige Blätter zur Verfügung standen.
Aus stark befallenen und sporulierenden Salatblättern vom Feld bzw. aus neusporu-
lierendem, genetisch homogenem Material aus dem Klimaschrank wurde analog zu
den Versuchen mit P. halstedii ein Inokulum hergestellt. Die Sporangienmenge
wurde mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer auf die optimale Menge von
5000 Sporangien/ml eingestellt. Im Unterschied zu P. halstedii bildeten die Sporan-
gien von B. lactucae unter genannten Bedingungen direkt Keimschläuche und
entließen keine Zoosporen (Abb. 2.2.).
Abb. 2.2.: B. lactucae. Links: Keimendes Sporangium von B. lactucae mit Keimschlauch und Plasma.
Rechts: Sporulierender Erreger mit weißem Sporangienrasen auf der Blattunterseite von jungem
Salat.
5 µm
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
16
Die Infektion selbst erfolgte in großen, flachen, lichtdurchlässigen und verschließ-
baren Plastikschalen. Diese wurden mit feuchtem Papier ausgelegt, worauf 8
Wochen alte, gesunde Salatblätter platziert wurden. Das Inokulum wurde mit einer
1ml Pipette aufgezogen und tropfenweise, gleichmäßig auf die Salatblätter verteilt.
Die lichtdurchlässigen Plastikschalen wurden geschlossen und in den Klimaschrank
(16/8 h Tag/Nacht, 20°C, 80% relative Luftfeuchte, Li chtintensität (Photonenfluss) 30
µmol/m²•s) gestellt. Nach ca. 7-10 Tagen fand auf der Oberfläche (meist zu 80-100
%) der Salatblätter spontan die Neusporulation statt (Abb. 2.2.).
2.1.1.3. Ernte und Lagerung von Sporangien und Pfla nzenmaterial
Die Sporangien von P. halstedii und B. lactucae mussten, um den Fettsäuregehalt
untersuchen zu können, von den Pflanzenoberflächen möglichst schonend, komplett
und verlustfrei geerntet werden. Dies geschah mit einer Mikroabsaugvorrichtung
(ROZYNEK 2000), die als Deckel auf ein 2 ml Reaktionsgefäß passte. Sie funktionierte
nach dem Unterdruckprinzip mit einem Teflonschlauch, der an eine Wasserstrahl-
pumpe angeschlossen war. Durch den entstehenden Sog wurden die Sporangien der
Pflanzenoberflächen in das Reaktionsgefäß eingesaugt. Die Gefäße mit dem
eingesaugten Sporangien- und Hyphenmaterial wurden in Kryoboxen bei -20°C
gelagert, wo die Erreger haltbar und infektionsfähig blieben.
Um den EPA-Gehalt der infizierten Keimlinge und Salatblätter zu bestimmen, wurden
diese bei voller Infektion aber vor Sporulation geerntet, um keine Verluste während
der Ernte zu haben und gute Vergleichbarkeit zu garantieren. Die infizierten
Pflanzengewebe wurden für die FS-Analyse in einem geöffneten Reaktionsgefäß bei
Raumtemperatur (RT) im Exsikkator 4 Tage getrocknet. Das getrocknete Pflanzen-
gewebe wurde, ebenfalls wie die Sporangien, auf die EPA-Konzentration hin
untersucht.
2.1.2. Aufbereitung der Fettsäuren für die GC-Analy se
Um die verschiedenen Gehalte an EPA und anderen FS verschiedener Proben
miteinander vergleichen zu können, war eine verlässliche Standard-Analytik notwen-
dig. Für die Erfassung der FS-Profile von Oomyceten wurde die Gas-Chromato-
graphie (GC) mit Kapillarsäulen zur Flüssigaufgabe und Flammenionisationsdetektor
(FID) verwendet (SPRING & HAAS 2002). Diese Technik gilt auch in der Lebensmittel-
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
17
industrie als Standardmethode zur Quantifizierung und Analyse von Fettsäuremethyl-
estern (FAMEs) und wird ausdrücklich von der „American Oil Chemists Society“
(AOCS) empfohlen (SHANTHA & NAPOLITANO 1992). Die Bestimmung und Identifika-
tion der FAMEs in den Proben basierte auf identischen Retentionszeiten von Proben-
peak und externem Standard. Die Probenaufbereitung selbst bestand aus zwei
Schritten: 1. Extraktion der Gesamtlipide mit Lösungsmittel, 2. Abspalten der FS von
ihren Lipidklassen und Derivatisierung in leicht verdampfbare Methylester.
2.1.2.1. Extraktion der Fettsäuren
Materialien: Sporangien, infiziertes Pflanzenmaterial, Stahlkugeln, Vakuumkonzen-
trator (Bachofer, Reutlingen), Waage (sartorius research, Sartorius, Göttingen), Zen-
trifuge (Biofuge 13, Heraeus, Hanau), Schüttelmühle (Retsch, Haan), n-Hexan (p.a.,
Merck, Darmstadt), 2 ml Glasgefäße für chromatographische Zwecke, 2 ml Plastik-
reaktionsgefäße.
Sporangien
Für die GC-Analyse der FS reichten Sporangien in kleinsten Mengen, daher wurde
mit Lösungsmittelmengen im µl Bereich gearbeitet. Da Sporangien in lipophilem
Lösungsmittel sehr schnell aufplatzten und ihren Inhalt freigaben, war eine einmalige
Zugabe von n-Hexan ausreichend, Extraktion und Methylierung erfolgten daher in
einem Schritt (LEPAGE & ROY 1984; MEIER et al. 2006).
Zu ca. 0,5 mg Sporangien wurden 150 µl n-Hexan gegeben. Die Methylierungsrea-
genzien wurden dem Proben/n-Hexan-Gemisch direkt zugesetzt, wonach die Säure-
katalysierte Veresterung der FS für die GC-Analyse durchgeführt wurde. Jeder Probe
wurde vor Extraktion/Methylierung ein 17:0 oder ein 23:0 Standard (vgl. Kap. 2.1.4.)
in definierter Konzentration zugesetzt.
Pflanzenmaterial
Das Pflanzenmaterial wurde dagegen in 2 Schritten extrahiert und methyliert.
Die Proben (0,05-0,5 g) wurden auf einer Analysenwaage eingewogen und in einem
2 ml Plastikreaktionsgefäß mit einer Schüttelmühle 5 min bei 70 Schwingungen/min
mit 2 Stahlkugeln fein zermahlen. Jeder Probe wurden die Fettsäuren 17:0 bzw. 23:0
in einer definierten Konzentration als interner Standard zugesetzt. So konnte man
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
18
spätere Verluste an Fettsäuren während der Verarbeitung korrigieren. Die Lipide der
Proben wurden 3x30 min mit 150 µl n-Hexan extrahiert. Die Lösungsmittelphasen mit
Lipiden wurden bei 13000 Upm für 2 min abzentrifugiert und in 2 ml Reaktions-
gefäßen vereint. Das Lösungsmittel wurde bei RT für 30 min im Vakuumkonzen-
trator abgedampft. Die Lipide wurden in 150 µl n-Hexan aufgenommen und in 2 ml
Glasgefäße für die GC überführt. Sie wurden anschließend für die GC-Messungen
derivatisiert.
2.1.2.2. Säure-katalysierte Veresterung der Fettsäu ren für die GC-Analyse
Die FS mussten aus ihren Lipidgerüsten abgespalten und in leicht verdampfbare
Fettsäuremethylester (FAMEs) überführt werden. Bortrifluorid in Methanol ist eine
Lewis-Säure und katalysiert die Abspaltung der FS von den Lipidgerüsten sowie die
Neuveresterung der Säuregruppen der FS mit einer Methylgruppe.
Im Gegensatz zur Basen-katalysierten Veresterung werden bei der Säure-kataly-
sierten Veresterung die FS aller Lipidklassen, auch Freie FS, in ihre Methylester
überführt (SHANTHA & NAPOLITANO 1992).
Die Derivatisierung der FS zu FAMEs erfolgte säurekatalysiert mit Bortrifluorid–
Methanolkomplex (SPRING et al. 2005). Da die Veresterung mit Bortrifluorid–Metha-
nolkomplex auch in der Lebensmittelchemie als Standardmethode der AOCS
empfohlen wird (ACKMAN 1998; SHANTHA & NAPOLITANO 1992), konnte diese etablier-
te Methode unter geringer Abwandlung beibehalten werden.
Materialien: Spritze (10 µl ml, SGE, Griesheim) zur Flüssigprobenaufgabe am GC,
Thermoblock (Pierce reacti-therm, Thermo Fisher Scientific, Illinois, USA), Bortri-
fluorid-Methanolkomplex (p.a.,20%, Merck, Darmstadt), Petrolether (Riedel-de Haën,
Taufkirchen), tertiärer Butylmethylether (TBME) (p.a., Merck, Darmstadt), H20 dest,
Isooctan (p.a., Merck, Darmstadt), Stickstoff gasförmig (Reinheit 4.6, 5.0), Pasteur-
pipetten, Eppendorfpipetten, Supelco 37 Komponenten-Standard (Sigma-Aldrich,
Taufkirchen), EPA-Methylester (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), Heptadecansäure
(17:0) (Fluka, Taufkirchen).
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
19
Den Proben wurden 50 µl TBME als Lösungsvermittler und 250 µl Bortrifluorid-
Methanolkomplex zugesetzt. Bei 90°C im Thermoblock wurd en die FS von ihren
Esterbindungen abgespalten (Verseifung) und neu verestert. Die Proben mussten ca.
10 min bei RT abkühlen. Für die anschließende Phasentrennung wurden 500 µl
Petrolether sowie 500µl dest. Wasser zugesetzt und die Proben wurden gründlich
ausgeschüttelt. Die Petroletherphase wurde abpipettiert und im Stickstoffstrom
abgedampft. Die FAMEs wurden in 30-50 µl Isooctan aufgenommen und in 2 ml
Glasgefäßen bei -20°C bis zur Messung am GC gelagert.
2.1.3. GC-FID Messtechnik
Da es für die Quantifizierung der FS entscheidend ist, wie die Proben aufgegeben
werden (SCHREINER 2005), welche Säulen verwendet werden, wie die Temperatur-
programme geregelt sind und welcher Messbereich gewählt wird, soll kurz darauf
eingegangen werden.
2.1.3.1. Kalibrieren des Messbereiches
FID-Detektoren sind massenabhängig (SCHOMBURG 1987). Das elektrische Signal,
das am FID gemessen wird ist proportional zur Probenmenge. Um den linearen
Bereich des FID zu verifizieren und eine verlässliche Quantifizierung zu ermöglichen,
wurde eine bekannte Konzentration EPA-Methylester in unterschiedlicher Menge
eingespritzt (ACKMAN et al. 1963). Die Linearität der Messbereiche war stets mit
einem Bestimmtheitsmaß von über 99% gegeben. Es wurde je nach Proben-
konzentration mit „Range 0“ und „Range 1“ gearbeitet, wobei „Range 0“ das
empfindlichste Detektionsfenster darstellte, mit dem noch pg-Mengen an Substanzen
in Proben nachgewiesen werden konnten. „Range 1“ war um den Faktor 10 weniger
empfindlich und für höher konzentrierte Proben mit Fettsäuremengen im ng-Bereich
und µg-Bereich geeignet. Proben höherer Konzentration belasteten jedoch die
empfindlichen Säulen, was zu deaktivierten Stellen und Säulenbluten führte. Daher
wurde auf niedrigere Empfindlichkeitsstufen (Range 2 etc.) verzichtet, indem die
Proben so verdünnt wurden, dass bei Range 0 oder Range 1 gemessen werden
konnte.
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
20
2.1.3.2. Einspritztechnik/Probenaufgabe
Die Proben wurden in einer flüssigen Isooctan-Matrix mit einer 10 µl Spritze mit
Stahlkolben aufgegeben. Da jede Probe manuell eingespritzt wurde, war es für eine
reproduzierbare und verlässliche Quantifizierung nötig, eine präzise Einspritztechnik
anzuwenden (ACKMAN et al. 1963). Daher wurde die Probenaufgabe stets von
derselben Person durchgeführt. Es wurde die Kaltnadel-Technik („solvent flush cold
needle“) angewendet (SCHOMBURG 1987). Dazu wurden zwischen 0,5 und 2 µl
Flüssig-Probe aufgezogen. Zur Probe wurde zusätzlich 0,5 µl Luft aufgezogen und
sie wurde ohne Wartezeit in den Injektor gespritzt.
2.1.3.3. Säulen
Für die Fettsäure-Analytik am GC-FID wurden in dieser Arbeit gebundene Silika-
Kapillarsäulen („fused silica“) als stationäre Phasen verwendet. Dieser Säulentypus
gilt aktuell für die Trennung von FS als der Beste (ACKMAN 2002). Die Säulen werden
meist nach dem Polaritätsindex eingeteilt der von 0 (unpolar, Innenbeschichtung mit
Squalan) bis 100 (polar, Innenbeschichtung mit Cyanopropylpolysiloxan oder
Polyethylenglykol) reicht. Für diese Studie wurden polare Säulen verwendet, da
unpolare Säulen die ungesättigten FS der Kohlenstofflänge 18 schlecht bis gar nicht
trennen, ebenso wenig die ungesättigten FS der Kohlenstofflänge 20 und 22
(SHANTHA & NAPOLITANO 1992). Diese ungesättigten FS werden auf polaren Säulen
dagegen gut getrennt. Die Auftrennung auf der Säule erfolgte nach Polarität (Anzahl
der Doppelbindungen) und Kettenlänge der enthaltenen FAMEs. Je länger die Koh-
lenstoffkette und je mehr Doppelbindungen, desto länger die Retentionszeit der
FAMEs. Isomere eluieren schneller, je näher die Doppelbindung an der COOH-
Gruppe liegt, also 18:1 n-9<18:1 n-7<18:2 n-6 <18:3 n-3. Die polaren stationären
Phasen ermöglichen sogar die Trennung von cis- und trans-Isomeren, was sie für die
moderne Fettsäureanalytik besonders attraktiv macht (Abb. 2.3., 2.4.). Jedoch
können auch auf den besten polaren Säulen nicht alle FS voneinander getrennt
werden. Dieses Problem kann jedoch dadurch gelöst werden, dass nacheinander mit
2 verschiedenen Säulen gearbeitet wird. In dieser Arbeit wurde mit den polaren
Säulen CP7419 (Varian, Middelburg, Niederlande) und DB-23 (J&W Scientific,
Folsom, USA) analysiert, die folgende Spezifikationen aufweisen: DB-23: 30 m,
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
21
Filmdicke 0,25 µm, Innendurchmesser (ID) 0,25 mm. CP7419: 50 m, Filmdicke 0,25
µm, ID 0,25 mm.
Abb . 2.3.: Standardlauf der FAMEs mit 37 Komponenten-Standard, Säule DB-23
1: 8:0+10:0, 2: 11:0, 3: 12:0, 4: 13:0, 5: 14:0, 6: 14:1, 7: 15:0, 8: 15:1, 9: 16:0, 10: 16:1, 11: 17:0, 12:
17:1, 13: 18:0, 14: 18:1 n-9 trans, 15: 18:1 n-9 cis, 16: 18:2 n-6 trans, 17: 18:2 n-6 cis,: 18: 18:3 n-6,
19: 18:3 n-3, 20: 20:0, 21: 20:1, 22: 21:0, 23: 20:2, 24: 20:3 n-6, 25: 20:3 n-3, 26: 20:4 n-6, 27: 20:5 n-
3 + 22:0, 28: 22:1, 29: 23:0. 30: 22:2, 31: 24:0 + 24:1, 32: 22:6 n-3
Abb. 2.4. : Standardlauf der FAMEs mit 37 Komponenten-Standard, Säule CP7419
1: 6:0, 2: 8:0, 3: 10:0, 4: 11:0, 5: 12:0, 6: 13:0, 7: 14:0, 8: 14:1, 9: 15:0, 10: 15:1, 11: 16:0, 12: 16:1, 13:
17:0, 14: 17:1, 15: 18:0, 16: 18:1 n-9 trans, 17: 18:1 n-9 cis, 18: 18:2 n-6 trans, 19: 18:2 n-6 cis, 20:
18:3 n-6, 21: 18:3 n-3 + 20:0, 22: 20:1, 23: 21:0, 24: 20:2, 25: 20:3 n-6, 26: 20:3 n-3 + 20:4 n-6 + 22:0,
27: 22:1, 28: 20:5 n-3 + 23:0, 29: 22:2, 30: 24:0, 31: 24:1, 32: 22:6 n-3
1
2 3
4
5
6
7
8 9 10
11
12 13
14
15
16
17
18
19 21
20 22
24
23
25
26
27
28
29 30
31 32
1
2
3
4
5
6 7
8
9
10
11
12
13
14
15
16 17
18
19
20
21 221-
24-
23-
25- 26
-
27
28 29
30
31
32
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
22
Beide Säulen-Innenbeschichtungen bestehen zu mindestens 80% aus Cyanopropyl-
polysiloxan. Herstellerangaben zur genauen Beschaffenheit existieren nicht.
Über die Kombination dieser Standardläufe waren alle FAMEs ihren Retentionszeiten
zuordenbar. Der qualitative und quantitative Vergleich der Fettsäuremuster erfolgte
an beiden Säulen über den Supelco 37 Komponenten-Standard (Sigma-Aldrich,
Taufkirchen).
Auf der Säule DB-23 (Abb. 2.3.) waren die FS EPA (20:5 n-3) und 22:0 an Position
27 des Chromatogramms sehr dicht aufeinander. Eine Trennung der Peaks war nur
schwer möglich. Die anderen versuchsrelevanten FS wurden gut getrennt. ALA (18:3
n-3) lief an Position 19.
Auf der Säule CP7419 gab es ebenfalls Koelutionen von FS. EPA koeluierte mit 23:0
an Stelle 28 (Abb. 2.4.). Da 23:0 in biologischem Material aber sehr selten oder gar
nicht vorkommt, spielte das keine Rolle. Als interner Standard konnte 23:0 auf dieser
Säule nur dann nicht verwendet werden, wenn EPA quantifiziert werden sollte. An
Position 26 im Chromatogramm koeluierten die FS 20:3 n-3, ARA (20:4 n-6) und
22:0.
Durch wechselseitiges Einspritzen der Proben an beiden Säulen und die Quantifi-
zierung über einen mitgeführten Internen Standard konnte die Koelutions-Proble-
matik beseitigt werden.
2.1.3.4. Temperaturprogramme und Gassystem
Gassystem: Trägergas: Helium 4.6, Schönungsgas: Wasserstoff 5.0, Brenngase:
Wasserstoff 5.0 und Luft (KW frei).
Software: Class-VP (Shimadzu, Japan).
DB-23: Säulen-Temperaturprogramm: Vorsäulen- und Säulentemperatur 140°C (1
min), Aufheizrate 5°C/min auf 240°C (9 min). Injekt ortemperaturprogramm: 150°C (1
min), Aufheizrate 6°C/min auf 240°C (14 min).
CP7419: Säulen-Temperaturprogramm: Vorsäulen- und Säulentemperatur 120°C,
Aufheizrate 4°C/min auf 240°C. Injektortemperaturpro gramm: 150°C, Aufheizrate
4°C/min auf 240°C (7,5 min).
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
23
2.1.4. Quantifizieren der FAMEs am GC-FID
Die qualitative und quantitative Bestimmung der FS erfolgte unter Verwendung
Interner Standards und Externer Standards.
Materialien: Supelco 37 Komponenten-Standard (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), EPA-
Methylester (Sigma-Aldrich, Taufkirchen), Heptadecansäure/Margarinsäure (17:0,
Fluka, Taufkirchen), Tricosansäure (23:0, Fluka, Taufkirchen).
Interne Standards
Als interne Standards (IS) wurden den Proben in definierten Konzentrationen die FS
17:0 oder 23:0 zugesetzt. Dies sind gängige IS in der Fettsäureanalytik, da sie als FS
mit ungerader Anzahl an Kohlenstoffatomen von Organismen selten produziert
werden. Damit konnte die Extraktionseffizienz ermittelt werden und die FAMEs
konnten ohne Überschneidungen quantifiziert werden. FS-IS wurden als Korrektur-
standards (Wiederfindung) während der Extraktion und der Methylierung zugesetzt
und gewährleisteten eine Kontrolle über die korrekte Probenverarbeitung, ein
korrektes Einspritzvolumen sowie eine exakte Quantifizierung (JOSEPH 1992;
SCHREINER 2005).
Mit Hilfe der IS 17:0 und 23:0 konnte auf die absolute Konzentration der Fettsäuren
bezüglich der Probengewichte zurückgerechnet werden.
FS unterschiedlicher Länge und Anzahl an Doppelbindungen zeigen bei selber
Konzentration verschiedene Signalstärken bzw. Signalflächen („Response“) am FID
(SCHREINER 2005). Die Signalflächen der FS 22:6 sind z.B. bei selber Ausgangs-
konzentration höher, als die der Fettsäure 20:5 und viel höher als die von 17:0. Über
Korrekturfaktoren („Responsefaktoren“) können diese Flächenabweichungen korri-
giert werden. Der Faktor für jede einzelne FS errechnet sich aus dem Konzen-
trations- und Signalflächenabgleich mit einem Mehrkomponentenstandard. Das Si-
gnalfläche zu Konzentrationsverhältnis einer FS mit dem Faktor 1 (meist 20:0) dient
als Basis für die Abweichungen der anderen FS. Da die Korrekturfaktoren für viele
FID-Systeme übereinstimmen, die Gehalte der FS also in selber Weise über- oder
unterbewertet werden, kann man auch nach entsprechender Geräte-Kalibrierung
einen Korrekturfaktor („Theoretischer Responsefaktor“) aus der Literatur verwenden
(ULBERTH et al. 1999).
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
24
In Kap. 3 dieser Arbeit wurden lediglich Wiederfindungskorrekturen mit dem IS 17:0
durchgeführt, denn ging es um vergleichende Studien unterschiedlicher Behand-
lungen, wobei nicht die absoluten Mengen entscheidend waren, sondern die Unter-
schiede der Mittelwerte. In Kapitel 4 erfolgte dagegen, erfolgte die Bestimmung der
absoluten Konzentrationen der Fettsäuren und EPA in Sporangien, Eidotter und
infiziertem Pflanzenmaterial empirisch mit dem 37 Komponenten-Standard (CRASKE
& BANNON 1987; ULBERTH et al. 1999).
Externe Standards
Die Verwendung externer Standards erfolgte zur Identifizierung der FS über die
Retentionszeiten (KOLB 2003). Es wurden absichtlich Substanzen gewählt, die in der
Probe enthalten waren und deren Retentionszeiten übereinstimmten. Der 37
Komponenten Standard wurde verwendet, da aufgrund der verschiedenen Prozent-
anteile der Einzelfettsäuren eine genaue Zuordnung durch die Retentionszeiten auf
der Säule möglich war. Es war außerdem sehr bequem, nicht jede Fettsäure die man
später identifizieren wollte, als Einzelstandard einspritzen zu müssen.
Um eine eindeutige Identifizierung von EPA oder einzelnen FS zu gewährleisten,
wurden zusätzlich einzelne FAMEs zur Absicherung der Retentionszeiten verwendet.
Mit Hilfe des externen Standards EPA-Methylester wurden die EPA-Gehalte der
Proben in Kapitel 2 über Eichkurven bestimmt und mit Eichkurven wurde auch der
FID kalibriert. Die absoluten EPA-Konzentrationen von Proben konnten durch die
Kombination einer externen Eichkurve mit EPA-Methylester und einem 17:0 oder
23:0 Wiederfindungsstandard ermittelt werden, was vom Prinzip her der Methode
des empirischen Korrekturfaktors entsprach (siehe Interne Standards).
Absicherung der FS-Identitäten
Die Identitäten der FS von Oomyceten der Gattungen Bremia und Plasmopara wur-
den im Rahmen von taxonomischen Arbeiten mittels GC-MS (Gaschromatographie-
Massenspektrometrie) über die molekularen Massenspektren und Retentionszeiten
bereits abgesichert (SPRING et al. 2005). Da mit demselben Säulen- und GC-System
gearbeitet wurde, konnten die GC-MS-Analyse-Ergebnisse auf diese Arbeit über-
tragen werden und es waren keine zusätzlichen Absicherungen nötig.
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
25
2.1.5. DC-Technik
Vom ernährungsphysiologischen Standpunkt sind die verschiedenen Lipidklassen
von Interesse, da nicht nur FS selbst, sondern auch die Lipidklassen Einfluss auf
Prozesse im menschlichen Körper nehmen (SCHNEIDER 2001). Die Charakterisierung
der Lipidklassen von potenziellen Lebensmitteln nimmt daher, neben der Fettsäure-
zusammensetzung oder –konzentration, eine zentrale Stellung in aktuellen For-
schungsarbeiten ein (CARVALHO et al. 2005; CHEN et al. 2008; PACETTI et al. 2005). So
werden Phospholipide als besonders günstig für die Gesundheit eingeschätzt und als
Zutat für „functional food“ postuliert (SCHNEIDER 2001), Acylglyceride gelten ebenfalls
als positiv, Freie FS sind dagegen aufgrund ihrer starken Oxidationsanfälligkeit nicht
gerne in Lebensmitteln gesehen (MARSHALL et al. 1994). Daher werden Lebensmittel
und potenzielle Lebensmittel, wofür auch die Oomyceten in dieser Arbeit betrachtet
wurden, auf die Zusammensetzung ihrer Lipide untersucht. Da eine diesbezügliche
Untersuchung für obligat-biotrophe Oomyceten aufgrund der schwierigen Kultivier-
barkeit noch nicht durchgeführt wurde, bot sich die Analyse der Lipidzusammen-
setzung für diese Arbeit an.
Um die Lipidklassen von P. halstedii und B. lactucae voneinander zu trennen und
ihre Fettsäurezusammensetzungen zu ermitteln, wurde kombiniert mit DC und GC
gearbeitet.
Es werden 2 Lipidgruppen unterschiedlicher chemischer und biologischer Eigen-
schaften beschrieben. Hierzu gehören die Fettsäurederivate und die Steroidderivate
(LOTTSPEICH & ENGELS 2006). Zur Lipidgruppe der Fettsäurederivate zählen die
Lipidklassen der Freien FS, der Acylglyceride (Mono-, Di-, Tri-, Glyko-), der Phospho-
lipide (PL) und Wachse, da sich von diesen Lipidgruppen, im Gegensatz zu Ste-
roiden, Sphingolipiden und Alkanen, Fettsäuregruppen chemisch abspalten lassen.
Die Lipidklassen wurden über DC nach einem Standardverfahren (BELITZ et al. 2001;
PACETTI et al. 2005; SCHREINER et al. 2005) aufgetrennt und die Banden aus dem
Kieselgel herauspräpariert. Die enthaltenen FS wurden danach in einem Schritt
extrahiert, methyliert und am GC als FAMEs detektiert.
Stationäre Phase: Kieselgelplatten Alugram Sil G 60, Schicht 0,2 mm (Nr. 818162,
Macherey-Nagel, Düren), DC-Standards: Cholesterin (Nr. 3670, Merck, Darmstadt),
Triolein (Nr. T7140, Sigma-Aldrich Taufkirchen,), Sphingomyelin (Nr. 85615, Fluka,
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
26
Taufkirchen), L-α-Phosphatidinositol (Nr. P6636, Sigma-Aldrich, Taufkirchen), Hepta-
decaensäure (Nr. 51633, Fluka, Taufkirchen), L-α-Lecithin (Nr. 42556, Fluka, Tauf-
kirchen). Mobile Phase: Petrolether/Diethylether/Essigsäure (90+10+1 v/v/v).
Detektionsreagenz: 2’,7’-Dichlorfluorescein (Nr. 410217, Sigma-Aldrich, Taufkirchen)
0,05% in Methanol (99,8%, Fluka, Taufkirchen,).
Herstellung der Probenextrakte von P. halstedii und B. lactucae
50 mg Sporangienpulver ohne Hyphenanteil von P. halstedii (Stamm GG-16.10.97-
A25) und 40 mg von B. lactucae (Feldisolat der Versuchsstation für Gartenbau,
Hohenheim) wurde mit 100 µl n-Hexan/TBME/Methanol 80+15+5 v/v/v 3mal für je 30
min extrahiert. Die Proben wurden 2 min bei 30000 rpm abzentrifugiert, die
Überstände wurden vereinigt.
Um alle Lipidklassen quantitativ zu extrahieren, wurde ein Gemisch aus polarem
(Methanol), mittelpolarem (TBME) und unpolarem (n-Hexan) Lösungsmittel verwen-
det, da die Lipide selbst verschiedene Polaritäten besitzen und sich danach die
Lösungseigenschaften richten. Phospholipide sind polarer als Freie FS, Freie FS
sind etwas polarer als Acylglyceride.
