Caracterización de genes implicados en
enfermedades hereditarias
Genética y Genómica de EnfermedadesNeuromusculares y Neurodegenerativas
Novarino et al. Cell 2011; 147: 70-79
Mecanismos de Enfermedad
A. Pasado
Pedigrís informativos
Análisis de ligamiento
Cartografiado genómico
Secuenciación Sanger
Mutación identificada
Organismos modelos
Mecanismos de Enfermedad
y Tratamiento
B. Presente/Futuro
Secuenciación del genoma
Identificación de variantes
Modificadores, carga genética,…
Interactomas proteicos
Cribados de drogas terapéuticas
Células humanas
Approach Applies to Advantages Disadvantages
CANDIDATE GENE Anydisease
Easy to perform; Requires no mapping; Identifies directly themutation.
Relies heavily on current biologicalknowledge; Sucess rate very low
GENETIC MAPPING BY KARYOTYPING
Anydisease
Easy to perform; No familialcases required; Can detect (large)balanced events.
Low resolution, only detects largechromosomal aberrations; Mutationdetection requieres 2nd step.
GENETIC MAPPING BY LINKAGE ANALYSIS
Inheriteddisease
Easy to perform. Requires large families; Oftenidentifies large loci; Mutationdetection requieres 2nd step.
GENETIC MAPPING BY HOMOZYGOSITY MAPPING
Recessivemonogenicdisease
Small families can be used. Most useful for consanguineous fam;Often identifies large loci; Mutationdetection requieres 2nd step.
GENETIC MAPPING BY CNVANALYSIS
Monogenicdisease
High resolution CNV screening;No familial cases required; Can potentially identify small loci.
Only investigates CNVs; Cannotdetected balanced events; Mutationdetection requieres 2nd step.
WHOLE EXOME SEQUENCING (WES)
Anydisease
Detects most types of genomicvariation; Identifies directly themutation.
Unable to detect non-coding variants;Limited resolution for CNVs; Coveragevariability due to enrichment process; Relatively expensive.
WHOLE GENOMESEQUENCING (WGS)
Anydisease
Detects most types of genomicvariation; Identifies directly themutation.
Data analysis complex; even more expensive than WES.
Gilissen et al. Genome Biology 2011; 12:228
Approach Applies to Advantages Disadvantages
CANDIDATE GENE Anydisease
Easy to perform; Requires no mapping; Identifies directly themutation.
Relies heavily on current biologicalknowledge; Sucess rate very low
GENETIC MAPPING BY KARYOTYPING
Anydisease
Easy to perform; No familialcases required; Can detect (large)balanced events.
Low resolution, only detects largechromosomal aberrations; Mutationdetection requieres 2nd step.
GENETIC MAPPING BY LINKAGE ANALYSIS
Inheriteddisease
Easy to perform. Requires large families; Oftenidentifies large loci; Mutationdetection requieres 2nd step.
GENETIC MAPPING BY HOMOZYGOSITY MAPPING
Recessivemonogenicdisease
Small families can be used. Most useful for consanguineous fam;Often identifies large loci; Mutationdetection requieres 2nd step.
GENETIC MAPPING BY CNVANALYSIS
Monogenicdisease
High resolution CNV screening;No familial cases required; Can potentially identify small loci.
Only investigates CNVs; Cannotdetected balanced events; Mutationdetection requieres 2nd step.
WHOLE EXOME SEQUENCING (WES)
Anydisease
Detects most types of genomicvariation; Identifies directly themutation.
Unable to detect non-coding variants;Limited resolution for CNVs; Coveragevariability due to enrichment process; Relatively expensive.
WHOLE GENOMESEQUENCING (WGS)
Anydisease
Detects most types of genomicvariation; Identifies directly themutation.
Data analysis complex; even more expensive than WES.
