Wintersemester 2008/2009
Vorlesung zum Mastermodul
Bakterien-Pflanze Interaktionen
Frederik Börnke – Lehrstuhl für Biochemie, AG Molekulare Netzwerke
Email: [email protected]
Bakterielle Typ-III Effektorproteine
Wege der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen
Kompatibel Inkompatibel
Virulentes Pathogen
Suszeptibler Wirt
Krankheit
Avirulentes Pathogen
Resistenter Wirt
Resistenz
(nicht-Wirt oder
rassenspezifisch)
flg22
MAPKKK
MAPKK
MAPK
ER
Nucleus
FLS2
PR
PAMP – vermittelte Immunität (PTI)
modified after Speth, E.B. et al., Current Opinion in Plant Biology, 10, 2007, 580-586
Secretory pathway
PR-proteins
Zellwandverstärkung
PAMP – vermittelte Immunität (PTI)
•!PTI umfasst d ie Gesamthei t der durch PAMPs ausgelösten
Abwehrreaktionen.
•!PAMPs stimulieren eine sehr schnelle aber nur vorübergehende
Abwehrantwort, die sich auf verschiedenen Ebenen abspielt, z.B. präinvasiv
(schließen der Stomata) und post-invasiv (Oxidative-Burst H2O2; Sekretion
antimikrobieller Proteine, Zellwandverstärkung durch Kallose Einlagerung)
•!PTI ist Teil der Nicht-Wirts-Resistenz und reicht in den meisten Fällen aus
potentielle Pathogene abzuwehren. Sie geht i.d.R. nicht einher mit der
Entwicklung von makroskopisch sichtbaren Symptomen
flg22
MAPKKK
MAPKK
MAPK
ER
Nucleus
FLS2
Secretory pathway
PR
PR-proteins
TTSS
Bakterielle Effektorproteine supprimieren die Abwehr der Pflanzenzelle
modified after Speth, E.B. et al., Current Opinion in Plant Biology, 10, 2007, 580-586
Die Injektion von Effektorproteinen in die Wirtszelle
erfolgt über ein Typ-III Sekretionsystem (T3SS)
•! S e k r e t i o n s a p p a r a t , d e r Effek torpro te ine d i rek t in d ie Wirtszelle injiziert
•! Kommt in einer Vielzahl gram-negativer pathogener Bakterien vor
•!Komponenten in Phytopathogenen von sog. hrp-Genen (hypersensitive response and pathogenicity) codiert
•!Aus ca. 20 Proteinen aufgebaut, neun Komponenten des T3SS sind sehr stark konserviert zwischen den Organismen
•!Evolutionär wahrscheinlich aus den Flagellen hervorgegangen
•!Die translozierten Effektoren besitzen eine Vielzahl von z.T. unbekannten aber auch überlappenden Funktion in der Virulenz (Virulenzfaktoren)
Identifizierung von Typ III Effektoren pflanzlicher
Pathogene war sehr schwierig
Ursachen:
•! Expression des T3SS erfolgt erst nach Kontakt mit der Wirtspflanze
•! Effektoren werden nicht ins Medium abgegeben
•! kein einheitliches Sekretionssignal bekannt
•! viele Effektoren haben redundante Funktionen und tragen daher
einzeln nur wenig zur Virulenz bei
•! haben keine oder geringe Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen
Unterdrückung der Abwehrreaktionen Nutzung von Nährstoffen Bakterielles Wachstum Ausprägung der Krankheit
HR and Abwehr Kein bakterielles Wachstum
Bacterium
hrp F
Plant cell
Hrp genes
R
Type III secretion system
avr
Effector proteins
Kompatibilität Inkompatibilität
Typ III Effektoren können verschiedenen zelluläre
Antworten hervorrufen
Erste Ansätze zur Identifizierung von Typ III Effektoren
beruhten auf ihrer Avirulenz-Funktion
Gen- für - Gen
Hypothese
“Effector-triggered Immunity” ETI
•!ETI wird nach der Ekennung von
Elicitioren (Avirulenzfaktoren) durch
R-Proteine ausgelöst
•!Dabei wird zum einen die PTI
extrem verstärkt und verlängert und
zusätzlich eine hypersensitive
Reaktion (HR; Zelltod) ausgelöst
(makroskopisch sichtbar)
•!ETI führt zu einer inkompatiblen
Interaktion und wird auch als
rassen-spezi f ische Resis tenz
bezeichnet.
