QUÍMICA FISIOLÓGICA Y PATOLOGÍA INTEGRADA I
BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR DEL CÁNCER
METÁSTASIS
2015
Vicente A. Torres, PhDLaboratorio de Biología Celular y Molecular
Instituto de Investigación en Ciencias OdontológicasFacultad de Odontología – Universidad de Chile
Centro FONDAP-ACCDIS
PRIMERA PARTE – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR DEL CÁNCER
Generalidades y Conceptos
Características del Cáncer (“hallmarks”)Proliferación, Diferenciación y Muerte CelularAngiogénesis
Invasión de Tejidos y MetástasisMarcadores Emergentes
Oncogenes y Supresores de Tumores
Aproximaciones Experimentales para Estudiar el Cáncer
La Cascada de MetástasisSEGUNDA PARTE
Muertes en Chile: años 1970, 1990, 2004
órgano/tejido vs rankingmujeres hombres
1o
3o
2o
6º
10º
7º
11º
Prevalencia de Distintos Tipos de Cáncer en Chile
biliar
El Cáncer de Colon como Modelo de Estudio
pólipos y adenomas adenocarcinomatejido normal
PÉRDIDA DE LA HOMEOSTASIS CELULAR TUMORIGÉNESIS
¿Qué sucede a nivel celular y molecular durante el cáncer?
HOMEOSTASIS CELULAREn un determinado tejido, las células deben co-existir de maneraorganizada e interdependiente. En relación a ésto, se destacan una seriede características que deben ser finamente reguladas:
⇒PROLIFERACIÓN Y VIABILIDAD CELULAR
⇒INTERACCIONES DE LA CÉLULA CON SU ENTORNO
⇒RESPUESTA A SEÑALES EXTRACELULARES(MITÓGENOS Y FACTORES INHIBITORIAS DEL CRECIMIENTO)⇒
“TRANSFORMACIÓN CELULAR”
Proliferación
muerte celular
Proliferación sostenidaEvasión de la muerte celular
Ejemplo en el cáncer de colon tejido normal
cáncer colorectal
Normal
muerte
celular
Proliferación
cáncer
muerte celular
Proliferación
normal
Se han definido una serie de eventos característicos o marcadores (hallmarks) asociados al cáncer
Douglas Hanahan & Robert WeinbergCell 2000: 100: 57-70
Douglas Hanahan & Robert WeinbergCell 2011: 144: 646-674
INMORTALIDAD REPLICATIVA
PÉRDIDA DE LA RESPUESTA A SEÑALES DE DIFERENCIACIÓN E INHIBIDORAS DEL CRECIMIENTO
RESISTENCIA A LA MUERTE CELULAR
INDUCCIÓN DE LA ANGIOGÉNESIS
INVASIÓN DE TEJIDOS Y METÁSTASIS
Hallmarks del Cáncer
El orden y la temporalidad de cada uno de estos
marcadores es propio de cada neoplasia en particular
SEÑALIZACIÓN PROLIFERATIVA SOSTENIDA
La capacidad de proliferación en una célula somática es limitada. Estaproliferación ocurre hasta alcanzar el “Límite de Hayflick” (Exp Cell Res1965; 37: 614). Este límite restringe hasta 40-50 divisiones, luego del cual se llega a un estado de “senescencia” y muerte celular
PROLIFERACIÓN Y VIABILIDAD CELULAR
Inmortalización celular
Senescencia
Poblaciones clonales con crecimiento continuo
(alteraciones teloméricas y cromosomales, aneuploidía)
Dependencia de anclaje a sustrato: La proliferación celular está directamenteasociada a la interacción célula-matriz extracelular, mediada por integrinas
Inhibición por contacto: En cultivos celulares, el contacto entre células del “mismo tipo” inhibe su movimiento
INTERACCIONES DE LA CÉLULA CON SU ENTORNO
Pérdida de la “inhibición por contacto”:Las células pueden crecer por sobre la capacidad
permitida en una monocapa
Pérdida de la dependencia de anclaje a sustratoLas células pueden crecer en suspensión
Transformación Celular:Proliferación Celular
Viabilidad Celular
Interacción Célula-Célula
Respuesta a Señales Extracelulares
¿Cuál célula será más transformada?
