Bloedstolling
Waarom is bloedstollingcomplex?
• Moet snel optreden wanneer nodig• Mag niet optreden wanneer niet
noodzakelijk• Moet lokaal optreden• Daarom : vele regulatie niveau’s
Stolling op 2 niveau’s:
• Cellulaire respons–bloedplaatjes
• Moleculaire respons–stollingsfactoren
OverzichtInjury
Extrinsic PathwayPlatelet Aggregation
Release of Activating Factors
Thrombin Formation
Intrinsic Pathway
Fibrin Formation
Cellular Response
OverzichtInjury
Extrinsic PathwayPlatelet Aggregation
Release of Activating Factors
Thrombin Formation
Intrinsic Pathway
Fibrin Formation
Molecular Response
Cellulaire Respons
• Gezond vasculair endotheel inhibeertcoagulatie:
– Thrombomoduline– Weefsel plasminogeen activator (t-PA)– PG-I2 (prostacycline)– NO (stikstof oxide)
Cellulaire Respons
Beschadiging endotheel veroorzaakt:
• Adhesie bloedplaatjes• Vrijstellingsreacties door plaatjes• Plaatjes aggregatie
Cellulaire Respons
Beschadigd endotheel stelt onderliggendeproteïnen bloot:
• Collageen• Fibronectine• von Willebrand Factor
Deze adhereren aan plaatjes
Plaatjes
• Kleine anucleaire celfragmenten• Ontstaan uit megakaryocyten• Levensduur: ~10 dagen• Normaal: 200-400,000 / microliter• Normaal niet adhererend• Wanneer geactiveerd vormen ze een
oppervlak voor coagulatie reacties
Plaatjes
• Veel oppervlaktereceptoren• Bezitten granules waarin chemische
substanties gestockeerd• Actine & myosine filamenten
veranderen celvorm na activatie
1. Plaatjes adhesie
vWFGP Ib/IX
ADHESIONto endothelium
R
RR
R
R
epinephrine
ADPthrombin
PAF
throm-boxane
GP IIb/IIIa
fibrinogen
plateletAGGREGATION
SECRETIONPIP2
DAG
IP3
PKC P47
P47-PO4
Ca++
PLC
PLA2
MLC MLC-PO4
MLCK
Phospholipid
Arachidonate
PGG2, PGH2
Thromboxane A2TS
CO
VIIIa
Ca++Ca++
IXa
X
Xa
Va
II
IIa
COAGULATION
collagen
GP IVGP Ia
vWF
-von Willebrand factor op endotheel bindt GP Ib/IX op plaatjes
-collageen bindt GP IV & GP Ia op plaatjes
-fibronectine bindt op integrine receptoren op plaatjes
• 2. Vrijstellingsreacties• Adhesie catalyseert veranderingen in
plaatjes• Celvorm veranderingen• Granules bewegen naar oppervlak en
stellen inhoud vrij– ADP– serotonine– calcium– Veel andere
-aggregatie wordt autocatalytisch door vrijstelling van ADP en TXA2.
