UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
DIRETORIA DE GRADUAÇÃO E ENSINO PROFISSIONAL
COORDENAÇÃO DO CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS
LAURA NEVES FACCO
MONIQUE DE PAULA
MURILO HAS
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FISIOLÓGICA DE
LEVEDURAS SUBMETIDAS A PRESERVAÇÃO PROLONGADA
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
PONTA GROSSA
2016
LAURA NEVES FACCO
MONIQUE DE PAULA ROSA
MURILO HAS
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FISIOLÓGICA DE
LEVEDURAS SUBMETIDAS A PRESERVAÇÃO PROLONGADA
Trabalho de Conclusão de Curso de graduação apresentado á disciplina de Trabalho de Diplomação, do Curso Superior de Tecnologia em Alimentos, Coordenação do Curso Superior de Tecnologia em Alimentos – da Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR, como requisito parcial à obtenção do título de Tecnólogo.
Orientadora: Profª. Drª Giovana A. Moura Pietrowski
PONTA GROSSA
2016
TERMO DE APROVAÇÃO
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA E FISIOLÓGICA DE LEVEDURAS SUBETIDAS À PRESERVAÇÃO PROLONGADA
por
LAURA NEVES FACCO
MONIQUE DE PAULA
MURILO HAS
Este Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) foi apresentado no dia 7 de dezembro
de 2016 como requisito parcial para a obtenção do título de Tecnólogo em Alimentos.
Os candidatos foram arguidos pela Banca Examinadora composta pelos professores
abaixo assinados. Após deliberação, a Banca Examinadora considerou o trabalho
aprovado.
_______________________________________ Profa. Dra. Giovana de Arruda Moura Pietrowski
Professora Orientadora
_______________________________________ Profa. Dra. Denise Milléo Almeida
Membro titular
_______________________________________ Profa. Dra. Maria Carolina de Oliveira Ribeiro
Membro titular
- O Termo de Aprovação assinado encontra-se arquivado na Secretaria Acadêmica -
Ministério da Educação Universidade Tecnológica Federal do Paraná
Câmpus Ponta Grossa
Diretoria de Graduação e Educação Profissional Curso Superior de Tecnologia em Alimentos
AGRADECIMENTOS
Agradecemos em primeiro lugar a Deus, pelo dom da vida e por nos dar forças para
nunca desistir de nossos sonhos, mostrando que a perseverança e dedicação são essenciais
para a concretização de nossos objetivos.
Um agradecimento de maneira especial, a nossa Professora e orientadora Giovana de
Arruda Moura Pietrowski, pela oportunidade de participarmos dos projetos de Iniciação
Científica e Estágio, que resultaram no desenvolvimento do presente trabalho, pelo imenso
apoio e dedicação e por nos proporcionar o conhecimento, não apenas racional, mas a
manifestação de caráter e afetividade da educação no processo de formação profissional,
fazendo-nos crescer como profissionais e como pessoas.
A nossa gratidão a professora Juliana V. M. Bittencourt, pelo auxílio na
caracterização molecular das leveduras utilizadas. Agradecemos também as suas orientandas
do mestrado e iniciação científica, de maneira especial a Cláudia e Maryeli, pela
disponibilidade e apoio durante a realização das análises.
Aos amigos que conquistamos durante toda a vivência no laboratório de
microbiologia Andréia, Crislaine, Fran, Jean, Kahtlyn, Lilian, Luciane, Mariane e Valdinéia,
pelo carinho e pelas inúmeras conversas que resultaram em bons risos, mas também em
aprendizagem. Em especial aos amigos e companheiros na realização desse trabalho, que
sempre estiveram presentes nos momentos difíceis e nos momentos de glória.
A professora Denise Milléo, pela assistência e paciência em esclarecer dúvidas e pelo
conhecimento emitido sobre microbiologia.
A esta universidade, sеu corpo docente, direção е administração quе oportunizaram а
janela quе hoje avistamos um horizonte superior, constituído pеlа acendrada confiança nо
mérito е ética aqui presentes.
A nossos pais e nossas famílias, que em mesmo às dificuldades, fizeram a diferença,
pelo amor, incentivo e apoio incondicional, acreditando na conclusão de mais essa etapa de
nossas vidas.
A todos que direta ou indiretamente fizeram parte de nossa formação, o nosso muito
obrigado.
O conhecimento torna a alma jovem e diminui
a amargura da velhice. Colhe, pois, a
sabedoria. Armazena suavidade para o
amanhã.
(Leonardo da Vinci)
RESUMO
FACCO, Laura Neves; ROSA, Monique de Paula; HAS, Murilo. Caracterização
morfológica e fisiológica de leveduras submetidas a preservação prolongada. 2016. 33f.
Trabalho de Conclusão de Curso de Tecnologia em Alimentos - Universidade Tecnológica
Federal do Paraná. Ponta Grossa, 2016.