1 2
ONCOGENES
1. Son genes cuya sobre-expresión o mutación con “ganacia de función”favorecen la tumorigénesis
2. Descubiertos a raíz de virus con acción transformante
PROTEÍNAS ONCOGENES
SUPRESORES DE TUMORES
SUPRESORES DE TUMORES
1. Son genes cuya “pérdida o disminución de su función” favorece la tumorigénesis
2. Inicialmente se describieron en el contexto de mutaciones, ya seande la línea germinal (hereditarias) o de origen somático. Ejemplos, pRb, p53, APC, BRCA1
ALTERACIONES EN LA
PROLIFERACIÓN Y CRECIMIENTO
CELULAR
Dependencia de factores de crecimiento: La proliferación depende de la disponibilidad de factores de crecimiento específicos para el tejido. En cultivos celulares, la privación de estos factores (por ejemplo, suerosuplementario) lleva a muerte celular. Otro factor importante es la producción autocrina de estos factores
Pérdida completa o parcial de la dependencia de factores de crecimiento
Factores de suplemento en cultivo (suero)Crecimiento a menor densidad inicial
In vitro
RESPUESTA A SEÑALES EXTRACELULARES(MITÓGENOS)
RECEPTORES DE TIPO TIROSINA KINASA
5. Catalizan la transfosforilación en residuos de tirosina (autofosforilación)
4. La unión de ligando lleva a la dimerización del receptor
1. Son proteínas integrales de membrana
2. Poseen actividad tirosina kinasaintrínseca
3. Sus ligandos son usualmente MITÓGENOS
EGF, PDGF, FGF, VEGF, insulina
SEÑALIZACIÓN POR FACTORES DE CRECIMIENTO RECEPTORES DE TIPO TIROSINA KINASA
SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR POR RECEPTORES DE TIROSINA KINASA
La cascada de proteínas MAP kinasa (MAPK, Proteína KinasaActivada por Mitógeno)
La cascada de señalización MAPK se inicia por Ras-GTP
Las MAPK son kinasas que fosforilan en residuos de Ser o Thr
Estas enzimas se activan en respuesta a estímulos extracelulares, como MITÓGENOS, shock térmico y citoquinas
Ras
MAPK
MAPKK
MAPKKK
Proliferación y Diferenciación Celular
Apoptosis
Expresión génicaMitosis
Mecanismos moleculares por los cuales las células
tumorales sobre-activan las vías de señalización de
mitógenos (RTKs)
1.Sobre-producción de ligando (mitógeno)
2.Mutaciones activadoras del receptor (RTK)
3. Mutaciones en la cascada río abajo: Ras
VIABILIDAD Y MUERTE CELULAR
Mecanismos de Control de la Viabilidad y Muerte Celular
MEMBRANA PLASMÁTICA
Señales de sobrevivencia
Receptor de factor de crecimiento
Receptor de la MEC (integrinas)
Receptor de muerte celular
Proliferación
muerte celular
MUERTE CELULAR PROGRAMADA
www.invesmed.com
Principal forma caracterizada: apoptosis
Otras formas: autofagia, necrosis programada
DESARROLLO Y PROCESOS FISIOLÓGICOS
En el modelo de adenocarcinoma de colon
APOPTOSIS: DOS VÍAS PRINCIPALES CON UN MISMO FIN
ANGIOGÉNESIS, INVASIÓN DE TEJIDOS
Y METÁSTASIS
ANGIOGÉNESIS
El ”sprouting” de vasos sanguíneos ocurre a razón de varios milímetros por día (dependiendo del estímulo)
“Crecimiento de nuevos vasos a partir de vasos sanguíneos pre-existentes”
Angiogénesis de “sprouting”(brotante)
Factores de regulación importantes:
Factores de crecimiento: FGF, VEGF, PDGF
Receptores: VEGFR
Receptores de adhesión célula-célula: VE-cadherina
Enzimas: eNOS, COX2
