Download - Cours Aa2 Cml Paces 17sept-2013
I- Généralités!!
II- Les différents acides aminés!!II-1 Les acides aminés courants!
!II-2 Les acides aminés rares !!
III- Propriétés acido-basiques des acides aminés !!III-1 Ionisation/dissociation!!III-2 Courbes de titration acides aminés à chaîne latérale non ionisable!
!III-3 Courbes de titration acides aminés à chaîne latérale ionisable !!
IV- Autres propriétés des acides aminés !!!IV-1 Propriétés physiques!!IV-2 Réaction à la ninhydrine!
!
V- Rôle Biologique des acides aminés!!V-1 Intermédiaires métaboliques!!V-2 Précurseurs!
!
VI-Techniques dʼanalyse des acides aminés!!
LES ACIDES AMINES!
Diagramme de Venn !
Caroline Moyret-Lalle © !
Le groupe carboxyle (-COOH) se comporte comme un acide faible et libère un proton (-COO-) en milieu basique!
Le groupe amine (-NH2) se comporte comme une base faible et accepte un proton (-NH3
+) en milieu acide!
-N: + H+ ---------------> -N+-H !
H!
H!
H!
H!
AH+!
A-!
III- Propriétés acido-basiques des acides aminés!III-1 Ionisation/Dissociation des acides aminés!
Caroline Moyret-Lalle © !
Zwitterion!
- A un certain pH (caractéristique de l’AA), chaque AA est complètement ionisé :!
-le radical aminé (-NH3+) contient un proton!
-le radical carboxyle est dissocié (-COO-)!=> cʼest un ion dipolaire, appelé ion amphotère!!- Lorsque la somme des charges portées par lʼAA est nulle, lʼAA est alors appelé zwitterion!
Ion amphotère!
- Le pH est appelé point isoionique ou isoélectrique de l’AA = pHi !
Caroline Moyret-Lalle © !
On peut suivre l’état d’ionisation! d’un AA en fonction du pH !
Forme cationique! Forme zwitterionique! Forme anionique!
H-CH-COOH!! NH3
+!
H-CH-COO-!! NH3
+!
H-CH-COO-!! NH2!
H+! H+!
OH-! OH-!
A+! A0! A-!
pHi!chaîne latérale non dissociable!
Caroline Moyret-Lalle © !
!• Les acides aminés ont des courbes de titration caractéristiques!
• La courbe de titration permet de!
!- mesurer le pKa de chaque groupement ionisable! !
!- prédire la charge électrique des acides aminés à un pH donné!!
!- définir les régions de pouvoir tampon de l'acide aminé!
Courbes de titration des acides aminés!
Le titrage implique l’addition (ou l’élimination) graduelle de protons!
Caroline Moyret-Lalle © !
La courbe de titration est biphasique !
A+! A0! A-!
A+!
A0!
A-!
Points d’équivalence!100% d’une forme!
Points de demi équivalence!50%/50% de 2 formes pH = pKa!
III- Propriétés acido-basiques des acides aminés!III-2 Courbes de titration acides aminés à chaîne latérale non ionisable!
Caroline Moyret-Lalle © !
Equation d’Henderson-Hasselbach! !pH = pKa + log B/A !avec : B = R-COO-/ R-NH2!
! ! ! A = R-COOH/ R-NH3+!!Qd B=A => pH = pKa + log 1 => pH = pKa!!
Détermination des valeurs de pKa!
A+! A0! A-!
pHi = pI= ½ (pKa1 + pKa2)!!
pKa1! pKa2!
Caroline Moyret-Lalle © !
Caroline Moyret-Lalle © !
Courbe de titration de la glycine!
Espèce totalement protonée!
pH = pKa!
H3N+ -CH2-COO-!
H3N+ -CH2-COOH!
En concentrations équimolaires!
H2N -CH2-COO-!H3N+ -CH2-COO-!
En concentrations équimolaires!
Effet tampon dans les zones voisines des pKa!
pH = pKa!
Chaînes latérales sans groupe ionisable!
Les valeurs des pKa des acides aminés dont les chaînes latérales ne sont pas ionisables sont très proches mais pas identiques!
Caroline Moyret-Lalle © !
pHi = 3,25
pKa1!pKa2!
pKa3!
III- Propriétés acido-basiques des acides aminés!III-2 Courbes de titration acides aminés à chaîne latérale ionisable!
Attention: L’ordre de dissociation des fonctions dépend de la nature (donc du pKa) de la fonction portée par chaîne latérale!
!• Groupe α-carboxylique (-COOH)!• Groupe α-aminé (-NH2)!
• Groupe ionisable de R !! ! !!
3 étapes d'ionisation = 3 valeurs de pKa!
Courbe de titration de l’acide glutamique!
A0! A-!A+! A2-!
Caroline Moyret-Lalle © !
H+!
OH-!
H+!
OH-!
A+! A0! A-!