Leveduras do gênero Hanseniaspora são reconhecidas por sua contribuição aromática para
sidras, fermentados de frutos e vinhos. Para uma boa preservação das culturas de leveduras é
essencial manter as propriedades morfológicas e fisiológicas das estirpes, independentemente
do método de armazenamento escolhido. O congelamento a -80ºC e a liofilização são
métodos muito utilizados para preservação de micro-organismos a longo prazo. O presente
trabalho teve como objetivo avaliar as características fisiológicas e morfológicas de leveduras
utilizadas na indústria de bebidas fermentadas (Hanseniaspora uvarum e Hanseniaspora
guilliermondii), submetidas à conservação por congelamento a -80°C e liofililzação. Foi
realizado teste ecométrico, avaliações morfológicas de crescimento em meio sólido e líquido,
avaliações bioquímicas envolvendo fermentações de carboidratos e testes de assimilação de
diversos compostos e caracterização molecular. Os resultados evidenciaram a seletividade do
meio de cultura Ágar Malte Extrato de Levedura – YMA para as cepas estudadas. No perfil
bioquímico a avaliação das cepas evidenciou diferenças na capacidade de fermentar a glicose
e outros açúcares como também na assimilação de citrato, nitrato e hidrólise do amido,
entretanto todos os demais testes bioquímicos não sofreram variações. Portanto, as
características morfológicas e fisiológicas das cepas de leveduras estudadas, mesmo com
pequenas variações, foram mantidas, garantindo a viabilidade destes micro-organismos para a
produção de compostos aromáticos em bebidas fermentadas, tanto por congelamento a -80ºC,
quanto por liofilização.
Palavras-chave: Hanseniaspora uvarum. Hanseniaspora guilliermondii. Congelamento.
Liofilização.
ABSTRACT
FACCO, Laura Neves; ROSA, Monique de Paula; HAS, Murilo.
Morphological and physiological characterization of yeasts subjected to prolonged
preservation. 2016. 33f. Completion Work of Course of Food Technology - Federal
Technology University Paraná. Ponta Grossa, 2016.
Yeasts of the genus Hanseniaspora are recognized for their aromatic contribution to ciders,
fermented fruits and wines. For good preservation of yeast cultures it is essential to maintain
the morphological and physiological properties of the strains regardless of the storage method
chosen. Freezing at -80 ° C and lyophilization are widely used methods for the long-term
preservation of microorganisms. The objective of the present work was to evaluate the
physiological and morphological characteristics of yeasts used in the fermented beverage
industry (Hanseniaspora uvarum and Hanseniaspora guilliermondii), preserved by freezing at
-80 ° C and lyophilization. Ecometric test, morphological growth assays in solid and liquid
medium, biochemical evaluations involving carbohydrate fermentations and tests of
assimilation of several compounds and molecular characterization were performed. The
results evidenced the selectivity of the culture medium Malt Agar Extract - YMA for the
studied strains. In the biochemical profile the evaluation of the strains showed differences in
the capacity to ferment glucose and other sugars as well as in the assimilation of citrate,
nitrate and starch hydrolysis, however all other biochemical tests did not change. Therefore,
the morphological and physiological characteristics of the strains of yeasts studied, even with
small variations, were maintained, guaranteeing the viability of these microorganisms for the
production of aromatic compounds in fermented beverages, both by freezing at -80ºC and by
freeze-drying.
Key words: Hanseniaspora uvarum. Hanseniaspora guilliermondii. Freezing.
Lyophilization.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Colônias típicas das leveduras em meio Ágar Malte Extrato de Levedura
(YMA)………………………………………………………………………………………..21
Quadro 1- Características morfológicas das colônias de leveduras em Ágar Malte Extrato de
Levedura (YMA), em placas de Petri.......................................................................................22
Quadro 2 - Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e liofilização, em tubos
de ensaio com ágar inclinado....................................................................................................23
Quadro 3 - Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e liofilização em Caldo
Glucose – Peptona – Extrato de levedura (GPBY). .......................................................... 24
Quadro 4 - Perfil Bioquímico das leveduras preservadas por congelamento e liofilização ... 26
Quadro 5 - Resultados da fermentação de carboidratos........................................................28
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 13
2 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 15
2.1 RECUPERAÇÃO DAS CEPAS ............................................................................15
2.2 TESTE ECOMÉTRICO .......................................................................................15
2.3 AVALIAÇÕES MORFOLÓGICAS ......................................................................16
2.4 AVALIAÇÕES FISIOLÓGICAS ..........................................................................17
2.4.1Teste de catalase .................................................................................................17
2.4.2 Teste da utilização do citrato ...............................................................................17
2.4.3 Coloração de gram .............................................................................................17
2.4.5 Hidrólise da gelatina ..........................................................................................18
2.4.6 Teste do indol ....................................................................................................18
2.4.7 Análise da motilidade .........................................................................................19
2.4.8 Teste de redução do nitrato .................................................................................19
2.4.9 Teste da urease ..................................................................................................19
2.4.10 Teste vermelho de metila e voges - proskauer .....................................................20
2.4.11 Fermentação de carboidratos (frutose, glicose, lactose, manitol, sacarose e xilose) ..20
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................................... 21
3.1 RECUPERAÇÃO E AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DAS CEPAS .......................21
3.2 TESTE ECOMÉTRICO .......................................................................................25
3.3 AVALIAÇÃO FISIOLÓGICA (PERFIL BIOQUÍMICO) DAS CEPAS ...................26
CONCLUSÃO ...................................................................................................................... 30
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 31
13
1 INTRODUÇÃO
A descoberta de que as leveduras possuem um papel fundamental na fermentação foi
o primeiro elo entre a atividade dos micro-organismos e as modificações físicas e químicas
nos materiais orgânicos. Estudos bibliográficos citam que várias leveduras produzem uma
infinidade de aromas que melhoram a qualidade sensorial dos produtos. Embora existam
muitos métodos para a síntese química de bioaromas, uma série de esforços tem sido realizada
para desenvolver a produção natural dos aromas, utilizando diversas vias biotecnológicas,
dentre elas, a via fermentativa e a via enzimática, métodos que são ecologicamente corretos e
menos poluentes, atendendo a exigência de uma gama de consumidores que preferem
produtos naturais, em vez de seus correspondentes químicos (FAITH et al 1991 ; XIÃO &
XU, 2007).