Gilissen et al. Genome Biology 2011; 12:228
Actionablevariants
Actionablevariants
Modified by Newman et al., Genes (2014)
WESWGS
Screening of novel
candidate genes
Different approaches: WGS, WES & Gene panel
Los paneles de genes
permiten también el
descubrimiento de
genes→nuevos fenotipos
1.- Baja frecuencia
2.- Exónico o splicing
3- No sinónimo
4.- Predicho patológico
5.- Modo de herencia
6.- Estudios funcionales
Análisis de Segregación
70.000-90.000
variantes
~2000-5000
~500-700
~300-500
~110
Exoma (WES) Panel de Genes
1.- Baja frecuencia
2.- Exónico o splicing
3- No sinónimo
4.- Predicho patológico
5.- Modo de herencia
6.- Estudios funcionales
Análisis Multimuestra
300-600
variantes
~50-60
~10-20
~5-10
~0-2
Mutación patológica Mutación patológica
Las dos herramientas más utilizadas en el diagnóstico genético: WES y panel de genes
Different approaches: WGS, WES & Gene panel
Wright CF, FitzPatrick DR, Firth HV. Nat Rev Genet 2018
Diagnostic potential versus practicality and cost
Trio-based WGS
Highest yield (42%)
IT demand
Expensive Trio-based WES
Highest yield (40%)
IT demand~1,800-2,400€
Proband-only WES
Low yield (28%)
IT demand~600-800€
Gene panel NGS
Variable yield
Low IT demand~400-800€
Gene-to-GeneSlowEasy to analyseCheap: ~200€
ENFE
RM
EDA
D M
ON
OG
ÉNIC
A
ENFE
RM
EDA
D M
ON
OG
ÉNIC
A
ENFE
RM
EDA
D C
OM
PLE
JA
ENFE
RM
EDA
D M
ON
OG
ÉNIC
A
ENFE
RM
EDA
D C
OM
PLE
JA
MUTACIÓN PATOLÓGICA
VARIANTES DE SIGNIFICADO INCIERTO (VUS)
Whitcomb et al. Gastroenterology 2015
F1.III.2 Debilidad muscular leve de aparición tardía (debut: 44 años; edad: 77 años)
F1.IV.4 Cuadriparesia grave con compromiso respiratorio (debut: 3 años; edad: 44 años)
La expresión de las mutaciones en neuronas revela quelas mutaciones conducen a un incremento significativode muerte celular respecto al control wild-type.
TRPV4 c.805C>T (p.R269C)
1º. La variabilidad clínica, tanto intra como interfamiliar, asociada a una enfermedad Mendeliana omonogénica es extensa.
2º. La variabilidad clínica se debe en parte al fondo genético propio del individuo en el que coexistencambios con gran impacto en el fenotipo con otros de baja relevancia.
Key points
>80 genes!!
…distribuidos por todo el Genoma Humano
Charcot-Marie-Tooth y neuropatías relacionadas
Timmerman et al 2014 http://neuromuscular.wustl.edu
Funciones diversas
-Genes específicos del sistema nervioso
-Genes ubicuos
Charcot-Marie-Tooth disease
Hereditary Motor and Sensory Neuropathy (HMSN)Prevalence: 28 / 100 000
Main clinical features: - Onset in the first two decades of life- Progressive distal muscle weakness and atrophy- Distal sensory loss and foot deformities (pes cavus, hammer toes)- Involvement of the hands may follow as the disease progresses- Wide spectrum of additional symptoms (e.g. ataxia, hearing loss, optic atrophy, etc.)
DEMYELINATING CMT (CMT1, CMT4)Nerve Conduction Velocity (NCV) < 38 m/sNerve biopsy: demyelinating, onion bulbs.
CMT AXONAL (CMT2, AR-CMT2)Normal or slightly reduced NCV (> 42 m/s)Nerve biopsy: axonal neuropathy
INTERMEDIATE CMT (DI-CMT, RI-CMT)Intermediate NCV (30–45m/s)Pathological features of demyelinating and axonal forms
1009 patients evaluated
571 Excluded (not CMT)
275 Demyelinating 163 Axonal
34 Gypsy241 Caucasian • 42 GDAP1
- 18 AR
- 24 AD (CMT2K)
• 31 GJB1 (CMTX1)
• 10 MPZ (CMT2I/J)
• 7 HSPB1 (CMT2F)
• 4 MFN2 (CMT2A)
• 3 NEFL (CMT2E)
• 3 HSPB8 (CMT2L)
• 1 GARS (CMT2D)
• 1 KARS
CMT1
• 184 PMP22a (CMT1A)
• 25 GJB1 (CMTX1)
• 9 MPZ (CMT1B)
• 2 PMP22b (CMT1A)
• 1 NEFL (CMT1F)
CMT4
• 4 PRX (CMT4F)
• 2 SH3TC2 (CMT4C)
• 2 FGD4 (CMT4H)
12 Uncharacterized
61 Uncharacterized
• 26 SH3TC2 (CMT4C)
• 6 HK1 (CMT4G)
• 2 NDRG1 (CMT4D)
438 CMT
0 Uncharacterized
Sivera et al. Neurology 2013
Sigue habiendo un importante número de pacientes sin diagnóstico genético…
Series de CMT (Saporta et al., 2011, Murphy et al., 2012, Sivera et al., 2013)
En CMT2, diagnóstico genético en 60% de los casos
…Faltan genes implicados en CMT y neuropatías relacionadas por identificar
Dónde está la mutación/gen responsable?