Plaatjes ReceptorenReceptoren voor:• collageen• vWf• epinephrine• ADP• PAF• Thromboxaan• ThrombineActivatie draagt bij tot vrijstellingsreacties
vWFGP Ib/IX
ADHESIONto endothelium
R
RR
R
R
epinephrine
ADPthrombin
PAF
throm-boxane
GP IIb/IIIa
fibrinogen
plateletAGGREGATION
SECRETIONPIP2
DAG
IP3
PKC P47
P47-PO4
Ca++
PLC
PLA2
MLC MLC-PO4
MLCK
Phospholipid
Arachidonate
PGG2, PGH2
Thromboxane A2TS
CO
VIIIa
Ca++Ca++
IXa
X
Xa
Va
II
IIa
COAGULATION
collagen
GP IVGP Ia
vWF
Receptor-gecontroleerde vrijstelling
vWFGP Ib/IX
ADHESIONto endothelium
R
RR
R
R
epinephrine
ADPthrombin
PAF
throm-boxane
GP IIb/IIIa
fibrinogen
plateletAGGREGATION
SECRETIONPIP2
DAG
IP3
PKC P47
P47-PO4
Ca++
PLC
PLA2
MLC MLC-PO4
MLCK
Phospholipid
Arachidonate
PGG2, PGH2
Thromboxane A2TS
CO
VIIIa
Ca++Ca++
IXa
X
Xa
Va
II
IIa
COAGULATION
collagen
GP IVGP Ia
vWF
Receptor-gecontroleerde vrijstelling
vWFGP Ib/IX
ADHESIONto endothelium
R
RR
R
R
epinephrine
ADPthrombin
PAF
throm-boxane
GP IIb/IIIa
fibrinogen
plateletAGGREGATION
SECRETIONPIP2
DAG
IP3
PKC P47
P47-PO4
Ca++
PLC
PLA2
MLC MLC-PO4
MLCK
Phospholipid
Arachidonate
PGG2, PGH2
Thromboxane A2TS
CO
VIIIa
Ca++Ca++
IXa
X
Xa
Va
II
IIa
COAGULATION
collagen
GP IVGP Ia
vWF
Receptor-gecontroleerde vrijstelling
vWFGP Ib/IX
ADHESIONto endothelium
R
RR
R
R
epinephrine
ADPthrombin
PAF
throm-boxane
GP IIb/IIIa
fibrinogen
plateletAGGREGATION
SECRETIONPIP2
DAG
IP3
PKC P47
P47-PO4
Ca++
PLC
PLA2
MLC MLC-PO4
MLCK
Phospholipid
Arachidonate
PGG2, PGH2
Thromboxane A2TS
CO
VIIIa
Ca++Ca++
IXa
X
Xa
Va
II
IIa
COAGULATION
collagen
GP IVGP Ia
vWF
3. Plaatjes Aggregatie
vWFGP Ib/IX
ADHESIONto endothelium
R
RR
R
R
epinephrine
ADPthrombin
PAF
throm-boxane
GP IIb/IIIa
fibrinogen
plateletAGGREGATION
SECRETIONPIP2
DAG
IP3
PKC P47
P47-PO4
Ca++
PLC
PLA2
MLC MLC-PO4
MLCK
Phospholipid
Arachidonate
PGG2, PGH2
Thromboxane A2TS
CO
VIIIa
Ca++Ca++
IXa
X
Xa
Va
II
IIa
COAGULATION
collagen
GP IVGP Ia
vWF
-Geaggregeerdeplaatjes verstoppencaviteit
-Geaggregeerdeplaatjes voorzien hetoppervlak voormoleculairerespons.
Moleculaire Respons:Historisch & vereenvoudigd beeld
Extrinsic Pathway
Intrinsic Pathway X
Xa
FibrinFibrinogen
ThrombinProthrombin
Terloops: historisch...
• Veel stollingsfactoren aangeduid met Romeinse cijfers
• Niet in numerische volgorde• Factoren I-IV = fibrinogeen, prothrombine,
tissue factor (weefselfactor) & Ca++
• Subscript-a = geactiveerde vorm• geen Factor VI
Algemeen overzichtRood: extrinsieke routeBlauw: intrinsiekZwart: gemeenschappelijk
Extrinsieke Cascade-brengt vorming fibrine prop op gang
- éénstaps proces dat sleutelenzym activeert, factor X → Xa → prothrombine activatie.
- thrombine → fibrine prop
Extrinsieke Cascade• Vasculaire beschadiging stelt bloed bloot aan
weefselfactor (tissue factor=TF) (Factor III), • = receptor voor FVII (Gla- bevattend proteïne)
dat bindt aan TF in aanw. van Ca++.• Factor VII + Factor III + Ca++ vormen complex
Extrinsieke CascadeFVIIa < thrombine inwerking.
beetje FVIIa voortdurend aanwezig maar niet actief bij gebrek aan weefselfactor.
