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El sistema de expresión Baculovirus-células de insecto
Oscar Taboga
Instituto de Biotecnología
INTA
Baculovirus como sistema de expresión
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Parte 1 – Introducción a los baculovirus
Parte 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas
Parte 3 – Puesta en práctica
Preguntas y discusión
Baculovirus como sistema de expresión
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Parte 1 – Introducción a los baculovirus
¿Qué son los baculovirus?
• Su ciclo de vida y cómo podemos hacer uso de él
Baculovirus como sistema de expresión
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Baculovirus como sistema de expresión
Los baculovirus son un grupo de virus encontrados mayormente en insectos (Baculoviridae).
Tienen una estructura de varilla (baculum=bastón), un diámetro de entre 40-50 nm y una longitud de entre 200-400 nm.
Su información genética está almacenada en una molécula de ADN doble cadena, circular, de aproximadamente 80-200 Kpb.
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Spodoptera
frugiperda
Baculovirus como sistema de expresión
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Baculovirus como sistema de expresión
Trichoplusia ni
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En cultivos celulares o cuando se multiplican dentro de un insecto permisivo, los baculovirus forman dos tipos de viriones: virus ocluidos y virus brotados.
peplómeros
envoltura
nucleocápside
Baculovirus como sistema de expresión
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Para una sobrevida a largo plazo se forman los cuerpos de oclusión o poliedros que ocluyen los virus ocluidos.
cálix
nucleocápsides
matriz
envoltura
Baculovirus como sistema de expresión
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Infección primaria
Fusión
Virus derivados de cuerpos de oclusión
Liberación de virionespor lisis celular
Poliedros
Solubilizaciónen el intestino de la larva
Virus brotados
Brotación
Liberación del
genoma
Endocitosis
Infección secundaria
Ciclo de replicación
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¡Película!
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Baculovirus como sistema de expresión
Su ciclo de multiplicaciónLa proteína poliedrina se acumula hasta alcanzar el 50% del total de proteínas celulares, pero el virus puede multiplicarese en cultivos celulares sin formar cuerpos de oclusión (virus pol -).
¿Qué significa en términos de expresión de proteínas?=>Pueden expresarse genes heterólogos bajo el control del promotor de poliedrina
=> La expresión ocurre en un estadío muy tardío de la infección
=> Los niveles de expresión serán probablemente muy altos
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Parte 1 – Introducción a los baculovirus
Parte 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas
Seguridad
Características generales del BVES
Alternativas
Modificaciones postraduccionales
Parte 3 – Puesta en práctica
Baculovirus como sistema de expresión
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Seguridad
Riesgo personal o de contaminación de células de mamífero.Estudios mostraron que pueden entrar en células de mamífero, pero no alcanzan el núcleo ni transcriben genes
Pueden considerarse entonces que no poseen riesgo de seguridad adicionaly son clasificados como Clase I
Contaminación de otras células de insectoAunque su rango de hospedador es bastante limitado, pueden penetrar otras células de insecto pero no replican ni entran en estadíos tardíos
De todas maneras, cuidado de no contaminar otros trabajos y como todo organismo recombinante, debe ser considerado potencialmente peligroso
Baculovirus como sistema de expresión
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Características generales del BVES
Producción de proteínas en un hospedador eucariota
Siendo un sistema eucariota el BVES es capaz de:
•Plegamiento apropiado
•Modificaciones postraduccionales
Estos requisitos son cruciales para proteínas con actividad biológica
Baculovirus como sistema de expresión
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Características generales del BVES
Altos niveles de expresión
El BVES tiene el potencial de una muy fuerte expresión de genes heterólogos: se han alcanzado niveles de hasta 25-50%de las proteínas totales (1g/l).
Sin embargo, usualmente los niveles de expresión están en orden de:
•1- 3 mg /l (proteínas intracelulares)
•3-15 mg /l (proteínas secretadas)
•Tan poco como 0.1 mg /l (algunas integrinas)
•Hasta 50 mg /l (algunas kinasas)
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Características generales del BVES
Expresión de proteínas tóxicas o termosensibles
La mayor fase de producción de proteínas ocurre tardíamente en la infección. Esto significa que:
•Pueden expresarse proteínas heterólogas tóxicas a pesar de posibles efectos sobre funciones celulares esenciales
•Hay poca presión de selección contra el gen tóxico ya que este no interfiere con la producción de virus brotado
La expresión ocurre a 27°C, lo que puede ser permisivo para proteínas termosensibles
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Características generales del BVES
• Construcciones largas o múltiples
Debido a que el genoma de los baculovirus puede acomodar grandes porciones de ADN, el sistema permite la expresión de largas construcciones o multiples genes simultáneos
• Simplicidad de la tecnología
Los vectores son accesibles para el clonado directo
La construcción de un baculovirus recombinante es considerablemente más rápida que la de una línea celular eucariota (CHO, por ejemplo)
Hay un rango muy amplio de vectores comerciales disponibles y kits para la construcción de virus recombinantes.
