C o n t r o l m i c r o b i o l ó g i c o d e m e d i c a m e n t o s
Determinación de endotoxinas bacterianas por el método de gelificación
con lisado de amebocitos de Limulus polyphemus (LAL)
Práctica No.7
Castro Loa Fernando Adrian López Rangel Lourdes Villa Pérez Diana Gabriela
9FM1 - QFI
Equipo No.2
F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
1
Es cualquier agente productor de fiebre.
Son sustancias que actúan de forma indirecta sobre los centros termorreguladores del hipotálamo y producen un aumento de temperatura.
Por lo general, son moléculas de alto peso molecular y de naturaleza polimérica.
Los pirógenos más comunes son los de origen microbiológico, como los componentes esenciales de la pared
celular de bacterias (Lipopolisacárido de bacterias Gram negativas).
Amebas
Cél. Vegetal
Bacterias Virus
P i r ó g e n o
F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
2
T i p o s d e P i r ó g e n o s
• Endógenos
Citocinas proinflamatorias e inflamatorias como Interleucinas (I, II, IV), Prostaglandina (PGE2) , Ácido araquidónico, etc. Algunos individuos tienden a ser muy susceptibles a dichas moléculas, ya sea por sobreexpresión de receptores a las mismas o bien por algún daño en el centro termorregulador hipotalámico.
• Exógenos
— Agentes microbiológicos: Provenientes de bacterias, levaduras, hongos, tales como constituyentes celulares (LPS, flagelos, Pili, etc.).
— Agentes químicos: Pueden encontrarse en la naturaleza y
pueden provenir de algunas plantas o insectos, por ejemplo la melitina.
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3
E f e c t o s f i s i o l ó g i c o s d e l o s P i r ó g e n o s
Los efectos que se presenten son dosis dependiente. • Bajas dosis de pirógenos inducen reacciones inflamatorias, sin
síntomas clínicamente significativos.
• Dosis moderadas de pirógenos inducen fiebre y cambios significativos en la composición del plasma.
• Altas dosis de pirógenos puede llevar a choques sépticos, caracterizados por una disfunción cardiovascular, incluyendo la depresión y dilatación del miocardio, la vasodilatación, vasoconstricción, disfunción del endotelio y disfunción de órganos (riñón, hígado, pulmones y cerebro) seguido de la falla de múltiples órganos y muerte.
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4
L i p o p o l i s a c á r i d o b a c t e r i a n o
Considerado como la endotoxina pirogénica más importante dentro del ámbito clínico.
Bacteria Gram (-) p. ej. Brucella sp.
• Antígeno O: Está formado por un homopolímero lineal de 10 a 100 unidades.
• Núcleo: Está formado por oligosacáridos de Glucosamina, Glucosa, Manosa, Quinovosamina y Ácido 3-desox-D-nanno octulosónico (Kdo).
• Lípido base o A: Es un esqueleto disacárido de diaminoglucosa y ácidos grasos de cadena larga.
(Endotoxin)
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5
C a r a c t e r í s t i c a s d e l l p s b a c t e r i a n o
Tienen dos partes principales: 1. Una cadena polisacárida hidrofílica. 2. Un grupo hidrofóbico. Dado que la longitud de la cadena polisacárida es variable, su peso molecular va desde los 5,000 a 25,000 Da. Es muy estable y puede soportar temperaturas de 120°C por periodos de 3 horas. Son insensibles a cambios de pH, por lo que se requiere una alta concentración de ácidos o álcalis durante un periodo de tiempo largo para destruirles.
En agua, los LPS pueden tomar dif. tamaños: • En presencia de surfactantes, se rompen en monómeros con
pesos moleculares bajos. • En disoluciones que contienen cationes mono o divalentes,
forman micelas de alto peso molecular (>300 kDa) • En agua ultrapura, se forman agregados que permiten su
remoción con membranas de ósmosis inversa y ultrafiltración.