Extrinsieke cascade
Factor VII:• Vitamine K-afhankelijk proteïne…• Inactieve precursor van een protease• Wanneer VII → VIIa, 100 x meer actief• Converteert Factor X → Xa
Extrinsieke cascade(cross-talk met intrinsiek)
Wat activeert VII naar VIIa?• Thrombine• Factor IXa (<intrinsieke cascade)• Factor XIIa (<intrinsieke cascade)• Factor Xa
Extrinsieke cascade
• Rol van Xa is complex
VII VIIa VII (inactive)Xa Xa
Extrinsieke cascade(cross-talk met intrinsiek)
Substraten voor Tissue Factor:VIIa:Ca++• X (serine protease)• Converteert IX to IXa (traditioneel "intrinsiek")
– Vitamine K-afhankelijk– Serine protease
Intrinsieke cascade
• Geïnitiëerd op negatief geladen oppervlakken• In vivo: beschadigd endotheel (anionisch
membraanoppervlak)• In vitro: glas, dextraan sulfaat,…
-FXII bindt op AO
-Prekallikrein en FXI : HMW kininogeen
-FXII: prekallikrein →kallikrein
-kallikrein: XII → XIIa.
-FXIIa : FXI → XIa.
-FXIa activeert FIX
-FIXa + FVIIIa: X → Xa
-Cascadereactie.
12
2
34
5
6
7
Thrombine vorming-FXa-FV complex=prothrombinase.
-vorming V,VII,VIII,XIII(a), -onvoldoende om bloeding te stelpen (extrinsiek)
-belang thrombine : extrinsieke + intrinsieke pathway.
-FXIII (transglutaminase): vormt harde fibrine klonter.
Algemeen schema.
-Xa gevormd door I en E.
-afwijkingen gekend in iedere component van de intrinsieke route.
Intrinsieke cascade
vWFGP Ib/IX
ADHESIONto endothelium
R
RR
R
R
epinephrine
ADPthrombin
PAF
throm-boxane
GP IIb/IIIa
fibrinogen
plateletAGGREGATION
SECRETIONPIP2
DAG
IP3
PKC P47
P47-PO4
Ca++
PLC
PLA2
MLC MLC-PO4
MLCK
Phospholipid
Arachidonate
PGG2, PGH2
Thromboxane A2TS
CO
VIIIa
Ca++Ca++
IXa
X
Xa
Va
II
IIa
COAGULATION
collagen
GP IVGP Ia
vWF"tenase"
Intrinsieke cascade
Kallikrein verknipt HMWK in tweefragmenten:
• Bradykinine (nonapeptide)– vasodilator– Verhoogt capillaire doorlaatbaarheid
• Kininogeen– Vergemakkelijkt accumulatie van
prekallikrein & XI op plaatjesoppervlak
Gemeenschappelijke Cascade
• Factor V komtvoor op plaatjesopp.
• Factor Xa, Factor Va, Ca++, phospholipidevormen eencomplex
vWFGP Ib/IX
ADHESIONto endothelium
R
RR
R
R
epinephrine
ADPthrombin
PAF
throm-boxane
GP IIb/IIIa
fibrinogen
plateletAGGREGATION
SECRETIONPIP2
DAG
IP3
PKC P47
P47-PO4
Ca++
PLC
PLA2
MLC MLC-PO4
MLCK
Phospholipid
Arachidonate
PGG2, PGH2
Thromboxane A2TS
CO
VIIIa
Ca++Ca++
IXa
X
Xa
Va
II
IIa
COAGULATION
collagen
GP IVGP Ia
vWF
prothrombine
thrombine
fibrinogeen/fibrine:
-2 x αβγ polypeptiden
-3 globulaire domeinen
-N-terminale gebieden αα’ββ’:ladingsafstoting.
-thrombine verwijdert deze peptiden → zachte klonter
-versteviging door XIIIa: vormt isopeptide binding tussen monomeren
Fibrine
fibrin
fibrinogenb
a aBB
AAb-4-4
-8
Fibrine
fibrin
fibrinogenb
a aBB
AAb-4-4
+5
Fibrine
fibrin
fibrinogenb
a aBB
AAb
Fibrine
fibrin
fibrinogenb
a aBB
AAb
Fibrine
fibrin
fibrinogenb
a aBB
AAb
Fibrine
fibrin
fibrinogenb
a aBB
AAb
Fibrine
fibrin
fibrinogenb
a aBB
AAb
Fibrine
fibrin
fibrinogenb
a aBB
AAb
Ander proteïne(op endotheel of op plaatjes)
Anticoagulatie fase (↔ procoagulatie fase):
- begint bijna zodra coagulatie zelf begint.