Segundo Viana et al, 2009; Moreira et al ,2005, Xu et al., 2006 ; Xufre et al, 2006
(apud Pietrowski et al, 2015) o gênero Hanseniaspora mostra uma contribuição aromática
para sidras, fermentados de frutos e vinhos, devido à produção de ésteres que fornecem estas
bebidas notas sensoriais como frutado e / ou floral. De acordo com Girão et al. (2004) , uma
boa preservação das culturas de leveduras se torna essencial para estudos futuros sendo
necessário manter as mesmas propriedades morfológicas e fisiológicas das estirpes,
independentemente do método de armazenamento escolhido.
Para tanto, a manutenção e preservação das culturas deve ser realizada garantindo a
sobrevivência do micro-organismo, bem como conservando propriedades morfológicas,
fisiológicas, características genéticas e pureza dos isolados por longos períodos de tempo
(CANHOS et al, 2004).
A escolha da forma mais adequada de conservação deve levar em conta à finalidade
desta manutenção, o custo, a disponibilidade de material e espaço, além da eficácia de tal
método na manutenção (KIRSOP & SNELL, 1984; HAWKSWOTH, 1985; ABADIAS et al,
2006).
Como uma forma bastante utilizada para preservação de micro-organismos está o
congelamento em nitrogênio líquido ou em ultra-freezer. O preparo das culturas para o
congelamento apresenta procedimentos simples e fáceis (KURTZMAN et al, 2003). A
liofilização também se apresenta como uma das técnicas mais eficientes para a manutenção de
micro-organismos, justamente por garantir a viabilidade dos agentes por longos períodos
(SOLA et al, 2012).
14
Tanto o congelamento quanto a liofilização são técnicas frequentemente utilizadas
para preservação e estocagem de material biológico, não somente pela qualidade
microbiológica dos materiais armazenados, mas também porque permitem uma redução
drástica do tempo gasto em transferência de culturas (ROBERT et al, 2006).
A escolha do método de manutenção mais adequado deve ser baseada nas
características do agente em estudo, assim como, pelas vantagens e desvantagens de cada
técnica disponível. O alvo de qualquer método de manutenção está em preservar a viabilidade
e principalmente proporcionar estabilidade genética do microrganismo, pelo maior tempo
possível, evitando assim a formação excessiva de mutações que alterem suas características
(SOLA et al, 2012).
Assim, o presente trabalho tem como objetivo realizar a caracterização fisiológica e
morfológica de leveduras utilizadas na indústria de bebidas fermentadas (Hanseniaspora
uvarum e Hanseniaspora guilliermondii), submetidas a conservação por congelamento a -
80°C e liofililzação.
15
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 RECUPERAÇÃO DAS CEPAS
Foram coletadas cepas congeladas e liofilizadas do Banco de Cepas no Laboratório
de Microbiologia da UTFPR-PG, armazenadas há sete anos. As cepas de H. uvarum e H.
guilliermondii tanto congeladas quanto liofilizadas, foram recuperadas em dois momentos:
setembro de 2015 e em junho de 2016, para a realização das avaliações propostas.
Para a recuperação das cepas congeladas, foram coletadas assepticamente 0,5 mL do
criotubo depois de descongelado, e adicionadas em tubos de ensaio contendo 8,5 mL de água
peptonada 0,1% e 1 mL de glicose. As cepas congeladas foram homogeneizadas em
equipamento Vórtex Mixer (MODEL KMC – 1300V) e deixadas em repouso por 30 minutos.
Decorridos os 30 minutos, foi transferido 1 mL da solução obtida para tubos de ensaio
contendo 9mL de caldo Glucose – peptona – extrato de levedura (GPBY), e incubados à 30ºC
em Estufa Bacteriológica (Quimis Pat. 34200022) por 24 horas (PIETROWSKI et al, 2015).
Para as cepas liofilizadas, foram pesadas 0,007 mg das mesmas, e colocadas em
tubos de ensaio contendo 9 mL de água peptonada 0,1% e 1 mL de glicose. As cepas
liofilizadas foram homogeneizadas e incubadas seguindo o mesmo procedimento realizado
com as cepas congeladas a -80ºC (PIETROWSKI et al, 2015).
Após a recuperação das cepas em caldo GPBY, foi realizada semeadura em Ágar
Malte e Extrato de Levedura (YMA), por meio do método de estriamento descontínuo, e
incubação em estufa bacteriológica à 30ºC por 24 horas, para a obtenção de colônias típicas e
isoladas (PIETROWSKI et al, 2015).
2.2 TESTE ECOMÉTRICO
Para o teste ecométrico, foi utilizado o meio de cultura Àgar Malte Extrato de
Levedura (YMA) e Ágar Cetrimide com as respectivas cepas: Hanseniaspora uvarum e
Hanseniaspora guilhermondii (cepas desejadas), Staphylococcus aureus, Salmonella thyphi e
Pseudomonas aeruginosa (cepas não desejadas).
Foram preparadas 8 placas de Petri estéreis, sendo 4 placas com aproximadamente 20
mL de YMA e 4 placas com aproximadamente 20 mL de Ágar Cetrimide. Após a
solidificação dos meios foi realizado a inoculação a partir de uma alçada de 0,001 mL de cada
16
cepa em seu caldo específico. Para as cepas não desejadas foi utilizado Caldo Nutriente e para
as cepas desejadas foi utilizado Caldo Glucose – peptona – extrato de levedura (GPBY).
Cada placa foi divida em 4 quadrantes e foram feitas 5 estrias em cada quadrante e uma estria
no centro da placa. As placas foram incubadas a 30ºC por 48 horas (MOSSEL et al, 1983).