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6
M e c a n i s m o d e a c c i ó n d e l o s p i r ó g e n o s
Tipo Ligandos
TLR1 Lipoproteínas
TLR2 Peptidoglicano & Lipoproteínas
TLR3 RNA
TLR4 LPS, Ác. Lipoteicoico
TLR5 Flagelina bacteriana
TLR6 Peptidoglicano
Receptores tipo toll (TLR) en mamiferos
Célula animal
TLR1 TLR5
TLR2
Bacteria Gram -
Respuesta inflamatoria e inmunológica
Respuesta “dosis”-dependiente. Se elevan los niveles de citocinas proinflamatorias e inflamatorias circulantes como la IL-I,II y
IV, la PGE2, etc.
IL
PGE2
Circulación sanguínea hacia SNC
Región hipotalámica sensa dichas citocinas y genera aumento en los procesos metabólicos viscerales, aumentando así la temperatura
corporal (Fiebre)
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7
I m p o r t a n c i a d e l a p r e s e n c i a d e
e n d o t o x i n a s e n p r e p a r a d o s f a r m a c é u t i c o s
En vista de que los niveles de pirógenos en agua pueden variar dramáticamente y de que su presencia puede afectar los resultados de experimentos bioquímicos y biológicos, se han establecido niveles máximos
aceptables para contaminantes pirogénicos en el agua de laboratorio en estándares ASTM relativos a agua purificada para aplicaciones de laboratorio.
Las endotoxinas interactúan con las membranas celulares y tienen efectos sobre las funciones y crecimiento celular.
Estos efectos pueden son causados por la inserción de LPS sobre receptores celulares o a proteínas solubles. Ha sido demostrado que el uso de agua libre de pirógenos en los
medios para cultivo celular optimiza la viabilidad celular y su crecimiento.
Cultivo de células de mamíferos
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8
Electroforesis
Biología molecular
El agua utilizada para la preparación de reactivos y el enjuague del equipo debe estar libre de pirógenos y otras
sustancias orgánicas que podrían afectar la polimerización de geles o bien la precisión del enfoque isoeléctrico, con lo que
pondrían en riesgo la precisión y reproducibilidad de resultados experimentales.
Técnicas experimentales sensibles, como la PCR, clonación o producción de anticuerpos monoclonales, requieren el uso de agua ultrapura y libre de contaminantes inorgánicos y
orgánicos (como pirógenos y ácidos nucleicos).
El uso de agua ultrapura, libre de pirógenos en la preparación de medios y buffers con lleva un mejor desarrollo del embrión y mayores tasas de fertilización.
Fertilización in vitro
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9
P r o c e s o d e d e s p i r o g e n i z a c i ó n
Inactivación
• Empleo de calor seco a más de 250 °C
• Empleo de calor húmedo de 110-120°C
• Inactivación química
– Agentes Oxidaciones
– Agentes Alquilantes
– Agentes Hidrolíticos
• Empleo de radiaciones ionizantes
Eliminación
• Por lavado con agua exenta de pirógenos
• Osmosis inversa
• Ultrafiltración: membranas con un límite de peso molecular nominal (NMWL de su nombre en inglés) suficientemente bajo.
• Filtros de profundidad.
• Combinación de los anteriores
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10
M é t o d o s d e d e t e c c i ó n d e p i r ó g e n o s
1. Método in vivo: Prueba en conejo
2. Método in vitro: Prueba de gelificación por el método del Lisado de amebocitos de Limulus polyphemus.
F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
11
Método in vivo: Prueba en conejo (MGA-0711 – Prueba de pirógenos)
INTERPRETACIÓN Considerar cualquier disminución de temperatura con respecto a la temperatura control como cero. La muestra cumple los requisitos para ausencia de pirógenos si ningún conejo muestra un incremento individual de 0.5°C o mayor con respecto a su temperatura control. Si un conejo muestra un aumento de temperatura individual de 0.5°C o mayor, continuar la prueba usando cinco conejos más.