Herstellung der Standard Lösungen
Für jede Lipidklasse wurden repräsentative Standards gewählt und in der Konzen-
tration 5 mg/ml in Lösungsmittel n-Hexan/TBME/Methanol (80+15+5 v/v/v) gelöst
(PACETTI et al. 2005; SCHREINER et al. 2004):
Cholesterin (Sterine), Triolein (Triacylglyceride), L-α -Phosphatidylcholin (Phospho-
lipide), Sphingomyelin (Sphingophospholipide), L-α-Phosphatidinositol (Glycerophos-
pholipide), C17:0 (Freie FS).
Je 500 µl aus den Standardlösungen wurden entnommen und in einer Standard-
mischung vereint.
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
27
Durchführung der DC
Die Kieselgelplatten wurden mit Aceton vorgewaschen. Mit Glaskapillaren wurden
die Lipidproben der Oomyceten komplett (je 300 µl) und die Standards in 5 cm
langen Banden im Abstand von 1 cm vom Unterrand der DC-Platte aufgetragen.
Die Detektion erfolgte durch Besprühen mit 2’,7’-Dichlorfluorescein (0,05% in
Methanol) und Betrachten unter UV-Licht (254 nm).
Um herauszufinden in welcher Lipidklasse welche FS vorhanden waren, wurden die
Einzelbanden der Lipide, von denen Fettsäuren abgespalten werden konnten, näm-
lich Phospholipide, Freie FS und Triacylglyceride aus dem Kieselgel präpariert und in
2 ml Glasgefäße für die GC überführt.
Da auf den Ebenen der Di- und Monoacylglyceride kaum Banden sichtbar waren,
wurde auf deren weitere Fettsäure-Charakterisierung verzichtet.
Dem lipidhaltigen Kieselgelpulver wurden 100 µl n-Hexan und 50 µl TBME zugesetzt.
Die Lipide wurden unter Schütteln über Nacht bei RT extrahiert. Am nächsten Tag
wurden 250 µl Bortrifluorid-Methanolkomplex zu den Proben gegeben. Die Methy-
lierung und die Messung der FS am GC erfolgten wie unter Kapitel 2.1.2. bis 2.1.4.
beschrieben.
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
28
2.2. Ergebnisse
2.2.1. Qualitative Analyse der FS-Muster von P. halstedii und B. lactucae
Das FS-Muster aus dem Gesamtlipidextrakt der Sporangien von P. halstedii des
Stammes GG-16.10.97-A25 ist in Abb. 2.5. dargestellt. Die FS 16:0, 18:2 n-6 und
20:5 waren die 3 typischen Hauptfettsäuren der Sporangien von P. halstedii. EPA
(20:5 n-3) hatte mit ca. 37% Gesamtanteil den größten Anteil im FS-Muster.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
FAME
% a
m G
esam
tant
eil
Area% 2,60 16,88 0,53 0,49 5,04 24,13 0,55 3,04 1,32 0,97 1,55 4,41 36,76 0,22 0,44 0,45
14:0 16:0 16:1 18:0 18:118:2 n-6
18:3 n-6
18:3 n-3
20:1 20:2 20:320:4 n-6
20:5 n-3
22:1 22:222:6 n-3
Abb. 2.5.: FAMEs des Gesamtlipidextraktes aus P. halstedii (Stamm GG-16.10.97-A25).
0
5
10
15
20
25
30
35
FAME
% a
m G
esam
tant
eil
Area% 5,43 17,67 6,27 0,78 11,70 15,43 0,48 4,55 1,70 0,50 1,04 1,88 29,52 1,71 0,00 1,83
14:0 16:0 16:1 18:0 18:118:2 n-6
18:3 n-6
18:3 n-3
20:1 20:2 20:320:4 n-6
20:5 n-3
22:1 22:222:6 n-3
Abb. 2.6.: FAMEs des Gesamtlipidextraktes aus B. lactucae (Feldisolat von der Versuchsstation für
Gartenbau, Stuttgart-Hohenheim).
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
29
Die FS 18:2 n-6 war mit 24% Anteil am FS-Muster ebenfalls sehr stark vertreten,
gefolgt von 16:0 mit ca. 17% Anteil. ALA (18:3 n-3) war mit 3% am FS-Muster
vertreten. Weitere typische FS für P. halstedii mit ebenfalls hohen Anteilen am FS-
Muster waren 14:0, 20:4 n-6 und 18:1 n-9. Die LC-PUFA 22:6 n-3 war mit 0,4%
Anteil nur sehr schwach vertreten.
Sporangien von B. lactucae enthielten etwa 30% EPA im Gesamtlipidextrakt (Abb.
2.6.). Die FS 18:2 n-6 und 16:0 waren mit je 15-18% Anteil ebenfalls stark am
Gesamtfettsäuremuster vertreten. Die n-3-FS 18:3 n-3 und 22:6 n-3 waren mit ca.
5% und 2% stärker vertreten, als bei P. halstedii. Die FS 20:4 n-6 war im Extrakt von
P. halstedii mit durchschnittlich 4-6 % Anteil am Gesamtfettsäuremuster deutlich
stärker vertreten als bei B. lactucae mit nur ca. 1-2%. Die Verschiedenheit der Fett-
säuremuster ist artspezifisch und da es dazu bereits einschlägige Arbeiten gibt
(SCHÄUFFELE 2005), soll an dieser Stelle nicht näher darauf eingegangen werden.
2.2.2. Lipidklassentrennung und FS-Zusammensetzung d er einzelnen Lipid-
klassen
Um die einzelnen Lipidklassen zu trennen und deren FS-Zusammensetzung zu
untersuchen, wurde die DC mit anschließender GC durchgeführt. Die Gesamtlipid-
extrakte aus 50 mg Sporangien von P. halstedii und B. lactucae wurden mittels DC in
ihre Lipidklassen getrennt. Sowohl P. halstedii als auch B. lactucae zeigten Banden
auf Höhe aller 4 Lipidklassen, die von Standards repräsentiert wurden (Abb. 2.7.).
Die Phospholipide blieben als stark fluoreszierende Banden am Start sitzen, Sterine
(Rf 0,07), Freie FS (Rf 0,14) und Triacylglyceride (Rf 0,25) wurden im gewählten
Laufmittel aufgetrennt. Zusätzlich fluoreszierten Banden der Monoacylglyceride kurz
oberhalb der Phospholipide und der Diacylglyceride kurz oberhalb der Sterine sehr
schwach. Diese wurden auf Grund der geringen Substanzmenge jedoch nicht weiter
untersucht.
Die Breite der Triacylglyceridbanden in den Proben der Oomyceten ließ auf ein
Gemisch aus mehreren Komponenten schließen.
Da Sterine keine Fettsäurereste enthalten, wurde diese Fraktion für den GC-FID
nicht weiterverarbeitet. Von der Leuchtkraft der Lipidbanden her zu schließen, waren
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
30
bei beiden Arten die Triacylglyceride am stärksten vertreten, gefolgt von den Phos-
pholipiden und Freien FS.
Abb. 2.7. : DC-Banden der Lipide aus Sporangien unter UV 265 nm. Von links nach rechts: Standard-
mischung mit Lipiden in aufsteigender Reihenfolge (L-α-Phosphatidylcholin (Rf 0), Cholesterin Rf 0,07,
17:0 (Rf 0,14), Triolein (Rf 0,25)), Lipide aus P. halstedii und B. lactucae.
Schwache Banden auf Höhe der Mono- und Diacylglyceride zeigten, dass auch diese
Lipidklassen in beiden Arten vertreten waren. Die am GC-FID gemessenen Signale
der FAMEs aus den DC-Lipidbanden von P. halstedii und B. lactucae wurden als
Bestandteile ihrer Lipidklassen in Prozent am Gesamtlipidmuster dargestellt (Abb.
2.8., 2.9.). So entstand, zusätzlich zur groben Bestimmung der Lipidklassen von P.
halstedii und B. lactucae, ein genaues Bild über die Lokalisation der einzelnen
Fettsäuren aus dem Gesamtlipidextrakt.
Beim Vergleich der FS-Muster der Lipidklassen von P. halstedii und B. lactucae
(Abb. 2.8. u. 2.9.) ergibt sich, aus der Senkrechtaddition der Werte jeder einzelnen
FS für Triacylglyceride, Phospholipide und Freien Fettsäuren, der Gesamtanteil der
FS im Gesamtextrakt.
Aus der Waagrechtaddition aller FS-Anteile innerhalb der Triacylglyceride bzw.
Freien FS oder Phospholipide ergibt sich der Gesamtanteil der Lipidklassen am
Gesamtmuster. Die Gesamtgehalte aus der Senkrecht bzw. Waagrechtaddition sind
in den Abb. 2.8. und 2.9. nicht zusätzlich aufgeführt.
Addiert man die FS aus Sporangien von P. halstedii waagrecht (Abb. 2.8.), so lagen
diese insgesamt zu ca. 60,8% als Triacylglyceride, zu 32,4% als Phospholipide und
zu 6,8% als Freie FS vor. Bei Senkrechtaddition lag die FS 20:5 n-3 insgesamt zu
Standard P. halstedii B. lactucae
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
31
18,89% am Gesamtmuster vor: Mit 12,18% in Triacylglyceriden, mit 6,44% in
Phospholipiden und mit 0,27% in Spuren als Freie FS. Das Balkendiagramm für die
einzelnen FS entstand folgendermaßen: Wurde der Wert 18,89% von z.B. 20:5 n-3
auf 100% gesetzt, so zeigte sich, dass die FS 20:5 n-3 zu einem Anteil von 67,67 in
Triacylglyceriden, zu 34,1 % in Phospholipiden und zu 1,4% in Freien FS vorkam.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
FAME
Pro
zent
im L
ipid
extr
akt
TAG 4,54 12,00 1,21 0,68 6,41 13,12 0,43 2,09 1,22 0,22 0,96 1,62 0,25 12,18 0,52
Freie FS 0,18 1,19 0,00 0,47 0,95 0,21 0,33 0,00 0,16 0,00 0,00 0,00 2,85 0,27 0,00
PL 0,72 11,21 0,33 0,49 1,97 7,35 0,15 0,95 0,57 0,00 0,51 0,89 0,00 6,44 0,28
14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 n-9 18:2 n-6 18:3 n-6 18:3 n-3 20:1 20:2 20:3 n-6 20:3 n-3 20:4 n-6 20:5 n-3 22:6 n-3
Abb. 2.8.: Zusammensetzung des FS-Musters der Lipidklassen von P. halstedii (Stamm GG-
16.10.97-A25). Von links nach rechts ist für jeden FAME im Gesamtlipidextrakt der Anteil (%) in den
Lipid-klassen der Phospholipide (PL, gestreifte Balken), Freien FS (weiße Balken) und der
Triacylglyceride (TAG, schwarze Balken) aufgeführt.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
FAME
Pro
zent
im L
ipid
extr
akt
TAG 5,20 8,87 0,77 1,23 7,48 6,27 0,36 2,60 1,35 0,00 0,45 0,62 0,16 8,22 0,31
Freie FS 5,37 4,80 0,23 1,87 2,14 1,96 0,00 0,94 0,48 0,00 0,08 0,17 0,00 5,38 0,55
PL 2,20 8,15 0,75 0,88 2,30 5,58 0,20 1,81 0,50 0,20 0,00 0,40 0,00 6,36 0,83
14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 n-9 18:2 n-6 18:3 n-6 18:3 n-3 20:1 20:2 20:3 n-6 20:3 n-3 20:4 n-6 20:5 n-3 22:6 n-3
Abb. 2.9.: Zusammensetzung des FS-Musters der Lipidklassen von B. lactucae (Feldisolat der
Versuchsstation für Gartenbau, Hohenheim). Von links nach rechts ist für jeden FAME im Gesamt-
lipidextrakt der Anteil (%) in den Lipidklassen der Phospholipide (PL, gestreifte Balken), Freien FS
(weiße Balken) und der Triacylglyceride (TAG, schwarze Balken) aufgeführt.
In ähnlichen Größenverhältnissen (Triacylglyceride > Phospholipiden > Freie FS) wie
20:5 n-3, lagen auch die FS 16:1, 18:2 n-6, 18:3 n-3, 20:3n-6, 20:3 n-3 und 22:6 n-3
als Triacylglyceride, Phospholipide oder Freie FS vor. Die FS 16:0, 18:0, 18:1 n-9,
18:3 n-6 sowie 20:1 kamen in allen 3 Lipidklassen in nennenswerten Anteilen vor.
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
32
Besonders auffällig war die FS 20:2, die beinahe ausschließlich als Triacylglycerid
vorlag, sowie die FS 20:4 n-4, die fast nur als Freie FS vorlag.
Addiert man die FS aus Sporangien von B. lactucae waagrecht (Abb. 2.9.), so lagen
diese insgesamt zu ca. 45% als Triacylglyceride, zu 31% als Phospholipide und zu
ca. 24% als Freie FS vor. Bei Senkrechtaddition lag die FS 20:5 n-3 insgesamt zu
19,95% am Gesamtmuster vor: Mit 8,22% in Triacylglyceriden, mit 6,36% in
Phospholipiden und mit 5,38% in Freien FS. Wurde der Wert von 19,95% für das
Balkendiagramm auf 100% gesetzt, so zeigte sich, dass die FS 20:5 n-3 von B.
lactucae zu 41,2% aus Triacylglyceriden, zu 31,9% aus Phospholipiden und zu
26,9% aus Freien FS stammte.
Die Sporangien von B. lactucae enthielten insgesamt deutlich mehr Freie FS als die
Sporangien von P. halstedii. Die Freien FS dominierten besonders bei 14:0 und 18:0.
Als Phospholipide lagen vor allem 16:1 und 22:6 n-3 vor. Bei 16:0, 16:1, 18:1 n-9,
18:2 n-6, 18:3 n-3, 20:1 und 20:3 n-3, waren, wie bei 20:5 n-3, Triacylglyceride und
Phospholipide etwa gleich stark vertreten, wobei beachtliche Anteile an Freien FS zu
finden waren. Deutlich mehr Triacylglyceride als Phospholipide bei einem sehr
geringen Anteil an Freien FS enthielt nur die FS 18:3 n-6. Besonders auffällig waren
die FS 20:3 n-6 und 20:4 n-6, die beinahe nur als Triacylglyceride vorlagen, sowie
die FS 20:2, die hauptsächlich in der Phospholipidfraktion gefunden wurde.
2.2.3. EPA-Konzentrationen von Sporangien und Wirtsgewebe
Die absoluten Konzentrationen an EPA, die mit Hilfe einer EPA-Eichkurve und dem
17:0 IS bestimmt wurden (vgl. Kap. 2.1.4.), betrugen in den Sporangien von P.
halstedii 25-30 mg EPA/g FG. Die absoluten Konzentrationen an EPA in infiziertem
Sonnenblumengewebe lagen bei maximal 1,1 mg pro g TG (Tab. 2.1.).
Die absoluten Konzentrationen an EPA in den Sporangien von B. lactucae betrugen
durchschnittlich 8-13 mg EPA/g FG, in infiziertem Salatgewebe lagen die EPA-
Konzentration jedoch, ähnlich wie bei infiziertem Sonnenblumengewebe, bei maximal
1,0 mg EPA/ g TG.
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
33
Tab. 2.1.: EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflanzengewebe: P. halstedii (Stamm
BL-11.06.02-A4z), B. lactucae (Feldisolat der Versuchsstation für Gartenbau, Hohenheim) und
Peronospora swinglei (Supermarktware (Isolat 867)).
___________________________________________________________________ Kultursystem Wirtsgewebe Infektionsdauer EPA-Konzentration (Tage) (mg/g TG) Sporangien Inf. Gewebe P. halstedii Sonnenblumenkeimlinge 14 25-30 1,1
B. lactucae adulte Salatblätter 7-10 8-13 1,0
P. swinglei adulte Blätter nicht getestet 30-38 1,4
___________________________________________________________________
Die Analyse der EPA-Gehalte einer weiteren Wirt-Parasit-Kombination, Ocimum
basilicum L. (Basilikum) und Peronospora swinglei, ergab EPA-Konzentrationen in
Sporangien von durchschnittlich 30-38 mg EPA/g FG und EPA-Konzentrationen von
infiziertem Gewebe von maximal 1,4 mg EPA/g TG. Da diese Werte im selben
Produktivitätsbereich wie für P. halstedii und B. lactucae lagen, wurde in dieser
Kombination kein Vorteil im Hinblick auf die Zielsetzung der Arbeit gesehen.
Die im Labormaßstab erzielten EPA-Gehalte wurden für B. lactucae im Großmaßstab
hochgerechnet, um einen Vergleich mit der EPA-Produktivität derzeit verwendeter
Systeme aus dem Bioreaktor zu ermöglichen. Es wurden die Produktivitäten in g
EPA pro Tag im Volumen (Bioreaktormedium) bzw. der Fläche (benötigte Fläche für
Pflanzen) verglichen.
In Tabelle 2.2. erfolgt ein Vergleich der theoretisch erzielbaren EPA-Produktivität von
Sporangien von B. lactucae sowie der theoretisch (unter Laborbedingungen) erziel-
baren EPA-Produktivität von infiziertem Salat (auf einer theoretischen Anbaufläche)
mit den derzeit leistungsfähigsten EPA-Produktivitäten anderer Organismen, die
jedoch in Bioreaktoren gezüchtet werden (WARD & SINGH 2005).
Die höchste EPA-Produktivität von Oomyceten aus optimierten Systemen erreicht die
Gattung Thraustochytrium mit maximal 47 mg EPA/L•Tag. In optimierten Bioreaktor-
Systemen können derzeit von Schizochytrium Stämmen DHA-Konzentrationen von
bis zu 10 g/L•Tag produziert werden, Schizochytrium Stämme sind jedoch bezüglich
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
34
EPA wenig produktiv. Im Vergleich dazu produziert die Mikroalge Nitzschia alba 100-
300 mg EPA/L•Tag und Phaeodactylum tricornutum produziert im Photobioreaktor 40
mg EPA/L•Tag.
Tab. 2.2.: Vergleich der erzielbaren EPA-Produktivität. Systeme im Bioreaktor (g/L•d) nach WARD &
SINGH 2005 und die theoretisch erzielbare EPA-Produktivität von B. lactucae auf Salat (g/(m²•d).
Hochgerechnete EPA-Mengen sind blau dargestellt.
Kultursystem Erzielbare EPA-Produktivität
B. lactucae Sporangien (FG) 0,047 g/(m²•d)
Inf. Salat (TG) 0,280 g/(m²•d)
Phaeodactylum tricornutum (TG) 0,040 g/(L•d)
Thraustochytrium sp. (TG) 0,047 g/(L•d)
N. alba (TG) 0,1-0,3 g/(L•d)
Für die EPA-Produktivitätsprognosen von B. lactucae wurden folgende Hochrech-
nungen angestellt: Um 1 g Sporangien zu produzieren waren für infizierten Salat
unter genannten Laborbedingungen (vgl. Kap. 2.1.1.) Infektionszeiten von 7-10
Tagen, für infizierte Sonnenblumen von 14-16 Tagen nötig. Für die Produktivität von
47 mg EPA/ m² •Tag aus Sporangien von infiziertem Salat wäre eine absaugbare
Pflanzenoberfläche der Blätter von ca. 26 ausgewachsenen Salatköpfen nötig, wofür
ca. 3 m² Anbaufläche benötigt würden. In infiziertem, getrocknetem Pflanzengewebe
konnte mit Salat etwa 1 mg EPA/g produziert werden. Daher könnten rein
rechnerisch in 7 Tagen (nach vorangegangener 8-wöchiger Salatanzucht) nach
optimierter Infektion und optimierten Sporulationsbedingungen auf 60 m² Fläche ca.
120 kg infizierter Salat gezüchtet werden. Dies entspräche einer Produktivität von
280 mg EPA/ m² •Tag aus B. lactucae infiziertem Salat.
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
35
2.3. Diskussion
2.3.1. Qualitative FS-Zusammensetzung von P. halstedii und B. lactucae
P. halstedii und B. lactucae wiesen mit 30-40% ähnlich hohe Anteile an EPA wie
andere Systeme auf, die bereits großtechnisch für die menschliche Ernährung
verwendet werden (WARD & SINGH 2005). So produziert Phaeodactylum tricornutum
unter optimalen Bedingungen im Bioreaktor ca. 35 % EPA an seinem FS-Muster, der
Eumycet Mortierella alpina produziert EPA zu 20% seines FS-Musters, Thrausto-
chytrium-Stämme produzieren 30-40% EPA in ihrem FS-Muster.
Vergleicht man die relativen FS-Anteile von P. halstedii und B. lactucae, so hat EPA
in P. halstedii mit durchschnittlich 37 % EPA einen etwas höheren Anteil am FS-
Muster als in B. lactucae mit 29% (Abb. 2.5. u. 2.6.). Trotz etwas geringerer EPA-
Anteile am Gesamtmuster hat B. lactucae gegenüber P. halstedii jedoch den Vorteil,
als Pathogen auf einem Nahrungsmittel zu wachsen, das in großen Mengen roh
verzehrt wird, während die befallenen Teile der Sonnenblumen nicht nahrungs-
relevant für den Menschen sind.
2.3.2. Lipidklassenzusammensetzung
Die FS-Muster sowie die Fettsäuren der einzelnen Lipidklassen wurden für manche
Oomyceten (HUANG et al. 2001; KENDRICK & RATLEGE 1992), Mikroalgen (GALANINA &
KONOVA 1998; SANINA et al. 2008), Pilze (KOCK & VAN DER WALT 1986) und Höhere
Pflanzen (MONGRAND et al. 2001) für taxonomische und industrielle Zwecke intensiv
erforscht. Für die meisten Gattungen und Arten der Oomyceten sind bisher jedoch
weder die Fettsäurezusammensetzungen der einzelnen Lipidklassen noch die
Gesamtlipidmuster bekannt.
Vergleicht man die Gesamtlipidmengen der Abb. 2.5. u. 2.6. mit denen der Abb. 2.8.
u. 2.9., so wurden im Gegensatz zum Gesamtlipidextrakt ohne DC-Auftrennung für
P. halstedii und B. lactucae nicht 37 bzw. 29% EPA im Extrakt sondern lediglich
18,89 % bzw. 19,95% EPA wiedergefunden. Dies lässt sich jedoch dadurch erklären,
dass bei der Auftrennung per DC natürliche Verluste auftraten, die durch oxidative
Prozesse und Verschleppung auf dem Kieselgel verursacht wurden. Diese Verluste
traten bei P. halstedii und B. lactucae in selber Weise auf. Bei den ungesättigten FS
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
36
verstärkte sich dieser Verschleppungseffekt mit zunehmender Anzahl an Doppel-
bindungen gegenüber den gesättigten FS zusätzlich, was auf wesentlich niedrigere
Siedepunkte und damit verbundener stark erhöhter Flüchtigkeit zurückzuführen war.
Die prozentualen Zusammensetzungen der FS in den einzelnen Lipidklassen unter-
schieden sich zwischen P. halstedii und B. lactucae. Vergleicht man die Zusammen-
setzung dominierender FS wie 20:5 n-3, 18:2 n-6 oder 16:0 von P. halstedii und B.
lactucae, so fällt auf, dass B. lactucae wesentlich mehr Freie FS als P. halstedii
enthält. Die Anteile von Triacylglyceriden und Phospholipiden überwogen jedoch bei
beiden Organismen gegenüber den Freien FS. Lediglich im Gesamtextrakt schwach
vertretene FS (Abb. 2.8. u. 2.9.) wie 20:4 n-6, 20:2, 20:3 n-6 21:0, 22.1 oder 22:6 n-3
unterschieden sich extrem in ihrer Lipidklassenzusammensetzung, was jedoch sehr
wahrscheinlich ein methodisches Problem der verlässlichen Quantifizierung im
Bereich der Nachweisgrenze ist.
Das sehr unterschiedliche Vorhandensein von Einzelfettsäuren in den unterschied-
lichen Lipidklassen könnte zudem an verschiedenen Entwicklungsstadien der Spo-
rangien und auch Umwelteffekten liegen, da bei B. lactucae ein Feldisolat verwendet
wurde, bei P. halstedii dagegen ein regenerierter Laborstamm. Die Unterschiede in
der Zusammensetzung der Freien FS zwischen B. lactucae und P. halstedii,
besonders im Hinblick auf 20:5 n-3 und 20:4 n-6, sollten daher nochmals näher
untersucht und in einem anderen Zusammenhang diskutiert werden. Eventuell ließe
sich durch weitere Messungen bestätigen, dass die Zusammensetzung der einzelnen
Lipidklassen taxonspezifisch ist, dann wäre es mit genügend zur Verfügung
stehendem Sporangienmaterial eventuell auch möglich über einen „FS-Strichcode“
eine Art zu identifizieren. Da Fettsäuremuster taxonspezifisch sind (SPRING & THINES
2004; SPRING et al. 2006), würde ihre weitere Erforschung, neben dem Potenzial zur
industriellen Nutzbarkeit, eine reizvolle Ergänzung zu molekularbiologischen
Untersuchungen bieten.
Die Hauptfettsäuren von P. halstedii und B. lactucae (16:0, 18:1 n-9, 18:2 n-6, 20:5
n-3) lagen zu sehr hohen Anteilen als Neutrallipide (Triacylglyceride) vor, es
existierten jedoch auch nennenswerte Anteile an polaren Lipiden wie Phospholipiden
gefolgt von Freien FS. Ferner wurden per DC geringe Mengen an Mono- und
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
37
Diacylglyceriden detektiert. Im Vergleich dazu zeigte eine Studie zur Lipidklassen-
verteilung von Thraustochytrium, dass dort Triacylglyceride mit 44-68% am Gesamt-
lipidanteil überwogen, gefolgt von Phospholipiden mit ca. 29% Anteil (KENDRICK &
RATLEGE 1992), was einer sehr ähnlichen Lipidklassenzusammensetzung wie für P.
halstedii und B. lactucae entspricht. Freie FS wurden genannter Studie nicht
behandelt.
Die Anwesenheit von Phospholipiden und Triacylglyceriden konnte für P. halstedii
und B. lactucae als positive potenzielle Lebensmitteleigenschaft bewertet werden,
von den Freien FS musste jedoch befürchtet werden, dass sie sich aufgrund ihrer
hohen Oxidationsanfälligkeit negativ in einem potenziellen Lebensmittel auswirkten.
In ernährungsphysiologisch wertvollen Pflanzenölen sind die ungesättigten FS nur
als Triacylglyceride gespeichert und werden, besonders in Sonnenblumen und Wal-
nussöl, zusätzlich durch die Produktion des Lipidvitamins Tocopherol (Vitamin E) vor
Oxidation geschützt (BÄSSLER 1991).
Tierische Lipide enthalten im Vergleich zu Ölen Höherer Pflanzen neben Triacyl-
glyceriden auch Phospholipide. Eidotterlipide bestehen z.B. zu ca. 67% aus Triacyl-
glyceriden und zu 25 % aus Phospholipiden. Die übrigen Lipide sind Sterole, die zu
98% aus Cholesterin bestehen (SCHREINER et al. 2005). Freie FS finden sich dage-
gen in ranzigem Öl und in verdorbenem Eidotter. Sind Freie FS in einem Lebens-
mittel vorhanden, so tragen zu dessen ernährungsphysiologischer Wertminderung
bei (BELITZ et al. 2001).
2.3.3. EPA-Konzentrationen in Sporangien u. infiziert em Pflanzengewebe
Die beinahe selben EPA-Konzentrationen in infiziertem Pflanzengewebe bei jedoch
recht unterschiedlichen EPA-Konzentrationen in Sporangienlipiden könnten dadurch
erklärt werden, dass die 3 Arten P. halstedii, B. lactucae und P. swinglei ihre
Sporangien zwar in unterschiedlichem Maße mit FS ausstatten, der Mycelanteil im
Pflanzengewebe jedoch verschieden ist. Eine weitere Erklärung wäre, dass die Lipid-
gehalte der Erreger aus entsprechendem Pflanzengewebe in Mycel und Sporangien
stark variieren. Da eine gesonderte Analyse des Mycels auf Grund der Untrenn-
barkeit vom Wirtsgewebe nicht möglich ist, konnte dem Phänomen nicht weiter
nachgegangen werden.
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
38
Sporangienpulver von P. halstedii bzw. B. lactucae enthielt 25-30 bzw. 8-13 mg EPA/
g FG. Um 1 g Sporangien von B. lactucae zu produzieren wären bei einem Durch-
schnittswert von 10 mg EPA/g TG gemäß Hochrechnung (Tab. 2.2.) die Blätter von
ca. 26 optimal infizierten Salatköpfen auf 3 m² Fläche nötig. Die Realisierung dieser
Mengen scheitert derzeit jedoch an geeigneten Anzucht- und Produktionssystemen,
die auf sehr großer Fläche (mehrere hundert m²) mit optimaler Technik steuerbare
Umweltverhältnisse bieten sollten und gleichmäßige Sporulation sowie eine
ökonomische Ernte der Sporangien gewährleisten müssten.