Cómo distinguir entre mutación causal y variantes raras?
Cómo validar la mutación/gen?
Identificar la mutación
responsable de la enfermedad es
un gran reto…
Evidencias genéticas adicionales: otras familias → evidencia más potente
Identificar mutaciones en el gen candidato en otras familias con la misma enfermedad
Estudios celulares, moleculares y/o bioquímicos
WT vs. Mutante
Organismos modelo
Reproducir la enfermedad debido a mutaciones en el gen candidato
¿Alteraciones de la funcionalidad, estabilidad…?
Validación/caracterización de nuevos genes en NPH
Establecer correlación
genotipo-fenotipo
+
¡modificadores genéticos!
Variabilidad
clínica
Intra e Inter-familiarPenetrancia incompleta
Expresividad variable
Mutación causal
Asintomático
Más grave
1º. La variabilidad clínica, tanto intra como interfamiliar, asociada a una enfermedad Mendeliana omonogénica es extensa.
2º. La variabilidad clínica se debe en parte al fondo genético propio del individuo en el que coexistencambios con gran impacto en el fenotipo con otros de baja relevancia.
3º. En enfermedades con heterogeneidad genética suelen restar genes por descubrir.
4º. Genes con funciones muy diversas pueden conducir a fenotipos clínicos similares cuando estánmutados.
Key points
•Más rápido: Máquinas que secuencian con una velocidad de hasta 200 veces la secuenciación Sanger.•Más barato: El rendimiento tan alto abarata el coste de lectura/base. Objetivo: un genoma humano = 1000$
NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS)
Metodología Año Tiempo Coste económico
SecuenciaciónSanger
2001Proyecto Genoma Humano
13 años 2.7 billones de $
NGS 2008 5 meses 1.5 millones de $
NGS 2011 Unos días Menos de 10.000$
¿Cuánto cuesta secuenciar un genoma humano completo?
Chong et al. Am J Hum Genet 2015
NGS_Descubrimiento de genes
Study Design: Exome Sequencing
•Families are investigated independently
•Previous genetic analysis:
panel gene/common genes
•4 individuals / family
•At least two of them are affected subjects
•Distant relatives are preferred
I:2
II:2II:1
III:1 III:2
II:4II:3
III:3 III:4
II:5 II:6
III:7III:5 III:6
II:8II:7
III:8
II:10II:9
III:9 III:10
I:1
Selected candidate disease-causing mutations
1. Prioritize non synonymous SNVs
2. Changes segregating in heterozygosis/homozygosis
3. dbSNP variants excluded
Exome sequencing (CNAG)
Informatics analysis
How to determine a variant is a clinical mutation?
1.- Novel change?
•Database of DNA changes
•Database of pathological mutations
2.- Genetic analysis
•To confirm the change in the patient
•Segregation analysis
I:2
II:2II:1
III:1 III:2
II:4II:3
III:3 III:4
II:5 II:6
III:7III:5 III:6
II:8II:7
III:8
II:10II:9
III:9 III:10
I:1
3.- In silico analysis
•Study of the conservation of the variant
•Pathogenicity prediction
•Prediction of the protein structure PROBABLY DAMAGING
with a score of 1.000
4.- Functional approaches
•Biochemistry
•Cell analysis
•Animal models
1. El cambio detectado es novel?
2. El cambio cosegrega con la enfermedad
3. Los análisis in silico predicen que el cambio es probablemente deletéreo
4. La mutación altera la función de la proteína
OBJETIVOS
5. Investigar el nuevo cambio en familias pendientes de diagnóstico
• Heterogeneidad genética
• Consecuencias fenotípicas de las variantes noveles
* Relevancia del análisis de segregación
* Bases de datos
Dificultades
Diseño del Estudio
1º. La variabilidad clínica, tanto intra como interfamiliar, asociada a una enfermedad Mendeliana omonogénica es extensa.