Para a interpretação dos resultados, foi calculado o Índice de Crescimento Absoluto
(ICA). O cálculo foi realizado atribuindo um valor de 0,2 (precisão do método) a cada estria, e
multiplicado pelo número de estrias onde foi observado crescimento. Para o ICA, foram
considerados como critérios de avaliação a produtividade e a seletividade. Para a
produtividade, as cepas desejadas em meio de cultivo não seletivo deveriam ter ICA pelo
menos igual a 3,5. Para a seletividade, as cepas não desejadas em meio seletivo não deveriam
ter ICA maior que 2; e para as cepas desejadas o ICA não deveria ser menor que 2 (MOSSEL
et al, 1983).
2.3 AVALIAÇÕES MORFOLÓGICAS
As cepas de leveduras obtidas em caldo Glucose – peptona – extrato de levedura
(GPBY) foram inoculadas por estriamento descontínuo em placas de Petri contendo Ágar
Malte e Extrato de Levedura (YMA) e incubadas a 30°C por 48 horas. As colônias isoladas
foram observadas em contador de colônia (Phoenix, CP 600 plus) e analisadas quanto ao
tamanho (grande – 5mm, média – 2 a 5mm e pequena – 2mm), forma (circular, irregular,
rizoide, filamentosa ou puntiforme), elevação (côncava, elevada, ondulada, protuberante,
achatada ou convexa) bordos (lisos, lacerados, lobados, filamentosos ou ondulados), estrutura
(lisa, granulosa, filamentosa ou rugosa), brilho (transparente, translúcida ou opaca) cor
(incolor, branca ou pigmentada) (MADIGAN et al, 2010).
As leveduras presentes em caldo Glucose – peptona – extrato de levedura (GPBY)
foram inoculadas por estriamento contínuo em tubos de ensaio contendo Ágar Malte e Extrato
de Levedura (YMA) inclinado, com bisel longo, sendo incubados a 30°C por 48 horas. O
crescimento foi analisado quanto à forma (difusa, espalhada ou equinulado), quantidade
(escasso, abundante ou moderado), brilho (brilhante e sem brilho), cor (colorido ou sem cor).
Os inóculos obtidos em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
observados quanto ao aspecto (turvo ou não turvo), sedimento (com ou sem sedimento), tipo
de sedimento (granulado, feculento ou mucoide), película (com ou sem película na
17
superfície), tipo da película (resistente, frágil, lisa, rugosa, aderente as paredes do tubo) e com
ou sem anel nas paredes do tubo (MADIGAN et al, 2010).
2.4 AVALIAÇÕES FISIOLÓGICAS
2.4.1 Teste de catalase
As cepas presentes em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
inoculadas por estriamento descontínuo em placas de Petri contendo Ágar Malte Extrato e
Levedura (YMA) e incubadas a 30°C por 48 horas. Em seguida, foi transferida uma colônia
pura em lâmina de vidro e adicionado 3 gotas de peróxido de hidrogênio 3%. O resultado
positivo mostra borbulhamento imediato e o resultado negativo não apresenta borbulhamento
(SILVA et al, 2010).
2.4.2 Teste da utilização do citrato
As cepas presentes no caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
inoculadas em tubos de ensaio contendo Ágar Citrato de Simmons, em forma de bisel longo, e
incubadas a 35ºC por 48 horas. O resultado positivo mostra o crescimento na rampa do meio
de cultivo com viragem alcalina do indicador, com alteração da cor verde para azul e o
negativo sem crescimento e sem alteração de cor (SILVA, 1996).
2.4.3 Coloração de Gram
As cepas presentes em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
inoculadas por estriamento descontínuo em placas de Petri contendo Ágar Malte Extrato e
Levedura (YMA) e incubadas a 30°C por 48 horas. A partir das colônias isoladas foi realizada
a coloração. Micro-organismos Gram positivos apresentam coloração roxa e Gram negativos
são vermelhos (SILVA et al, 2010).
18
2.4.4 Hidrólise do Amido
As cepas presentes em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
inoculadas por picada, com auxílio de fios de platina em placas de Petri contendo o Meio
Ágar Amido adicionado de 1% de Iodo e 2% de Iodeto de potássio, sendo incubadas a 37°C
por 48 horas. O resultado positivo mostra a hidrólise do amido pela formação de halo
transparente ao redor da colônia e o resultado negativo não há formação de halo (SILVA et al,
2010).
2.4.5 Hidrólise da Gelatina
As cepas presentes em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
inoculadas por picada, com auxílio de fios de platina, em tubos de ensaio com Ágar Gelatina a
12%, até a profundidade de 1 cm e incubados a 37ºC por 24 horas. Após incubação foram
retirados e colocados em banho de gelo por 10 minutos. O resultado positivo mostra a
liquefação do meio de cultura e no resultado negativo o meio se mantém sólido (MADIGAN
et al, 2010).
2.4.6 Teste do Indol
As cepas presentes em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
inoculadas com uma alçada em tubos de ensaio com caldo triptona e incubados a 35°C por 24
horas. Após a incubação, foi transferido uma alíquota de 5 mL da cultura para um tubo estéril
vazio e adicionado 5 gotas do reagente de Kovacs, e em seguida, agitado levemente. O
resultado positivo mostra o desenvolvimento de anel vermelho – violeta na superfície do
meio. A permanência do anel na cor amarela indica resultado negativo. (MADIGAN et al,
2010).
19
2.4.7 Análise da Motilidade
As cepas presentes em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
inoculadas em tubo de ensaio com Ágar Motilidade, por picada no centro do meio até a
profundidade de 1 cm e incubados a 30°C por 24 horas. O resultado positivo mostra o
crescimento fora da linha de inoculação e o negativo se restringe a linha da picada
(MADIGAN et al, 2010).