In Anbetracht der Nutzung von infiziertem Salatgewebe sind die EPA-Produktivitäts-
vergleiche von B. lactucae mit bisher verwendeten Bioreaktor-Systemen recht
vielversprechend. Vergleicht man die im Reaktor erzielbaren EPA-Mengen von 40-
300 mg EPA/ L • Tag mit 280 mg EPA/ m² • Tag aus infiziertem Salat, so läge man in
mengenmäßig konkurrenzfähigen Dimensionen. Das System B. lactucae/ Salat wäre
gegenüber der derzeitigen EPA-Produktion im Bioreaktor konkurrenzfähig, wenn es
betriebswirtschaftlich günstiger wäre, optimiert billiger in der Fläche zu produzieren
als im Bioreaktor. Es bestehen jedoch derzeit keine optimierten Infektions- und
Anzuchtsysteme für infizierten Salat auf Großflächen, die erst entwickelt werden
müssten, um diese Rechnung zu verifizieren, so dass die Diskussion damit hinfällig
wird.
Für den direkten menschlichen Verzehr sind die Gehalte an EPA in infiziertem
Pflanzengewebe mit 1 mg/g TG etwa um den Faktor 10 zu niedrig dosiert, da pro
Tag 150-300 mg EPA aufgenommen werden sollen. Um diese Menge EPA
aufzunehmen müsste man nach bisherigen Rechnungen am Tag z.B. 1,5-3-kg
frischen, infizierten Salat essen. Könnte man den EPA-Gehalt jedoch um Faktor 10
steigern, so wäre die tägliche Aufnahmemenge mit 150 g Salat (eine große Portion)
durchaus realistisch.
2. Qualitative FS-Zusammensetzung und EPA-Konzentrationen in Sporangien und infiziertem Pflan-zengewebe
39
2.4. Schlussfolgerungen
Sowohl die qualitativen FS-Muster von P. halstedii und B. lactucae als auch die
Fettsäurezusammensetzungen der Lipidklassen von Sporangien wurden für die men-
schliche Ernährung wegen der hohen EPA-Gehalte in Form von Triacylglyceriden
und Phospholipiden als geeignet erachtet. Die EPA-Konzentrationen in Sporangien
(10-30 mg EPA/g FG) und infiziertem Gewebe (ca. 1 mg EPA/g TG) erreichten
ebenfalls nennenswerte Größen. Die theoretisch erzielbare EPA-Produktivität mit
infiziertem Salat pro Flächeneinheit lag mit 0,28 g/(m²•d) im Wertebereich der derzeit
erzielbaren Mengen im Bioreaktor pro Volumeneinheit durch andere Systeme. Es
wurden jedoch keine weitere Studien durchgeführt um diese Rechnung zu
verifizieren, da dies bereits großtechnische Dimensionen annehmen würde und in
dieser Arbeit, im Rahmen der Mittel (Arbeitsaufwand, Zeit, begrenzter Raum,
Kosten), der Fokus auf der natürlichen Produktion lag.
Da EPA-Mengen von 1 mg/g TG in infiziertem Sonnenblumen- bzw. Salatgewebe
nicht genügen, um den täglichen menschlichen Bedarf an EPA zu decken, sollte nun,
im Rahmen der Möglichkeiten und im Labormaßstab, mit Optimierungsversuchen ge-
testet werden, ob eine relevante Steigerung (Faktor 10) der EPA-Produktion auf na-
türlichem Wege möglich war.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
40
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeis piel P. halstedii
3.1. Einleitung
Nach den Schlussfolgerungen in Kap. 2 galt es die Fragen zu klären, auf welche
Weise und in wieweit man die EPA-Gehalte von P. halstedii bzw. B. lactucae durch
Selektion des Ausgangsmaterials oder Modifikation der Kulturbedingungen steigern
konnte. Da die Biologie von P. halstedii bereits untersucht war (ROZYNEK 2000) und
Infektionstechniken und genetisch homogene Stämme zur Verfügung standen, wurde
P. halstedii als Modellbeispiel für Optimierungsversuche herangezogen. Zunächst
wurde erforscht, ob eine natürliche genetische Variabilität zwischen verschiedenen
Pathogenstämmen existierte, die eine Selektion besonders leistungsfähiger Stämme
ermöglichte. Für Arten der Gattung Thraustochytrium wurden schon mehrere
leistungsfähige Stämme für die Produktion von DHA entdeckt (HUANG et al. 2001).
Analog dazu wurde auf Seite der Wirtspflanze getestet, ob Sorten oder Linien
existieren, die besonders anfällig sind und dadurch eine erhöhte Besiedelung
zulassen, was mehr EPA im Gewebe zur Folge haben könnte. Zusätzlich wurde
versucht, den EPA-Gehalt über den Infektionsdruck zu beeinflussen.
Abschließend sollte die Frage geklärt werden, ob und wie sich die FS-Konzen-
trationen von infizierten und gesunden Pflanzen im Hinblick auf extreme und opti-
male Stickstoffgaben (N) in Form von Calciumnitrat Ca(NO3)2 änderten. Um Boden-
effekte zu vermeiden, wurde eine Nährlösungskultur etabliert. So konnten alle Nähr-
stoffe gezielt verabreicht und bis auf den variierten Makronährstoff N gleichgehalten
werden. Aus Ernährungsstudien von Algen aus de Bioreaktoren war bereits bekannt,
dass über den Faktor Ernährung der EPA-Gehalt positiv beeinflusst werden kann
(KHOZIN-GOLDBERG & COHEN 2006). Aus einer aktuellen Studie ging zudem hervor,
dass der Feldbefall von Wegerich mit dem Oomyceten Peronospora plantaginis
durch hohe N-Düngergaben stark gefördert wurde (MANDAL et al. 2008).
3.2. Materialien und Methoden
3.2.1. Artinternes Screening auf EPA-Gehalte in Spo rangien
Der erste Schritt bestand darin, nach leistungsfähigen, geeigneten Stämmen von P.
halstedii zu suchen, die möglichst hohe Mengen an EPA produzierten. Es sollte
geklärt werden, ob grundsätzlich zwischen den Isolaten signifikante Unterschiede im
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
41
absoluten EPA Gehalt bestanden und ob sich eine Selektion in diese Richtung
lohnen würde.
Die Anzucht von 4 verschiedenen Stämmen von P. halstedii für die Fettsäureanalyse
erfolgte auf der Sorte Giganteus und 8 weiteren Sonnenblumenlinien. Ziel war es,
Sporangien, die von derselben Wirtssorte/-linie geerntet wurden, auf ihre absoluten
EPA-Gehalte hin zu testen um eventuelle Unterschiede zwischen verschiedenen
Stämmen zu entdecken. Da die Erreger auf derselben Wirtssorte/-linie unter selben
Bedingungen angezogen wurden, konnten Umwelteffekte ausgeschlossen werden.
Materialien: Je 20 Sonnenblumenkeimlinge: Sorte Giganteus, Linien HA821, HA304,
RHA 265, RHA 274, DM2, PM13, 799-2, 803-1; Einheitserde; Saatschalen; genetisch
homogene Isolate von P. halstedii: Stämme LS-13.12.05-C6, BL-11.06.02-A4z, GG-
16.10.97-A25, HE-10.01.06-A8.
20 Sonnenblumensamen der jeweiligen Sorte/Linie wurden 24h im Wärmeschrank
bei 20°C angekeimt und mit der WSI Methode (vgl. Ka p. 2.1.1.1.) infiziert. Für die
Fettsäureanalysen wurden für ein Isolat je 7 Keimlinge geerntet. Da jedes Isolat auf 9
Wirten angezogen wurde, standen pro Isolat 63 Messwerte zur Verfügung. Die
statistische Analyse erfolgte wie in. Kap. 3.2.5. beschrieben.
Mikroskopische Kontrolle und Aufbereitung der Sporangien für die GC-Analyse
Die Sporangien wurden mit einer Mikroabsaugvorrichtung in 2 ml Plastikreaktions-
gefäße überführt. Um eine möglichst gute Vergleichbarkeit der Proben zu
gewährleisten und homogenes Probenmaterial zu schaffen, wurden die Sporangien
einer mikroskopischen Kontrolle unterzogen. Die Hyphenanteile der Proben lagen
unter 5%. Dies wurde dadurch erreicht, dass die Hyphen, die sich nach dem
Absaugvorgang als wolliges Knäuel oberhalb des Sporangienpulvers sammelten, mit
Hilfe einer Pinzette entfernt wurden.
Das Sporangienpulver wurde bis zur Extraktion bei -20°C tiefgefroren.
Die Aufbereitung der Lipide der Sporangien für die qualitative und quantitative GC-
Analyse erfolgte wie in Kapitel 2.1.2.-2.1.4. beschrieben.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
42
3.2.2. Erfassen besonders EPA-reicher Sonnenblumens orten/-linien
Bei einem obligat-biotrophen System liegt es auch am Wirt, wie gut sich der Parasit
entwickelt. Daher lag der Schritt nahe, innerhalb der Wirtsart Sonnenblume nach
Genotypen zu suchen, die besonders anfällig für P. halstedii waren und dement-
sprechend viel Mycel und EPA im Gewebe enthielten. Von Arbeiten aus dem
Pflanzenschutz war bekannt, dass es nicht nur besonders virulente Stämme (GULYA
et al. 1991) sondern auch besonders anfällige Sonnenblumensorten bzw -linien für P.
halstedii gab.
Die Materialien und Methoden für Anzucht und Infektion entsprachen im Wesent-
lichen denen von Kapitel 2.1.1.1. bis auf die Infektion, die mit einem Isolat, BL-
11.06.02-A4z von P. halstedii, für 10 Wirtssorten/-linien (zusätzliche Linie PM-17)
durchgeführt wurde.
Nach 12 Tagen waren die Sonnenblumenkeimlinge bereits sehr stark befallen und
mussten geerntet werden. Die Biomasse jedes Keimlings mit Keimblättern und 2 cm
Stängel wurde an der Analysenwaage bestimmt.
Ernte und Lagerung von getrocknetem Pflanzenmaterial erfolgten wie unter 2.1.1.3.
beschrieben. Die Extraktion, Methylierung und Quantifizierung der FS aus dem
Pflanzengewebe erfolgten wie in Kapitel 2.1.2.-2.1.4 beschrieben.
3.2.3. Variation des Infektionsdrucks
Der Infektionsdruck wurde über das Sporangieninokulum definiert. Anhand der
Biomasse und der EPA-Konzentrationen des Pflanzengewebes wurde die Auswir-
kung des Infektionsdrucks gemessen. Je 25 Sonnenblumenkeimlinge der Sorte
Giganteus wurden mit 3 verschiedenen Inokuli des genetisch homogenen Erreger-
stammes BL-11.06.02-A4z (vgl. Kap. 2.1.1.) infiziert. 2000 Sporangien/ml sollten
schwach infizieren, 5000 Sporangien/ml eine mittelschwere Infektion auslösen und
10000 Sporangien/ml sollten zu einer schweren Infektion, bis hin zum Absterben von
Pflanzen, führen. Die entsprechend infizierten Keimlinge wurden nach 16 Tagen
Infektion gleichmäßig oberirdisch abgeerntet und gewogen. Die Frischgewichte (FG)
und die Letalität der Pflanzen nach Behandlung mit 2000, 5000 und 10000
Sporangien/ml wurden verglichen.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
43
3.2.4. Variation des Stickstoffangebotes
3.2.4.1. Etablieren der Nährlösungskultur
Die Pathogenanzucht erfolgte wie unter 2.1.1.1. beschrieben. Im Unterschied dazu
fand die Infektion jedoch nicht in Erd- sondern in Hydrokultur statt, wofür die
Sonnenblumen daher speziell angezogen wurden.
Materialien: Sonnenblumensaatgut der Sorte Giganteus, Bechergläser (100 ml),
stumpfe Pinzette, Sieb, destilliertes Wasser, frische Sporangien von P. halstedii
Erregerisolat BL-11.06.02-A4z, Wärmeschrank, Klimakammer (16°C, 80% Luft-
feuchte), Filterpapier DIN A 2, verschließbare, transparente Anzuchtboxen.
Gesunde (Kontrollpflanzen) und mit P. halstedii infizierte Sonnenblumenpflanzen
wurden räumlich getrennt, jedoch zeitgleich, angezogen.
Aussaat und Keimung: Sonnenblumensaatgut der Sorte Giganteus wurde sorgfältig
in einem Sieb mit destilliertem Wasser abgespült. Die Keimlinge wurden in flachen
Plastikschalen auf feuchtem Papier verschlossen und dunkel im Wärmeschrank für
12 h bei 23°C angekeimt.
Am nächsten Tag wurden alle Sonnenblumenkerne von Hand mit einer stumpfen
Pinzette von ihren Schalen befreit. Die angekeimten Samen kamen am 1. Tag nach
Aussaat ohne Schale in Bechergläser mit destilliertem Wasser. Das Saatgut wurde in
2 x 120 Keimlinge in 100 ml Bechergläser mit dest. Wasser aufgeteilt. Eine Hälfte
wurde infiziert, die andere Hälfte blieb ohne Infektion.
Am 2. Tag nach Aussaat bzw. nach einem Tag im Becherglas wurden das infizierte
und gesunde Saatgut nicht in Erde gepflanzt, sondern auf Filterpapier ausgelegt. Das
Filterpapier war mit destilliertem Wasser getränkt und wurde so gefaltet, dass die
Keimlinge darin ein Hypokotyl ausbilden konnten, das lang genug war, um die
Pflanzen später mit Schaumstoff in Hydrokultur zu pflanzen. Infiziertes und gesundes
Saatgut wurden je mit sterilen Gerätschaften und zeitlich um eine Stunde getrennt
behandelt, um einer eventuellen Infektion des gesunden Kontrollsaatgutes vorzu-
beugen. Das Filterpapier mit den Sonnenblumenkeimlingen wurde mit Bodenkontakt
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
44
in eine transparente Plastikwanne mit Deckel gestellt, die zu 2 cm mit destilliertem
Wasser gefüllt war.
Gesundes und infiziertes Pflanzenmaterial wurden in getrennte Wannen gestellt und
an verschiedenen Orten über Nacht mit geschlossenen Deckeln bei 15°C gelagert.
Am 3.Tag nach Aussaat wurden die transparenten Gefäße in geschlossenem
Zustand (Schutz vor Läusen und anderen Schädlingen) ins Gewächshaus überführt,
damit die Pflanzen ergrünen konnten.
Am 4. Tag nach der Aussaat wurden die Pflanzen in eine belüftete Nährlösungskultur
in die Klimakammer überführt (Abb. 3.1.).
Materialien: Klimakammer, 24 Nährlösungstöpfe a 2,5 l, 240 Schaumstoffstreifen, 24
Silikonschläuche mit Glasausgang für die Töpfe, Nadeln für den Pumpenanschluss,
Luftpumpe, Nährlösungen.
Abb. 3.1.: Nährlösungskultur mit Sonnenblumen. Links: Belüftete Nährlösungskultur in der Klima-
kammer. Mitte: Mit BL-11.06.02-A4z infizierte Keimlinge der Sorte Giganteus nach 14 Tagen
Infektionszeit. Rechts: Giganteus-Kontrolle ohne Infektion nach 14 Tagen.
Die Pflanzen wurden bis zum 15. Tag nach Aussaat unter kontrollierten Bedingungen
in einer Klimakammer (16/8 h Tag/Nacht, 20°C, 70% re lative Luftfeuchte,
Lichtintensität (Photonenfluss) 250 µmol/m²•s) kultiviert.
In jedes Gefäß (Fassungsvermögen 2,5 l), welches bis 2 cm unter den Rand mit
Nährlösung befüllt war, wurden 10 Keimlinge gesetzt. Jeder Gefäßdeckel hatte 10
runde Löcher, in welche die Keimlinge, in Schaumstoffstreifen gewickelt, in das
Gefäß gepfropft werden konnten. Die Zusammensetzung der Nährlösung (mmol/L)
für Sonnenblumen folgte den Angaben von Dannel bzw. Pfeffer (DANNEL et al. 1995;
PFEFFER 1999): 0,7 K2SO4, 0,1 KCl, 0,5 MgSO4, 0,1 KH2PO4, 0,5 x 10-3 MnSO4, 0,5 x
10-3 ZnSO4, 0,2 x 10-3 CuSO4, 0,01 x 10-3 (NH4)6Mo7O24, 0,02 NaFe(III)-EDTA, 0,01
H3BO3.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
45
Stickstoff wurde in Form von Ca(NO3)2 zugegeben und variiert. Um Effekte zu sehen,
wurden die Stickstoffstufen (N-Stufen) im Minimum, Optimum und Maximum gewählt.
Die erste Stufe (N1) mit 0,1 mmol/L Ca(NO3)2 sollte deutlichen N-Mangel hervorrufen,
die zweite N-Stufe (N2) mit 1,0 mmol/L Ca(NO3)2 sollte im optimalen Versor-
gungsbereich liegen, die dritte N-Stufe (N3) mit 5,0 mmol/L Ca(NO3)2 sollte eine
Überversorgung der Pflanzen gewährleisten. Die prozentualen N-Grenzwerte (%TG),
die von Jungpflanzen aufgenommen werden können und die daraus berechneten
Mengen an Ca(NO3)2 wurden aus der Literatur entnommen (REUTER et al. 1997).
Ein Wechsel der Nährlösungen erfolgte am 8. Tag, und am 11. Tag nach Aussaat,
um eine dauerhaft gute Nährstoffversorgung zu garantieren. Die Ernte erfolgte am
15. Tag nach Aussaat.
Es existierten insgesamt 6 Behandlungen: 3 N-Stufen mit 2 Varianten (infizierte und
gesunde Pflanzen). Von jeder Behandlung (N- Stufe) gab es 4 Töpfe mit je 10
Pflanzen, sodass 40 Pflanzen pro Ansatz zur Auswertung zur Verfügung standen.
Zur Ernte wurden alle 40 Pflanzen fotografiert und gewogen um das FG zu ermitteln.
Die Pflanzen wurden anschließend mit einer Schere in die Einzelteile Wurzel,
Spross, Keimblätter und Primärblätter zerlegt und erneut gewogen.
Von 28 willkürlich ausgewählten Pflanzen pro Behandlung wurden die Keimblätter für
Sporulationsversuche geerntet, die restlichen Pflanzenteile wurden, nachdem sie
gewogen waren, als Rückstellmuster eingefroren. Die restlichen 12 Pflanzen pro
Behandlung wurden komplett, jedoch in ihre Einzelteile zerlegt, in Trockentütchen
gepackt und 3 Tage bei 60°C im Wärmeschrank getrocknet. D ie getrockneten
Keimblätter von 8 Pflanzen wurden für die Fettsäureanalysen verwendet, 4 Gesamt-
pflanzen wurden zur Elementaranalyse verwendet, wobei der N-Gehalt in %
Trockengewicht ermittelt wurde.
3.2.4.2. Wachstum und Gewichte
Wachstum und FG von je 40 Pflanzen pro Behandlung wurden mit einer zwei-
stelligen Analysenwaage ermittelt. Das Wachstum wurde zudem mit Fotos doku-
mentiert.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
46
3.2.4.3. Infektion und Befallsgrad
Die Sporulation wird im Pflanzenschutz als gängiger Infektionsbeweis und als Maß
zur Bestimmung von Pathotyp und Infektionsgrad bei obligat-biotrophen Oomyceten
benutzt (GARIBALDI et al. 2007; GULYA et al. 1991; ILOTT et al. 1987; MANDAL et al.
2008). Dabei wird der Prozentsatz an Pflanzen mit Befallssymptomen (Sporulation)
gegenüber den Pflanzen ohne Befallssymptome ausgewertet. Befallsgrad und
Infektion sollten mit Hilfe der Sporulation von 28 Keimblattpaaren pro Behandlung
ermittelt werden.
Material: Sporulationsgitter, Styroporbox, destilliertes Wasser, Pinzette, Fuchs-
Rosenthal-Zählkammer, Lichtmikroskop.
Um den Befallsgrad zu ermitteln und den Befall zu bestätigen, wurden Sporulations-
versuche mit Keimblattpaaren von 28 Pflanzen pro Behandlung durchgeführt. Um
Verluste an Sporangien zu vermeiden, wurden die Keimblätter der befallenen
Pflanzen in unsporuliertem Zustand geerntet und auf umgedrehte Spitzenhalter von
Reaktionsgefäßboxen gelegt, sodass sie nur an wenigen Punkten auflagen und
beidseitig sporulieren konnten. Die Keimblätter wurden über Nacht in einer Styropor-
box zur Sporulation gebracht. Am nächsten Morgen wurden die Keimblätter
fotografiert. Jedes Keimblattpaar wurde vorsichtig mit einer spitzen Pinzette in ein 10
ml Gefäß mit 3 ml destilliertem Wasser überführt. So konnten die Sporangien
verlustfrei mit einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer ausgezählt werden. Die ermittelte
Zahl der Sporangien für die Keimblattpaare der Pflanzen aus einem Behandlungs-
ansatz diente so als Beweis für eine Infektion und als Maß für den Befallsgrad der
jeweiligen Probe.
Anschließend erfolgte für jedes Keimblattpaar zusätzlich eine Blattflächenmessung
am Tageslichtprojektor mit der Computersoftware „WinDias“ (UP GmbH, Osnabrück),
um eventuell bestehende Korrelationen zwischen Sporangienanzahl und Blattfläche
zu ermitteln.
3.2.4.4. Gesamt-N Bestimmung im Sonnenblumengewebe
Die Elementaranalyse diente zur Abschätzung des Ernährungszustandes der
Pflanzen mit Hilfe von Grenzwerttabellen (Gesamt-N%) und zusätzlich zur
Berechnung der tatsächlichen N-Bilanz. Die Prozentanteile an Stickstoff von der
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
47
Pflanzeneinwaage (TG) wurden am Elementaranalysator nach der Dumas-Methode
gemessen. Die Proben wurden dafür im Gasstrom verbrannt und die Elementar-
zusammensetzung wurde mit einem Wärmeleitfähigkeitsdetektor über einen Refe-
renzgasstrom gemessen.
Material: Waage, Wärmeschrank, Trockentüten, Pflanzenproben von 4 Pflanzen pro
Behand-lung, Schüttelmühle (Retsch GmbH, Haan), 2 ml Reaktionsgefäße,
Stahlkugeln, Feinwaage, Zinnkartuschen (5x9 mm, Hekatech GmbH, Wegberg) für
den Elementaranalysator, Elementaranalysator (NCS 2500, CE Instruments,
Mailand, Italien), Pinzetten, Feinspatel.
Vier Proben ganzer Pflanzen pro Behandlung (N-Stufe), bestehend aus getrock-
netem Keimblattpaar, Hypokotyl, Wurzel und Primärblattpaar, wurden mit der
Schüttelmühle in 2 ml Gefäßen mit 2 Stahlkugeln fein zermahlen. Pro Probe wurden
zwischen 1 und 5 mg in die Zinnkartuschen an der Feinwaage eingewogen. Die
Gehalte an Stickstoff wurden am Analysator ermittelt und in Prozent am Gesamt-
probenanteil angegeben.
Auf Basis der Trockengewichte sowie der N-Gehalte (% TG) der untersuchten
Pflanzen wurde nach folgender Beispiel-Rechnung eine N-Bilanz (Angebot/Auf-
nahme-Verhalten) erstellt:
In einer 1 molaren Ca(NO3)2- Lösung befanden sich 28 g/l reines N. In 2,5 l
Nährlösung (c= 1 mM) befanden sich folglich 0,07 g N. In 0,1 mM Nährlösung waren
0,007 g N vorhanden, in 5 mM Nährlösung befanden sich 0,35 g N. Da pro Topf 10
Pflanzen wuchsen, standen pro Pflanze in 0,1 mM Lösung 0,0007 g N zur
Verfügung, in 1,0 mM Lösung 0,007 g und in 5,0 mM Lösung 0,035 g N.
Enthielt die Pflanze beispielsweise 6,3% N im TG von 3,3 g (=0,006 g N) und wurde
in einer 1,0 mM Lösung mit 10 anderen Pflanzen aufgezogen, so entsprach das einer
Aufnahme von 0,006 g N bei einem Angebot von 0,007 g N und damit einer
ausgeglichenen N-Bilanz bzw. optimalen Düngung.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
48
3.2.4.5. Analyse der FS-Gehalte im Stickstoff-Steig erungsversuch
Die Fettsäureanalysen wurden zur Analyse der EPA-Konzentrationen nach unter-
schiedlichen N-Behandlungen sowie zum genaueren Nachweis des Infektions-
stadiums durchgeführt. Die infizierten Keimblätter der Sonnenblumen sowie Keim-
blätter der 3 N-Stufen der Kontrollpflanzen wurden, wie in Kap. 2.1.1.3. beschrieben,
geerntet und getrocknet. Die Proben für die Fettsäureanalyse verblieben bis zur
Verarbeitung bei RT im Exsikkator. Die Fettsäurekonzentrationen wurden qualitativ
und quantitativ wie in Kap. 2.1.2.-2.1.4. beschrieben ausgewertet.
Korrektur mit dem IS für die Wiederfindung und Vergleichbarkeit
Allen Proben wurde eine definierte Konzentration der FS 17:0 zugesetzt, womit
Aufar-beitungs- bzw. Einspritzverluste über die Peakflächen des 17:0 Peaks
korrigiert werden konnten. Der Mittelwert des elektrischen Signals von 17:0 aller
Proben (selbe Konzentration) wurde bestimmt und einer Konzentration zugeordnet.
Die Signal-flächen jeder Probe wurden in Relation zur Abweichung an diesem 17:0
Mittelwert angepasst:
Die Konzentrationen der FS in der Probe wurden daher wie folgt berechnet:
Es galt:
C FS = A FS
C17:0 IS A 17:0 (MW)
Daraus folgte:
C FS = C 17:0 IS • A FS
A 17:0 (MW)
Wobei: C FS = Konzentration der FS in der Probe, C 17:0 = bekannte Konzentration
des IS, A FS = Signalfläche der FS in der Probe, A 17:0 (MW) = auf Mittelwert
korrigierte Signalfläche des IS.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
49
3.2.5. Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Statistikpaket SAS (SACHS & HEDDERICH
2006). Die Daten wurden in Excel aufgenommen und in SAS Datenblätter
transformiert (DUFNER et al. 1992). Die Auswertung erfolgte mit der SAS Methode
„Mixed“, da mit dieser Prozedur alle Rechenoperationen wie für das GLM (general
linerar model) durchgeführt werden konnten. Mit SAS standen graphische Verfahren
zur Überprüfung von Varianzhomogenität und Normalverteilung (WEBSTER 2001) der
Proben zur Verfügung.
Design zum Vergleich der Sporangienstämme und Wirtspflanzen
Die Mittelwertsvergleiche bei der einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) erfolgten
über einen multiplen t-Test. Die Schätzung der Mittelwerte und Varianzen erfolgte
nach der REML-Methode (restricted maximum likelyhood), die derzeit als beste
Schätzmethode gilt (PIEPHO et al. 2003). Bestanden innerhalb des Faktors „Fett-
säurekonzentration“ Unterschiede, so wurde ein multipler t-Test nachgeschaltet, der
signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Faktorstufen (Sporangienstämme
bzw. Wirtspflanzen) aufdeckte.
Statistisches Design zum Stickstoffversuch
Es sollte überprüft werden, ob sich Wachstum und Fettsäuregehalt infizierter und
gesunder Sonnenblumen, die in hydroponischer Kultur aufsteigend viel Stickstoff
erhielten, positiv änderten. Für alle 3 Stickstoff-Stufen (N1, N2, N3) und beide
Varianten (infiziert/gesund) wurden je 4 Wiederholungen angelegt. Pro Topf wuchsen
10 Pflanzen, pro N-Stufe und Variante standen somit 40 Pflanzen zur Verfügung, die
als eine Parallele gewertet wurden. Damit stellte eine Parallele grundsätzlich eine
Mischprobe mehrerer Individuen dar.
Alle Töpfe wurden bei Nährlösungswechsel örtlich randomisiert, so dass keine
Standorteffekte auftreten konnten.