-initieel : concentratie inhibitor complexen = laag (concentratie van de enzymen waarmee ze moeten interageren ook laag).
-complexen dissociëren niet meer → uit bloed verwijderd (lever)
Inhibitie extrinsieke route (TF-VIIa-Ca2+-Xa)
-uniek, door ‘TF pathway inhibitor’ (TFPI) aka anticonvertine-ieder subdomein van TFPI interageert met een onderdeel van het complex-TFPI-Xa complex geïnternaliseerd door endocytose (derde domein)
-meeste inhibitoren < serpine familie (serine proteïnase inhibitor)
-anti-thrombine III = serpine dat thrombine en Xa inhibeert. Heparine versnelt deze inhibitie (9000-17000x efficiënter)
-inhibitie van Xa (alternatieve manier) : proteïne Z* Gla-bevattend proteïne* geen protease activiteit.* In aanw van calcium bindt het de membraan en vormt
complex met Xa → inactivatie.
-a2 macroglobuline inhibeert thrombine & kallikrein
Inactivatie Va en VIIIa: proteïne C pathway
-Proteïne C: * Gla-bevattend. * inactieve precursor van een serine protease
Thrombine/thrombomoduline/Ca2+ activeert proteïne C Dit complex + proteïne S → degradatie Va en VIIIa
Eindresultaat: inhibitie van verdere thrombine vorming direct : Factor V5indirect: Factor 8
!Thrombine : van pro-coagulatie naar anti-coagulatie!
-C of S deficiëntie,
→ veneuze thrombose
(bloedklonters → bloedcirculatie geblokkeerd).
(ook: puntmutaties in substraten, vb factor V)
• Plasminogeen: precursor, hoge affiniteit voor fibrine via Kringle domeinen.
• weefsel plasminogeen activator (t-PA): activeert plasminogeen proteolytisch.
• plasmine → lyse fibrine klonters • t-PA wordt op zijn beurt gereguleerd door
plasminogeen activator inhibitoren (PAI’s).
Fibrinolyse
• Start/stop van de stolling volgt zelfde patroon: – eiwit-eiwit interacties– vorming multi-enzym complexen– proteolyse.
De processen zijn unidirectioneel →nieuwsynthese noodzakelijk.
Rol van Gla residuen/domeinen in coagulatie factoren
Gla=γ-carboyl glutaminezuur• Post-translationele modificatie• excellente chelatoren van calcium• tweevoudige rol Ca2+:
– complexeren met Gla → ∆conformatie →interactie met membraanreceptoren,
– binden op (andere plaatsen in) eiwitten →catalytische activiteit ↑.
NH
O
OO
NH
O
O
γ-carboxylglutaminezuur
γ
Structuur Gla proteinen:
Proteolytische activatie :
ter hoogte van residuen gelegen binnen een S-S brug.
(enkel bij prothrombine wordt Gla fragment afgesplitst).
Vitamine K(‘Coagulatie vitamine’)
• Co-factor voor post-translationele modificatievan factoren VII, IX, X; prothrombin; proteïnen C, Z en S
• Glutamaat zijketens gemodificeerd in γ-carboxy-glutamaat
• gebeurt tijdens synthese in het lumen van RER.
• Vitamine K is een essentiële co-factor voor het carboxylase.
Vitamine K
O-
O
O-
O
O-O
strong attractionweak attraction
Enzyme vitamin K
Ca++Ca++
Glu Gla
• Prothrombine Gla peptiden: verwijderd via de lever
• Deze peptiden stimuleren de novo synthese van eiwitten die Gla-gemodificeerd moeten worden.
Ca++ chelering
• Ca++ chelatoren (citrate, oxalate, fluoride, EDTA) verhinderen coagulatievan bloed
• Vitamine K antagonisten (dicumarol, warfarin) inhiberen bloedstolling
Hemophilias
Hemophilie A (Classic Hemophilia)• Defect: Factor VIII• X-linked• 1/10,000 males
Hemophilias
Hemophilia B • Defect: Factor IX• X-linked• 1/50,000 males
Hemophilias
von Willebrand disease• Defect: von Willebrand factor• Not X-linked• 1/1,000,000• Looks like Factor VIII deficiency• Recall that vWF binds VIII