2º. La variabilidad clínica se debe en parte al fondo genético propio del individuo en el que coexistencambios con gran impacto en el fenotipo con otros de baja relevancia.
5º. La tecnología actualmente disponible NGS nos permite conocer mejor el fondo genético de unindividuo: identificar cambios nucleotídicos que contribuyen al fenotipo (mutaciones clínicas ymodificadores genéticos).
3º. En enfermedades con heterogeneidad genética suelen restar genes por descubrir.
4º. Genes con funciones muy diversas pueden conducir a fenotipos clínicos similares cuando están mutados.
Key points
Secu
en
ciac
ión
de
Exo
ma
NO CAMBIOS CANDIDATOS
MUTACIONES CONOCIDAS
GENES CONOCIDOS
GEN NOVEL
Revisar información y reanalizar informáticamente los datos
Ensayo de patogenicidad
Diagnóstico logrado
FAMILY GENE CHANGE
412 New c.1627G>A, p. A543T Functional studies in progress
421 New c.613 C>A, p.P205T Functional studies in progress
423 AARS c.5delACTCT, p.T4NfX3 Functional studies in progress
424 BSCL2 c.455A>G, p.N152S Previously reported mutation
246 KIF1A c.31C>T, p.R11W 3D Structure of Protein
418 GARS c.794C>T, p.S265F Previously reported mutation
402 No candidate change
411 New c.1302G>T, p. Q434H Functional studies in progress
95 No candidate change
248 EGR2 c.1226G>A, p.R409Q Expression analysis & 3D Structure
237 MORC2 c.568C>T, p.R190W ATPase activiy
348 FIG4c.122T>C, p.I41T
c.446+5G>C
p.I41T : known mutation
Minigenes (exon skipping mutation)
83 DNAJB2 c.352+1G>A Previously reported mutation
Thirteen families investigated by exome sequencing
Two families with no candidate mutation
Once clinical data is revised,
informatics analysis… again
FAMILY GENE CHANGE
402 No candidate change
95 No candidate change
fHMN-95fCMT-402
Exome Sequencing
FAMILY GENE CHANGE
424 BSCL2 c.455A>G, p.N152S Previously reported mutation
418 GARS c.794C>T, p.S265F Previously reported mutation
83 DNAJB2 c.352+1G>A Previously reported mutation
Three families with known mutations
The DNAJB2 c.352+1G>A was first described in a family from Morocco
Mutational Screening
Gene Panel
Lupo et al. J Mol Diagn 2016
Frasquet et al. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2016
Four families with mutations in known genes
FAMILY GENE CHANGE
423 AARS c.5delACTCT, p.T4NfX3 Functional studies in progress
246 KIF1A c.31C>T, p.R11W 3D structure of the protein
248 EGR2 c.1226G>A, p.R409Q Expression analysis & 3D structure
348 FIG4 c.122T>C, p.I41T
c.446+5G>C
p.I41T : known mutation
Minigenes (exon skipping mutation)
c.31C>T (p.R11W) KIF1AfCMT-246p.Arg11
p.Trp11
The pocket where the ATP is placed is smallerand therefore, the ATP hydrolisis will not be
possible
Axonal CMT
fCMT-248
chr10:64573172 c.1226G>A p.R409Q EGR2
Four families with mutations in known genes: fCMT-248
0
20
40
60
80
100
120
EGR2 p.R409Q p.R409W p.R359W pcDNA3
perc
en
tag
e o
f acti
vati
on
Luc
*
* p value
<0.005
Cx32-Promoter LIGHT
EGR2
WT or Mutants
Luciferase
assay
DSS/CMT
1
CMT1CMT2
**
Expression analysis
p.R409Q mutation behavessimilarly to DBD mutations
Sevilla et al. Eur J Neurol 2015
FAMILY GENE CHANGE
412 New c.1627G>A, p. A543T
421 New c.613 C>A, p.P205T
411 New c.1302G>T, p. Q434H
237 MORC2 c.568C>T, p.R190W
Four families with mutations in new genes
The beginning of a new story…
Has the identified variant phenotypic effects?