Tabellen und Grafiken wurden mit Software Excel 2003 (Microsoft) erstellt. Es
wurden immer Mittelwerte und Standardfehlerbalken angegeben. In den Standard-
fehler (SF=√(s²)/√n) geht, verglichen mit der Standardabweichung, neben der
Varianz (s²) noch die Anzahl der Proben (n) mit ein, was ab einem Stichproben-
umfang von 4 Proben empfohlen wird (SACHS & HEDDERICH 2006). Es wurde eine
zweifaktorielle Varianzanalyse (Einfluss der N-Stufe und der Variante infiziert/gesund
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
50
auf die Faktoren EPA-Konzentration bzw. Wachstum) durchgeführt. Bei der zwei-
faktoriellen ANOVA zeigte ein F-Test, ob überhaupt signifikante Unterschiede
zwischen Faktoren bestanden. Bestanden Unterschiede zwischen Faktoren, wurde
ein multipler t-Test nachgeschaltet, der signifikante Unterschiede zwischen den
einzelnen Faktorstufen aufdeckte. Unterschiede zwischen den Faktorstufen innerhalb
des Faktors wurden auf dem 5%igen Signifikanzniveau (p<0,05%) mit Hilfe eines
multiplen t-Tests festgestellt.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
51
3.3. Ergebnisse
3.3.1. EPA-Gehalte verschiedener Sporangienstämme v on P. halstedii
Es galt die Frage zu klären, ob Stämme existieren, die besonders leistungsstark in
der n-3-FS-Produktion sind. Der Stamm BL-11.06.02-A4z enthielt mit durchschnittlich
fast 25 mg EPA/g Sporangien signifikant mehr EPA als die Stämme GG-16.10.97-
A25, LS-13.12.05-C6 und HE-10.01.06-A8, die durchschnittlich 20 und 18 mg EPA/g
Sporangien enthielten (Abb. 3.2.).
0
5
10
15
20
25
30
BLA4 GGA25 HEA8 LSC6P. halstedii Stämme
mg E
PA
/g S
pora
ngie
n
Abb. 3.2.: EPA-Gehalte der untersuchten P. halstedii Stämme: BL-11.06.02-A4z (BL-A4), GG-
16.10.97-A25 (GGA25), HE-10.01.06-A8 (HE-A8), LS-13.12.05-C6 (LS-C6). Dargestellt sind die
Mittelwerte aus n=63 Messungen und die Standardfehler. Verschiedene Buchstaben stellen signifi-
kante Unterschiede dar.
Da BL-11.06.02-A4z die höchste EPA-Konzentration aufwies, wurde dieser Stamm
für die Untersuchung von weiteren Optimierungsschritten verwendet.
3.3.2. Besonders anfällige Sonnenblumensorten und - linien
In infiziertem Zustand zeigten die Sorte Giganteus und die Linie DM-2 die höchsten
Biomassen (Abb. 3.3.), wogegen die Linien 799-2 und 803-1 sehr wachstums-
schwach waren. Die Produktion von EPA korrelierte sehr stark mit der Biomasse der
Wirtspflanze (vgl. Abb. 3.3. u. 3.4.). Es gab bei einer Infektion im selben Zeitraum
stark anfällige Wirte wie Giganteus und DM-2, die bei viel Biomasse viel EPA
enthielten, es gab jedoch auch wenig anfällige Linien wie PM17, die bei viel
a
b b b
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
52
Biomasse wenig EPA enthielten. Als dritte Variante gab es noch Linien, die nicht viel
Biomasse bilden konnten und dementsprechend wenig EPA enthielten wie 803-1 und
799-2.
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
Sorte/Linie
TG
[g]
Mittleres TG [g] 0,05 0,02 0,04 0,04 0,02 0,02 0,01 0,04 0,01 0,04
Giganteus
HA 821
HA 304
RHA 265
RHA 274
PM 13 799-2 PM 17 803-1 DM-2
Abb. 3.3.: Mittlere Trockengewichte TG (g) mit Standardfehler von 20 P. halstedii-infizierten Keim-
lingen einer Sonnenblumensorte bzw. -Linie. Unterschiedliche Buchstaben stehen für statistisch
signifikante Unterschiede in der Biomasse.
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
Sorte/Linie
EPA [m
g/g
TG
)
EPA [mg/g TG] 0,98 0,88 1,07 0,87 0,72 0,86 0,68 0,28 0,31 1,10
Giganteus
HA 821
HA 304
RHA 265
RHA 274
PM 13 799-2 PM 17 803-1 DM-2
Abb. 3.4.: Mittlere EPA-Gehalte mit Standardfehler (mg/g TG) von je 20 P. halstedii-infizierten Keim-
lingen einer Sorte bzw. Linie. Unterschiedliche Buchstaben stehen für statistisch signifikante
Unterschiede in der EPA-Produktion.
Die Sorte Giganteus und die Linien HA304 und DM-2 konnten vom Stamm BL-
11.06.02-A4z bei den höchsten EPA-Durchschnittsgehalten pro g Biomasse am
besten infiziert werden. Die höchst erzielbaren Konzentrationen an EPA im Wirt
a a
b b b
c c c
d d
a b
c
b
a
b
c
d d
a
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
53
betrugen bei voller Infektion und vor Sporulation bei Giganteus im Mittel 0,98 mg
EPA/g TG, bei HA 304 1,07 und bei DM-2 sogar 1,10 mg/g TG, wobei jedoch keine
statistischen Unterschiede zwischen den 3 Wirten festgestellt werden konnten (Abb.
3.4.).
3.3.3. Variation des Infektionsdrucks
Ziel war es, das Optimierungspotenzial von Biomasse und EPA-Gehalt durch den
Infektionsdruck über die Variation des Erregerinokulums zu untersuchen. Eine
Infektionszeit von etwa 2 Wochen war erwünscht, da ab diesem Zeitraum unter
gegebenen Bedingungen (vgl. Kap. 2.1.1.1.) die Biomassen der Keimblätter der
Sonnenblumen maximal ausgebildet waren.
Bei einem Inokulum von 10000 Sporangien/ml wurde ein Durchschnittsgewicht von
2,7 g/Keimling erreicht (Abb. 3.5.), alle Pflanzen der Infektionsstufe zeigten nach 16
Tagen und Inkubation über Nacht Sporulation. Die Keimlinge bei einer Inokulation
von 5000 Sporangien/ml erreichten mittlere Gewichte von 3,02 g, 3 Pflanzen zeigten
keine Sporulation.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
c(Sp.)/ml
FG
[g]
FG (g) 3,68 3,34 3,03 2,77
gesund (0) 2000,00 5000,00 10000,00
Abb. 3.5.: Mittlere Frischgewichte von 25 infizierten (Stamm BL-11.06.02-A4z) Sonnenblumen (Sorte
Giganteus) mit Standardfehler bei versch. Sporangieninokuli (16 Tage Infektionszeit): c=2000
Sporangien/ml, 5000 Sporangien/ml, 10000 Sporangien/ml. Verschiedene Buchstaben stellen statis-
tisch signifikante Unterschiede dar.
Mit einem mittleren Gewicht von 3,34 g waren die Biomassen der Keimlinge bei 2000
Sporangien/ml am besten ausgeprägt, jedoch gab es bei dieser Behandlung 10 von
25 Pflanzen, die nach Inkubation keine Sporulation zeigten und damit nicht sichtbar
a
b a
b
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
54
infiziert waren. Nach 16 Tagen Infektionszeit, bei einem Sporangieninokulum von
10000 Sporangien/ml starben 7 von 25 Keimlingen vor der Ernte (Abb.3.6.). Bei
einem Inokulum von 5000 Sporangien/ml starben nur 3 Pflanzen, bei 2000
Sporangien/ml starben nur 2 von 25 Pflanzen frühzeitig ab.
Die höchsten Biomassen bei geringer Letalität und guter allgemeiner Infektion (wenig
gesunde Pflanzen) erreichten die Keimlinge bei einer Infektion mit 5000 Sporan-
gien/ml. Bei steigender Sporangienanzahl nahmen die FG von infizierten Sonnen-
blumen deutlich ab und die Letalität stieg, bei niedrigerer Sporangienzahl gab es zu
viele Pflanzen ohne Befallssymptome.
0
5
10
15
20
25
30
c(Sp.)/ml
Stü
ck
Letale Pfl. 0 2 3 7
gesunde Pfl. 25 10 3 0
gesund (0) 2000 5000 10000
Abb. 3.6. : Letalität bei versch. Sporangieninokuli (16 Tage Infektionszeit): c=2000 Sporangien/ml,
5000 Sporangien/ml, 10000 Sporangien/ml. Sonnenblumen der Sorte Giganteus, gesund und nach
Infektion mit dem Stamm BL-11.06.02-A4z.
Eine Infektionsdauer über 20 Tage hinaus führte unter gegebenen Bedingungen im
Klimaschrank meist zu Totalausfall, da die Pflanzen durch fortschreitende Infektion
umkippten und faulten.
Die besten Infektionsergebnisse bezüglich Biomasse der Keimblätter und Infektions-
grad (= Ausbreitungsfläche für den Erreger bei gleichzeitigem Anstieg des EPA-
Gehaltes) zeigten sich daher nach etwa 2 Wochen Infektionszeit bei dem Inokulum
von 5000 Sporangien/ml.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
55
3.3.4. Variation des Stickstoffangebotes
3.3.4.1. Wachstum und Gewichte
In diesem Kapitel sollte geklärt werden, ob mit Hilfe der N-Düngung die
Wirtsbiomasse oder die EPA-Konzentrationen in infiziertem Gewebe gesteigert
werden konnten. Das Wachstum der infizierten Pflanzen in Hydrokultur zeigte die
Erreger-typischen Symptome (ROZYNEK 2000): P. halstedii verursachte Wuchs-
hemmung, Blattchlorosen und verdickten Wurzelhals bei infizierten Sonnenblumen.
Befallene Pflanzen waren somit bereits visuell von den Kontrollpflanzen ohne
Infektion deutlich zu unterscheiden.
Verglich man die N-Stufen 1, 2 und 3 der infizierten Pflanzen miteinander, so fiel auf,
dass die oberirdischen Teile aller N-Stufen ähnlich klein blieben und wenige optische
Unterschiede zwischen den Behandlungen feststellbar waren (Abb. 3.7. oben).
Abb. 3.7.: Vergleich des Wachstums 15 Tage alter Sonnenblumen bei 3 N-Stufen. Oben: Infizierte
Sonnenblumen, unten: Gesunde Sonnenblumen. Von links nach rechts sieht man das Wachstum bei
0,1 mM, 1 mM und 5 mM Ca(NO3)2 pro Topf.
Die Wurzelfarbe der infizierten Pflanzen war bei der niedrigsten N-Stufe 0,1 mM
Ca(NO3)2/Topf weiß, bei der mittleren N-Stufe 1,0 mM Ca(NO3)2 gelblich und bei der
höchsten N-Stufe mit 5,0 mM Ca(NO3)2/Topf braun. Dies war ein Indiz dafür, dass
sich hohe Ca(NO3)2-Gaben toxisch auf das Wurzelwachstum der infizierten Pflanzen
auswirkten. Im Vergleich zu den gesunden Kontrollpflanzen waren alle infizierten
Pflanzen deutlich kleiner und schwächer entwickelt.
0,1 mM 1,0 mM 5,0 mM
0,1 mM 1,0 mM 5,0 mM
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
56
Verglich man die N-Stufen der gesunden Variante untereinander, dann wiesen die
Kontrollpflanzen zwischen allen 3 N-Stufen deutliche Unterschiede im Wachstum der
oberirdischen und der unterirdischen Pflanzenteile auf (Abb. 3.7. unten). Mit 0,1 mM
Ca(NO3)2 waren die Keimblätter ausgewachsen, die Primärblätter waren jedoch, im
Vergleich mit den beiden höheren N-Stufen unterentwickelt. Das Wurzelwachstum
der Mangelvariante stand ebenfalls sichtbar hinter dem Wurzelwachstum bei
höheren N-Gaben zurück. Von der optimalen N-Stufe mit 1,0 mM Ca(NO3)2 pro Topf
zur überdüngten Variante mit 5,0 mM Ca(NO3)2/Topf war eine leichte Abnahme der
Wurzelmasse und der oberirdischen Pflanzenmasse zu sehen.
Die Frischgewichte von 40 gesunden und infizierten Pflanzen derselben Düngungs-
stufe wurden miteinander verglichen und statistisch mit einem multiplen Mittelwerts-
vergleich überprüft (Abb.3.8.). Die mittleren Frischpflanzengewichte der
Stickstoffstufen N1 und N3 innerhalb der gesunden Variante (Kontrolle) lagen mit 2,2
bzw. 2,17 g signifikant (p<0,01) unter den Frischgewichten der optimal gedüngten
Stufe N2 mit 3,3 g.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
Ca(NO3)2/Topf
FG
[g]
K [g] 2,21 3,32 2,71
I [g] 0,66 0,77 0,68
0,1 mM 1 mM 5 mM
Abb. 3.8.: Mittlere FG (mit Standardfehler) von je 40 gesunden (K) und infizierten (I), 15 Tage alten
Sonnenblumen. Von links nach rechts sieht man nebeneinander die Gewichte der N-Stufen 1 bis 3 mit
0,1m 1 und 5 mM Ca(NO3)2 pro Topf. Unterschiedliche Buchstaben stellen statistisch signifikante
Unterschiede dar.
Die mittleren FG der infizierten Pflanzen lagen mit etwa 0,7 g insgesamt signifikant
unter denen der gesunden, gleichaltrigen Kontrollpflanzen, die Gewichte bis zu 3,3 g
b
a
c
d e e
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
57
pro Pflanze erreichten. Innerhalb der infizierten Pflanzen ließ sich zusätzlich
beweisen, dass die Pflanzen der mittleren Düngungsstufe mit durchschnittlich 0,77 g
signifikant mehr Biomasse aufwiesen, als die Pflanzen der anderen beiden
Düngungsstufen.
3.3.4.2. Infektion und Befallsgrad
Es wurden Sporulationsversuche ausgeführt, um Infektion und Befallsgrad der 3 N-
Stufen zu testen. Hierzu wurden von 28 Pflanzen die Keimblattpaare abgenommen
und zur Sporulation gebracht (vgl. Kap. 2.1.1.1.). Es gab statistisch signifikante
Unterschiede zwischen den Sporangienzahlen der Keimblattpaare der verschie-
denen Düngerstufen (Abb. 3.9.). Die mittlere Stufe N2 wies mit 72708 Sporangien
pro Keimblattpaar einen statistisch signifikant höheren Mittelwert auf, als die nicht
optimal gedüngten Stufen N1 und N3 mit mittleren Sporangienzahlen von 33088 und
36428 Sporangien pro Keimblattpaar.
0
20000
40000
60000
80000
100000
N-Stufe
Sp
oran
gien
pro
K
eim
blat
tpa
ar
Sp/KB-Paar 33088 72708 36428
0,1 mM 1 mM 5 mM
Abb. 3.9. : Mittlere Sporangienzahlen von 28 Keimblattpaaren infizierter Pflanzen bei 3 N-Stufen mit
Standardfehlerbalken. Unterschiedliche Buchstaben kennzeichnen statistisch signifikante Unterschie-
de zwischen den Behandlungen.
Zusätzlich durchgeführte Messungen der Blattflächen der Keimblattpaare zeigten,
dass die Sporangienzahlen eine positive Korrelation zur durchschnittlichen Blatt-
fläche der Keimblattpaare aufwiesen. Je größer die durchschnittliche Blattfläche war,
umso mehr Sporangien wurden gefunden. So wiesen Keimblattpaare der Mangel-
a
b
a
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
58
Stufe N1 die kleinsten durchschnittlichen Oberflächen mit 2,0 cm²/Keimblattpaar auf,
Keimblattpaare der Stufe N2 hatten mit 2,6 cm²/Keimblattpaar die größten Blatt-
flächen und die Stufe N3 zeigte einen mittlere Blattfläche von 2,2,cm²/Keimblattpaar.
3.3.4.3. Gesamt-N-Gehaltsbestimmung in Sonnenblumen pflanzen
Grenzwerte für die optimale N-Düngung wurden aus der Literatur entnommen
(REUTER et al. 1997) und mit vorliegenden Werten der N-Analyse verglichen. Für
Sonnenblumenkeimlinge wird der Literatur-Grenzwert für ausreichende N-Versor-
gung bei 5,21 N(%) angesetzt. In diesem Versuch wurden Gesamt-N Gehalte von 4
bis 7,5 N(%) erreicht. Mit der Elementaranalyse konnte für die Kontrolle gezeigt
werden, dass die Pflanzen der Töpfe der Stufe N1 mit durchschnittlich 4 % N unter
der Grenze von 5% lagen und damit als unterversorgt eingestuft werden konnten
(Abb. 3.10.). Die Pflanzen der Stufe N2 lagen mit 6,3% N im Trockengewicht daher
im optimal versorgten Bereich (Abb. 3.10). Die Pflanzen der Stufe N3 waren mit
7,41% Gesamt-N im Stickstoffüberschuss.
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
N-Stufe
Ge
sam
t N in
Ge
wic
hts-
%
Kontrolle 3,94 6,31 7,41
Befallen 6,84 6,16 5,88
0,1 mM (N1) 1 mM (N2) 5 mM (N3)
Abb. 3.10.: Gesamt-N Gehalte (% TG) von gesunden (Kontrolle, gestreifte Balken) und P. halstedii-
befallenen Sonnenblumen (weiße Balken) bei 3 N-Stufen.
Bei den infizierten Pflanzen der Stufe N1 waren die Prozentanteile von N am TG sehr
viel höher als bei der Kontrolle, wobei sich ein deutlicher N-Verdünnungseffekt von
N-Stufe 1 nach N-Stufe 3 zeigte. Es wurde zwar N angeboten, die ansteigenden
Mengen konnten jedoch nicht assimiliert werden.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
59
Die N-Bilanz (vgl. Kap. 3.2.4.4.) bestätigte die Aussage der Literatur-Grenzwerte. So
nahmen die gesunden Pflanzen bei optimaler N-Versorgung (N2) etwa soviel
Stickstoff auf (0,006 g pro Pflanze), wie in der Nährlösung angeboten wurde (0,007
g). Bei einem Überangebot von 0,035 g N/Pflanze in den Nährlösungen konnte von
den Pflanzen ebenfalls nur 0,006 g N/Pflanze aufgenommen werden. Im N-Mangel
Nährmedium stand mit 0,0007-0,0014 g N/Pflanze weniger N zur Verfügung als pro
Pflanze/Topf durchschnittlich assimiliert wurde (0,0015 g N/Pflanze).
Die N-Bilanz für die infizierten Pflanzen ergab, dass mit steigendem N-Angebot zwar
mehr N assimiliert wurde (N-Aufnahme: Stufe N1 0,00041 g N/Pflanze, Stufe N2
0,00049 g N/Pflanze, Stufe N3 0,00058 g N/Pflanze), die Gesamtaufnahme jedoch
stark unter dem Niveau der gesunden Sonnenblumenpflanzen lag und das Angebot
an N in der Nährlösung bei allen 3 N-Stufen nicht ausgeschöpft werden konnte.
3.3.4.4. EPA-Konzentrationen bei 3 N-Stufen
Für die infizierten und gesunden Pflanzen der 3 N-Stufen wurden qualitative und
quantitative Vergleiche der FS mit den höchsten Anteilen am FS-Muster durchgeführt
Diese wurden zunächst exemplarisch als Signalflächenmuster dargestellt (Abb. 3.11.
u. 3.12.). Es folgten die Analyse und der Vergleich der FS-Konzentrationen der
Behandlungen in mg pro g TG für die N-Stufen 1 bis 3 (Abb. 3.13.).
Bei gesunden Pflanzen bestand das Fettsäuremuster hauptsächlich aus den Fett-
säuren 18:3 n-3 mit über 50% Anteil am Gesamtmuster, 18:2 n-6 mit etwa 30%, 18:1
n-9 mit etwa 5% und 16:0 mit etwa 10 % am Gesamtanteil des Fettsäuremusters
(Abb. 3.11.). Die FS 14:0, 16:0, 16:1, 18:1 n-9, 18:2 n-6, 18:3 n-3 und 20:5 n-3 waren
die dominierenden FS der P. halstedii-infizierten Pflanzen (Abb. 3.12.), wobei von
gesunden Sonnenblumen weder 16:1 noch 20:5 n-3 produziert wurden. Die Flächen-
signale der FSME aus infizierten Pflanzen waren, trotz ähnlicher Pflanzeneinwaagen,
deutlich stärker als die aus gesunden Pflanzen.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
60
Abb. 3.11.: Fettsäuremuster von gesundem Sonnenblumenkeimblatt. Sorte Giganteus mit den FS
16:0, 18:1 n-9, 18:2 n-6 und 18:3 n-3 auf der Säule CP7419.
Abb. 3.12.: FS-Muster von den Keimblättern einer P. halstedii-infizierten Sonnenblume. Sorte
Giganteus mit dem kombinierten Muster von P. halstedii und Sonnenblume auf der Säule CP7419.
Die Fettsäurekonzentrationen stiegen innerhalb der gesunden Variante bei den
ungesättigten FS 18:2 n-6 und 18:3 n-3 von Stufe N1 (0,1 mM) nach Stufe N3 (5
mM) signifikant an (vgl. Abb. 3.13.). Die Stufen N1 und N2 zeigten keine signifikanten
Unterschiede.
Auch bei den infizierten Sonnenblumen lagen die Konzentrationen der FS bei N-
Stufe 1 insgesamt deutlich niedriger, als bei der höchsten Stufe N3 (Abb. 3.14.).
Bei den FS 16:0, 18:2 n-6 und 20:5 n-3, die für P. halstedii typisch sind, waren diese
Unterschiede zwischen den Stickstoffstufen N1 und N3 ebenfalls signifikant (p<0,01).
Die höchsten Fettsäuregehalte für 20:5 n-3 und 18:2 n-6 mit 1,8 und 2,2 mg/g TG
wurden von infizierten Pflanzen der höchsten Stufe N3 mit 5,0 mM Ca(NO3)2/Topf
erzielt (vgl. Tab. 3.14.).
14:0
16:0
17:0 IS
18:1 n-9
18:2 n-6
18:3 n-3
20:5 n-3
16:0 18:1 n-9
18:2 n-6
18:3 n-3
17:0 IS
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
61
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
FAME
mg
FS
/g T
G
0,1 mM 0,25 0,19 0,58 0,94
1 mM 0,23 0,09 0,47 0,84
5 mM 0,28 0,09 0,85 1,42
16:0 18:1 18:2 n-6 18:3 n-3
Abb. 3.13.: FS-Gehalte von gesunden Sonnenblumen (15 Tage) bei 3 N-Stufen: 0,1 mM, 1,0 mM und
5,0 mM Ca(NO3)2 pro Topf. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardfehler.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
FAME
mg F
S/g
TG
0,1 mM 0,18 0,98 0,02 0,75 1,74 0,22 0,69
1 mM 0,39 1,79 0,26 1,05 1,94 0,58 1,23
5 mM 0,30 1,53 0,07 0,96 2,26 0,43 1,80
14:0 16:0 16:1 18:1 18:2 n-6 18:3 n-3 20:5 n-3
Abb. 3.14.: FS-Gehalte von P. halstedii-infizierten Sonnenblumen (15 Tage) bei 3 N-Stufen: 0,1 mM,
1,0 mM und 5,0 mM Ca(NO3)2 pro Topf. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardfehler.
Verglich man die FS-Konzentrationen zwischen den Behandlungen gesund/infiziert,
(Abb. 3.13. u. 3.14.) so produzierten die gesunden Keimblätter im Gesamtmittel 2,6
mg FS/g TG bei Stufe N3, bei der infizierten Variante war es auf derselben N-Stufe
mit 7,0 mg FS/g TG mehr als das Doppelte. Dabei fiel jedoch die FS 18:3 n-3 etwas
aus dem Rahmen, da die Gehalte in gesunden Pflanzen von Stufe N1 nach Stufe N3
signifikant stiegen, wogegen sie in infizierten Keimblättern bei der höchsten N-Stufe
absanken.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
62
3.4. Diskussion
3.4.1. Optimierungspotenzial durch die Selektion von Pathogenstämmen
Das artinterne Sporangienscreening zeigte, dass Stämme von P. halstedii existier-
ten, die im Durchschnitt statistisch signifikant mehr EPA produzieren konnten als
andere Stämme. Mit BL-11.06.02-A4z stand ein Stamm zur Verfügung, der 25-30 mg
EPA/g Sporangien produzieren konnte. Es war eine Steigerung von 25% zwischen
den untersuchten Stämmen möglich. Diese geringe Steigerungsmöglichkeit des
EPA-Gehaltes innerhalb der Art P. halstedii genügte jedoch nicht, um den EPA-
Gehalt in geforderter Weise so zu steigern, dass der Verzehr von infizierten Sonnen-
blumenkeimlingen einen erheblichen EPA-Gewinn durch das potenzielle Nahrungs-
mittel darstellen würde. Es muss allerdings bemerkt werden, dass lediglich 4 unter-
schiedliche Stämme verschiedener Feldisolate auf ihre EPA-Gehalte untersucht
wurden. Es kann zu diesem Zeitpunkt daher nicht ausgeschlossen werden, dass
leistungsfähigere Stämme oder Isolate von P. halstedii oder auch anderer Arten wie
z.B. B. lactucae existieren, bei denen deutlichere Leistungsunterschiede vorhanden
sind.
3.4.2. Optimierungspotenzial durch die Selektion von Wirtspflanzen
Erwünscht war ein möglichst geringes Biomasse/EPA-Verhältnis, da möglichst viel
EPA pro Biomasse im Pflanzengewebe enthalten sein sollte.
Mit der Sorte Giganteus konnte man aufgrund der großen Samen besonders gut
arbeiten. Sie gehörte mit der Linie DM-2 zu den Wirten, mit der besten Biomasse-
entwicklung und dem besten Biomasse/EPA-Verhältnis, wenn mit dem besonders
EPA-haltigen Sporangienisolat BL-11.06.02-A4z infiziert wurde (Abb. 3.3. u. 3.4.),
jedoch auch andere Isolate erzielten gute EPA-Gehalte auf der Sorte Giganteus.
Die Wirt/Pathogen-Kombination Giganteus/BL-11.06.02-A4z schien für weitere Opti-
mierungsversuche besonders geeignet. Da jedoch, aufgrund genannter Vorzüge,
bereits im Vorfeld der Optimierungsversuche (Kap. 2.2.) mit der Sorte Giganteus
gearbeitet wurde, war der Optimierungsspielraum durch einen besonders anfälligen
Wirt bereits ausgereizt, und infiziertes Gewebe erreichte lediglich die bisher
gemessenen EPA-Gehalte von durchschnittlich 1 mg/g TG.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
63
3.4.3. Optimierungspotenzial durch variierten Infekt ionsdruck
Über den Infektionsdruck konnte der Infektionsverlauf gesteuert werden. Mit Hilfe der
Inokulation definierter Sporangienkonzentrationen wurde in einem definierten Zeit-
raum eine relativ homogene, gleichmäßige Infektion von Sonnenblumenkeimlingen
derselben Sorte erreicht. Dies war Voraussetzung für vergleichbare Ergebnisse und
optimale Erntemöglichkeiten von Sporangien und infiziertem Pflanzengewebe. Der
Spielraum für eine Optimierung des Infektionsdrucks war jedoch sehr begrenzt, da im
selben Zeitraum bei zu hohem Inokulum die Infektion schneller verlief und zu
statistisch vermehrtem Pflanzenausfall führte, wogegen ein zu niedrig gewähltes
Inokulum für eine Infektion innerhalb des gewähltes Zeitraumes nicht genügte.
Infizierte Pflanzen bei zu hohem Sporangieninokulum zeigten daher verfrühte
Letalität, Pflanzen bei zu niedrigem Sporangieninokulum wurden entweder nicht
infiziert oder konnten, trotz Infektion (Nachweis über EPA-Gehalt), nach dem
definierten Infektionszeitraum nicht mehr zur Sporulation gebracht werden.
Zur Optimierung des EPA-Gehaltes war der Infektionsdruck daher zwar indirekt
wichtig, um einen gleichmäßigen Infektionsverlauf und gute Ernteergebnisse zu
erzielen, direkte EPA-Steigerungsmöglichkeiten waren damit jedoch nicht möglich.
3.4.4. Optimierungspotenzial durch variierte N-Düngu ng
Das Wachstum verlief für gesunde und infizierte Pflanzen bei den 3 N-Stufen sehr
unterschiedlich. Die gesunde Variante verhielt sich bezüglich der gebildeten Bio-
masse gemäß den Düngeregeln. Je mehr N den gesunden Pflanzen angeboten
wurde, umso mehr N wurde in das Pflanzengewebe eingelagert (MARSCHNER 1995).
Die infizierte Variante blieb im Wachstum bei allen N-Stufen stark hinter der Kontrolle
zurück und konnte den zusätzlichen Stickstoff nicht umsetzten. Dieses Wachs-
tumsverhalten stimmte sowohl mit der Elementaranalyse des Anteils an N im
Pflanzengewebe, als auch mit der N-Bilanz überein. Für Sonnenblumenkeimlinge
wird dort der Literatur-Grenzwert für ausreichende N-Versorgung bei 5,21 N(%)
angesetzt. In diesem Versuch wurden Gesamt-N Gehalte von 4 bis 7,5 N(%) erreicht.