VEGFR (Tirosina kinasa receptora)
El receptor VEGF (VEGFR) es una proteína tirosina kinasa receptora, del tipoPDGFR
PRIMERA PARTE – BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR DEL CÁNCER
Generalidades y Conceptos
Características del Cáncer (“hallmarks”)Proliferación, Diferenciación y Muerte CelularAngiogénesis
Invasión de Tejidos y MetástasisMarcadores Emergentes
Aproximaciones Experimentales para Estudiar el Cáncer
Oncogenes y Supresores de Tumores
La Cascada de MetástasisSEGUNDA PARTE
La METÁSTASIS ocurre a través de una serie de pasos interrelacionados, en donde cada uno de ellospuede ser una etapa limitante
MIGRACIÓN CELULAR E INVASIVIDAD
INTRAVASACIÓN
TRANSPORTE
EXTRAVASACIÓN
CRECIMIENTO DE TUMOR 2RIO
Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816
Cada uno de estos procesos son muy ineficientes: < 0,1% células
diseminadas formarán mets
Composición del Tejido(ECM y células vecinas)
Receptores de Superficie
Señalización Intracelular
Remodelamiento de la ECM
MIGRACIÓN CELULAR E INVASIVIDAD
Composición del Tejido(ECM y células vecinas)
Receptores de Superficie
Señalización Intracelular
Remodelamiento de la ECM
MIGRACIÓN CELULAR E INVASIVIDAD
(Medición Experimental en Ensayo de Cierre de Herida)
Células de melanoma murino B16-F10
La migración celular esun proceso fundamental, tanto durante el desarrollo, como en el organismo adulto
MIGRACIÓN CELULAR
Durante la migración celular existen alteraciones en estas uniones
Mol Biol Cell 2010; 21: 369
MIGRACIÓN CELULAR: composición del microambiente
INTERACCIÓN CÉLULA – CÉLULA
INTERACCIÓN CÉLULA – ECM
Célula de cáncer de mama (MCF10A) sr.burnham.org
¿Qué Sucede con estas Interaccionesentre la Célula y su Entorno Durante el
Cáncer?
La célula sufre una serie de transformaciones, tantoa nivel morfológico, como bioquímico
Célula de cáncer de mama (MCF10A)
sr.burnham.org
E-cadherinaactinanúcleo
ALTERACIONES EN LA INTERACCIÓN CÉLULA-CÉLULA
Característicasde tipo epitelial
Característicasde tipo
mesenquimáticas
TRANSICIÓN EPITELIO-MESÉNQUIMA
(epithelial-mesenchymal transition, EMT)
“EMT”
BioEssays 2001; 23: 912
↓ Expresión de E-cadherina
↓ Expresión de componentesestructurales de Uniones Adherentes
Cancer Res 2006; 66 (17): 9
MORFOLOGÍA
CARACTERÍSTICAS FÍSICASUNIONES
INTERCELULARESMARCADORES MOLECULARES
ORGANIZACIÓN CITOESQUELETO
Polaridad Apical y Basolateral
Asimetría: extremolíder y posterior
Adhesión celular e inhibición por contacto
Movilidad celular e invasividad
AJ, TJ, GJ y desmosomas
Adhesiones focales / GJ transitorios
E-cadherina y citoqueratinas
N-cadherina, vimentina, metaloproteasas
Microtúbulos longitudinalesactina circunferencial
Microtúbulos astrales / Fibras de estrés
DIFERENCIAS PRINCIPALES
MECANISMOS DE DISMINUCIÓN EN LA EXPRESIÓN DE E-CADHERINA
Una célula de carcinoma pulmonar migrandosobre matriz extracelular de fibronectina
Adhesiones Focales(sitios de adhesión celular)
Citoesqueleto Celular
MIGRACIÓN CELULAR
Cancer Sci 2007; 98(10): 1512-1520
TRENDS Cell Biol 2004; 14(5)
Adhesión celular
Remodelamientodel citoesqueleto
Desensamble de adhesiones
¿Cuáles son los mecanismos moleculares implicados en la migración celular?