2.4.8 Teste de redução do nitrato
As cepas presentes em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
inoculadas com uma alçada em tubos de ensaio com caldo nitrato e tubo de Durhan
invertidos, sendo incubados a 35°C por 48 horas. O resultado positivo apresenta a formação
de gás nos tubos de Durhan. Não ocorrendo a produção de gás, foi adicionado 5 gotas da
solução de 0,6% de α-naftol e 5 gotas da solução de 0,8% de ácido sulfanílico e agitado
delicadamente os tubos. O desenvolvimento da cor vermelha entre 1 a 2 minutos indicava
resultado positivo (presença de nitrito), se não era adicionado 20 mg de pó de zinco aos tubos
contendo as soluções de α-naftol e ácido sulfanílico. O desenvolvimento da cor vermelha
entre 5 a 10 minutos indica redução de nitrato a nitrito pelo zinco resultando em negativo. O
não desenvolvimento da cor vermelha indica ausência de nitrato no meio, resultando em
positivo (SILVA, 1996).
2.4.9 Teste da Urease
As cepas presentes em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
inoculadas com uma alçada em tubo de ensaio com caldo uréia de Christensen, sendo
incubados a 37 ºC por 24 horas. O resultado positivo mostra a viragem alcalina do indicador,
com alteração da cor do meio de alaranjado para cor rosa escuro, o que indica que o micro-
organismo produz a enzima urease, responsável pela decomposição da uréia em amônia. No
resultado negativo há permanência da cor original (SILVA et al, 2010).
20
2.4.10 Teste Vermelho de metila e Voges - Proskauer
As cepas presentes em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
inoculadas com uma alçada leve em tubos de ensaio com Caldo Vermelho de Metila e Voges-
Proskauer (VM-VP) e incubados a 35°C por 48 horas, com tampas levemente desrosqueadas.
Para teste de Voges Proskauer (VP) foi adicionado 2,5 mL da cultura, 6 gotas de
solução alcoólica de 5% de α -naftol e 2 gotas de solução 40% de hidróxido de potássio,
sendo o tubo agitado por 30 segundos a 1 minuto, para introduzir oxigênio atmosférico e
promover a oxidação da acetoína. O resultado positivo, após 15 minutos, há o aparecimento
de cor vermelha ou rosa escuro na superfície do meio e a permanência da cor amarela indica
resultado negativo.
O teste de Vermelho de Metila foi realizado após 96 horas de incubação, sendo
adicionado 2,5 mL da cultura e 5 gotas de solução vermelho de metila. O resultado positivo
mostra alteração do meio para a cor vermelha e o resultado negativo há permanência da cor
amarela. O surgimento de uma cor alaranjada indica reação lenta (SILVA, 1996).
2.4.11 Fermentação de Carboidratos (frutose, glicose, lactose, manitol, sacarose e xilose)
As cepas presentes em caldo Glucose – peptona - extrato de levedura (GBPY) foram
inoculadas em tubos de ensaio com Ágar Vermelho de Fenol suplementado com os
carboidratos testados (frutose, glicose, lactose, manitol, sacarose e xilose), sendo incubados a
35°C por 48 horas. O resultado positivo mostra a viragem ácida do indicador da cor de
vermelho alaranjado para amarelo e o negativo há a viragem alcalina para a cor rosa escura
(SILVA, 1996).
21
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1 RECUPERAÇÃO E AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA DAS CEPAS
Foram recuperadas cepas congeladas e liofilizadas, até a obtenção de colônias típicas
(Figura 1).
(A) (B)
(C) (D) Nota - Colônia A – Hanseniaspora uvarum congelada a -80ºC; Colônia B - Hanseniaspora uvarum liofilizada;
Colônia C - Hanseniaspora guilliermondii congelada a -80ºC; Colônia D - Hanseniaspora guilliermondii
liofilizada.
Figura 1 – Colônias típicas das leveduras em meio Ágar Malte Extrato de Levedura (YMA).
Fonte: Autoria própria, 2016.
Foi observado o crescimento em placas e verificado que as quatro cepas em estudo,
apesar de serem preservadas por métodos distintos, apresentaram aspectos semelhantes, como
coloração das colônias, tamanho e forma.
22
As avaliações morfológicas mostram que todas as leveduras recuperadas nos dois
momentos (setembro de 2015 e em junho de 2016), tanto congeladas quanto liofilizadas,
apresentam características brancas, opacas e com bordos lisos (Quadro1).
Leveduras
Morfologia das colônias de leveduras preservadas
por congelamento e liofilização
Tamanho Forma Elevação Bordos Estrutura Brilho Cor
H.
uva
rum
Cong. (1) Pequena Circular Achatada Lisos Lisa Opaca Branca
Cong. (2) Pequena Circular Achatada Lisos Lisa Opaca Branca
Liof. (1) Pequena Circular Achatada Lisos Lisa Opaca Branca
Liof. (2) Pequena Circular Achatada Lisos Lisa Opaca Branca
H.
guil
lier
mondii
Cong. (1) Pequena Circular Achatada Lisos Lisa Opaca Branca
Cong. (2) Pequena Circular Convexa Lisos Lisa Opaca Branca
Liof. (1) Média Circular Achatada Lisos Lisa Opaca Branca
Liof. (2) Pequena Circular Convexa Lisos Lisa Opaca Branca
Nota: (1) – cepas recuperadas em set/2015; (2) – cepas recuperadas em jun/2016; (Cong.) – cepas congeladas;
(Liof.) – cepas liofilizadas; Pequena (2 mm); Média (3mm a 5 mm); Grande (maior que 5 mm).