Conejo 1 Conejo 2 Conejo 3
Temperatura 38 °C 38.3 °C 38.1 °C
38.1 °C 38.3 °C 38.2 °C
38.2 °C 38.5 °C 38.3 °C
38.1 °C 38.6 °C 38.1 °
38.3 °C 38.3 °C 38.1 °C
38 °C 38.2 °C 38.2 °C
38.2 °C 38.4 °C 38.1 °C
Δmax 0.3 °C 0.3 °C 0.2 °C
Temperatura
Adminis tración
F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
12
1° Etapa
INTERPRETACIÓN Considerar cualquier disminución de temperatura con respecto a la temperatura control como cero. La muestra cumple los requisitos para ausencia de pirógenos si ningún conejo muestra un incremento individual de 0.5°C o mayor con respecto a su temperatura control. Si un conejo muestra un aumento de temperatura individual de 0.5°C o mayor, continuar la prueba usando cinco conejos más.
Conejo 1 Conejo 2 Conejo 3
Temperatura 38 °C 38.3 °C 38.1 °C
38.1 °C 38.3 °C 38.2 °C
38.2 °C 38.5 °C 38.3 °C
38.1 °C 38.8 °C 38.1 °
38.5 °C 38.3 °C 38.1 °C
38 °C 38.2 °C 38.2 °C
38.2 °C 38.4 °C 38.1 °C
Δmax 0.5 °C 0.5 °C 0.2 °C
Temperatura
Adminis tración
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13
2° Etapa
INTERPRETACIÓN La muestra cumple los requisitos para ausencia de pirógenos si no más de tres de los ocho conejos presentan un aumento de temperatura individual de 0.5°C o mayor y si la suma del aumento de la temperatura máxima individual de los ocho conejos no excede 3.3°C.
RESULTADO Producto pirogénico o no libre de pirógenos.
Conejo 1 Conejo 2 Conejo 3 Conejo 4 Conejo 5 Conejo 6 Conejo 7 Conejo 8
Δ max 0.5 °C 0.5 °C 0.2 °C 0.7 °C 0.8 °C 0.5 °C 0.9 °C 0.6 °C
Δ max total 4.7 °C
Conejo 4 Conejo 5 Conejo 6 Conejo 7 Conejo 8
Temperatura 38 °C 38.3 °C 38.1 °C 38.5 °C 38.4 °C
Δ max 0.7 °C 0.8 °C 0.5 °C 0.9 °C 0.6 °C
Administración
F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
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Método in vitro: Prueba de gelificación por el método del Lisado de amebocitos de Limulus polyphemus
• En 1960 el Dr. Frederick Bang encontró que al inyectar bacterias marinas al torrente sanguíneo del cangrejo herradura (Limulus polyphemus) se producía la coagulación de la sangre.
• Estudios posteriores, revelaron que ésta coagulación se debía a endotoxinas de las bacterias marinas.
• El ahora conocido reactivo de LAL, se obtuvo de los amebocitos.
— Limulus: Nombre genérico del cangrejo
— Amibocito: Célula que contiene los componentes activos del reactivo.
— Lisado: Proceso para obtener el componente de las células.
• Existen dos métodos para su determinación:
— Formación de un gel (Gelificación).
— Fotométrico.
F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
15
Método de LAL por gelificación
Es el ensayo clásico. La reacción desarrollada en el tubo de ensaye es la misma que ocurre in vivo en la hemolinfa del cangrejo de herradura cuando éste tiene contacto con alguna endotoxina bacteriana.
INTERPRETACIÓN Considerar una prueba positiva cuando el gel se mantiene integro al invertir el tubo 180° y una prueba negativa cuando no hay formación de un gel firme.
F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
16
Método de LAL por vía fotométrica
• Método Turbimétrico: Las pruebas se llevan a cabo a temperatura (37 ± 1°C) y tiempo de incubación recomendada por el fabricante del lisado.
— Cinético: Mide el tiempo necesario para que la mezcla de reacción alcance una absorbancia predeterminada o el grado de turbiedad desarrollada.
— Turbimétrico de punto final: Se basa en la relación cuantitativa entre la concentración de endotoxina y la turbiedad de la mezcla de reacción al final de un periodo de incubación.
• Método cromogénico: Se mide el cromóforo liberado de un péptido
cromogénico, al reaccionar el lisado con la endotoxina.