MIGRACIÓN CELULAR: MECANISMOS MOLECULARES
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA MIGRACIÓN CELULAR
ADHESIÓN CELULAR
CITOESQUELETO
FACTORES EXTRACELULARES (ECM, QUIMIOQUINAS, ETC)
PROTEÍNAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR
EXPRESIÓN GÉNICA
Modelo de estudio: migración celular sobre sustrato 2D
Según este modelo, la migración celular puede ser descrita como una serie sucesiva de etapas
EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”)
FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM
CONTRACCIÓN CELULAR
DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO
POLARIZACIÓN CELULAR
MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas
EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”)
FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM
CONTRACCIÓN CELULAR
DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO
MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas
POLARIZACIÓN CELULAR
Science 2003; 302: 5
MDA-MB-231golginúcleo
Polarización celular (Cdc42, Rac)
Contracción (Rho)
GTPasas de la Familia Rho
Cdc42
Rac
Rho
Polarización celular, filopodiosProtrusiones celulares, lamelipodios, polarización celularContracción celular, maduración de adhesiones focales, fibras de estrés
Dev Biol 2004: 265: 23
Tanto la regulación, como la actividad de estas GTPasas se ven alteradas en cáncer
EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”)
FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM
CONTRACCIÓN CELULAR
DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO
MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas
POLARIZACIÓN CELULAR
Importancia del citoesqueleto en la adhesión y migración celular
Célula expandiéndose sobre fibronectina. Tinción de actina con faloidina. J Cell Sci 2013; 126(17): 3835
15‛ 45‛ 60‛
Nature Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 2647
Podosomas
Invadopodios
Fibroblasto, microscopía electrónica de barrido
Molecular Biology of the Cell (Alberts, cap 16)
Queratocito, microscopía de luz
DINÁMICA DEL CITOESQUELETO Y LA MEMBRANA PLASMÁTICA
Lamelipodios y procesos de membrana
Mol Cancer Ther 2005; 4 (5): 772-778
FIBRAS DE ESTRÉS (fibras de tensión)
DINÁMICA DEL CITOESQUELETO Y LA MEMBRANA PLASMÁTICA
www.lifetechnologies.com
EXTENSIÓN O PROTRUSIÓN (“leading edge”)
FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM
CONTRACCIÓN CELULAR
DESENSAMBLE Y LIBERACIÓN DE LOS SITIOS
DE CONTACTO
MIGRACIÓN CELULAR: Secuencia de etapas repetitivas
POLARIZACIÓN CELULAR
Formación y desensamble de los sitios de contacto celulares
TRENDS Cell Biol 2004; 14(5)
Estos sitios de contacto se encuentran principalmente en la interfase célula-ECM
INTEGRINAS
FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM
2. Reclutamiento de proteínas adaptadoras
1. Unión ligando extracelular (ECM)/Activación
3. Anclaje del citoesqueleto (actina o filamentos intermedios)
4. Formación de complejos macromoleculares
FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM
Complejos Focales
Complejos Macromoleculares Formados por las Integrinas
CONTACTOS FOCALES
Sitio de Iniciación
ADHESIONES FOCALES
Madurez del complejo de adhesión
Filamentos de ActinaPaxilina
Adhesiones Focales
FORMACIÓN DE CONTACTOS CON LA ECM
CONTACTOS FOCALES
Sitio de Iniciación
ADHESIÓN FOCAL
Madurez del complejo de adhesión
CONTACTOS FOCALES
Sitio de Iniciación
ADHESIÓN FOCAL
?
DESENSAMBLE DE CONTACTOS CON LA ECM
MECANISMO POCO CLARO
Proteínas de señalización:Kinasa de Adhesión Focal (FAK), Pyk2, Src, MAPK
Proteasas: Calpaínas
Componentes de la endocitosis: Dynamin, AP-2, Clathrin, Rabs
Se ha postulado que el tráfico endosomal es esencial en el desensamble de los complejos de adhesión
Traffic 2009; 10: 811–818Traffic 2009; 10: 811–818
MARCACIÓN DE ADHESIONES Y CONTACTOS FOCALES(GFP-vinculina, transfección transitoria de células de cáncer de mama MDA-MB-231)