Why does the novel gene lead to a neuropathy?
fCMT-237
c.568C>T p.R190W MORC2
•The mutation segregates in fCMT-237
•In silico analyses (SIFT and PolyPhen) predict that this change
could not be tolerated
•This is a novel change that is highly conserved
New axonal CMT gene: MORC2
fCMT-237
MORC2, a new gene involved in CMT
Sevilla, Lupo et al. Brain 2016
c.568C>T p.R190W c.74C>T p.S25L
Four families with mutations in new genes: fCMT-237
fCMT-440
fCMT-237
New axonal CMT gene: MORC2
Sevilla, Lupo et al. Brain 2016
fCMT-440
c.568C>T p.R190W
MORC2: clinical mutations
• ATPase domain
• Axonal CMT
• Predicted like damaging at the protein structure
• Healthy controls: No carried the change
•Position highly conserved in evolution
c.568C>T p.R190W c.74C>T p.S25L
• Exon 10•Symptoms 2nd decade•Severe incapacity in adulthood
• Exon 5•Congenital onset• SMA•Optic Atrophy
Sevilla, Lupo et al. Brain 2016
Microarchidia family: 5 human proteins
Shao et al.,2010
MORC2: Functions
PAK1
MORC2
Li et al.,2012
dsDNA breaks
AT
Pase
acti
vit
y
(Un
its
/mo
l)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
***
WT R190W S25L D6A EMPTY
* p_valor < 0,05
MORC2 p.S25L shows a decreased of 50% in ATPase activity
MORC2: Functional Assay
Immunoblot of Morc2 on protein extracts from neural and non-neural mouse tissues RT-PCR using a primer pair in exons 20 and 21
Immunostaining of Morc2 (green channel) and MBP (red channel) on a sciatic nerve cross-section. DAPI staining (blue) shows the Schwann cell nuclei
MORC2: Expression analysis Sevilla, Lupo et al. Brain 2016
EX 5 EX 6 EX 7 EX 8 EX 10 EX 11EX 9
c.74 C>Tp.S25L
c.209 G>Tp.R70L c.521 A>G
p.E174G
c.568 C>Tp.R190W3 FAMILIES
7 FAMILIES1 FAMILY
1 FAMILY
CMT 2Z
MORC2: reported mutations/cases
MORC2 expression
in purified rat
sensory neurons
•The morphology of the
somas of infected neurons
was unaltered by
overexpression of WT or
mutated forms of
MORC2.
•The expression of
endogenous Morc2 and
overexpressed forms of
MORC2 were
predominantly detected in
the nuclei of the cells.
•All forms of MORC2 were
also detected in the axons
Sancho et al. Hum Mol Genet 2019
• Detailed analysis of axons
using SMI32 staining
revealed the presence of
axonal swellings in
neurons expressing the
p.S87L mutation.
• Further quantification
confirmed this observation
for the p.S87L mutation
while the p.R252W-
expressing neurons had
an axonal morphology
similar to the neurons
expressing WT-MORC2
Sancho et al. Hum Mol Genet 2019
MORC2 expression
in purified rat
sensory neurons
1 2 3
Climbing Assay
Gen silenciado en tubo 3
Afectación locomotora tras
el silenciamiento del gen
“New?”