Zwitterion!pI!
H+! OH-!
A2-!
pKa1 2,1! pKaR 3,8!
pKa2 9,8!
On peut suivre l’état d’ionisation d’un AA en fonction du pH !
chaîne latérale dissociable (Acide) : Glu!
NH3+-CH-COOH!
! !
COOH!
CH2!CH2!
NH3+-CH-COO-!
! !
COOH!
CH2!CH2!
NH3+-CH-COO-!
! !
COO-!
CH2!CH2!
NH2-CH-COO-!
! !
COO-!
CH2!CH2!
Caroline Moyret-Lalle © !
Courbe de titration de la Lysine!
pKa1!pKa2!
pKa3!
9.2!
pHi = 9,85!
A2+! A+! A0! A-!
Caroline Moyret-Lalle © !
pKa1 2,1! pKa2 9,2!
NH3+-(CH2)4-CH-COOH!
!! NH3
+!
pKaR 10,5!
NH3+-(CH2)4-CH-COO- !
!! NH3
+!
NH3+-(CH2)4-CH-COO-!
!! NH2!
NH2-(CH2)4-CH-COO-!!! NH2!
H+!
OH-!
H+!
OH-!
H+!
OH-!
A2+! A+!
A0! A-!
On peut suivre l’état d’ionisation d’un AA en fonction du pH !
chaîne latérale dissociable (Basique) : Lys!
Caroline Moyret-Lalle © !
7 acides aminés ont des chaînes latérales ionisables!!
• Groupement carboxyle !: Acide aspartique ! !! ! ! ! Acide glutamique!
• Groupement amine ! !: Lysine!• Groupement guanidyle !: Arginine!
!!• Noyau imidazole ! ! : Histidine!
!
Histidine : noyau imidazole!
pKaR = 12,5!
pKaR = 6,0!
Caroline Moyret-Lalle © !
• Groupement thiol ! ! !: Cystéine!
• Groupement phénol ! !: Tyrosine!
NH2—CH —COOH! ! CH2!! S-!!
NH2—CH —COOH! ! CH2!! SH! pKaR = 8,3!
pKaR = 10,1!
Caroline Moyret-Lalle © !
Hydrophobicité des acides aminés!• Le caractère hydrophobe ou hydrophile des acides aminés repose sur la possibilité pour leurs atomes d’échanger des liaisons hydrogène avec H2O!
• La chaîne latérale des acides aminés est + ou – hydrophobe !
• Attribution d’un indice d'hydrophobie et dʼun indice dʼhydrophilie à chaque acide aminé !
!! Hopp and Wood !(indice hydrophilie)!
Kyte and Doolittle!(indice hydrophobie)!
Caroline Moyret-Lalle © !
2 Enantiomères!
NH3+ à droite = D !
ou à gauche, L!
IV- Autres propriétés des acides aminés!!!
IV-1 Propriétés physiques!
L’isoleucine et la thréonine ont 2 carbones asymétriques!
Caroline Moyret-Lalle © !
• Tryptophane ! !280 nm!• Tyrosine ! !275 nm!• Phénylalanine! !257 nm!
Cette propriété est utilisée pour le dosage des protéines en solution aqueuse!
Spectre d’absorption!des AA aromatiques!
Caroline Moyret-Lalle © !
La détermination de la concentration se fait en mesurant l’absorbance (A) de la solution - Loi de Beer-Lambert!
A = ε x L x c!A !Absorbance!L !Longueur du trajet optique (cm)!c !Concentration molaire!
ε !Coefficient d’extinction molaire (M-1 x cm-1). Constant pour !!chaque molécule dosée. !
I0! I!
I0 = Intensité du faisceau lumineux incident!I = Intensité du faisceau lumineux transmis!!
A=log I0/I!
La loi de Beer-Lambert est additive!
Caroline Moyret-Lalle © !
"."
"
La ninhydrine!révélateur !des acides aminés!
!réagit avec les amines !
primaires!
Réduction de la ninhydrine !
pourpre de Ruhemann"
IV- Autres propriétés des acides aminés!!!
IV-2 Réaction à la ninhydrine!
Ninhydrine réduite!Caroline Moyret-Lalle © !
Fonction essentielle des AA: composition des protéines,des peptides!!Certains AA (Gly, Glu) possèdent une activité biologique propre sous forme libres!
!- De nombreux AA sont les précurseurs de nombreuses molécules indispensables comme : !! !- Intermédiaires métaboliques la créatine, la citrulline, l’ornithine ! !- Hormones : les catécholamines, le GABA, les hormones thyroïdiennes! !- Nucléotides purique et pyrimidique (Asp et Gln)! !- Coenzymes comme le NAD (Nicotinamide-Adénine-Dinucléotide)!
!- Certains AA servent de substrats énergétiques!
V- Rôle Biologique des acides aminés!
Caroline Moyret-Lalle © !
Phosphate de pyridoxal!