REMODELAMIENTO DE LA MATRIZ EXTRACELULAR
Nature Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 2647
REMODELAMIENTO DE LA MATRIZ EXTRACELULAR
1. Migración celular
2. Estructuras derivadas del citoesqueleto y la membrana
3. Proteasas de la matriz extracelular
MIGRACIÓN CELULAR E INVASIVIDAD
INTRAVASACIÓN
TRANSPORTE
EXTRAVASACIÓN
CRECIMIENTO DE TUMOR 2RIO
EVENTOS ASOCIADOS A LA METÁSTASIS
Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816 Mutation Research 2011; 1-12
VÍA LINFÁTICA
VÍA SANGUÍNEA
MIGRACIÓN CELULAR E INVASIVIDAD
INTRAVASACIÓN
TRANSPORTEEXTRAVASACIÓN
CRECIMIENTO DE TUMOR 2RIO
FEBS Journal 2011; 278: 16
VEGFR
VEGFR
VEGFR
Integrinas
Integrinas
MMPs
MMPs
S Inmune
CRECIMIENTO DE TUMOR SECUNDARIO
MICROMETÁSTASISMETÁSTASIS
CLÍNICAMENTE DETECTABLE
COLONIZACIÓN
Asentamiento reciente
En estado de “dormancia”
No detectable mediantetécnicas convencionales
Técnicas convencionales de detección macroscópicas
Características similaresal tumor primario
EL PROCESO DE COLONIZACIÓN INVOLUCRA DIVERSOS EVENTOS:Interacción con el nuevo estroma (ECM, células parénquima, etc)
Adquisición (o re-adquisición de hallmarks observados en tumor primario): viabilidad, proliferación
Modificaciones en el programa migratorio
APROXIMACIONES EXPERIMENTALES Y MODELOS DE ESTUDIO EN LA INVESTIGACIÓN
DEL CÁNCERAdhesión y migración celular
MODELOS DE ESTUDIO: in vitro versus in vivo
Técnicas de estudio in vitro
Proliferación, viabilidad y muerte celular
Proteínas de señalización
Ensayos de transformación celular
√
√
√
√
Técnicas de estudio in vivoTumorigenicidadModelos experimentales de metástasis
√
√
Ensayos de Transformación Celular
Tumorigenicidad(formación de tumores
primarios)
14-21 días
Análisis
Agar blando(crecimiento independiente de
anclaje)
Conteo de colonias
Modelos de Estudio in vitro
Los ensayos de proliferación y viabilidad celular son ampliamente usados en la caracterización de nuevos fármacos antineoplásicos
Formazán (A490-500nm)Sal tetrazolium
Ensayos de Viabilidad
El taxol (paclitaxel) actúa estabilizando microtúbulos. ¿Qué efecto tendrásobre el histograma de DNA?
Proliferación y Ciclo Celular
¿qué sucede si la célula es privada de factores de crecimiento (mitógenos)?
Histograma de DNA(ciclo celular)
DNA content
Cell
numbe
r
Otras Técnicas:
Incorporación de 5-bromo-2-desoxiuridina
Marcación con 3H-timidina
Microscopía de Fluorescencia
Expresión de Ciclinas
Muerte Celular / Apoptosis
DNA content
Cell
Siz
e
viableapoptosis
necrosis
Citometría de FlujoTinción de DNA vs tamaño celular
DNA laddering Microscopía de Fluorescencia
NT
APOP TOSIS
MicroscopíaElectrónica
Apoptosis
Autofagia
Otras Técnicas:Activación de caspasasProteínas señalización (WB)
Modelos de Estudio in vitro
MIGRACIÓN CELULAR
Parámetros cinéticos, comovelocidad de migración,
polarización y direccionalidad
Ensayo de cierre de heridaEXP 1
EXP 2t=0h t=12h
t=0h t=12h
¿Qué se puede decir de EXP2 en relación a EXP1?
Ensayos de Migración e Invasión Celular
Cámara Boyden Matrigel
Matriz compuesta de múltiples proteínas ECM
Depende de MMP‛s
Sustrato ECM
Migración celular (quimiotaxis – haptotaxis)
Invasión
Modelos de Estudio in vivo
ANGIOGÉNESISMembrana corioalantoide de pollo(Chick CAM assay)
Imagen membrana
corioalantoide
¿Qué agente contiene este
disco?
Disco de papel filtro
Modelos de Estudio in vivo
MODELOS EXPERIMENTALES DE METÁSTASIS
1. Metástasis Espontánea
2. Metástasis Experimental
14-21 días Análisis
Análisis
¿qué ventajas y desventajas destacan?
Modelos de Estudio in vivo
Sembrar células de tumor humano sobrela CAM de embriones
de 10 días
7-8 días
Cosechar el tumor
Extraerpulmones y médula ósea
Metástasis
Tumor primario
PCR de secuencia Alu
MODELOS EXPERIMENTALES DE METÁSTASIS
3. MicrometástasisChick CAM Assay
Nat Rev Mol Cell Biol 2004; 5: 816Mutation Research 2011; 1-12
Cell 2000: 100: 57-70Cell 2011: 144: 646-674
PRIMERA PARTE DE LA CLASE SEGUNDA PARTE DE LA CLASE