Bei infizierten Sonnenblumen zeigte sich dabei ein negativer Verdünnungseffekt
(Abb. 3.10.), trotz steigendem N-Angebot konnte kein zusätzlicher Stickstoff
assimiliert werden. Auffällig waren zudem die deutlich höheren N-Gehalte der
infizierten Variante der Stufe N1 im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 3.10.). So lagerten
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
64
infizierte Pflanzen der Stufe N1 ca.7 % N ins Gewebe ein, die gesunden Kontrollen
jedoch nur ca. 4 % N. Bei der optimal gedüngten Stufe N2 gab es mit ca. 6 % N im
Pflanzengewebe keine Unterschiede zwischen infizierter und gesunder Variante. Bei
der hoch gedüngten Stufe N3 enthielt die Kontrolle mit ca. 7 % N signifikant mehr N
als die infizierte Variante mit nur 6 % N.
Eventuell löste die Infektion als „Stressfaktor“ eine gesteigerte N-Assimilation aus.
Solche Reaktionen sind aus der Literatur bekannt, bei moderatem Salzstress wurden
z.B. für Gossypyrum hirsutum L. (PESSARAKLI & TUCKER 1985) und für Solanum
melongena L. (PESSARAKLI & TUCKER 1988), trotz Wachstumsdepression der
Pflanzen, signifikante Anstiege in der N-Assimilation ins Gewebe registriert, wobei
dieser Effekt bei sehr hohem Salzstress nicht mehr nachgewiesen wurde und die
Kontrollpflanzen mehr N pro Trockenmasse zeigten. Dieses Ergebnis deckt sich
auch mit den Beobachtungen dieser Arbeit. Von den infizierten Pflanzen der höheren
N-Stufen wurde gegenüber der Kontrolle weniger N ins Gewebe assimiliert. Dies
stand wohl mit dem zusätzlichen Stressfaktor der zunehmenden Wurzelschädigung
bei steigender N-Düngung in Zusammenhang.
Bei den Sporulationsversuchen zu Infektion und Befallsgrad zeigte sich, dass optimal
gedüngte Pflanzen deutlich mehr Sporulation aufwiesen als die Pflanzen der niedrig
und hoch gedüngten N-Variante. Es zeigte sich jedoch, dass sowohl die mittlere
Biomasse, als auch die mittlere Blattfläche der infizierten Pflanzen bei optimaler N-
Stufe signifikant höher waren, als die der beiden anderen N-Stufen. Da mit
vermehrter Biomasse mehr Keimblattfläche und damit mehr Sporulationsfläche zur
Verfügung stand, konnten aufgrund dieser positiven Korrelation bei der mittleren N-
Stufe am meisten Sporangien geerntet werden.
Die Fettsäuremessungen zeigten, dass hohe Gaben an Ca(NO3)2 hohe Konzen-
trationen an n-3-FS in Pflanzengewebe förderten. Der ALA (18:3 n-3) Gehalt stieg
mit zunehmender N-Stufe bei gesunden Pflanzen signifikant an. Diese Ergebnisse
stimmten mit den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen überein, die versuchten
Fettsäuregehalte von Pflanzen über den Weg der N-Düngung zu beeinflussen. Bei
hohen Stickstoffgaben in hydroponischer Kultur ließen sich z.B. auch die n-3-FS-
Gehalte von Portulak signifikant steigern (FONTANA et al. 2006; RANI PALANISWAMY et
al. 2000).
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
65
In infizierten Pflanzen stiegen die EPA Gehalte mit steigenden N-Konzentrationen in
der Nährlösung ebenfalls deutlich an. Untersuchte Keimblätter der höchsten N-Stufe
mit 5,0 mM (CaNO3)2 zeigten dabei die höchsten EPA-Gehalte. Eventuell förderten
hohe Stickstoffgaben den Befall mit Falschem Mehltau. Dass hohe Stickstoffgaben
den Befall mit Falschem Mehltau fördern, wurde aktuell für Wegerich gezeigt
(MANDAL et al. 2008). Gegenüber vorherigen Optimierungsversuchen bei denen
höchstens 1 mg EPA/g TG erzielt werden konnte, war es mit Hilfe von N immerhin
möglich, die EPA-Konzentration in infiziertem Gewebe um Faktor 2 auf ca. 2 mg/g
TG zu steigern.
Auffällig war dabei, dass die FS-Gehalte in infizierten Pflanzen, außer für 18:3 n-3,
insgesamt deutlich höher waren als in gesunden Pflanzen. Die zusätzlichen FS
wurden wohl von P. halstedii gebildet, denn es waren hauptsächlich die Hauptfett-
säuren von P. halstedii, wie 16:0, 18:2 n-6 und 20:5 n-3, die in infizierten Pflanzen
vermehrt vorkamen. Dass allein die FS 18:3 n-3 bei infizierten Pflanzen in deutlich
geringerem Maße vorkam, als bei Kontrollpflanzen, war interessant. Ein Grund dafür
könnte die Verwendung von 18:3 n-3 als Substrat für die Synthese von EPA sein
(SAYANOVA & NAPIER 2004; TRIPODI et al. 2006), von der, vor allem von der infizierten
der Stufe N3, erhebliche Mengen (1,8 mg/g TG) produziert wurden. Für manche
Mikroalgen wurde bereits bewiesen, dass 18:3 n-3 als Substrat für die Biosynthese
von EPA oder DHA dient (TONON et al. 2005).
Im Rahmen von Optimierungsstudien bezüglich der Produktion von EPA bei
Mikroalgen und heterotrophen Oomyceten führten andere Forschergruppen bereits
Ernährungsstudien mit Stickstoff durch, für obligat-biotrophe Oomyceten ist die
vorliegende Studie diesbezüglich die erste.
Zählt man die Ergebnisse anderer Studien auf, so produzieren die heterotrophen
Oomyceten Schizochytrium und Thraustochytrium in N-Mangel-Medium mehr EPA
und DHA als in N-reichem Medium (HUANG et al. 2001; WARD & SINGH 2005). Die
Mikroalge Pavlova lutheri hat unter N-Mangel ebenfalls eine verbesserte EPA-
Produktion (CARVALHO et al. 2005) und auch Eismeerdiatomeen erhöhen die EPA-
Produktion in Phospholipiden bei N-Mangel (MOCK & KROON 2002). Bei N-Mangel ist
zudem die EPA-Produktion von Nitzschia laevis erhöht.
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
66
Es existieren jedoch auch Studien zu Mikroalgen mit gegenteiligen Ergebnissen.
Diese Arten erhöhen ihre EPA-Produktion, wenn viel Stickstoff im Nährmedium ist.
Phaeodactylum tricornutum produziert bei viel N im Medium mehr EPA
(YONGMANITCHAI & WARD 1991), ebenso verhalten sich Nannochloropsis oculata und
Thalassiosira pseudonana (TONON et al. 2002). Im Widerspruch zu dem phylo-
genetisch näher verwandten Oomyceten Schizochytrium und Thraustochytrium
produzierte P. halstedii bei höheren N-Gaben an den Wirt mehr EPA und verhielt
sich daher ähnlich wie die phototrophen Algen Phaeodactylum tricornutum,
Nannochloropsis oculata und Thalassiosira pseudonana, die ebenfalls mehr EPA
produzieren, je mehr N im Nährmedium vorhanden war (TONON et al. 2002).
Beim Wirt/Pathogen System Sonnenblume/P. halstedii konnte das Pathogen nicht
direkt in einem Nährmedium gezogen werden, da es sich vom lebenden Wirt ernährt.
Daher mussten die Zusammenhänge komplexer betrachtet werden. Wurde dem Wirt
mehr N zur Verfügung gestellt, so konnte auch im infizierten Gewebe deutlich mehr
EPA nachgewiesen werden. Da EPA allein von P. halstedii stammt, kann festgestellt
werden, dass hohe N-Gaben den Erreger wohl fördern. Dies konnte zum Einen mit
der dichteren Ausbreitung des Erregers in Pflanzengewebe in Verbindung stehen,
dem zu Gunsten von Proteinen und Aminosäureverbindungen die stabilisierenden
Strukturelemente verloren gingen. Eine weitere Erklärung wäre eine verbesserte
EPA-Synthese im Mycel von P. halstedii wegen des Vorhandenseins von mehr FS-
Substrat für die EPA-Synthese im Pflanzensaft, denn auch gesunde Pflanzen
erhöhten bei vermehrter N-Gabe ihren ALA-Anteil im Gewebe.
3.5. Schlussfolgerungen
Die Grenzen der Optimierbarkeit innerhalb geeigneter Parasitenstämme und
Wirtspflanzen waren mit 30 mg EPA/FG für Sporangien und 1 mg EPA/g TG für
Pflanzengewebe erreicht. Mithilfe des Faktors Stickstoffernährung und gesteigerten
N-Gaben an die Wirtspflanzen konnten die EPA-Gehalte des genetisch homogenen
Stammes BL-11.06.02-A4z immerhin um Faktor 2 von 1 mg EPA/g TG auf 2 mg
EPA/g TG gesteigert werden. Um in realistische Dimensionen für die direkte mensch-
liche Ernährung zu kommen, wäre eine Steigerung der EPA-Konzentrationen in
Sporangien oder infiziertem Wirtsgewebe um Faktor 10 nötig gewesen (vgl. Kap. 2.).
3. Optimierung der EPA-Konzentrationen am Modellbeispiel P. halstedii
67
In der Studie einer anderen Arbeitsgruppe, wobei es im die Erhöhung der Produktion
von Docosapentaensäure (DPA, 22:5 n-3) in einer Pilzkultur von Pythium acanthicum
im Bioreaktor ging, blieb die erreichbare Menge an n-3-FS nach Optimierungs-
versuchen ebenfalls auf 1-5 mg DPA/g Biomasse beschränkt (SINGH & WARD 1998).
Die Möglichkeit der direkten Nutzung von EPA aus infizierten Pflanzen für die
menschliche Ernährung bleibt somit weiterhin fraglich. Da aus Kap. 2 jedoch hervor-
ging, dass eventuell erzielbare Mengen auf großer Fläche mit den gewonnenen
Mengen aus Bioreaktoren konkurrenzfähig waren und in infiziertem Gewebe immer-
hin 1-2 mg EPA/g TG erreicht wurde, schien es denkbar und realistisch die FS EPA
aus B. lactucae zwar nicht durch technische Anreicherung in Kapseln, jedoch durch
natürliche Anreicherung über die Nahrungskette nutzbar zu machen.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
68
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in
Hühnereiern
4.1. Hintergrund und Zielsetzung des Fütterungsexper iments
Als Futterzusätze zur Steigerung der Gehalte von DHA und EPA im Eidotter werden
derzeit n-3-FS-haltige Pflanzenöle wie Leinöl (CASTON & LEESON 1990; STEINHILBER
2003) aber auch Robbenöl und Fischöl (SCHREINER et al. 2004) verwendet. Analog
zur Nahrungskette im Meer sollte versucht werden, über die Nahrungskette mit
infiziertem Salat, der an Hühner verfüttert wurde, den EPA- oder DHA-Gehalt im
Eidotter zu erhöhen.
Da Salat in großen Mengen von Hühnervögeln verzehrt werden kann und B. lactucae
unter beschriebenen Bedingungen in infiziertem, getrocknetem Pflanzengewebe bis
zu 1mg EPA/g produzierte (vgl. Kap. 2.2.3.), stand ein Wirt/Parasit-System mit
geeignetem FS-Muster für einen Nahrungskettenversuch zur Verfügung. Hierzu
waren mehrere, bisher ungeklärte Voraussetzungen zu überprüfen: 1.) Lässt sich für
eine Fütterung genügend infiziertes Pflanzenmaterial gewinnen? 2.) Wie hoch sind
die erzielbaren EPA-Gehalte in infiziertem Salat vom Freiland? 3.) Sind Trocknung
und Lagerung von großen Salatmengen ohne Verlust an EPA realisierbar? 4.) Wie
wirkt Bremia-infizierter Salat als Futterbeimischung auf die Tiere und die Eiqualität?
4.2. Materialien und Methoden:
4.2.1. Versuchsaufbau und Aufgabenverteilung
Für die Bearbeitung der komplexen Fragestellung war die Kooperation mit mehreren
Instituten Hohenheims notwendig.
Die Umsetzung des Versuches wurde in 5 generelle Schritte untergliedert (Abb. 4.1.),
die mit Hilfe der Kooperationspartner ausgeführt wurden.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
69
Abb. 4.1.: Flussdiagramm der Projekteinheiten und die dafür zuständigen Kooperationspartner.
Die Feldanzucht von genügend gesundem und infiziertem Salat mit starkem B.
lactucae-Befall erfolgte auf der Versuchsstation für Gartenbau des Landes Baden-
Württemberg (Stuttgart-Hohenheim). Der langfristige Anbau- und Pflegeplan wurde,
nach Abstimmung mit den Futterberechnungen von Herrn Grashorn, von Frau
Anderle erstellt und von Gärtnern der Versuchstation durchgeführt.
Die Trocknung von infiziertem und gesundem Salat im Großmaßstab erfolgte am
Institut für Agrartechnik, wo mit freundlicher Unterstützung von Herrn Professor
Müller ein Hordentrockner zur Verfügung stand, mit dem die großen Salat-mengen
für die Hühnerfütterung fachgerecht und definiert getrocknet werden konnten. Die
Trocknung musste sofort nach der Ernte erfolgen, um Qualitätsverluste (Oxidations-
und Abbauprozesse) zu verhindern. Kurze Wege waren erforderlich, da infizierter
Salat schnell welkte und die Oxidationsanfälligkeit auf Grund des hohen Gehaltes an
n-3-FS von B. lactucae (BELITZ et al. 2001) stark erhöht war. An den Instituten für
Botanik und Agrartechnik wurden Vorversuche mit infiziertem Salat gefahren, um
eine optimale Trocknungsprozessführung zu gewährleisten.
Feldanzucht von Bremia lactucae-infiziertem Salat und gesundem Kontrollsalat
Versuchsstation für Gartenbau, Institut für Botanik
Bestimmung der Trocknungsparameter im Labor, Trocknung der Fütterungsversuche im
Hordentrockner
Qualitätskontrolle der Futterproben Bestimmung der Omega-3-Fettsäuren
Herstellung von Futtermischungen Fütterungsversuche mit Legehennen Produktion von Hühnereiern
Analyse der Eidotter Überprüfung der Hühnergesundheit
Institut für Botanik Institut für Agrartechnik
Institut für Botanik Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung
Versuchsstation für Tierzüchtung „Unterer Lindenhof“
Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
70
Die Herstellung der Futterrationen für die einzelnen Tier-Versuchsgruppen erfolgte
unter Leitung von Herrn Professor Grashorn auf der Versuchsstation für Tierhaltung,
Tierzüchtung und Kleintierzucht „Unterer Lindenhof“.
Die Aufzucht und die Haltung von Hühnern als Multiplikatoren der n-3-FS aus dem
Futter ins Ei erfolgten ebenfalls unter Leitung von Herrn Prof. Grashorn auf der
Versuchsstation für Tierzüchtung „Unterer Lindenhof“. Alle Gesundheits- und
Leistungsdaten der Tiere sowie alle weiteren Qualitätsmerkmale der Legeabschnitte
wurden am Unteren Lindenhof vom Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung
erhoben. Es wurden 5 Fütterungsgruppen gebildet, die jeweils 8 Tiere umfassten.
Die Versuchsdauer betrug 21 Tage.
Um eine verlässliche Quantifizierung der n-3-FS in Salat, Futter und Eidotter zu
garantieren, wurden die Fettsäureanalysen am Institut für Botanik und am Institut für
Tierhaltung und Tierzüchtung (Zentrallabor „Unterer Lindenhof“) durchgeführt. So
konnten die Ergebnisse verglichen und abgesichert werden.
4.2.2. FS-Konzentrationen der Salatextrakte, der Fut terrationen und der Dotter-
lipide
Materialien: Infizierte und gesunde Salatblätter von Grünem Kopfsalat (Sorte Nadine
Fa. Rijkzwaan, Niederlande), Roter Eichblattsalat (Mischung der Sorten Murai, Fa.
Rijkzwaan, Niederlande, Ribai (Fa. Rijkzwaan, Niederlande), Nun7816 (Fa. Nunhems
Zaden BV, Niederlande), Stromboli (Fa. Seminis, USA)). Futtermischungen der 5
Varianten: Kraftfutter+ 10% Grüner Kopfsalat infiziert; Kraftfutter+ 10% Grüner Kopf-
salat gesund; Kraftfutter+ 10% Roter Eichblattsalat infiziert; Kraftfutter + 10% Roter
Eichblattsalat gesund; Kraftfutter ohne Salat als Kontrolle; Eidotter von Hühnern, die
mit den 5 Futtervarianten versorgt wurden.
Die qualitativen und quantitativen Analysen der Fettsäuremuster am Institut für
Botanik erfolgten mit geringen Abwandlungen wie in den Kapiteln 2.1.2.-2.1.4.
beschrieben. Für Wiederfindung und Vergleichbarkeit erfolgte die Korrektur mit dem
IS 17:0 (vgl. Kap. 3.2.4.5.).
Am „Unteren Lindenhof“ erfolgte die Extraktion der Proben unter Verwendung des
20:0 IS nach der Standardmethode von Folch (FOLCH et al. 1957).
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
71
Die Korrektur der absoluten FS-Konzentrationen erfolgte mit Hilfe des externen
Supelco 37 Komponenten-Standards, dessen Signalfläche/Konzentration-Verhältnis
von 20:0 (Faktor 1) bezüglich der anderen FS ins Verhältnis gesetzt wurde (vgl. Kap.
2.1.4.). Dazu wurde der 37-Komponenten-Standard siebenmal injiziert. Da sich die
FS im 37 Komponentenstandard bezüglich ihrer Signalfläche/Konzentrationsverhält-
nisse (bekannte relat. Konzentration, bekannte Signalfläche) ebenso verhalten wie
der FS-Standard in der Probe, galt für die Korrekturfaktoren der FS folgende Formel
(HAASMANN 1998):
Korrekturfaktor = (rQIS/rQS)/(AIS/AS), wobei galt: rQIS = Flächenprozentanteil der FS
im internen Standard, rQS = Flächenprozentanteil der FS im externen Standard, AIS =
FS-Signalfläche der FS im internen Standard, AS = FS-Signalfläche der FS im
externen Standard.
Bsp.: Bei gegebener Konzentration bekommt der interne Standard 20:0 den Faktor 1
zugeordnet, FS mit selber Konzentration jedoch abweichender Signalfläche im
externen Standard, bekommen Faktoren < oder > 1 zugeordnet, die FS 20:5 z.B.
0,89, 22:6 z.B. 1,06 (Anhang I).
Für die Quantifizierung der Lipidgehalte der Dotterproben erfolgte ein Flächen-
vergleich des 20:0 IS mit jeder einzelnen Fettsäure unter Verwendung dieser
berechneten Korrekturfaktoren. Die hierfür verwendete Formel lautete (HAASMANN
1998):
CFS = Korrekturfaktor•(mIS/mPR)•(AFS/AIS), wobei galt: CFS =korrigierte Konzentration
FS, mIS= Einwaage interner Standard, mPR = Einwaage Probe,
AIS = Peakfläche interner Standard, AFS = Peakfläche FS Probe.
Bsp. C20:5 = 0,89•(1g/4g)•(18000 PFE 20:5)/14000 PFE 20:0), EPA ist in einer
Konzentration von 0,17 mg pro g Probe enthalten.
Da dies dem derzeitigen Standard in der Wissenschaft zur absoluten Konzentrations-
berechnung von FS in Lebensmitteln am GC-FID entspricht, wurden für die statis-
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
72
tische Auswertung (Kap. 4.2.6.) die empirisch über den 37-Komponenten-Standard
korrigierten FS-Konzentrationswerte vom Institut für Tierzüchtung verwendet.
4.2.3. Salatproduktion
Aus Forschungsarbeiten (STEINHILBER 2003) war bekannt, dass Leinölzusatz zum
Futter (einer Menge von 17,6 mg ALA/g entsprechend) die Produktion von ALA und
DHA im Eidotter erheblich steigerte. Auf 1 kg Futter wurden 40 g Leinöl (4%)
zugemischt. Ein kg Futter enthielt 17,6 g n-3-FS in Form von ALA.
Infizierter Kopfsalat produzierte im Labor bei optimaler Infektion (Sporulation von
100% der Fläche) 1 mg EPA/g TG. Für den besten Infektionsfall galt daher die
Annahme, dass ein kg getrockneter Salat mit B. lactucae-Infektion 1 g EPA enthielt.
Da Salat dem Hühnerfutter nur in eingeschränkter Konzentration zugemischt werden
sollte, um die Legeleistung der Hennen nicht zu beeinträchtigen, wurde eine
Zumischung von 10 % infiziertem Salat zum Kraftfutter festgelegt. Damit konnten
EPA Mengen von höchstens 0,1 g EPA/kg TG erreicht werden. Da aber Salat selbst
erhebliche Mengen an ALA produzierte (ca. 5-7 mg/g TG), konnte die ALA-Menge
aus Salat den Gesamtgehalt an n-3-FS im Futter wesentlich erhöhen. Somit war von
einer n-3-FS Menge von 7,1 g n-3-FS/kg TG (7 g ALA/kg + 0,1 g EPA/kg Futter)
auszugehen, was nur noch etwas weniger als der Hälfte der Menge der ALA
Beimischung aus Leinöl (17,6 g/kg) entsprach. Eventuell würde ALA aus Salat zu
einer Sättigung an ALA im Eidotter beitragen, was wiederum zum Anstieg von DHA
führen könnte, das aus dem überschüssigen ALA und EPA synthetisiert werden
konnte. Dann würden die EPA-Mengen aus B. lactucae schon in kleinen Mengen ins
Gewicht fallen.
Ein Huhn benötigte etwa 100 g Trockenfutter/Tag, 8 Hühner bildeten eine Gruppe.
Der Versuch wurde auf 21 Tage angelegt. Gruppe 1 bekam Kontrollfutter, die
Gruppen 2, 3, 4 und 5 erhielten Kontrollfutter mit 10 % getrockneten Salat mit oder
ohne B. lactucae. Um diese Mischung zu erhalten, mussten für diesen Zeitraum pro
Gruppe 30 kg Frischsalat bzw. 3 kg Trockensalat eingeplant werden.
Um diese Menge an getrocknetem Salat auf jeden Fall zu erhalten, wurden etwa
2000 Köpfe für die infizierte Variante und ca. 1000 Köpfe für die Kontrolle gepflanzt.
Dafür standen 2x2 Beete (räumlich getrennt) mit je 150 m² zur Verfügung.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
73
Anbau, Infektion und Ernte des Futtersalates
Da das Feldisolat in dem Laborversuch identisch mit dem bodenbürtigen Pathogen
auf der Versuchsstation für Gartenbau war und dies zusätzlichen Genehmigungs-
aufwand verhinderte, wurde auf eine Zusatzinfektion verzichtet und mit dem natür-
lichen Befall gearbeitet. Alle Jungpflanzen wurden vor der Pflanzung einmal mit dem
Pflanzenschutzmittel Polyram (Wirkstoff: Ethylen(bis)-dithiocarbamat) behandelt, um
eine Frühinfektion mit B. lactucae und einen dadurch bedingten Pflanzenverlust zu
vermeiden. Die Beete mit B. lactucae-infiziertem und die Beete mit „gesundem“ Salat
waren räumlich durch ein Kohlfeld getrennt (Abb. 4.2.), Beete auf denen Falscher
Mehltau erwünscht war, wurden abends zusätzlich bewässert, da dies die Verbrei-
tung förderte.
Abb. 4.2. : Feldanbau von infiziertem Salat. Links: Früher und später Satz von Grünem Kopfsalat,
Rechts: Sortenversuch der Staatsschule für Gartenbau mit infiziertem und gesundem Roten Eichblatt-
salat.
Die Beete, die infektionsfrei bleiben sollten, wurden nach der Pflanzung zusätzlich
mit Ortiva (Wirkstoff: Azoxystrobin) und Aliette (Wirkstoff: Fosetyl) behandelt, um eine
Infektion auszuschließen.
Der Anbau von Rotem Eichblattsalat erfolgte im Rahmen eines Sortenversuches von
Herrn Blauhorn von der Staatsschule für Gartenbau (Abb. 4.2.) und durfte mit freund-
licher Genehmigung für den Bremia-Versuch zusätzlich geerntet werden. Da von ein-
er Sorte des Roten Eichblatt Salats nicht genügend infiziertes bzw. gesundes Mate-
rial zur Verfügung stand, wurde je eine Mischung mehrerer Sorten vorgenommen
(vgl. Kap. 4.2.2.).
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
74
Die Ernte erfolgte in Etappen über 3 Wochen, wobei gleichzeitig die Trocknung
stattfand. Zunächst wurde im Zeitraum von einer Woche gesunder Salat geerntet und
getrocknet. Zeitlich versetzt, um Kontaminationen vorzubeugen, erfolgten Ernte und
Trocknung des infizierten Salates.
Der Salat wurde, um eine kurze Ernte- und Verarbeitungsdauer zu gewährleisten,
stets mit mehreren Personen geerntet. Die Kisten mit Salat wurden mit dem Auto
direkt zur Trocknungshalle gefahren und dort weiterverarbeitet.
4.2.4. Trocknung
Trocknung im Kleinmaßstab
Die wichtigste Voraussetzung war eine gewisse Temperaturstabilität der FS im infi-
zierten Salatgewebe während der Trocknung. Um allgemein zu testen, wie tempera-
turstabil die Lipide von B. lactucae waren, wurde zunächst am Institut für Botanik ein
Trocknungsversuch im Kleinmaßstab durchgeführt.
Material:
Ein vollständig infiziertes, frisch sporulierendes Salatblatt von Grünem Kopfsalat, 3
Trockenschränke mit Thermometer, Exsikkator bei RT 20°C, 2 ml Reaktionsgefäße.
Methode:
Von einem gleichmäßig sporulierenden Salatblatt wurden mit einer Rasierklinge acht
0,5 cm² große Stücke ausgeschnitten. Die beiden der Hauptblattader gegenüber-
liegenden Stücke vom Blattgrund zur Blattspitze wurden bei 20°C (RT) für je 24 und
48 h im Exsikkator und bei 40°C, 60°C bzw. 80°C für j e 24 und 48 h im
Wärmeschrank einzeln getrocknet. Anschließend wurden die EPA-Gehalte der 8
Proben nach der Methode von Kapitel 2.1.2.-2.1.4. bestimmt.
Trocknung der Salatmenge für Futterzwecke im Großmaßstab
Der Salat für das Fütterungsexperiment wurde im Großmaßstab, anhand der
Erfahrungswerte aus dem Kleinversuch, in einem Hordentrockner, nach dem
Umluftprinzip getrocknet (Abb. 4.3.).
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
75
Zuerst wurde 2 h bei 60°C getrocknet, wobei die Oberfl ächentemperatur des Salates
ca. 40°C betrug. Danach folgte eine Trocknungszeit von 15 h bei 40°C.
Abb. 4.3. : Trocknung des Salats auf Blechen im Hordentrockner. Links: Entfernen des Strunks. Mitte:
Befülltes Blech für den Hordentrockner. Rechts: Abfüllen des getrockneten Salates in ein geeignetes
Behältnis bis zur Fütterung.
Damit der Trocknungszeitraum nicht unnötig verlängert wurde und der Salat keine
Stellen mit erhöhter Restfeuchte aufwies, sollten keine ungleichmäßig getrockneten
Stellen entstehen. Daher entfernte man den Strunk mit dem Handmesser und legte
die Blätter einschichtig auf die Trockenbleche (Abb. 4.3.). Um 120 kg Frischsalat zu
trocknen wurden 8 Trockner-Ladungen mit jeweils ca. 17 h Trockenzeit benötigt. Der
getrocknete Salat wurde an zwei Terminen gewogen und die Restfeuchte, die unter
10% liegen sollte, wurde bestimmt.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
76
4.2.5. Fütterungsversuch
Versuchstiere und Haltungsbedingungen
Für den Versuch standen 40 Legehennen der Rasse „Lohmann Selected Leghorn“
(LSL, Rhein-Main, Groß-Umstadt) im Alter von 38 Wochen zu Verfügung, die in
Einzelkäfighaltung (Grundfläche 40 x 50 cm) untergebracht waren. Die Eier wurden
von Hand gesammelt. Die Belüftung des Stalles erfolgte über eine Unterdrucklüftung,
wobei eine RT von 18-20°C und eine rel. Luftfeuchte von 60 % angestrebt wurde.
Der Stall war ohne Tageslichteinfall, die Beleuchtungsdauer betrug 14 h bei 10
Stunden Dunkelheit. Die Beleuchtungsintensität lag bei 20 Lux.