Phosphate de !pyridoxamine!
« ping-pong »!
transaminase!
échange d’azote en 2 étapes!
irréversible!
réversible!
Caroline Moyret-Lalle © !
V- Rôle Biologique des acides aminés!!
V-1 Intermédiaires métaboliques!
NH2-CH2-CH2-SO3H!
taurine!
HO3S-CH2-CH-COOH!
NH2!
acide cystéique!
SH-CH2-CH-COOH!
NH2! cystéine!
oxydation!
décarboxylation!
Métabolisme de la cystéine!
Sels biliaires!
Caroline Moyret-Lalle © !
Acide Glutamique précurseur de GABA!
GABA (acide γ amino butyrique) : principal inhibiteur du SNC! !!!
GAD : Glutamique !acide décarboxylase!
Réponse au GABA modulée par d’autres molécules : benzodiazépines, barbituriques, alcool….!
Glu! GABA!GAD!
CO2!
Traitement!épilepsie!
V- Rôle Biologique des acides aminés!V-2 Précurseurs!!
Caroline Moyret-Lalle © !
!Allergies, anaphylaxie, urticaire, inflammation!!
L’histidine précurseur de l’histamine!
NH2—CH —COOH! ! CH2!! CH!CH!
N! NH!
CH!
NH2—CH2! ! CH2!! CH!CH!
N! NH!
CH!
Histidine!
CO2!
Histamine!
L-histidine décarboxylase. !
amine hydrophile vasoactive
Pathologie
Caroline Moyret-Lalle © !
Phe!
Tyr! hormones thyroïdiennes !T3 et T4!
DOPA!
Noradrénaline!
Adrénaline!
Dopaquinone!
Mélanine! Dopamine!
tyrosinase! Cu++!
Caroline Moyret-Lalle © !
La Phénylcétonurie!
-Des mutations produisant la maladie ont été décrites dans le gène codant l'enzyme : phénylalanine-hydroxylase!!
! ! !Phe ---------> Tyr!! ! phénylalanine-hydroxylase!
!- Phénylcétonurie : 1 / 15 000 naissances.!!- Le dysfonctionnement de la phénylalanine-hydroxylase => Phe => î Tyr => î de la synthèse des catécholamines => destruction progressive du cerveau et des cellules nerveuses => retard mental sévère!
Normes : 8 mg/l!
Test de Guthrie !!
Pathologie > 40 mg/l!
Bacillus subtilis! + analogue de F!
Caroline Moyret-Lalle © !
Soumis à un champ électrique, les AA migrent vers l'électrode de polarité opposée :!!pH>pHi, l'acide aminé a une charge globale négative => électrode positive (anode)!!pH<pHi, l'acide aminé a une charge globale positive => électrode négative (cathode)!!pH=pHi, l'acide aminé est sous forme zwitterionique => ne migre pas !
Séparation des acides aminés par électrophorèse!
Dans un tampon de pH 6!
VI-Techniques dʼanalyse des acides aminés!
Caroline Moyret-Lalle © !
Séparation d’acides aminés par CCM !
-La phase stationnaire est composé de cellulose déposé sur une feuille d’aluminium !!-Le solvant est composé de butanol, acide acétique, eau (70, 18, 12 ; v %)!!-La révélation se fait à la ninhydrine!
CCM de 20 acides !aminés protéinogènes !
Caroline Moyret-Lalle © !
échange réversiblement !des cations!!Résine-G- / X+ + cation+!! Résine-G- / cation + + X+!!!!
Résines cationiques!
SO3-!H2PO4-!COO-!
Na+!H+!
Chromatographie par échange d’ions!
Résines anioniques!
(R)2-N+H!
Cl-!OH-!
échange réversiblement !des anions !!Résine-G+ / Y- + anion- !!Résine-G+ / anion- + Y-!
Caroline Moyret-Lalle © !
NaCl 1M!Citrate 0,2M!
pH = 6,4!
Citrate de Na!0,2M!
pH =3.19!
Citrate de Na!0,2M!
pH = 4,25!
DST
EA
P
GC
MV L
I!
YF H
K
R
Chromatographie sur échangeurs dʼions!
Profil !
Chromatographie par échange d’ions!
Résine cationique
Caroline Moyret-Lalle © !
colonne!solvant!
V a n n e d’injection!
Robinet!
enregistreur!
Détecteur!Spectro, fluo…!UV!
Collecteur de fractions!
Chromatographie Liquide Haute Pression HPLC!
Injection à la seringue!
Augmentation de l’efficacité de la colonne, mais augmentation considérable de la résistance au passage du solvant.!
Caroline Moyret-Lalle © !
Séparation d’acides aminés par HPLC !
AA + PITC (phenylisothiocyanate) !
PTC-AA (phénylthiocarbamyl-AA)!
254
nm!
+ méthanol!
Chromophores-PTC!
Colonne de silicate!Caroline Moyret-Lalle © !