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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 1
CHMI 2227FBiochimie I
Enzymes:- Cinétique
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 2
Réactions enzymatiques
Enzyme (chacun = 1 µmol)
Substrat (chacun = 1 µmol)
Ce sont les seules concentrations que l’on connait pcq nous préparons l’expérience.
X min Produit
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 3
Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on l’activité enymatique?
1. Détection du produit: pNA = para-nitroaniline Absorbe à 405 nm
H3+N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-OH
O O O O
CH2
COO-
CH2
CH2
COO-
CHCH3H3C
CH2
COO-
NO2H2N
pNA (jaune)
H3+N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-
O O O O
CH2
COO-
CH2
CH2
COO-
CHCH3H3C
CH2
COO-
NO2DEVD-pNA(incolore)
DEVD(incolore)
Caspase 3 (protéasehydrolase)Mesure l’augmentation
de A405nm
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 4
Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on l’activité enymatique?
2. Accumulation/utilisation d’un cofacteur: NADH = absorbe fortement à 340 nm ( = 6.3 molL-1cm-1 ) NAD+ = n’absorbe pas à 340 nm
Mesure l’augmentation de A340nm
Mesure la diminution de A340nm
Lactate dehydrogenase
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 5
Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on l’activité enymatique?
3. Réactions enzymatiques couplées: Très utiles lorsque ni le substrat/produit/cofacteur ne peut être
facilement détecté;
Glutaminase
+ NH4+
1ière réaction
Mesure l’augmentation
de A340nm
GlutamateDehydrogenase
+ NAD+ + NADH +H+
2ième réaction
+ NH4++ H2O
Peut être détecté parHPLC (peu pratique)
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 6
Réactions enzymatiques
1 min
3 µmol / min Vitesse de la réaction
15 µmol S vs 1 µmol E
Temps
[Pro
duit]
Pente = vitesse initiale = v0 = [P] / time
2 min
3 µmol / min
4 min
<3 µmol / min
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 7
Réactions enzymatiques
Temps
[Pro
duit]
v0 est proportionnel à [E]
1µmol E
2µmol E
3µmol E
1 min
3 µmol / min
15 µmol S vs 1 µmol E
1 min
6 µmol / min
15 µmol S vs 2 µmol E
1 min
9 µmol / min
15 µmol S vs 3 µmol E
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 8
Réactions enzymatiques
1 min
2 µmol / min
1 µmol / min
1 min
3 µmol / min
1 min
[Substrat]
v 0
Vitesse maximale = Vmax
Vmax
½ Vmax
E saturé par S
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 9
Réactions enzymatiques
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 10
Équation de Michaelis-Menten
[Substrat]v 0
Vitesse maximale = Vmax
Vmax
½ Vmax
E + S ES E + Pk2
k1
k-1
RAPIDE LENT
vo = Vmax [S] Km + [S]
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 11
Équation de Michaelis-Menten
[Substrat]
v 0
Vmax
½ Vmax
Km1 Km2
E2
E1
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 12
Km
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 13
Turnover number
E + S ES E + Pk2
k1
K-1
RAPIDE LENT
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 14
Mesure de Km et Vmax
[Substrate]
v 0
Vmax
½ Vmax
Km
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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 15
Mesure de Km et Vmax
1/vo
1/[S]
1/Vmax
-1/Km
Graphe de Lineweaver-Burk
1 vo
= Km x 1 + 1
Vmax [S] Vmax