En colaboración con Dr. Máximo Ibo Galindo
Filtrado de datos con un pipeline diferenteFBXO3, gen implicado en dHMN
1
2
3
NEW GENE??? c.1302G>T (p.Q434H)
DHTKD1 DNM2EGR2 FGD4FIG4 GANGDAP1 GJB1*GNB4 HARSHINT1 HK1**KARS KIF1BKIF5A LITAFLMNA LRSAM1MARS MED25**MFN2 MICAL1MPZ MTMR2NDRG1 NEFLPDK3 PMP22PRSP1 PRXRAB7A SBF1SBF2 SH3TC2SLC12A6 TDP1TFG TRIM2TUBA8 YARS
ATP7ABICD2BSCL2DCTN1HSPB3
PLEKHG5SETX
[9 genes]
AARSDNAJB2
DYNC1H1FBLN5GARSHSPB1HSPB8
IGHMBP2TRPV4
Genes CMT[40 genes]
Genes AED[7 genes]
*Incluida región promotora
**Sólo mutación fundadora
• Panel de 56 genes • 862 regiones• 186,34 kb• Cobertura 99,98%
Lupo et al J Mol Diagn 2016PANEL DE GENES
ID no.Clinical
formGene dbSNP/1000G
NucleotideChange
Amino acidchange
Pathogenic effect
DNA_1138 I-CMT HARS rs78741041/0.0055 c.14C>A p.Ala5Glu possibly damaging
SGT/018 dHMNPLEKHG5 rs140202670/0.0023 c.1225C>T p.Arg409Trp deleterious
SBF1 rs201776298/0.0045 c.868G>A p.Ala290Thr possibly damagingSGT/031 CMT2 MICAL1 rs201447051/0.0014 c.374T>C p.Leu125Pro deleterious
SGT/029 I-CMTPLEKHG5 Novel c.800G>A p.Arg267His deleterious
SETX rs151117904/0.0027 c.7727T>C p.Ile2576Thr possibly non-damagingSETX rs148568105 c.6013G>A p.Val2005Met deleterious
SGT/030 CMT2KIF1B rs121908162/0.0009 c.2480C>T p.Thr827Ile possibly non-damagingSETX rs61742937/0.0096 c.2975A>G p.Lys992Arg possibly non-damagingSETX rs79740039/0.0064 c.59G>A p.Arg20His possibly non-damaging
SGT/068 CMT2PRX Novel c.4077_4079delGGA p.Glu1360del possibly damaging
SLC12A6 Novel c.1421A>G p.His474Arg possibly non-damaging
SGT/072 CMT2 IGHMBP2 Novel c.1582G>A p.Ala528Thr possibly damaging
SGT/081 CMT2 DNM2 Novel c.2201A>G p.Asn734Ser possibly non-damaging
SGT/139 CMT2HARS Novel c.989A>G p.Tyr323Cys deleterious
HARS Novel c.679T>G p.Ser227Ala possibly damaging
SGT/142 CMT2MFN2 rs140234726 c.749G>A p.Arg250Gln possibly non-damaging
LRSAM1 Novel c.2136_2143delCATCGCCCinsC p.Ile713SerfsTer20 possibly damagingSGT/106 CMT2 LRSAM1 Novel c.2083_2095delTGCTGCCAGCAGTinsT p.Cys696_Cys699del possibly damaging
SGT/109 CMT2PLEKHG5 Novel c.718G>A p.Asp240Asn possibly non-damaging
SETX rs61742937/0.0096 c.2975A>G p.Lys992Arg possibly non-damagingSGT/114 I-CMT SETX Novel c.4289C>T p.Ser1430Phe possibly damaging
SGT/170 CMT2AARS rs138081804/0.0009 c.2185C>T p.Arg178Trp deleteriousKARS Novel c.1603C>T p.Arg535Trp possibly damaging
PANEL DE GENES14 CAMBIOS NOVELES Y/O VARIANTES CON MAF<1%
Lupo et al J Mol Diagn 2016
•En un panel de genes, se pueden identificar variantes candidatas a ser la
mutación causal en varios genes siendo muy complejo establecer si
realmente alguna de ellas es la mutación responsable de la enfermedad.
•Los paneles de genes permiten también el descubrimiento de genes
porque genes conocidos se pueden asociar a fenotipos nuevos, ampliando
el espectro clínico de las enfermedades relacionadas con un gen.
HUMAN GENOMES“Recent human genomic projects have revealed an unexpectedly high amount of deleterious variability in apparently normal, healthy individuals”
(Xue et al. Am J Hum Genet. 2012)
Ojo con las bases de datos de mutaciones patológicas
Heterozygous Homozygous
Missense substitutions predicted to be highly damaging
Disease-causing mutations (HGMD)
“Hasta el 27% de las variantes publicadas como patológicas, se ha demostrado más tarde que son realmente polimorfismos benignos”
(Pang et al. Transl Neurodegener 2017)
1º. La variabilidad clínica, tanto intra como interfamiliar, asociada a una enfermedad Mendeliana omonogénica es extensa.
2º. La variabilidad clínica se debe en parte al fondo genético propio del individuo en el que coexistencambios con gran impacto en el fenotipo con otros de baja relevancia.
5º. La tecnología actualmente disponible NGS nos permite conocer mejor el fondo genético de un individuo:identificar cambios nucleotídicos que contribuyen al fenotipo (mutaciones clínicas y modificadoresgenéticos).
3º. En enfermedades con heterogeneidad genética suelen restar genes por descubrir.