Futter
Die Herstellung der Versuchsrationen erfolgte auf der amtlich zugelassenen
Mischfutteranlage (DE BW 4 000 01) der Versuchsstation „Unterer Lindenhof“. Für
die Versuchsrationen wurde eine gemeinsame Grundration erstellt, bei der die Nähr-
stoffverdünnung durch die 10%ige Salatzugabe berücksichtigt wurde (Tab. 4.1.).
Für die Kontrollgruppe wurde eine eigene Ration ohne Salat hergestellt. Die
Nährstoffgehalte der Rationen wurden auf der Basis der Empfehlungen des Lege-
hennenzüchters (Lohmann Tierzucht, Cuxhaven) eingestellt.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
77
Tab. 4.1.: Futterzusammensetzung und wichtigste kalkulierte Nährstoffgehalte (g/kg)
Komponenten Kontrollgruppe Versuchsgruppe
Sojaextraktionsschrot 210 200
Weizen 528 430
Mais 120 100
Salat - 100
Sojaöl 24 55
Futterkalk grob 52 50
Futterkalk fein 44 43
Mono-Calciumphosphat 8,0 10
Natrium-Bikarbonat 2,4 2,4
Kochsalz 2,4 2,4
Cholinchlorid 1,0 1,0
Methionin 1,6 1,6
Kalzium-Propionat 4,0 4,0
Antioxidans Loxidan 0,2 0,2
Farbstoff Avizant Y 20S 0,6 0,6
Farbstoff Avizant R 20S 0,8 0,8
Spurenelement-VM* 0,8 0,8
Vitamin-VM** 2,0 2,0
Kalkulierte Nährstoffe
Rohprotein 171 171
Methionin 3,9 3,9
L-Lysin 7,8 7,8
Umsetzbare Energie (MJ/kg)* 11,4 11,3
Ca 39 4,0
Pges 5,8 5,9
* Spurenelement-Vormischung (mg/kg): 120.000 Mn, 80.000 Zn, 90.000 Fe, 15.000 Cu, 1.600 J, 500 mg Se, 600
mg Cu. ** Vitamin-Vormischung (/kg): 6.000.000 I.E. A, 1.500.000 I.E. D3, 15.000 mg E, 1.500 mg B1, 3.000 mg
B2, 3.000 mg B6, 15.000 µg B12, 1.200 mg K2, 25.000 mg Nikotinsäure, 7.000 mg Ca-Panthotenat, 500 mg
Folsäure, 50.000 µg Biotin
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
78
4.2.5.1. Leistungsdaten der Tiere
Die Legeleistung wurde täglich erfasst, der Futterverbrauch wöchentlich. Die Eige-
wichte wurden am Versuchsende im Rahmen der Bestimmungen zu Eiqualität
(Dotterfarbe, Dotter- und Schalenanteil, n-3-FS Depositionsrate) und FS-Muster
ermittelt. Zur Bestimmung der Fettsäuremuster im Dotter wurden zwei Eier pro
Henne gesammelt. Die Dotter wurden einzeln bis zum Analysentermin tiefgefroren.
Der Dotteranteil wurde berechnet. Je ein Dotter wurde für die Analysen am Institut für
Botanik und eines für die Analysen am Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung
verwendet. Vom Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung wurden zusätzlich die
Oxidationsprodukte (TBARS) im Dotter bestimmt.
Eigewichte, Dotter- und Schalenanteil, Dotterfarbe
Es wurde untersucht, wie sich die Fütterung auf die Eigewichte, den Dotter- und
Schalenanteil sowie die Dotterfarbe auswirkte. Es wurden die Farben von frischen
und gekochten Eidottern bestimmt. Zusätzlich wurde ein Sensoriktest zur visuellen
und geschmacklichen Konsistenz gekochter Eier durchgeführt.
Depositionsraten der n-3-FS im Dotter
Die Berechnung der Depositionsraten der n-3-FS erfolgte am Institut für Tierhaltung
und Tierzüchtung nach der Beschreibung von Steinhilber (STEINHILBER 2003). Die
Depositionsrate beschreibt die prozentuale Einlagerung an n-3-FS aus dem Futter in
die Dotterlipide. Sie ist ein Maß für die Verwertung der Hühner von n-3-FS aus dem
Futter.
Zur Berechnung der Depositionsraten (%) wurde folgende Formel eingesetzt:
DP = ((DG•FSD)•LL)/(FA•FSF), wobei: DP=Depositionsrate (%), DG=Dottergewicht
(g), FSD=Fettsäuregehalt Dotter (mg/g), FA=Futteraufnahme (g), FSF=Fettsäure-
gehalt Futter (mg/g), LL=Legeleistung (%).
Lipidoxidation - TBARS-Bestimmung in Eidotter
EPA und DHA neigen wegen ihrer hohen Anzahl an Doppelbindungen sehr leicht zur
Oxidation, wobei kurzkettige, aromatische Verbindungen entstehen. Diese Verbind-
ungen sind für Fehlaromen im Ei verantwortlich und unerwünscht (MARSHALL et al.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
79
1994). Ein Maß für die Oxidation und die damit verbundene Qualität stellte der
TBARS-Test dar (vgl. Kap. 4.2.5).
Beim TBARS-Test reagieren 2 Moleküle Thiobarbitursäure mit einem Molekül Malon-
dialdehyd. Dies führt zur Bildung eines roten Farbkomplexes, der photometrisch zwi-
schen 532-538 nm nachgewiesen werden kann (SINNHUBER & YU 1958). Die Intensi-
tät der gemessenen Farbe hängt vom PUFA-Gehalt der Probe ab. Eine Probe mit
hohen Gehalten an mehrfach-ungesättigten FS weist deutlich höhere TBARS-Werte
auf, als eine Probe mit nur gesättigten Fettsäuren (DAHLE 1962). Die TBARS-
Bestimmung erfolgte unter Leitung von Herrn Grashorn am Unteren Lindenhof nach
einer modifizierten Methode von Kornbrust und Mavis (KORNBRUST & MAVIS 1980).
Die Berechnung der TBARS erfolgte photometrisch als Malondialdehyd unter
Zuhilfenahme des molaren Extinktionskoeffizienten nach folgender Formel:
Malondialdehyd (nmol/mg Dotter) = (6,410•1000•3•Extinktion)/100.
Für die Analyse der TBARS wurde 1g Dotter in ein Reagenzgefäß eingewogen. Der
Probe wurden 9 ml KCl (1,15 %ig) hinzugefügt. Um eine homogene Lösung zu
erhalten, wurde die Probe bei 9000 Umdrehungen ca. 15 sec. gründlich homogeni-
siert. Anschließend wurde in 10 ml Schraubgefäße 0,5 ml 80 mM Tris-Malat-Puffer
(pH 7,4), 0,2 ml 5 mM Eisensulfatlösung, 0,2 ml 2mM Ascorbinsäure und 0,1 ml
Probenhomogenat vorgelegt. Als Blindwert für die spätere photometrische Be-
stimmung wurde in 2 Röhrchen, anstelle des Probenhomogenats, 1,15% KCl
pipettiert. Den Proben wurde nun 2 ml des Probenreagenz (150 g Trichloressigsäure
und 3,75 g Thiobarbitursäure, die in 1Liter 0,25 n HCl gelöst wurden) gegeben. Nach
dieser Zugabe wurden die Röhrchen fest verschlossen und 30 s kräftig geschüttelt.
Es folgte ein 30minütiges Kochen und ein anschließendes Abkühlen der Proben auf
Eis, um die Reaktion zu stoppen. Bei 2200 U/min und 4°C wurden die Proben 20 min
zentrifugiert und danach in 1 cm Glasküvetten bei einer Wellenlänge von 535 nm in
einem Photometer (PM 2 DL, Zeiss, Jena) vermessen.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
80
4.2.6. Statistische Auswertung der Lipidgehalte in den Dotterproben
Der Test des Einflusses der Faktoren Salatsorte und Futtervariante auf den Gehalt
an n-3-FS im Dotter, in Abhängigkeit vom Faktor Futterbehandlung, erforderte über
die klassische Varianzanalyse hinaus, die Formulierung eines statistischen Modells.
Das Modell wurde in Zusammenarbeit mit Jens Möhring vom Institut für Biometrie
(Prof. Dr. Piepho) an der Universität Hohenheim entwickelt und mit Hilfe der
Prozedur für Gemischte Modelle mit SAS ausgewertet.
Modell mit fixen Effekten:
Y(ijkl) = µ + αi + βj (αi) + γk (αi) + βγjk (αi) + eijkl
Wobei:
Y= Fettsäure (z.B. 22:6 n-3 bzw. 18:3 n-3)
µ= geschätzter wahrer Gruppen-Mittelwert
αi= Faktor Futterbehandlung (Salat ja/nein)
βj (αi)= Faktorstufe Futterbehandlung (Salatsorte) innerhalb des Faktors αi
γk (αi)= Faktorstufe Bremia-Befall ja/nein innerhalb des Faktors αi
βγjk (αi)= Wechselwirkungen der Faktorstufen innerhalb des Faktors αi
eijkl= Restfehler
Die Signifikanzgrenze wurde mit Hilfe des p-Wertes (Teststärke) ausgedrückt. Sie lag
bei p<0,05%, was der Vertrauenswahrscheinlichkeit von α=5% entspricht. Bei p>0,05
(α>5%) wurde die Nullhypothese (es existieren keine Unterschiede) angenommen,
bei p<0,05 (α<5%) wurde die Nullhypothese abgelehnt und die Alternativhypothese
(es existieren Unterschiede) trat in Kraft. Bei p<0,01 waren die Unterschiede als
hochsignifikant einzustufen.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
81
4.3. Ergebnisse
4.3.1. Befallsergebnis des Feldversuches zur Ernte
Die Ernte von Rotem Eichblatt- und Grünem Kopfsalat erfolgte vom 25.09.-
15.10.2007. Der Befall mit B. lactucae erfolgte bei Rotem Eichblattsalat massiv
schon ab Mitte September 2007. Zuerst wurden einzelne ältere Blätter befallen, die
Kontakt mit dem Boden hatten. B. lactucae verbreitete sich von einem Intercostalfeld
zum nächsten, so dass innerhalb von 2 Wochen Die Salatköpfe komplett infiziert
waren, was sich an einem weißen Sporulationsbelag von B. lactucae auf den Blatt-
unterseiten zeigte. Ein infizierter Salatkopf wog durchschnittlich 350 g, gesunde
Köpfe wogen etwa 500 g. Ab Anfang Oktober zeigte auch der 3 Wochen jüngere
Grüne Kopfsalat ersten Befall mit B. lactucae. Ab Anfang Oktober konnte der Grüne
Kopfsalat geerntet werden, der jedoch deutlich weniger Biomasse aufwies und
schlechter befallen war, als der Rote Eichblattsalat. Infizierte Köpfe wogen im
Durchschnitt 150 g, gesunde Köpfe wogen ca. 200 g. Der frühere Satz des Grünen
Kopfslates (Aussaat am 07.08.) war zu 20% besser mit Falschem Mehltau befallen
als der spätere Satz (Aussaat am 22.08.) und wies fast doppelt soviel Biomasse auf.
Insgesamt war der Grüne Kopfsalat nur zur Hälfte sichtbar infiziert, wobei nur die
ältesten Blätter Sporulation zeigten. Der Rote Eichblattsalat dagegen wies
Sporulation bis in die jüngsten Blätter hinein auf, wobei ältere infizierte Blätter
teilweise schon faulten. Von beiden Salattypen konnten infizierte und gesunde Köpfe
in ausreichender Menge geerntet werden. Grüner Kopfsalat vom Feld enthielt 150-
200 mg EPA/kg TG, Roter Eichblattsalat vom Feld enthielt 300-400 mg EPA/kg TG.
4.3.2. Temperaturstabilität und Trocknung
Die Voruntersuchungen zur Trocknung (Abb. 4.4.) von infiziertem Salat zeigten, dass
die EPA-Konzentrationen bei RT nach 24 h bei 0,7 mg EPA/g TG lagen, wobei nach
48 h nur noch 0,35 mg EPA/g TG nachgewiesen werden konnten. Bei 40°C waren
die EPA-Gehalte mit ca. 1 mg EPA/g TG am höchsten und blieben über den
Zeitraum von 48 h stabil.
Bei 60°C lagen die EPA Gehalte sowohl nach 24 h als a uch nach 48 h nur noch bei
etwa 0,7 mg/g TG, bei 80°C lagen die EPA-Gehalte fü r beide Trocknungszeiträume
nur noch bei ca. 0,5 mg/g TG.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
82
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
[°C]
EP
A-G
ehal
t [m
g/g
TG
]
24 h 0,71 1,06 0,62 0,53
48 h 0,36 1,01 0,70 0,60
20°C 40°C 60°C 80°C
Abb. 4.4.: Vergleich der EPA-Gehalte innerhalb eines gleichmäßig sporulierenden Salatblattes bei 4
Temperaturen (20°C, 40°C, 60°C, 80°C) und 2 Zeiträu men (24 h und 48 h).
An diese Werte angepasst wurde der Salat im Hordentrockner auf Blechen für 2 h
bei einer Ofentemperatur von 60°C getrocknet, wobei die Oberflächentemperatur
vom Salat ca. 40°C betrug. Danach folgte eine Trocknung szeit von 15 h bei 40°C.
Der Restfeuchtegehalt des getrockneten Salates lag durchschnittlich und stabil
zwischen 5 und 9 %. Nach etwa 17 h konnte der getrocknete Salat von den Blechen
genommen und gewogen werden. Danach wurde der Salat in doppelwandige Papier-
säcke überführt, die in verschließbaren, blauen 60 l Plastiktonnen gelagert wurden.
Das Fassungsvolumen einer Tonne wurde von ca. 1,5 kg Trockensalat ausgefüllt.
Stichproben nach 1 und 2 Wochen Lagerung zeigten, dass es weder Veränderungen
gegenüber der Anfangsfeuchte gab und keine nachträgliche Durchfeuchtung
stattfand, noch dass sich FS-Gehalte verschlechterten.
4.3.3. Fettsäureanalyse in der Nahrungskette
Zunächst wurden die qualitativen Muster der FS von infiziertem und gesundem Salat,
den Futtermischungen und den Eidottern mit ihren relativen Anteilen an FAME am
Gesamtmuster miteinander verglichen. In Abb. 4.5. sind die relativen Anteile der
relevanten FS der verschiedenen Nahrungsmittel einander gegenübergestellt. Der
Übersichtlichkeit wegen wurde die Darstellung auf das Beispiel des Roten Eichblatt-
salates beschränkt. Grüner Kopfsalat wies dasselbe Fettsäuremuster mit nicht
signifikant unterscheidbaren relativen Anteilen auf. Die Qualität der Fettsäuremuster
der Eidotter änderte sich nach unterschiedlicher Fütterung nicht. Das Muster blieb
konstant, es wurden keine zusätzlichen oder fehlenden FS detektiert.
83
0
10
20
30
40
50
60
70
FAME
Sig
nalfl
äche
nant
eile
der
FA
ME
[%
]
Fläche % RE- 0,11 11,27 0,11 2,20 1,95 28,73 55,63 0,00 0,00 0,00
Fläche % RE+ 3,83 25,66 2,03 3,28 2,91 17,27 43,28 0,00 1,73 0,00
Fläche % FK 0,09 9,97 0,11 2,37 23,71 57,81 5,94 0,00 0,00 0,00
Fläche % FRE- 0,16 11,22 0,16 2,99 22,45 54,96 8,05 0,00 0,00 0,00
Fläche % FRE+ 0,14 11,38 0,20 3,04 22,69 54,54 7,97 0,00 0,04 0,00
Fläche % Dok 0,18 28,11 1,71 13,18 31,07 17,36 0,49 4,81 0,00 3,08
Fläche % DoRE- 0,20 24,06 1,45 14,66 28,53 21,61 1,04 5,67 0,00 2,78
Fläche % DoRE+ 0,16 23,92 1,27 14,63 28,06 22,71 0,93 4,93 0,00 3,40
14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 n-6 18:3 n-3 20:4 n-6 20:5 n-3 22:6 n-3
Abb. 4.5. : Vergleich der relativen Signalflächenanteile der FAME in der Nahrungskette. Infizierter Salat (RE+), gesunder Salat (RE-), Futter
(Kontrolle (FK), mit inf. Salat (FRE+), mit gesundem Salat (FRE-)) und Dotter (nach Fütterung mit Kontrollfutter (DoK), mit Beimischung von inf.
(DoRE+) und gesundem (DoRE-) Salat).
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
84
Im Fettsäuremuster von gesundem Salat dominierte die Fettsäure ALA (18:3 n-3) mit
über 50% Anteil, gefolgte von LA (18:2 n-6) und Palmitinsäure (16:0) mit je ca. 25%
Gesamtanteil. Infizierter Salat enthielt sowohl FS von B. lactucae als auch von Salat
und war von gesundem Salat dadurch eindeutig unterscheidbar, dass EPA zu einem
Anteil von 1-2 % am Fettsäuremuster beteiligt war. Eine Infektion mit B. lactucae
konnte bei einem EPA-Anteil von 0,01 % noch nachgewiesen werden.
Das Fettsäuremuster von Kontrollfutter ohne Salatzusatz wurde deutlich vom
enthaltenen Sojaöl geprägt (Abb. 4.5.). Sojaöl enthält zu 60% und mehr die n-6-FS
LA (vgl. Kap. 1), was sich im Fettsäuremuster vom Kontrollfutter (Abb. 4.5.) wider-
spiegelte. Die n-3-FS ALA war nur zu einem Anteil von ca. 5-6 % im FS-Muster
enthalten. Im Kontrollfutter waren zudem hohen Mengen an Ölsäure (18:1 n-9) mit
ca. 23% und Palmitinsäure (16:0) mit ca. 10% Anteil nachweisbar. Kontrollfutter mit
Beimischung von 10% Salat (infiziert bzw. gesund) enthielt als Hauptfettsäure
ebenfalls LA (18:2 n-6), durch die Beimischung sank der LA-Anteil im Futter jedoch
von 57 auf 54%. Der ALA-Anteil in Futter mit Salatzusatz war mit durchschnittlich 8
% gegenüber dem ALA-Gehalt im Kontrollfutter mit nur 5,9 % statistisch signifikant
erhöht.
EPA konnte in Futter mit 10% infiziertem Salat nachgewiesen werden, jedoch mit nur
noch sehr geringen Anteilen von 0,02-0,04%, die aus Abb. 4.5. grafisch nicht mehr
ersichtlich sind.
Der Anteil von ALA im Dotter war nach Fütterung mit Kontrollfutter mit 0,5% sehr
gering und konnte mit Salatbeimischung auf 1% gesteigert werden. EPA konnte in
Dotter nicht bzw. nur in Spuren nachgewiesen werden. Von der n-6-FS-Reihe waren
LA (18:2 n-6) mit 17% und ARA (20:4 n-6) in Dotter aus Kontrollfütterung weniger
stark vertreten wie in Dotter aus Salatfütterung mit 21 und 22%. Ölsäure (18:1 n-9)
hatte ca. 30% den höchsten Anteil am FS-Muster im Eidotter, gefolgt von
Palmitinsäure (16:0), Linolsäure (18:2 n-6) und Stearinsäure (18:0). DHA und ARA
waren, im Gegensatz zu Futter oder Salat, nur in Dotter vorhanden. DHA war die
dominante n-3-FS im Eidotter. Sie hatte einen durchschnittlichen Gesamtanteil von
etwa 4-5% am Fettsäuremuster. Die gesättigten FS 16:0 und 18:0 hatten im Dotter
einen gemeinsamen Anteil von etwa 40%.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
85
Die absoluten n-3-FS-Konzentrationen in Form von ALA, EPA und DHA aus
Sporangien von B. lactucae, Salat, Futter und Dotter sowie die n-6/n-3-Verhältnisse
wurden in Tab. 4.2. zusammengefasst, um einen vergleichenden Überblick zu
ermöglichen. Je kleiner der n-6/n-3-Wert der Tabelle, umso besser war das n-6/n-3-
Verhältnis.
Tab. 4.2.: Die Konzentrationen der n-3-FS in der Nahrungskette
EPA mg/g
(20:5 n-3)
ALA mg/g
(18:3 n-3)
DHA mg/g
(22:6 n-3)
n-3 Gesamt
(mg/g)
n-6/n-3-
Verhältnis
Bremia lactucae Sporangien FG 10 1,5 0,5 12 0,72
Infizierter Grüner Kopfsalat TG 0,14
5,02 - 5,16 0,75
Gesunder Grüner Kopfsalat TG - 7,15 - 7,15 0,52
Infizierter Roter Eichblattsalat TG 0,27
5,00 - 5,27 0,59
Gesunder Roter Eichblattsalat TG - 7,26 - 7,26 0,52
Futter mit 10% inf. Grünem
Kopfsalat TG
0,019 5,43 5,45 6,5
Futter mit 10% ges. Grünem
Kopfsalat TG
- 4,93 - 4,93 5,3
Futter mit 10% inf. Rotem
Eichblattsalat TG
0,026
5,43 - 5,46 6,8
Futter mit 10% ges. Rotem
Eichblattsalat TG
- 4,49 4,49 6,8
Kontrollfutter ohne Salat TG - 2,42 - 2,42 9,7
Dotter mit inf. Grünem Kopfsalat
FG
- 4,62
3,39
8,01 8,71
Dotter mit ges. Grünem Kopfsalat
FG
- 4,34
3,63
7,98 8,48
Dotter mit inf. Rotem
Eichblattsalat FG
- 4,05
3,71
7,76 8,69
Dotter mit ges. Rotem
Eichblattsalat FG
- 4,26
3,54
7,80 8,42
Dotter mit Kontrollfutter FG - 2,12 2,92 5,04 9,82
ALA
Sporangien enthielten nur 1,5 mg ALA/g FG. Da auch hier durch den 10%igen
Futterzusatz die Konzentrationen bis in den µg Bereich hinein verdünnt wurden,
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
86
spielte ALA aus B. lactucae wohl keine Rolle für den ALA Gehalt im Dotter. Salat
dagegen zeigte Mengen an ALA im einstelligen mg-Bereich. Gesunder Grüner
Kopfsalat produzierte durchschnittlich 7,15 mg ALA/g TG, gesunder Roter Eichblatt-
salat produzierte durchschnittlich 7,26 mg ALA/g TG. Futter ohne Salatzusatz enthielt
nur 2,42-3 mg ALA/g TG. In Futter mit 10%iger Beimischung von infiziertem und
gesundem Salat wurden zwischen 4,5 und 5,5 mg ALA/g TG gemessen. Diese
Mengen wirkten sich bereits signifikant auf die ALA-Gehalte im Eidotter aus, denn
Hühner, denen Futter mit Salatbeimischung gegeben wurde, produzierten mit bis zu
4,6 mg/g FG im Dotter signifikant höhere ALA-Gehalte, als Hühner, denen nur
Kontrollfutter gegeben wurde (2,12 mg ALA/g FG). Dabei war es nicht entscheidend,
ob der Salat infiziert war oder nicht. Bezüglich der n-3-FS ALA aus Salat zeigten sich
somit signifikante Anreicherungseffekte über die Nahrungskette.
EPA
Enthielten Sporangien noch EPA Gehalte von ca. 10 mg/g FG, so enthielt infizierter
Grüner Salat im Trockengewicht nur noch 0,14 mg EPA/g TG. Der etwas besser
befallene Rote Eichblatt Salat wies durchschnittlich 0,27 mg EPA/g TG auf. Futter mit
10% Grünem Kopfsalat enthielt daher durchschnittlich 0,019 mg EPA/g TG, Roter
Eichblattsalat enthielt im Schnitt 0,026 mg EPA/g TG. Im Dotter war EPA nur in
Spuren nachweisbar. Bezüglich EPA aus B. lactucae zeigten sich daher keine
Anreicherungseffekte über die Nahrungskette.
DHA
DHA war mit 0,5 mg/g in Sporangien von B. lactucae nachweisbar und stellte die n-3-
FS mit dem höchsten Anteil im Eidotter dar. Eidotter aus Fütterung mit Kontrollfutter
enthielt mit nur 2,92 mg DHA/g FG statistisch signifikant weniger DHA als die
Eidotter aus Fütterung mit Salatbeimischung mit bis zu 3,71 mg DHA/g FG. Es gab
keinen Beweis dafür, dass eine Infektion mit B. lactucae den Gehalt an DHA
beeinflusste. Bezüglich der FS DHA zeigten sich durch Zufütterung von Salat zwar
nicht ebenso starke, jedoch gleichfalls statistisch signifikante Anreicherungseffekte
wie für ALA.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
87
n-6/n-3-Verhältnisse
Sporangien und Mycel von B. lactucae zeigten ein n-6/n-3-FS-Verhältnis von 0,72
(Tab. 4.2.).
Die n-6/n-3-FS Gehalte von Salat lagen zwischen 0,5 und 0,75. Infizierter Salat wies
tendenziell höhere n-6/n-3-Verhältnisse auf als gesunder Salat.
Im Kontrollfutter ohne Salatbeimischung zeigte sich ein n-6/n-3-Verhältnis von 9,7-
10. Die n-6/n-3-Verhältnisse von Futter mit 10% Salatbeimischung lagen mit einem
durchschnittlichen Verhältnis von 6 in einem signifikant besseren Bereich, als die des
Kontrollfutters. Es spielte keine Rolle, ob der Salat infiziert war oder nicht.
Die FS-Muster von Eidotter nach Fütterung mit 10%iger Salatbeimischung enthielten
signifikant mehr ALA und DHA als Kontrollfutter. Das n-6/n-3-Verhältnis im Dotter
änderte sich nach unterschiedlicher Fütterung signifikant positiv (Tab. 4.2.) von 9,82
bei Fütterung ohne Salatzusatz nach durchschnittlich 8,5 bei Fütterung mit
Salatzusatz.
Gesamt-n-3-FS-Gehalte
Sporangien von B. lactucae enthielten einen Gesamtgehalt an n-3-FS von 12 mg/g.
Gesunder Salat enthielt je nach Typus 7,15 (Grüner Kopfsalat) bzw. 7,26 (Roter
Eichblattsalat) mg n-3-FS/g TG (Tab. 4.2.). infizierter Salat wies mit 5,16 bzw. 5,27 n-
3-FS/g TG statistisch signifikant weniger n-3-FS im Gewebe auf als gesunder Salat.
Kontrollfutter enthielt nur 2,42, mg n-3-FS/g TG. Futter mit 10% Beimischung von
gesundem Salat enthielt mit 4,49 bzw. 4,93 mg n-3 FS/g TG etwas niedrigere n-3-
FS-Gehalte als Futter mit Beimischung von infiziertem Salat mit 5,46 bzw. 5,45 mg n-
3-FS/g TG. Eine 10%ige Salatbeimischung zum Kontrollfutter brachte einen
signifikanten Gewinn an n-3-FS im Eidotter. Enthielten die Dotter der Kontrollgruppe
in Schnitt 5,04 mg n-3/g FG, so waren es bei den Salatgruppen bis zu 8,01 mg n-3/g
FG. Dies bedeutete eine statistisch signifikante Verbesserung des Gesamt-n-3
Fettsäuregehaltes des Dotters um ca. 60%. Es gab keine statistisch signifikanten
Unterschiede zwischen Fütterung mit gesundem oder infiziertem Salat.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
88
4.3.4. Lipidoxidation und Sensorik
Die Oxidation startete erst nach etwa 60 min Inkubation (Abb. 4.6., Zeitstufe 4). Die
Oxidationsstufen in den Behandlungen mit infiziertem Salat waren von Anfang an
niedriger und bewegten sich danach auf einem insgesamt geringeren Niveau,
parallel zu den anderen Behandlungsgruppen.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
Zeitstufen
MD
A [n
mol
/mg]
Kontrolle 0,21 0,30 0,31 0,33 0,39 0,76 1,11 1,55 1,62 1,83
RE- 0,30 0,32 0,39 0,45 0,48 0,85 1,25 1,47 1,68 1,82
RE+ 0,28 0,37 0,41 0,36 0,38 0,67 0,90 1,18 1,39 1,60
SN- 0,26 0,31 0,33 0,37 0,56 0,96 1,24 1,41 1,60 1,77
SN+ 0,25 0,32 0,36 0,33 0,34 0,44 0,72 0,95 1,15 1,47
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Abb. 4.6. : Verlauf der Oxidation bis zur Inkubationszeit von 135 min in den Dottern der 5
Fütterungsgruppen: 10%Roter Eichblattsalat gesund (RE-) bzw. infiziert (RE+), 10%Grüner Kopfsalat
gesund (SN-) bzw. infiziert (SN+) und 100% Kontrolle. Die Zeitstufen sind in 15 min-Schritten von 1
bis 10 aufgeteilt.