Erste Ansätze zur Identifizierung von Typ III Effektoren
Collmer et al. (2002), Trends Microbiol. (10)
Erster Typ III Effektor war ein Avr-Gen
Staskawicz et al. (1984), PNAS (81)
Erster Typ III Effektor war ein Avr-Gen
Staskawicz et al. (1984), PNAS (81)
•! Identifizierung eines Klons (pPg6L3), der Inkompatibilität von Psg5 in cv. Harosoy und Peking verursacht •! Restriktionskartierung von pPg6L3 •!Tn5-Mutagenese und anschließender RE-Verdau führte zur Identifizierung des verantwortlichen Locus •! 1.4 kb Fragment kodiert für ein Avr-Gen
Buell et al. 2003, PNAS 100 (18)
Entschlüsselung des Genome von
Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000
•! Pathogen von A. thaliana
•! Modellsystem zum Studium der Pflanze-Bakterium-Interaktion
•! vollständige genomische Sequenz
•! 6.5 MBP: zirkuläres Chromosome
+ 2 Plasmide
•! kodieren für 5763 ORFs
•! 3520 (61%) mit Funktionszuweisung
•! ca. 300 involviert in Virulenz
Gleiche Regulation
-! Expression in planta
-! Zugehörigkeit zum Hrp-Regulon
Sekretion/
Translokationsfähigkeit
-! gleiche Sequenzmerkmale
Weitere Ansätze basierten auf einer Kombination von bioinformatischer Analyse
und experimentellen Daten
Verfügbarkeit von Sequenzinformationen hat die
Identifizierung von Typ III Effektoren sehr erleichtert
Identifizierung von 13 Typ III Effektoren über die HR-
auslösende Interaktion von avrRpt2 und RPS2
Guttman and Vinatzer et al. (2002), Science (295)
•! Interaktion zwischen P. syringae AvrRpt2 und
A. thaliana RPS2 (R-Protein) induziert HR
•! AvrRpt2- C-Terminus ist für Auslösung der HR
verantwortlich
•! N-Terminus kann durch den anderer Effektoren
ersetzt werden (z.B. avrRpm1)
•! Eigenschaft wurde ausgenutzt und ein N-
terminal verkürztes AvrRpt2 (81-255) als Reporter
benutzt um Typ III sekretierte Proteine zu finden
Identifizierung von 13 Typ III Effektoren über die HR-
auslösende Interaktion von avrRpt2 und RPS2
Guttman and Vinatzer et al. (2002), Science (295)
•! Konstruktion eines Transposons, enthält verkürztes AvrRpt2 und Km-Resistenzgen •! Insertion des Transposons in P. syringae
•! translationale Fusion mit hop Genen (unbekannte Effektoren) löst HR nach
Infektion in A. thaliana aus •! ca. 10.000 Pflanzen mit Pools von 8 Km-resistenten Isolaten infiziert
•! 25 Pflanzen zeigten HR •! Isolation einzelner HR-induzierender Stämme •! Identifizierung von 13 Effektoren •! Überprüfung: Auslösen der HR ist RPS- und T3SS - abhängig
Vergleichende Sequenzanalyse führte zur Identifizierung
neuer Typ III sekretierter Proteine
Guttman and Vinatzer et al. (2002), Science (295)
•! Analyse der identifizierten hop‘s und bekannter Typ III sekretierter Proteine
offenbarte einen hohen Ser-Gehalt innerhalb der ersten 50 AA (N-terminal),
sowie einen niedrigen Gehalt von Asp, Leu, Lys
•! Durchmustern des P.s. Genoms nach diesem Merkmal und dem
konservierten hrp-Box Motiv
38 sekretierte Proteine (15 unbekannte)
Erste Ansätze zur Identifizierung von Typ III Effektoren
beruhten auf ihrer Avirulenz-Funktion
Gen- für - Gen
Hypothese
R- Proteine können in 2 Klassen eingeteilt werden
Chisholm et al (2006), Cell 124
Einteilung basiert auf Organisation verschiedener Domänen
NB-LRR (nucleotide binding and Leucin rich repeats), größte Gruppe - CC (coiled-coil) - TIR (Toll interleukin receptor) - RRS1-R (novel class)
eLRR (extracellular LRR) - RLP (receptor-like) - RLK (receptor like kinase) - PGIP (Polygalacturonase inhibiting
protein)
AvrPto und AvrPtoB
interagieren in Tomate mit
dem Pto Resistenzgen
Jones & Dangl (2006), Nature 44 (16)
Es gibt nur wenige Beispiele für eine direkte Interaktion
zwischen Avr- und R-Proteinen
„Guard Hypothesis“
1- Effector is recognized by receptor protein leading to defence 2 - Modified target is recognized by receptor protein leading to defence
McDowell & Woffenden (2003) TRENDS in Biotechnol. 21, 178.
1
2
Chisholm et al (2006), Cell 124
Effektor-vermittelte Modifikationen von RIN 4 werden von 2 verschiedenen R-Proteinen erkannt
-RPM1 (NB-LRR) erkennt hyper- phopshoryliertes RIN4 - Mechanismus wird durch AvrRpm1 und AvrB ausgelöst
- RPS2 (NB-LRR) erkennt gespaltenes RIN4
- Proteolytische Spaltung von RIN4 wird durch AvrRpt2 vermittelt
Wenn Effektoren Avirulenzfunktion haben, warum gibt es sie dann?