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Costos
Los costos son significativamente más altos que los sistemas de expresión bacterianos y de levaduras, tanto en materiales como en equipamiento.
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Modificaciones postraduccionales
Las células de insecto son capaces de lidiar con modificaciones postraduccionales como
•Clivaje de péptido señal (incluidos los de mamífero•Fosforilación•N y O glicosilaciones•Miristilación•Plegamiento, formación de puentes S-S, oligomerización•Modificaciones lipídicas
Baculovirus como sistema de expresión
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Modificaciones postraduccionales
Limitaciones:
•Clase y grado de modificación puede no ser idéntico al encontrado en la especie o tejido original
•El muy alto nivel de expresión puede disminuir la capacidad de la célula de modificar correctamente el producto
•Secreción, fosforilación y glicosilación pueden verse particularmente afectadas
•Algunos de estos inconvenientes pueden resolverse usando promotores más tempranos
Baculovirus como sistema de expresión
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Parte 1 – Introducción a los baculovirus
Parte 2 – Baculovirus para la expresión de proteínas
Parte 3 – Puesta en práctica
Preguntas y discusión
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Sistemas de expresiSistemas de expresióónn
• Vector
• Hospedador
• Metodología
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Baculovirus como sistema de expresión
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Baculovirus como sistema de expresión
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CaracterCaracteríísticassticas
• Ambiente eucariota para la producción de proteínas
• Expresión excepcionalmente alta• Expresión durante la fase de oclusión• Expresión a 27ºC• Capacidad de grandes inserciones• Expresión eficiente de genes no “spliceados”(cDNAs)
• Simplicidad de la tecnología
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Crecer virus parental
Preparar ADN viral
Clonar gen en vector de transferencia
Preparar ADN plasmídico
Cotransfectar
Screening de recombinantes
Purificar recombinantes
Amplificar recombinantes
Confirmar identidad
Caracterizar expresión génica
Scaling-up
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HistoriaHistoria
• Placas de lisis occ+ vspacas occ- (1:1000)
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• Gen reportero (igual frecuencia)
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• Linealización del genoma (eficiencia 30%)
Bsu361
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• Deleción en orf letal y linealización(eficiencia 100%)
Bsu361Bsu361
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VariacionesVariaciones
• Bácmidos como fuente de ADN viral
• Generación de recombinantes por transposición
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• Bácmido bAcGOZA
poliedrinaPp10
marker orf1629
Mini F
Baculovirus como sistema de expresión
Ppol
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Generación de baculovirus recombinantes por el sistema Bac to Bac
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ElecciEleccióón del virus y especie n del virus y especie hospedadorahospedadora
• 500 especies• AcNPV y BmNPV• 90% identidad• rango de hospedador y líneas susceptibles muy diferentes y con distintas propiedades
Baculovirus como sistema de expresión
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AcNPVAcNPV vsvs BmNPVBmNPV
• Crecimiento y niveles de expresión de las líneas
• Rango de plásmidos de transferencia
• Expresión en larvas de insecto (tamaño, voumen de hemolinfa, canibalismo, bioseguridad, métodos de infección
Baculovirus como sistema de expresión
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Cultivo de cCultivo de céélulas lulas vsvs larvaslarvas
CCéélulaslulas:
• Igual sistema al usado en la caracterización inicial
• Más “limpio” (medio libre de suero)
• Más homogéneas purificaciónespostraduccionales
• Caro
• Equipamiento
Baculovirus como sistema de expresión
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Cultivo de cCultivo de céélulas lulas vsvs larvaslarvas
LarvasLarvas:
• Más alta eficiencia de modificaciones postraduccionales
• Bajo costo
• Se necesita mantener insectos
• Más difícil purificación
Baculovirus como sistema de expresión
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ElecciEleccióón de cn de céélulaslulasPropiedadesPropiedades
• Tiempo de duplicación
• Capacidad de crecimiento en monocapa o suspensión