— Cinético: Mide el tiempo que tarda la reacción en alcanzar una absorbancia predeterminada o el grado de color desarrollado.
— Cromogénico de punto final: Se basa en la reacción cuantitativa entre la concentración de endotoxina y la cantidad de cromóforo liberado al final del período de incubación
Límite endotoxina (máxima concentración válida)
Es la máxima concentración de endotoxina bacteriana permitida en el producto la cual no debe producir una respuesta clínica pirogénica cuando se administra bajo la dosis indicada.
Máxima dilución válida (MVD)
Es la máxima dilución permitida para el producto en su forma concentrada o diluida en la que el límite de endotoxina puede determinarse.
Sensibilidad del lisado
Es la mínima concentración de endotoxina bacteriana en una muestra, la cual puede ser detectada por el LAL , sin que exista inhibición o realce de la reacción. Se encuentra indicada en el marbete.
F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
17
Conceptos importantes
CEE: Reconstituir con el volumen de agua del reactivo y se agita vigorosamente por 4 min. LAL: Reconstituir con el volumen de agua del reactivo y se MEZCLA SUEAVEMENTE sin hacer espuma. Realizar pruebas preliminares con la finalidad de: 1. Verificar la sensibilidad del lisado y así validar el proceso o la prueba.
2. Detección de interferencias del producto con la prueba.
F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
18
Consideraciones
Realizar no menos de 4 determinaciones de cada lote
LAL empleando un solo lote de endotoxina
Incluir un control negativo en cada determinación utilizando agua grado reactivo para LAL
Diluir hasta tener una concentración de 1 UE/mL
Prepara diluciones empleando factor de dilución 1:2 que
comprenda intervalo de 0.25λ a 4λ, agitar por lo menos 1
min.
Agitar suavemente para evitar destrucción de LAL
Incubar a 37ªC ±1 ªC por 60 min y hacer lectura
Calcular sensibilidad
Sensibilidad del lisado
Un resultado positivo es la formación de un coagulo firme que mantiene su
integridad cuando el tubo se invierte.
Un resultado negativo se caracteriza por la ausencia total de gel o por la formación de un gel viscoso que no se mantiene íntegro
al invertir el tubo.
F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
19
* SENSIBILIDAD DEL LISADO F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
20
Ejemplo para el calculo de la sensibilidad del lisado
* PRUEBA DE INTERFERENCIA F u n d a m e n t o s t e ó r i c o s
21
Prueba de interferencia del producto con el lisado
P a r t e e x p e r i m e n t a l
1 UE/mL
1 mL
0.5 UE/mL 0.25 UE/mL 0.06 UE/mL0.125 UE/mL
1 mL 1 mL1 mL
0.03 UE/mL0.25 UE/mL 0.125 UE/mL 0.06 UE/mL Control (-)0.5 UE/mL
0.1 mL
Agua libre de
pirógenos
1.0 mL
1.0 mL 1.0 mL1.0 mL
0.1 mL
1:2 1:2 1:21:2
0.06 UE/mL
1:2
1 mL
1 UE/mL1 UE/mL
1 mL
0.5 UE/mL0.5 UE/mL 0.25 UE/mL0.25 UE/mL 0.06 UE/mL0.06 UE/mL0.125 UE/mL0.125 UE/mL
1 mL 1 mL1 mL
0.03 UE/mL0.25 UE/mL 0.125 UE/mL 0.06 UE/mL Control (-)0.5 UE/mL
0.1 mL
0.03 UE/mL0.25 UE/mL 0.125 UE/mL 0.06 UE/mL Control (-)0.5 UE/mL
0.1 mL
Agua libre de
pirógenos
Agua libre de
pirógenos
1.0 mL
1.0 mL 1.0 mL1.0 mL
0.1 mL
1:2 1:2 1:21:2
0.06 UE/mL0.06 UE/mL
1:2
1 mL
P a r t e E x p e r i m e n t a l
22
Curva de sensibilidad
Control (-)Control (+)Control (+)
De Muestra
Muestra
MuestraEndotoxina