So ergab die Bestimmung der Oxidationsprodukte (TBARS) in den Eiern tendenziell
höhere Inkubations-Endwerte für die Kontrollgruppe und die Futtergruppen mit
gesundem Salat (Abb. 4.6., Zeitstufe 10). Eidotter aus Fütterung mit infiziertem Salat
neigten daher weniger zur Oxidation, als Eidotter aus Fütterung mit konventionellem
Futter oder gesundem Salat. Die Unterschiede zwischen den Futterbehandlungen
waren wegen hoher Standardabweichungen der Mittelwerte jedoch nicht signifikant.
10 Eier jeder Versuchsgruppe wurden gleichmäßig abgekocht und in einem Blindtest
verkostet. Alle Teilnehmer des Sensoriktests bewerteten die Eier, die von Hühnern
aus Fütterung mit infiziertem Salat stammten, als geschmacklich am besten.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
89
4.3.5. Leistungsdaten der Tiere
Die Hühner wurden durch keine Fütterungsvariante in ihrer Gesundheit oder
Leistungsfähigkeit beeinträchtigt.
Nährstoffgehalte von Salat und Futter
Die Analyse der Salatproben offenbarte deutliche Unterschiede. Bei infiziertem Salat
waren Asche- und Kalziumgehalte deutlich erhöht, während bei infiziertem Grünem
Kopfsalat geringe Stärke- und keine Zuckergehalte ermittelt wurden. Die erhöhten
Asche- und Kalziumgehalte bei infiziertem Salat (Grüner Kopfsalat und Roter
Eichblattsalat) konnten auf starke Verunreinigungen mit Erdreich zurückgeführt
werden. Die Abweichungen des infizierten Grünen Kopfsalates bezüglich der Zucker-
und Stärkewerte entstanden eventuell durch Fehler bei Probenahme des Salates,
der sehr inhomogen strukturiert und unterschiedlich befallen war.
Die umsetzbare Energie von Rotem Eichblattsalat lag mit 5,05 und 6,73 MJ/kg
deutlich über Grünem Kopfsalat mit nur 3,47 und 3,51, MJ/kg.
Tab. 4.3.: Analyse der Nährstoffgehalte der getrockneten Salate (%).
Salatvariante/ Nährstoffe
Was
ser
Eiw
eiß
Fet
t
Asc
he
Roh
fase
r
Zuc
ker
Stä
rke
Cal
cium
Pho
spho
r
Um
setz
bare
E
nerg
ie
(MJ/
kg)
RE inf. (TG) 7,63 20,2 3,27 20,2 10,3 6,05 0,00 1,12 0,53 5,05
RE ges. (TG) 9,48 18,5 2,77 13,7 8,87 22,5 0,00 0,99 0,44 6,73
GK inf. (TG) 8,10 13,4 2,51 34,4 7,10 4,39 0,00 2,16 0,41 3,51
GK ges. (TG) 10,2 17,6 1,43 12,2 8,48 0,00 1,49 0,66 0,50 3,47
RE = Roter Eichblattsalat, GK = Grüner Kopfsalat, inf. = infiziert, ges. = gesund; MJ = Megajoule
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
90
Die Nährstoffanalyse der eingesetzten Futterrationen stimmte weitgehend mit den
geplanten Gehalten (vgl. Kap. 4.2.5.) überein. So lag die umsetzbare Energie der
Futterrationen zwischen 11,5 und 11,8 MJ/kg, der Richtwert war bei 11,3 MJ/kg an-
gesetzt (Tab. 4.4.). Die Eiweißgehalte lagen mit 13,4 bis 20,2 % ebenfalls im gefor-
derten Bereich von 17,1%. Die Kalziumgehalte lagen etwas unterhalb der geforder-
ten Menge von 3,9%, die Phosphorgehalte lagen dagegen wieder im geforderten Be-
reich von 0,58%.
Tab. 4.4.: Analyse der Nährstoffgehalte (%) der Versuchsrationen (* Erklärung siehe Tab. 4.1. in
Abschnitt 4.2.5.) Futtervariante / Nährstoffe
Was
ser
Eiw
eiß
Fet
t
Asc
he
Roh
fase
r
Zuc
ker
Stä
rke
Cal
cium
Pho
spho
r
Um
setz
bare
E
nerg
ie
(MJ/
kg)
Futter + RE inf. (TG)
9,87 17,5 7,46 14,5 3,69 4,55 33,6 4,28 0,60 11,5
Futter + RE ges. (TG)
9,78 17,3 7,58 13,6 3,76 5,41 33,8 4,09 0,57 11,6
Futter + GK inf. (TG)
9,43 16,7 7,45 17,2 13,8 4,29 35,0 4,70 0,61 11,5
Futter + GK ges. (TG)
9,86 17,5 7,81 14,4 3,78 6,15 33,6 4,29 0,62 11,8
Kontrollfutter ohne Salat TG
10,9 17,1 4,73 13,6 2,72 4,07 40,5 4,39 0,53 11,6
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
91
Legeleistung
Die Fütterung mit dem gesunden Salat führte zu einem geringeren Futterverzehr bei
höherer Legeleistung gegenüber der Kontrollfütterung.
Tab. 4.5.: Mittelwerte und Standardabweichungen für Legeleistung und täglichen Futterverzehr Futtervariante Legeleistung (%) Täglicher Futterverzehr (g)
Futter + RE inf. (TG) 92,5±8,18 111±15,8
Futter + RE ges. (TG) 95,2±6,23 111±12,5
Futter +GK inf. (TG) 91,7±7,53 117±9,38
Futter + GK ges. (TG) 96,4±2,20 108±8,37
Kontrollfutter ohne Salat (T)G 94,1±6,10 118±7,08
F-Werte (Sign.) 0,73 (n.s.) 1,13 (n.s.) Futter mit infiziertem Salat führte zu einem tendenziellen Rückgang der Legeleistung
der Hennen, während die Futteraufnahme bei infiziertem Grünem Kopfsalat etwa so
hoch war wie beim Kontrollfutter (Tab. 4.5.). Die Unterschiede zwischen den
Behandlungen waren jedoch nicht signifikant.
Eigewichte, Dotter- und Schalenanteil, Dotterfarbe
Für keines der untersuchten Qualitätskriterien wie Eigewichte, Dotter- und Schalen-
anteil oder Dotterfarbe (ungekocht), konnten signifikante Effekte der Fütterung
beobachtet werden (Tab. 4.6.).
Mit durchschnittlich 68,2 und 67,6 g waren die Eigewichte bei Fütterung mit
infiziertem Salat etwas höher als die Eigewichte bei Fütterung mit gesundem Salat
mit 66,7 und 66 g. Bei den Dotteranteilen verhielt es sich umgekehrt, diese waren bei
Fütterung mit gesundem Salat mit 25,7 und 26,8 % höher als die von infiziertem
Salat mit 25,0 und 25,5%. Alle durchschnittlichen Schalenanteile waren bei
Zufütterung von Salat niedriger als bei Fütterung mit Kontrollfutter. Die Fütterung
wirkte sich nicht auf die Dotterfarbe von frischem Eidotter aus.
Ein Sensoriktest zeigte jedoch, dass die Eier nachdem sie gekocht und verzehrt
wurden, deutliche Unterschiede zeigten. Die Dotter von Eiern aus Salatfütterung
wurden von allen Testpersonen als „sattgelb“, geschmacklich sehr gut und von
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
92
angenehmerer Konsistenz bewertet. Eier aus konventioneller Fütterung sowie aus
einer Vergleichsgruppe aus dem kommerziellen Handel wurden im Vergleich dazu
als „blass“, „künstlich orange“ und „schmierig“ eingestuft.
Tab. 4.6.: Mittelwerte und Standardabweichungen für Eigewichte (g), Dotteranteil (%), Schalenanteil
(%), Dotterfarbe (Fächerwert).
Futtervariante Eigewicht Dotteranteil Schalenanteil Dotterfarbe
Futter + RE inf. (TG) 68,2±4,03 25,0±1,03 9,71±0,69 12,0±0,00
Futter + RE ges. (TG) 66,7±5,55 25,7±1,12 9,65±0,50 12,0±0,00
Futter + GK inf. (T) 67,6±4,82 25,5±1,11 9,64±0,59 12,3±0,46
Futter + GK ges. (TG) 66,0±2,53 26,8±1,22 9,60±0,79 12,0±0,00
Kontrollfutter ohne Salat
(TG)
66,9±4,00 25,7±1,35 9,94±0,55 12,0±0,00
F-Werte 0,33 n.s. 2,42 n.s. 0,37 n.s. 2,33 n.s.
Depositionsraten und Gesamtgehalte an n-3-FS im Gesamtei
Die n-3-Aufnahme war bei Fütterung mit infiziertem Salat deutlich höher als für
gesunden Salat oder Kontrollfutter, was mit dem höheren Futterverbrauch korrelierte.
Die Aufnahme an Gesamt-n-3-FS mit 1020 mg/Ei war bei Fütterung mit infiziertem
Grünem Salat am höchsten (Tab. 4.7.). Sie war höher, als bei Fütterung mit
infiziertem Roten Eichblatt Salat (934 mg/Ei), mit gesundem Roten Eichblatt Salat
(858 mg/Ei) und bei Fütterung mit gesundem Grünem Kopfsalat (896 mg/Ei). Die
geringste n-3-Aufnahme mit nur 553 mg/Ei lag bei der Kontrollgruppe vor.
Die n-3-FS-Gehalte pro Ei waren mit 122,6 und 118 mg/Ei bei Zufütterung von
Rotem Eichblattsalat deutlich geringer als bei Zufütterung von Grünem Kopfsalat mit
130 und 135,7 mg/Ei.
Bei den Hühnern, die mit Salat gefüttert wurden, wiesen die Eidotter mit bis zu 135,7
mg/Ei beinahe um das Doppelte höhere n-3-FS-Gehalte auf, als die Eidotter der
Kontrollgruppe mit nur 81,8 mg n-3-FS/Ei (Tab. 4.7.). Die Aufnahme an n-3-FS sowie
die n-3-FS-Gehalte der Eier korrelierten mit den vergleichsweise hohen n-3-FS-
Gehalten von Futter mit Salatbeimischung gegenüber Kontrollfutter.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
93
Die Depositionsrate für n-3-FS variierte zwischen 13,1 und 15,1 % und lag im
Durchschnitt bei 13,9 %. Im Vergleich dazu lag die durchschnittliche Depositionsrate
von n-3-FS verschiedener Hühnerrassen bei einer Studie mit Leinöl als Futterzusatz
in derselben Größenordnung bei 17,4% (STEINHILBER 2003). Die n-3-FS aus Salat
konnten folglich genau so gut „verwertet“ werden wie die FS aus Leinöl mit ähnlich
guter „Einlagerungsbilanz“.
Die Depositionsraten waren bei Fütterung mit infiziertem Salat nicht signifikant von
denen bei Fütterung mit gesundem Salat oder Kontrollfutter verschieden.
Tab. 4.7.: Berechneter durchschnittlicher Futterverbrauch (FV, g/Ei), Dottergewicht (DG, g/Ei), n-3-FS-
Aufnahme (mg/Ei), n-3-FS-Gehalt (mg/Ei), und n-3-Deposition (%)
Futtervariante FV DG n-3-FS-Aufnahme n-3-FS-Gehalt n-3-Deposition
Futter + RE inf. (TG)
120,4 15,8 934 122,6 13,1
Futter + RE ges. (TG)
117,0 16,1 858 118,0 13,8
Futter + GK inf. (TG)
127,4 16,2 1020 130,0 12,7
Futter + GK ges. (TG)
112,3 17,0 896 135,7 15,1
Kontrollfutter ohne Salat (TG)
125,6 16,2 553 81,6 14,8
Futterverbrauch, Dottergewichte, n-3-Aufnahme und Depositionsraten unterschieden
sich nicht signifikant, wohingegen die Unterschiede im n-3-FS-Gehalt bei der
Salatfütterung gegenüber der Kontrollfütterung statistisch signifikant erhöht waren.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
94
4.4. Diskussion
4.4.1. Befallsergebnis vom Feldversuch
Verglichen mit dem im Labor 100%ig infizierten Salat und erzielten EPA-Gehalten
von 1 mg/g, wies der zur Hälfte infizierte Grüne Kopfsalat vom Feld mit 0,2 mg EPA/g
FG nur etwa 1/5 des erzielbaren EPA-Gehaltes auf. Der Rote Eichblattsalat war, trotz
Sporulation auf der kompletten Blattfläche, mit 0,4 mg EPA/g TG um 60% schlechter
als Laborsalat und doch doppelt so gut befallen wie der Grüne Kopfsalat. Die
anfänglich abgeschätzte Menge an EPA für das Fütterungsexperiment entsprach
somit nicht dem aus Laborversuchen erwarteten Wert von 1 g EPA/kg TG Salat. In
einem Kilogramm Trockensalat war mit Konzentrationen von nur 200-400 mg
lediglich genauso viel EPA enthalten, wie in einer handelsüblichen Fischölkapsel.
Dieser geringe EPA-Gehalt des Salates vom Feldversuch lag wohl an mehreren
Faktoren. Zuallererst war wohl das Pflanzdatum für den schlechten Befall des
Grünen Kopfsalates mit B. lactucae verantwortlich, im Labor wurden sowohl der Rote
Eichblatt- als auch der Grüne Kopfsalat etwa gleich gut und gleich schnell infiziert.
Sorteneffekte wurden ausgeschlossen, da bei verschiedenen Sorten und beiden
Salattypen unter Laborbedingungen dieselben EPA-Durchschnittsgehalte gemessen
wurden. Der Rote Eichblattsalat konnte wohl aufgrund des früheren Pflanzdatums
eine bessere Biomasse und einen stärkeren Bremia-Befall ausbilden. Dafür spricht
auch das Ergebnis, dass die Biomasse und der Befall des früheren Satzes des
Grünen Kopfsalates ebenfall besser ausgeprägt waren, als beim späteren Satz. Die
Faktoren Licht, Feuchtigkeit und Temperatur, welche die Infektion mit B. lactucae
steuern (DATNOFF et al. 1990; SCHERM et al. 1993; SU et al. 2000; SU et al. 2004)
konnten auf dem Feld nicht beeinflusst werden. Die durchschnittlich schlechteren
EPA-Gehalte des Salates vom Freiland wurden wohl auch vom zeitlich verzögerten
Befall von älteren zu jüngeren Blättern mit verursacht. Da die Zellstruktur des Salates
bei Infektion mit Falschem Mehltau durch die Besiedelung verändert wurde, waren
die älteren Blätter teilweise schon braun und faulig, während die jüngeren Blättern
noch in der Anfangsphase einer Infektion waren oder frisch sporulierten. Daher
schwankten die Fettsäuregehalte innerhalb eines Salatkopfes sehr stark. Ein
Freilandfeld war, aufgrund der schlechten Optimierbarkeit des Befalls, wegen kaum
regulierbarer Umweltbedingungen, nicht für den Erhalt optimaler EPA-Gehalte in
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
95
infiziertem Salat geeignet. Infiziertes Pflanzenmaterial für einen Fütterungsversuch
ließ sich zwar in genügender Menge, jedoch nicht in genügender Qualität gewinnen.
4.4.2. Temperaturstabilität und Trocknung
Die EPA-Gehalte bei den Messungen der Temperaturstabilität in den Vorversuchen
unterschieden sich etwas bei unterschiedlichen Trocknungstemperaturen und
Trocknungszeiten. Dabei konnte ein nicht sichtbarer Befallsgradient vom Mycel im
Salatblatt jedoch nicht ausgeschlossen werden, da nur ein (äußerlich homogen
sporulierendes) Salatblatt beprobt wurde und für jede Temperatur mit zugehörigem
Trocknungszeitraum immer Blattstücke links und rechts der Hauptblattader verwen-
det wurden. Es konnte jedoch auch nicht ausgeschlossen werden, dass die mittleren
Blattteile besonders gut infiziert waren und folglich bei 40°C die höchsten EPA-
Konzentrationen aufwiesen. Die blattinterne Befallsdichte konnte jedoch nicht weiter
untersucht werden, da Mycel vom Blattgewebe nicht trennbar war. So konnte nicht
gesagt werden, ob die niedrigen FS-Gehalte bei 20°C auf eine sehr niedrige
Befallsdichte am Blattgrund zurückzuführen waren oder ob enzymatische Abbau-
prozesse bei vergleichsweise erhöhtem Wassergehalt dafür verantwortlich waren,
denn bei RT enthielten die Blattstücke nach 48 h mehr Restfeuchte als bei 40°C. Die
niedrigeren FS-Gehalte bei 60°C bzw. 80°C Trocknung ko nnten ebenfalls sowohl am
niedrigen Befall der Blattspitze liegen, als auch am Verlust der flüchtigen FS durch zu
hohe Trocknungstemperatur wegen hitzebedingtem Aufplatzen von Zellen. Auf jeden
Fall galt: 1. Je Kürzer der Trocknungszeitraum und je geringer die Temperatur, umso
geringer die Energie- und Sachkosten. 2. Für stabil getrocknetes Gewebe war eine
Restfeuchte höher als 10% unerwünscht, da enzymatischer FS-Abbau in engem
Zusammenhang mit dem Wassergehalt steht (BELITZ et al. 2001). Eine Restfeuchte
kleiner als 10% konnte mit 20°C Trocknungstemperatur na ch 48 h Trocknung nicht
erreicht werden. Als Fazit aus dem Vorversuch ging daher hervor, dass eine
Trocknungstemperatur bei 40°C über einen möglichst kurzen Zeitraum optimale
EPA-Gehalte bei vertretbarem Energieaufwand ermöglichte. Diese Parameter
wurden bei der Trocknung im Hordentrockner umgesetzt und eine Lagerung ohne
Verluste an FS konnte gewährleistet werden.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
96
4.4.3. FS-Analyse in der Nahrungskette
Die FS-Messungen zeigten, dass in infiziertem Salat weniger ALA und damit
insgesamt weniger n-3-FS enthalten waren als in gesundem Salat. Dies war wohl auf
Oxidationsprozesse während des Feldbefalls zurückzuführen, da ältere infizierte
Blätter meist schon faulig waren. Auch die geringen zusätzlichen Mengen an EPA
und ALA aus B. lactucae konnten dieses ALA-Defizit im infizierten Salat nicht
wettmachen. In den Futterproben konnte dieser Trend nicht nachgewiesen werden.
Futter mit infiziertem Salat unterschied sich im n-3-FS-Gehalt nicht signifikant vom
Futter mit gesundem Salat, was an einer sehr großen Varianz zwischen den
einzelnen Futterproben lag. Dass das Futter eher grobkörnig strukturiert war und
schon beim Salat große Unterschiede von Infektionsgrad und Beschaffenheit (älteres
oder jüngeres Blatt) vorhanden waren, wirkte sich auf die Beprobung aus. Futter mit
Salatbeimischung enthielt jedoch insgesamt doppelt soviel n-3-FS wie Kontrollfutter,
was sich statistisch signifikant auswirkte. So zeigten auch die Dotter der Hühner aus
Fütterung mit infiziertem und gesundem Salat um ein Drittel höhere n-3-FS-Gehalte
als Dotter von Hühnern aus Kontrollfütterung, was sich als statistisch signifikant
belegen ließ. Eine Beimischung von 10% Salat wirkte sich folglich positiv auf den n-
3-FS-Gehalt im Eidotter aus, wobei es keine Rolle spielte, ob dieser infiziert oder
gesund war. Es konnte nicht bewiesen werden, dass sich EPA über die
Nahrungskette auswirkte, da die Gehalte in infiziertem Salat bei einer Beimischung
von 10% zum Futter für einen Effekt nicht genügten. Dies lag wohl auch mit an den
geringeren EPA-Gehalten des Freilandsalates. Die FS, die einen nachweisbaren
Einfluss auf den n-3-FS-Gehalt in der Nahrungskette „Salat-Futter-Dotter“ hatte, war
ALA aus Salat, da diese FS mengenmäßig genügend ins Gewicht fiel. ALA aus Salat
erhöhte den ALA-Anteil im Dotter um das Doppelte und den DHA-Anteil um etwa
20%.
Infizierter Salat wies trotz niedrigerer ALA-Konzentrationen ein besseres n-6/n-3-
Verhältnis auf als gesunder Salat. Dies war dadurch zu erklären, dass gesunder
Salat mehr von der n-6-FS LA produzierte. Im Futter war dieser Effekt nicht
nachweisbar. Das verbesserte FS-Verhältnis im Futter mit Salatbeimischung war, wie
der höhere n-3-FS-Gehalt, auf ALA aus Salat zurückzuführen. Das verbesserte n-
6/n-3 Verhältnis im Eidotter, nach Salatbeimischung zum Futter, war durch signifikant
erhöhte ALA und DHA Gehalte im Eidotter gegenüber der Kontrollgruppe begründet.
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
97
Eine Infektion mit B. lactucae wirkte sich auf das n-6/n-3-Verhältnis im Dotter
statistisch gegenüber Fütterung mit gesundem Salat nicht aus.
Als exzellente Quelle von ALA, die positiv zum FS-Muster von Eidotter beitragen
kann, wurde Portulak beschrieben. Portulak enthält in 1 g Frischgewicht 3-4 mg ALA
(SIMOPOULOS & SALEM 1986; SIMOPOULOS 1995). Die Zufütterung von Portulak kann
den n-3-FS Gehalt von Hühnereiern daher deutlich verbessern (SIMOPOULOS &
SALEM 1992; SIMOPOULOS 1995). In Salat wurden im Vergleich zu Portulak nur 5-7
mg ALA/g TG bzw. 0,5-0,7 mg ALA auf 1 g Frischgewicht gemessen. An dieser
Stelle sollte zusätzlich bemerkt werden, dass bei der Herstellung von „Omega-3-
Eiern“ ALA- und DHA-Steigerungen um Faktor 5-10 gefordert werden (Professor
Grashorn mündlich), die bisher nur durch massive Zufütterung von n-3-FS-haltigen
Ölen erreicht werden können.
4.4.4. Lipidoxidation und Sensorik
Für die Dotter der Hühner der Salatgruppen wurden höhere Oxidationswerte
erwartet, da aus Fütterungsversuchen mit Leinöl bekannt ist, dass die Dotterlipide
wegen des höheren n-3-FS-Gehaltes schneller zu Oxidation neigen, als Dotterlipide
aus Kontrollfütterung (LEESON et al. 1998). Zudem sind in Sporangien Freie FS
enthalten, die Oxidationsprozesse theoretisch ebenfalls beschleunigen sollten (vgl.
Kap. 2). Insgesamt waren die Dotter jedoch wohl alle gut gegen Oxidation geschützt,
so dass erst nach 60 Minuten Oxidationsprozesse messbar waren. Interessant war,
dass die Eidotter aus Fütterung mit infiziertem Salat die starke Tendenz aufwiesen,
weniger gegen Oxidation anfällig zu sein, als Dotter aus Kontrollfütterung oder
Fütterung mit gesundem Salat. Diese Unterschiede waren jedoch wegen zu hoher
Standardabweichungen knapp unter der Signifikanzgrenze von 5 % und daher nicht
mehr signifikant. Eventuell produziert infizierter Salat jedoch vermehrt Stoffe, die
Oxidationsprozesse verhindern. Dem Tierfutter wurden insgesamt wohl genügend
Antioxidantien beigemischt, sodass Oxidationsvorgänge allgemein verhindert werden
konnten. Dieses Ergebnis belegte deutlich, dass sich EPA aus B. lactucae, trotz
massiver Zufütterung, nicht negativ auf die Eiqualität auswirkte.
Der Sensoriktest war eine zusätzliche Bestätigung für die Richtigkeit der Oxidations-
Messungen, da die massive Verfütterung von infiziertem Salat keineswegs zu Fehl-
4. Fütterungsexperiment zur Anreicherung von n-3-FS aus B. lactucae in Hühnereier
98
aromen im Eidotter beitrug, der Geschmack der Eier aus Fütterung mit infiziertem
Salat sogar als sehr gut bewertet wurde.
4.5. Zusammenfassung
Die Studie zur Anreicherung von EPA aus B. lactucae über die Nahrungskette in
Hühnerdotter zeigte, dass die eingesetzten EPA-Mengen aus B. lactucae bei Zusatz
von 10% infiziertem Salat zum Futter offensichtlich zu gering waren, um sich über
Nahrungskette die im ALA oder DHA-Gehalt des Dotters niederzuschlagen.
Hierbei muss allerdings bemerkt werden, dass mit dem Freilandversuch nicht die
optimalen EPA-Gehalte in infiziertem Salat erreicht werden konnten.
Gegenüber der Fütterung mit gesundem Salat brachte infizierter Salat keine Vorteile,
jedoch auch keine Nachteile für den n-3-FS-Gehalt von Eiern. In einem Sensoriktest
wurden Eier aus Fütterung mit infiziertem Salat sogar mit am besten bewertet.
Auf Grund der hohen ALA-Gehalte von Salat und den damit verbundenen erhöhten
n-3-FS-Gehalte des Futters, war nach Fütterung mit salatversetztem Futter eine
deutliche Anreicherung der n-3-FS im Eidotter zu beobachten. Die Salat-Menge im
Futter bewirkte im Hühnerdotter gegenüber der Kontrollfütterung, dass doppelt soviel
ALA und 20% mehr DHA synthetisiert wurden. Verglichen mit etwa 17 mg ALA/kg TG
in Futter mit Leinöl, lag Futter mit 10% Salat (7 mg ALA/kg TG) daher schon in dem
Bereich, der für eine Anreicherung der DHA-Gehalte im Dotter relevant war. Durch
die Verbesserung des n-3-FS- Anteils im Futter mit Salatbeimischung wurden auch
die n-6/n-3-Verhältnisse im Eidotter signifikant positiv beeinflusst.
Negative Auswirkungen von infiziertem Salat auf Qualität oder Tierleistung konnten
für keines der untersuchten Merkmale festgestellt werden. Das Experiment belegte
erstmalig, dass die Zufütterung von Pflanzenmaterial mit Infektion durch einen
obligat-biotrophen Oomyceten keine toxischen oder leistungsmindernden Einflüsse
auf die Versuchstiergruppe hatte.
5. Bewertung des Potenzials von infizierten Nutzpflanzen als n-3-FS-Quellen für die menschliche Ernährung
99
5. Bewertung des Potenzials von infizierten Nutzpflanze n als n-3-FS-
Quellen für die menschliche Ernährung
5.1. Das Potenzial von Sporangien
In Sporangien von B. lactucae und P. halstedii konnten EPA-Konzentrationen von 10
bis 30 mg/g FG gemessen werden. Neben den Empfehlungen für Aufnahmeraten
von n-6 und n-3-FS existieren Empfehlungen für die täglichen Aufnahmekonzentra-
tionen für EPA und DHA, die in den USA bei 650 mg/Tag und in Großbritannien bei
200 mg/Tag liegen. Die NATO empfiehlt sogar 800 mg EPA + DHA täglich. Die DGE
empfiehlt eine EPA- und DHA-Aufnahme von 300 mg pro Person und Tag.
Fischölkapseln und Algenölkapseln, in denen hoch ungesättigte FS stark aufkon-
zentriert werden, enthalten zwischen 100 und 300 mg EPA und zusätzlich 100 bis
300 mg DHA pro Kapsel. Um eine tägliche Aufnahme von 100-300 mg EPA zu
gewährleisten, müssten statt einer Fischölkapsel täglich 10 g Sporangien von B.
lactucae oder P. halstedii verzehrt werden. Ein Produktivitätsvergleich in Kap. 2 (Tab.
2.2.) zeigte zwar, dass die theoretisch erzielbaren EPA-Gehalte pro Fläche von
sporu-lierenden Pflanzen durchaus mit den EPA-Gehalten pro Volumen aus
Bioreaktorsystemen konkurrenzfähig wären. Dafür wären jedoch sehr große
Anbauflächen (mehrere hundert m²) notwendig, deren Umwelt steuerbar sein sollte
und Fach-personal mit guten Kenntnissen im Umgang mit Erreger und Wirt wäre
unabdingbar. Da B. lactucae und P. halstedii obligat-biotroph sind und noch kein
Nährmedium für Kultivierung existiert, ist eine direkte Gewinnung der FS auf diese
Art bisher ausgeschlossen. Zudem gibt es schon Oomyceten-Gattungen wie Ulkenia
oder Thraustochytrium, die in Nährmedium alleine ohne Wirt wachsen und sehr hohe
Anteile an EPA oder DHA produzieren können. Das Potenzial von Sporangien als
direkte Quelle für die menschliche Ernährung wird daher derzeit als gering eingestuft.
5.2. Das Potenzial von infiziertem, essbarem Pflanzen gewebe
In infiziertem Pflanzengewebe fand man nach Optimierungsversuchen EPA-Höchst-
gehalte von etwa 2 mg EPA/g TG. Um den Tagesbedarf von 200-300 mg EPA zu
decken, müssten daher 100 g getrocknetes, infiziertes Pflanzengewebe gegessen
werden, was etwa einer Menge von 1 kg Frischgewicht entspricht. Bezieht man diese
5. Bewertung des Potenzials von infizierten Nutzpflanzen als n-3-FS-Quellen für die menschliche Ernährung
100
Menge auf z.B. Salat, so müssten vier komplett infizierte Salatköpfe mit je 250 g FG
von einer Person am Tag verzehrt werden.