4º. Genes con funciones muy diversas pueden conducir a fenotipos clínicos similares cuando están mutados.
8º. Establecer qué cambios son causa primaria es complicado y cuáles son modificadores genéticos esmucho más complejo.
Key points
7º. La gran mayoría de enfermedades genéticas son raras y por tanto, la casuística es escasa.
6º. La forma fehaciente de demostrar que una mutación conduce a una enfermedad es con la descripciónde muchos casos con mutaciones en el mismo gen y un cuadro clínico similar.
9º. Los paneles de genes permiten el descubrimiento de genes en tanto que genes conocidos se puedenasociar a fenotipos nuevos, ampliando el espectro clínico de las enfermedades relacionadas con un gen.
NATURE | Vol 456 | 6 November 2008
An analysis using a larger number of markers requires a larger sample size. Testing 1 SNPmarker requires 248 cases, while testing 500,000 SNPs and 1 million markers requires 1,206cases and 1,255 cases, respectively, under the assumption of an odds ratio of 2, 5% diseaseprevalence, 5% minor allele frequency, complete linkage disequilibrium (LD), 1:1 case/controlratio, and a 5% error rate in an allelic test
EP Hong & JW Park Genomics Inf 2012; 10: 117-122
Genome Wide Association Studies (GWAS)
✓ Tasa de portadores: 1/40-1/60. Casos de novo: 1-2%
✓ Alrededor del 95% de los casos son debidos a la deleción de los exones 7 y 8 del gen SMN1
(Survival Motor Neuron 1)
✓ Fenotipo: Poliomielitis mucho más agresiva y generalizada; degeneración de motoneuronas del
asta anterior de la médula espinal; debilidad proximal y simétrica y atrofia progresiva de los
músculos esqueléticos.
✓ Tres tipos: - AME tipo I o aguda: aparición antes de los 6 meses.
- AME tipo II o intermedia: aparición antes de los 18-24 meses
- AME tipo III o crónica: aparición posterior 18-24 meses
7
c.840C>T
Modificadores Genéticos: Atrofia Muscular Espinal
SMN2 modificador genético de AME.
El nº de copias de SMN2 afecta a la
gravedad de la enfermedad: (i) AME
tipo I, 1 ó 2 copias de SMN2; y (ii)
AME tipo II y tipo III, 3 – 5 copias de
SMN2.
La deleción de SMN2 no causa AME:
10% población deleción homozigota
SMN2
Modificadores Genéticos: Atrofia Muscular Espinal
Locus AME. Contiene duplicaciones e inversiones de 500 kb que comprende 4 genes en la mayoría deindividuos sanos. Esta unidad de repetición puede variar de 0-4 copias por cromosoma lo que le confieregran inestabilidad al gen. La alta tasa de nuevas mutaciones encontradas en el 2% de pacientes con AME sedebe a un desigual entrecruzamiento de las unidades repetidas durante la meiosis.
CONVERSIÓN
CEN TEL
SMN1 NAIPψNAIP SMN2
Un modificador genético puede afectar diferentes aspectos de una enfermedad:
• Debut • Gravedad de la enfermedad• Duración de la enfermedad• …
Modificador genético
Locus genético que aumenta o disminuye/suprime el resultado de la mutación
causal primaria
¡modificadores genéticos!
AD-CMT2K Gran variabilidad clínica intrafamiliar
¿Identificar modificadores?
Mutaciones dominantes en GDAP1
Penetrancia incompleta
Expresividad variable
Estrategia:
Búsqueda candidatos → Funcionalmente relacionados con GDAP1
GDAP1 p.R120W
Asintomático
Más grave
Sivera et al., J Peripher Nerv Syst. 2010
Zimon et al., Neurology 2011
Papel en dinámica mitocondrial
Procesos Redox
Relación retículo-mitocondria
Homeostasis de calcio
Funciones GDAP1
Papel en dinámica mitocondrial
Procesos Redox
Relación retículo-mitocondria
Homeostasis de calcio
Vaciado de Ca2+ de los depósitos Activación del mecanismo del SOCE para rellenar de Ca2+ los depósitos
SOCE (Store-Operated Calcium Entry)
Funciones GDAP1
Pla-Martín et al. Neurobiol Dis. 2013SOCEGDAP1
JPH1:
Buen candidato a
ser modificador
funcional de GDAP1
SOCE
JPH1
GDAP1
Store-Operated Calcium Entry (SOCE)
homeostasis del Ca+2
→ cluster conservado en vertebrados
Pla-Martín et al. Neurobiol Dis. 2013
Hirata et al. Biophys J. 2006
- JPH1GDAP1
JPH1GDAP1
Homeostasis de Ca2+
(genes implicados en SOCE)consideramos…
JPH1: candidato a modificador de GDAP1
JPH1
Merged
Pla-Martín*, Calpena* et al. HMG 2015
→ JPH1 está presente en sistema nervioso
RT-PCR WB
→En tejido…
→A nivel subcelular…
…participar en
homeostasis Ca2+
→ MAMs (Mitochondrial-Associated Membranes)
JPH1 y GDAP1 coinciden en SNP (a nivel tisular) y en las MAMs (a nivel subcelular)
SOCEGDAP1
SOCE (rescate)GDAP1+GDAP1
¿es JPH1 modificador de GDAP1?