0.25 UE/mL (+)
Agua libre
de pirógenos
0.1 mL0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL
Control (-)Control (+)Control (+)
De Muestra
Muestra
MuestraEndotoxina
0.25 UE/mL (+)
Agua libre
de pirógenos
0.1 mL
Control (-)Control (-)Control (+)Control (+)Control (+)
De Muestra
Control (+)
De Muestra
MuestraMuestra
MuestraMuestraEndotoxina
0.25 UE/mL (+)
Endotoxina
0.25 UE/mL (+)
Agua libre
de pirógenos
Agua libre
de pirógenos
0.1 mL0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL
P a r t e e x p e r i m e n t a l
23
Análisis de muestras
R e s u l t a d o s
R e s u l t a d o s e x p e r i m e n t a l e s
24
EQUIPOMUESTRA
ANALIZADA
CONTROL
NEGATIVO
CONTROL
POSITIVO
CONTROL POSITIVO
DEL PRODUCTO
VALIDÉZ DEL
ANÁLISIS
ANÁLISIS DEL
PRODUCTODICTAMEN
1Medroxi
progesterona- - - Rechazado - Rechazado
3Di luyente
inyectable- + - Aprobado - Aprobado
4Solución
his tidina- + - Aprobado - Aprobado
5Bromuro de
vercuronio- - - Rechazado - Rechazado
6Bromuro de
rocuronio- - - Rechazado - Rechazado
Curva de sensibilidad
Análisis de muestras
NÚMERO DE TUBO 1 2 3 4 5
4λ 2λ λ 0.5λ 0.25λ
0.5 UE/mL 0.25UE/mL 0.125 UE/mL 0.06 UE/mL 0.03UE/mL
CURVA 1 + + + - -
CURVA 2 + + - - -
CONCENTRACIÓN DE
ENDOTOXINA Sensibilidad del lisado 0.1768 UE/mL
R e s u l t a d o s e x p e r i m e n t a l e s
25
Conclusiones
• Existen principios activos que no pueden ser probados mediante el método de LAL.
• La interferencia de los productos puede dar falsos negativos.
• No se pueden utilizar animales de experimentación si los principios activos a evaluar producen algún efecto cardiotónico o bien que puedan dañar algún órgano o la muerte del mismo animal de experimentación.
• El método de LAL es rápido y efectivo para la detección de pirógenos en un producto farmacéutico.
• La sensibilidad del kit tiene que ser comprobada previo al análisis de un producto farmacéutico.
• Previo al análisis del producto, se tiene que realizar una investigación bibliográfica para conocer el principio activo que se va a someter a éste tipo de pruebas.
A n e x o s
* PRUEBA DE INTERFERENCIA A n e x o i
26
Comparación de métodos de análisis para pirógenos
Ventajas Desventajas
Método cualitativo
Tiempos largos de prueba
Costoso y se necesita de un bioterio y
condiciones estrictas
El efecto depende de la respuesta fisiologica
Método cualitativo
Susceptibilidad de contaminación
Condiciones controladas
Personal calificado
Método cuantitativo
Amplio rango de detección
Tiempo de detección rápido
Alta sensibilidad 0.005 UE/ mL
Tiempo de incubación y lectura controlado
Solo se puede leer una vez la muestra
Límite de detección de 0.001 UE/mL
Fácil uso
Método de gelificación
Respuesta a gran variedad de agentes
pirogénicos Uso de animales
Equipo sencillo y económico
Fácil interpretación de resultados
Punto final Provee resultados rápidos (16 min) Interpretación del color de las muestras
Método
Fotométrico
Turbidimétrico
Cinético Equipo costoso
Punto final Método cuantitativo
Cromogénico
Cinético Interpretación del color de las muestras
Bacterial endotoxin testing (Get-clot) – PDF
B i b l i o g r a f í a y R e f e r e n c i a s
Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos 10ma edición
United States Phamacopeia . 24th ed.
Validación del método de LAL – PDF
Especificaciones de un kit de LAL – PDF