Quadro 1- Características morfológicas das colônias de leveduras em Ágar Malte Extrato de Levedura
(YMA), em placas de Petri.
Fonte: autoria própria, 2016.
Todas as cepas de leveduras congeladas e liofilizadas apresentaram crescimento em
ágar inclinado com características filiforme e branca (Quadro 2).
23
Leveduras
Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e
liofilização, em tubos de ensaio com ágar inclinado.
Forma Quantidade Brilho Cor
H.
uva
rum
Cong. (1) Filiforme Moderado Brilhante Branca
Cong. (2) Filiforme Moderado Brilhante Branca
Liof. (1) Filiforme Moderado Brilhante Branca
Liof. (2) Filiforme Moderado Brilhante Branca
H.
gu
illi
erm
on
dii
Cong. (1) Filiforme Escasso Brilhante Branca
Cong. (2) Filiforme Escasso Brilhante Branca
Liof. (1) Filiforme Escasso Brilhante Branca
Liof. (2) Filiforme Escasso Brilhante Branca
Nota: (1) – cepas recuperadas em set/2015; (2) – cepas recuperadas em jun/2016; (Cong.) – cepas congeladas;
(Liof.) – cepas liofilizadas
Quadro 2 - Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e liofilização, em tubos de ensaio
com ágar inclinado.
Fonte: autoria própria, 2016.
Todas as cepas de leveduras tanto liofilizadas quanto congeladas apresentaram as
mesmas características em crescimento em Caldo GPBY (Glucose – peptona – extrato de
levedura) sendo, turbidez, com sedimento feculento, sem película na superfície e sem
desenvolvimento de anel na parede do tubo. (Quadro 3).
24
Leveduras
Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e liofilização
em Caldo Glucose – Peptona – Extrato de levedura (GPBY)
Aspecto Sedimento Película Anel
H.
uva
rum
Cong. (1) Turvo Feculento Sem película Sem anel
Cong. (2) Turvo Feculento Sem película Sem anel
Liof. (1) Turvo Feculento Sem película Sem anel
Liof. (2) Turvo Feculento Sem película Sem anel
H.
gu
illi
erm
on
dii
Cong. (1) Turvo Feculento Sem película Sem anel
Cong. (2) Turvo Feculento Sem película Sem anel
Liof. (1) Turvo Feculento Sem película Sem anel
Liof. (2) Turvo Feculento Sem película Sem anel
Nota: (1) – cepas recuperadas em set/2015; (2) – cepas recuperadas em jun/2016; (Cong.) – cepas congeladas;
(Liof.) – cepas liofilizadas
Quadro 3 - Crescimento das leveduras preservadas por congelamento e liofilização em Caldo Glucose –
Peptona – Extrato de levedura (GPBY).
Fonte: autoria própria, 2016.
Pietrowski et al (2015) em seu trabalho verificou que as leveduras do gênero
Hanseniaspora uvarum conservadas por liofilização, se apresentam como esbranquiçadas,
com bordos lisos e brilhantes. No presente estudo, foi possível a identificação dessas
características relacionadas a este gênero de levedura, porém, houve distinção com o autor, na
característica de brilhante para opaca.
Segundo dados da Viticulture and Enology (2016), as leveduras do gênero
Hanseniaspora guilliermondii apresentam suas colônias cremosas, lisas brilhantes e
convexas. Com relação a característica colonial, as cepas de leveduras apresentaram
resultados semelhantes aos dados da literatura para o aspecto “lisa e convexa”. De acordo com
Kurtzman & Fell (1998), o aspecto colonial das cepas pertencentes ao gênero Hanseniaspora
guilliermondii, coincidem com os resultados obtidos, diferenciando apenas a característica de
opaca para brilhante.
As cepas de leveduras analisadas apresentaram características morfológicas
semelhantes revelando que não houve alterações nestas características dentro de um prazo de
nove meses sob conservação por congelamento a -80ºC e liofilização.
25
3.2 TESTE ECOMÉTRICO
O teste ecométrico foi realizado e foi observado que o meio de cultura Àgar Malte
Extrato de Levedura (YMA) se mostrou como seletivo e produtivo como pode ser observado
com os dados da tabela 1.
Tabela 1. Índice de Crescimento Absoluto (ICA) considerando a
Produtividade e Seletividade por meio do Teste Ecométrico
Nota: A - H. uvarum congelada; B – H. uvarum liofilizada; C – H. guilliermondii congelada; D – H.
guilliermondii liofilizada.
Conforme apresenta a tabela 1, o meio (YMA) quanto a sua produtividade e sua
seletividade, se mostrou eficiente pois as cepas desejadas (A, B, C e D) tiveram ICA com
valores iguais a 5, enquanto que as cepas não desejadas (Salmonella thypi, S.aureus e P.
aeruginosa) tiveram ICA de valor 0. Segundo Gelli et al (2003), para um meio ser
considerado produtivo, o ICA deve ser ao menos 3,5 e para ser considerado seletivo, as cepas
desejadas devem ter ICA maior que 3,0 e cepas não desejadas, menor que 2,0.
Gelli et al (2003) ao realizar o controle de qualidade em laboratório de microbiologia
de alimentos e avaliação de desempenho de meios de cultura no isolamento de Salmonella
spp. utilizou como método o teste ecométrico e verificou que testes ecométricos, de
seletividade e produtividade e de recuperação demonstraram a adequacidade geral dos meios
de cultura usados nas diferentes etapas analíticas de seu estudo, enfatizando assim, a
Seletividade e Produtividade
Meio Ágar Malte
Extrato de Levedura (YMA)
Meio Ágar Cetrimide
Micro-organismo ICA Micro-organismo ICA
A 5 A 0
B 5 B 0
C 5 C 0
D 5 D 0
Salmonella thypi 0 Salmonella thypi 0
S. aureus 0 S. aureus 0
P. aeruginosa 0 P. aeruginosa 1
26
importância e confiabilidade do teste. Neste sentido, o teste ecométrico realizado no presente
estudo mostrou a eficiência do Ágar Malte Extrato de Levedura para H. uvarum e H.
guilliermondii.