Sie müssen dem Bakterium einen Selektionsvorteil
vermitteln um evolutionär stabil zu sein. Besitzen sie
also im Normalfall Virulenzfunktion?
AvrRpm1 und AvrRpt2 unterdrücken die basale Abwehr
Kim et al. 2005, Cell 121(3)
•! Infektion von Wildtyp-Pflanzen und transgenen Pflanzen die entweder AvrRpt2 oder AvrRpm1 induzierbar exprimieren mit Pst DC 3000 TTSS- Mutante
AvrRpt2 und AvrRpm1 verbessern das
bakterielle Wachstum einer TTSS-defizienten Pst DC3000 Mutante
AvrRpm1 und AvrRpt2 unterdrücken die basale Abwehr
Kim et al. 2005, Cell 121(3)
AvrRpt2 und AvrRpm1 inhibieren Callose-Ablagerungen
AvrPto interagiert in Tomate
mit dem Pto Resistenzgen
Jones & Dangl (2006), Nature 44 (16)
Es gibt nur wenige Beispiele für eine direkte Interaktion
zwischen Avr- und R-Proteinen
Ko-Kristallisation von AvrPto und Pto deutet darauf hin, dass AvrPto ein Kinaseinhibitor ist. (Xing et al., (2007) Nature 449: 243)
Die Bindungsstelle von AvrPto an Pto ist in anderen Kinasen konserviert
•!FLS2 und EFR sind „pattern-recognition“ Rezeptoren,
die für die Wahrnehmung von PAMPs verantwortlich
sind (Flagellin bzw. EfTu)
•!Biochemische Experimente konnten eine Interaktion
von AvrPto mit FLS2 bzw. EFR in vitro und in vivo
zeigen
flg22
MAPKKK
MAPKK
MAPK
ER
Nucleus
FLS2
PR
AvrPto inhibiert die Signalweiterleitung von PRRs
und verhindert damit basale Abwehr
modified after Speth, E.B. et al., Current Opinion in Plant Biology, 10, 2007, 580-586
Secretory pathway
PR-proteins
Zellwandverstärkung
AvrPto
Der Pst DC3000 Effektor HopAI-1 inhibiert MAPK Signaltransduktion
-!MPK3 und MPK6 werden zur
Signalweiterleitung an
spezifischen Threonin-Resten
phosphoryliert
-!HopAI-1 besitzt
Phosphothreonin-Lyase Aktivität
-!HopAI-1 interagiert spezifisch
mit MPK3 und MPK6
-!HopAI-1 vermittelte
dephosphorylierung verhindert
die Signalweiterleitung von MPK3
und MPK6
Der Pst DC3000 Effektor HopU1 destabilisiert mRNAs
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MAPKKK
MAPKK
MAPK
Nucleus
FLS2
PR
TTSS
modified after Speth, E.B. et al., Current Opinion in Plant Biology, 10, 2007, 580-586
AAAAAAA
Induktion von Abwehrgenen
RBP
Kallose, HR, etc.
RBP = RNA-binde Protein
Der Pst DC3000 Effektor HopU1 destabilisiert mRNAs durch
Ribosylierung von RNA-binde Proteinen
flg22
MAPKKK
MAPKK
MAPK
Nucleus
FLS2
PR
TTSS
modified after Speth, E.B. et al., Current Opinion in Plant Biology, 10, 2007, 580-586
AAAAAAA
RBP
RBP = RNA-binde Protein
RBP HopU1
ADP-
mRNA Abbau
Der Xcv Effektor AvrBs3 wird in den pflanzlichen Zellkern transportiert
Der Xcv Effektor AvrBs3 fungiert als Transkriptionsfaktor und induziert
einen „Cell-Size“ Regulator
+ AvrBs3 + AvrBs3 - AvrBs3
upa20
AvrBs3
upa 20 promotor
•!AvrBs3 induziert die Expression des Transkriptionsfaktors upa20 durch Bindung an dessen Promotor
•!Upa20 aktiviert Gene die zur Hypertrophie führen, die vergrößerte Zelloberfläche ist offensichtlich von Vorteil für das Bakterium
Der Pst DC3000 Effektor HopM1 inhibiert die Proteinsekretion
TGN
PM
HopM1 Zytosol
Apoplast
PR-Proteine
•!HopM1 interagiert mit dem ARF-GEF Protein AtMIN7 und vermittelt dessen Abbau über das Proteasom
•!AtMIN7 ist notwendig für die Abschnürung sekretorischer Vesikel vom Golgi-Apparat
•!HopM1 verhindert die Sekretion von Abwehrmolekülen
Jones & Dangl (2006) Nature 444; Chisholm et al (2006), Cell 124
Time
Evolutionäres „Wettrüsten“ zwischen Pathogen und Wirt