Descubrimiento de Snu17p
1. Habían aislado en levaduras el complejo Tri-snRNP (U4/U6.5)mediante cromatografía de afinidad.
2. Logran separar parcialmente Tri-snRNP (U4/U6.5) de U1 y U2 snRNPmediante gradientes de glicerol.
3. Encontaron 34 bandas correspondientes a proteínas que comigrabancon Tri-snRNP (U4/U6.5)
4. De esas 34 proteínas generaron péptidos mediante proteólisis y estofue analizado mediante espectrometría de masas; las secuenciashalladas fueron buscadas en DATABase
28 P Asociadas a 2 p específicas Tri-snRNP (U4/U6.5) de U2 snRNP
Una nueva proteína con RRM a la cual llamaron Snu17p
Snu17p es una proteína U2 snRNP
¿Está Snu17p asociada al spliceosoma?
- Snu17p se asocia al pre-mRNA en el prespliceosoma- se asocia también al lariat-exón2 forma parte del spliceosoma catalíticamente activo- es un factor general del splicing
Transcripción de pre-mRNA de actina ó U3 en presencia de [-32P]UTP
Incubación con extracto de splicing de AGY9 (Snu17p-tag) ó TR2 (Snu17p)
-25°, 20 ó 40 minutos-
Extracción de RNA Inmunoprecipitación con IG-beads
Electroforesis en gel desnaturalizante Extracción de RNA
Autorradiografía Electroforesis en gel desnaturalizante
Autorradiografía
¿Es Snu17p esencial para la viabilidad
celular?
5´UTR HIS3 3´UTR
Transformación de cepa TR1(integración al genoma por recombinación homóloga)
Crecimiento en medio HIS-
Cepa AGY17 (Snu17p)
Esporulación
2 esporas normales + 2 esporas de crecimiento lento (Snu17::HIS3)
Cepa AGY21 (knock-out para el gen SNU17)
Aislamiento de esporas Snu17p
Análisis de crecimiento a 17,30 y 37°C
- El fenotipo de crecimiento lento no se modifica con la temperatura
- Bajo cualquier condición, las levaduras Snu17 crecen 1.3 veces más lento que las wild type
Interesa determinar si la deleción en el gen Snu17p tiene algún efecto sobre el splicing
-La cepa Snu17p presenta defectos en el splicing tanto a 25° como a 37°C.
- A pesar de no presentar un fenotipo sensible a la temperatura, los defectos del splicing aumentan con la misma.