3.3 AVALIAÇÃO FISIOLÓGICA (PERFIL BIOQUÍMICO) DAS CEPAS
Todas as cepas de leveduras apresentaram coloração de Gram negativa e resultados
positivos para produção de catalase, indicando que são capazes de converter o H2O2 em água
e oxigênio gasoso. (Quadro 4)
Nota: 1 – cepas recuperadas em set/2015; 2 – cepas recuperadas em jun/2016; (+) positivo; (-) negativo.
Quadro 4 - Perfil Bioquímico das leveduras preservadas por congelamento e liofilização
Fonte: autoria própria, 2016.
As leveduras são tradicionalmente caracterizadas, classificadas e identificadas
utilizando características morfológicas e fisiológicas. Para a identificação específica, estudos
bioquímicos e de exigências nutricionais são mais relevantes que traços morfológicos e
sexuais, os quais são importantes na determinação genérica (PHAFF, 1990).
Perfil Bioquímico das Leveduras
Leveduras
H. uvarum H. guilliermondii
Cong.
(1)
Cong.
(2)
Liof.
(1)
Liof.
(2)
Cong
(1)
Cong
(2)
Liof.
(1)
Liof.
(2)
Coloração de Gram - - - - - - - -
Citrato - + + + - - + +
Nitrato + + + + - - - -
V. Proskauer + - - - - - + -
V. Metila - - - - - - - -
Indol - - - - - - - -
Motilidade - - - - - - - -
Hid. Amido + - + + + - + -
Hid. Gelatina - - - - - - - -
Catalase + + + + + + + +
Urease - - - - - - - -
27
Para os testes de Vermelho de Metila, Indol, Motilidade, Hidrólise da Gelatina,
Catalase e Urease, as leveduras apresentaram resultados semelhantes, não evidenciando
alterações em relação aos testes mencionados e à diferença de métodos de conservação e de
espécies.
No teste do Citrato, as cepas H. uvarum congelada (1) e H. guilliermondii congelada
(1 e 2) apresentaram resultado negativo, enquanto que as demais foram positivas para
utilização do citrato, demonstrando que são capazes de utilizar o citrato como única fonte de
carbono para seu crescimento. Assis et al (2012), ao realizar uma série de testes fisiológicos
em leveduras isoladas uvas Vitis vinifera L. verificou que leveduras do gênero
Hanseniaspora, não assimilam o citrato. Essa afirmação mostra-se divergente com os
resultados obtidos no presente estudo.
A capacidade de reduzir o nitrato em nitrito foi verificada apenas pelas cepas de H.
uvarum tanto congeladas quanto liofilizadas (Quadro 4). Neste processo, o micro-organismo
consegue suprir a ausência do oxigênio atmosférico derivando-o do nitrato (SILVA, 1996).
Segundo dados da Viticulture & Enology, as leveduras Hanseniaspora uvarum e
Hanseniaspora guilliermondii não assimilam o nitrato, sendo consideradas como aeróbicas.
Tal afirmação não condiz com os resultados apresentados pelas cepas do gênero
Hanseniaspora uvarum neste trabalho.
No teste de Voges-Proskauer apenas as leveduras H. uvarum congelada (1) e H.
guilliermondii liofilizada (1); mostraram capacidade de produzir butilenoglicol, como
resultado do produto final da fermentação da glicose. O que se confirma pela capacidade de
fermentar a glicose pelas leveduras H. uvarum congelada (1 e 2), H. uvarum liofilizada (2) e
H. guilliermondii liofilizada (1 e 2) (Quadro 5).
A hidrólise do amido foi verificada apenas pelas cepas H. uvarum congelada (1), H.
uvarum liofilizada (1 e 2), H. guilliermondii congelada e liofilizada (1), portanto, capazes de
hidrolisar o amido em carboidratos menores (Quadro 4). Este aspecto também foi observado
por Crestani (2007), que ao isolar e caracterizar leveduras de uma madeireira verificou que as
pertencentes ao gênero Hanseniaspora sp. não são capazes de utilizar o amido como única
fonte de carbono. Contudo, o crescimento dessas cepas foi variável, indicando como causa a
diferença na atividade amilolítica, seja pela especificidade das enzimas ao substrato amiláceo
ou pela acessibilidade das enzimas aos grânulos de amido.
Todas as leveduras apresentaram a capacidade de hidrolisar a uréia formando duas
moléculas de amônia pela ação da enzima urease, mas não hidrolisaram a gelatina em
aminoácidos, ou seja, não possuem a enzima gelatinase (Quadro 4). As cepas de leveduras por
28
meio da ação enzimática, fizeram a decomposição da uréia em fontes de nitrogênio, sendo de
grande importância para o crescimento microbiano.
No quadro 5, são apresentados os resultados da fermentação de carboidratos pelas
leveduras.
Nota: 1 – cepas recuperadas em set/2015; 2 – cepas recuperadas em jun/2016; (+) positivo; (-) negativo.
Quadro 5. Resultados da fermentação de carboidratos
Fonte: Autoria própria, 2016.
