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Cromatografia líquida de alta eficiência
1
Universidade Federal de Santa Catarina
Departamento de Química
Aula de: Michelle Barcellos
Professor: Ivan Gonçalves de Souza
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Cromatografia líquida de alta eficiência
2
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Modalidades e Classificação
Cromatografia
Gasosa (CG)
3
Fase Fase
MMóóvelvel
Líquida
Gás
CromatografiaLíquida
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Fator GC HPLC
Requisito p/ amostra Volátil e termicamente estável Solúvel na fase móvel
Tipos de amostra Gases, líquido e sólidos Líquidos e sólidos
Introdução à cromatografia líquida
• Versatilidade
• Sensibilidade
• Resultados quantitativos
• Espécies não-voláteis e termolábeis
• Automatização
4
Vantagens da técnica
• Alto custo do instrumento
• Alto custo de operação
• Falta de detector universal sensível
• Necessidade de experiência no seu manuseio
Limitações da técnica
Comparações entre CG e HPLC
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5
Equipamento de HPLC
Introdução à cromatografia líquida
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6
Instrumentação para HPLC
Introdução à cromatografia líquida
fase mfase móóvelvelInjetorInjetor
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7
Instrumentação para HPLC
Introdução à cromatografia líquida
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8
Instrumentação para HPLC
Fase móvel
Reservatório da Fase Móvel
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Características da fase móvel
• Alto grau de pureza ou fácil purificação;
• Dissolver a amostra sem decompor seus componentes;
• Não decompor ou dissolver a fase estacionária;
• Ter baixa viscosidade;
• Ser compatível com o tipo de detector;
• Polaridade adequada para permitir a separação dos componentes da amostra.
9
Instrumentação para HPLC
Fase móvel
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10
Bomba
Instrumentação para HPLC
Bomba para HPLC
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Sistema de bombeamento
REQUISITOS:
• Vazão contínua, sem pulsos
(ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos);
• Vazões de 0,1 a 10 ml/min
• Controle de vazão e reprodutibilidade melhor que 1 %;
• Inércia química: componentes resistente à corrosão.
11
Instrumentação para HPLC
Bomba para HPLC
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12
Injetor
Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC
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• Loop de 0,5 a 500 µL
• Reprodutível
13
Sistema de injeção Loop
Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC
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14
Preenchendo o Loop (Load)
Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC
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15
Injetando no Loop
Instrumentação para HPLC
Inejtor para HPLC
![Page 16: Cromatografia líquida de alta eficiênciaqmc3306pg.paginas.ufsc.br/files/2014/07/aula-HPLC-jul... · 2014-07-16 · Instrumentação para HPLC Fase móvel Reservatório da Fase Móvel](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022102/5bb5d55e09d3f2f2678d3dc5/html5/thumbnails/16.jpg)
16
Coluna
Instrumentação para HPLC
Colunas para HPLC
![Page 17: Cromatografia líquida de alta eficiênciaqmc3306pg.paginas.ufsc.br/files/2014/07/aula-HPLC-jul... · 2014-07-16 · Instrumentação para HPLC Fase móvel Reservatório da Fase Móvel](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022102/5bb5d55e09d3f2f2678d3dc5/html5/thumbnails/17.jpg)
• Pequena e de constituição similar à da coluna analítica
• Retém:• Material particulado
• Contaminantes do solvente
• Componentes da amostra que se ligam irreversivelmente à fase estacionária.
• Custo reduzido
17
Pré-colunas
Instrumentação para HPLC
Colunas para HPLC
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Geralmente em aço inox
Coluna empacotada
Preço: > R$ 1.500,00
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Características das colunas de HPLC
Instrumentação para HPLC
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Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl
Si
OH
silanol livre
••
Ciano (-C2H4CN)
Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
Amina (–C3H6NH2)
R =
19
Cromatografia líquida de alta eficiência
Tipos de interação soluto/fase estacionária
Fase normal
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20
Cromatografia líquida de alta eficiência
Tipos de interação soluto/fase estacionária
Fase reversa – Fase ligada
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21
Cromatografia líquida de alta eficiência
Tipos de interação soluto/fase estacionária
Cromatografia Quiral
Separação de isômeros ópticos
�Fase estacionária: ciclodextrinas, éteres de coroa;
� Fase móvel: tampões, solventes polares, seletores quirais;
![Page 22: Cromatografia líquida de alta eficiênciaqmc3306pg.paginas.ufsc.br/files/2014/07/aula-HPLC-jul... · 2014-07-16 · Instrumentação para HPLC Fase móvel Reservatório da Fase Móvel](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022102/5bb5d55e09d3f2f2678d3dc5/html5/thumbnails/22.jpg)
A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou
mistura de solventes).