Dies sind Mengen, die nicht der natürlichen Nahrungsaufnahme entsprechen. Es
kann nun natürlich bemerkt werden, dass die empfohlenen Tagesmengen an EPA
sehr hoch angesetzt sind, da sie an klinische Studien zur Wirksamkeit angelehnt
sind. Würde pro Person nur ein infizierter Salatkopf pro Tag verzehrt, käme man
schon auf eine nennenswerte Dosis von etwa 50 mg EPA. Fraglich bliebe allerdings
die Akzeptanz der Verbraucher für infizierten Salat. Die Tatsache, dass sich B.
lactucae in Salat latent ausbreitet und bis zum Zeitpunkt der Sporulation nicht
sichtbar ist, könnte die Akzeptanz der Verbraucher steigern, zumal die gesundheits-
fördernde Wirkung der n-3-FS hervorgehoben werden könnte. Das Potenzial von
großtechnisch produzierten Nutzpflanzen als Quelle für die menschliche Ernährung
wurde in dieser Arbeit relativ hoch eingeschätzt. Die theoretische Produktivität von
infizierten Pflanzen pro Fläche war im Vergleich zu Bioreaktorsystemen hoch (vgl.
Kap. 2). Allerdings sollte die Infektion nicht im Freiland sondern in Gewächshäusern
stattfinden. Dort könnten Luftfeuchtigkeit und Temperatur geregelt werden, um die
Infektion ohne Nachteile für EPA-Gehalt, Aussehen oder Geschmack des Salates
optimal zu steuern. Die Infektion müsste standardisiert mit ausgewählten, besonders
EPA-haltigen Stämmen von B. lactucae geschehen. Zudem müssten Gefahren für
die menschliche Gesundheit über zusätzliche Biotests ausgeschlossen werden.
Das Potenzial von mit Oomyceten infizierten Pflanzen als n-3-FS-Quellen für die
menschliche Ernährung wird unter den genannten Vorbehalten, als bedingt möglich
eingestuft.
5. Bewertung des Potenzials von infizierten Nutzpflanzen als n-3-FS-Quellen für die menschliche Ernährung
101
5.3. Das Potenzial von Bremia lactucae in der Nahrungskette
Zunächst müsste das Potenzial von B. lactucae als EPA-Lieferant für die Nahrungs-
kette besser ausgeschöpft werden, indem die Anbau- und Infektionstechniken auf
Großflächen mit steuerbarer Umwelt optimiert würden, so dass die EPA-Mengen im
Futter von bisher nur 0,2 mg EPA/g TG um Faktor 5 auf mindestens 1 mg EPA/g TG
(Laborwerte) gesteigert werden könnten. Zudem könnte versucht werden, analog
zum Optimierungsversuch für P. halstedii bei Sonnenblumen (vgl. Kap. 3), den EPA-
Gehalt in infiziertem Salat über gesteigerte Stickstoffgaben zusätzlich um den Faktor
2 zu erhöhen. Um deutliche Effekte von B. lactucae im Dotter zu sehen, müssten die
EPA-Mengen von Futter mit Beimischung von infiziertem Salat wohl mindestens um
den Faktor 10 erhöht werden, was mit optimierten Infektions- und Anbaumethoden
eventuell möglich wäre. Hier besteht noch pflanzenbaulicher Forschungsbedarf.
Der Versuch zur Anreicherung von EPA aus B. lactucae in Hühnereier brachte zwar
den gewünschten Effekt erhöhter ALA- bzw. DHA-Konzentration, dieser war jedoch
nicht auf B. lactucae sondern auf Salat zurückzuführen. Ein Zusatz von nur 10%
stark infiziertem Salat zum Futter zog einen Verdünnungseffekt des EPA-Gehaltes im
Futter nach sich, so dass sich EPA selbst nicht im Dotter anreicherte und es auch
keine Hinweise dafür gab, dass EPA vom Huhn für die DHA-Synthese verwendet
wurde.
Das Potenzial von absichtlich produziertem, infiziertem Salat für die Produktion von
n-3-FS-Eiern oder für die direkte menschliche Ernährung kann derzeit noch nicht
abgeschätzt werden. Angesichts existierender, leistungsfähiger und bewährter
Alternativen (Algen, heterotrophe Oomyceten, Grünfutter, gut dosierbare n-3-FS-
haltige Öle), erscheint eine Weiterentwicklung des hier getesteten Versuchsansatzes
als wirtschaftlich wenig sinnvoll.
Infizierter Salat fällt großflächig jedoch öfters an und stellt einen enormen Ernte-
verlust für Landwirte dar, die Arbeit, Geld und Zeit in die Anzucht und Pflege
verwendeten. Da es sich bei B. lactucae um einen landwirtschaftlichen Erreger
handelt, dessen Einfluss auf die menschliche Ernährung bisher nicht erforscht wurde,
ist der Salat nicht marktfähig und muss vernichtet werden.
5. Bewertung des Potenzials von infizierten Nutzpflanzen als n-3-FS-Quellen für die menschliche Ernährung
102
Wenn Salat großflächig von B. lactucae befallen wird, könnte er aufgrund der
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit jedoch an Tiere verfüttert werden. Um B.
lactucae-infizierten Salat als Futtermittel zulassen zu können, bedürfte es
eindeutiger, ernährungsmedizinischer Studien bezüglich der Nahrungskette, die
zweifelsfrei belegen, dass der Verzehr von großen Mengen an B. lactucae für Tiere
und Menschen ungefährlich ist. Das Potenzial von infiziertem Salat in dieser Hinsicht
wird als relativ vielversprechend eingestuft, zumal DHA-reiche, getrocknete
Schizochytrium-Präparate bereits als Tierfutterzusatz zugelassen sind und als sicher
und unbedenklich gelten (WARD & SINGH 2005).
6. Zusammenfassung
103
6. Zusammenfassung
Obligat-biotrophe Systeme wurden bisher nicht auf ihre Eignung als Omega-3-
Fettsäure-Quellen (n-3-FS-Quellen) untersucht. Das Ziel dieser Arbeit war es, das
Potenzial der Nutzpflanzen-Pathogene Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. & DeToni
(1888) und Bremia lactucae Regel (1843) auf ihre Eignung als alternative Quellen
von n-3-FS für die menschliche Ernährung zu erforschen, da die Lipide dieser
Oomyceten zu über 30% aus diesem Fettsäuretyp bestehen.
Die Methodik der quantitativen Fettsäureanalytik wurde im Rahmen der vorliegenden
Arbeit angewandt und für die Testsysteme adaptiert.
Die Fettsäure Eicosapentaensäure (EPA) wurde für beide Erreger mittels
Gaschromatographie quantifiziert. EPA war nicht nur in Triacylglyceriden gespei-
chert, sondern stammte zu großen Teilen auch aus anderen Lipidklassen wie z.B.
Phospholipiden und Freien FS (vgl. Kap. 2). Die Ergebnisse wurden mit der
Produktivität von EPA aus anderen Systemen verglichen. Bei optimierter EPA-
Produktion pro Fläche könnte B. lactucae nach Hochrechnungen mit 0,28 g/(m²•d)
durchaus mit der EPA-Produktion derzeit bestehender Bioreaktorsysteme (z.B.
Nitzschia alba) konkurrieren. Infizierte Pflanzen produzierten durchschnittlich 1 mg
EPA/g Trockengewicht (TG). Dies ist jedoch für den direkten Einsatz in der
menschlichen Ernährung um etwa den Faktor 10 zu wenig.
Daher wurden die Grenzen der natürlichen Optimierbarkeit von EPA in Kap. 3 am
bereits gut erforschten Modellorganismus P. halstedii in Sonnenblumen getestet. In
Sporangien waren maximale EPA-Konzentrationen von 25-30 mg/g FG erreichbar,
es gab Stämme, die unwesentlich mehr EPA produzierten als andere.
Bezüglich des Wirtes gab es spezielle Sonnenblumensorten und –linien, die bei guter
Biomasseentwicklung besonders gut infiziert werden konnten, was sich in vergleichs-
weise höheren EPA-Gehalten pro Biomasse zeigte. In infiziertem Gewebe fand man
im Optimalfall weiterhin lediglich etwa 1 mg EPA/g TG. Über die Variation des In-
fektionsdruckes (verschiedene Sporangieninokuli) konnten die EPA-Konzentrationen
in infiziertem Sonnenblumengewebe nicht gesteigert werden.
Hohe Gaben von Stickstoff an die Wirtspflanzen trugen dagegen statistisch signifi-
kant zur Steigerung der EPA-Gehalte im Pflanzengewebe bei, sodass bis zu 2 mg
6. Zusammenfassung
104
EPA/g TG erreicht werden konnten. Da die erreichten EPA-Konzentrationen bei
normalen Ernährungsgewohnheiten immer noch nicht ausreichten, um den in
Deutschland empfohlenen Tagesbedarf von 150-300 mg EPA zu decken, wurde
versucht, EPA über die Nahrungskette aus infiziertem Salat in Hühnerdotter
anzureichern (vgl. Kap. 4).
Ein Kooperationsprojekt mit dem Institut für Tierhaltung und Tierzüchtung, der
Versuchsstation für Gartenbau und dem Institut für Agrartechnik ermöglichte die
Durchführung eines komplexen Versuches zur Anreicherung von EPA aus B.
lactucae-infiziertem Salat in Dotterlipiden von Hühnereiern. Die Studie ergab, dass
bei einem Zusatz von 10% Salat (stark infiziert bzw. gesund) zum Hühnerfutter, im
Dotter die Gehalte der n-3-FS Alpha-Linolensäure (ALA) und Docosahexaensäure
(DHA) um das Doppelte bzw. um 20% gesteigert werden konnten. Gleichzeitig
verschob sich das n-6/n-3-Verhältnis zu günstigeren Werten für die menschliche
Ernährung. Für diese Effekte war es nicht relevant, ob der Salat infiziert oder gesund
war. Der Geschmack der Eier wurde durch Fütterung mit infiziertem Salat positiv
beeinflusst. Bezüglich der Eiqualität und der Leistungsdaten der Tiere konnten im
untersuchten Zeitraum keine negativen Einflüsse durch B. lactucae festgestellt
werden.
7. Summary
105
7. Summary
The potential of downy mildew as source of omega-3-fatty acids for human
nutrition
Obligate-biotrophic systems have yet not been tested for their suitability as sources
for omega-3-fatty acids (n-3-FA). The aim of this work was, to explore the potential of
the crop-plant pathogens Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. & DeToni (1888) and
Bremia lactucae Regel (1843) to serve as alternative sources of n-3-FA for human
nutrition, as the lipids of these oomycetes consist of 30% or more n-3-FA.
Methods of quantitative fatty acid analysis were applied in this work and adapted for
the test systems.
The fatty acid eicosapentaenoic acid (EPA) of both pathogens was quantified by
means of gas chromatography. The study showed that EPA was not only stored in
triacylgycerides but was also part of other lipid classes, e.g. phospholipids and free
fatty acids (see chapter 2). The results were compared with the productivity of EPA
from other systems. The estimated EPA-production of B. lactucae per area (0,28
g/(m²•d)) could compete with the EPA-production of existing bioreactor systems (e.g.
Nitzschia alba). Infected plants produced an average of 1 mg EPA/g dry weight
(DW). This, however, is only about 10% of the amount which would be required for
direct use in human nutrition.
In consequence, the possibility of enhancing EPA production through genotype
selection and growth conditions was tested with the already well explored model
organism P. halstedii in sunflowers (chapter 3). Sporangia of different pathogen
strains slightly varied in their EPA content, reaching maximum concentrations of 25-
30 mg/g DW. With respect to the host, several sunflower cultivars and –lines were
tested for susceptibility and biomass development in infected plant tissue. A
maximum of 1 mg EPA/g DW was found. Variation of infection pressure (different
doses of sporangia) could not influence the EPA-production.
In contrast, high amounts of nitrogen during host plant cultivation raised the EPA-
contents in infected plant tissue up to 2 mg EPA/g DW. This was still insufficient to
7. Summary
106
meet the recommended daily uptake of 150-300 mg EPA within normal dietary
habits.
Hence an enrichment of EPA or n-3-FA in hens´ egg yolk was attempted, using
infected lettuce in hens´ food (chapter 4).
This experiment was carried out in colaboration with the “Institut für Tierhaltung und
Tierzüchtung (Universität Hohenheim)”, the “Versuchsstation für Gartenbau (Hohen-
heim)” and the “Institut für Agrartechnik (Universität Hohenheim)”. B. lactucae
infected lettuce was produced in a field trial, dried and added to commercial hens´
food with a ratio of 10%. Uninfected lettuce served as control. The study showed,
that a supplementation of 10 % lettuce (strongly infected or healthy) to hens´ food
doubled the content of the n-3-FA alpha-linolenic acid (ALA, 18:3 n-3) and raised
docosahexaenoic acid (DHA) by 20 % in egg yolk. Simultaneously the n-6/n-3-ratio
with respect to the physiological requirement of human nutrition improved. The plants
cultivated in the field contained only about 20% of the maximum EPA-contents of
plants in the laboratory. It was not relevant for the n-3-FA content of egg yolk, if the
lettuce was infected or healthy. The flavour of the eggs was influenced positively by
feeding hens with infected lettuce. With respect to the egg quality and the perfor-
mance data of the hens, there could not be seen any negative influences.
8. Literatur
107
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9. Anhang
118
9. Anhang I: Berechnete und in der Untersuchung verwendeten Responsefaktoren von 7 Injektionen und deren Mittelwert mit der Bezugsbasis C 20:0.
Fettsäure Injektionen Mittelwert
1 2 3 4 5 6 7 C12:0 0,67 0,59 0,57 0,59 0,62 0,60 0,59 0,60 C13:0 0,71 0,65 0,64 0,64 0,67 0,65 0,63 0,66 C14:0 0,74 0,70 0,68 0,71 0,73 0,69 0,69 0,71 C14:1 0,72 0,68 0,68 0,68 0,73 0,71 0,67 0,69 C15:0 0,83 0,74 0,73 0,73 0,82 0,74 0,73 0,76 C15:1 0,77 0,73 0,72 0,73 0,79 0,73 0,72 0,74 C16:0 0,85 0,79 0,79 0,80 0,83 0,79 0,80 0,81 C16:1 0,84 0,77 0,76 0,79 0,78 0,77 0,77 0,78 C17:0 0,90 0,83 0,82 0,85 0,88 0,83 0,82 0,85 C17:1 0,86 0,84 0,83 0,81 0,87 0,84 0,80 0,84 C18:0 0,94 0,90 0,88 0,91 0,93 0,89 0,90 0,91 C18:1n9t 0,90 0,89 0,87 0,91 0,94 0,91 0,91 0,90 C18:1n9c 0,92 0,89 0,87 0,90 0,93 0,90 0,89 0,90 C 18:2n6t 0,88 0,87 0,84 0,87 0,92 0,86 0,87 0,87 C18:2n6c 0,87 0,87 0,86 0,86 0,89 0,84 0,87 0,87 C18:3n6 0,93 0,82 0,86 0,83 0,88 0,84 0,84 0,86 C18:3n3 0,87 0,82 0,84 0,83 0,84 0,84 0,84 0,84 C20:0 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 C20:1n9 1,04 0,99 0,96 1,00 0,97 0,98 0,99 0,99 C20:2 0,97 0,96 0,98 0,98 0,98 0,97 0,99 0,97 C 20:3n6 1,04 1,00 0,94 0,98 1,04 1,00 0,99 1,00 C21:0 1,00 0,98 0,94 0,97 1,02 0,96 0,97 0,98 C20:4n6 1,00 0,91 0,90 0,90 0,91 0,89 0,90 0,91 C20:3n3 0,96 0,93 0,92 0,92 0,98 0,92 0,92 0,94 C20:5n3 0,91 0,91 0,91 0,87 0,87 0,89 0,89 0,89 C22:0 1,11 1,14 1,09 1,09 1,13 1,11 1,11 1,11 C22:1n9 1,23 1,10 1,07 1,10 1,08 1,12 1,11 1,12 C 22:2 1,00 1,06 1,04 1,05 1,02 1,05 1,08 1,04 C23:0 1,20 1,15 1,12 1,14 1,15 1,16 1,13 1,15 C 24:0 1,19 1,25 1,22 1,18 1,23 1,20 1,20 1,21 C22:6n3 1,16 1,09 0,76 1,12 1,12 1,07 1,09 1,06 C24:1 1,05 1,10 1,36 1,10 1,09 1,11 1,07 1,12
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Fatty Acid 20.01.05 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8STAR 108 109 110 111 116 113 114 115 108 109 110 111 116 113 114 115C 12:0 0,59C 13:0 0,65C 14:0 0,71 153 217 185 229 292 160 162 182 0,38 0,47 0,63 0,47 0,54 0,46 0,45 0,55C 14:1n5 0,69C 15:0 0,75C 15:1n5 0,78C 16:0 0,82 18839 21521 15099 22069 25448 15477 16334 14830 53,97 54,37 59,51 52,11 54,32 52,05 52,75 52,45C 16:1n9cC 16:1n7tC 16:1n7c 0,77 2052 2579 1916 3069 3098 1872 2059 1648 5,48 6,07 7,04 6,75 6,16 5,87 6,20 5,43C 17:0 0,76 144 149 97 147 221 138 154 149 0,38 0,35 0,35 0,32 0,44 0,43 0,46 0,49C 17:1n7 0,86 65 242 59 92 64 35 0,19 0,64 0,24 0,23 0,22 0,13C 18:0 0,92 7091 8002 5956 7855 8339 6401 6038 5880 22,68 22,57 26,21 20,71 19,87 24,03 21,77 23,22C 18:1n9t 0,91C 18:1n9c 0,94 33830 37920 26020 40014 39818 28941 30947 24726 110,51 109,24 116,94 107,74 96,92 110,98 113,96 99,72C 18:1n7C 18:2n6t 0,93 31 30 0,10 0,11C 18:2n6c 0,88 13543 16433 9601 17292 20600 12829 15132 11724 41,53 44,44 40,50 43,70 47,06 46,18 52,30 44,38C 18:3n6 0,81 111 94 124 55 82 78 0,27 0,22 0,26 0,18 0,26 0,27C 18:3n3 0,87 651 767 442 824 966 593 721 600 1,98 2,05 1,85 2,06 2,19 2,11 2,47 2,25C 18:4n3C 20:0 1,00 7183 8145 5221 8715 9640 6119 6372 5818 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00C 20:1n9 1,01 112 148 164 168 112 131 74 0,39 0,46 0,48 0,44 0,46 0,52 0,32C 20:2n6 1,01 84 172 161 170 99 115 82 0,30 0,53 0,47 0,45 0,41 0,46 0,36C 20:3n6 1,16 103 96 70 0,37 0,32 0,33C 21:0 0,88 32 121 0,10 0,28C 20:4n6 0,82 1417 1860 1192 1909 1972 1318 1507 1168 4,06 4,70 4,70 4,51 4,21 4,44 4,87 4,13C 20:3n3 0,99C 20:5n3 0,87C 22:0 1,15C 22:1n9 1,11C 22:2n6 1,12C 23:0 1,20C 24:0 1,27 95 184 172 269 169 125 104 72 0,42 0,71 1,04 0,98 0,55 0,65 0,52 0,39C 22:5n3 127 200 92 132 237 52 139 148C 22:6n3 0,89 887 1078 710 1309 1280 865 592 784 2,76 2,96 3,04 3,36 2,97 3,16 2,08 3,01C 24:1n9 1,23
Kontrolle Kontrolle
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Fatty Acid 20.01.05 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8STAR 134 136 137 138 139 140 141 142 134 136 137 138 139 140 141 142C 12:0 0,59C 13:0 0,65C 14:0 0,71 212 181 168 164 265 0,40 0,49 0,44 0,44 0,00 0,72C 14:1n5 0,69C 15:0 0,75C 15:1n5 0,78C 16:0 0,82 24936 15725 13909 15184 14561 10810 15021 15974 54,30 49,12 47,07 46,60 44,87 49,78 47,42 54,97C 16:1n9cC 16:1n7tC 16:1n7c 0,77 2168 1744 1392 1570 1687 1227 1818 1292 4,40 5,08 4,39 4,49 4,84 5,27 5,35 4,14C 17:0 0,76 355 189 183 198 152 130 159 186 0,71 0,55 0,57 0,56 0,43 0,55 0,46 0,59C 17:1n7 0,86 83 73 69 68 69 0,27 0,26 0,22 0,33 0,23C 18:0 0,92 23274 7418 5817 7512 5967 4882 6198 6442 56,58 25,87 21,98 25,74 20,53 25,10 21,84 24,75C 18:1n9t 0,91C 18:1n9c 0,94 41212 31037 22609 28334 26084 20205 26978 22916 102,33 110,56 87,26 99,16 91,65 106,11 97,12 89,92C 18:1n7C 18:2n6t 0,93C 18:2n6c 0,88 30582 21516 16955 19974 17302 13229 17272 15610 71,28 71,94 61,42 65,61 57,06 65,21 58,36 57,49C 18:3n6 0,81 155 110 79 88 98 60 0,33 0,34 0,26 0,26 0,30 0,19C 18:3n3 0,87 2099 1528 1174 1436 1160 835 1191 1125 4,85 5,06 4,21 4,67 3,79 4,08 3,99 4,11C 18:4n3 33C 20:0 1,00 9450 6587 6080 6705 6678 4468 6518 5980 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00C 20:1n9 1,01 116 86 121 98 55 100 88 0,45 0,36 0,46 0,37 0,31 0,39 0,37C 20:2n6 1,01 240 203 148 146 127 97 127 100 0,64 0,78 0,62 0,55 0,48 0,55 0,49 0,42C 20:3n6 1,16 111 47 62 88 67 70 0,49 0,22 0,27 0,38 0,31C 21:0 0,88C 20:4n6 0,82 1976 1570 1069 1342 1201 935 1208 1181 4,31 4,91 3,62 4,12 3,70 4,31 3,82 4,07C 20:3n3 0,99C 20:5n3 0,87C 22:0 1,15C 22:1n9 1,11C 22:2n6 1,12C 23:0 1,20C 24:0 1,27 78 77 112 71 56 87 88 0,37 0,40 0,53 0,34 0,40 0,42 0,47C 22:5n3 105 107 100 121 94 98 127C 22:6n3 0,89 1779 1097 905 1198 1128 737 911 861 4,21 3,72 3,33 4,00 3,78 3,69 3,13 3,22C 24:1n9 1,23
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V 507
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Fatty Acid 20.01.05 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8STAR 117 119 120 121 122 123 124 125 117 119 120 121 122 123 124 125C 12:0 0,59C 13:0 0,65C 14:0 0,71 125 164 103 117 134 126 0,37 0,50 0,30 0,31 0,36 0,40C 14:1n5 0,69C 15:0 0,75 91 0,28C 15:1n5 0,78 26 0,08C 16:0 0,82 13024 14593 14198 14829 14795 14499 14715 11828 44,31 51,24 48,68 52,21 45,86 45,64 53,82 45,27C 16:1n9cC 16:1n7tC 16:1n7c 0,77 1503 1505 1392 1347 1222 1537 1259 1265 4,76 4,92 4,45 4,42 3,53 4,51 4,29 4,51C 17:0 0,76 216 187 173 106 233 220 206 187 0,68 0,61 0,55 0,35 0,67 0,64 0,70 0,66C 17:1n7 0,86 134 51 34 26 69 40 0,48 0,18 0,13 0,09 0,26 0,16C 18:0 0,92 6079 6603 6341 6039 6863 6439 6435 5505 23,09 25,89 24,27 23,74 23,75 22,63 26,28 23,52C 18:1n9t 0,91C 18:1n9c 0,94 24071 26567 23867 24827 24682 25638 22901 19739 93,39 106,38 93,31 99,69 87,24 92,03 95,52 86,16C 18:1n7C 18:2n6t 0,93 31 0,12C 18:2n6c 0,88 16155 17124 13759 15701 19333 18743 18427 14609 58,83 64,36 50,49 59,17 64,14 63,15 72,14 59,85C 18:3n6 0,81 118 87 74 81 99 94 41 0,39 0,30 0,25 0,25 0,31 0,34 0,15C 18:3n3 0,87 1169 1234 918 987 1365 1304 1362 1009 4,22 4,60 3,34 3,69 4,49 4,35 5,28 4,10C 18:4n3C 20:0 1,00 6048 5860 6002 5844 6639 6537 5626 5376 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00C 20:1n9 1,01 139 103 86 97 123 102 83 0,58 0,44 0,36 0,42 0,47 0,39 0,37C 20:2n6 1,01 177 135 129 137 207 137 149 95 0,74 0,58 0,54 0,59 0,79 0,53 0,67 0,45C 20:3n6 1,16 30 103 72 99 124 84 88 65 0,14 0,51 0,35 0,49 0,54 0,37 0,45 0,35C 21:0 0,88 102 0,37C 20:4n6 0,82 1236 1459 1049 1137 1344 1236 1137 1125 4,21 5,13 3,60 4,01 4,17 3,89 4,16 4,31C 20:3n3 0,99 49 0,20C 20:5n3 0,87 23 0,08C 22:0 1,15C 22:1n9 1,11C 22:2n6 1,12C 23:0 1,20C 24:0 1,27 100 33 64 53 0,00 0,54 0,17 0,31 0,31C 22:5n3 152 128 86 196 79 63C 22:6n3 0,89 1010 1028 810 843 958 1077 955 900 3,73 3,92 3,02 3,23 3,23 3,68 3,80 3,74C 24:1n9 1,23
RE - RE -
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Fatty Acid 20.01.05 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8STAR 143 145 146 147 148 149 150 151 143 145 146 147 148 149 150 151C 12:0 0,59C 13:0 0,65C 14:0 0,71 157 127 110 144 117 159 142 138 0,38 0,38 0,37 0,49 0,45 0,50 0,49 0,45C 14:1n5 0,69C 15:0 0,75 41 0,15C 15:1n5 0,78C 16:0 0,82 16654 14977 13317 14142 11825 14822 13279 14350 46,79 52,15 52,43 56,33 52,74 53,91 52,85 53,83C 16:1n9cC 16:1n7tC 16:1n7c 0,77 1787 1281 1367 1488 1226 1533 1404 1295 4,68 4,16 5,02 5,52 5,09 5,20 5,21 4,53C 17:0 0,76 205 159 146 147 102 166 93 136 0,53 0,51 0,53 0,54 0,42 0,56 0,34 0,47C 17:1n7 0,86 66 59 66 0,27 0,25 0,26C 18:0 0,92 7842 5820 5837 5753 4737 5875 4921 5585 24,60 22,63 25,66 25,58 23,58 23,86 21,87 23,39C 18:1n9t 0,91C 18:1n9c 0,94 31616 24314 22348 23546 19758 24378 22436 23785 101,29 96,55 100,34 106,95 100,48 101,12 101,83 101,75C 18:1n7 21C 18:2n6t 0,93C 18:2n6c 0,88 19485 18234 16383 15849 14967 16190 13785 16581 58,59 67,96 69,04 67,57 71,44 63,03 58,73 66,58C 18:3n6 0,81 73 113 73 73 41 0,20 0,39 0,28 0,26 0,16C 18:3n3 0,87 1964 1165 1150 1026 1076 1058 906 1177 5,85 4,30 4,80 4,33 5,09 4,08 3,82 4,68C 18:4n3C 20:0 1,00 7324 5909 5226 5166 4614 5657 5170 5485 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00 25,00C 20:1n9 1,01 122 129 97 102 88 104 95 97 0,42 0,55 0,47 0,50 0,48 0,46 0,46 0,45C 20:2n6 1,01 175 166 131 120 115 146 114 140 0,60 0,71 0,63 0,59 0,63 0,65 0,56 0,65C 20:3n6 1,16 137 82 98 82 54 0,67 0,46 0,50 0,46 0,28C 21:0 0,88C 20:4n6 0,82 1520 1305 1068 1199 965 1312 992 1178 4,27 4,55 4,21 4,78 4,31 4,78 3,95 4,42C 20:3n3 0,99C 20:5n3 0,87C 22:0 1,15C 22:1n9 1,11C 22:2n6 1,12C 23:0 1,20C 24:0 1,27 68 43 67 44 47 76 0,36 0,26 0,41 0,25 0,29 0,44C 22:5n3 89 96 112 70 100 112 55C 22:6n3 0,89 990 932 797 877 665 922 776 771 3,02 3,53 3,41 3,80 3,22 3,64 3,36 3,14C 24:1n9 1,23
SN + SN +
A R E A mg / g DotterII:
Am
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