Todas as leveduras apresentaram diferenças nos resultados referentes à fermentação de
carboidratos quando comparadas entre si. Assis et al (2012) evidencia que as leveduras
Hanseniaspora fermentam a glicose. Essa afirmação relatada pelo autor não apresenta
concordância com os resultados obtidos com as cepas H. uvarum liofilizada (1) e H.
guilliermondii congelada (1 e 2) (Quadro 5). No entanto, a capacidade de fermentar a glicose
referente à cepa H. uvarum liofilizada, sugere erro operacional, uma vez que a cepa passa a
“ganhar” esta capacidade fermentativa, evidenciando uma incoerência de resultado. Com
relação à fermentação do manitol, sacarose e xilose, para a cepa H. guilliermondii recuperada
nos dois momentos, se observa o mesmo fato.
A capacidade fermentativa da frutose e lactose foi observada em todas as cepas, com
exceção das leveduras H. guilliermondii congeladas (1 e 2). Com base nos dados descritos por
Kurtzman e Fell (1998), as leveduras Hanseniaspora uvarum fermentam glicose e não
Fermentação de Carboidratos
Leveduras
H. uvarum H. guilliermondii
Cong.
(1)
Cong.
(2)
Liof.
(1)
Liof.
(2)
Cong.
(1)
Cong.
(2)
Liof.
(1)
Liof.
(2)
Frutose + + + + - - + +
Glicose + + - + - - + +
Lactose + + + + - - + +
Manitol - - - + - - - +
Sacarose - - - + - - - +
Xilose - - - + - - - +
29
fermentam a lactose. Os resultados apresentados mostram concordância para a fermentação da
glicose, porém diferem na fermentação da lactose.
Crestani (2007) apresenta em seu trabalho as características bioquímicas de leveduras
Hanseniaspora sp. e demonstra que essas leveduras fermentam a glicose e não fermentam a
xilose e o manitol. No presente estudo, todas as cepas apresentam anuência com os dados
apresentados pelo autor em relação a fermentação da xilose e manitol, com ressalva para as
cepas H. uvarum liofilizada (2) e H. guilliermondii liofilizada (2).
Diferenças na assimilação e na fermentação de compostos de carbono são critérios
importantes na taxonomia e identificação de leveduras, pois estes microrganismos apresentam
uma variação diversificada na habilidade de fermentação de açúcares (GUIMARÃES, 2005).
Portanto o perfil bioquímico das leveduras em estudo apresenta variâncias quando
comparado com dados da literatura e de vários autores, sugerindo que a causa das diferenças
fisiológicas seja devido à agressividade que os métodos de conservação empregados
causaram, uma vez que essas leveduras foram conservadas por congelamento a -80ºC e por
liofilização.
Segundo Sola et al (2012) a criopreservação (congelamento a -80ºC) requer alguns
cuidados para que seja realmente eficiente e que apesar da liofilização ser amplamente
empregada na manutenção de diferentes micro-organismos e ser considerada uma técnica de
conservação a longo prazo, as etapas que compõem o processo são capazes de causar injúrias
ou danos celulares. Esses fatores podem afetar a viabilidade e estabilidade celular, sendo
decorrentes principalmente do comportamento da água sob condições de baixas temperaturas,
tendo como exemplo mais frequente, a crioinjúria (lesão celular causada durante os processos
de congelamento e descongelamento), ocasionando alterações nas estruturas da membrana
plasmática dos micro-organismos preservados.
Os resultados apresentados na literatura foram comparados com os resultados obtidos
não considerando a linhagem das cepas utilizadas. Sugerindo que as características
morfológicas e fisiológicas sofrem variações advindas também da diferença de linhagem
dessas cepas.
Comparando os métodos de conservação em que as leveduras estavam submetidas, se
observa que ambos foram eficientes para a preservação da viabilidade das estirpes estudadas,
assim para a escolha do método seria necessário pensar no custo de armazenamento, que para
liofilização não existe, enquanto para o congelamento a -80ºC resulta no custo com energia
elétrica. Por outro lado, o pesquisador nem sempre dispõe do liofilizador, tornando o
congelamento a -80ºC, mais viável neste caso. Entretanto, pensar em manter, estocar e
30
preservar coleções significa assegurar um patrimônio de culturas e bancos genéticos com
atenção à morfologia, fisiologia, respostas celulares e teciduais. A variabilidade das
populações microbianas determina a comparação experimental quanto ao melhor método,
melhor temperatura e período de tempo para condições específicas, ou a combinação de dois
ou mais métodos (SOLA et al, 2012).
CONCLUSÃO
Foi observada a seletividade do meio de cultura Ágar Malte Extrato de Levedura –
YMA para as cepas H. uvarum e H. guilliermondii tanto congeladas quanto liofilizadas.
A avaliação morfológica das cepas, não mostrou distinção das características
apresentadas com dados descritos na literatura, apresentando suas colônias brancas, opacas e
com bordos lisos.
A avaliação fisiológica das cepas evidenciou diferenças na capacidade de fermentar a
glicose e outros açúcares, como também na assimilação de citrato, nitrato e hidrólise do
amido. Entretanto, todos os demais testes bioquímicos não sofreram variações, mostrando que
o congelamento a -80ºC e a liofilização em que as cepas foram submetidas foram eficientes
preservando suas características por um período de nove meses.
As características morfológicas e fisiológicas das cepas de leveduras estudadas
mesmo com pequenas variações, foram mantidas, garantindo a viabilidade destes micro-
organismos para a produção de compostos aromáticos em bebidas fermentadas, tanto por
congelamento a -80ºC, quanto por liofilização, mostrando que os dois métodos foram
eficientes para garantir a viabilidade e características das leveduras H. uvarum e H.
guilliermondii.
31
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