Se um solvente não propiciar uma eluição
suficientemente rápida de todos os componentes, então
pode ser utilizada uma eluição por gradiente.
22
Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação isocrática ou por gradiente
Tipos de eluição
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23
Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação isocrática
![Page 24: Cromatografia líquida de alta eficiênciaqmc3306pg.paginas.ufsc.br/files/2014/07/aula-HPLC-jul... · 2014-07-16 · Instrumentação para HPLC Fase móvel Reservatório da Fase Móvel](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022102/5bb5d55e09d3f2f2678d3dc5/html5/thumbnails/24.jpg)
24
Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação isocrática
![Page 25: Cromatografia líquida de alta eficiênciaqmc3306pg.paginas.ufsc.br/files/2014/07/aula-HPLC-jul... · 2014-07-16 · Instrumentação para HPLC Fase móvel Reservatório da Fase Móvel](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022102/5bb5d55e09d3f2f2678d3dc5/html5/thumbnails/25.jpg)
25
Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação isocrática
![Page 26: Cromatografia líquida de alta eficiênciaqmc3306pg.paginas.ufsc.br/files/2014/07/aula-HPLC-jul... · 2014-07-16 · Instrumentação para HPLC Fase móvel Reservatório da Fase Móvel](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022102/5bb5d55e09d3f2f2678d3dc5/html5/thumbnails/26.jpg)
Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir.
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Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação por gradiente
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27
Cromatografia líquida de alta eficiência
Separação por gradiente
30% ACN
32% de THF40 % MeOH
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28
Cromatografia líquida de alta eficiência
Monógrafo
Porcentagem de volume de solvente com mesma força.
![Page 29: Cromatografia líquida de alta eficiênciaqmc3306pg.paginas.ufsc.br/files/2014/07/aula-HPLC-jul... · 2014-07-16 · Instrumentação para HPLC Fase móvel Reservatório da Fase Móvel](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022102/5bb5d55e09d3f2f2678d3dc5/html5/thumbnails/29.jpg)
29Detector
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC
![Page 30: Cromatografia líquida de alta eficiênciaqmc3306pg.paginas.ufsc.br/files/2014/07/aula-HPLC-jul... · 2014-07-16 · Instrumentação para HPLC Fase móvel Reservatório da Fase Móvel](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022102/5bb5d55e09d3f2f2678d3dc5/html5/thumbnails/30.jpg)
A sensibilidade deve ser compatível com a concentração do analito na amostra.
30
Características ideais para o detector
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC
Detector universal
Detector seletivo:� Permite detectar uma de duas ou mais espécies que coeluam.
� Em geral, melhor linha base.
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31
Características ideais para o detector
Ampla faixa linear:
� Maior comodidade no dimensionamento do volume de amostra.
� Analisar em uma mesma corrida cromatográfica espécies de concentrações diferentes.
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC
Baixo volume internoGrande volume: Alargamento dos picos registrados.
Resposta Rápida� Sinal que represente o exato instante de detecção.
� Detector lento: Picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.
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32
Detector por espectrofotometria UV-visível
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC
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33
Detector por arranjo de diodos - DAD
Instrumentação para HPLC
Detectores para HPLC
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34
Resultado da detecção - Cromatograma
Instrumentação para HPLC
Detector por arranjo de diodos - DAD
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35
Resultado da detecção – Cromatograma em 3D
Instrumentação para HPLC
Detector por arranjo de diodos - DAD
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Referências
36
1. COLLINS, C.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Fundamentos de
Cromatografia. 1ª reimpressão.. Editora da UNICAMP - Campinas:
Editora da UNICAMP, 2007.
2. SKOOG, D. A., WEST, D. N. Fundamentos de Química Analítica.
Barcelona : Reverte, 1974.
3. SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A. Principles of
instrumental analysis. Philadelphia: Saunders College Publishing ,
c1998