• Tamaño
• Susceptibilidad
• Modificaciones postraduccionales
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ElecciEleccióón del pln del pláásmido de smido de transferenciatransferencia
• Método de producción (transposición vs. recombinación)
• Proteína auténtica vs. fusión• Secretada vs citoplasmática• Complementación de la deleción letal en orf1629
• Bajo la regulación de qué promotor• Una o más proteínas• Fenotipo occ + vs occ-
Baculovirus como sistema de expresión
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ProteProteíína autna autéénticantica
• Acortar región 5’ no traducida entre promotor y ATG (hasta 100 pb)
• Evaluar secuencias que rodean ATG
• Consenso: A YAUGAUG Y
Baculovirus como sistema de expresión
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TAAG
consenso
100 pb
UAAATG
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ProteProteíínas secretadasnas secretadas
• Señales propias
• Señales probadas (gp64, melitina, etc)
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PromotoresPromotores
• Immediate early no usados
• Early poco usados
• Late durante y luego de S! de ADN, 39K, proteína básica
• Very late P10, Pol
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MMáás de un gen s de un gen simultaneamentesimultaneamente
• Heterodímeros
• Necesidad de coexpresión de enzima modificante tejido o célula-específica
• 1 p10 + 1 pol en locus poliedrina
• 2 p10 + 1 pol en locus poliedrina
• 1 p10 + 1 pol en locus p10
Baculovirus como sistema de expresión
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Fenotipo del virusFenotipo del virus
• Mantener una copia de poliedrina bajo su promotor o el de p10
Baculovirus como sistema de expresión
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Conclusiones bConclusiones báásicassicas
• Usar genes sin intrones• Remover sec. heterólogas en región 5’ no codificante
• Buen contexto para el codón ATG (A a -3)• No son necesarias secuencias para poliA• Secuencias TAAG o CTTA dentro de la secuencia del gen de interés pueden ser perjudiciales
• El uso de codones parece tener poca influencia• Emplear secuencias de secreción comprobadas
Baculovirus como sistema de expresión
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Baculovirus vs. otros sistemas de expresión de proteínas eucariotas
RapidezPlantas Baculovirus Levaduras BacteriasTrangénicos Células de
mamiferos
BacteriasGlicosidación
LevadurasPlantas
BaculovirusTrangénicos Células de
mamiferos
PlantasTrangénicos
BaculovirusBacterias Levaduras
Plegamiento Células de mamiferos
Bajo CostoTrangénicos Levaduras BacteriasCélulas de mamiferos
PlantasBaculovirus
Baculovirus como sistema de expresión
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Baculovirus como sistema de expresión
Baculovirus
recombinantes
Sistemas de expresión
Display en cápside o superficie
Gene delivery
Control biológico de plagas
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Expresión de proteínas a partir de células infectadascon el baculovirus Ac3AB1pol+:
clon 1 clon2 AcNPV MPM
47,5 Kda
32,5 kDa
25 kDa
Tinción con azul de Coomassie
poliedrina
3AB1
3AB1
clon 1 clon 2 AcNPV MPM
47,5 Kda
32,5 kDa
25 kDa
Western blot
SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGOS PARA PROTEÍNAS
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Reconocimiento de la proteína no estructural 3AB1 por sueros de
animales infectados con VFA
Sueros negativos VFA Sueros positivos
Sueros
vacunadosSueros bovinos negativos VFA
Sueros bovinos infectados VFA
Sueros bovinos vacunados contra VFA
A C O
Western blot de extractos
de células infectadas
SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGOS PARA PROTEÍNAS
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SISTEMAS DE EXPRESIÓN HETERÓLOGOS PARA PROTEÍNAS
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Producción de VLPs en larvas de Rachiplusia ni
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Display en superficie (GP64)
• Exposición en sup. de gp64-gD
• Inducción de Ac seroneutralizantes
• Competencia por el receptor celular:
plegamiento similar a la proteína nativa
Display de la glicoproteína gD de BHV-1 en la
superficie de baculovirusAcSup-gD
Microscopía electrónica
y marcación (específica
para gD) con oro
-X
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Display en cápside (VP39)
Display de OVA
en cápside
vp39vp39-X
Se agrega una copia extra de
vp39 fusionada a la secuencia
del antígeno X.
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Gene delivery (pCMV)
BHK (uv) A11 moi180