En colaboración con Dr. David Pla Martín
Modelo celular: Células SH-SY5Y GDAP1 KD
Pla-Martín et al. Neurobiol Dis. 2013
Experimentos de rescate
(homeostasis de calcio)
JPH1 es un modificador funcional de
GDAP1SOCEGDAP1
SOCE (rescate)GDAP1+JPH1
JPH1 rescata los defectos del SOCE de las células GDAP1 KD
GDAP1 p.R120W/+
JPH1 p.R213P/+
+/+
JPH1 p.R213P/+
GDAP1 p.R120W/+
+/+
+/+
JPH1 p.R213P/+GDAP1 p.R120W/+
+/+
+/+
+/+
Cuadro clínico
más grave
Dr. C. Márquez
Biopsia nervio sural
-Importante depleción de fibras mielinizadas
-Bulbos de cebolla
MRI
Infiltración grasa
Rastreo mutacional en JPH1 en familias CMT2K (GDAP1 p.R120W)
29 pacientes con mutación GDAP1 p.R120W
10 familias españolas no relacionadas
Secuenciación exones codificantes JPH1
JPH1 p.R213P
Posibilidad:
¿JPH1 p.R213P
modificador negativo?
GDAP1 p.R120W/+
JPH1 p.R213P/+
+/+
JPH1 p.R213P/+
GDAP1 p.R120W/+
+/+
+/+
JPH1 p.R213P/+GDAP1 p.R120W/+
+/+
+/+
+/+
GDAP1 p.R120W + JPH1 p.R213P
-Reducción en SOCE
CMT2K
GDAP1 p.R120W
GDAP1
p.R120WJPH1
p.R213P
-Incremento niveles basales Ca2+
JPH1 p.R213P →modificador negativo
GDAP1 p.R120W
Participa en la variabilidad
1º. La variabilidad clínica, tanto intra como interfamiliar, asociada a una enfermedad Mendeliana omonogénica es extensa.
2º. La variabilidad clínica se debe en parte al fondo genético propio del individuo en el que coexistencambios con gran impacto en el fenotipo con otros de baja relevancia.
5º. La tecnología actualmente disponible NGS nos permite conocer mejor el fondo genético de un individuo:identificar cambios nucleotídicos que contribuyen al fenotipo (mutaciones clínicas y modificadoresgenéticos).
3º. En enfermedades con heterogeneidad genética suelen restar genes por descubrir.
4º. Genes con funciones muy diversas pueden conducir a fenotipos clínicos similares cuando están mutados.
8º. Establecer qué cambios son causa primaria es complicado y cuáles son modificadores genéticos es muchomás complejo.
Key points
7º. La gran mayoría de enfermedades genéticas son raras y por tanto, la casuística es escasa.
6º. La forma fehaciente de demostrar que una mutación conduce a una enfermedad es con la descripción demuchos casos con mutaciones en el mismo gen y un cuadro clínico similar.
10º. La baja prevalencia de las enfermedades monogénicas hace que para la identificación demodificadores genéticos se recurra a aproximaciones relacionadas con su fisiopatología.
9º. Los paneles de genes permiten el descubrimiento de genes en tanto que genes conocidos se puedenasociar a fenotipos nuevos, ampliando el espectro clínico de las enfermedades relacionadas a un gen.
Genética y Genómica de EnfermedadesNeuromusculares y Neurodegenerativas
Funding: