Diversidade Microbiana da
AmazôniaVol. 2
Editores: Oliveira L.A., Bentes J.L.S., Jesus M.A., Rocha L.C.,Fernandes
O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L.
Copyright © 2017, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
PRESIDENTE DA REPÚBLICAMichel Temer
MINISTRO DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA, INOVAÇÕES E COMUNICAÇÕESGilberto Kassab
DIRETOR DO INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIALuiz Renato de França
EDITORA INPAEditor: Mario Cohn-Haft. Produção editorial: Rodrigo Verçosa, Shirley Ribeiro Cavalcante, Tito Fernandes. Bolsistas: Brenda Costa, Alan Alves, Mariana Franco de Sá e Sabrina Trindade.
FICHA CATALOGRÁFICA
D618 Diversidade microbiana da Amazônia Vol.2 /Editor L. A. Oliveira... [et.al.].--Manaus: Editora INPA, 2017.348.: il. color.
ISBN 978-85-211-0175-8
1. Microbiologia - Amazônia. 2. Diversidade. I. Oliveira, L. A.
CDD 576.9811
Editora do Instituto Nacional de Pesquisas da AmazôniaAv. André Araújo, 2936 – Caixa Postal 2223Cep : 69067-375 Manaus – AM, BrasilFax : 55 (92) 3642-3438 Tel: 55 (92) 3643-3223www.inpa.gov.br e-mail: [email protected]
AGRADECIMENTOS
Pelo apoio financeiro para a realização do evento.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017.
Editora INPA, 348p.
Oliveira L.A., Bentes J.L.S., Jesus M.A., Rocha L.C.,Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L.
Luiz Antonio de Oliveira
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Jania Lilia da Silva Bentes
Universidade Federal do Amazonas [email protected]
Maria Aparecida de Jesus
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Liliane Coelho da Rocha
Universidade do Estado do Amazonas
Ormezinda Celeste Cristo Fernandes Instituto Leônidas e Maria Deane/Fiocruz-Amazônia
Suanni Lemos de Andrade
Universidade do Estado do Amazonas
Antonia Queiroz Lima de Souza
Universidade Federal do Amazonas [email protected]
Esse é o segundo volume do livro Diversidade Microbiana da Amazônia, tendo como
conteúdo, parte dos trabalhos apresentados no 6° CDMicro – Congresso sobre Diversidade
Microbiana da Amazônia - realizado no final de 2016 na cidade de Manaus. O CDMicro é
um evento que já se consolidou na região e serve como referência para todos os profissionais
que trabalham com a microbiota amazônica.
Ao compilarmos as informações divulgadas no congresso na forma de capítulos de um livro
digital, damos oportunidade para que todos os que estiverem interessados possam acessá-las
sem restrição, facilitando os avanços necessários para conhecermos melhor a microbiota
regional na busca de novas tecnologias e bioprodutos advindo da sua utilização racional.
Esperamos com essa atitude, estar contribuindo para que as pesquisas com microrganismos
da Amazônia sejam mais intensamente compartilhadas entre os estudantes, professores e
pesquisadores que se dedicam a conhecê-los melhor.
A Comissão Organizadora
5
Sumário
Páginas
Alimentos Fermin A.S., Klehm K.G., Souza E.O., Lima C.R.T., Silva C.M.A. Presença de
coliformes em hambúrguer caseiro comercializado em food truck na cidade de
Manaus-AM.
1
Machado A.R.G., Martim S.R., Prado F.B., Teixeira M. F. S. Caracterização parcial
de proteases de extratos orgânicos de cogumelos comestíveis.
9
Minelli-Oliveira C., Brito L.L., Menezes N.C., Cáuper F.R.M., Clement C.R., Oliveira L.A. Crescimento de bactérias isoladas de queijos e iogurtes em meio
contendo lactose.
14
Nunes C.O., Souza F.S. Ocorrência de Salmonella spp. em amostras de queijos
comercializados em feiras na cidade de Manaus, AM.
21
Reis D. M., Nunes A.S., Pedreno G.Y.O., Galúcio V.C.A., Sales-Campos C. Crescimento micelial e atividade enzimática qualitativa de macromicetos
amazônicos em meio de cultivo à base de casca de tucumã (Astrocarium aculeatum
Meyer).
30
Santos R.A., Fernandes F.S., Farias A.V., Souza J.V.B., Souza, E.S. Potencial da
levedura Candida humilis inpa1105 para a produção de proteína unicelular e etanol a partir dos hidrolisados ácidos de resíduos vegetais Amazônicos.
40
Souza J.A., Pedreno G.Y.O., Nunes A.S., Galúcio, V.C.A.; Sales-Campos C.
Análise microbiológica de resíduos de Musa sp. (bananeira) empregados no cultivo
de fungos comestíveis.
48
Ambiental
Almeida A.F., Bentes J.L.S., Hidalgo A.F. Atividade antifúngica de Picrolemma
sprucei Hook sobre o crescimento de fitopatógenos. 58
Alves E.S.F., Oliveira F.R., Moreira F.W. , Oliveira L.A. Atividade proteolítica de
rizobactérias de nódulos de leguminosas de municípios circunvizinhos de Manaus /
Amazonas.
66
Aparício J.F., Silva S.R.S, Souza A.Q.L., Freitas A.D.G. Isolamento, identificação e produção de celulases dos microrganismos associados aos Cupins Nasutitermes
sp.
74
Brito L.L., Menezes N.C., Minelli-Oliveira C., Cáuper F.R.M., Moreira F.W.,
Oliveira L.A. Avaliação da capacidade de produção de biossurfactantes e
degradação de petróleo por isolados de rizóbactérias.
83
Brito L.L., Menezes N.C., Minelli-Oliveira C., Cáuper F.R.M., Moreira F.W., Oliveira L.A. Biodegradação de petróleo por isolados de rizobactérias.
89
Carvalho W.O., Fonseca N.F. , Silva J.R. Produção de lacase por uma cepa de
Trametes elegans coletada no Município de Alvarães-Amazonas.
98
Cáuper F.R.M., Brito L.L., Minelli-Oliveira C., Oliveira L.A., Costa S.S., Menezes
N.C. Potencial de produção de amilase por rizóbios isolados de nódulos de feijão
caupi cultivado em solo da Amazônia.
107
Costa S.C.F.C., Menezes N.C., Minelli-Oliveira C., Oliveira L.A. Produção de 115
6
amilases por rizobactérias em meio contendo farinha da babaçu.
Couceiro D.M., Jesus M.A. Macrofungos Polyporaceae (Basidiomycota) no Jardim
Botânico Adolpho Ducke, Amazonas.
124
Fernandes K.R.P., Souza A.Q.L., Alencar L.F., Silva H.F., Pereira J.O., Rodrigues-
Filho E., Souza, A.D.L. Constituintes químicos do fungo Trichoderma koningii
isolado de Strychnos cogens.
133
Ferreira A.S., Jesus M.A. Biodegradação dos corantes azul brilhante de remazol R e vermelho congo por linhagens de Basidiomycetes.
142
Figueiredo T.F., Souza V.C., Cortez A.C.A., Souza J.V.B. Identificação de fungos
de água doce pelo sequenciamento das regiões Its, isolados de madeira submersa
em decomposição de um lago do município de Iranduba-AM.
152
Galúcio V.A., Teixeira N.S., Prestes A.G., Nunes A.S., Sales-Campos C. Análise
nutricional e microbiológica de resíduos de abacaxi Ananas sp.
161
Gomes D.M.D., Nascimento A.P.F., Silva L.P., Amaral P.A.S., Machado A.R.G., Martim S.R., Alecrim M.M., Teixeira M.F.S. Caracterização parcial de protease
alcalina produzida por Aspergillus pulverulentus em resíduo lignocelulósico.
171
Jesus M.A., Oliveira D.A.S., Santos J.F.S., Magalhães F.F.C., Souza D.H.,
Couceiro, D.M. Macrofungos (Aphyllophorales, Basidiomycetes) da área urbana de Manaus
180
Machado A.R.G., Martim S.R., Prado F.B., Teixeira M.F.S. Caracterização parcial
de proteases de extratos orgânicos de cogumelos comestíveis.
194
Magalhães A.A.S.., Carvalho T.B., Souza A.Q.L., Pereira J.O. Efeito da
temperatura e do pH no crescimento micelial do fungo amazônico Lentinus crinitus
(L.) Fr.
200
Martim S.R., Silva L.S.C., Prado F.B., Machado A.R.G., Teixeira M.F.S. Estabilidade e toxicidade de extratos proteolíticos de Pleurotus ostreatoroseus e
Lentinus citrinus cultivados em resíduo lignocelulósico da Amazônia.
208
Moura D.C.G. , Oliveira L.A. Capacidade de microrganismos autóctones de solos
amazônicos em usar o petróleo como fonte de carbono com meios nutricionais distintos.
218
Nonato L.S., Nascimento N.J.C., Silva M. S., Santos S. F., Mota A. J. Análise
comparativa de captação de fosfato usando bactérias isoladas do rio Negro e rio
Solimões.
225
Ohse, K.C., Gorayeb, G., Sabino, C.V.M., Lima, B.R., Silva, F.M.A., Souza,
A.Q.L., Souza, A.D.L., Lima, E.S. Biotransformação de rutina por Guinardia sp.
233
Oliveira F.R., Moreira F.W., Oliveira L.A. Rizobactérias de solos amazônicos com habilidade de degradar gasolina obtida da Refinaria de Manaus (REMAN).
242
Oliveira K.K.C., Moreira, F.W.; Oliveira, L.A. Rhizoctérias de solos amazônicos
com habilidade para degradar óleo diesel.
249
Oliveira R.C., Santos J.P., Santos S.F., Mota A.J. Uso de resíduos de abacaxi
(Ananas comosus) e maracujá (Passiflora edulis) para a produção de bioplásticos
por bactérias.
259
7
Queiroz C.A., Sousa S.B., Hanada R.E., Silva G.F. Distribuição de mating type e
diversidade de Fusarium decemcellulare isolados de mudas de guaranazeiro em
viveiro.
265
Silva L.S.C., Silva L.P., Souza B.C., Silva T.A., Vieira L.F.S., Durán, N.,
Teixeira M.F.S. Síntese de nanopartículas de prata por espécies de
Aspergillus do grupo Niger
275
Silva P.H.F., Silva S.R.S., Batista R.M., Soares L.N., Souza A.D.L., Costa E.V.,
Koolen H.H.F., Souza A.Q.L. Isolamento e caracterização de policetídeos diméricos em Talaromyces sp., um fungo endofítico de Duguetia stelachantha.
282
Siqueira, R.H.S., Evald A., Melo V.F., Rocha P.R.R., Matos K.S., Espindola I.C.,
Maia, S.S. Indicadores microbiológicos do solo sob diferentes manejos de água no
cultivo de arroz na Amazônia Setentrional.
287
Sousa A.S., Almeida M.F.O., Souza A.Q.L., Souza A.D.L. Sorbicilinoide de
Penicillium chrysogenum isolado de Gustavia sp.
295
Sousa T.F., Queiroz C.A., Sousa S.B., Silva G.F. Diferenciação genética entre as formas homotálicas e heterotálicas de Fusarium decemcellulare por meio de
marcadores moleculares.
305
Médica
Carvalho W.O., Fonseca N.F., Silva J.R. Avaliação de consórcios de fungos amazônicos (Trametes lactinea e Hexagonia glabra) contra as bactérias
Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Proteus vulgaris.
312
Grisolia M.E., Alves, G.S.B., Cruz, K.S., Jackisch-Matsuura A.B. Avaliação de
métodos de extração de DNA genômico para fungos dermatófitos.
320
Silva, T.G., Teles, A.L.M., Souza, L.C.A., Araujo, K.S., Cordeiro, A.T.D., Santos, J.G., Cruz Filho, R.F. Detecção de Micobactérias de Crescimento
Rápido em aparelhos videoscópicos na cidade de Manaus - AM.
326
Souza I. S., Silva D. M., Fernandes O.C.C., Rodrigues J. C. Avaliação da
patogenicidade de fungos filamentosos: Aldeia Fronteira – Mundurukú, Borba–
AM.
333
Xavier M.S., Lisbôa R.S., Guedes V.T.M., Souza F.S. Microbiota bacteriana da mucosa oral de cães (Canis lupus familiaris) atendidos em clínica veterinária na
cidade de Manaus, AM.
340
1
Oliveira L.A., Bentes J.L.S., Jesus M.A., Rocha L.C.,
Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L. Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017. Editora INPA
Presença de coliformes em hambúrguer caseiro
comercializado em food truck na cidade de Manaus-AM.
Fermin A.S.1, Klehm K.G.
2, Souza E.O.
3, Lima C.R.T.
4, Silva C.M.A.
5
1Especialista em Ensino da Biologia, Faculdade Arthur Thomas,
2Graduada em Licenciatura em
Química, Instituto Federal do Amazonas, 3Graduada em Licenciatura em Ciências Biológicas,
Centro Universitário do Norte, 4Graduada em Administração de Empresas, Faculdade
Metropolitana de Manaus,5Mestre em Biologia de Água Doce e Pesca Interior, INPA.
Emails:[email protected],
Resumo
O comércio de alimentos de rua apresenta aspectos positivos devido à sua importância
socioeconômica, cultural e nutricional, e negativo quanto às questões higiênico-sanitárias.
O hambúrguer por ter como matéria-prima principal a carne, necessita de cuidado e uma
correta manipulação, pois facilmente pode ser contaminado por microrganismos
patógenos. Sendo assim o objetivo deste estudo é avaliar a qualidade microbiológica de
hambúrguer caseiro e as condições higiênico-sanitárias através de ocorrência de
microrganismos indicadores como: Coliforme Total e Termotolerante através do método
de plaqueamento em superfície. Um total de 15 amostras de hambúrguer de diferentes
estabelecimentos food trucks foram analisadas. Coliformes termotolerantes ocorreram em
todos os estabelecimentos analisados e o de coliformes totais em dois estabelecimentos. As
amostras se encontravam fora dos parâmetros preconizados pela RDC 12/2001 da
ANVISA, não estando adequadas para o consumo humano, demonstrando que boas
práticas devem ser implantadas e que sejam fiscalizadas tanto a produção como a venda
desses alimentos.
Palavras-chave: Análise microbiológica, Hambúrguer, Grupo Coliforme.
Introdução
Embora o comércio ambulante seja uma atividade centenária, a modalidade Food
Trucks (caminhões de alimentos) surgiu a partir da primeira década do século XXI. Essa
tendência virou moda, pois muitos consumidores passaram a buscar os caminhões como
forma de acesso a alimentos mais sofisticados e a preços acessíveis (SEBRAE, 2015).
O comércio de alimentos de rua apresenta aspectos positivos devido à sua
importância socioeconômica, cultural e nutricional, e negativo quanto às questões
higiênico-sanitárias pois a venda de alimentos de rua é muito controversa, por representar
2
uma ameaça à saúde do consumidor, principalmente devido às técnicas inadequadas de
higiene e manipulação dos alimentos (Lucca e Torres, 2002).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que, a cada ano, mais de dois
milhões de pessoas morram por doenças diarreicas, muitas das quais adquiriram ao ingerir
alimentos e/ou água contaminados (Brasil, 2014).
Doenças Transmitidas por Alimentos (DTAs) são todas as ocorrências clínicas
consequentes da ingestão de alimentos que possam estar contaminados com
microrganismos patogênicos (infecciosos, toxinogênicos ou infestantes), substâncias
químicas, objetos lesivos ou que contenham em sua constituição estruturas naturalmente
tóxicas, ou seja, são doenças consequentes da ingestão de perigos biológicos, químicos ou
físicos presentes nos alimentos (Silva Junior, 2014). Existem mais de 250 tipos de DTA e a
maioria é infecção causada por bactérias e suas toxinas, vírus e parasitas (Brasil, 2014).
Muitos casos de enfermidades causadas por alimentos não são notificados, pois
seus sintomas são geralmente parecidos com gripes. Os sintomas mais comuns de doenças
de origem alimentar incluem dor de estômago, náusea, vômitos, diarreia e febre, ao fato de
que muitos patógenos presentes em alimentos causam sintomas brandos, e a vítima não
busca auxílio médico (Forsythe, 2013), sendo que o período de incubação varia conforme o
agente etiológico, porém usualmente é curto, variando de 1 a 7 dias (Brasil, 2014).
Existe um grande número de fatores que contribuem para tornar um alimento não
saudavel, causando toxinfecções àquelas pessoas que os ingerirem. As principais causas
são: controle inadequado da temperatura durante o cozimento, o resfriamento e a
estocagem; higiene pessoal insuficiente; contaminação cruzada entre produtos crus e
processados e monitoramento inadequado dos processos (Forsythe, 2013), tornando-os
veículos de microrganismos patogênicos ou não, tais como: bactérias, fungos, protozoários,
dentre outros.
Coliformes são definidos como bactérias tipo bastonetes gram-negativos aeróbicos
ou anaeróbicos facultativos, não-formadores de endósporos (Tortora et al., 2017). O grupo
dos coliformes totais é um subgrupo da família Enterobacteriaceae que, inclui 44 gêneros e
176 espécies. No grupo dos coliformes totais estão apenas as enterobactérias capazes de
fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas a 35 °C. O grupo dos
coliformes termotolerantes, é um subgrupo dos coliformes totais, restrito aos membros
capazes de fermentar a lactose em 24 horas a 44,5-45,5 °C, com produção de gás. São
microrganismos indicadores usados para avaliar a segurança e higiene dos alimentos (Silva
et al. 2010).
3
Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de microrganismos que,
quando presentes em um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de
contaminação de origem fecal, sobre a provável presença de patógenos ou sobre a
deterioração potencial do alimento, além de poderem indicar condições sanitárias
inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento (Franco e Landgraf,
2005) de alimentos de origem vegetal ou animal.
O hambúrguer por ter como matéria-prima principal a carne, necessita de cuidado e
uma correta manipulação, pois facilmente pode veicular microrganismos patógenos (Melo
et al., 2012). Carnes moídas comercializadas, originárias de vários cortes, manipuladas
excessivamente e por ter uma grande superfície de contato (moedor de carne, facas
destinadas ao corte e os utensílios do estoque) contribuem para o aumento da flora
microbiana (Jay, 2005).
A chave para a produção de alimentos seguros é produzir alimentos
microbiologicamente estáveis. É necessário certificar-se de que nenhum microrganismo do
alimento vai se multiplicar até doses infecciosas. O ideal é que os microrganismos estejam
inativados e que não haja toxinas (Forsythe, 2013).
Para tal, é importante avaliar as condições higiênico-sanitárias e qualidade
microbiológica dos alimentos comercializados, devido o processo de manipulação
excessivo e possível problemático sistema de conservação, favorecendo sua contaminação
por patógenos.
Torna-se necessária a avalição de sua qualidade higiênico-sanitária do ponto de
vista microbiológico a fim de garantir que o consumo ocorra de forma segura e livre de
contaminação.Assim, objetivou-se avaliar a qualidade microbiológica de hambúrguer
caseiro e as condições higiênico-sanitárias através de ocorrência de microrganismos
indicadores como: Coliforme Total e Termotolerante comercializado na cidade de Manaus-
AM através do método plaqueamento em superfície.
Material e Métodos
Os hambúrgueres caseiros utilizados nesse estudo são comercializados em food
trucks da Cidade de Manaus-AM. A coleta foi em cinco pontos na zona centro-sul da
cidade, localizados em uma das principais ruas dos bairros: 1 (Parque das Laranjeiras), 2
(Parque 10 de Novembro), 3 (Adrianopólis), 4 (Dom Pedro) e 5 (Adrianopólis). Os
4
caminhões estão instalados nas ruas com grande movimentação de carros e pessoas; o
estabelecimento 3 está localizado em uma vila food truck.
Em cada estabelecimento foram compradas três amostras, totalizando quinze
hambúrgueres imediatamente identificados e transportados em embalagem para viagem
conforme cada estabelecimento, até o Laboratório Multidisciplinar da Esbam para
realização das análises. Foram analisadas através da metodologia plaqueamento em
superfície, usando os meios de cultura M Endo Agar e M FC Agar de acordo com as
instruções do fabricante e vertido os meios em placa de Petri, em ambiente asséptico
usando-o ao solidificar. De cada amostra foram pesados 25 g do hambúrguer caseiro,
adicionados 225 mL de água peptonada a 0,1 % estéril e procedeu-se a homogeneização
das amostras, obtendo a diluição inicial 10ˉ¹. Em seguida, preparou-se diluições decimais
sucessivas até 10ˉ³ (Silva et al., 2007).
Para determinação de coliforme total e coliforme termotolerante, foram transferidos
0,1 mL da diluição 10ˉ³ das amostras para as placas de Petri contendo os meios de cultura
especifíco, espalhando o inóculo por toda a superfície do meio. Incubou-se em estufa
bacteriológica a 35 °C para Coliforme total e 45 °C para Coliforme termotolerante, ambos
por 48 h para o desenvolvimento das colônias. Todo o material utilizado para o
processamento das amostras estava estéril e todo procedimento foi realizado próximo ao
bico de Bunsen com a chama a meia altura em uma câmara de fluxo laminar (Silva et al.,
2007).
O resultado considerado positivo foi a formação de colônias com características
compatíveis ao de Coliformes, com a contagem das colônias e expressas em UFC/g
(Unidades Formadoras de Colônias por grama).
Resultados e Discussão
Os dados da pesquisa para coliforme total encontram-se na Tabela 1. Observa-se
que dos cinco estabelecimentos analisados, as amostras dos estabelecimentos 1 e 2
apresentaram esse grupo de microrganismos. A RDC n° 12, de 2 de janeiro de 2001 não
estabelece limites de tolerância para o grupo dos coliformes totais em hambúrgueres.
Entretanto, a presença desses microrganismos pode indicar condições higiênico-sanitárias
deficientes, colocando em risco a saúde dos consumidores (Silva et al., 2010).
5
Menezes e Alexandrino (2014) também observaram níveis altos de contaminação
por coliformes totais em hambúrgues comercializados em mercados na Cidade de Campo
Mourão-PR, indicando condições higiênico-sanitárias precárias.
Tabela 1. Presença de Coliformes Totais em amostras de hambúrguer caseiro
comercializado na cidade de Manaus-AM.
Frequência de UFC/g
Estabelecimentos Coliformes Totais
1ª Coleta 2ª Coleta 3ª Coleta
1 7 x 10⁴ Aus 1 x 10³
2 1 x 10³ Aus Aus
3 Aus Aus Aus
4 Aus Aus Aus
5 Aus Aus Aus
LMA - - - Legenda; LMA= Limite Máximo Aceitável (RDC N° 12, 2001)
Nas Tabela 2 e 3 estão representados os dados obtidos na pesquisa de Coliformes
Termotolerantes. Observa-se que as amostras dos estabelecimentos 1 e 2 apresentaram
presença de coliforme de origem fecal, sendo considerados fora dos padrões legais
vigentes preconizadas pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Então de
acordo com a legislação, tais amostras foram consideradas como “produtos em condições
higiênico-sanitárias insatisfatórias” para o consumo.
Tabela 2. Presenças de Coliformes Fecais em amostras de hambúrguer caseiro
comercializado na cidae de Manaus-AM.
Frequência de UFC/g por aquisição
Estabelecimentos Coliforme Termotolerante (Fecal)
1ª Coleta 2ª Coleta 3ª Coleta
1 2 x 10⁴ Aus Aus
2 4 x 10⁴ Aus 1 x 10⁵ 3 - - - 4 - - -
5 - - -
LMA 5 x 102 5 x 10
2 5 x 10
2
Legenda; LMA= Limite Máximo Aceitável (RDC n° 12, de 2 de janeiro de 2001)
Na Tabela 3 observa-se o crescimento de coliformes a 45°C de origem não fecal.
Segundo Silva et al. (2010), o grupo inclui membros de origem não fecal (várias cepas de
Klebsiella pneumoniae, Pantoea agglomerans, Enterobacter aerogenes, Enterobacter
6
cloacae e Citrobacter freundii). Em função disso, o termo coliformes fecais tem sido,
gradativamente, substituído por coliformes termotolerantes.
Segundo Sabota et al. (1998), dentre as espécies de Klebsiella, a K. pneumoniae
enteroinvasiva foi isolada, no final dos anos 1990, de hambúrguer servido por uma cadeia
de restaurantes fast food nos EUA, tendo causado gastrenterite.
O argumento de que elevados números de coliformes termotolerantes em alimentos
estão correlacionados com contaminação fecal já não é válida, pois as enterobactérias
mencionadas não são obrigatoriamente habitantes do trato intestinal de animais de sangue
quente, podendo ser encontradas em reservatórios naturais. Além disso, são organismos
comuns nos ambientes de manipulação de alimentos, podendo se tornar parte da
microbiota residente (Silva et al., 2010).
Tabela 3. Contagem das Unidades Formadoras de Colônias de Não Fecal em amostras de
hambúrguer caseiro comercializado na cidae de Manaus-AM.
Frequência de UFC/g por aquisição
Estabelecimentos Coliforme Termotolerante (Não Fecal)
1ª Coleta 2ª Coleta 3ª Coleta
1 - - -
2 - - - 3 2,4 x 10
6 - 1 x 10
3
4 4,4 x 106
2,8 x 106
2,6 x 106
5 3 x 106
1,8 x 106
2,6 x 106
LMA 5 x 102 5 x 10
2 5 x 10
2
Legenda; LMA= Limite Máximo Aceitável (RDC n° 12, de 2 de janeiro de 2001)
A RDC n° 216, de 15 de setembro de 2004 dispõe sobre regulamento técnico de
boas práticas para serviços de alimentação a fim de garantir as condições higiênico-
sanitárias do alimento preparado. Aplica-se aos serviços de alimentação que realizam
atividades de manipulação, preparação, fracionamento, armazenamento, distribuição,
transporte, exposição à venda e entrega de alimentos preparados ao consumo. Ressalta-se
a importância da prática desse procedimentos para que se tenha alimentos seguros.
Nota-se também, que é essencial a implementação de ações que regularizem e
fiscalizem as condições higiênico-sanitárias de estabelecimentos food trucks, a fim de
promover a distribuição de alimentos seguros aos consumidores.
7
Conclusões
De acordo com os parâmetros conferidos pela ANVISA, foram encontrados
hambúrgueres caseiros comercializado em food trucks na cidade Manaus-AM não
recomendados para consumo devido à contaminação por coliformes totais e
termotolerantes, dois grupos de microrganismos indicadores das condições higiênico-
sanitárias.
Diante do exposto, destacamos a importância da higiene, do controle de
temperatura das instalações onde se processam alimentos cárneos e da adoção de boas
práticas de manipulação de alimentos, em virtude de a carne moída ser a principal matéria-
prima do hambúrguer caseiro e por ser um alimento com grande potencial para causar
doenças de origem alimentar.
Referências
ANVISA (2001). Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução RDC nº 12, de 02
de janeiro de 2001. Dispõe sobre os princípios gerais para o estabelecimento de critérios e
padrões microbiológicos para alimentos. Disponível em: < http://www.
vigilanciasanitaria.gov.br/anvisa.html>. Acesso em 30 set. 2016.
ANVISA (2004). Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução RDC
n° 216, de 15 de setembro de 2004. Diário Oficial da República Federativa do Brasil,
Brasília, 15 set. 2004, Seção 1, p. 25.
Brasil (2014). Descrição da Doença. Ministério da Saúde. Disponível em:
http://portalsaude.saude.gov.br/. Acesso em 29 set 2016.
Brasil (2014). Doenças transmitidas por alimentos. Ministério da Saúde. Disponível em:
http://portalsaude.saude.gov.br/. Acesso em 29 set 2016.
Franco BDGM, Landgraf M (2005). Microbiologia dos Alimentos. São Paulo: Atheneu.
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Forsythe, SJ (2013). Microbiologia da Segurança dos Alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2ª
edição. 602p.
Jay, JM (2005). Microbiologia de Alimentos. Porto Alegre: Artmed, 6ª edição. 712p.
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Caracterização parcial de proteases de extratos orgânicos de cogumelos
comestíveis
Machado A.R.G.1, Martim S.R.
1, Prado F.B.
2 Teixeira M. F. S.
3
1PG Biodiversidade Biotecnologia – Rede Bionorte, Universidade Federal do Amazonas,
2 PG
Biotecnologia , Universidade Federal do Amazonas, 3Professora associada e curadora da coleção de
culturas DPUA, Universidade Federal do Amazonas. Emails: [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected].
Resumo
As proteases são enzimas que possuem ampla utilização comercial e industrial. As
peptidases de origem fúngica apresentam vantagens como alta diversidade, fácil produção
em larga escala e recuperação. O objetivo deste estudo foi caracterizar parcialmente
proteases de extratos orgânicos de cogumelos comestíveis. A cultura matriz foi preparada
em meio OMYA (aveia + extrato de levedura. Os extratos dos cogumelos foram obtidos
por processo de extração com etanol e álcool:água (1:1). O extrato bruto foi filtrado
sucessivamente em tecido de algodão e membrana polietersulfônica de 0,22 µm. Nos
extratos enzimáticos foi determinada a atividade proteolítica utilizando azocaseína como
substrato. Os resultados demonstraram que o extrato de P. ostreatoroseus obtido da
mistura de água:álcool (1:1) foi fonte de proteases que apresentaram atividade catalítica
significativa em pH 5 a 40˚C.
Palavras-chave: Peptidases, Pleurotus albidus, Pleurotus ostreatoroseus.
Introdução
Cogumelos são fontes de nutrientes e compostos bioativos que conferem
propriedades medicinais e terapêuticas. São produtos que despertam pouco interesse para
comercialização, embora que contribuem de forma significativa para a subsistência de
várias populações, no mundo (Bernaud e Rodrigues, 2013; Mattila et al. 2016; Zoho et al.
2016).
Os fungos do gênero Pleurotus, conhecidos por causar a podridão branca da
madeira, apresentam a capacidade de se desenvolver em vários resíduos agroindustriais
que contenham celulose, hemicelulose, lignina, amido, pectina e proteínas. (Figueiró e
Graciolli, 2011; Minotto et al. 2011).
10
Proteases são enzimas utilizadas em diferentes setores industriais. Estes
biocatalisadores são usados na fabricação de queijo e de pães, amaciamento de couro,
aditivo de detergentes, além de possuírem importância medicinal e cosmética (Sawant;
Nagendran, 2014). As peptidases são obtidas de diversas fontes vegetais, animais e de
micro-organismos, Dentre os fungos, os cogumelos têm se destacado como produtores de
enzimas proteolíticas, além de serem utilizados como alimentos (Fonseca et al., 2014).
Diversos estudos têm sido realizados sobre a extração de compostos bioativos de
cogumelos por solventes orgânicos (Silva et al. 2009). Contudo ainda há poucos relatos
sobre o potencial biotecnológico deste macrofungo.
Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar parcialmente proteases de
extratos orgânicos de cogumelos comestiveis.
Material e Métodos
Para a produção de enzimas, foram utilizados Pleurotus albidus DPUA 1692 e
Pleurotus ostreatoroseus DPUA 1720 do acervo da Coleção de Culturas DPUA/UFAM.
As culturas foram reativadas e cultivadas em placas de Petri contendo ágar OMYA (aveia
+ extrato de levedura) durante sete dias a 25°C.
Os extratos de cogumelo foram obtidos por processo de extração com etanol e
álcool:água (1:1). O processo de extração ocorreu sob agitação contínua em agitador
orbital a 150 rpm, a 25 °C. Posteriormente os extratos foram filtrados em papel de filtro
Whatman n°1 e foram feitas as análises subsequentes.
Determinação da atividade proteolítica quantitativa
Para a determinação da atividade enzimática proteolítica foram adicionados 250 µL
de solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2 em 150 µL de
extrato bruto. Os tubos reação foram incubados por 1 hora a 25 °C em câmara escura. Para
a interrupção da reação foram adicionados 1,2 mL de ácido tricloroacético 10% (p/v) e em
seguida procedeu-se a centrifugação por 10 minutos a 10000 rpm, a 4 °C. Em seguida, de
cada sobrenadante, foram retirados 0,8 mL e transferidos para tubos de ensaio contendo 1,4
mL de hidróxido de sódio 1M. A leitura das amostras foi realizada a 440 nm. Como branco
foi utilizada solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2.
11
Efeito do pH e da temperatura na atividade proteolítica
A partir do extrato bruto onde foi determinada a maior atividade proteolítica
analisou-se o efeito do pH na atividade proteolítica, incubando-se o extrato enzimático em
diferentes faixas de pH (5,0 – 10,0), a 25 ºC por 60 minutos. Os tampões utilizados foram
Citrato Fosfato 0,2 M (pH 5,0-6,0), Tris-HCl 0,2M (pH 7,0-8,0), Glicina-NaOH (pH 9,0-
10,0). O efeito da temperatura foi determinado em 25 ºC, 30 ºC, 40 ºC, 50 ºC, 60 ºC e 70
ºC, em 60 minutos. A atividade das proteases foi determinada conforme descrito
anteriormente. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise estatística descritiva média, desvio padrão,
gráfico e os cálculos de atividade enzimática (R2 ≥ 95%) por meio de análise de variância
(Anova) e teste Tukey (p < 0,05), utilizando o software Minitab ® versão 17.0.
Resultados e Discussão
Pleurotus albidus e P. ostreatoroseus excretaram proteases em todas as condições
avaliadas, sendo que o maior quantitativo de proteases (185 U/mL) foi verificado quando
P. ostreatoroseus foi extraído com água: álcool (1:1). Os menores valores de atividade
proteasica (80 U/mL e 102 U/mL) foram observados nos extratos de P. albidus em
solventes etanol e água:álcool (1;1) respectivamente.
Tabela 1. Atividade proteolítica de P. albidus e P.ostreatoroseus extraídos em
diferentes solventes orgânicos
Taxa Solvente Atividade proteolítica
(U/mL)
Pleurotus albidus Água:álcool (1:1) 102±0,1c
P. ostreatoroseus Água:álcool (1:1) 185±0,1ª
P. albidus Etanol 80±0,0d
P. ostreatoroseus Etanol 129±0,1b
O extrato bruto com maior atividade proteolítica foi submetido à caracterização
parcial de proteases. O efeito do pH na atividade proteolítica consta na figura 1 (A). As
proteases do extrato de P. ostreatoroseus extraído com água:álcool (1:1) apresentaram
12
atividade máxima em pH 5,0 com valores de 308 U/mL. Esses dados sugerem a presença
de proteases ácidas no extrato enzimático avaliado. Nos trabalhos realizados por Fonseca
et al. (2014), os autores verificaram que as proteases extraídas dos basidiomas de P.
ostreatoroseus demonstraram máxima atividade em pH 6,0.
Conforme indicado na Figura 1 (B), a temperatura ótima de atividade proteolítica
foi de 40 °C, com decréscimo de atividade nas temperaturas subsequentes, enquanto que
em 70 °C e 80 °C ocorreram perdas de 63,3 % e 60,5 %, respectivamente. Dados
semelhantes foram obtidos por Fonseca et al. (2014) e Kirsch et al. (2013) nos trabalhos
realizados com extratos dos basidiomas de P. ostreatoroseus e outros cogumelos
comestíveis.
Em relação à importância das proteases ácidas, pesquisas mostram que a maior
significância está associada à propriedade coagulante das proteínas do leite (caseínas),
processo evidenciado mundialmente e que tem contribuído para substituição da quimosina
animal pelas proteases microbianas por questões dos direitos dos animais. Espécies de
Mucor, Rhizopus, Aspergillus e Penicillium são reportadas como fonte dessas proteases
(Daboor et al., 2010).
Figura 1- Efeito do pH (A) e da temperatura (B) na atividade proteolítica de P.
ostreatoroseus
0
50
100
150
200
250
300
350
5 6 7 8 9 10
Ati
vid
ade
pro
teolí
tica
(U
/mL
)
pH
0
50
100
150
200
250
300
350
400
20 30 40 50 60 70 80
Ati
vid
ade
Pro
teolí
tica
(U
/mL
)
Temperatura C°
A B
13
Conclusões
O extrato P. ostreatoroseus obtido da mistura de água:álcool (1:1) foi fonte de
proteases com atividade catalítica significativa em pH 5 a 40˚C.
Este estudo sugere a possibilidade do uso de P. ostreatoroseus obtido da mistura de
água e álcool como fonte de proteases para aplicação industrial com extrato orgânico.
Referências
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Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L. Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017. Editora INPA
Crescimento de bactérias isoladas de queijos e iogurtes em meio contendo
lactose.
Minelli-Oliveira C.1, Brito L.L.
1, Menezes N.C.
2, Cáuper F.R.M.
3, Clement C.R.
4, Oliveira
L.A.4
1PPG Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas,
2Mestre em Agricultura no Trópico
Úmido, INPA, 3Universidade Paulista, UNIP,
4Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia. E-mails: [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected],
Resumo
A lactose está presente em diversos tipos de leite, e todos os mamíferos, inclusive o
ser humano, nascendo em condições normais, estão aptos a digerir este açúcar. Porém,
entre 5% das pessoas no norte da Europa e 90% em alguns países asiáticos sofre de algum
grau de intolerância à lactose, uma inabilidade para digerir completamente esse
dissacarídeo. O tratamento da intolerância à lactose consiste na retirada ou diminuição
desse componente da dieta. A utilização de microrganismos não patogênicos ou suas
enzimas capazes de degradar a lactose pode ser uma alternativa para pessoas com
intolerância à lactose consumirem uma maior quantidade de alimentos sem a preocupação
com essa substância. Este trabalho teve como objetivo estudar o crescimento de 12
bactérias isoladas de queijos e iogurtes vendidos no município de Manaus, em meio
contendo lactose com contagem de células em câmara de Neubauer nos tempos de inóculo
e, 4, 8, 12, 24 e 28 horas de incubação a 37°C. As bactérias BLG01, BLG25, BLG28,
BLG38 e BLG45 esporularam e apresentaram concentrações de células bem abaixo das
demais, sugerindo que a composição do meio não favorece os seus crescimentos. As
bactérias esporulantes BLG06 e BLG33 apresentaram elevadas concentrações de esporos,
sendo necessários mais estudos para identificar os fatores que induzem a essa modificação
morfo-fisiológica. Cinco das bactérias não esporularam nas condições ambientais, com a
BLG52 apresentando dificuldade para crescer no meio nas condições experimentais,
enquanto que as BLG02, BLG16 e BLG56 mostraram crescimentos medianos. Por
apresentar elevado crescimento sem esporular, a bactéria BLG73 é a que apresenta maior
potencial como degradadora de lactose, merecendo ser melhor estudada visando ser usada
na produção de algum bioproduto capaz de minimizar a intolerância á lactose encontrada
na população humana.
Palavras-chave: Metabolismo microbiano, microbiota de queijos, Biotecnologia.
Introdução
A intolerância à lactose é uma anormalidade digestiva que causa problemas de
saúde em uma parte da população mundial. Entre 5% das pessoas do norte da Europa e
90% em alguns países asiáticos sofrem dessa intolerância (Wikipédia, 2015), que é uma
15
inabilidade para digerir completamente esse dissacarídeo predominante no leite (Téo,
2002). A intolerância à lactose pode ser classificada como primária, quando há um defeito
intrínseco da enzima, ou secundária, quando ocorre um dano na mucosa intestinal com
consequente falta da mesma. Algumas causas do distúrbio primário são: deficiência de
lactase do prematuro, deficiência de lactase congênita e deficiência de lactase do tipo
adulto. O distúrbio secundário pode ter como causas: doença celíaca, fibrose cística,
alergia à proteína heteróloga, desnutrição, retocolite ulcerativa, síndrome do cólon irritável,
giardíase, utilização de alguns medicamentos com efeitos colaterais, entre outras situações
indesejáveis (Sabra e Wills, 1994; Téo, 2002). A lactose não digerida, conforme passa pelo
cólon, é fermentada por colônias de bactérias, havendo produção de ácidos orgânicos de
cadeia curta e gases (Téo, 2002). Isto resulta em diversos sinais e sintomas clínicos, como
diarreia acompanhada de desidratação, principalmente nas crianças de baixa idade,
evacuação explosiva logo após a ingestão do alimento, assadura perianal, distensão e dor
abdominal, flatulência, desnutrição, acidose metabólica e enterite necrosante (Sabra e
Wills, 1994; Moriwaki e Matioli, 2000; Téo, 2002; Lopes et al. 2008).
Diversas pesquisas têm mostrado que microrganismos encontrados na cavidade
bucal e nos intestinos apresentam habilidade de degradar esse componente do leite (Di
Cagno et al., 2001; Montalto et al., 2006; Fujimura et al. 2010; Rowat et al., 2010;
Fernandez-Feo et al. 2013). Em derivados do leite, como nos queijos e iogurtes, também
foram encontradas diversas bactérias com essa capacidade (Heller, 2001; Gobbetti, 2005;
Masotti et al., 2013), criando perspectivas de se obterem, através de isolamentos, novos
gêneros e espécies de bactérias presentes nas populações humanas de todas as regiões do
planeta com capacidade de solucionarem ou minimizarem os problema de saúde devido a
intolerância a lactose.
A utilização de microrganismos não patogênicos capazes de degradar a lactose
pode ser uma alternativa para pessoas que possuem essa intolerância em consumirem uma
maior quantidade de alimentos sem a necessidade de preocupação com essa substância.
Essa utilização pode ser: a) pelas suas ingestões no trato digestivo (digestório), caso eles
sejam compatíveis e possam fazer parte da flora intestinal; b) usando suas enzimas como
um complemento medicamentoso, junto com a alimentação; c) usando suas enzimas na
área industrial para degradarem a lactose presente em alimentos antes que sejam digeridos
pelos seres humanos. Esse trabalho teve como objetivo, avaliar o crescimento de 12
bactérias isoladas de queijos e iogurtes em um meio de cultura contendo lactose como
fonte de carbono.
16
Material e Métodos
Foram escolhidas 12 bactérias Gram negativas isoladas de queijos e iogurtes em
testes anteriores denominadas Bactéria Lactose e Glúten (BLG).
Um volume de 50 mL de meio contendo lactose (1%) foi adicionado em
erlenmeyers com capacidade de 125 mL e esterilizados a 120ºC por 40 min. Após o
esfriamento, cada um dos microrganismos (concentração inicial de 105 células bacterianas
mL-1
) foi inoculado e colocado em agitador constante sob uma temperatura de 37°C.
Uma alíquota de 1 mL do caldo foi retirada no exato momento da inoculação (0), 4,
8, 12, 24 e 28 horas de crescimento. Foi feita a contagem de células pela câmara de
Neubauer. Todas as análises foram feitas com 4 repetições.
Resultados e Discussão
Na tabela 1 consta o numero de células das bactérias que cresceram no meio líquido
contendo lactose como fonte de carbono na câmara de Neubauer após diferentes tempos de
incubação. Todas as 12 bactérias são bastonetes Gram negativos, mas as BLG01, BLG05,
BLG25, BLG28, BLG33, BLG38 e BLG45 se converteram em esporos, sendo que essa
transformação celular ocorreu na BLG28 em 12 horas de crescimento e nas demais, após
24 horas de incubação a 37°C.
Apesar de inicialmente apresentarem a mesma concentração de células por mL
(1x105 bactérias), após 4 horas de crescimento observou-se uma diferença de crescimento
entre as 12 bactérias, com a BLG02 se sobrepondo às demais. Após essa alta taxa de
crescimento inicial, essa bactéria apresentou um crescimento mais equilibrado até às 24
horas de incubação, com sua densidade dobrando a cada período de avaliação,
estabilizando-se após esse tempo de incubação.
Diferenças de crescimento entre microrganismos são bastante conhecidas na
literatura, sendo provenientes das suas adaptações às condições de nutrientes, elementos
químicos, temperaturas, pHs, entre outros fatores (Ferreira e Lund 1987; Mossel et al.,
1995; Higgins e Dworkin, 2012; Vieira e Fernandes, 2012).
Sete das 12 bactérias produziram esporos ao longo do tempo de crescimento no
meio contendo lactose, mostrando certa dificuldade em usarem a lactose ao longo do
tempo. A formação de esporos varia com o tipo de microrganismo e as condições
ambientais em que se encontram. Segundo Higgins e Dworkin (2012), a formação de
esporos em Bacillus subtilis é uma resposta à limitação de nutrientes no meio de cultura.
17
Esse comportamento pode ser observado nas bactérias BLG01, BLG25, BLG28, BLG38 e
BLG45, cujas concentrações de células até o final foram abaixo das demais e que
esporularam 12 ou 24 horas após o início da inoculação no meio de cultura. Esse
comportamento sugere que a constituição do meio pode limitar os seus crescimentos e que
em um determinado momento, essa limitação se intensificou, provocando a mudança
morfo-fisiológica para esporos como uma estratégia de sobrevivência quando as condições
ambientais não são mais favoráveis para elas.
Tabela1. Crescimento das células bacterianas pela contagem por câmara de Neubauer
Bactérias
INPA
Horas
Tipo de célula 0 4 8 12 24 28
Número de células bacterianas (105 /mL)
BLG01 1 26 156 118 268 242 Esporos 24hs
BLG02 1 232 526 938 2038 2054 Bastonetes
BLG06 1 29 184 716 6412 6956 Esporos 24hs
BLG16 1 51 307 587 1046 1041 Bastonetes
BLG25 1 41 187 216 514 512 Esporos 24hs
BLG28 1 42 316 574 550 654 Esporos 12hs
BLG33 1 15 502 3913 5919 5538 Esporos 24hs
BLG38 1 86 312 328 291 995 Esporos 24hs
BLG45 1 36 172 369 454 529 Esporos 24hs
BLG52 1 19 82 138 891 641 Bastonetes
BLG56 1 55 312 659 1306 1297 Bastonetes
BLG73 1 20 309 762 4475 4538 Bastonetes
Esse comportamento, no entanto, não foi observado nas bacterias esporulantes
BLG06 e BLG33, que apresentaram elevadas concentrações nos tempos de 24 e 28 horas
de crescimento, mas nesses casos, os números mostrados na tabela 1 refletem a
concentração de esporos no meio de cultura e não o de bastonetes. Outro detalhe observado
nessa tabela é que apenas a bactéria BLG02 esporulou aos 12 dias de crescimento,
18
sugerindo que ela foi precocemente afetada pelas condições do meio de cultura nas
condições ambientais em que foi realizado o experimento.
As demais bactérias estudadas não esporularam durante o período experimental,
evidenciando um metabolismo e fisiologia diferente. Pode ser que em outras situações
algumas delas esporulem, mas isso não aconteceu nas condições experimentais em que
foram avaliadas.
Pode-se dividir as bactérias que não esporularam em três grupos, com base nas suas
concentrações de células nas condições experimentais. Dentre essas, a bactéria BLG52
apresentou dificuldade para crescer no meio, com uma concentração baixa de células,
sugerindo certa dificuldade em degradar a lactose e usá-la para seu crescimento, enquanto
que BLG02, BLG16 e BLG56 tiveram crescimento mediano, cujas populações variaram
entre 1041x105 e 2054x10
5 células mL
-1. A bactéria BLG73, por outro lado, se destacou
com maior crescimento, mostrando-se a com maior potencial para degradar a lactose e
usá-la como fonte de carbono.
Conclusões
As bactérias BLG01, BLG25, BLG28, BLG38 e BLG45 esporularam e
apresentaram concentrações de células bem abaixo das demais, sugerindo que a
composição do meio não favorece os seus crescimentos.
As bactérias esporulantes BLG06 e BLG33 apresentaram elevadas concentrações
de esporos, sendo necessários mais estudos para identificar os fatores que induzem a essa
modificação morfo-fisiológica.
Cinco das bactérias não esporularam nas condições ambientais, com a BLG52
apresentando dificuldade para crescer no meio nas condições experimentais, enquanto que
as BLG02, BLG16 e BLG56 mostraram crescimentos medianos.
Por apresentar elevado crescimento sem esporular, a bactéria BLG73 é a que
apresenta maior potencial como degradadora de lactose, merecendo ser melhor estudada
visando ser usada na produção de algum bioproduto capaz de minimizar a intolerância á
lactose encontrada na população humana.
Agradecimentos
Ao INPA, UFAM, CNPq e FAPEAM, pelo apoio de infraestrutura e financeiro para
a realização da pesquisa.
19
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Ocorrência de Salmonella spp. em amostras de queijos comercializados
em feiras na cidade de Manaus, AM.
Nunes C.O.1, Souza F.S.
2
1PG em Microbiologia Geral, Escola Superior Batista do Amazonas,
2Doutor em Ciências
Veterinárias, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. E-mails: [email protected],
Resumo
A causa mais comum de doenças transmissíveis por alimento é a contaminação
microbiana, sendo na maioria das vezes, as bactérias com certo destaque para o gênero
Salmonella principalmente em alimentos como o queijo. A contaminação ocorre tanto pela
falta de conhecimento e por negligência do manipulador de alimentos, quanto pela
inadequação do espaço de trabalho e dos locais de armazenamento e, ainda por deficiências
na higienização de equipamentos bem como pela higiene pessoal. O objetivo da pesquisa
foi verificar a presença de Salmonella sp. em queijos comercializados em feiras. Durante o
período de março a abril de 2015 foram coletadas 48 amostras de queijos (de coalho, de
manteiga e mussarela) comercializados em 12 feiras do tipo livres e fixas nas diferentes
zonas da cidade de Manaus. As amostras dos queijos foram analisadas qualitativamente
para a presença de Salmonella spp. em 25g de queijo. Os resultados mostraram que
96,87% dos queijos comercializados não possuíam selo de inspeção oficial de produto de
origem animal e das 48 amostras de queijos examinadas, 37 (77,08%) apresentaram
Salmonella spp. Portanto, a maioria dos queijos comercializados nas feiras pode ser
imprópria para o consumo humano.
Palavras-chave: Risco, Contaminação, Saúde pública, Microbiologia, Bactéria.
Introdução
A tradição do consumo de queijo artesanal é bastante relevante em algumas regiões
do Brasil; na cidade de Manaus existe uma cultura em caracterizar os queijos artesanais
frescos como mais saborosos, sendo os mais consumidos em tapiocas e pães.
Embora haja legislação que dispõe sobre o Regulamento Técnico de Identidade e
Qualidade de Queijos, e nela estabeleça que o leite a ser processado e comercializado deva
ser pasteurizado, ainda existem municípios do Estado do Amazonas produtores de leite
com produção de queijo de forma artesanal utilizando leite cru (sem pasteurização) e
manipulado inadequadamente e improvisado.
22
A comercialização destes produtos na cidade de Manaus consiste na principal renda
dos produtores rurais de municípios como Iranduba e Autazes; entretanto, o queijo
fabricado de forma artesanal está sujeito a fontes de contaminações microbiológicas.
Apesar da comercialização de queijos artesanais sem selo de inspeção oficial de
produtos de origem animal ser legalmente proibida no Brasil, a sua venda ocorre de
clandestinamente.
Atualmente, Salmonella spp. é um dos microrganismos mais frequentes no
envolvimento em casos e surtos de doenças de origem alimentar em diversos países,
inclusive no Brasil. Neste país, um levantamento indicou que S. typhimurium, S. agona, S.
anatum e S. oranienburg são os quatro sorotipos mais frequentes encontrados no homem,
em alimentos e amostras ambientais (Yamaguchi et al., 2013).
Sendo assim, o presente trabalho teve o objetivo de verificar em feiras livres e fixas
da cidade de Manaus a qualidade microbiológica dos queijos quanto à presença de
Salmonella spp.
Material e Métodos
No período de março a abril de 2015 foram coletadas 48 amostras de queijos
comercializados nos boxes de 12 feiras (livres e fixas) nas diferentes zonas administrativas
de Manaus: duas Feiras livres (Feira Volante Prefeito sendo uma localizada no bairro
Aparecida e a outra na Feirinha do Parque 10) e, dez Feiras fixas (Feira Municipal do
Santo Antônio, Feira Modelo da Compensa, Feira Coberta da Alvorada I, Feira do Mutirão,
Feira da União Jorge Teixeira 4° etapa, Feira da Bola do Produtor, Feira da Banana, Feira
Comunitária do Aripuanã, Feira do 10 - Novo Israel, Feira do Manoa).
Foram coletadas 32 amostras de queijos tipo artesanal coalho bovino, 11 amostras
do artesanal manteiga bovino, três de artesanal mussarela búfala, uma de artesanal
pasteurizado bovino e uma de industrial coalho bovino com selo de inspeção estadual. As
amostras dos queijos de 32 boxes foram armazenadas em sacos plásticos transparentes
comuns, os mesmos utilizados pelos feirantes manipuladores ao comercializarem o
produto, e identificadas por tipo de queijo, data e local de coleta (Tabela 1).
23
Tabela 1. Amostras de diferentes tipos de queijos em feiras de diferentes zonas da cidade
de Manaus, AM.
AMOSTRA FEIRA ZONA DA
CIDADE BOXE TIPO DE QUEIJO
DATA DA
COLETA 1 Modelo da Compensa Oeste 01 Mussarela 20.03.15
2 Modelo da Compensa Oeste 01 Coalho-SIE 20.03.15
3 Modelo da Compensa Oeste 01 Coalho 20.03.15
4 Modelo da Compensa Oeste 02 Coalho 20.03.15
5 Municipal do Santo Antônio Oeste 01 Coalho 20.03.15
6 Municipal do Santo Antônio Oeste 02 Coalho 20.03.15
7 Bola do Produtor Leste 01 Coalho 20.03.15
8 Bola do Produtor Leste 02 Coalho 20.03.15
9 Bola do Produtor Leste 03 Coalho 20.03.15
10 Bola do Produtor Leste 04 Coalho 20.03.15
11 Bola do Produtor Leste 05 Coalho 20.03.15
12 Mutirão Leste 01 Coalho 20.03.15
13 Mutirão Leste 02 Coalho 20.03.15
14 Mutirão Leste 02 Manteiga 20.03.15
15 União Jorge Teixeira 4 etapa Leste 01 Coalho 20.03.15
16 União Jorge Teixeira 4 etapa Leste 01 Manteiga 20.03.15
17 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 01 Coalho 14.04.15
18 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 01 Manteiga 14.04.15
19 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 01 Mussarela 14.04.15
20 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 01 Coalho Pausterizado 14.04.15
21 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 02 Coalho 14.04.15
22 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 02 Manteiga 14.04.15
23 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 03 Coalho 14.04.15
24 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 03 Manteiga 14.04.15
25 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 04 Coalho 14.04.15
26 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 05 Coalho 14.04.15
27 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 05 Manteiga 14.04.15
28 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 06 Coalho 14.04.15
29 Municipal Volante Prefeito 1 Sul 06 Manteiga 14.04.15
30 Coberta do Alvorada 1 Centro-Oeste 01 Coalho 17.04.15
31 Coberta do Alvorada 1 Centro-Oeste 02 Coalho 17.04.15
32 Municipal da Banana Sul 01 Coaho 17.04.15
33 Municipal da Banana Sul 02 Coalho 17.04.15
34 Municipal da Banana Sul 02 Manteiga 17.04.15
35 Municipal da Banana Sul 03 Coalho 17.04.15
36 Municipal da Banana Sul 04 Coalho 17.04.15
37 Municipal da Banana Sul 04 Manteiga 17.04.15
38 Municipal da Banana Sul 05 Coalho 17.04.15
39 Municipal da Banana Sul 05 Manteiga 17.04.15
40 Municipal da Banana Sul 05 Mussarela 17.04.15
41 Municipal da Banana Sul 06 Coalho 17.04.15
42 Municipal da Banana Sul 06 Manteiga 17.04.15
43 Manoa - Hiper varejão do Peu Norte 01 Coalho 20.04.15
44 Comunitária do Aripuanã Norte 01 Coalho 20.04.15
45 Do 10 – Novo Israel Norte 01 Coalho 20.04.15
46 Do 10 – Novo Israel Norte 02 Coalho 20.04.15
47 Feirinha do Parque 10 Centro-Sul 01 Coalho 24.04.15
48 Feirinha do Parque 10 Centro-Sul 02 Coalho 24.04.15
Para o transporte das amostras ao laboratório foi utilizada caixa isotérmica. Foi
utilizado uma cabine fluxo laminar da marca Opti-mair modelo ESCO, onde foram
realizadas as análises sensoriais e comparados de acordo com Instrução Normativa (IN) Nº
30 de 26 de junho de 2001 (Brasil, 2001) para queijos tipo coalho e manteiga e a IN Nº 68
de 12 de dezembro de 2006 (Brasil, 2006) para queijo mussarela.
O controle de qualidade em queijos é de grande relevância para contribuição nos
padrões sensoriais e microbiológicos nos alimentos de origem animal. Portanto, a referida
pesquisa foi baseada em legislações como Instrução Normativa Nº 30 (Brasil, 2001),
Instrução Normativa N° 68 de 12 de dezembro de 2006 (Brasil, 2006), Código Sanitário de
24
Manaus formado pela Lei 392/97 de 27/06/97 e 3910/97 decreto (Manaus, 1997),
Resolução RDC nº 12, de 02/01/01 Padrões Microbiológicos Sanitários para Alimentos
(Brasil, 2001) e Lei Municipal N° 123 DE 25/ 11/ 2004 referente à Organização e o
Funcionamento dos Mercados e Feiras no Município de Manaus (Manaus, 2004).
Também foi realizado o isolamento de Salmonella spp. de acordo com Hirsh e Zee
(2012), Koneman et al. (2012) e IN 62 de 26 de agosto de 2003 (Brasil, 2003) (método
analíticos para analise microbiológica de P.O.A e água) pela qual 25g de amostra de cada
queijo foi adicionada em 225mL no enriquecimento não seletivo água peptona tamponada
0,1% por 24h a 36ºC em estufa bacteriológica marca Odontobras modelo E.C.B 1.2 digital.
Posteriormente, foram pipetados 1mL (pipeta automática de volume fixo 1000µL, marca
Kacil) e transferidos para tubos de ensaio contendo 9mL meio de enriquecimento seletivo
caldo Rappaport Vassiliadis Soja (RVS) por 48h a 42ºC em estufa bacteriológica marca
Odontobras modelo E.C.B 1.2 digital. Utilizando um swab esterelizado da marca Absorve,
o material foi semeado em triplicata contendo meio ágar Salmonella-Shigella (SS) em
placas de Petri usando a técnica do estriamento, foram levados a estufa bacteriológica
marca Odontobras modelo E.C.B 1.2 digital por 20h a 42ºC.
Como determina a Resolução RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001, a pesquisa de
Salmonella spp. foi realizada de forma qualitativa, da presença ou ausência do
microrganismo em 25g de alimento.
Resultados e Discussão
Das 48 amostras de queijos examinadas, 37 (77,08%) apresentaram Salmonella spp.
Segundo manual Himedia, o crescimento de espécies de S. sorotipo Typhimurium, S.
sorotipo Typhi e S. sorotipo Enteritidis não é inibido, e as colônias aparecem incolores com
o centro negro (Figuras 1 a 5).
De acordo com Hirsh e Zee (2012), as salmonelas aparecem como colônias não
fermentadoras de lactose no meio contendo lactose e como a maioria das cepas produzem
H2S, as colônias em meio contendo ferro produzem um centro negro.
Existem poucas pesquisas publicadas quanto à qualidade microbiológica de queijos
fabricados e comercializados em Manaus. Ramos e Costa (2003) encontraram Listeria spp.
em queijo coalho, comprovando haver risco de transmissão de enfermidades pelo consumo
do referido alimento, não sendo observados outros microrganismos nas mesmas amostras.
Em pesquisas envolvendo surtos por doenças transmitidas por alimentos em Manaus, AM
entre os anos de 2005 e 2009 observou-se, por exemplo, problemas microbiológicos com
25
queijo coalho (Ruwer et al., 2011) assim como a falta de estudos microbiológicos nos
queijos comercializados na cidade e sua relevância para saúde pública.
Figura 1 – Amostras de 1 a 16 em meio Salmonella-Shigella após 18h em 36°C,
apresentaram coloração incolor com centro preto, total de onze amostras.
Figura 2 –Amostras de 17 a 29 em meio Salmonella-Shigella após 18h em 36°C,
apresentaram coloração incolor com centro preto, total de treze amostras.
26
Figura 3 –Amostras de 30 a 42 em meio Salmonella-Shigella após 18h em 36°C,
apresentaram coloração incolor com centro preto, as amostras de número 30, 31, 33, 34,
35, 38, 39 e 40.
Figura 4 –Amostras de 43 a 46 em meio Salmonella-Shigella após 18h em 36°C,
apresentaram coloração incolor com centro preto, as amostras números 43, 44 e 45.
Figura 5 –Amostras de 47 e 48 em meio Salmonella-Shigella após 18h em 36°C, ambas
apresentaram coloração incolor com centro preto.
27
Deve ser enfatizado que grande parte da população não consegue perceber que a
compra de queijos sem selo de inspeção sanitária pode trazer consequências negativas à
saúde uma vez que os alimentos contaminados aparentemente são normais, com pouca ou
sem alterações sensoriais no que se refere ao odor e sabor.
As amostras coletadas de queijos de números 2, 5, 7, 11, 12, 32, 36, 37, 41, 42 e 46,
que representam (22,91%), não tinham Salmonella spp.. Estas amostras são oriundas de
seis das doze feiras inspecionadas (Feira Modelo da Compensa; Feira Municipal do Santo
Antônio; Feira da Bola do Produtor; Feira do Mutirão; Feira Municipal da Banana e Feira
do 10-Novo Israel).
Com relação às características sensoriais, de acordo com as Instruções Normativas
com relação ao requisito olhaduras, as amostras (5, 32, 36, 41 e 46) apresentaram-se com
muitas olhaduras, já as amostras (7, 11, 32) são de odor ácido a ácido forte, já a amostra
número 46 apresentou uma textura quebradiça. Somente quatro amostras (8,34%) de
número 2 (queijo de coalho- SIE), 12 (queijo de coalho), 37 (queijo de manteiga) e 42
(queijo de manteiga) estão dentro das normas que envolvem características sensoriais e
análise qualitativa aceitáveis para Salmonella, sendo um queijo com o selo ou identificação
do serviço de inspeção produto de origem animal SIE (Serviço de Inspeção Estadual).
O queijo artesanal comercializado em feiras na cidade de Manaus, AM, apresenta
grande ocorrência (77,08%) de Salmonella spp. Em termos qualitativos, a presença de
Salmonella spp. assemelhou-se com outros achados como os realizados por Feitosa et al.
(2003) no nordeste brasileiro, onde afirmaram que Salmonella sp. foi detectada em 9% das
amostras de queijo de coalho e em 15% das de queijo de manteiga no Rio Grande do
Norte. Já Duarte et al. (2005) detectaram Salmonella sp. em 5,5% das amostras analisadas
no Estado de Pernambuco, demonstrando que o consumo deste tipo de queijo poderia
representar risco à saúde da população, já que este é um alimento típico e acessível à
maioria das classes sociais.
Dados qualitativos semelhantes também foram encontrados em estudos realizados
por Pinto (1996), Florentino e Martins (1999) e Nassu (2000), os quais, em suas pesquisas,
encontraram Salmonella sp. em queijos de coalho e manteiga produzidos em diferentes
locais no Brasil.
Segundo o Departamento de Vigilância Epidemiológica e Ambiental do município
de Manaus, AM, na distribuição da frequência e percentual de agente etiológico por surtos
12
42 41 37
32 36
46
28
de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA), durante período de 2005-2009,
Salmonella foi uma das bactérias patogênicas encontrada no estudo de Ruwer et al. (2011).
Dados do Ministério da Saúde, setor de Vigilância Epidemiológica, apuraram no
período de 1999 a 2008, que os agentes etiológicos mais frequentes em surtos de DTA no
Brasil foram Salmonella sp. (42,9%) e Staphylococcus sp. (20,2%) (Ruwer et al., 2011),
concordando com os presentes dados.
Conclusões
As amostras de queijos oriundas das doze feiras de diferentes zonas administrativas
da cidade de Manaus, não apresentam segurança alimentar, pois 37 amostras (77,08%)
estavam com Salmonella spp. (S. typhimutium, S. typhi ou S. enteritidis).
Nas condições observadas, os queijos artesanais tipo coalho, manteiga e mussarela
de 47 amostras coletadas seriam classificados como impróprios para o consumo humano,
por não possuírem validação de serviço de inspeção oficial.
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Crescimento micelial e atividade enzimática qualitativa de macromicetos
amazônicos em meio de cultivo à base de casca de tucumã (Astrocarium
aculeatum Meyer)
Reis, D. M.¹, Nunes A. S.², Pedreno G. Y. O.³, Galúcio V. C. A.
4, Sales-Campos C.
5.
1Universidade do Estado do Amazonas,
2Univeridade Federal do Amazozas,
3Pesquisador, Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia. Emails: [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
O aproveitamento de resíduos da agroindústria tem recebido destaque devido ser fonte rica
em nutrientes, podendo ser aplicados em processos biotecnológicos com fungos.
Assim,utilizou-se farinha da casca do tucumã para o crescimento de fungos basidiomicetos
e avaliou-se sua capacidade proteolítica. Os fungos CESP-03 e CEP-45foram incubados a
30°C durante 8 dias em meio semi-sólido à base de farinha da casca de tucumãe seu
crescimento mensurado diariamente. O delineamento foi inteiramente casualizado com
quatro repetições. Para detecção da atividade qualitativa proteolítica foi utilizado meio
agar-gelatina-leite, sendo mensurado o halo incolor ao redor da colônia. Ao nível de 5% de
significância foi observada diferença estatística entre o crescimento micelial com farinha
de tucumã e seu controle. Ambos os fungos estudados não apresentaram atividade de
fenoloxidase através do teste utilizado. Quanto à atividade proteolítica, os dois fungos
apresentaram halo incolor, porém não foi observada diferença estatística. Portanto, a
farinha da casca de tucumã influenciou positivamente no crescimento dos fungos,
apresentando potencial para enriquecimento de meios de cultura, bem como os fungos
basidiomicetos estudados apresentaram potencial qualitativo quanto à produção de
proteases.
Palavras-chave: Aproveitamento de resíduos, protease, fenoloxidase, fungos
basidiomicetos
Introdução
Nas últimas décadas há uma crescente busca pela utilização de resíduos
agroindustriais, devido a incessante demanda das atividades agrícolas. O acúmulo destes
resíduos gera poluição do meio ambiente e perda de recursos, com contribuição
significante para o problema da reciclagem e conservação da biomassa, pois são substratos
persistentes no meio ambiente.
31
Dentre os principais resíduos gerados pela agroindústria destacam-se o bagaço de
cana-de-açúcar, bagaço de laranja, casca de arroz, farelo de soja, serragem de madeira,
casca do tucumã, entre outros. Desta forma, aminimização dos impactos ambientais
causados pelo homem utilizando estratégias ambientais sustentáveis como forma de
diferenciação e agregação de valor tem se tornado o objetivo de diversas organizações
(Dias, 2009).
Com a grande quantidade de resíduos descartadas no meio ambiente, processos
biotecnológicos procuram métodos para a utilização dos mesmos (Bernabé-Gonzáles et al.,
2006; Nyochembeng et al., 2008, Sales-Campos, 2008). A possibilidade de aproveitamento
dos resíduos agroindustriais no setor biotecnológico pode ser feita através da utilização dos
próprios, para fins enzimáticos, no setor farmacêutico e na bioconversão de produtos de
valor agregado, entre outros.Várias pesquisas neste âmbito indicam o uso de diversos
resíduos para produção de enzimas por microrganismos (entre eles fungos que produzem
enzimas extracelulares) como fontes de carbono e nitrogênio.
As enzimas fúngicas tem se mostrado úteis na degradação de uma variedade de
persistentes poluentes ambientais. O gupo Basidiomiceto apresenta grande potencial
enzimático no que se refere à capacidade degradadora, cuja classificação é baseada nas
diferenças dos padrões de degradação da madeira que estes apresentam, sendo levada em
consideraçãoa característica macroscópica da degradação. Fungos da decomposição branca
são bastante conhecidos pelas habilidades de produzir enzimas extracelulares oxidativas
que iniciam o processo de despolimerização ligninolítica. Esta capacidade permite a sua
aplicação em uma série de processos biotecnológicos, baseados na degradação das
estruturas de diversos compostos aromáticos (Mielgo et al., 2001).
Dentre as enzimas secretadas pelos fungos de podridão branca com maior
interesse econômico, destaca-se as fenoloxidases, que compreendem um conjunto de
enzimas fúngicas ligninolíticas como lacase e manganês peroxidase-MnP (D’Souza et al.,
1999). Estas enzimas são utilizadas principalmente na indústria de biopolpação da madeira,
aproveitamento de resíduos lignocelulósicos para ração animal, degradação de
xenobióticos e biorremediação (Maciel et al., 2010; Valmaseda et al., 1990).
O interesse também é voltado para a produção de proteases, que são capazes de
hidrolisar proteínas com consequente modificação das propriedades físicas, químicas e
biológicas originais, sendo a proteólise essencial para todos os organismos e envolvida em
diferentes processos fisiológicos (Sabotic et al., 2007). A característica de ação da protease
pode variar em função de sua origem e estrutura química. A diversidade aliada à ação
32
hidrolitica altamente especifica e a capacidade de síntese das proteases encontradas na
natureza têm estimulado cada vez mais a procura por enzimas proteolíticas para a
aplicação biotecnológica. São enzimas que executam diversas funções nos mais variados
setores, cerca de 60% do mercado mundial de enzimas hidrolíticas corresponde à aplicação
de proteases na indústria (Silva, 2010). As proteases são empregadas na indústriano
tratamento de couro e peles, na formulação de detergentes, na indústria dealimentos, assim
como na panificação, juntamente com as amilases, sendo responsáveis pela hidrólise do
glúten e no processamento de carnes, conservas e peixes (Bom e Pereira, 1999).
No que se refere aos resíduos com potencial para substrato de cultivo fúngico com
objetivo de produção enzimática, a casca de tucumã ganha evidência, especialmente em
Manaus, no Amazonas, poisessa frutatem um consumo tradicional intenso pela população
amazonense e um significante valor financeiro, representando uma atividade econômica
crescente. Apenas sua polpa é utilizada, gerando grandes quantidades de resíduos da casca,
que é desperdiçada sem nenhum aproveitamento (Nunes et al., 2011).
O tucumã é uma fruta de palmeira natural da Amazônia muito conhecida e
apreciada. É uma palmeira grande, podendo atingir até 15 metros de altura, possui um
único tronco grosso e temido por seus espinhos compridos (Costa et al., 2008). Seu fruto é
encontrado em grandes cachos protegido por palmeira espinhosa, colhido ao cair quando
maduro e consumido in natura ou como ingrediente de várias receitas amazonenses.
Estudos científicos demonstram o potencial do tucumã (polpa e casca) como fonte de
potássio, cálcio, selênio e a polpa com teores expressivos de lipídios, logo, um alimento
abundante em energia, assim como fibra alimentar, predominantemente na casca (Yuyama
et al., 2008), demonstrando a viabilidade de sua utilização como substrato em processos
biotecnológicos paraconversão em produtos de valor agregado. Neste contexto, este estudo
teve por finalidade utilizar farinha da casca do tucumã para o crescimento micelial de
fungos basidiomicetos amazônicosdeterioradores de madeira ocorrentes no município de
Parintins-AM, bem como avaliação de sua capacidade proteolítica.
Material e Métodos
Foram selecionados ao acaso carpóforos de dois fungos pertencentes à classe dos
Basidiomicetos degradadores de madeira coletados no interior do município de Parintins-
AM, região do Baixo Amazonas. As amostras foram embaladas em sacos de papel e
transportadas para o Laboratório de Estudos Fúngicos – LabEF, do Centro de Estudos
33
Superiores de Parintins-CESP, com as devidas informações sobre local, data, coletor e tipo
de substrato, onde foi realizado o isolamento para obtenção das culturas puras e posterior
uso nos testes experimentais. As linhagens fúngicas coletadas não foram identificadas a
nível taxonômico, codificadas como CESP-F03 e CESP-F45 (Figura 1), para inoculação
em meio de cultura BDA (Batata, Dextrose, Agar).
Figura 1. Carpóforos dos fungos A) CESP-03 e B) CESP-45.
As amostras dos fungos foram submetidas à assepsia, retirando fragmentos do
basidiocarpo e mergulhando-os em soluções de álcool a 70% com a finalidade de quebrar a
tensão superficial, o hipoclorito de sódio a 20 % para eliminar microrganismos agregados e
água destilada para retirar o excesso das soluções e evitar oxidação, por um período de
3,2,1 minutos em cada solução respectivamente.
O preparo do inoculo foi em meio de cultura BDA (Batata, Dextrose Agar), nas
proporções de 11,7g de Agar BDA e 300 mL de água destilada. As amostras foram
inoculadas em placas de Petri e incubadas em BOD a 30ºC por um período de 5 dias.
O processo de repicagem ocorreu no meio BDA, em ambiente estéril (interior da
Câmara UV), para a obtenção de culturas puras. As placas de Petri foram identificadas,
lacradas com fita plástica (Parafilm “M”). As culturas foram armazenadas em temperatura
de 30ºC, para posterior utilização.
O meio de cultivo utilizado como substrato para o crescimento fúngico foi
composto de matéria prima regional a partir da casca do tucumã (Astrocaryum aculeatum
Meyer). As cascas dos frutos do tucumã foram coletadas na Feira Municipal dos
Produtores do município de Parintins-AM, desidratadas e em seguida trituradas em moinho
de facas, tormando-se desta forma, a farinha da casca de tucumã (MFT). Foram utilizados
3g da farinha de tucumã e 300 mL de água destilada (MFT). Foram realizados também
A B
34
tratamentos com o meio sem suplementação deste resíduo (M1), ambos devidamente
autoclavados.
Para avaliar o crescimento micelial dos fungos, discos de 5mm de diâmetro
previamente miceliados foram transferidos para o centro das placas de Petri e mantidos em
período de incubação durante 08 dias até preenchimento micelial total da placa. A
avaliação do crescimento foi realizada com auxílio de régua milimetrada, realizando-se as
medições nas duas direções perpendiculares diariamente para a obtenção da media geral do
crescimento fúngico. O controle foi realizado em meio contendo apenas Ágar. As placas
foram distribuídas inteiramente ao acaso com quatro repetições para cada tratamento.
Os fungos basidiomicetos estudados foram avaliados quanto a sua capacidade
enzimática proteolítica e oxidativa através de métodos qualitativos. Os experimentos foram
realizados inteiramente ao acaso com quatro repetições para cada tratamento.
A capacidade de distinguir isolados capazes de produzir fenoloxidase foi
determinada pelo teste de Bavendamm (Davidson et al.,1938). O meio de cultura foi
preparado nas proporções: 400 mLdo meio de cultura BDA com 50 mL a menos de água
destilada, que foi esterilizada separadamente em autoclave. Após esterilização e resfriada,
à água acrescentou-se em condições assépticas 2g de ácido tânico e agitou-se até a
homogeinização. Após esse procedimento adicionou-se esta solução ao meio de cultura
BDA levemente morno. Os fragmentos fúngicos previamente miceliados foram inoculados
no centro da placa e distribuídos ao acaso para observação dos aspectos de indicação de
fenoloxidases. Após 24 horas de incubação, realizou-se a avaliação visual quanto à
formação de um halo marrom considerado como reação positiva para produção de
fenoloxidases.
Para a avaliação qualitativa de protease utilizou-se 300ml do meio de Ágar
nutriente, acrescentou-se ao meio 3g de leite em pó desnatado, 3g de gelatina sem sabor
como substrato e agitou-se até a formação da mistura homogênea. Após serem misturados,
os ingredientes foram homogeneizados com água destilada e devidamente autoclavados.Os
fragmentos fúngicos previamente miceliados foram inoculados no centro da placa e as
placas foram distribuídas inteiramente ao acaso para observação dos aspectos de indicação
de protease. Após 24 horas de incubação, a protease foi identificada pela formação de um
halo indicando a degradação da gelatina, através do aparecimento de zonas transparentes
em torno das colônias.
Para a análise estatística dos dados coletados foi usado o software Bioestat 7.0 para
obter os parâmetros descritivos (média, desvio padrão, variância) e correlação entre as
35
variáveis. Para a inferência sobre a relação entre as variáveis a serem mensuradas foi
utilizado o teste ANOVA e para contraste das médias, o Teste de Tukey.
Resultados e Discussão
Crescimento em meio suplementado com farinha da casca de tucumã
Estatisticamente ao nível de 5% de significância não foi evidenciada diferença
estatística entre os fungos CESP-03 e CESP-45 em meio de cultivo suplementado com a
farinha da casca do tucumã. Porém quando os fungos são comparados aos seus respectivos
controles são observadas diferenças significantes, ambas ao nível de 95% de probabilidade.
A média observada para o CESP-45 em meio com farinha da casca foi 2,84cm, enquanto
seu controle foi de 1,85cm respectivamente. Para CESP-03 com suplementação de farinha
foi 3,41cm e seu respectivo controle, 1,45cm (Figura 2).
Figura 2. Crescimento dos fungos CESP-45 e CESP-03 em meio suplementado com
farinha da casca de tucumã.
O crescimento micelial em meio suplementado com farinha da casca de tucumã
demonstrou as maiores médias de velocidade de crescimento comparadas aos seus
controles sem acréscimo da farinha, demonstrando que o resíduo testado oferece
substâncias nutricionais que otimizaram o metabolismo fúngico.
Estudos de Yuyama et al. (2005) relatam que o tucumã (polpa e casca) possui fonte
de potássio, cálcio, e selênio e a polpa com teores expressivos de lipídios, assim como fibra
alimentar.Efeito contrário foi observado em estudos de Aguiar e colaboradores (2011), que
relataram não haver diferença entre tratamento e controle para o crescimento do fungo
basidiomiceto Lentinula edodes em meio acrescido de farelo da casca de tucumã
suplementado com farelo de trigo.
Possivelmente a casca do tucumã contém substâncias macromoleculares que foram
utilizadas como fonte de nutrientes, para isto as enzimas hidrolíticas, secretadas pelos
0,00
2,00
4,00
Méd
ia d
e
cresc
imen
to (
cm
)
FUNGOS E CONTROLE
CESP-45
CESP-03
CONTR CESP-45
CONTR CESP-03
36
fungos estudados, hidrolisaram estas macromoléculas e liberaram pequenas moléculas
solúveis que puderam ser utilizadas para o crescimento destes microorganismos.
Vale ressaltar que os requisitos nutricionais de qualquer organismo são
determinados pelo seu metabolismo energético característico e pela sua capacidade
biossintética (Santos, 2009).
Os fungos CESP-03 e CESP-45 não apresentaram nenhuma reação de oxidação
através do teste de Bavedanm. Estudos de Anguiano (2009) e Regina et al. (2009)
demonstraram que o fungo Lentinula edodes apresentou enzimas fenoloxidativas pela
análise quantitativa, mas no estudo qualitativo o resultado é negativo.
É importante destacar que embora não tenha sido detectada atividade enzimática de
alguns fungos, não se pode descartar completamente a sua ausência, pois são vários os
fatores que contribuem para a ativação do sistema lignocelulolítico, como condições
nutricionais e culturais, substrato metabolizável, altos níveis de oxigênio, nitrogênio e
várias outras condições de cultivo (Regina et al., 2009).
Para os testes qualitativos para protease, os dois fungos CESP-03 e CESP-45
exibiram capacidade em degradar o leite desnatado do meio semi-sólido a partir do terceiro
dia de incubação, apresentando halos enzimáticos translúcidos sem a necessidade de
adicionar solução reveladora na superfície do ágar, ou seja, mostrando reação positiva
quanto à competência em produzir proteases. Os índices enzimáticos variaram de 0,35 a
0,5 cm, para os isolados CESP-03 e CESP-45 respectivamente (Figura 3).
Figura 3. Índice enzimático da atividade qualitativa de protease de CESP-03 e CESP-45
respectivamente.
Estes resultados corroboram com estudos de Alves et al. (2002), os quais
verificaram a produção de proteases por diferentes espécies de Mucor spp. cultivadas em
meio sólido durante 96 horas. As colônias apresentaram halos que variaram de 3 a 6,4 cm.
O principal papel das enzimas proteolíticas é nutricional, em que grandes cadeias
0
0,2
0,4
0,6
CESP-03 CESP-45
Ati
vid
ad
e e
nzim
áti
ca
(cm
)
Fungos
CESP-03
CESP-45
37
polipeptídicas são hidrolisadas em pequenas moléculas que a célula possa absorver
(Fedatto, 2004).
Estudos de Campos et al. (2011) com os basidiomicetos Pleorotus ostreatus e
Lentinula edodes também comprovam o aparecimento do halo indicador da presença de
protease variando de 0,42 a 0,26 mm para os fungos acima citados respectivamente. Por
outro lado, os autores também relatam basidiomicetos que não produzem proteases.
É necessário estudos que selecionem uma maior quantidade de fungos
basidiomicetos produtores de proteases, uma vez que, a hidrólise proteica pode liberar
peptídeos bioativos que atuam no metabolismo, em glândulas excretoras, pressão
sanguínea e no desenvolvimento corporal de forma geral (Wang e Mejia, 2005). Além
disso, proteases representam um dos três maiores grupos de enzimas de interesse industrial
e tem ampla aplicação biotecnológica, especialmente na indústria de alimentos, couro,
detergentes e em processos de biorremediação (Raoet al., 1998).
Ao nível de 95% de probabilidade não houve diferença estatística na produção de
protease entre os fungos testados.
Conclusões
A farinha da casca de tucumã influenciou positivamente no crescimento dos fungos,
apresentando potencial para enriquecimento de meios de cultura para os fungos
basidiomicetos estudados.
Os dois fungos estudados apresentaram atividade proteolítica, com destaque para o
fungo CESP-45.
Não foi detectada atividade enzimática oxidativa pelo método utilizado.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio da CAPES, CNPq, FAPEAM, INPA, e UEA
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Potencial da levedura Candida humilis inpa1105 para a produção de
proteína unicelular e etanol a partir dos hidrolisados ácidos de resíduos
vegetais Amazônicos
Santos, R.A.¹, Fernandes, F.S.¹ Farias, A.V.¹, Souza, J.V.B.², Souza, É,S.¹
¹PG Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazônia, Universidade do Estado do Amazonas, ²Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. Email: [email protected],
[email protected],[email protected],[email protected]
m.br, [email protected]
Resumo
A hidrólise química da biomassa é uma das séries de tecnologias viáveis desenvolvidas
como um processo de conversão de biomassa em açúcares, esses açúcares podem ser
usados por microrganismos como fonte de energia para produção de etanol e de Single Cell
Protein (SCP) que é uma terminologia utilizada para designar células microbianas
crescidas em substratos orgânicos e posteriormente colhidas como proteína para ser usada
como suplemento alimentar. Diante disso o presente estudo teve por objetivo estudar uma
levedura da espécie Candida humilis INPA1105 para produção de etanol e SCP através dos
hidrolisados ácidos dos resíduos vegetais amazônicos. No bioprocesso submerso foram
utilizados os hidrolisados das cascas de cupuaçu, cascas de tucumã e casca da raiz de
macaxeira. A produção de SCP pela C. humilis INPA1105 foi eficiente no hidrolisado das
cascas do tucumã tendo o máximo de concentração celular de 7,60 células/mL em 72
horas. Já a produção de etanol no caldo de cana a cepa consumiu cerca de 90% do ART
com a produção de 31,0% de etanol. Portanto, entre os hidrolisados analisados, o que teve
mais destaque para produção de biomassa foi o hidrolisado da casca do tucumã e a
levedura apresentou potencial para produção de etanol quando cultivada em caldo de cana-
de-açúcar.
Palavras chave: Proteína unicelular, Etanol, Candida humilis
Introdução
Devido ao grande crescimento populacional e o vasto aumento no uso de fontes de
energias, tanto para o setor automotivo com a utilização de derivados do petróleo, quanto
ao setor alimentício (Silva et al., 2015). E isso tem incentivado a procura por
microrganismos que sejam capazes de atender esta demanda, principalmente com a
produção de bioprodutos de interesse industrial, dentre eles podemos citar os
biocombustíveis e a produção de proteína unicelular (Single cell protein) (Sauer, 2007).
41
O Termo single cell protein (SCP) ou proteína unicelular refere-se à proteína
obtida a partir de um único organismo biológico, podendo ser de fungos, bactérias e algas
(Gabriel et al. 1981; Litchfield, 1983). Dentre os fungos, as leveduras destacam-se por
crescerem em diversos ambientes, se adaptarem em vários substratos, rápido crescimento
celular, alta diversidade biológica, são produtoras de enzimas e outros metabólitos e
possuem em sua estrutura bioquímica, proteínas, lipídeos, carboidratos, vitaminas e sais
minerais, o que viabiliza sua produção, levando a necessidade de buscar substratos
alternativos para o crescimento microbiano e posteriormente a produção de moléculas de
interesse (Kihlberg, 1972).
Para a produção de moléculas de interesse, a hidrolise ácida de resíduos da
agroindústria surge como alternativa para a obtenção de açúcares fermentescíveis e não
fermentescíveis, que podem estar sendo utilizados como fonte de energia para o
crescimento microbiano (Oberoi et al., 2010), pois os resíduos agroindustriais apresentam
alto teor de matéria orgânica e um grande teor de nutrientes necessários para o
desenvolvimento microbiano (Gabriel et al., 1981). Entre esses resíduos para a produção
de SCP destacam-se o bagaço de maçã, bagaço de laranja, cascas de abacaxi (Vendruscolo,
2007; Albuquerque, 2003).
Das leveduras comumente estudadas para a produção de SCP e para a produção
de etanol destacam-se Candida utilis, Candida lipolítica, Candida tropicalis, Candida
novellas, Candida intermedia e Saccharomyces cerevisiae (Bhalla et al., 2007). Além das
leveduras, alguns fungos filamentosos também são estudados para produzir SCP, como
Gongronella butleri (Vendruscolo, 2007) e Rhizopus oligosporus (Albuquerque, 2003).
A fermentação submersa é uma alternativa para a produção de SCP e etanol, pois
proporciona uma melhor disponibilidade de nutrientes ao meio, proporcionando um melhor
desempenho microbiano, gerando assim, maior concentração da biomassa celular e melhor
produção de metabolitos (Suhet e Fioreze, 2011). Diante disso, o presente estudo teve por
objetivo estudar a produção de proteína unicelular e etanol pela Candida humilis INPA
1105 a partir dos hidrolisados ácidos de resíduos vegetais amazônicos.
Material e Métodos
A levedura utilizada foi a Candida humilis INPA1105 e faz parte da coleção
Microbiológica do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), isolada em 2013 da
manipueira, um efluente oriundo da produção de farinha de mandioca. Também foi
utilizada uma cepa padrão da levedura Saccharomyces cerevisiae Pe-2, cedida pelo
42
Laboratório de Bioprocessos da Universidade Federal do Amazonas. As leveduras foram
reativadas em meio Ágar Sabouraud com extrato de levedura (20 g Agar, 20 peptona, 40 g
dextrose, 250 mg de cloranfenicol, 1000 mL de água destilada) e mantidas à temperatura
de 25 oC.
Os resíduos utilizados nesse estudo foram: cascas de cupuaçu (Theobroma
grandiflorum), casca da raiz de mandioca (Manihot esculenta) e cascas de Tucumã
(Astrocaryum aculeatum), obtidos das feiras abertas da cidade de Manaus.
A hidrólise ácida dos resíduos das feiras foi realizada como descrito por Oberoi
(2011). Resumidamente, em Erlenmeyers de 2000 mL foram colocados 100 g do resíduo
seco e 1000 mL de uma solução de ácido sulfúrico a 2%. Essa foi aquecida à temperatura
de 121 oC a 1,2 atm por 15 min. O hidrolisado obtido teve seu pH corrigido para 5,0 com
hidróxido de sódio, em seguida foi filtrado em carvão mineral ativado e então submetido
ao bioprocesso para produção de biomassa pela levedura C. humilis INPA1105. O
bioprocesso foi realizado em Erlenmeyers de 125 mL, contendo 25 mL do hidrolisado
estéril que foi inoculado com a razão de 1,0x104 cel.mL
-1. A incubação foi realizada à
temperatura ambiente, entre faixa de 25º C e 28º C, em um ambiente climatizado e com
agitação orbital de 100 rpm. Durante as 72 horas de bioprocesso, foram retiradas alíquotas
para avaliar a produção de biomassa (P) e o consumo dos açucares redutores totais (ART)
a cada 24 horas.
O processo para a avaliação do potencial de fermentação por Candida humilis
INPA1105 usando como substrato o caldo de cana-de-açúcar foi realizado em Erlenmeyers
de 250 mL, contendo 100 mL de caldo de cana (12o Brix) e inóculo de 1x10
6 cel.mL
-1. A
incubação foi realizada à temperatura ambiente na faixa de 25º C a 28º C, sendo um
ambiente climatizado e de forma estática. A cada 24 horas, durante 96 horas, foram
retiradas alíquotas para avaliar a produção de etanol (P), biomassa produzida (X) e o
consumo dos açucares redutores totais (ART).
O crescimento celular no bioprocesso para a produção de SCP de S. cerevisiae Pe-
2 e C. humilis INPA 1105 foi realizado a partir de contagem de células em câmara de
Neubauer, para cada microrganismo.
A concentração de açúcares redutores totais (ART) foi determinada pelo método
do ácido 3,5 dinitrossalicílico (DNS) como proposto por Miller (1959).
Todos os experimentos foram realizados em triplicata e então calculados a média
e o desvio padrão para cada uma das determinações realizadas.
43
Resultados e Discussão
A produção de biomassa e o consumo de açúcares redutores totais se encontram
nas figuras abaixo. A Figura 1 apresenta a produção de biomassa e seu consumo de
açúcares redutores totais nos hidrolisados das cascas de macaxeira pela levedura C.humilis
INPA1105 pelo período de 72 horas de bioprocesso em agitação orbital. Durante a
produção de biomassa, houve o consumo de açúcares redutores totais de 26,4 g.L-1
com
aumento na biomassa da levedura de 1,0x104 cél.mL
-1 para 2,71 x10
7 cél.mL
-1.
Figura 1. Produção de biomassa e consumo de açúcares redutores totais (ART)
por C. humilis INPA 1105 no hidrolisado da macaxeira.
A Figura 2 mostra a produção de biomassa e seu consumo de açúcares redutores
totais nos hidrolisados das cascas de tucumã pela levedura C. humilis INPA1105 pelo
período de 72 horas de bioprocesso em agitação orbital. Durante a produção de biomassa,
houve o consumo dos açúcares redutores totais de 2,59 g/L-1
, com aumento na biomassa
celular da levedura de 1,00x 104 para 5,29 x10
7 cel.mL
-1.
4
8
12
16
20
24
28
32
1,00E+04
5,01E+06
1,00E+07
1,50E+07
2,00E+07
2,50E+07
3,00E+07
0 24 48 72
AR
T(
g/L
)
Bio
mass
a c
el.m
L-1
Horas Biomassa
ART
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Horas Biomassa
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Figura 2. Produção de biomassa e consumo de açúcares redutores totais (ART)
por Candida humilis INPA 1105 no hidrolisado da cascas do tucumã.
A Figura 3 apresenta a produção de biomassa e seu consumo de açúcares
redutores totais nos hidrolisados das cascas de cupuaçu pela C.humilis INPA1105 pelo
período de 72 horas de bioprocesso em agitação orbital. Durante a produção de biomassa,
houve o consumo dos açúcares redutores totais de 3,00 g.L-1
, com aumento na biomassa
celular da levedura de 1,00 x104 para 3,57 x10
7 cel.mL
-1.
Figura 3. Produção de biomassa e consumo de açúcares redutores por
C.humilis INPA 1105 no hidrolisado da cascas do Cupuaçú.
Foi possível notar que não houve declínio celular durante as 72 horas de produção
de biomassa, devido o meio de cultivo ainda ter açúcares disponíveis para o crescimento
celular. Râbelo (2011) verificou que o declínio celular da levedura S. cerevisiae ocorreu a
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L-1
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Biomassa
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partir de 72 horas de cultivo em meio contendo a Algoroba (Prosopis juliflora). Foi
possível perceber que o crescimento celular no período de 72 horas, se manteve estável em
torno de 3,5.107 cel.mL
-1.
Dentre os hidrolisados, as cascas de tucumã foram mais adequadas para a
produção de biomassa. Segundo Rodrigues (2007), a hidrólise ácida é uma das técnicas
mais eficientes, pois é capaz de recuperar até 90% dos açúcares fermentescíveis dos
resíduos lignocelulósicos, mas uma parte dos açúcares formados durante a hidrólise pode
ser degradados e transformando-se em outros compostos, que muitas vezes são tóxicos
para o metabolismo microbiano.
A Candida humilis INPA1105 apresentou uma produção de biomassa diferente
nos três substratos. Essa diferença se deve principalmente ao fato da disponibilidade inicial
dos açúcares nos hidrolisados. O processo de hidrolise ácida pode resultar em açúcares não
fermentáveis, com a formação de pentoses (xilose e outros), muitas vezes não
metabolizadas pelas leveduras do gênero Saccharomyces. Chandel et al. (2007)
especificam que algumas leveduras do gênero Candida são capazes de assimilar tais
pentoses. Pode ser que a levedura Candida humilis INPA1105 tenha consumido esses
açúcares, explicando que no período de 24 horas houve uma queda drástica na
concentração de açúcares redutores totais. Nesse contexto, as cepas padrões de
Saccharomyces cerevisiae, que são empregadas na indústria para processos fermentativos,
não são capazes de fermentar tais pentoses, tornando o estudo deste microrganismo
atrativo com características para processos biotecnológicos.
Com a finalidade de investigar a produção de etanol por C. humilis INPA1105, foi
realizada uma batelada, avaliando os parâmetros cinéticos. Durante a cinética, a levedura
C. humilis INPA1105 apresentou maior velocidade de remoção de açúcares redutores e de
crescimento celular. Assim como neste estudo, Fugita (2010) obteve no caldo de cana-de-
açúcar, um bom crescimento celular, indicando que as quantidades de açúcares presentes
no caldo eram na maior parte, metabolizadas pelas leveduras.
A Figura 4 apresenta a produção de etanol produzido pelas leveduras Candida
humilis INPA1105 e Saccharomyces cerevisiae Pe-2 pelo período de 96 horas de
bioprocesso. A C.humilis INPA1105 produziu durante as 24 horas, 19,6 % de etanol, sendo
que nas 48, 72 e 96 horas de fermentação o etanol aumentou para 28,4 %, 29,9% e 31,0%.
Durante as 96 horas de fermentação, a levedura C. humilis INPA1105 consumiu 61,9 g/L
de ART, produzindo 31,0 % de etanol, enquanto no mesmo período, a S. cerevisiae Pe-2
teve um consumo de 64,8 g/L de ART, formando 32,3 % de etanol, ou seja, a levedura
46
C.humilis INPA1105 obteve um nível bem próximo na produção de etanol durante o
período da fermentação, tendo uma diferença de 1,40 % de etanol gerado durante as duas
fermentações.
Figura 4. Produção de etanol e consumo de açúcares por C.humilis INPA1105 e S.
cereviasiae Pe-2 a partir do caldo de cana-de-açúcar.
Ao observar o etanol teórico produzido pela levedura C. humilis INPA1105, a
mesma pode ser considerada como uma boa produtora, semelhante ao produzido pela cepa
padrão. O presente trabalho demonstrou que uma levedura isolada de manipueira (C.
humilis INPA1105) foi capaz de apresentar grande crescimento celular utilizando
hidrolisados ácidos como substrato e fermentar caldo de cana para produzir etanol. Para
confirmar a produção de etanol por ambos os microrganismos, o etanol foi destilado e
queimado para comprovação.
Conclusões
A levedura C. humilis INPA1105 produz proteína unicelular usando hidrolisados
ácidos de resíduos vegetais e para a produção de etanol utilizando o caldo de cana de
açúcar.
Dos três resíduos estudados o que apresentou maior potencial para a produção de
biomassa foi o tucumã, com uma concentração de 5,29.107 células.mL
-1 e para produção de
etanol com cerca de 31,0 % a partir do caldo de cana.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
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19,0
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0 24 48 72 96
Eta
no
l (%
)
AR
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/L)
Horas
ART (S.cerevisiae Pe-2)
ART(C. humilis INPA1105)
Etanol S.cerevisiae Pe-2
Etanol C.humilis INPA1105
47
Referências
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Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L. Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017. Editora INPA
Análise microbiológica de resíduos de Musa sp. (bananeira) empregados no
cultivo de fungos comestíveis
Souza J.A.1, Pedreno G. Y. O.
2, Nunes A.S.
3, Galúcio, V.C.A
4; Sales-Campos C.
5
1Graduada em Ciências Biológicas, Universidade do Estado do Amazonas,
2Acadêmica
Universidade do Estado do Amazonas, 3, 4
Doutorandas em Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas, UFAM,
5 Pesquisadora, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. Email:
Resumo
A importância dos cogumelos comestíveis vem crescendo devido ao avanço da tecnologia
de cultivo, que possibilita a utilização de resíduos agropecuários e industriais, a produção
pode ser realizada aproveitando-se resíduos agroindustriais, principalmente por possibilitar
o aproveitamento lignocelulósico comumente desperdiçados. Neste sentido, este trabalho
teve como objetivo a análise microbiológica de resíduos de bananeira (pseudocaule e
engaço) utilizados no cultivo de fungo comestível Lentinula edodes. A linhagem do fungo
foi acessada da Micoteca do laboratório de Fungos Comestíveis do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia. Foram separados resíduos das cultivares prata-anã e thap maeo,
divididos em dois pares de mesma grandeza e unidade interdependentes e calculada a
porcentagem da umidade perdida na secagem. Foram utilizadas 4 amostras de 10g de cada
resíduo das duas cultivares de Musa para a análise microbiológica. Para o meio de cultivo,
inóculos crescidos em BDA foram transferidos para placas de Petri contendo meio RDA. O
pseudocaule da cultivar thap maeo apresentou menor rendimento (3,6%), mas o seu engaço
apresentou maior rendimento com 18,33% do total de matéria seca extraída. Na análise
microbiológica, em 100% das amostras foram detectados coliformes totais e fecais, bem
como a presença da bactéria Escherichia coli. No crescimento micelial, as médias de
crescimento de L. edodes em meios de cultivo suplementados com farelo de cereais, o
maior crescimento foi no tratamento com engaço thap maeo. O protocolo inicial para
assepsia utilizado não foi suficiente para a inibição dos microrganismos contaminantes,
sendo necessária uma outra esterilização e ajuste no protocolo.
Palavras-Chave: Resíduos agroindustriais, cultivares de bananeira, crescimento micelial,
assepsia.
Introdução
A preservação ambiental tem despertado o interesse por fontes renováveis e os
resíduos agroindustriais tornaram-se uma fonte importante para a produção de novos
49
materiais, de produtos químicos e de energia. O desenvolvimento e implementação de
processos sustentáveis capazes de converter biomassa em vários produtos com valor
agregado é uma necessidade absoluta para aproveitar resíduos agroindustriais e gerar
menor impacto ambiental (Rosa et al., 2011).
Nesse contexto, o Brasil é um dos grandes produtores mundiais de banana, sendo
a terceira fruta mais exportada no Brasil (FAO, 2014), consistindo a região norte na
terceira maior produtora. O Amazonas é o segundo maior produtor da região, ficando atrás
apenas do Estado do Pará (IBGE, 2008).
Após a produção do cacho de banana, uma vez a cada 18 meses de cultivo, grande
parte da bananeira é descartada, deixando-se apenas 50 cm do pseudocaule que servirá de
fonte nutricional aos brotos. O restante da planta é inutilizada (Alves e Oliveira, 1999), o
que gera grande quantidade de resíduos pós-colheita (Coelho et al., 2001). Tanto o
pseudocaule quanto as folhas da bananeira são ricas em fibras lignocelulósicas (Soffner,
2001), o que os tornam substratos propícios ao desenvolvimento de fungos comestíveis.
O avanço na introdução dos cogumelos comestíveis na alimentação ocidental tem
obtido destaque devido às suas características nutricionais e funcionais. No entanto, há a
necessidade de estudos a cerca da matéria-prima utilizada para a formulação de substratos
de cultivo (Cunha et al., 2013). Por outro lado, vale ressaltar que na produção de
alimentos, um fator importante é a qualidade microbiológica desse produto, que permite
avaliá-lo quanto às condições de processamento, armazenamento e distribuição para o
consumo, sua vida útil e quanto ao risco à saúde da população. A geração de resíduos
provenientes da bananicultura gera preocupação não apenas na utilização deste em alguma
formulação, mas também em se conhecer a sua qualidade conforme os parâmetros legais.
Diante do exposto, o objetivo desse trabalho foi a avaliação microbiológica de
resíduos de bananeira (pseudocaule e engaço) utilizados no cultivo de fungo comestível,
como parâmetro para a qualidade do produto de valor agregado (cogumelo) produzido.
Material e Métodos
As duas cultivares de bananeira (prata-anã e thap maeo) e seus respectivos
resíduos (pseudocaule e engaço) foram cedidas por produtores rurais do município de
Parintins/AM.
Os resíduos in natura coletados foram pesados na coleta e após a secagem para
avaliação do percentual de umidade perdida. O pseudocaule e o engaço de bananeira in
natura foram triturados em triturador de resíduos orgânicos Trap 200. O material triturado
50
foi seco ao ar livre em estufa solar, e posteriormente, acondicionados em depósitos
plásticos em sala refrigerada até posterior utilização.
Meios de cultura específicos para cada grupo de microrganismos tanto para
coliformes, Escherichia coli, como para bolores e leveduras, foram utilizados nas análises.
Para as análises microbiológicas, 10g das amostras de resíduos foram transferidas
para 490 mL de água destilada autoclavada para realização da diluição (1:50) preconizada
para amostras sólidas. Desta diluição foram transferidos assepticamente 25 mL para
frascos contendo 225 mL de água peptonada estéril (diluição 10–1
). A partir dessa diluição,
foram feitas as diluições seriadas até 10–3
com o mesmo diluente.
A determinação do número mais provável (NMP.g–1
) de coliformes totais e
termotolerantes foi realizada com a retirada de alíquotas de 1 mL de cada diluição,
inoculadas em séries de três tubos contendo 9 mL de caldo Lauril Sulfato Triptose (LST),
com tubo de Duhran invertido (teste presuntivo) e incubados a 35°C por 24-48 horas.
Para a confirmação da presença de E. coli, o conteúdo dos tubos contendo caldo
EC que apresentaram turbidez (com ou sem produção de gás no interior do tubo de
Durhan) foram semeadas em placas de Petri contendo ágar eosina azul de metileno (EMB)
e incubadas à 35°C por 24-48 horas para confirmação.
Para a contagem de bolores e leveduras, foi utilizado o método de plaqueamento
direto em superfície das diluições 10–1
e 10–2
, em meio batata dextrose ágar (BDA).
Alíquotas de 100 μL foram semeadas na superfície do BDA e as placas incubadas a 22ºC
por 3 a 5 dias. Os resultados foram expressos pelo número de Unidades Formadoras de
Colônia por grama de material (UFC.g–1
).
A linhagem do fungo Lentinula edodes LED 96/13 foi acessada da Micoteca do
Laboratório de Fungos Comestíveis do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia –
INPA – Procedente da UNESP de Botucatu.
Inóculos da cultura crescido em BDA foram transferidos para placas de Petri
contendo meio resíduo-dextrose-ágar (RDA), preparados conforme Eira e Minhoni (1997)
e Eira et al. (1997), com adaptações de Sales-Campos (2008), para promover adaptação do
micélio do fungo ao substrato de cultivo. Os meios de cultura foram feitos utilizando-se em
base seca, 100g de substrato/L, preparado com 80% de resíduo, 18% farelo de cereais
(mistura de arroz, trigo e milho) e 2% de CaCO3, para ajuste do pH (6,50). Os meios de
cultura contendo os diferentes resíduos foram preparados a partir da infusão de cada
substrato em 1,5L de água fervente durante 30 minutos. Foram filtrados em algodão e
51
completados os volumes para 1L. Após a filtração, foram adicionados a cada meio, 12g de
dextrose e 15g de agar/L. Os meios de cultura foram elaborados a partir do pseudocaule e
do engaço das cultivares prata-anã e thap-maeo, conforme código: PSPA – pseudocaule de
prata-anã, PSTM – pseudocaule de thap-maeo, ENPA – engaço de prata-anã e ENTM –
engaço de thap-maeo.
Para a esterilização dos meios alternativos foi adotado o processo de autolavagem
a 1 atm durante 15 minutos. Em seguida foram vertidos em placas de Petri e inoculados em
com o micélio do fungo crescido em meio BDA e incubadas a 25º C. Ao grupo controle
não foi adicionada a mistura de farelos.
A mensuração do crescimento de L. edodes foi realizada a cada 24 horas até a
colonização total do meio na placa de Petri, através da progressão linear da fronteira micelial,
feita com régua milimetrada na base de cada placa de Petri. As medidas foram mensuradas em
duas direções perpendiculares. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com
fatorial 2x2 (duas cultivares de bananeira e dois tipos de resíduos) com cinco repetições para
cada tratamento. Para análise estatística dos dados foi utilizado o software BioEstat 7.0.
Resultados e discussão
De acordo com os dados da Tabela 1, as duas cultivares de bananeira apresentam
pseudocaule rico em água, refletindo em baixo rendimento da matéria seca. O pseudocaule
da cultivar thap maeo apresentou menor rendimento (3,6%), mas o seu engaço apresentou
maior rendimento com 18,33% do total de matéria seca extraída do resíduo seco. Ao nível
de 5% de significância foram observadas diferenças estatísticas entre o rendimento do
engaço da cultivar thap-maeo e os demais resíduos estudados.
De acordo com Jarman et al. (1997), o pseudocaule da bananeira é constituído de
feixes fibrosos com comprimentos relacionados ao comprimento do pseudocaule e
representa de 1-1, 5% da composição. Os outros constituintes são substâncias
mucilaginosas (4 a 8%) e água (90 a 96%). Além do elevado teor de umidade, Silva (1998)
e Cordeiro et al. (2004) verificaram um elevado teor de extrativos para o pseudocaule de
bananeira: 14,1% de extrativos (em base seca). Kluge et al. (1999) obtiveram uma média
para o peso do engaço de 8% do peso do cacho para o grupo Cavendishii.
52
Tabela 1. Percentuais de umidade e matéria seca de pseudocaules e engaços das cultivares
de bananeira.
Variedades de
bananeira
UMIDADE E MATÉRIA SECA
Peso in natura
(kg)
Peso após
secagem (kg)
Umidade (%) Matéria seca
(%)
Pseudocaule prata-
anã - PSPA
70,27 2,72 96,13 3,87 A
Pseudocaule thap
maeo – PSTM
80,97 2,91 96,40 3,60 A
Engaço de thap
Maeo - ENTM
3,6 0,660 81.67 18,33 B
Engaço de prata-
anã - ENPA
16 1,90 88,12 11,87 C
Obs.: Médias em letras iguais não diferem entre si pelo (teste de Tukey, 1%).
Nas amostras de engaço e pseudocaule das cultivares de bananeira foram
detectadas presença de coliformes totais e termotolerantes (Tabela 2). 90% dos tratamentos
com as diluições seriadas apresentaram indicação de turbidez ou produção de gás no
interior do tubo de Duhran. Em 100% das amostras foram detectados coliformes, tanto do
grupo totais quanto fecais. Nos engaços de Musa sp., a presença de coliformes totais e
termotolerantes foi maior que nos pseudocaules, sendo detectado no engaço de prata-anã,
quantidades >1100 NMP/g e no pseudocaule de prata-anã, 210 NMP/g (Tabela 2).
Tabela 2. Determinação do número mais provável (NMP.g–1) de coliformes e
termotolerantes.
De acordo com a legislação vigente RDC nº 12/2001ª da ANVISA – técnica
utilizada para alimentos, os resíduos estão fora dos padrões exigidos, pois estabelece o
Resíduo Coliformes totais e termotolerantes
(NMP/g)
Pseudocaule de prata-anã 210
Pseudocaulde de thap maeo 27
Engaço de prata-anã >1100
Engaço de thap maeo >1100
53
valor <3,0 NMP/g para a amostra. Porém, vale ressaltar que os resíduos utilizados são
descartes de lavouras, sendo considerado lixo e não possuindo uma legislação especifica
para análise microbiológica.
O número elevado de coliformes pode significar contaminação direta com material
fecal, ou manipulação inadequada, como higiene do manipulador, transporte e
acondicionamento inadequados (Franco e Landgraf, 1996).
Para a confirmação de E. coli, foram observadas as características da coloração da
colônia após semeadura em caldo EC – pigmentação verde metálico indicativo da presença
da bactéria (Figura 1). Essas características foram observadas nos meios elaborados com
engaços das duas cultivares, prata-anã e thap-maeo. Por esse tipo de resíduo
lignocelulósico ser coletado em feiras ou mesmo lixeiras, pode refletir em material
altamente contaminado microbiologicamente com coliformes do grupo termotolerantes.
Figura 1. Presença de E. coli no resíduo do engaço de prata-anã (a) e engaço de thap-maeo
(b).
Para bolores e leveduras, não houve crescimento significativo. Por outro lado,
observaram-se quantidades elevadas de bactérias. Acredita-se que as mesmas inibiram o
crescimento do cogumelo. Microrganismos contaminantes crescem no substrato,
destruindo o micélio, infectando os esporos ou meramente competindo com o cogumelo e
impedindo o seu crescimento em todo o substrato.
Após análise microbiológica procedeu-se com o cultivo do cogumelo comestível L.
edodes utilizando os resíduos das cultivares de bananeira, seguindo o protocolo de assepsia
proposto por Sinoga et al. (2003), observando-se a presença ou ausência de contaminações.
De acordo com as observações, houve contaminações tanto no tratamento quanto
no controle. Possivelmente a esterilização do meio de cultivo realizada em autoclave
(a) (b)
54
durante 15 minutos a 1 atm não foi suficiente para eliminar os microrganismos presentes
nos resíduos, refletindo nos percentuais de contaminações observados na tabela 3.
Tabela 3. Percentuais de contaminação dos meios alternativos elaborados a partir de
resíduos de cultivares de bananeira esterilizados a 1 atm durante 15 minutos em autoclave. Resíduos Tratamento Controle
Pseudocaule de Prata-anã 0% 40%
Pseudocaule de Thap maeo 60% 0%
Engaço de Prata-anã 20% 0%
Engaço de Thap maeo 20% 0%
O tempo de autoclavagem do resíduo é crucial para o êxito do cultivo. Neste processo
que utiliza a temperatura e a pressão para a eliminação de microorganismos indesejados, por
diversas vezes faz-se necessário aumentar o tempo do processo de esterilização para assegurar
a qualidade do cultivo. O tempo de assepsia foi alterado de 15 para 45 minutos para eliminação
de microrganismos contaminantes.
Mazaro (2007) observou em seu trabalho que o tempo de autoclavagem é um fator
determinante no processo de esterilização do substrato, ele elevou o tempo de assepsia para 60
minutos, pois com 30 minutos de autoclavagem não foi suficiente para eliminação completa
dos microrganismos contaminantes.
Após esses processos serem adotados procedeu-se novamente com o cultivo em placas
de Petri utilizando os resíduos (engaço e pseudocaule) das cultivares de bananeira. Não foram
observadas contaminações após as medidas adotadas para assepsia do substrato.
Na figura 3 observa-se que o tratamento com engaço da cultivar thap maeo apresentou
a maior média de crescimento micelial (1,34 cm), seguido do crescimento em pseudocaule de
prata-anã (1,27 cm). Quando comparado ao grupo controle (sem adição da mistura de farelos),
observa-se que o fungo L edodes apresentou melhor crescimento em meio à base de
pseudocaule de prata-anã sem suplementação de farelos (1,44 cm), seguido do crescimento em
engaço da mesma cultivar sem suplementação (1,33 cm). Por outro lado, vale ressaltar, que no
meio de cultivo a base de engaço de thap maeo, o fungo apresentou maior crescimento com a
suplementação de farelos (1,34 cm) quando comparado ao seu controle, porém sem diferenças
estatísticas significativas.
Ao nível de 99% (p < 0,01) de probabilidade, pelo teste de Tukey foram evidenciadas
diferenças estáticas entre o crescimento micelial em meio de cultivo à base de pseudocaule de
prata-anã suplementado com mistura de farelos e seu respectivo controle. Sendo que a maior
55
média (1,44 cm) observada no grupo controle. Assim, supõe-se que os níveis de carbono e
nitrogênio presentes no meio de cultivo à base de pseudocaule de prata-anã, são suficientes
para promover um crescimento micelial mais eficiente e que a adição de cereais possivelmente
ocasionou excesso de nitrogênio e consequentemente inibiu o crescimento fúngico.
Segundo Gomes-Da-Costa et al. (2008) e Sales-Campos e Andrade (2010), o tipo de
substrato e a suplementação podem influenciar na velocidade do crescimento micelial. Maziero
et al. (1990) e Ragunathan et al. (1996) também citaram que a velocidade de crescimento e o
vigor são parâmetros que podem ser influenciados pela composição do substrato, pelos isolados
testados e pela suplementação fornecida.
De acordo com Donini et al. (2005), um substrato muito enriquecido pode
desfavorecer a degradação da lignina pelo fungo podendo retardar ou até reprimir seu
crescimento micelial. A suplementação de substratos ligninocelulósicos altera a relação C:N,
elevando os níveis de nitrogênio que em excesso pode inibir o crescimento micelial do fungo
(Dias et al., 2003; Singh e Verma, 1996; Boyle, 1998, Sales-Campos, 2008).
Figura 3: Medias de crescimento micelial (cm) de L. edodes em meios de cultivo elaborados com
resíduos de bananeira com e sem suplementação de cereais. Códigos dos meios de cultivo
seguidos de letra t correspondem ao tratamento e seguidas de letra c correspondem ao controle –
PSPA-pseudocaule de prata-anã, PSTM-pseudocaule de thap-maeo, ENPA-engaço de prata-anã,
ENTM-engaço de thap-maeo. Médias com letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey.
Eixo x: médias em cm do crescimento micelial, eixo y: grupos de tratamentos e controles.
1,05
1,1
1,15
1,2
1,25
1,3
1,35
1,4
1,45
1,5
PSPAt PSPAc PSTMt PSTMc ENPAt ENPAc ENTMt ENTMc
Cre
scim
ento
mic
elila
d L
.ed
ode
s em
mei
os
elab
ora
do
s co
m r
esíd
uo
s d
e b
anan
eira
Meios de cultivo
A
A
A
B
A A A
A
56
Conclusões
Foram detectadas a presença de coliformes totais e termotolerantes em todos os
tratamentos, com NMP maiores (>1100) nos tratamentos com engaços das duas cultivares
de bananeira;
Não foram encontradas presenças de bolores e leveduras;
Foi necessário elevar o tempo de esterilização em autoclave a 1 atm de 15 para 45
minutos para eliminação de contaminantes.
L. edodes obteve seu melhor crescimento em meio suplementado com pseudocaule
de prata-anã sem mistura de farelos.
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Atividade antifúngica de Picrolemma sprucei Hook sobre o crescimento
de fitopatógenos
Almeida, A.F.
1; Bentes, J.L.S.
2; Hidalgo, A.F.
2
1Aluna de doutorado do Programa de Pós-Graduação em Agronomia Tropical-UFAM;
2Faculdade
de Ciências Agrárias-UFAM. Av. Rodrigo Otávio, 6200, 69080-000, Manaus-AM. E-mails:
[email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
O trabalho teve por objetivo avaliar in vitro o efeito de duas concentrações do extrato
vegetal aquoso de caferana sobre o crescimento micelial de Colletotrichum guaranicolla,
Corynespora cassicola e Colletotrichum spp. O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado, com 4 repetições. Foram utilizadas alíquotas de 100µL (0,01%) e
200µL (0,02%) de extrato aquoso de caferana. Para obtenção do extrato foi utilizado 50g
do material vegetal, triturado e misturado em 500mL de água destilada. O extrato foi
filtrado em papel filtro e sistema millipore® com membrana 0,45µm e distribuído em
placas de petri com auxílio de alça de Drigalsky, onde foram depositados discos de micélio
de cada um dos fungos, medindo 0,3 cm de diâmetro. As placas foram incubadas a 28 °C
no escuro. A avaliação do crescimento micelial foi realizada através de medições em dias
alternados do diâmetro das colônias, e os tratamentos foram analisados em relação ao
crescimento micelial da colônia e a porcentagem de inibição de crescimento. O extrato
bruto aquoso de caferana reduziu o crescimento micelial de Corynespora cassicola,
podendo ter potencial para uso como medida alternativa de controle deste fitopatógeno. Os
fungos Colletotrichum guaranicolla e Colletotrichum spp não foram inibidos com o uso do
extrato aquoso de caferana nas concentrações de 0,01 e 0,02%.
Palavras-chave: caferana, inibição de crescimento, fungos.
Introdução
Em todos os lugares onde se pratica uma agricultura econômica, a intervenção para o
controle de doenças de plantas é largamente realizada por meio de agrotóxicos. O uso
racional destes produtos pode ter, em curto prazo, um efeito positivo para o produtor. No
entanto, em longo prazo, os resultados para a sociedade e para o ambiente podem se tornar
negativos, devido a poluição causada pelos resíduos, além do surgimento de isolados dos
patógenos resistentes às substâncias químicas utilizadas (Kimati et al., 1997; Zadoks,
1992).
59
Desse modo se faz necessária a busca de medidas alternativas de manejo fitossanitário
compatíveis com a qualidade ambiental visada no manejo sustentável, surgindo medidas de
controle alternativo para as doenças de plantas (Franzener et al., 2003; Fonseca et al.,
2015).
Plantas medicinais possuem compostos secundários que tanto podem ter ação
fungitóxica, como eliciadora, ativando mecanismos de defesa nas plantas, tornando-se uma
alternativa no controle de fitopatógenos com potencial ecológico para substituir o emprego
de agrotóxicos, por meio da utilização de seus subprodutos, como extrato bruto e óleo
essencial (Matos, 1997; Stangarlin et al., 1999).
Neste sentido, algumas plantas se destacam, como é o caso da planta medicinal
Picrolemma sprucei Hook (caferana). Pertence à família Simaroubaceae, que se distingue
pela presença nos seus tecidos de substâncias terpênicas altamente oxigenadas, conhecidas
como quassinóides (Thomas, 1990).
Estudos químicos realizados em folhas de P. sprucei isolaram 15-desacetilsergeolida,
sergeolida e isobruceína (Polonsky et al. 1984). Os quassinóides sergeolida, isobruceína e
15-desacetilsegeolida apresentaram potente atividade antifágia e inibição do crescimento
do verme Heliothis virescens f. (lagarta do broto do tabaco ou lagarta-da-maça) e da praga
do milho Agrotis ípsilon Hfn. (lagarta-rosca negra), sem provocar a morte dos insetos
(Lidert et al., 1987).
Polonsky et al. (1989) demonstraram que a isobruceína apresenta forte atividade
antifágica frente à espécie de pulgão Myzus persocaes s.s (Sulzer) (Hemíptera, Aphididae),
a uma concentração de 0,05%, com uma baixa fitotoxicidade a Brassia campestres var.
Chinensis (L.) Makino (repolho branco chinês – pak choi), enquanto que a sergeolida não
se mostrou eficaz até uma concentração de 0,1%; porém, causou danos consideráveis às
folhas de repolho.
Tendo em vista as propriedades existentes na caferana, objetivou-se avaliar in vitro o
efeito de diferentes concentrações do extrato aquoso de caferana sobre o crescimento de
Colletotrichum guaranicolla, Corynespora cassicola e Colletrotrichum spp.
Material e Métodos
O presente trabalho foi desenvolvido no laboratório de Microbiologia e Fitopatologia
da Universidade Federal do Amazonas – UFAM. Os fungos, Colletotrichum guaranicola e
Corynespora cassicola, foram obtidos da coleção fitopatológica do laboratório, e o fungo
60
Colletotrichum spp. foi obtido a partir de frutos de pimenta de cheiro (Capiscum spp.),
com sintomas de antracnose.
Para a obtenção do extrato, folhas frescas de P. sprucei Hook foram coletadas no
período da manhã, no mini-campus da UFAM, lavadas com água corrente e foram
dispostas em uma bancada para secar em temperatura ambiente durante 7 dias. Para
obtenção do extrato bruto, as amostras foram trituradas em liquidificador, obtendo-se 50g
de material, e adicionados 500mL de água destilada, permanecendo 48 horas em
temperatura ambiente e ao abrigo da luz, sendo agitado 1 vez por dia. Após esse período,
foi realizada a filtragem em gaze e papel filtro esterilizado, seguido de esterilização a
vácuo em filtro Milipore® com membrana de porosidade de 0,45 µm. A solução final foi
armazenada em frasco esterilizado, identificado, fechado e conservado em freezer (± 4 ⁰C)
(Bonaldo, 2004; Bandeira, 2013).
Para avaliar o crescimento micelial foram utilizadas duas doses de extrato bruto
vegetal de caferana 0,01% e 0,02%. Alíquotas de 100µL e 200µL do extrato de caferana
foram colocados no centro de placas de Petri contendo cerca de 15 mL de BDA e
distribuídas sobre a superfície do meio com auxílio de alça de Drigalsky. Em seguida,
discos de 3 mm de diâmetro contendo micélio dos fungos C. guaranicolla, C. cassicola e
C. spp. com nove dias de cultivo foram depositados no centro das placas, que foram
vedadas com filme plástico e mantido a 28°± 2°C, no escuro. A testemunha constou da
adição água destilada e esterilizada ao meio (Hillen, 2012).
A avaliação do crescimento micelial foi realizada por meio de medições em dias
alternados do diâmetro das colônias, obtida pela média de duas medidas diametralmente
opostas, até que as colônias no tratamento testemunha atingisse a borda da placa. A
porcentagem de inibição do crescimento (PIC) foi obtida por meio da fórmula: PIC =
[(diâmetro da testemunha – diâmetro do tratamento)/diâmetro da testemunha] x 100, para
cada extrato em relação à testemunha (Fernandes, 2015).
O delineamento experimental foi inteiramente casualisado, com quatro repetições. Os
resultados foram analisados estatisticamente com o auxílio do programa ASSISTAT v. 7.7
(Silva e Azevedo, 2016) e comparação de médias pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
Resultados e Discussão
O extrato aquoso da caferana promoveu significativa redução no crescimento do fungo
Corynespora cassicola, com a dose de 100 µL diferindo do tratamento testemunha (Tabela
1). Houve também, uma tendência do extrato aquoso dessa planta em inibir os
61
crescimentos do Colletotrichum guaranicolla e do Colletotrichum spp., mas não ao ponto
de ser um efeito significativo estatisticamente. Os resultados obtidos estão de acordo com
as avaliações de outros autores, em estudos com fungos fitopatogênicos, nas quais se
verificaram ocorrer maior inibição do crescimento micelial com o emprego das maiores
concentrações dos extratos vegetais (Franzener et al., 2003; Souza et al., 2007). É possível
que uma dose mais concentrada desse extrato resulte numa inibição significativa desses
dois fungos, pois pode-se verificar pelos dados da Tabela 1, que à medida que a dose é
aumentada, menor é o crescimento micelial dos mesmos.
Tabela 1. Média do crescimento micelial de Colletotrichum guaranicolla,
Corynespora cassiola e Colletotrichum spp. sob influência de extrato aquoso
de caferana em duas diferentes concentrações. Alíquota/Extrato
Aquoso
Fungos Fitopatógenos
Colletotrichum guaranicola
Corynespora cassicola
Colletotrichum spp.
Testemunha 8,00 a 8,00 a 8,00 a
100µL 7,66 a 5,60 b 7,71 a
200µL 7,61 a 6,21 ab 7,21 a
CV (%) 7,65 14,35 9,35
Venturoso (2011), observou menores porcentagens de inibição com o uso do extrato
de canela sobre o crescimento de Colletrotichum sp. e para o Fusarium solani não se
verificou altas inibições, mesmo nas maiores concentrações.
O extrato aquoso de caferana não resultou em redução no diâmetro da colônia de
Colletotrichum spp. e Colletotrichum guaranicolla em comparação ao tratamento controle
(Figura 1, Figura 3, Tabela 1).
Figura 1. Crescimento micelial (cm) de Colletotrichum spp. sob influência de duas
concentrações de extrato aquoso de caferana.
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
0 2 4 6 8 10 12 14
Diâ
met
ro d
a C
olô
nia
(cm
)
Dias de Incubação
Testemunha
0,01%
0,02%
62
Para o fungo Colletotrichum guaranicolla não foi observada redução do crescimento
micelial (Figura 2).
Figura 2. Crescimento micelial (cm) de Colletotrichum guaranicolla sob influência
de duas concentrações de extrato aquoso de caferana.
Segundo Simões e Spitzer (2000) os extratos podem perder sua capacidade de inibição
devido à volatilização dos seus constituintes químicos na presença de luz, calor, ar e
umidade no interior das placas de Petri.
Outro aspecto que deve ser levado em consideração são os aspectos agronômicos. Essa
possibilidade é reforçada pelos estudos de Morais (2009) e Ehlert et al. (2013) que, ao
estudarem os efeitos dos fatores abióticos e de diferentes épocas e horário de colheita na
composição química de óleos essenciais, constataram melhor adaptação das plantas às
condições de alta intensidade luminosa, e que época e horários de colheita influenciaram
na percentagem relativa dos principais constituintes químicos dos óleos essenciais.
O extrato aquoso de caferana promoveu uma redução no crescimento do fungo
Corynespora cassicola (Figura 3) quando comparado ao tratamento controle. No entanto,
não houve diferença significativa com o aumento da concentração de extrato.
Resultado semelhante foi encontrado por Cunico et al. (2006), que não verificou
diferenças sobre o crescimento micelial de Fusarium oxysporum, utilizando extratos de
Ottonia martiana nas concentrações de 12, 5, 25 e 50%.
De acordo com Silva (2006), a discrepância entre os resultados obtidos com o uso de
extratos vegetais no controle de fitopatógenos justifica-se pela quantidade e composição
Diâ
met
ro d
a C
olô
nia
(cm
)
Dias de Incubação
Testemunha
0,01%
0,02%
63
química variáveis dos extratos. Leme et al. (2007) verificaram que a forma de esterilização
e o tempo de armazenamento do extrato de capim-limão interferiram na atividade do
mesmo em relação ao desenvolvimento micelial.
Figura 3. Crescimento micelial (cm) de Corynespora cassicola sob influência de
duas concentrações de extrato aquoso de caferana.
Conclusões
O extrato bruto aquoso de caferana reduziu o crescimento micelial de Corynespora
cassicola, podendo ter potencial para uso como medida alternativa de controle deste
fitopatógeno
Os fungos Colletotrichum guaranicolla e Colletotrichum spp não foram inibidos
estatisticamente com o uso do extrato aquoso de caferana nas concentrações de 0,01% e
0,02%.
Agradecimentos
À CAPES pela concessão da bolsa e ao PGATR (UFAM) pela estrutura de
laboratórios oferecida para o desenvolvimento do trabalho.
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(cm
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1Graduanda do curso de Agronomia, Universidade Federal do Amazonas,
2Bolsista
FIXAM/FAPEAM, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. 3Pesquisador, Instituto Nacional
de Pesquisas da Amazônia, E-mails: [email protected], [email protected] [email protected], [email protected]
Resumo
Os microrganismos são uma rica fonte de proteases, entre eles, destacam-se as
rizobactérias encontradas nas rizosferas das plantas e dentro de nódulos de leguminosas. A
Doença Celíaca (DC), caracterizada por um processo inflamatório na mucosa do intestino
delgado devido à presença do glúten, não tem tratamento além da dieta, assim, uma
alternativa seria o uso de algum bioproduto capaz de neutralizar ou evitar os efeitos
nocivos dessa proteína para os celíacos. Em vista disso, foram realizados experimentos
iniciais para obter rizobactérias produtoras de proteases capazes de degradar o glúten
eficientemente. Mais de 20% de um total de 164 rizobactérias testadas apresentaram
atividade proteolítica no glúten sob diferentes condições de tratamento: a uma temperatura
de 26 e 36 °C em meios de cultivos sólido e líquido MG (manitol e glúten) e G (somente
glúten). Mais de 20% das rizobactérias testadas apresentaram habilidade em degradar o
glúten, entre as quais, sete (INPA 959, 962, 963, 964, 965, 967, 968) destacaram-se pelos
altos índices enzimáticos. O meio de cultivo mais adequado foi o MG a uma temperatura
de 26 °C, em que houve a maior produção de proteases.
Palavras-chave: Microbiota do solo, metabolismo microbiano, proteases.
Introdução
As proteases são largamente utilizadas tanto na área de saúde quanto na alimentícia.
Essas enzimas têm sido incorporadas, por exemplo, aos alimentos das aves e suínos com o
propósito de melhorar a digestão de várias fontes proteicas. As dietas desses animais,
compostas principalmente de milho e soja, possuem alguns componentes que podem
dificultar a digestão e prejudicar a sua integridade intestinal. A soja, alimento de alto valor
nutritivo (com cerca de 45% de proteína) e o milho (com cerca de 10% de proteína)
possuem compostos de baixa digestibilidade, reduzindo assim, a absorção dos nutrientes
(Carvalho, 2012). Dessa forma, enzimas proteolíticas são utilizadas como alternativa para
melhorar a qualidade do farelo com esses ingredientes proteicos.
67
Outro fator importante relacionado à área alimentícia e da saúde é que existem
pessoas com predisposição genética para intolerância ao glúten, caracterizada pela Doença
Celíaca (DC). A ingestão contínua dessa proteína desencadeia um processo inflamatório na
mucosa do intestino delgado, levando ao atrofiamento das vilosidades intestinais e,
consequentemente, a má absorção dos nutrientes durante a digestão. Quando não tratada
pode levar a uma série de patologias que podem envolver a pele, o fígado, sistema nervoso,
reprodutivo, endócrino e ossos (Silva et al., 2006; Silva e Furlanetto, 2010; Stoven et al.,
2012).
O glúten, o causador da manifestação da doença, é um composto protéico
encontrado em cereais como o trigo, cevada, centeio e aveia de grande importância na
dieta. Ele constitui cerca de 90% das proteínas presentes no endosperma do grão do trigo e
subdivide-se em duas frações de acordo com suas características moleculares – glutenina e
gliadina, que são parcialmente digeridas pelas enzimas do sistema digestório, sendo
consideradas altamente tóxicas para os celíacos (Wieser, 2007; Araujo et al., 2010; Stoven
et al., 2012).
Mundialmente, a DC é considerada um problema de saúde pública devido a sua
morbidade e à probabilidade do aparecimento de complicações graves, principalmente
linfomas e carcinomas associados ao trato gastroentérico. E o único tratamento para a
doença é a total exclusão do glúten na dieta (Nascimento et al., 2012; Andreoli et al., 2013;
Mooney et al., 2014). Até o ano de 1970, acreditava-se que a prevalência da DC na
população geral fosse de 0,03% (Tack et al., 2010). No entanto, este valor aumentou
significativamente e encontra-se em torno de 1-2%, com uma distribuição bastante
homogênea em todo o mundo (Rodrigo Saez et al., 2011). Uma das razões para este
aumento é a maior sensibilidade dos métodos diagnósticos, porém os fatores de risco
ambientais também devem ser considerados (Lebwohl et al., 2014).
Buscando uma alternativa para o tratamento da DC, muitos microrganismos, tais
como as rizobactérias estão sendo estudadas quanto à sua capacidade na produção de
enzimas proteolíticas com inúmeras funções bioativas (Oliveira, 2014). Em vista disso, o
objetivo do presente trabalho foi obter rizobactérias de nódulos de leguminosas capazes de
degradar o glúten, avaliando sua eficiência em consumir esse composto em meios de
cultivo sólido e líquido, em diferentes temperaturas, a fim de se obter aquelas com um
maior potencial enzimático, visando o interesse para a saúde pública com base no possível
uso de seus metabólitos na bioindústria em benefício das pessoas com a DC.
68
Material e Métodos
Os isolados bacterianos foram obtidos de nódulos de raízes de leguminosas
coletadas às margens de estradas federais (em municípios circunvizinhos de Manaus /
Amazonas) e dentro de reservas pertencentes ao INPA. No laboratório, cada nódulo foi
lavado com etanol (92%) por 3 minutos, seguido por uma desinfecção superficial com
hipoclorito de sódio por 4 minutos e dez lavagens com água estéril. Em seguida, os
nódulos foram pressionados com auxílio de espátula estéril e estriados com alça
bacteriológica em placas de Petri contendo meio YMA (Yeast Manitol Agar) esterilizado
(Vincent, 1970). As placas com os isolados foram incubadas a 26 ºC até o crescimento das
colônias (cerca de 3 dias). Após o crescimento de colônias de bactérias, estas foram
novamente isoladas e repicadas para novas placas contendo YMA para obtenção de
colônias puras.
Os isolados de rizobactérias purificados foram testados em meio de cultura sólido
YMA, onde se substituiu o manitol pelo glúten. Cada isolado de rizobactéria foi inoculado
nas placas de Petri contendo YA com glúten para visualização do crescimento da colônia e
do halo proteolítico (região transparente ao redor das colônias). Com o auxílio de uma alça
bacteriológica, foi retirada uma porção da colônia bacteriana, realizando-se um leve toque
no meio de cultura. Cada placa conteve quatro repetições de uma colônia selecionada. As
placas foram incubadas a 26 ºC e avaliadas após três dias.
A avaliação da atividade proteolítica se deu por difusão radial em meio sólido, em
que o índice enzimático ou índice de degradação do glúten (IDG) para cada isolado foi
obtido pela fórmula: DD (média do diâmetro da zona de degradação em mm) / DC (média
do diâmetro da colônia em mm) (Hankin e Anagnostakis, 1975).
Com o objetivo de selecionar o meio de cultivo adequado para a produção de
metabólitos enzimáticos, as bactérias com os maiores IDGs foram testadas quanto ao
crescimento em meio líquido em duas temperaturas (26 e 36 °C) e em duas formulações de
fontes de carbono: a) 0,2 % de glúten (meio G) (0,2 % glúten, 0,5 g K2HPO4, 0,2 g
MgSO4, 0,1 g NaCl, 0,5 g extrato de levedura em 1 L de água destilada, pH 7,0); b) 1,0 %
de manitol + 0,2 % de glúten (meio MG). Um volume de 50 mL de cada meio foi
adicionado separadamente em erlenmeyers e esterilizados a 120 ºC por 35 min. Após o
esfriamento, cada bactéria (concentração de 1,5 x 108 UFC/ mL - tempo 0) foi inoculada
em triplicata e colocada sob agitação constante em incubadora a 26 e 36 °C,
separadamente.
69
Um total de 15 mL de cada amostra foram retirados após 24h (tempo 1), 48h
(tempo 2), 72h (tempo 3) e 96h (tempo 4) e armazenados em geladeira para posterior
obtenção dos extratos brutos e realização da atividade enzimática.
Em seguida, um total de 15 mL de cada amostra do teste anterior foi coletado com a
finalidade de se obter os extratos brutos para a detecção de proteases capazes de degradar o
glúten. Primeiramente, cada amostra foi centrifugada a 5000 rpm por 5 min. Em seguida, o
sobrenadante foi filtrado em membrana Millipore 0,22 µm, armazenado em microtubos e
mantidos a 4 °C. Um total de 100 µL do extrato bruto obtido de cada amostra foi
depositado em 4 poços (6 mm cada) perfurados em placas com meio ágar-glúten e
incubado a 26 e 36 ºC, separadamente. Posteriormente, as amostras foram avaliadas a cada
24h por um período de 4 dias, quanto ao tamanho dos halos de transparência, medidos por
um paquímetro digital.
Os dados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey a 5% de
probabilidade para a comparação das médias, pelo programa Assistat versão 7.7 beta (pt)
para os diferentes tratamentos.
Resultados e Discussão
Dos 164 isolados de rizobactérias testados, 35 apresentaram atividade proteolítica
no glúten, dos quais, sete apresentaram altos índices enzimáticos (>4) (Figura 1, Tabela 1).
Figura 1. Colônias do isolado INPA 960 com os respectivos halos de transparência,
evidenciando atividade proteolítica em meio de cultivo sólido contendo 1,0% de
glúten após incubação a 26 °C por quatro dias.
Segundo Lealem e Gashe (1994), um valor de índice de atividade enzimática ≥ 2,0
é o recomendado para considerar um microrganismo como produtor potencial de enzimas
em meio sólido. Essa é uma boa metodologia para avaliar a habilidade na produção de
enzimas extracelulares em meio sólido, pois permite a triagem de uma grande quantidade
70
de microrganismos (Ceska, 1971; Hankin e Anagnostakis, 1975; Neto e Cunha, 1987; Lin
et al., 1991). É possível inferir, com base nos resultados do presente trabalho, que os
isolados mostraram capacidade quanto à degradação do glúten, produzindo enzimas
proteolíticas de forma bastante eficiente.
Os sete isolados que apresentaram altos índices de degradação enzimática foram
utilizados para os testes em meio líquido MG (manitol + glúten) e G (glúten) em duas
temperaturas distintas (26 e 36 °C), com o objetivo de selecionar o meio de cultivo e a
temperatura mais indicados para a produção de proteases capazes de degradar o glúten.
Tabela 1. Atividade proteolítica dos extratos brutos obtidos dos isolados de rizobactérias
cultivados em diferentes meios líquidos por um período de 4 dias, avaliada em
meio sólido com glúten.
Extrato brutos
dos isolados
Meios de cultivo
MG (1,0% manitol + 0,2% glúten) G (0,2% glúten)
----------halos de transparência em milímetros----------
INPA 959 2,71 eB 7,84 aA
INPA 962 7,66 bcA 7,85 aA
INPA 963 5,48 dA 0,00 cB
INPA 964 10,80 aA 8,11 aB
INPA 965 7,43 cA 5,91 bB
INPA 967 8,12 bA 0,00 cB
INPA 968 7,42 cA 0,00 cB
Obs.: Médias com letras maiúsculas iguais nas linhas e minúsculas nas colunas não diferem pelo teste de
Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Figura 2. Atividade proteolítica dos extratos brutos obtidos do isolado INPA 962 cultivado
em meio: (A) MG a 26 °C e (B) meio G a 26 °C, evidenciada pelos halos de
transparência em meio sólido contendo 1,0% de glúten após incubação a
temperatura ambiente por quatro dias.
B A
71
O meio de cultivo em que as rizobactérias apresentaram maiores atividades
proteolíticas foi o MG, destacando-se a INPA 964. As únicas exceções foram a
rizobactéria INPA 959, que apresentou maior atividade proteolítica no meio G e, a INPA
962, que mostrou atividade proteolítica igual nos dois meios (Tabela 1, Figura 2).
Quanto à temperatura, a maioria dos isolados apresentou maior atividade
proteolítica a 26 °C. As exceções foram a INPA 965 que mostrou maior atividade a 36 °C
e a INPA 959 que apresentou atividade igual nas duas temperaturas. (Tabela 2).
Tabela 2. Atividade proteolítica dos extratos brutos obtidos dos isolados de rizobactérias
cultivados em diferentes temperaturas por um período de 4 dias, avaliada em
meio sólido com glúten.
Extrato brutos
dos isolados
Temperatura
26 °C 36 °C
-------halos de transparência em milímetros-------
INPA 959 5,28 cA 5,26 cA
INPA 962 8,09 bA 7,42 bB
INPA 963 5,48 cA 0,00 gB
INPA 964 9,14 aB 9,76 aA
INPA 965 9,59 aA 3,74 dB
INPA 967 5,71 cA 2,41 fB
INPA 968 4,42 dA 2,99 eB
Obs.: Médias com letras maiúsculas iguais nas linhas e minúsculas nas colunas não diferem pelo teste de
Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Esses dados mostram que essas rizobactérias apresentam moléculas bioativas
capazes de degradar o glúten eficientemente, mas que ainda precisam ser identificadas. É
necessário, a partir desses resultados, purificá-las e caracterizá-las molecularmente,
visando o uso futuro para aplicações biotecnológicas na área da saúde.
Conclusões
Mais de 20% das rizobactérias testadas apresentaram habilidade em degradar o
glúten, entre as quais, sete (INPA 959, 962, 963, 964, 965, 967, 968) destacaram-se pelos
altos índices enzimáticos.
O meio de cultivo mais adequado foi o MG a uma temperatura de 26 °C, em que
houve a maior produção de proteases.
72
Agradecimentos
Ao INPA pela infraestrutura e, FAPEAM e CNPq pelos recursos financeiros e bolsa que
permitiram a realização dessa pesquisa.
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Isolamento, identificação e produção de celulases dos microrganismos
associados aos cupins Nasutitermes sp.
Aparício J.F.1, Silva, S.R.S
2, Souza A.Q.L
3, Freitas A.D.G
4
1Biotecnologista, Universidade Federal do Amazonas, ISB/Coari,
2Discente do PPG Bionorte, da
Universidade Federal do Amazonas, 3Docente, Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade
Federal do Amazonas, Manaus,4Docente, Universidade Federal do Amazonas, ISB/Coari. Emails:
[email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
Os cupins são consumidores de madeira, material orgânico, e em estágios de
decomposição. Existem poucos experimentos com enzimas de cupins, logo, tais
experimentos foram realizados na UFAM, Campus do ISB/Coari, AM. Os isolados foram
conservados, nesse trabalho observou-se a riqueza fúngica associada aos cupins, fungos do
gênero: Penicillium sp., Aspergillus sp., Trichoderma sp. e Xylaria sp., além de outros não
identificados. Os resultados das atividades enzimáticas da FPase, β-glicosidase e CMCase
foram significativas, porém, a atividade da FPase expressa em UI mLˉ¹ de extrato
enzimático, foi mais eficaz em relação a β-glicosidase e CMCase.
Palavras-chave: Cupins, Lignina e Celulose
Introdução
Os cupins são insetos sociais que formam colônias de indivíduos interdependentes
entre si, onde há sobreposição de gerações e cuidados com a prole. Sua estrutura social é
composta por indivíduos que se desenvolvem por paurometabolia e compreende machos e
fêmeas que se distribuem em categorias ou castas (Oliveira et al. 1986).
Os cupins são os invertebrados dominantes em ambientes terrestres tropicais e estão
espalhados desde as florestas úmidas até as savanas, sendo encontrados até mesmo em
regiões áridas (Wood, 1978; Wood e Thomas, 1982; Eggleton et al., 1996). Os térmitas
desempenham um papel importante na dinâmica dos ecossistemas em que encontram-se
presentes. O comportamento social juntamente com seus hábitos alimentares e de
nidificação, propiciam o desenvolvimento de colônias com grande número de indivíduos e
grande longevidade. Deste modo, os térmitas podem causar impactos ambientais maiores
que as atividades de muitos organismos mais conspícuos, incluindo modificações nas
75
propriedades físicas e químicas do solo, no processo de decomposição, na distribuição de
plantas e animais termitófilos e na ciclagem de nutrientes (Wood, 1978).
A grande abundância dos cupins nos ecossistemas, associada à existência de
diferentes simbiontes intestinais, confere a estes insetos a possibilidade de desempenhar
importantes papeis como super decompositores e auxilio no balanço Carbono-Nitrogênio
(Higashi e Abe, 1997). Algumas espécies possuem simbiontes intestinais capazes de fixar
nitrogênio atmosférico (Breznak et al., 1994; Tayasu, 1994).
Termitidae é a maior família de cupins e consiste de ¾ de todas as espécies conhecidas,
agrupadas em 3 subfamilias: Amitermitinae, Macrotermitinae, Nasutitermitinae. É formada
pelas espécies de cupins que fazem ninhos em formas de montículos, embora haja as que
constroem ninhos subterrâneos, e por outras que tem ninhos arborícolas ou semi-
arborícolas (Berti Filho, 1993; Constantino, 2002).
Nasutitermes é o gênero de cupins com maior número de espécies do mundo,
apresentando maior diversidade em região neotropical, além de representar o táxon com
maior número de evolução e especialização. Poucas são as espécies deste gênero que
modificam somente no solo. Algumas espécies de Nasutitermes têm a tendência de
construir ninhos vulgarmente denominados cabeça de nego em galhos de árvores,
indicando ser este o principal local de formação da colônia, ainda que o casal real
inicialmente nidifique no solo; mais tarde a colônia acaba transferindo-se para locais acima
do nível do mesmo (Fontes, 1987; Constatino, 1999).
Segundo Moore (1996), muitas fontes alimentares dos cupins são ricas em lignina e
em carboidratos, especialmente celulose, mas pobres em vitaminas, proteínas e outras
formas de nitrogênio orgânico. A lignina não é completamente degradada durante a
passagem pelo canal alimentar dos cupins (Breznak e Brune, 1994) e a nutrição desses
insetos depende do auxílio de microrganismos simbióticos. Tais relações simbióticas
tiveram um papel essencial na evolução dos térmitas, já que eles proporcionaram novas
vias metabólicas de processamento de carbono e fixação de nitrogênio a partir da quebra
dos componentes lignocelulosicos sob ação dos microrganismos simbiontes (Lima e Costa-
Leonardo, 2007). O principal alimento dos cupins vem da celulose. A celulose é um
polímero, formado por várias moléculas idênticas. A celulose é um composto duro e
resistente encontrado nas plantas, sendo ela que dá às árvores e arbustos sua estrutura. As
moléculas que compõem a celulose são de glicose, chegando a até 3 mil.
Esses simbiontes agem bem sobre a celulose, porém pouco se conhece sobre as
enzimas que atuam sobre a molécula de lignina, cuja digestão feita através de bactérias e
76
fungos são apoiadas pela ação de micélios de basidiomicetos e ascomicetos e, certamente,
também por protozoários flagelados que se alimentam de lignina. As celulases são
utilizadas em diversas aplicações biotecnológicas. Na indústria têxtil, essas enzimas são
usadas para dar melhor acabamento aos tecidos, tornando-os mais lisos, macios e com
melhor caimento. Também são utilizadas na indústria de bebidas para produção de sucos
de frutas e nos processos de vinificação. Exercem papel importante na nutrição animal. Na
fabricação de detergentes, proporcionam maior limpeza e menor degradação dos tecidos e
na indústria de polpa e papel, tornam o papel mais branco e liso. Entretanto, o interesse por
essas enzimas tem aumentado muito devido a sua utilização no processo de produção de
etanol a partir de resíduos vegetais.
Assim, considerando as boas perspectivas da utilização dessas Enzimas de origem
vegetal em diversas aplicabilidade este trabalho tem como objetivo investigar, isolar
purificar identificar e conservar fungos associados ao cupim Nasutitermites sp.
Material e Métodos
Os recipientes contendo os cupins foram conduzidos para o Laboratório de
Microbiologia do ISB (Instituto de Saúde e Biotecnologia), onde foi realizado o isolamento
dos microrganismos presentes nos cupins. Os mesmos foram levados ao freezer a 28oC
para adormecimento e em seguida levados para câmara de fluxo para assepsia. Para o
isolamento, os insetos foram divididos em cabeça, tórax e abdômen, além de termos os
insetos completos (com todas as estruturas) transferindo pequenos fragmentos dos insetos
para placa de Petri com o meio de cultura BDA (Batata Dextrose Ágar), As culturas foram
transferidas para estufa tipo B.O.D (Biological Oxygen Demand) a 26ºC. Após 7 dias, foi
realizado o isolamento, transferindo-se fragmentos de ágar contendo hifas, para novas
placas contendo o referido meio de cultura BDA. Para se obter colônias de fungo puras
realizou-se a purificação dos isolados e posteriormente a diluição seriada seguida de
plaqueamento de acordo com o protocolo de Azevedo e Costa (1973). Os fungos foram
armazenados usando os métodos de Castellani (1939) e do glicerol a 15%.
Para a identificação dos isolados, realizaram-se observações macroscópicas da
colônia (crescimento, coloração, textura e pigmento difuso) e observações microscópicas
das estruturas vegetativas (hifas) por meio de microcultivos. O aspecto macromorfológico
das colônias dos isolados foi examinado a olho nu, com atenção especial ao crescimento
micelial, a forma das bordas a presença de pigmento difuso, a textura e a coloração de
77
colônia. O aspecto micromorfológico das estruturas vegetativas e reprodutivas foi
examinada sob microscopia, em aumento total de 400X.
Para o crescimento fúngico e indução da atividade enzimática, foram preparadas
duas soluções de Manachinni sólido, uma contendo o indutor enzimático e outra sem o
indutor com a seguinte composição: KH2 PO4 – 2g; (NH4)2 SO4–1g; MgSO4 7H2O – 0,1g;
Na2HPO4- 0,98 g; Extrato de Levedura-1g; Ágar – 7,5g; Água destilada - 1000 mL.
Para a indução da enzima celulase, foi adicionado o substrato carboximetilcelulose
– CMC (0,5%). O pH para detecção de celulase foi de 5,0. Após a solução foi levada para
autoclave por 15min a 120ºC. Percorrido o tempo determinado verteu-se o meio em placas
de Petri e estas foram acondicionadas na estufa B.D.O. por 10dias.
Para a quantificação da atividade da celulase total (FPase), utilizou-se a
metodologia descrita por Ghose (1987) e para a quantificação da atividade β-glicosidase
utilizou-se o kit glucose Liquicolor em tubos de ensaios.
Para determinar a atividade CMCase (endoglucanase) utilizou-se tubo de ensaio
onde foram adicionados 450μL de CMC em tampão acetato de sódio a 1% 50 mM, pH 5,0
e 50μL das amostras. Após equilíbrio térmico em banho-maria por 10 min a 50ºC,
adicionou-se 500μL de DNS e mais 50μl das amostras nos controles totalizando 1mL os
mesmos foram levados para o banho fervente por 5 min. Após o tempo reacional foram
retirados e colocados em banho gelado nesse processo foi acrescentado 4mL de agua
destilada. As absorbâncias foram verificadas em espectrofotômetro a 540nm.
Resultados e Discussão
Foram encontrados 450 isolados fungicos e 300 isolados de bactérias nos cupins
Nasutitermites sp., tanto nos insetos completos como nos fragmentos (cabeça, tórax e
abdômen). Isto demonstra que o meio de cultura utilizado mostrou-se eficiente em garantir
uma grande diversidade de microrganismos, além das condições empregadas para o
isolamento como temperatura, pH, entre outros foram favoráveis.
A observação da diversidade fúngica foi possível quando analisamos as estruturas
macroscópica (crescimento, coloração e textura). Os gêneros Penicillium sp., Aspergillus
sp., Tricoderma sp., Fusarium sp. e Xylaria sp. foram encontrados, segundo Visser (2009).
Ninhos abandonados de Macrotermitinae geralmente apresentam os jardins de fungos
cobertos por espécie fúngica do gênero Xylaria sp. No entanto, no presente trabalho
78
encontramos este microrganismo em um ninho ativo de cupins, e no inseto principalmente
se localizando na cabeça do mesmo.
Observou-se fungos com colorações esverdeadas, amareladas marrom e branca.
Alguns com texturas liguenta e alguns esporulentos. Foi notada presença de hifas, de
conidióforo sem os conídios, e conídios de forma dispersa.
Os cupins Nasutitermites sp. apresentaram fungos do gênero Penicillium sp.,
Aspergillus sp. e Trichoderma sp. Suas presenças corrobora estudos anteriores (Grace,
1990; Zoberi, 1993). Esses fungos são capazes de produzir celulases. Em geral, esses
fungos celulolíticos produzem um grande número de celulases e muitos as usam para a
degradação de polissacarídeos da parede celular vegetal. A análise qualitativa da atividade
da celulase total (FPase) mostrou eficiência nas amostras estudadas (Figura 1).
Figura 1. Produção de FPase; β-glicosidase e CMCASE dos fungos oriundos dos
fragmentos e inseto inteiro dos Cupins Nasutitemites sp.
79
Os isolados que apresentaram maior atividade foi o 40-T/C seguido de 33-
INS(S.A). Os mesmos são classificados como Trichoderma sp. Os fungos filamentosos,
especialmente os Basidiomycetes, são os mais utilizados para a produção dessas enzimas
(Pandey et al., 2000). Entre esses fungos, Trichoderma reesei é reconhecido pela produção
de diversos sistemas extracelulares de enzimas envolvidas na hidrolise de polissacarídeos
(Beguim, 1990). Em estudos anteriores, Khan et al. (2007) utilizaram e obtiveram
atividade celulósica total de 0,10 UI mL¹ de extrato enzimático. Os microrganismos
estudados apresentaram uma boa produção enzimática quando utilizado o indutor de
FPase. No entanto, os fungos 18-C/C e 15-T/C não apresentaram atividade enzimática, mas
fato este não diminui a sua produção de enzimas celulolíticas, pois mostraram uma ótima
produção como indutores de CMCase e β- glicosidase.
Nem todos os isolados mostraram uma produção significativa de β-glicosidase. O
isolado 37-C/C foi o que apresentou uma maior produção de β- glicosidase, seguido do
isolado 40-T/C.
O isolado 37-C/C foi classificado como Penicillium sp. Os Penicillium, em
condições naturais ou in vitro, são fontes de biocompostos; por isso muitos deles tornam-se
valiosos por produzirem pigmentos, enzimas e outros compostos com atividades
hipocolesterolêmica, anticancerígenos, antitumoral, antioxidantes inibidores de ά-
glucosidase, inseticidas, herbicidas, antimicrobianos e fungicidas (Paterson et al., 2004;
Oliveira et al., 2006). Os mesmos estão envolvidos em estudos ecológicos como:
patógenos oportunistas, contaminantes de alimentos e em processos biotecnológicos, por
isso a identificação desse fungo é essencial em nível de espécie.
Para atividades enzimáticas da CMCase, os isolados 12-INS(A) e 11-A/C
apresentaram maior atividade enzimática em relação aos demais. A atividade especifica da
CMCase em relação à β-glucosidase mostrou maior produção nos isolados citados, sendo
que os mesmos não mostrarm resultados significantes quanto à produção da β-glicosidase.
Os maiores produtores de CMCase foram os isolados 12- INS(A) e 11-A/C
classificados como Aspergillus sp. Os Aspergillus são representados por mais de 200
espécies e comumente são isolados do solo, vegetais ou como patógenos oportunistas.
Entre estes, diversas linhagens produzem compostos com atividade biológica de
importância econômica, propriedade que contribui para o impacto desses fungos nos
diversos setores industriais, na agricultura e medicina (Asan, 2004; Samson, 2007;
Stephenson, 2010).
80
Na indústria alimentícia, os fungos Aspergillus são muito utilizados, porém,
somente aqueles reconhecidos como mais seguros assim como: Generally Regarded As
Safe, por não serem fontes de compostos tóxicos, além de produzirem altos níveis de
compostos com atividade biológica como enzimas, em particular pectinase, protease,
celulases, biocatalizadores de grande valor alimentício. Devido à importância
biotecnológica de Aspergillus, várias pesquisas já estão sendo concretizadas e em
desenvolvimento focalizando o uso industrial desses fungos e estratégias de estudos
taxonômicos.
Conclusões
Foi possível perceber a riqueza fúngica associada aos cupins, entre os quais, fungos
do gênero: Penicillium sp., Aspergillus sp., Trichoderma sp. Fusarium sp e Xylaria sp.,
além de outros ainda não identificados.
As atividades enzimáticas da celulase total (FPase), β-glicosidase e endoglucanase
(CMCase) dos isolados 11-A/C, 33-INS(S.A), 37-C/C, 12-INS(A), 32-INS(A), 40-T/C, 18-
C/C 35-A/C, 15-T/C e 04-T/C foram significativas no transcorrer dos testes enzimáticos.
A atividade da FPase mostrou-se maior em relação a β-glicosidase e CMCase.
Somente os isolados 15-T/C e 18-C/C não apresentaram atividade enzimática de
FPase, porém mostraram atividades significantes para β-glicosidase e CMCase.
Agradecimentos
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas FAPEAM pela concessão da
bolsa.
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Avaliação da capacidade de produção de biossurfactantes e degradação
de petróleo por isolados de rizobactérias
Brito L.L.1, Menezes N.C.
2, Minelli-Oliveira C.
1, Cáuper F.R.M.
3, Moreira F.W.
4, Oliveira
L.A.4
1PG Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas,
2Mestre em Agricultura no Trópico
Úmido, INPA, 3Universidade Paulista, UNIP,
4Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia. E-mails: [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
A biorremediação é um processo que utiliza microrganismos que degradam e
transformam compostos orgânicos, como o petróleo. É importante testar microrganismos
com capacidade para degradar ou que auxiliem na solubilização do petróleo como forma
de minimizar os danos causados por derrames desse poluente. Esse trabalho teve como
objetivos testar a capacidade de 7 isolados e 3 consórcios de rizobactérias em degradar
petróleo em meio líquido, avaliando sua capacidade quanto à produção de biossurfactantes.
A metodologia de teste foi qualitativo utilizando do colapso da gota, que consistiu da
adição de 1µL de suspensão microbiana padronizada a 105 UFC.mL
-1 dispostas
separadamente em placas de multipoços previamente preenchidos com 2,0 mL de meio
nutricional SYM (sais do meio YMA) líquido e 1 gota de petróleo, com avaliação a cada
24 horas. As rizobactérias INPA R692, INPA, R702, INPA R735, INPA R759, INPA
R762, INPA R764 e INPA R785 e os consórcios 1, 2 e 3 possuem capacidade para
degradar o petróleo utilizando-o como fonte de carbono, mesmo não havendo formação de
biossurfactantes. O consórcio 3, formado pelas rizobactérias INPA R759, INPA R762,
INPA R764 e INPA R785, foi o único em que houve a dispersão total da gota de petróleo.
Essas bactérias demonstraram potencial para serem utilizadas no processo de
biorremediação de petróleo.
Palavras-chave: Biorremediação, Petróleo, Rizobactérias, Amazônia.
Introdução
Atualmente existe uma enorme preocupação quanto ao uso sustentável dos recursos
naturais. A grande demanda pelo petróleo poderá acarretar em sua escassez e a extração e
produção deste composto são atividades de alto risco ambiental.
A poluição causada por hidrocarbonetos constitui séria preocupação ambiental e de
saúde, merecendo maior investimento em tecnologias compatíveis para sua remediação. Os
84
maiores problemas são os danos ambientais causados por derrames acidentais e descarga
de petróleo ou de resíduos oleosos intencionalmente descartados (Lai et al., 2009).
A biorremediação é um processo de tratamento que utiliza microrganismos que
degradam e transformam compostos orgânicos, como o petróleo, existentes nos solos
contaminados, aquíferos, lodos e resíduos sólidos, em compostos menos complexos e
geralmente mais facilmente degradáveis (Wetler-Tonini et al., 2010). A capacidade dos
microrganismos de degradar compostos orgânicos é cientificamente reconhecida e vem
sendo utilizada ao longo do tempo em processos de tratamento biológico. Neste contexto,
bactérias aeróbicas e anaeróbicas vêm sendo utilizadas com sucesso em diversas técnicas
para atenuar naturalmente, bioaumentação, bioestimualação, produção de biossurfactantes,
entre outras.
Biosurfactantes são metabólitos produzidos por uma grande variedade de bactérias,
leveduras e fungos filamentosos que podem aumentar a disponibilidade dos
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) a estes microrganismos degradadores,
auxiliando na solubilização do poluente, além de apresentarem vantagens como baixa
toxicidade, natureza biodegradável e eficácia em amplas variações de temperatura, pH e
salinidade (Maniasso et al., 2001; Tabatabaee et al., 2005). Dentre esses, as rizobactérias
têm se mostrado capazes de degradar o petróleo, gasolina e óleo diesel (Brito et al., 2015,
2017; Oliveira et al., 2017 a,b), sendo altamente promissoras para uso na descontaminação
de ambientes contaminados por esses compostos orgânicos por fixarem o nitrogênio
atmosférico e não serem patogênicas aos animais e às plantas.
Diante disso, torna-se fundamental selecionar microrganismos com capacidade para
degradar ou que auxiliem na solubilização do petróleo como forma de minimizar os danos
causados por derrames desse poluente. Portanto, esse trabalho teve como objetivos testar a
capacidade de isolados de rizobactérias em degradar petróleo e seus derivados em meio
líquido e avaliar o potencial desses isolados quanto à produção de biossurfactantes,
baseando-se na redução da tensão superficial e aumento da atividade emulsificante.
Material e Métodos
Foram utilizados sete isolados de rizobactérias (INPA R692, INPA, R702, INPA
R735, INPA R759, INPA R762, INPA R764 e INPA R785 da Coleção de Microbiológica-
INPA, selecionados previamente em testes anteriores e três tipos de consórcios diferentes,
onde o potencial das cepas identificadas para degradar derivados do petróleo e produzir
85
biossurfactantes foi analisado mediante o teste qualitativo do colapso da gota, segundo
Boduor e Miller-Maier (1998), que consistiu da adição de 1,0 µL de suspensão microbiana
padronizada a 105 UFC.mL
-1, foram dispostas separadamente em placas de multipoços
previamente preenchidos com 2,0 mL de meio nutricional SYM (sais do meio YMA)
líquido e 1 gota de petróleo. Foram feitas avaliações visuais a cada 24 horas durante 6 dias.
Quando houve o colapso da gota de petróleo, formação de microemulsões, o resultado foi
considerado positivo, avaliadas pela comparação com os poços em que foi inoculado 1 μL
de água destilada estéril utilizada como controle negativo. Foram selecionados 7 isolados e
3 consórcios, sendo: Consórcio 1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA
R702 e INPA R735) e Consórcio 3 (INPA R759, INPA R762, INPA R764 e INPA R785).
Neste teste, as suspensões de microrganismos em meio YMA líquido foram
aplicadas ao petróleo para formar microemulsões, fazendo com que as moléculas polares
da água repelida pela superfície hidrofóbica do petróleo interajam entre si. Foi adicionada
água destilada estéril como controle em substituição aos microrganismos. Nas placas de
multipoços onde foram realizados os testes, a vertical foi enumerada de um a seis, sendo
cada número uma rizobactéria e na horizontal, a quadruplicata do teste (Figura 1).
Resultados e Discussão
Na placa 1 estão as rizobactérias (INPA R692, INPA R702, INPA R735, INPA
R759, INPA R762 e INPA R764), na placa 2, INPA R785), Consórcio1, Consórcio2 e
Consórcio3). Os resultados demonstraram que não houve formação de microemulsões,
apontando que esses isolados não produziram biossurfactantes. No entanto, houve
degradação da gota de óleo pela quantidade observada em cada poço, que a cada dia se
mostrou menor, com uma tonalidade cada vez mais clara.
A tonalidade do petróleo nos tratamento foi avaliada 24 horas. A tonalidade mais
clara ocorreu onde se inoculou os isolados INPA R785 e Consórcio1 (Tabela 1). Todos os
tratamentos, com exceção da INPA R692 apresentavam tonalidade mais clara do óleo em
48h. A partir das 72hs de avaliação, todos os tratamentos apresentaram dispersão da gota
de óleo para as bordas dos poços, enquanto que o Consórcio 3 mostrou total dispersão do
petróleo após 144h de avaliação.
86
Figura 1 – Teste qualitativo do colapso da gota
Tabela 1. Descoloração do DCPIP utilizando manitol como fonte de carbono. Isolado 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas 120 horas 144 horas
Controle 1 1 SD SD SD SD
CMINPA R692 1 1 D D D D
CMINPA R702 1 2 D D D D
CMINPA R735 1 2 D D D D
CMINPA R759 1 2 D D D D
CMINPA R762 1 2 D D D D
CMINPA R764 1 2 D D D D
CMINPA R785 2 2 D D D D
C01 2 2 D D D D
C02 1 2 D D D D
C03 1 2 D D D DT
Tonalidades: 1= normal, 2= mais clara; SD= Sem dispersão da gota; D = dispersão da gota; DT =
dispersão total da gota.
A influência da fonte de carbono na produção de biossurfactante por diferentes
cepas de microrganismos tem sido bastante estudada. A literatura aponta uma ampla
diversidade entre as fontes de carbono (Fontes et al., 2008; Brito, 2011).
Silva et al. (2010) isolaram 112 colônias de bactérias a partir de sedimento de um
manguezal do Estado do Rio de Janeiro e verificaram que 59 produziram biossurfactante
(aproximadamente 53%). Percentuais de degradação ainda maiores foram descritos por
Catter et al. (2007) quando descreveram que 13 cepas identificadas (12 espécies de
bactérias) e avaliadas pelo método qualitativo do colapso da gota, todas (100%) mostraram
1 2
87
capacidade de produzir surfactantes, sendo que sete (53,8%) delas excretaram-no para o
meio de cultura.
Valores semelhantes já tinham sido descritos por Tugrul e Cansunar (2005), que
utilizaram a mesma metodologia para demonstrar a capacidade de produção de
biossurfactantes por microrganismos coletados na Universidade de Hacettepe na Turquia.
Safary et al. (2010) demonstram a capacidade de produção de biossurfactantes por 10
colônias de bactérias isoladas do Mar Cáspio no Irã. De acordo com Bodour et al. (2003),
estudos sugerem que a produção destes metabólitos aumentam a disponibilidade dos
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), constituindo uma importante ferramenta
para a sobrevivência destes organismos em ambientes contaminados.
Conclusões
As rizobactérias INPA R692, INPA R702, INPA R735, INPA R759, INPA R762,
INPA R764, INPA R785 e os consórcios 1, 2 e 3 possuem capacidade para degradar o
petróleo utilizando-o como fonte de carbono, mesmo não havendo formação de
biossurfactantes.
O consórcio 3, formado pelas rizobactérias INPA R759, INPA R762, INPA R764 e
INPA R785, foi o único tratamento onde ocorreu a dispersão total da gota de petróleo.
Essas bactérias demonstraram potencial para serem utilizadas no processo de
biorremediação de petróleo.
Agradecimentos
Ao INPA, CNPq e FAPEAM, pelo apoio de infraestrutura e financeiro para a
realização da pesquisa.
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1PG Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas,
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4Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia. E-mails: [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected],
Resumo
O petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos e outros compostos. A
contaminação ambiental por esta substância e por seus derivados causa impacto ecológico,
que vêm sendo minimizado por técnicas de remediação. A biorremediação é uma dessas
técnicas que emprega microrganismos ou suas enzimas para destoxificar ambientes
contaminados. O estudo da população microbiana do solo poderá ter grande valor
econômico para a biorremediação. Estudos já realizados com alguns grupos de
rizobactérias mostraram que apresentam a habilidade de usarem petróleo como fonte de
carbono e, por serem não patogênicos a animais e plantas, apresentam potencial de uso na
biorremediação de ambientes contaminados com esse produto. Este trabalho teve como
objetivo testar a capacidade de isolados de rizobactérias em degradar petróleo e seus
derivados, indicando os mais aptos para serem utilizados no processo de biorremediação de
solos contaminados com petróleo. A metodologia utilizada foi a da técnica do indicador
redox 2,6-diclorofenol-indofenol (DCPIP) com duas fontes de carbono: manitol e petróleo.
Os resultados indicam diferenças significativas entre as velocidades de biodegradação do
manitol e petróleo pela ação dos microrganismos utilizados. Os isolados INPA R702,
INPA R759, INPA 764 e o consórcio C01 (todas as bactérias) foram os que se
apresentaram os mais promissores, por degradarem o petróleo mais rapidamente.
Palavras-chave: Biorremediação, Petróleo, Rizobactérias, Enzimas.
Introdução
O petróleo bruto e produtos do petróleo são misturas complexas de estruturas variáveis que
exibem uma ampla variedade de propriedades físicas, compreendendo os compostos de
hidrocarbonetos, responsável por 50-98% do total da composição, e os compostos sem
hidrocarbonetos, contendo enxofre, nitrogênio, oxigênio e vários metais (Tyagi et al.,
2011)
90
A presença desses compostos no solo e sedimentos, causado principalmente por
derrame acidental ou descarte irregular, despertou grande preocupação em autoridades
ambientais e pesquisadores, uma vez que, comprometem a sobrevivência de muitas
espécies, e ainda estão associados com o aumento de incidência de diversos tipos de
cânceres no homem (Weber, 2013). Esses compostos podem causar uma gama de ameaças
para a saúde humana e ambiental, alterando o equilíbrio ecológico (Cohen et al., 2013)
Na tentativa de fazer reparo adequado em áreas contaminadas, utiliza-se uma
técnica muito explorada nas últimas décadas conhecida como biorremediação. Essa
tecnologia compreende o processo de transformação e/ou degradação de compostos tóxicos
para torná-lo ecologicamente inofensivo. Esse processo é feito através do emprego de
microrganismos inerentes ou não ao próprio meio ambiente e adaptáveis ao produto
contaminante. A eficiência da biorremediação é limitada se as condições fisíco-química
não forem favoráveis à sobrevivência e à atividade dos microrganismos degradadores. É,
portanto, necessário, um rigoroso controle e definição de parâmetros para aplicação dessa
técnica (Jacques, 2010).
Trabalhos realizados constataram que os diferentes compostos de hidrocarbonetos
nem sempre são degradados em igual proporção pelo mesmo microrganismo, defendendo
assim, a ideia de que cada espécie é responsável por degradar um tipo de componente do
óleo fazendo-se necessário o uso de consórcios para melhorar a eficiência da
biorremediação (Weber, 2013).
A população microbiana do solo e seu estudo pode conduzir à descoberta de
estirpes de grande valor econômico para serem usadas na biorremediação de ambientes
contaminados com compostos de petróleo, visto que podem mostrar maior eficiência,
competitividade e tolerância às condições de estresse. Estudos já realizados com grupos de
rizobactérias mostraram a habilidade de usarem petróleo, gasolina e óleo diesel como fonte
de carbono (Brito et al., 2015, 2017; Oliveira et al., 2017 a,b) e, por serem não patogênicos
a animais e plantas, apresentam potencial de uso na descontaminação de ambientes
impactados com esse contaminante ou seus derivados, o que poderá ter grande valor
econômico e ambiental.
Material e Métodos
A avaliação do potencial de degradação de derivados de petróleo em meio líquido
pelos isolados foi realizada através da técnica do indicador redox 2,6-diclorofenol-
91
indofenol (DCPIP), segundo Hanson et al. (1993). O princípio deste teste é que durante a
oxidação microbiana dos hidrocarbonetos, elétrons são transferidos até aceptores (como
oxigênio e nitrato) e ao incorporar um aceptor de elétron como o DCPIP ao meio de
cultura, é possível averiguar a capacidade dos microrganismos em utilizar hidrocarbonetos
como substrato pela observação da mudança de cor do DCPIP de azul (oxidado) para
incolor (reduzido) (Mariano et al., 2007).
Esse teste foi realizado através da transferência de 2 mL de suspensão bacteriana
das placas de Petri para erlenmeyers de 125 mL, contendo 50 mL de meio YM líquido,
deixando-os em mesa agitadora a 75 rpm a 30 °C por 48 horas. Após o crescimento
bacteriano, fez-se a contagem de células em câmara de Neubauer para padronização das
bactérias a 105
células mL-1
. Foram selecionados 7 isolados e 3 consórcios, sendo:
Consórcio 1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA R702 e INPA R735) e
Consórcio 3 (INPA R759, INPA R762, INPA R764 e INPA R785).
O ensaio foi realizado em tubos de ensaio previamente estéreis, contendo 7,5mL de
meio YM líquido (Vincent, 1970), 400μL do DCPIC, 25μL de derivado de petróleo (diesel,
querosene gasolina e nafta), fornecido pela REMAN e óleo lubrificante e 100μL de inóculo
padronizado a 105 UFCmL
-1 de isolados de rizobactériasmL
-1, sendo determinado o
número de células em Câmara de Neubauer. O experimento foi realizado em triplicata,
com três tratamentos controle: dois controles negativos, um contendo meio mineral YM,
indicador DCPIP e derivado de petróleo (óleo diesel, querosene gasolina, nafta e óleo
lubrificante) o outro com meio YM e DCPIP. O controle positivo continha meio mineral
YM, indicador DCPIP e inóculo de isolados de rizobactérias. Os tubos de ensaio foram
incubados a 30ºC e a cada 24 horas foi observado o desaparecimento da coloração azul do
indicador DCPIP (forma oxidada) para a incolor (forma reduzida) (Mariano et al., 2007). A
leitura positiva foi dada com a atribuição de notas após estes tempos, pela descoloração do
DCPIP, onde:
Nota 1: Coloração Total; Nota 2: Início da Descoloração; Nota 3: Descoloração Parcial
Nota4: Descoloração Quase Total; Nota 5: Descoloração Total.
Foram retiradas a cada 24 horas, por um período de seis dias, para análise
quantitativa, alíquotas, onde foram quantificadas a biodegradação em fontes de carbono
distintas e DCPIP em Espectrofotometria em 465 nm. O delineamento foi em parcelas
subdivididas de 11 x 7 x 3, sendo cada tratamento representado pelas estirpes e consórcios
utilizados e em sete tempos diferentes (0, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas), contendo três
repetições cada. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), pelo teste F
92
e as médias dos tratamentos ao teste Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade,
utilizando o programa ASSISTAT.
Resultados e Discussão
Esse teste mostra a capacidade de rizobactérias em utilizar hidrocarbonetos como
substrato utilizando o indicador redox diclorofenol indofenol (DCPIP), observando a
mudança de cor do azul (oxidado) para incolor (reduzido). Esta mudança oscila entre
coloração total e descoloração total. A leitura desse teste foi realizada durante um período
de seis dias em intervalos de 24 horas, onde foi observada a redução total do DCPIP.
Segundo Cruz et al. (2013a), após a oxidação total do DCPIP o meio volta a ficar azul
novamente por ser um indicador reversível. Para a realização desse teste, foram utilizadas
fontes distintas de carbono como manitol e petróleo. A tabela 1 mostra os resultados de
descoloração visual utilizando-se a fonte de carbono manitol, indicando que após 24 horas
de incubação, não ocorreu descoloração nas amostras.
Tabela 1. Avaliação visual relacionada à descoloração do DCPIP utilizando
manitol como fonte de carbono. Isolado 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas 120 horas 144 horas
Controle 1 1 1 1 1 1
INPA R692 1 1 1 4 5 5
INPA R702 1 1 5 5 5 5
INPA R735 1 1 2 2 2 2
INPA R759 1 1 1 3 3 3
INPA R762 1 1 5 5 5 5
INPA R764 1 1 5 5 5 5
INPA R785 1 1 4 4 5 5
C01 1 3 5 5 5 5
C02 1 2 5 5 5 5
C03 1 1 5 5 5 5
Obs.: Notas 1: Coloração Total; 2: Início da Descoloração; 3: Descoloração Parcial; 4: Descoloração Quase
Total; 5: Descoloração Total. Consórcio 1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA R702 e
INPA R735) e Consórcio 3 (INPA R759, INPA R762, INPA R764 e INPA R785).
Com 48 horas, apenas o Consórcio 1 apresentou descoloração parcial e o Consórcio
2, coloração quase total. No decorrer das horas, os tratamentos apresentaram alteração na
descoloração e, após 144 horas de incubação, oito tratamentos apresentaram descoloração
total. Esse resultado era esperado, pois o manitol é tradicionalmente usado para isolar e
para os estudos de crescimento desse microrganismo em laboratório (Vincent, 1970).
93
Com relação à descoloração usando petróleo, a ação da bactéria INPA R702
resultou na descoloração total já nas primeiras 24 horas de incubação. Um dado relevante
foi que com 48 horas de incubação, a ação das bactérias INPA R702 ou INPA R764
degradou totalmente o petróleo, indicando-as como as com os maiores potenciais de
degradação desses hidrocarbonetos. Exceto o tratamento controle e os com as bactérias
INPAR762 e INPA R785 todos os demais tratamentos atingiram, até seis dias, a nota
máxima de descoloração (INPA R692, INPA R702, INPA R735, INPA R759, INPA R764,
C01, C02 e C03). Esses resultados confirmaram que essas bactérias ou seus consórcios
mostraram capacidade de degradar totalmente o petróleo durante o período de incubação.
(Tabela 2).
Tabela 2. Avaliação Visual relacionada a descoloração do DCPIP utilizando
petróleo como fonte de carbono. Isolado 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas 120 horas 144 horas
Controle 1 1 1 1 1 1
INPA R692 1 1 1 4 5 5
INPA R702 5 5 5 5 5 5
INPA R735 1 2 2 5 5 5
INPA R759 1 4 4 5 5 5
INPA R762 1 1 1 1 1 1
INPA R764 1 5 5 5 5 5
INPA R785 1 2 2 2 2 2 C01 1 4 5 5 5 5
C02 1 1 1 2 4 5
C03 1 3 3 5 5 5
Obs.: Notas 1: Coloração Total; 2: Início da Descoloração; 3: Descoloração Parcial; 4: Descoloração Quase
Total; 5: Descoloração Total. . Consórcio 1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA R702 e
INPA R735) e Consórcio 3 (INPA R759, INPA R762, INPA R764 e INPA R785).
Além da avaliação visual dos sete isolados de rizobactérias e seus consórcios com
DCPIP, foi realizada ainda uma avaliação quanto à biodegradação usando a absorbância
em espectrofotometria, quando submetidos a fontes de carbono distintas (manitol e
petróleo).
Tendo a absorbância do controle (branco) como referência, e o manitol como fonte
de carbono (Tabela 3) no tempo de 0 horas, observou-se que os tratamentos com as INPA
R692 e INPA R762 apresentaram as maiores absorbâncias (0,769 e 0,696) respectivamente.
Ao se analisar os dados de absorbância após 24 horas de incubação, observou-se que
apenas os tratamentos com os isolados INPA R759, INPA R764 e o consórcio C01 não se
diferenciaram estatisticamente do controle. Os demais tratamentos já apresentaram
capacidades de degradação do manitol. O máximo de diferenciação dos tratamentos em
relação ao controle ocorreu na avaliação das 48 horas de incubação, quando todos eles
94
foram significativamente diferentes do controle, indicando que esse tempo de avaliação
seria o mais adequado para uma melhor interpretação dos resultados. Com o tempo, essas
diferenças foram mudando, devido à reversão da coloração do indicador redox DCPIP.
Tabela 31. Avaliação da biodegradação em espectrofotômetro por isolados de rizobactérias com
manitol como fonte de carbono.
Isolados 0 hora 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas
120
horas 144 horas
Absorbância (465 nm)
Branco 0,661 bA 0,663 aA 0,666 aA 0,675 aA 0,646 aA 0,707 aA 0,637 aA
INPA R692 0,769 aA 0,573 bB 0,234 bE 0.356 bD 0.467 bC 0,573 bB 0,725 aA
INPA R702 0,633 bA 0,298 cB 0,265 bB 0.337 bB 0.393 bB 0.744 aA 0,668 aA
INPA R735 0,616 bA 0,181 dE 0,299 bD 0,666 aA 0,419 bC 0,522 cB 0,367 bC INPA R759 0,607 bA 0,661 aA 0,230 bC 0,366 bB 0,355 cB 0,625 bA 0,649 aA
INPA R762 0,696 aA 0,515 bB 0,253 bD 0,383 bC 0, 316 cD 0,554 bB 0,671 aA
INPA R764 0,630 bA 0,674 aA 0,249 bC 0,348 bC 0,304 cC 0,527 cB 0,659 aA INPA R785 0,577 bB 0,530 bC 0.295 bD 0,650 aB 0,472 bC 0,823 aA 0,651 aB
C01 0,628 bB 0,669 aB 0,236 bC 0,276 bC 0,309 cC 0,773 aA 0,664 aB
C02 0,653 bB 0,490 bC 0,259 bD 0,278 bD 0,345 cD 0,774 aA 0,693 aB C03 0,674 bA 0,456 bB 0,235 bC 0,301 bC 0,249 cC 0,453 cB 0,439 bB Obs.: As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Scott-Knott ao
nível de 5% de probabilidade), considerando as minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas. . Consórcio
1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA R702 e INPA R735) e Consórcio 3 (INPA R759,
INPA R762, INPA R764 e INPA R785).
Ao se analisar os dados de absorbância usando o petróleo como fonte de carbono
(Tabela 4), observaram-se resultados diferentes aos encontrados com o uso do manitol. O
máximo de degradação do petróleo em cada tratamento deve ser observado pelo menor
valor de absorbância de cada um, tendo em vista que depois, a coloração do indicador
redox DCPIP se reverte com o tempo. Assim, o referencial de degradação máxima para os
isolados INPA R692, INPA R702 e os consórcios C01 e C02 ocorreram na leitura feita 24
horas de incubação, que foram significativamente menores do que as absorbâncias
observadas por esses tratamentos nos outros tempos de avaliação. Usando o mesmo
raciocínio, a degradação máxima do petróleo quando se usou os isolados INPA R735,
INPA R759, INPA R764 ocorreram às 96 horas. Por outro lado, não se observou redução
significativa da absorbância quando se usou os isolados INPA R762, INPA R785 ou o
consórcio C03, que foram estatisticamente iguais ou superiores (INPA R785) às
absorbâncias do controle, sugerindo que não são degradadores de petróleo usando essa
metodologia como parâmetro comparativo.
95
Tabela 42. Avaliação da biodegradação em espectrofotômetro por isolados de rizobactérias com
petróleo como fonte de carbono.
Isolados 0 hora 24 horas 48 horas 72 horas 96 horas
120
horas 144 horas
Absorbância (465 nm)
Branco 0,647 aB 0,633 aB 0,623 aB 0,642 aB 0,621 bC 0,839 aA 0,747 aA INPA R692 0,818 aA 0,725 aA 0,723 aA 0,720 aA 0,325 cB 0,385 cB 0,630 aA
INPA R702 0,880 aAz 0,234 bD 0,614 aB 0,470 cC 0,466 cC 0,386 cC 0,424 bC
INPA R735 0,782 aA 0,747 aA 0,705 aA 0,785 aA 0,573 bB 0,870 aA 0,524 bB
INPA R759 0,864 aA 0,696 aA 0,776 aA 0,530 bB 0,407 cB 0,544 bB 0,479 bB INPA R762 0,855 aA 0,722 aB 0,796 aA 0,736 aB 0,628 bB 0,901 aA 0.654 aB
INPA R764 0,817 aA 0,731 aA 0,755 aA 0,427 cB 0,325 cB 0,434 cB 0,412 bB
INPA R785 0,831 aA 0,719 aA 0,731 aA 0,717 aA 0,572 bB 0,822 aA 0,732 aA C01 0,765 aA 0,196 bC 0,424 bB 0,369 cB 0,369 cB 0,374 cB 0,401 bB
C02 0,859 aA 0,211 bD 0,403 bC 0,586 bB 0,294 cD 0,547 bB 0,417 bC
C03 0,846 aA 0,709 aA 0,738 aA 0,749 aA 0,830 aA 0,816 aA 0,679 aA Obs.: As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si (Teste de Scott-Knott ao
nível de 5% de probabilidade), considerando as minúsculas nas colunas e maiúsculas nas linhas. . Consórcio 1 (todas as bactérias), Consórcio 2 (INPA R692, INPA R702 e INPA R735) e Consórcio 3 (INPA R759,
INPA R762, INPA R764 e INPA R785).
O alto índice de descoloração pode não estar associado a um número elevado de
microrganismos, isso porque alguns, quando atuam em quantidades populacionais baixas,
podem possuir boa capacidade para biodegradabilidade. Todavia, esses resultados são
semelhantes aos descritos por Souza et al. (2010), que demonstraram a capacidade de 90%
de seus isolados em degradarem a gasolina comercial. Muitos outros trabalhos envolvendo
o uso do corante DCPIP utilizaram bactérias (Mariano et al., 2008; Furlan, 2011). Cruz
(2013b), ao avaliar a capacidade de degradação de Bacillus subtilis em solo contaminado,
demonstrou através de ensaios de DCPIP, que o petróleo é menos biodegradável quando
comparado com o diesel e o biodiesel.
Lima (2010) obteve bons resultados com o teste de biodegradabilidade usando o DCPIP e
mostrou que dos 106 microrganismos isolados dos solos rizosféricos de Vismia guianensis,
Mucuna pruriens, Brachiaria decumbens e Brachiaria humidicola coletados na Província
Petrolífera de Urucu, 65 (61,32%) apresentaram potencial de degradação do petróleo após
5 dias (120 horas), sendo 25 bactérias, 27 fungos filamentosos e 13 leveduras.
Estudos relacionados ao uso de microrganismos para biorremediação de áreas
contaminadas mostram-se promissores, pois estes possivelmente são capazes de
metabolizar as estruturas químicas complexas, fazendo com que aconteça uma diminuição
dos agentes contaminantes do meio.
96
Conclusões
Os resultados indicaram diferenças significativas entre as velocidades de
biodegradação dos diferentes tipos de fontes de carbono na presença dos mesmos
microrganismos utilizados.
As rizobactérias INPA R702, INPA R759, INPA 764 e o consórcio C01 (todas as
bactérias) foram os que se apresentaram como os mais promissores, por degradarem o
petróleo mais rapidamente.
Agradecimentos
Ao INPA, CNPq e FAPEAM, pelo apoio de infraestrutura e financeiro.
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Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L. Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017. Editora INPA
Produção de lacase por uma cepa de Trametes elegans coletada no
Município de Alvarães-Amazonas
Carvalho W.O.1, Fonseca N.F.
2 , Silva J.R.
3
1 Especializando em Micorobiologia Geral, Escola Superior Batista do Amazonas,
2Graduada em
Licenciatura em Ciências Biológicas, Universidade do Estado do Amazonas,3Especializando em
Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Cândido Mendes. Emails: [email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
Vários estudos estão sendo desenvolvidos para utilização de enzimas fúngicas e poucos são
os realizados com fungos pertencentes à biodiversidade Amazônica. A lacase (p-difenol;
dioxigêniooxidoredutase EC 1.10.3.2) é uma polifenol oxidase atuante numa variedade de
doadores de hidrogênio aromáticos e espécies inorgânicas, incluindo íons Mn+2
. A ampla
gama de substratos sobre os quais a lacase pode atuar é uma característica que direciona
seu emprego na biorremediação de ambientes complexos. Dada a relevância desta pesquisa
e ressaltando o aproveitamento de resíduos, utilizou-se o resíduo da casca da castanha-do-
brasil (Bertholletia excelsa), sendo lavados, colocados em estufa elétrica a 40ºC e
triturados em moinho de facas a 60 mesh. A “farinha” foi utilizada como substrato de
crescimento em meio líquido onde o meio de cultivo foi incubado a 30ºC em fase
estacionária e em triplicata. O substrato seringaldazina foi utilizado para determinação da
enzima lacase, através do método que se baseia na oxidação do substrato enzimático
seringaldazina para sua forma de quinona. O substrato de crescimento em fase estacionária
apresentou atividade de lacase para a cepa amazônica de Trametes elegans, determinados
por espectrofotômetro de absorbância. A cepa de Trametes elegans produziu lacase usando
casca da castanha-do-brasil como fonte de carbono. A maior produção de lacase foi aos
nove dias, com 38U/L.
Palavras-chave: Biorremediação, fungos, enzimas oxidativas
Introdução
Vários estudos estão sendo desenvolvidos para utilização de enzimas fungicas em
várias aplicações industriais, e a demanda por enzimas mais estáveis, altamente ativas e
específicas tem crescido rapidamente. O interesse crescente pela enzima “manganês-
peroxidase” vem em função do seu potencial de uso na indústria de celulose e papel
99
(biopolpação e bioclarificação) assim como em processos de biorremediação (Hofrichter et
al., 1998, Breen e Singleton, 1999, Rogalski et al., 2006).
Manganês-peroxidase (MnP) é uma heme-dependente Mn extracelular enzima (E.
C. 1.11.1.13), geralmente relacionada à mineralização da lignina, produzida somente por
basidiomicetos ligninolíticos (Gold et al., 2000). Esta enzima catalisa Mn2+
para altamente
reativo Mn3+
, este estabilizado por ácidos dicarboxilicos é um mediador difusível de baixa
massa molecular, o qual oxida uma variedade de substâncias fenólicas e não-fenólicas,
incluindo lignina e poluentes tóxicos (Perez e Jeffries, 1992, Moreira et al., 1997).
Devido ao importante potencial de degradação da manganês-peroxidase (MnP), há
interesse geral em produzí-la biotecnologicamente. Pesquisas vêm sendo realizadas
buscando-se conhecer os requisitos nutricionais, fatores fisiológicos e ambientais
relacionados à reativação dos sistema MnP e desenvolvimento de um eficiente sistema de
produção para operações em larga escala (Bonnarme e Jeffries, 1990), Gold e Alic, 1993).
Poucos ou raros são os estudos feitos nesse sentido com fungos pertencentes à
biodiversidade amazônica. A lacase (p-difenol; dioxigêniooxidoredutase EC 1.10.3.2) é
uma polifenol oxidase hidrogênio aromáticos e espécies inorgânicas, incluindo ions Mn+2
(Palma, 2003). Segundo esse autor, estudos têm mostrado que a produção enzimática por
Fermentação Semi-Sólida (FSS) apresenta bons níveis de atividade e propriedades
funcionais adequadas às aplicações industriais quando comparada com a Fermentação
Submersa (FSm) (Palma, 2003).
De acordo com Pandey (2003), no se refere à escolha do substrato, para este
experimento foi escolhido a casca da semente da Castanha do Brasil (Bertholletia excelsa).
Buscando encontrar alternativas para a sua utilização, neste experimento foi utilizada a
farinha feita a partir deste resíduo, onde os principais constituintes da casca da castanha-
do-Brasil (Bertholletia excelsa) são a lignina e a holocelulose que é constituída pela
celulose e hemicelulose (Bonelli et al., 2001).
O grupo dos basidiomicetos inclui os fungos que produzem esporos (basidiósporos)
de origem sexuada em uma estrutura especializada denominada de basídio e popularmente
chamados de cogumelos e orelhas de pau. Desta forma, a cepa escolhida para o
experimento foi a Trametis elegans, que é um basidiomiceto, e tem a sua carne dura
branca; sua tampa esbranquiçada, que é irregular para o ponto de ligação e mais suave em
direção à margem, e sua função ecológica, que serve para decompor a madeira morta de
folhosas (Gugliota e Capelari, 1998).
100
Dada a relevância da presente pesquisa e ressaltando o aproveitamento de resíduos,
se faz necessário a busca incrementar pesquisas no que se refere à produção e atividade de
enzimas peroxidases.
Através deste estudo buscou-se avaliar a atividade enzimática de uma cepa
amazônica de Trametes elegans, determinando a atividade de lacase utilizando como fonte
de carbono o resíduo da casca de Bertholletia excelsa, avaliando a atividade enzimática na
temperatura de 30°C e pH 5,0, verificando a secreção de lacase na fase estacionária.
Material e Métodos
A Coleta dos basidiocarpos (Trametes elegans) foi realizada no mês de março de
2011, durante o período de verão no perímetro rural do município de Alvarães-Am, na
comunidade de Nogueira (Lat.: 3°, 30’, 13”; Long.: 64°, 78’, 4”)
Estes foram coletados e acondicionados em sacos de papel, previamente
identificadas, registrados, anotados os substratos e encaminhadas ao laboratório de
Biologia do Centro de Estudos Superiores de Tefé – CEST/Universidade do Estado do
Amazonas – UEA, para então serem devidamente isolados e recebidos às respectivas
metodologias e códigos de identificação, sendo que uma amostra foi enviada a coleção de
Fungos do Mestrado em Biotecnologia para identificação taxonômica.
Utilizou-se o meio sintético BDA (Batata, Dextrose e Agar), sendo 38g para 1000
mL de água destilada e com o auxilio de um bastão de vidro foi dissolvido em Enlermeyer
de 1.000 mL. Posteriormente foi vedado e levado para autoclave a 121 0C por 20 min a 1
atm para esterilização final. O meio foi vertido em placas de Petri 90x15mm.
Dos basidiocarpos coletados foi retirada a amostra de fungo (30 mm), utilizada para
inoculação, a qual passou por um procedimento de assepsia, que consta das seguintes
etapas: mergulhar a amostra por 2 minutos em álcool 70%, em seguida em hipoclorito de
sódio a 3%, logo após deixou-se o inóculo imerso por 2 minutos em água destilada . Esses
procedimentos foram executados em ambiente estéril (interior da câmara de fluxo laminar
adaptado) (Bononi e Trufem 1985).
Após estes procedimentos, as amostras inoculadas, seguindo a metodologia
proposta por Castro e Silva (1996), colocadas em placas de Petri 90x15mm com meio com
BDA, posteriormente lacradas com fita plástica do tipo Parafilm e devidamente
identificadas. As placas de Petri inoculadas foram incubadas em BOD a 30º C ( 2ºC) para
o crescimento micelial.
101
As cascas de Castanha do Brasil foram coletadas na área da comunidade de
Nogueira no Município de Alvarães. Elas foram lavadas e colocadas em estufa elétrica a
40ºC e em seguida passadas em moinho de facas a 60 mesh. A farinha formada foi
autoclavada a 1,5atm por 15 min a 121° C, para eliminação de possíveis microrganismos
presentes na casca. A “farinha” produzida foi utilizada como substrato de crescimento em
meio líquido.
Foram retirados três fragmentos fúngicos de aproximadamente 5mm de diâmetro
das bordas das placas e transferidos para o meio de cultivo composto por 1000 mL de água
destilada estéril, 1g de glicose e farinha da casca da castanha na concentração 10g/L em
erlenmeyer com capacidade de 150 mL, os quais posteriormente foram incubados em
estufa BOD em condição estacionária à temperatura de 30°C. Todos os experimentos
foram realizados em triplicata.
Foram determinadas as atividades de lacase dos fungos Trametes elegans e na
concentração de 2% de farinha da casca da castanha testada nos períodos de 03, 06 e 09
dias. Para a determinação das atividades da enzima foi utilizado o aparelho
espectrofotômetro de absorbância para leitura das amostras coletadas, onde foi posto o
substrato seringaldazina juntamente com a mistura reacional em uma cubeta.
As alíquotas foram enviadas ao laboratório de biorgânica da Universidade do
Estado do Amazonas – Mestrado em Biotecnologia e Recursos Naturais / MBT, situada em
Manaus, , para serem determinadas em espectrofotômetro.
O substrato seringaldazina foi utilizado para determinação da enzima lacase,
utilizando-se o método proposto por Szklarz et al. (1989), que baseia-se na oxidação do
substrato enzimático de seringaldazina para sua forma de quinona. A mistura reacional foi
composta de 1 mL da amostra filtrada; 0,95 mL tampão tartarato de sódio pH 4,5; 0,1mL
seringaldazina (produção estoque de 5mg/ 1mL de etanol) e 0,1mL de água destilada,
sendo monitorado o aumento da absorbância em 525 nm durante 60 segundos, utilizando-
se o coeficiente de absorção ɛ= 6,5x104 cm¹.M¹.
Uma unidade de atividade enzimática corresponde à quantidade de produto (µmol)
liberada em um minuto por mL de amostra (U= µmol. mim¹).
No presente estudo, foi possível determinar a cinética enzimática da enzima lacase
obtida a partir da cepa do fungo Trametes elegans, sob a condição estacionária e utilizando
a concentração de 2% utilizando o suplemento do resíduo da casca da castanha do Brasil
(Bertholletia excelsa ) como fonte de carbono, fermentados em pH 5,0 e ainda dentro de
102
um intervalo de tempo de 09 dias de atividade. A atividade enzimática foi calculada
utilizando a metodologia proposta por Ander e Eriksson (1976).
Atividade enzimática = Δ ABS*10
6
ɛ.R ΔT
onde:
ɛ= coeficiente de absorção de cada substrato, conforme dados da literatura;
Δ ABS= Absorção final – Absorção inicial;
R= Volume em ml
Δt= tempo de reação em minutos.
Resultados e Discussão
O Trametes elegans produziu a enzima lacase logo no terceiro dia de atividade,
evidenciando assim, um pico de 14,67 U/L de cinética enzimática, resultado este que foi
potencializado na segunda leitura da amostra, no sexto dia de atividade. Ressalta--se que
houve um acréscimo na secreção de lacase de 29,07 U/L. No nono dia de secreção houve
ainda um acréscimo evidenciando a secreção destes metabólitos, obtendo um pico
enzimático de 38,00 U/L (Figura 01).
Figura 1 - Atividade Enzimática de Lacase utilizando uma cepa amazônica Trametes
elegans.
Diversos fatores influenciam a produção de lacase e consequentemente a formação
de produtos. Pode-se destacar entre outros, a composição do meio de crescimento, tempo
de cultivo, pH, razão carbono:nitrogênio, temperatura, natureza química do substrato,
103
luminosidade e aeração (Ikehata et al., 2004). As funções biológicas da lacase nos
microrganismos ainda não estão muito claras. Em fungos há relatos sobre sua participação
no rápido crescimento celular (Leonowicz et al., 2001), esporulação (Gianfreda et al.,
1999) e degradação de lignina (Eggert et al., 1996). De acordo com Rothschild et al.,
(2002), a atividade da Lipase e da Lacase tem sido relatada em alguns fungos da podridão
branca.
Segundo Mayer e Staples (2002), do ponto de vista evolucionário, a lacase fúngica
é uma enzima bastante antiga e a ligação da atividade enzimática associada a três diferentes
sítios de cobre é um processo evolucionário muito precoce. A atividade catalítica das lacases
está relacionada à presença de quatro átomos de cobre por unidade de proteína, sendo os
mesmos denominados de acordo com suas características espectrofotométricas (Claus,
2004), Leontievsky et al., 1997).
Entre a diversidade de compostos oxidados pela lacase, a oxidação da
seringaldazina na ausência de H2O2 é típica para identificação de lacase fúngica. A
seringaldazina é um substrato fenólico dimetoxilado apresentando em sua estrutura dois
átomo de nitrogênio ligados por uma dupla ligação, caracterizando assim um composto
azo. A reação com a seringaldazina gera inicialmente um radical livre. Em seguida ocorre
a liberação do segundo elétron através de ação enzimática e/ou desprotonoção,
formando uma quinona de coloração púrpura intensa e que aparentemente não é
propensa à polimerização (Thurston, 1994), (Figura 2).
Figura 2 - Reação de oxidação da seringaldazina até formação da correspondente
quinona.
104
Outro ponto que merece nossas considerações, foi a faixa de pH 5,0 utilizada neste
estudo por exemplo: a faixa de pH, ótima para basidiomicetos esta entre 4,0 e 5,0.
Portanto, estes organismos tem preferência por meios ácidos (Damasceno, 2009). Cabe
ainda mencionar a composição do resíduo da casca da castanha do Brasil (Bertholletia
excelsa), onde seus principais constituintes são a lignina e a holocelulose que é constituída
pela celulose e hemicelulose (Bonelli et al., 2001).
Conclusões
A cepa de Trametes elegans produziu lacase usando casca da castanha-do-brasil
como fonte de carbono.
A maior produção de lacase foi aos nove dias, com 38U/L.
Agradecimentos
À FAPEAM, CNPq, CAPES e UEA/CEST pelo apoio financeiro e de infraestrutura.
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Cáuper F.R.M.1, Brito L.L.
2, Minelli-Oliveira C.
2, Oliveira L.A.
3, Costa S.S.
3, Menezes
N.C.4
1Universidade Paulista,
2PG Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas,
3 Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia, 4Mestre em Agricultura no Trópico Úmido, INPA. E-mails:
[email protected], [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
As amilases estão entre as mais importantes enzimas industriais e são de grande
importância na biotecnologia. O espectro de aplicação das amilases tem cada vez mais se
expandido para outras áreas, incluindo as clínicas farmacêuticas, médicas e químico-
analíticas. Entre um grande número de microrganismos não patogênicos capazes de
produzir enzimas úteis, os rizóbios são particularmente interessantes devido a seu fácil
cultivo e elevada produção de enzimas extracelulares de grande potencial industrial. Esse
trabalho teve como objetivo, avaliar a capacidade de rizóbios em produzir Amilase. Para a
obtenção de 12 isolados de rizóbios, foram realizadas coletas de nódulos presentes nas
raízes de caupi (Vigna unguiculata). Foram realizados testes que verificaram a capacidade
de crescimento desses isolados e a produção de amilase. Os isolados de rizóbios que
apresentaram maiores crescimentos no meio contendo amido como fonte de carbono foram
UNIP R1, UNIP R2, UNIP R4, UNIP R5, UNIP R6, UNIP R7, UNIP R8, UNIP R11 e
UNIP R12. Os isolados com maiores Índices de Degradação de Amido (IDA) foram UNIP-
R6 e UNIP-R8, demostrando que foram superiores aos demais como produtores de
amilases.
Palavras-chave: Enzimas, Amido, Vigna unguiculata.
Introdução
As amilases estão entre as mais importantes enzimas industriais e são de grande
importância na biotecnologia. Além de serem usadas como aditivos em detergentes, elas
são empregadas na sacarificação do amido e nas indústrias de alimentos, fermentação,
papel e têxtil. O espectro de aplicação das amilases tem cada vez mais se expandido para
outras áreas, incluindo as farmacêuticas, médicas e químico-analíticas (Pandey et al.,
2000).
Entre os vários parâmetros que estimulam a produção de amilases, as condições de
crescimento microbiano e a fonte de carbono usados no meio de cultivo tem recebido
108
atenção especial (Haq et al., 2002). A dextrina, frutose, glicose, lactose, maltose, amido
solúvel, além de outros encarecem sua produção. No meio de cultivo, esses substratos
podem ser substituídos por subprodutos agrícolas de baixo custo, o que torna o processo de
produção dessas enzimas mais econômica. Existem várias fontes para a produção de
amilases, tais como bactérias, fungos e plantas. O Bacillus spp. é considerado a mais
importante fonte de amilase. As Beta-amilases são geralmente obtidas a partir de fontes
vegetais. Os fungos filamentosos aparentemente constituem a principal fonte de
glucoamilase (Pandey et al., 2000).
Um grande número de microrganismos não patogênicos capazes de produzir
enzimas úteis, como os rizóbios, são particularmente interessantes devido ao seu fácil
cultivo e elevada produção de enzimas extracelulares de grande potencial industrial. Estas
enzimas são aplicadas nas indústrias de detergentes, produtos de amido, de alimentos para
animais, panificação, papel e celulose, couro, produtos químicos e biomédicos. O uso de
enzimas degradantes de amido foi a primeira aplicação em grande escala das enzimas
microbianas na indústria alimentar (Bennett, 1998). Esse trabalho teve como objetivo,
avaliar a capacidade de rizóbios em produzir Amilase.
Material e Métodos
Foram realizadas coletas de nódulos presentes nas raízes feijão caupi (Vigna
unguiculata), para a obtenção de rizóbios. Após a obtenção dos nódulos, foram isoladas as
estirpes de rizóbios usando a metodologia descrita por Vincent (1970) e Somasegaran e
Hoben (1985), com modificações. Os nódulos passaram por uma desinfecção superficial
com álcool 92 % (1 minuto) e hipoclorito de sódio 10 % (4 minutos) e dez lavagens com
água estéril. Em seguida, foram pressionados com uma pinça e feitas as repicagens em
placas de Petri contendo meio YMA (yeast manitol agar). Após o isolamento, as placas
foram incubadas a 28 °C até o crescimento de colônias de bactérias para então serem
repicadas para novas placas contendo o mesmo meio e novamente incubadas até o novo
crescimento bacteriano. Os isolados obtidos foram mantidos em tubos de ensaio contendo
o meio YMA inclinado.
Para avaliar a capacidade de crescimento, foram testados 12 isolados de rizóbios,
através do método de riscagem proposto por Oliveira e Magalhães (1999) modificado,
realizados em placa de Petri contendo o meio de cultura YMA. Esse teste foi realizado em
quadruplicata. As avaliações foram feitas a cada três dias, no período de 15 dias, no qual as
109
bactérias foram mantidas em laboratório a uma temperatura de 23 – 28
oC. De acordo com o
desenvolvimento das colônias nas quatro zonas da placa (Figura 1A) foram dados valores
para o crescimento para cada isolado variando de 1 (sem crescimento visível na placa) a 4
(máximo crescimento em todas as zonas), segundo escala em faixa apresentada na Figura
1B. Com base no crescimento em placas de Petri, os isolados foram classificados como
pouco, moderado ou elevado.
Figura 1A: Zona de pontuação para avaliação do crescimento bacteriano utilizando no meio YMA
(Oliveira e Magalhães, 1999). Figura 1B: Valores para crescimento de bactérias, proposto pelo método de Oliveira e Magalhães (1999).
A caracterização morfológica das bactérias foi feita segundo Vincent (1970) e
Martins et al. (1997), onde foram observadas as seguintes características: Forma da colônia
(circular ou irregular), borda (inteira ou irregular), transparência, cor, aparência
(homogênea ou heterogênea); Aparência do muco (homogêneo ou heterogêneo) e
elasticidade (com ou sem).
A seleção de bactérias produtoras de amilase foi realizada segundo Mariano e
Silveira (2005), com modificações. As bactérias foram inoculadas em placas de Petri com
meio TSA 10% (Tripcase Soy Agar), acrescido com 1% de amido de milho. Placas foram
incubadas a 28 oC por 72 h e, em seguida, realizadas as leituras. Para tanto, foram
adicionados 5 mL de solução de Iodo (1%) e mantido por 20 min, em seguida, a solução
foi descartada e observada a presença de halo claro em torno da colônia, indicando
secreção de amilase. Os experimentos foram realizados em quadruplicata e para aquelas
linhagens que apresentaram halo visível, a atividade amilolítica foi estimada mediante um
índice enzimático (IE), que expressa a relação do diâmetro médio do halo de hidrólise e o
diâmetro médio da colônia. Baseado nos índices de degradação do amido, as bactérias
foram classificadas como estirpes com baixa (IS < 2), média (2 IS < 4), e alta
110
solubilização (IS > 4), segundo Hankin e Anagnostakis (1975). O delineamento
experimental constituiu-se de 12 tratamentos e quatro repetições.
Foi realizada a análise de variância pelo teste F e quando significativo, as
comparações de médias foram feitas pelo teste de Scott-Knott (quando comparado pelo
controle) ao nível de 5% de probabilidade, programa ASSISTAT Versão 7.7 beta 2014.
Resultados e Discussão
Os 12 isolados de rizóbios apresentaram características distintas em meio YMA, de
acordo com a forma, borda, transparência, aparência, cor da colônia e, aparência e
elasticidade do muco (Tabela 1).
Tabela 1. Morfologia dos 12 isolados de rizóbios
Isolados Forma da
colônia Borda Transp. Aparência
da colônia Cor da
colônia Aparência
do muco Elasticidade
do muco UNIP R1 Irregular Irregular Não Homogênea Branca Homogênea Sem
UNIP R2 Irregular Regular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem
UNIP R3 Irregular Irregular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem
UNIP R4 Circular Regular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem
UNIP R5 Irregular Irregular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem
UNIP R6 Circular Regular Não Homogênea Amarela Homogênea Sem
UNIP R7 Circular Regular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem
UNIP R8 Circular Regular Não Homogênea Branca Homogênea Sem
UNIP R9 Circular Regular Sim Homogênea Amarela Homogênea Sem
UNIP R10 Circular Irregular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem
UNIP R11 Irregular Irregular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem
UNIP R12 Circular Regular Sim Homogênea Branca Homogênea Sem
Estes resultados foram semelhantes aos obtidos por Hungria (1994) quando os
isolados apresentaram as características de cor, elevação, transparência e formação de
ácido e álcalis compatíveis. Essa diversidade morfológica também foi verificada por
Martins et al. (1997) estudando as características de 27 isolados de rizóbios de
Discolobium sp., nativos do Pantanal Mato-Grossense.
Ao serem analisadas as amostras durante o período de incubação em temperatura
média de 28 ºC, foi possível observar que no 3° dia de avaliação, houve diferença
significativa entre as rizobactérias, com os isolados UNIP R1, UNIP R7 e UNIP R8,
apresentando notas iguais ou próximas a 4,0 (Tabela 2).
111
Tabela 2. Crescimento de isolados de rizóbios em meio de cultura contendo amido como
fonte de carbono.
---------------------------Dias de crescimento ---------------------------
Rizóbios 3 6 9 12 15 18
UNIP R1 3,6 aA 3,8 aA 3,8 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA
UNIP R2 0,0 bC 0,2 bD 0,2 bC 0,3 bC 0,3 bC 1,1 aC
UNIP R3 0,0 aC 0,2 aD 0,3 aC 0,3 aC 0,3 aC 0,3 aD
UNIP R4 3,0 bB 3,7 aA 3,8 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA
UNIP R5 0,0 bC 3,7 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA
UNIP R6 3,0 bB 3,7 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA
UNIP R7 3,6 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA
UNIP R8 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA
UNIP R9 0,0 bC 3,7 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA
UNIPR10 0,0 cC 2,3 bB 3,3 aA 3,7 aA 3,7 aA 3,7 aA
UNIPR11 0,0 bC 0,6 bD 2,3 aB 3,0 aB 3,0 aB 3,0 aB
UNIPR12 0,0 cC 1,3 bC 3,7 aA 4,0 aA 4,0 aA 4,0 aA
Médias seguidas de mesma letra, minúsculas (rizóbios) nas colunas e maiúsculas (dias) nas linhas não
diferem entre si. Foi aplicado o teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
Na tabela 3 estão as médias dos rizóbios levando em conta todo o período de
avaliação. Os isolados que apresentaram melhores notas foram UNIP R1, UNIP R4, UNIP
R6, UNIP R7 e UNIP R8, pois, tinham notas superiores a 3,5. Em seguida, com notas
intermediárias, UNIP R5 e UNIP R9 com médias superiores a 3. As amostras com menores
médias de crescimento foram UNP R10, UNIP R11 e UNIP R12, com notas oscilando
entre 2,0 a 2,8 e as que tiveram as piores médias foram UNIP R2 e UNIP R3, com notas
inferiores a 2.
Os resultados foram similares aos obtidos por Brockwell et al. (1995), quando
descreveram que 88 isolados oriundos dos nódulos coletados em experimento de
infectividade e com base na escala de valores de 45% (40 isolados) apresentaram alto
crescimento, 21,5% baixo e 33% crescimento médio.
De acordo com Vincent (1970), os isolados procedentes dos solos salinos formaram
colônias em menos de 24 horas, o que caracteriza estirpes de crescimento rápido. Para
Stamford et al. (1996), que isolaram rizóbios de caupi, soja e jacatupé em amostras de
solos da Zona da Mata e da região Semi-árida de Pernambuco, a ocorrência de rizóbios de
crescimento lento ou rápido parece estar relacionada com aspectos ambientais, pois
112
observaram que 90% dos isolados da região Semi-árida tiveram crescimento rápido e
100% dos isolados da zona da mata, crescimento lento.
Tabela 3. Crescimento dos isolados de rizóbios em meio contendo amido.
Amostra Média de cada
amostra somando
todos os dias
Amostra Média de cada
amostra somando
todos os dias
UNIP R1 3,9 a UNIP R7 3,9 a
UNIP R2 0,4 e UNIP R8 4,0 a UNIP R3 0,3 e UNIP R9 3,2 b
UNIP R4 3,7 a UNIP R10 2,8 c UNIP R5 3,2 b UNIP R11 2,0 d
UNIP R6 3,7 a UNIP R12 2,8 c
Um microrganismo é considerado bom produtor de enzimas extracelulares quando
no meio sólido este apresente um índice enzimático (IE) ≥ 2,0 (Lealem e Gashe, 1994).
Dos isolados submetidos à avaliação com iodo em meio TSA 10% (presença de amilase),
os que apresentaram atividade amilolítica foram UNIP R1, UNIP R2, UNIP R4, UNIP R5,
UNIP R6, UNIP R7, UNIP R8, UNIP R11 e UNIP R12. Estes isolados apresentaram
formação de halo ao redor da colônia. Já os isolados UNIP R9 E UNIP R10 não foram
bons produtores de enzimas extracelulares, pois tiveram baixos índices enzimáticos. Os
isolados UNIP R8 e UNIP R6 mostraram os maiores índices enzimáticos (IE) ≥ 2,0.
Alguns autores como Stamford et al. (1998) e Oliveira et al. (2006), recomendaram
um índice enzimático ≥ 2,0, para considerar um microrganismo como produtor potencial
de enzimas em meio sólido. Com base no IE, foi observado que os isolados UNIP R9 e
UNIP R10 exibiram os menores índices amilolíticos, inferiores a 1,0.
Tabela 4. Índices amilolíticos dos isolados de rizóbios
Rizóbios IA
UNIP-R1 1,8 c UNIP-R2 1,4 c
UNIP-R4 1,7 c UNIP-R5 2,1 b
UNIP-R6 3,3 a UNIP-R7 2,3 b
UNIP-R8 3,8 a UNIP-R9 0,3 d
UNIP-R10 0,6 d UNIP-R11 2,3 b
UNIP R12 2,6 b
113
Conclusões
Os isolados de rizóbios que apresentaram maiores crescimentos no meio contendo
amido como fonte de carbono foram UNIP R1, UNIP R2, UNIP R4, UNIP R5, UNIP R6,
UNIP R7, UNIP R8, UNIP R11 e UNIP R12.
Os isolados com maiores Índices de Degradação de Amido (IDA) foram UNIP-
R6 e UNIP-R8, demostrando que foram superiores aos demais como produtores de
amilases.
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Produção de amilases por rizobactérias em meio contendo farinha de
babaçu
Costa S.C.F.C.1, Menezes N.C.
2, Minelli-Oliveira C.
2, Oliveira L.A.
2
1Bolsista do PIBIC/INPA/CNPq, 2Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia.
3PG
Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas, E-mails: [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
As amilases vêm sendo muito utilizadas na biotecnologia para aprimorar a produção de
etanol. Diversas usinas vêm investindo em culturas contendo amido como fonte primária
para a produção do álcool. Para isso, torna-se necessário encontrar fontes biológicas de
amilases, com os microrganismos apresentando-se como uma alternativa de potencial
elevado. A Amazônia possui uma grande quantidade de microrganismos ainda
desconhecidos que podem ter esse potencial, como as bactérias encontradas nas raízes e
nódulos de leguminosas. Esse trabalho teve como finalidade isolar e testar rizobactérias
quanto à produção de amilases, utilizando a farinha do babaçu. As rizobactérias foram
coletadas de nódulos de leguminosas em solos da Região Metropolitana de Manaus. Dos
111 isolados testados, 30 foram considerados de crescimento baixo, 6 de crescimento
médio e 76 de elevado, por um período de quinze dias. Os isolados identificados como
761, INPA-046, INPA-001, ARABA 2, ARABA 3, ARABA 5, ARABA 7, ARABA 17,
MAN-3.2.2, 781 foram os que apresentaram maiores potenciais de degradação do amido
do mesocarpo do babaçu, por apresentarem Índices de Degradação do Amido (IDAs)
superiores a 4,0.
Palavras-chave: Rizóbios, metabolismo microbiano, Amazônia.
Introdução
O Programa Nacional do Álcool – Proálcool - foi criado em 14 de novembro de 1975,
através do Decreto n° 76.593, com o objetivo de estimular a produção de álcool para
atender aos mercados interno e externo, diminuindo a dependência da política de preços
praticada pela Organização dos Países Exportadores de Petróleo (OPEP) e, a redução do
consumo da gasolina, uma das responsáveis pelo Efeito Estufa. A cana-de-açúcar é a
principal cultura utilizada pelo Proálcool, mas nos últimos anos, o programa vem
investindo em espécies amiláceas, como o sorgo açucareiro, milho, cultivados nas
entressafras da cana. Na Amazônia, essa nova estratégia permite a produção de álcool a
116
partir da mandioca, batata doce e até algumas espécies negligenciadas, como o babaçu, de
ampla ocorrência na região, mas pouco explorada economicamente.
O babaçu (Attalea speciosa Mart.) é uma palmeira pertencente à família Arecaceae,
com vasta distribuição em toda a Região Norte do Brasil, sendo ainda encontrada nos
estados do Maranhão, Piauí, Mato Grosso, Ceará, Pernambuco e Alagoas, além da Bolívia,
Guianas e Suriname (Lorenzi, 2010). É um importante recurso utilizado há séculos para a
produção de óleo, sendo um vegetal em destaque para mais de 300 mil famílias
extrativistas no Maranhão, que têm na quebra manual do coco para retirada da amêndoa,
sua principal fonte de renda (Santos, 2007). A farinha de babaçu possui entre 50-70% de
amido (Peixoto, 1973), podendo ser uma grande fonte na produção de biocombustíveis.
Para isso são necessárias enzimas de interesse econômico, como amilases, que já foram
encontradas em isolados de rizobactérias, tais como as do gênero Rhizobium (Oliveira et
al., 2006, 2007a,b).
Torna-se importante obter rizobactérias produtoras da enzima amilase, capaz de
converter o amido da farinha de babaçu em subprodutos que serão convertidos em álcool
no processo de fermentação. Essa enzima ainda é, na sua maioria, importada, uma vez que
a produção interna é insuficiente para atender as necessidades brasileiras.
As enzimas termoestáveis, de maneira geral, apresentam vantagens para a aplicação
na indústria, visto que os processos biotecnológicos conduzidos em elevadas temperaturas
têm o risco de contaminação por microrganismos mesófilos, que são a maioria em um
ambiente industrial, significativamente reduzido. Por isso o interesse em testar o
crescimento dos microrganismos em temperaturas elevadas (Palma-Fernandez e Gomes,
2002). Para interesse na produção de etanol, o ideal é que a bactéria cresça a altas
temperaturas para produzir enzimas termofílicas e termoestáveis (Arikan, 2008).
O objetivo desse trabalho foi avaliar o crescimento de rizobactérias isoladas de
nódulos de leguminosas em meio de cultura contendo farinha de babaçu como um teste
inicial quanto às suas capacidades em degradarem o amido.
Material e métodos
Foram coletados nódulos de raízes de leguminosas de diferentes locais (Tabela 1),
para isolamento de rizobactérias usando o meio de cultura YMA (Vincent, 1970),
substituindo o manitol pela farinha de babaçu (1%). Foram testadas rizobactérias da
coleção bacteriana do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Microrganismos da
Amazônia (LEBMAM), do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA).
117
Tabela 1. Rizobactérias isoladas de nódulos de leguminosas e seus locais de coleta no
Estado do Amazonas. Rizobactérias Local Planta
INPA R001, INPA R007, INPA R012, INPA R014, INPA R015,
INPA R020, INPA R026, INPA R046, INPA R028, INPA R034,
INPA R600
Município de Rio
Preto da Eva
Rhynchosia
macrocarpum
INPA R817(1), INPA R818(1), INPA R819 (1), INPA R820 (1),
INPA R821 (1), INPA R822 (1), INPA R823 (1), INPA R824 (1),
INPA R825 (1), INPA R826 (1), INPA R827 (1), INPA R828 (1),
INPA R829 (1), INPA R830 (1), INPA R831 (1)
Município de Rio
Preto da Eva
Inga edulis
(Ingá)
ARABA 3, ARABA 4, ARABA 5, ARABA 6, ARABA 7,
ARABA 8, ARABA 9, ARABA 10, ARABA 11, ARABA 12,
ARABA 13, ARABA 17, ARABA 2, ARABA 1, ARABA 14,
ARABA 15, ARABA 16
INPA, campus
V8, Manaus
Swartzia
polyphylla
(Arabá)
INPA R959, INPA R1001, INPA R1002, INPA R1005, INPA
R1007, INPA R964, INPA R962, INPA R1003, INPA R963,
BALB 5.8/17.1, BALB 2.4/10.2.2, BALB 1/12.1, BALB 1/11
Balbina,
município de
Presidente
Figueiredo
Pueraria
phaseoloides
INPA 976
Novo Remanso;
Ramal do Macaco
Cego
Inga cinnamomea
(Ingá chinelo)
INPA R792, INPA R293, INPA R302, INPA R548, INPA R769,
INPA R727, INPA R781, INPA R762, INPA R721, INPA R739,
INPA R315, INPA R722, INPA R548
Lago do Paru Inga edulis
(Ingá)
INPA R1062, INPA R1065, INPA R1060, INPA R1067, INPA
R1068, MAN 3.6.4, MAN- 3.2.2, MAN- 10.8.7, MAN-3.2.4,
MAN-10.8.10, MAN-10.8.16, MAN-10.8.2, MAN-10.8.4, MAN-
10.8.1, MAN- 5.4.6
Estrada do
Acajatuba
Pueraria
phaseoloides
INPA R966 Município de
Iranduba
Inga
heterophylla
INPA R721, INPA R278, INPA R692, INPA R784, INPA R761,
INPA R710, INPA R318, INPA R733, INPA R270, INPA R702,
INPA R709, INPA R325, INPA R287, INPA R689, INPA R739,
INPA R781, INPA R301, INPA R303, INPA R304, INPA R305, INPA R306, INPA R308, INPA R309, INPA R310, INPA R311,
INPA R312, INPA R739, INPA R315, INPA R722, INPA R781,
INPA R762, INPA R721
Ramal do Caldeirão km3
Pueraria phaseoloides
Para a avaliação do crescimento, os isolados foram estriados em placas de Petri
com meio contendo farinha do babaçu, submetidos à temperatura de 25 ºC. O experimento
foi realizado com quatro repetições usando o método de Oliveira e Magalhães (1999) para
as avaliações que consiste na atribuição de notas de 1,00 (sem crescimento visível na zona
1) a 4,00 (máximo crescimento até a zona 4, podendo ser atribuídas notas intermediárias,
subdivididas em 0,25, ou seja, 1,00, 1,25, 1,50, 1,75, 2,00, até 4,00, aumentando assim a
precisão do método. Para fins de comparações, foram considerados três graus de
crescimento, segundo apresentado na Tabela 2.
118
Figura 1. Método de avaliação do crescimento bacteriano (Oliveira e Magalhães, 1999).
Figura 2. Pontuações (notas) aplicadas para o crescimento das bactérias segundo Oliveira e
Magalhães (1999).
Tabela 2. Faixas de pontuação para avaliação do crescimento das bactérias em meio
sólido contendo babaçu.
Grau de crescimento Faixa de pontuação
Baixo 1,00 – 2,00
Médio 2,06* - 3,00
Elevado 3,06** - 4,00
* Três repetições com nota 2,0 e uma com 2,25. ** Três repetições com nota 3,0 e uma
com 3,25 (Oliveira e Magalhães, 1999).
Os isolados foram avaliados quanto à capacidade de degradação do amido do
mesocarpo do babaçu, pela visualização do halo de degradação (região transparente ao
redor das colônias). As rizobactérias foram repicadas em placas de Petri com o auxílio de
palitos de dentes esterilizados, retirando-se uma porção da colônia bacteriana, com um leve
toque no meio de cultura; cada placa teve quatro colônias como repetições.
Os diâmetros da colônia bacteriana e do halo de degradação foram medidos em
intervalos de dois dias usando um paquímetro digital, até estabilização dos diâmetros. A
Nota 1.0 Nota 1.25 Nota 2,0 Nota 3,0 Nota 4,0
119
partir dessas medidas, foram obtidos os Índices de Degradação do Amido (IDA) para cada
isolado, pela fórmula: DD (diâmetro da zona de degradação em mm)/DC (diâmetro da
colônia em mm), adaptando-se os critérios e cálculos de Berraquero et al. (1976). Com
base nos índices, os isolados foram classificados de acordo com a capacidade de
degradação do amido, em: baixa (IDA <2), média (2≤ IDA <4) e alta (IDA ≥4).
O experimento seguiu o delineamento inteiramente casualizado com 4 repetições.
Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos ao teste
Scott-Knott a 5% de probabilidade usando o programa ASSISTAT.
Resultados e Discussão
Dos 111 isolados cultivados em meio contendo farinha de babaçu, 30 foram
considerados de crescimento baixo, 6 de crescimento médio e 76 de elevado, por um
período de quinze dias segundo o método de Oliveira e Magalhães (1999) (Tabela 3).
Tabela 3. Crescimento das rizobactérias em meio de cultura contendo farinha do
mesocarpo de babaçu como fonte de nutrientes.
Rizobactérias Dias*
INPA R293, INPA R548, INPA R762, INPA R721, INPA R315, INPA R722, MAN 5.4.6,
INPA R1062, INPA R1065, INPA R278, INPA R284, INPA R325, INPA R689, INPA R739,
INPA R301, INPA R304, INPA R305, INPA R306, INPA R308, INPA R309, INPA R310,
INPA R311, INPA R312, INPA R959, INPA R1001, INPA R1002, INPA R1005, INPA
R1007, INPA R001, INPA R007, INPA R012, INPA R014, INPA R015, INPA R600, INPA
R826 (1), INPA R827 (1), INPA R831 (1), INPA R823 (1), INPA R826 (1), INPA R830 (1),
INPA R964, INPA R976, INPA R962, ARABA 4, ARABA 7, ARABA 10, ARABA 11,
ARABA 2, ARABA 15, ARABA 16, BALB 1/12.1, BALB 1/11, MAN 3.2.2, MAN 3.2.4
3
INPA R781, INPA R733, INPA R287, INPA R781, INPA R303, INPA R1003, INPA R829 (1),
ARABA 5, ARABA 6, ARABA 8, ARABA 9, ARABA 12, ARABA 13, ARABA 17, ARABA
1, ARABA 14
6
INPA R1067, INPA R769, INPA R727, ARABA 3, INPA R825 (1), INPA R827 (1) 9
INPA R318 12
INPA R1060, INPA R792, INPA R302, INPA R702, INPA R818 (1), INPA R819 (1), INPA
R829 (1), INPA R830 (1), INPA R976 **
INPA R020, INPA R026, INPA R046, INPA R028, INPA R817 (1), INPA R820 (1), INPA R821 (1), INPA R822 (1), INPA R823 (1), INPA R824 (1), INPA R825 (1), INPA R828 (1),
INPA R828 (1), INPA R831 (1), INPA R1068, INPA R739, INPA R548, INPA R692, INPA
R761, INPA R966, INPA R710, INPA R270, INPA R709, INPA R963, BALB 5.8/17.1, BALB
2.4/10.2.2, MAN-10.8.7, MAN-10.8.10, MAN-10.8.16, MAN-10.8.2, MAN-10.8.4, MAN-
10.8.1
***
* Número de dias para atingir crescimento 3,06 segundo notas de Oliveira e Magalhães (1999).
** Notas de 2,06 a 3,00 durante o período de avaliação. ***Notas de 1,00 a 2,00 durante o período de avaliação.
120
Dentre as bactérias testadas, 54 apresentaram crescimento alto a partir do terceiro
dia de crescimento (Tabela 3). Segundo Oliveira e Magalhães (1999), microrganismos que
apresentam valores elevados já no 3° dia de crescimento são os que estão mais bem
adaptados às condições do meio, indicando, que esses isolados estão usando os
constituintes do meio com mais eficiência para os seus crescimentos.
O índice de degradação de amido variou de 0,29 a 9,21 entre os isolados (Tabela 4).
Valores de IDA maiores ou iguais a 2,0 indicam elevada produção de enzimas extra
celulares (Lealem e Gashe, 1994). O IDA para amilases acima de 2,0 foi observado em 19
isolados. Resultados semelhantes foram observados por Oliveira et al. (2007 a, b).
Os tratamentos INPA R001, INPA R046, INPA R761, INPA R781, ARABA 2,
ARABA 3, ARABA 5, ARABA 7, ARABA 17 e MAN 3.2.2 apresentaram valores de IDA
maiores do que 4,0, indicando maiores potenciais biotecnológicos para serem usados como
fontes de amilases.
Tabela 4. Índices de Degradação do Amido (IDA) apresentados pelas rizobactérias.
Bactérias Diâmetro (mm) IDA (dh/dc)
Halo (dh) Colônia (dc)
INPA R001 10,37 c 1,55 c 6,69
INPA R007 5,15 d 3,72 a 1,38
INPA R012 15,19 a 2,27 c 6,69
INPA R014 10,35 c 3,46 b 3,00
INPA R015 1,88 e 1,88 c 1,00
INPA R020 4,39 d 3,90 a 1,12
INPA R028 4,19 d 4,88 a 0,86
INPA R034 12,18 b 2,15 c 2,36
INPA R046 9,64 c 2,11 c 4,56
INPA R278 1,13 e 1,98 c 0,57
INPA R287 1,49 e 1,49 c 1,00
INPA R302 4,59 d 2,05 c 2,24
INPA R315 2,42 e 2,70 c 0,89
INPA R318 4,50 d 1,99 c 2,26
INPA R325 2,43 e 2,59 c 0,93
INPA R548 5,71 d 3,28 b 1,74
INPA R689 4,83 d 4,32 a 1,11
INPA R721 3,73 d 3,73 a 1,00
INPA R722 1,00 e 3,34 b 0,29
INPA R733 1,55 e 2,35 c 0,66
INPA R761 8,97 c 1,88 c 4,77
INPA R781 5,94 d 1,45 c 4,09
INPA R783 4,85 d 1,88 c 2,58
INPA R784 1,22 e 2,16 c 0,56
INPA R792 4,69 d 3,90 a 1,20
INPA R959 2,53 e 2,54 c 0,99
121
INPA R976 4,81 d 1,42 c 3,38
INPA R1001 4,71 d 3,03 b 1,55
INPA R1002 2,38 e 1,67 c 1,42
INPA R1005 1,78 e 1,63 c 1,09
INPA R1007 2,49 e 2,49 c 1,00
INPA R1060 3,21 e 2,99 b 1,07
INPA R1062 4,35 d 2,02 c 2,15
INPA R1065 4,90 d 1,48 c 3,31
INPA R1067 2,91 e 1,67 c 1,74
INPA R1068 2,02 e 2,02 c 1,00
ARABA 1 1,63 e 1,49 c 1,09
ARABA 2 11,63 b 1,70 c 6,84
ARABA 3 9,18 c 1,88 c 4,88
ARABA 5 13,73 a 1,49 c 9,21
ARABA 7 15,41 a 2,15 c 6,60
ARABA 17 13,59 a 2,84 b 4,78
BALB 1/12.1 4,71 d 3,02 b 1,56
MAN 3.2.2 6,68 d 1,59 c 4,20
MAN 5.4.6 1,48 e 2,13 c 0,69
MAN 10.8.7 5,13 d 4,97 a 1,03
MAN 10.8.10 2,27 e 2,27 c 1,00 As médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de
Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Conclusões
A maioria dos isolados de rizobactérias apresentou crescimento médio ou elevado
no meio contendo farinha do mesocarpo de babaçu.
Os isolados identificados como INPA R001, INPA R046, INPA R761, INPA R781,
ARABA 2, ARABA 3, ARABA 5, ARABA 7, ARABA 17, MAN 3.2.2 foram os que
apresentaram maiores potenciais de degradação do amido do mesocarpo do babaçu, por
apresentarem Índices de Degradação do Amido (IDAs) superiores a 4,0.
Agradecimentos
Ao INPA, CNPq e FAPEAM, pelo apoio de infraestrutura e financeiro para a
realização da pesquisa.
122
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Macrofungos polyporaceae (basidiomycota) no Jardim Botânico Adolpho
Ducke, Amazonas, Brasil
Couceiro D.M.1, Jesus M.A.
2
1Bolsista AT PAIC FAPEAM/INPA,
2Pesquisadora INPA, Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia. E-mail: [email protected], [email protected]
Resumo
Os fungos Polyporaceae (Polyporales) compreendem aqueles conhecidos como
“orelha-de-pau”. São fungos cosmopolitas que ocorrem com maior frequência nas regiões
tropicais e subtropicais. O presente trabalho teve como objetivo realizar um levantamento
de macrofungos Polyporaceae no Jardim Botânico de Adolpho Ducke, Manaus. As coletas
foram realizadas no período entre março de 2015 a maio de 2016 em diferentes substratos
lignocelulolíticos das trilhas interpretativas na floresta, seguiu-se a metodologia para
identificação de Polyporaceae. Um total de 40 macrofungos foi coletado e todos
identificados, distribuídos em nove gêneros e 20 espécies. Das espécies, Fomes
fomentarius e Trametes hirsuta são relatadas pela primeira vez no Estado do Amazonas.
Existem diferenças notáveis com relação à ocorrência de espécies, nas trilhas, sendo que
nas trilhas Azul, Laranja, Marrom, Rosa, Verde não há registro de Polyporaceae no
período coletado. Os substratos com maior registro de macrofungos foram galhos e
troncos. A ocorrência de F. fomentarius e T. hirsuta é registrada pela primeira vez no
Estado do Amazonas. As espécies L. elegans, P. badius, P. tenuiculus, P. sanguineus e
T. hirsuta possuem potencial biotecnológico. As espécies fitopatogênicas encontradas
foram F. fomentarius, H. hydnoides, L. stereoides, M. cavernulosa, P. martia e T.
epimiltinus.
Palavras-chaves: Área Protegida, Biodiversidade, MUSA, Poliporoides.
Introdução
Polyporaceae Corda (1839) é uma família pertencente à ordem Polyporales,
comumente conhecida como “orelha-de-pau”. A maioria das espécies deste grupo é
degradadora de substrato lignocelulolítico (Ryvarden, 1991), tendo um papel fundamental
na reciclagem dos nutrientes no ecossistema (Alexopoulos et al. 1996). A família abriga 79
gêneros e 636 espécies, as quais estão amplamente distribuídas em diversas regiões do
mundo (Kirk et al., 2008).
125
Segundo Ryvarden e Iturriaga (2003), as principais características de
Polyporaceae são os basidiomas perenes, estipitados, pileados e ressupinados com uma
ampla variedade de cores: branca, creme, marrom, vermelho, violeta. Geralmente, o
himenóforo pode ser poroíde, lamelado, labiríntico a hidinoides, o que difere das demais
famílias de Basidiomycetes (Volk, 2000; Vieira et al., 2006). O sistema hifal é monomítico
quando o basidioma apresenta hifas generativas; dimítico que apresenta hifas generativas e
esqueléticas ou conectivas e trimítico quando o macrofungo é formado pelos três tipos de
hifas (generativa, esquelética e conectiva). A maioria das espécies de Polyporaceae possui
hifas hialinas e poucas hifas dextrinóides ou amilóides. As cistidias (estruturas
ornamentais) é uma das características utilizada na diferenciação entre os gêneros pela
ausência ou presença. Os basidiósporos variam de truncado, globoso, subgloboso,
cilíndrico e elipsóide, e podendo ser hialino, dextrinóide ou amilóide (Ryvarden e
Iturriaga, 2003).
A família Polyporaceae ocorre com frequências nas regiões tropicais e
subtropicais. A riqueza das espécies encontrada nestas regiões difere da relatada nas
regiões temperadas (Tokumasu et al., 1988). Algumas espécies são fitopatógenas, como
Hexagonia hydnoides (Sw.) M. Fidalgo, que atacam árvores vivas (Gugliota e Bononi,
1999). Outras espécies são comestíveis, apresentando um alto valor nutricional, como
Pleurotus ostreatus (Fr.) P. Kumm. comercializada mundialmente e Polyporus tenuiculus
(P. Beauv.) Fr., consumida pelos índios Yanomamis (Franco-Molano et al., 2005).
Espécies de Polyporaceae podem apresentar potencial biotecnológico como P.
badius (Pers.) Schwein., Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill e Lenzites elegans (Spreng.)
Pat., as quais são fonte de investimento em processos, tais como: biorremediação de solos
contaminados, tratamentos de resíduos têxteis, papelaria, e recentemente, na produção de
etanol e produção de enzimas (Soares et al., 2011).
O trabalho teve como objetivo realizar um levantamento de macrofungos
Polyporaceae no Jardim Botânico de Adolpho Ducke, visando contribuir com novos
exemplares identificados taxonomicamente e possibilitando, assim, associar as espécies
com a distribuição desses macrofungos na região Amazônica.
Material e Métodos
O Jardim Botânico Adolpho Ducke localiza-se no bairro Cidade de Deus, Zona
Leste de Manaus-AM, em 500 hectares de floresta primária de terra firme, na borda da
Reserva Florestal Adolpho Ducke (Figura 1).
126
As coletadas de macrofungos (Polyporaceae) foram realizadas no período entre
março de 2015 a maio de 2016 em diferentes substratos lignocelulolíticos das trilhas
interpretativas na floresta, identificadas pelos nomes Arecaceae, Amarela, azul, Branca,
Laranja, Lilás, Marrom, Rosa, Verde e Vermelha (Figura 2). A área amostral possui três
quilômetros de extensão do Jardim Botânico Adolpho Ducke.
Figura 1. Localização do Jardim Botânico Adolpho Ducke. Fonte JDABM, 2010.
Figura 2. Mapa das trilhas interpretativas do Jardim Botânico Adolpho Ducke.
A identificação dos basidiomas foi baseada na análise macroscópica, tais como:
forma do basidioma, modo de fixação no substrato, cor e poros (tamanho e tipo), e na
127
análise microscópica: basídias, esporos, tipos de hifa, presença ou ausência de estruturas
ornamentais (cistídios e cistídiolos) (Ryvarden e Johansen, 1980). As espécies foram
identificadas a partir dos trabalhos taxonômicos descritos por Gilbertson e Ryvarden
(1986, 1987), Gugliota e Bononi (1999), Ryvarden e Johansen (1980), Ryvarden (1991) e
Ryvarden e Gilbertson (1993).
Resultados e Discussão
Um total de 40 espécimes de macrofungos Polyporaceae foi coletado no Jardim
Botânico Adolpho Ducke. Todo o material foi identificado, e está distribuído em nove
gêneros e 20 espécies (Tabela 1). De acordo com Gilbertson (1980) e Alexopoulos et al.
(1996), a família é a que possui maior diversidade dentro da ordem Polyporales.
Dentre os representantes de Polyporaceae, destacam-se: Fomes fomentarius (L.) Fr.
(Figura 3A) e Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát (Figura 3B) como primeiros registros para o
Estado do Amazonas, de acordo com a Lista de Espécies da Flora do Brasil (Flora do Brasil,
2016) E L. elegans (Figura 3C), P. badius, P. tenuiculus (P. Beauv.) Fr., P. sanguineus (Figura
3D), T. hirsuta (Wulfen) Pilát são espécies com potencial biotecnológico (Chye et al., 2008;
Soares et al. 2011; Silva, 2014; Costa, 2015). As demais espécies, F. fomentarius (L.) Fr.,
Hexagonia hydnoides (Sw.) M. Fidalgo, L. stereoides (Fr.) Ryv., Megasporoporia cavernulosa
(Berk.) Ryv. (Figura 3E), Perenniporia martia (Berk.) Ryv. (Figura 3F) e Tinctoporellus
epimiltinus (Berk. , Broome) Ryv. são consideradas fitopatogênicas (Gilbertson, 1980; Ryvarden
e Johansen, 1980; Schwarze et al., 2013).
Dentre as espécies registradas, a mais representativa é L. elegans com cinco
espécimes, ocorrendo na Trilha Amarela, Lilás e Vermelha, seguido de M. cavernulosa
com quatro que ocorrem na Trilha Branca e Vermelha, como também P. inflexibilis
(Figura 3G) registrado na Trilha Amarela e vermelha, Perenniporia sp. 1 (Figura 3H) e P.
dictyopus que ocorre somente na Trilha Lilás e T. modesta ocorre na Trilha Amarela e
Vermelha todas essas espécies estão representadas por três espécimes (Tabela 1), estes
macrofungos são de ocorrência em regiões tropicais (Gilbertson, 1980).
Os macrofungos Polyporaceae encontrados no Jardim Botânico Adolpho Ducke
estão amplamente distribuídos em diversos tipos de substrato (Tabela 1). Nota- se que há
um registro em árvore morta e árvore viva (Figura 4), enquanto que seis espécimes
atacaram galhos e três em troncos na Trilha Amarela.
128
Figura 3. Basidiomas das espécies (A – H). A – Fomes fomentarius. B – Trametes hirsuta.
C – Lenzites elegans. D – Pycnoporus sanguineus. E – Megasporoporia cavernulosa. F –
Perenniporia martia. G – P. inflexibilis. H – Perenniporia sp. 1.
1 cm 1 cm
A B
C D
E F
G H
129
Na Trilha Vermelha ocorreu o inverso, nove fungos em troncos e dois em galhos,
e na Trilha Lílás ocorreram dois espécimes em galhos, sete em troncos e três em solo.
Entretanto, na Trilha Arecaceae ocorreram dois espécimes em galhos e na Trilha Branca,
dois em galhos e troncos. Verifica-se que a maioria dos espécimes ocorreu em galhos e
troncos de árvores caídas, o que indica a preferência desses fungos com estes dois tipos de
substratos lignocelulolíticos (Figura 4). Nas trilhas Azul, Laranja, Marrom, Rosa e Verde
não houve registro de Polyporaceae, dado que merece ser mais estudado tendo em vista
que essas trilhas são preservadas.
Os macrofungos Polyporaceae encontrados no Jardim Botânico Adolpho Ducke
estão amplamente distribuídos em diversos tipos de substrato (Tabela 1). Há um registro
em árvore morta e árvore viva (Figura 4), enquanto que seis espécimes atacaram galhos e
três em troncos na Trilha Amarela. Na Trilha Vermelha ocorreu o inverso, nove fungos em
troncos e dois em galhos, e na Trilha Lílás ocorreram dois espécimes em galhos, sete em
troncos e três em solo. Entretanto, na Trilha Arecaceae ocorreram dois espécimes em
galhos e na Trilha Branca, dois em galhos e troncos. Verifica-se que a maioria dos
espécimes ocorreu em galhos e troncos de árvores caídas, o que indica a preferência desses
fungos com estes dois tipos de substratos lignocelulolíticos (Figura 4). Nas trilhas Azul,
Laranja, Marrom, Rosa e Verde não houve registro de Polyporaceae, dado que merece ser
mais estudado tendo em vista que essas trilhas são preservadas.
Figura 4. Distribuição de macrofungos Polyporaceae em diferentes substratos lignocelulolíticos nas trilhas interpretativas do Jardim Botânico Adolpho Ducke. TA: Trilha Amarela; TAR: Trilha
Arecaceae; TB: Trilha Branca; TL: Trilha Lilás; TV: Trilha Vermelha.
A riqueza de espécies registradas no Jardim Botânico Adolpho Ducke pode estar
provavelmente associada às clareiras formadas ao longo das trilhas por fatores abióticos
devido às condições climáticas atípicas em 2016 causadas pelo fenômeno El Niño, que
130
provoca flutuações no clima devido ao aumento da temperatura das águas do Oceano
Pacífico, e que é responsável pela estiagem no Norte do Amazonas, considerada atípica
(Agência Brasil, 2016). Nesse caso, a falta de chuva pode ter contribuído para o não
desenvolvimento dos fungos, os quais necessitam de umidade para o seu crescimento. Em
vista da estiagem, novas coletas dos fungos devem ser realizadas assim que o período
chuvoso se normalize visando consolidar o conhecimento da diversidade de macrofungos
Polyporaceace no Jardim Botânico Adolpho Ducke, Manaus.
Conclusões
A ocorrência de F. fomentarius e T. hirsuta é registrada pela primeira vez no
Estado do Amazonas.
As espécies L. elegans, P. badius, P. tenuiculus, P. sanguineus e T. hirsuta
possuem potencial biotecnológico.
As espécies fitopatogênicas encontradas foram F. fomentarius, H. hydnoides,
L. stereoides, M. cavernulosa, P. martia e T. epimiltinus.
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Tabela 1. Macrofungos (Polyporaceae) que ocorrem em diversos substratos em trilhas interpretativas do Jardim Botânico Adolpho Ducke, Manaus.
Táxon
Trilhas
TOTAL TA TAR TB TL TV
Subs tratos
AM AV G T AM AV G T AM AV G T AM AV G S T AM AV G T
Fomes fomentarius (L.) Fr. – – – – – – – – – – – 1 – – – – – – – – – 1
Hexagonia hydnoides (Sw.) M. Fidalgo – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – 1 1
H. tenuis (Hook.) Fr. – – – 1 – – – – – – – – – – – – – – – – – 1
Lenzites elegans (Spreng.) Pat. – – 1 1 – – – – – – – – – – 2 – – – – – 1 5
L. stereoides (Fr.) Ryv. – – – – – – – – – – – – – – – – 1 – – – 1 2
Megasporoporia cavernulosa (Berk.) Ryv. – – – – – – – – – – 2 – – – – – – – – 2 – 4
M. setulosa (Henn.) Rajchenb. – – 1 – – – – – – – – – – – – – – – – – – 1
Perenniporia inflexibilis (Berk.) Corner – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – 3 3
P. martia (Berk.) Ryv. – – – – – – – – – – – 1 – – – – – – – – – 1
P. mundula (Wakef.) Ryv. – – 1 – – – – – – – – – 1 – – – – – – – – 2
Perenniporia sp. 1 – – – – – – – – – – – – – – – 3 – – – – – 3
Perenniporia sp. 2 – – 1 – – – – – – – – – – – – – – – – – 1 2
Polyporus badius (Pers.) Schwein. – – – – – – 1 – – – – – – – – – – – – – – 1
P. dictyopus Mont. – – – – – – – – – – – – – – – – 3 – – – – 3
P. grammocephalus Berk. – – – 1 – – – – – – – – – – – – 1 – – – – 2
P. tenuiculus (P. Beauv.) Fr. – – – – – – 1 – – – – – – – – – 1 – – – – 2
Pycnoporus sanguineus (L.) Murrill – – 1 – – – – – – – – – – – – – – – – – – 1
Tinctoporellus epimiltinus (Berk. & Broome) Ryv. – – – – – – – – – – – – – – – – 1 – – – – 1
Trametes hirsuta (Wulfen) Pilát – – – – – – – – – – – – – – – – – – 1 – – 1
T. modesta (Fr.) Ryv. – – 1 – – – – – – – – – – – – – – – – – 2 3
TOTAL 0 0 6 3 0 0 2 0 0 0 2 2 1 0 2 3 7 0 1 2 9 40
Legenda: Trilha TA = Trilha Amarela; TAR = Trilha da Arecaceae; TB = Trilha Branca; TL = Trilha Lilás; TV = Trilha Vermelha; Substrato: AM = Árvore morta; AV =
Árvore viva; G = Galho; T = Tronco.
133
Oliveira L.A., Bentes J.L.S., Jesus M.A., Rocha L.C.,
Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L. Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017. Editora INPA
Constituintes químicos do fungo Trichoderma koningii isolado de
Strychnos cogens
Fernandes, K.R.P.1, Souza, A.Q.L.de.
2, 3,4, Alencar, L.F.
3, Silva, H.F.
4, Pereira, J.O.
.2,
Rodrigues-Filho, E.5, Souza, A.D.L.
1
1PPGQ/UFAM, Programa de Pós Graduação em Química da Universidade Federal do Amazonas,
2FCA/UFAM, Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Amazonas,
3MBT/UEA,
Mestrado em Biotecnologia e Recursos Naturais da Universidade do Estado do Amazonas, 4DGEV/UFSCar, Departamento de Genética e Evolução da Universidade Federal de São Carlos,
5DQ/UFSCar, Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos. Emails:
[email protected]; [email protected]
Resumo
Os fungos do gênero Trichoderma produzem substâncias conhecidas como koningininas
que têm semelhanças estruturais com a vitamina E e são capazes de inibir microrganismos
patogênicos. Em diversas publicações, foram indicadas possíveis aplicações para as
koningininas: controle biológico de crescimento de plantas, atividades antimicrobianas e
capacidade de inibir atividades enzimáticas relacionadas à fosfolipase A2. Além disso, esta
classe de substâncias é promissora como marcadora taxonômica para este gênero. Neste
trabalho, apresenta-se o resultado do estudo químico de uma linhagem de Trichoderma
koningii, fungo endofítico obtido de Strychnos cogens, planta amazônica coletada na
região de Manaus – AM. Foram obtidas treze substâncias, com destaque para as
koningininas A, D, E e F, as quais apresentaram alguma inibição a Aspergillus flavus,
Staphylococcus aureus e Xanthomonas axonopodis. A menor concentração inibitória foi
proveniente da koninginina E, com 31µg/mL contra a A. flavus. O isolamento dessas
koningininas de T. koningii em boa quantidade indica que são relevantes para este
microrganismo.
Palavras – chave: Koningininas, fungo endofítico, potencial biológico.
Introdução
Espécies de Trichoderma podem ocorrer como fungos endofíticos ou saprófitas,
produzem diversos compostos com propriedades antibióticas e têm recebido considerável
atenção como agentes de controle biológico de inúmeros fitopatógenos. Entre os
metabólitos de Trichoderma spp. estão as koningininas A-M, compostos pirânicos,
furânicos, carotenos e diversos peptídeos N-acilados e com uma função amino álcool no
carbono terminal, os quais foram denominados peptaibois e são antibióticos que agem
como desestabilizadores de membranas celulares (Macias et al., 2000; Souza et al., 2004,
Lang et al., 2014).
134
Espécies vegetais amazônicas têm sido reveladas como abundantes fontes de
fungos endofíticos, muitos dos quais produzem compostos com atividades antimicrobianas
contra cepas patogênicas (Souza et al., 2004). Desta forma, este trabalho teve como
objetivo apresentar o resultado do estudo químico de uma linhagem de T. koningii, fungo
endofítico de Strychnos cogens. Entre os metabólitos obtidos, destacam-se as koningininas,
que foram avaliadas quanto a atividades antimicrobianas.
Material e Métodos
O fungo foi isolado a partir de um indivíduo da planta amazônica S. cogens
coletada em Manaus-AM e foi morfologicamente identificado como Trichoderma sp.
(Souza et al., 2004). Para a identificação molecular, o isolado foi cultivado em caldo (BD)
batata-dextrose à temperatura ambiente sob agitação durante 36 horas (a 120 rpm). Após a
separação do meio cultivado por filtração, o micélio foi tratado pelo método de CTAB para
a obtenção do DNA genômico (Doyle e Doyle, 1987).
A concentração de DNA foi estimada em 100 ng/µL em comparação com o
marcador de 1 kb em 1% de gel de agarose, e confirmada em espectrofotômetro de UV
visível, marca Cary 100 Varian (260 nm). A PCR foi realizada com volume de 25 µL
contendo 10,2 µL de água, 2,5 µL de Tp 10x, 3,0 µL de MgCl2 a 25 mM, 3,0 µL de dNTP
a 1,25 mM, 2,0 µL de cada um dos iniciadores Its 1 (5’ – TCCGTAGGTGAACCTGCGG–
3’) e 2 (5`-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3`) a 10 mM, 0,3 µL de Taq polimerase (5U)
e 2,0 µL de DNA genômico diluído para 10 ng/µL (White et al., 1990).
Após a desnaturação inicial a 94 ºC por 4 min, a amplificação gênica foi feita em 40
ciclos através dos seguintes passos: desnaturação por 2 min. a 94 ºC, anelamento dos
primers por 2 min. a 55 ºC e alongamento por 2 min. a 72 ºC. A finalização foi realizada
com 10 min. a 72 ºC. Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de
agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio, em comparação com marcador de 1000 pb,
estimado em 50 ng/µL. Ao todo, 2 µL do produto da PCR foram sequenciados em gel de
acrilamida e as sequências obtidas, com 539 pares de bases, foram comparadas com os
dados do Gene bank do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Souza,
2006).
Para o cultivo do fungo, 14 frascos erlenmeyer de 500 mL, cada um contendo 200
mL de meio BD com 0,2% de extrato de levedura, foram inoculados individualmente com
uma suspensão de 50 L de conídios do fungo T. koningii, na concentração de 9.107
135
cel/mL. O pH inicial do meio de cultura foi de 5,5. O cultivo ocorreu sob agitação
constante de 120 rpm e 25 ºC até o meio de cultura atingir o pH constante de 8,0 durante 3
dias, o que ocorreu entre o nono e o décimo primeiro dia, quando o crescimento foi
interrompido. O meio líquido cultivado foi filtrado em papel de filtro no funil de Büchner
(Souza, 2005).
Para o isolamento e caracterização das moléculas, o meio líquido cultivado foi
particionado com solventes orgânicos (CHCl3, acetato de etila e n-butanol) e o micélio foi
macerado com metanol e etanol. Os extratos foram concentrados sob pressão reduzida a
temperaturas entre 45 e 60 ºC, de acordo com a volatilidade de cada solvente. Após a
comparação dos extratos por cromatografia de camada delgada (CCD), os extratos do
líquido cultivado foram agrupados, dadas suas semelhanças e baixos rendimentos,
resultando em 1,0 g do material. Este material foi aplicado em coluna cromatográfica de
sílica de 230-400 mesh e eluído com misturas de hexano, diclorometano, acetato de etila e
metanol, em ordem de polaridade crescente, obtendo-se 36 frações. Tratamentos
cromatográficos complementares por HPLC resultaram em seis substâncias.
O extrato do micélio foi tratado com acetato de etila/ metanol 97:3 a quente e a
parte solúvel foi fracionada em coluna cromatográfica de sílica de 230-400 mesh e eluída
com misturas de hexano, acetato de etila e metanol, em ordem de polaridade crescente,
obtendo-se 19 frações. Tratamentos cromatográficos complementares permitiram a
obtenção de sete substâncias. Estas e as obtidas do meio líquido cultivado foram
submetidas à identificação através de análises por RMN (Ressonância Magnética Nuclear)
unidimensional e bidimensional e por espectrometria de massa.
Para os testes de sensibilidade das koningininas, foram utilizadas as cepas de
bactérias gram-positivas Staphyloccoccus aureus e Bacillus subtilis, cepas de bactérias
gram-negativas Escherichia coli, Xanthomonas axonopodis e Pseudomonas aeruginosa e
cepas dos fungos Candida tropicalis, Guignardia citricata, Fusarium monoliforme,
Aspergillus flavus e Colletotritchum sp. As koningininas foram submetidas aos ensaios de
detecção de antibióticos por difusão em ágar e para as amostras que apresentaram
atividades, foi realizada a dosagem mínima inibitória em microplacas de 96 poços
(Aligianis et al., 2001, Souza, 2006).
Resultados e Discussão
A identificação da linhagem foi confirmada por sequenciamento da região Its-1 do
rDNA e confrontados com sequências do GenBank. As comparações revelaram 99% de
136
identidade com T. koningii com e value de 0,0. Alguns aspectos macro e microscópicos são
mostrados na Figura 1, para facilitar o reconhecimento do fungo.
Figura 1– Aspectos macroscópicos de T. Koningii em A. Estruturas micro-morfológicas de
T. koningii, conidióforo com conídios em B.
As substâncias isoladas do meio líquido e do micélio de T. koningii (Figura 2)
foram caracterizadas através da análise dos espectros de RMN de 1H e
13C uni e
bidimensional e de espectrometria de massas, e confirmadas por comparação com dados da
literatura. Nos espectros de massas e de RMN 1D e 2D de 1 foram observados dados
compatíveis com a fórmula molecular C16H28O4: um pico em m/z 285,3 ([M+H]+), obtido
por ESI-MS; sinais entre 4,4-3,1, correspondentes a hidrogênios carbinólicos, e abaixo de
2,5, no espectro de RMN de 1H; e 16 sinais de
13C correspondentes a diversos carbonos:
um metílico, nove metilênicos, cinco metínicos e um de carbono tetrassubstituído em
109,2, nos espectros PENDANT e HSQC. A comparação desses dados com os da literatura
confirmaram a identificação de 1 como a koninginina A (Parker et al., 1995a; Xu e Zhu,
1995).
As outras koningininas foram identificadas seguindo o mesmo tipo de análise: 2,
com íon em m/z 299,5 ([M+H]+) no espectro de massas por ESI-MS, foi identificada como
a koninginina D; 3, com íon em m/z 283,4 ([M+H]+) foi identificada como a koninginina
E; e 4, com íon em m/z 299,6 ([M+H]+) foi identificada como a koninginina F.
A B
137
OO
OH
O
HOH
O
R3
R1
R2
2 K. D: R1=OH, R
2=OH, R
3=H
3 K. E: R1=H, R
2=OH, R
3=H
4 K. F: R1=OH, R
2=H, R
3=OH
5 Solerol
4-( 1-hidroxietil) -butan-4-olídeo
(CH2)12CH3
N O
O
OH
H
CH2OH
HOOH
H
H
H
H
H
H
HO
O
R
H
HO
H H
7 Ergosterol: D5
8 Cerevisterol: 5a-OH, 6b-OH 9 Peróxido de ergosterol
HO
H H
O
O
10 Cerebrosida
O
NH2
HO
6a 3-Amino-5-hidróxi-5-vinil-
2-ciclopenten-1-ona
O
HO
OH
O
OH
11 Ácido málico
O
HOO
OH
12 Ácido fumárico
O
HO
OH
OHO
O
OH
13 Ácido cítrico
O
NH2
HO
6b 3-Amino-4-hidróxi-4-vinil-
2-ciclopenten-1-ona
OU
O
OH
H
H
OH
OH
1 Koninginina A ( K. A)
Figura 2 – Substâncias isoladas de Trichoderma koningii.
138
Para as demais moléculas foram realizados os mesmos segmentos de análises até a
elucidação estrutural de todas as substâncias 13 apresentadas na Fig. 2. Seguem abaixo
tabelas dos deslocamentos químicos e multiplicidades observados nos espectros de RMN
de duas dessas konigininas, em comparação com a literatura.
Tabela 1 – Identificação de 1 como koninginina A pelos dados de RMN.
Koninginina A
1
13C
I 1H
II 13C
III 1H
1 72,66 d 3,89, 1H, dd (2,9;11,0) 72,75 d 3,90, 1H, tipo dd (2,8;11,2)
1-OH 3,15, 1H, d (11,0) 3,19, 1H, d (11,2)
2 30,85 t 1,54-1,47, 3H, m, HAa
1,87, 1H, m, HB
30,85 t 1,55-1,48, 3H, m, HAc
1,87, 1H, m, HB
3 25,38 t 1,82, 1H, dddd (3,9;11,8;13,0;13,0), HA
1,96, 1H, m, HB
25,25 t 1,82, 1H m, HA
1,96, 1H, m, HB
4 69,78 d 3,61, 1H, dd (4,8;11,8) 69,91 d 3,62, 1H, dd (4,4;11,9) 5 109,20 s 109,25 s
6 41,43 d 1,58, 1H, dd (2,9;7,3) 41,42 d 1,58, 2H, m, HÁd
7 20,60 t 2,10, 1H, m, HA
1,72, 1H, dd (6,5;13,9), HB
20,60 t 2,09, 1H, dddd (6,9;6,9;13,3;13,9), HA
1,72, 1H, tipo dd (6,5;13,9), HB
8 27,26 t 2,27, 1H, dddd (3,8;6,5;13,3;13,3), HA
1,54-1,47, 3H, m, HBa
27,30 t 2,27, 1H, dddd (3,7;6,5;12,8;13,3), HA
1,55-1,48, 3H, m, HBc
9 79,00 d 4,32, 1H, m 79,14 d 4,33, 1H, tipo d (2,8)
10 79,30 d 4,03, 1H, t (7,0) 79,39 d 4,04, 1H, t (6,9)
11 35,12 t 1,60-1,57, 1H, m, HA
1,54-1,47, 3H, m, HBa
35,23 t 1,58, 2H, m, HÁd
1,55-1,48, 3H, m, HBc
12 25,54 t 1,41-1,26, 8H, mb 25,59 t 1,34-1,26, 8H, me
13 29,08 t 1,41-1,26, 8H, mb 29,09 t 1,34-1,26, 8H, me
14 31,69 t 1,41-1,26, 8H, mb 31,72 t 1,34-1,26, 8H, me
15 22,53 t 1,41-1,26, 8H, mb 22,57 t 1,34-1,26, 8H, me
16 14,02q 0,88, 3H, t (7,0) 14,05q 0,88, 3H, t (6,9) IRMN de 13C a 75 MHz em CDCl3
(Parker et al., 1995a). IIRMN de 1H a 600 MHz em CDCl3 (XU e ZHU, 1995).
IIIDeslocamentos e multiplicidades observadas no PENDANT a 50 MHz em CDCl3. Espectro de RMN de 1H a 400 MHz em CDCl3. Correlações 1H-13C observadas no HSQC. Constantes de acoplamento (Hz) em parêntesis.
Nos ensaios biológicos contra as cepas das bactérias S. aureus, B. subtilis, E. coli,
X. axonopodis e P. aeruginosa e cepas dos fungos C. tropicalis, G. citricata, F.
monoliforme, A. flavus e Colletotritchum sp., as koningininas revelaram poder de inibição
moderado a ausente, sendo mais ativas contra as linhagens de B. subtilis, S. aureus, A.
flavus e X. axonopodis (Tabelas 3 e 4). Estes resultados são coerentes com os citados em
diversas publicações que indicaram serem estas substâncias mais importantes para o
controle de crescimento de plantas. O isolamento das koningininas em T. koningii em boa
quantidade e variedade indica que elas são relevantes para o microrganismo. Esta classe de
substâncias, juntamente com os peptaibois é, certamente, uma das mais promissoras como
marcadora taxonômica para este gênero (Souza, 2005).
139
Tabela 2 - Identificação de 3 como koninginina E pelos dados de RMN.
Koninginina E
3
13C
I 1H
I 13C
II 1H
1 197,3 197,6 s
2 33,8 2,61, 1H, m, HA
2,35, 1H, m, HB
33,4 t 2,63, 1H, ddd (4,8;7,6;16,9), HA
2,33, 1H, ddd (4,8;9,1;16,9), HB
3 29,3 2,45, 1H, m , HA
2,20-1,95, 3H, m, HBa
29,2 t 2,23, 1H, m , HA*
2,05-1,95, 2H, m, HBd
4 66,6 4,40, 1H, t (5,3) 66,0 d 4,43, 1H, t (5,9) 5 169,3 169,2 s
6 111,9 111,5 s
7 17,3 2,20-1,95, 3H, ma 17,6 t 2,47, 1H, tipo ddt (n.m.;5,4;16,9), HA*
2,11, 1H, ddd (5,8.;11,0;16,9), HB
8 22,9 1,75-1,60, 4H, mb 22,8 t 2,05-1,95, 2H, m, HAd
1,60-1,37, 5H, m, HBe
9 80,6 3,81, 1H, ddd (1,9;6,0;10,6) 81,2 d 3,81, 1H, ddd (2,1;6,9;10,9)
10 72,9 3,65, 1H, dd (2,9;7,2) 73,5 d 3,66, 1H, tipo dt (3,2;7,5)
11 32,8 1,75-1,60, 4H, mb 32,7 t 1,60-1,37, 5H, me
12 25,3 1,30, 8H, mc 25,1 t 1,60-1,37, 5H, me
13 29,3 1,30, 8H, mc 29,2 t 1,36-1,29, 6H, mf
14 31,8 1,30, 8H, mc 31,8 t 1,36-1,29, 6H, mf
15 22,6 1,30, 8H, mc 22,6 t 1,36-1,29, 6H, mf
16 14,1 0,89, 3H, t (6,8) 14,1 q 0,89, 3H, t (6,7) IRMN de 13C e 1H a 75/300 MHz em CDCl3
(LIU & WANG, 2001). IIDeslocamentos e multiplicidades
observadas no PENDANT a 50 MHz em CDCl3. Espectro de RMN de 1H a 400 MHz em CDCl3. Correlações
1H-13C observadas no HSQC. Constantes de acoplamento (Hz) em parêntesis.
Tabela 3 – Inibição de fungos e bactérias por koningininas em ensaios de difusão em ágar.
Linhagens
Koningininas
Mistura A D E
Bacillus subtilis +++ ++ ++ ++
Escherichia coli ++ - - - Pseudomonas aeruginosa ++ - - -
Guignardia citricata - - - -
Candida tropicalis - - - -
Amostras a 1 mg/mL. +++ indicam halos com mais de 20 mm de diâmetro. O sinal – indica que não houve inibição.
Tabela 4 – Ensaios de dosagem mínima inibitória de koningininas contra fungos e
bactérias.
Linhagens
Koningininas
Mistura A D E F
Staphylococcus aureus 125 250 125 125 125
Fusarium moniliforme 125 Nd Nd Nd Nd
Aspergillus flavus 62 62 125 31 62
Colletotrichum sp. 125 Nd Nd Nd Nd
Xanthomonas axenopodis 62 250 250 250 62
Valores em µg/mL; (Nd) Não detectado.
140
Analisando os resultados expressos na Tabela 4, pode-se perceber que as
konigininas A, D, E e F apresentaram os melhores desempenhos de inibição da A. flavus,
com destaque para a koninginina E, que inibiu o crescimento do fungo na mais baixa
concentração. Em outra abordagem, Souza et al. (2008) relataram que as konigininas A, E
e F isoladas de T. koningii possuem grande capacidade de inibir atividades indutoras de
edema e enzimáticas do veneno de Bothrops jararacussu (cobra jararacuçu), com destaque
para E e F.
O presente estudo é um exemplo da importância dos fungos endofíticos para a
obtenção de substâncias com potencial farmacológico e biotecnológico e um estímulo para
a continuidade dos estudos de fungos da Amazônia.
Conclusões
O trabalho de investigação de uma linhagem endofítica de T. koningii, isolada da
planta amazônica Strychnos cogens, resultou na caracterização de treze substâncias, com
destaque para as koningininas A, D, E e F.
Essas substâncias apresentaram moderada ou nenhuma atividade antimicrobiana,
com destaque para a koninginina E que inibiu o crescimento de A. flavus na concentração
de 31µg/mL.
Outras possíveis atividades citadas na literatura, como: herbicida, inibitória a
enzimas e antioxidante, reforçam a importância e a necessidade de novos estudos da classe
das koningininas.
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Biodegradação dos corantes azul brilhante de remazol R e vermelho
congo por linhagens de Basidiomycetes
Ferreira A. S.1, Jesus M. A.
2
1Mestrando em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia Universidade Federal do Paraná -
UFPR, 2Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia- INPA. Emails:
[email protected], [email protected]
Resumo
As enzimas lignocelulolíticas produzidas pelos fungos do filo Basidiomycota
possuem a capacidade de degradar, além da lignina, uma série de substâncias tóxicas,
como os resíduos originados pela indústria têxtil. Dentro deste contexto, o presente estudo
teve como objetivo, avaliar o potencial biodegradador dos corantes Azul Brilhante de
Remazol R e Vermelho Congo em meio sólido de onze linhagens de Basidiomycetes
isoladas da região Amazônica, acessadas na Coleção Microbiológica do INPA. È reportada
pela primeira vez a atividade degradativa dos corantes Vermelho Congo e RBBR por
Perenniporia sp., assim como a capacidade adsortiva dos mesmos corantes por Flavodon
flavus e a ação enzimática descolorante de ambos os corantes por Daedalea sp. Com base
nesses resultados, outros estudos são necessários para se avaliar melhor a atividade
lignocelulítica desses fungos, tal como o potencial biorremediador deles, visando
selecionar linhagens com alto potencial degradativo e que possam ser empregados em
processos de biorremediação representando uma alternativa sustentável e de menor custo
em substituição aos tratamentos de efluentes têxteis convencionais.
Palavras Chaves: Basidiomycetes, biodegradação e lignocelulolítico.
Introdução
A avaliação da atividade lignocelulolítica de fungos causadores da podridão branca
permite selecionar espécies com grande potencial enzimático para as mais diversificadas
aplicabilidades comerciais. Na natureza, grande parte destes fungos pertence ao filo
Basidiomycota e exercem um importante papel na ciclagem de nutrientes principalmente
do carbono nos ecossistemas florestais, representando os organismos mais eficientes
degradadores da lignina (Tuomela et al., 2000), por exemplo, os fungos causadores da
podridão branca, capazes de degradar a lignina, a celulose e a hemicelulose de um
substrato lignícola, reduzindo-as em moléculas menores até CO2 e H2O para obtenção de
energia em prol do fungo colonizador. A madeira torna-se esbranquiçada e com resistência
143
comprometida e os vários compostos formados no processo são liberados ao ambiente
(Matheus e Okino, 1998).
O complexo de enzimas inespecífico sintetizado pelos fungos Basidiomycetes
causadores da podridão branca é capaz de degradar compostos químicos clorados que
representam uma ameaça ambiental (D’Souza et al., 1999). Dentre os principais
constituintes desses complexos estão as enzimas da classe das fenoloxidases: Lacases,
Manganês Peroxidase e Lignina Peroxidase (Silva, 2004). Um exemplo desse complexo
enzimático, é o do macrofungos Phanerochaete chrysosporium Burds, descoberto na
década de 80 como um potente degradador de poluentes (Cameron et al., 2000). Com base
nesse estudo, Zouari et al. (2002) verificaram que os Basidiomycetes são capazes de
degradar substâncias como DDT [1,1-bis (4 clorofenol) -2,2,2-tricloetano], lindano
(hexaclorociclohexano), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH), dioxinas, assim
como outros poluentes orgânicos clorados. Atualmente, P. chrysosporium ainda é usado
como fungo padrão nos ensaios de avaliação de atividade lignocelulolítica de macrofungos
e devido a isso, buscam-se novas espécies tropicais de interesse em pesquisas em
aplicabilidade em processos de biorremediação, que consiste na decomposição de
compostos poluentes em substâncias inertes (Jacques et al., 2010).
Considerando a intensa atividade das indústrias de manufatura que gera uma maior
emissão de subprodutos, grande parte destes não são tratados previamente antes de serem
lançados na natureza, constituindo um risco ao ambiente natural (Babá e Rosado, 2009).
Dentre estes, pode-se citar os resíduos da indústria têxtil, em que são usados corantes no
processo de tingimento de tecidos, os quais contêm constituintes químicos de alta
toxicidade com potencial mutagênico, como anéis aromáticos, fenóis e grupos azo (Brown
e Devito, 1993; Bumpus e Aust, 1987). Por serem descartados no meio ambiente, seus
efeitos tóxicos podem persistir por décadas, o que representa uma ameaça ao ecossistema e
à saúde humana (Dellamatrice, 2005). Além disso, a alta concentração de efluentes
coloridos despejados em corpos d’água reduz a penetração de luz solar, diminuindo a
atividade fotossintética e a concentração de oxigênio dissolvido na água, alterando os
ciclos biológicos naturais (Yesilada et al., 2003).
Para minimizar estes efeitos, a legislação ambiental tem sido cada vez mais
rigorosa quanto à remoção de corantes de efluentes industriais (Rosolen et al., 2004). No
entanto, na solução dos problemas, algumas limitações como custo elevado e baixa
eficiência estão presente nos atuais métodos de tratamento de efluentes o que contribue
para a não aplicabilidade de medidas preventivas no controle ambiental. Dessa maneira, o
144
aprimoramento dos métodos já existentes ou desenvolvimento de novas técnicas que sejam
mais eficientes na remoção ou contenção dos rejeitos químicos industriais antes de serem
descartados no meio ambiente são necessários (Gaylarde et al., 2005), assim como na
busca de novos organismos com potencial biodegradador, podendo ser adotado como um
pré-tratamento combinado com o sistema de tratamento convencional (Banat et al., 1996).
Neste contexto, o presente estudo visa selecionar espécies de Basidiomycetes
tropicais com potencial biorremediador. Como objetivo geral: Avaliar o potencial de
biodegradação dos corantes Azul Brilhante de Remazol R e Vermelho Congo em meio
sólido por linhagens de Basidiomycetes. Como objetivos específicos: Comparar a
degradação do corante Azul Brilhante de Remazol R e Vermelho Congo pelas linhagens de
Basidiomycetes testadas com a linhagem testemunha e selecionar as com possível
potencial biorremediador para desses corantes.
Material e Métodos
Um total de 11 linhagens de culturas de Basidiomycetes, listadas na Tabela 1, foi acessado
da Coleção Microbiológica do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (CMINPA).
Tabela 3: Relação das linhagens de macrofungos (Basidiomycetes) testadas no
bioensaio.
Taxa N° de registro
Agaricales CMINPA,1713
Schizopyllaceae
Schizophyllum commune Fr. CMINPA,1720
Polyporales
Polyporaceae CMINPA,1695
Antrodiella sp. CMINPA,1716
Daedalea sp. CMINPA,
Earliella corrugata (Pers.) Murrill CMINPA,1727
Panus sp. CMINPA,1729
Perenniporia sp. CMINPA,1851
Trametes modesta (Kunze ex Fr.) Ryvarden CMINPA,1737
Trametes villosa (Sw.) Kreisel CMINPA,406
Meruliaceae
Flavodon flavus (Klotzsch) Ryvarden CMINPA,1738
145
Reativação das Linhagens e preparo de inóculos padrões
As linhagens dos fungos foram repicadas em meio de cultura Extrato de Ágar Malte em
placas de Petri 5,0x1,5 cm e incubadas a 28 °C até o crescimento micelial completo na
superfície da placa. Lâminas de cada cultura foram preparadas com água destilada para
checar se as características do macrofungo estavam de acordo com as descritas na
literatura. Com auxílio de uma ponteira estéril invertida foram feitos discos miceliais
padrões de 6 mm de diâmetro, que foram transferidos para uma placa de Petri estéril,
mantida a 28 °C na estufa por 3 dias visando obter inóculos viáveis e sem presença de
contaminantes.
Teste Qualitativo de Detecção de Atividade Lignocelulolítica em Meio Sólido
Para o bioensaio adotou-se o método de avaliação de atividade lignocelulolítica descrito
por Borokhov e Rothenburger (2000), utilizando o meio de cultivo Extrato de Ágar Malte
acrescido do corante Azul Brilhante de Remazol R (RBBR) e Vermelho Congo na
concentração de 0,025%. Cada placa de 15 x 1,5 cm foi marcada com pincel dividindo-a
em quatro quadrantes de mesmo tamanho e foi colocado um inóculo padrão do fungo por
quadrante, totalizando quatro amostras sobre o meio de cultura e mantida a 28 °C. A
capacidade de descoloração foi feita medindo-se o diâmetro dos halos de descoloração e do
crescimento da colônia fúngica, retirando-se uma média do diâmetro na vertical e na
horizontal por inóculo e uma média das quatro amostras a cada 3 dias durante 12 dias.
Resultados e Discussão
As linhagens de Antrodiella sp., Daedalea sp., Perenniporia sp., Panus sp. e de
Polypoaraceae cresceram por completo no meio de cultivo contendo RBBR ao sexto dia,
crescimento similar ao da linhagem testemunha T. villosa, enquanto que F. flavus ocupou
toda a placa no 4° dia, com crescimento mais rápido do que o de T. villosa. Por outro lado,
E. corrugata e Agaricales apresentaram um crescimento mais lento em que o primeiro
preencheu a superfície da placa no 9° dia e o segundo no 12° dia de incubação.
Não houve formação do halo de descoloração em torno dos inóculos dos fungos testados,
com exceção os da cepa de Agaricales, que apresentou um halo de degradação com
diâmetro de 0,2 cm no terceiro dia. No entanto, houve um crescimento micelial que atingiu
o halo e ambos cresceram paralelamente até o 12° dia. O mesmo ocorreu com a linhagem
de T. modesta (CMINPA, 1737), que formou um halo de degradação com diâmetro de 0,5
cm em torno da colônia no sexto dia, sendo superado no 9° dia pelo crescimento radial das
146
hifas. Notou-se ainda que a descoloração do RBBR ocorreu até o 12° dia (Figura 1),
concordando com os de Nyanhongo et al. (2002), que observaram a capacidade desta
espécie em degradar o mesmo corante.
Figura 1- Degradação do corante Azul Brilhante de Remazol R pelas linhagens de
Basidiomycetes da Coleção Microbiológica do INPA - CMINPA (reverso da placa de
Petri), no 12° dia. A: 406. B: 1646. C: 1695. D: 1713. E: 1716. F: 1720. G: 1727. H: 1729.
I: 1737. J: 1738 e K: 1851.
As linhagens de Daedalea sp., Polyporaceae, Antrodiella sp., Agaricales, E.
corrugata, Panus sp., F. flavus e Perenniporia sp. descoloriram RBBR restritamente sob o
micélio (Figura 1). Dentre os Basidiomycetes, Perenniporia medulla-panis (Jacq.) Donk.
degradou o corante Azure B. Segundo Arantes (2008), Daedalea flavida Lév. também é
eficiente na produção de lacase. Arora e Sandhut (1985) sugerem que este fungo apresenta
147
tal atividade, que pode estar presente na cepa de Daedalea sp em vista da degradação dos
corantes RBBR e Vermelho Congo neste estudo. Dentre os fungos, S. comune e T. modesta
não foram eficientes na degradação dos corantes testados.
Outro aspecto observado nas placas de Petri trata-se da mudança da coloração das
hifas hialinas para uma tonalidade azulada, que pode ser resultante da absorção do corante
RBBR pelos fungos Polyporaceae, S. commune, T. modesta, F. flavus e Perenniporia sp.
(Figura 1.C, F, G, I, J e K).
Quanto à degradação do Vermelho Congo, o micélio das cepas de Daedalea sp.,
Polyporaceae, Panus sp., Antrodiella sp. e Perenniporia sp. ocuparam toda a placa no 6°
dia de incubação, comparável com o da testemunha T. villosa, sendo que Daedalea sp.
(CMINPA, 1646) degradou totalmente o corante vermelho congo no sexto dia (Figura 2B).
Os demais fungos degradaram totalmente o corante ao final do 12° dia. A atividade
descolorante também ocorreu sob o micélio das linhagens acima citadas. Dentre os fungos,
somente S. commune e E. corrugata não degradaram o corante, nem mesmo sob o micélio,
diferindo dos obtidos por Barbosa e Santiago (2005), que relatam que S. commune degrada
o corante Vermelho Congo e o Remazol Brilhante Laranja. No entanto, neste ensaio
observou-se que houve absorção dos corantes por esses fungos (Figura 2. F e I).
O corante Vermelho Congo também foi absorvido pelas cepas de Antrodiella sp., S.
commune, E. corrugata, Panus sp., F. flavus que apresentaram um crescimento mais
rápido que as demais testadas e a testemunha T. villosa. Além da degradação, notou-se
uma intensa absorção de ambos os corantes (Vermelho congo e RBBR), tanto pelos
inóculos quanto pelas hifas dos fungos (Figura 1J e 2J). A absorção de corantes pelos
fungos é pouco relatada em literatura. Dentre os fungos testados, F. flavus (isolado de
ambiente marinho) em testes realizados por Raghukumar et al. (2000) degradou de 60 a
90% dos corantes sintéticos entre 3 e 10 dias.
No presente ensaio observou ainda a mudança na tonalidade do meio de cultura
com a degradação do corante Vermelho Congo, tornando-o escuro. Provavelmente, a
alteração de cor deve-se à produção de exocompostos sintetizados pela linhagem de T.
modesta (Figura 2.I). Estudos posteriores de caracterização dos biocompostos gerados que
são lançados no meio após a degradação dos corantes se faz necessário no sentido de se
conhecer se estes são tóxicos ou não.
As linhagens de Daedaea sp., Polyporaceae, Agaricales, Antrodiella sp., E.
corrugata, Panus sp. e Perenniporia sp. apresentaram maior potencial de degradar o
RBBR, enquanto que Agaricales, Polyporaceae, Antrodiella sp., Daedaea sp., Panus sp.,
148
T. modesta, Perenniporia sp. em descolorir Vermelho Congo. Dentre os fungos, Daedaea
sp., Polyporaceae, Agaricales, Antrodiella sp., Panus sp. e Perenniporia sp. apresentaram
capacidade degradativa de ambos os corantes corantes RBBR e Vermelho Congo testados.
A restrição da degradação dos corantes RBBR e Vermelho Congo ao micélio, assim
como formação de halo de descoloração dos fungos testados, provavelmente deve estar
diretamente relacionado as estratégias de colonização e degradação dos macrofungos no
meio ambiente relatada por Barrasa et al. (2014). Sabe-se que os fungos de podridão
branca da madeira, principalmente os pertencentes a Polyporales por decompor substratos
de difícil metabolização necessitam secretar suas enzimas próximo ao centro da hifa, de
modo que, a descoloração ocorre no interior do micélio, enquanto os fungos de podridão
branca de liteira, principalmente os Agaricales, por colonizarem substratos mais simples,
como a serapilheira suas são secretadas por hifas jovens que se encontram nas regiões
periféricas do micélio, este fato faz com que produzam os halos de descoloração ao redor
da colônia em presença do corante. A degradação e absorção dos corantes Vermelho
Congo e RBBR pelas cepas Daedaea sp., Polyporaceae, Agaricales, trodiella sp., E.
corrugata, Panus sp., Perenniporia sp., Trametes villosa, S. commune e Flavodon flavus
mostra que a maioria apresenta potencial biorremediador. De modo que mais estudos são
necessários para elucidar melhor a capacidade biodegradativa destes fungos. Estes dados
indicam a possível aplicabilidade de novas espécies de Basidiomycetes no tratamento
sustentável alternativo de efluentes de novas espécies de Basidiomycetes no tratamento
sustentável alternativo de efluentes contaminados por corantes, principalmente do grupo
químico azoico (Melo et al., 2014), reduzindo os custos do processo em substituição aos
tratamentos convencionais.
149
Figura 2 - Degradação do corante Vermelho Congo pelas linhagens de Basidiomycetes da Coleção
Microbiológica do INPA - CMINPA (reverso da placa de Petri), no 12° dia. A: 406. B: 1646. C:
1695. D: 1713. E: 1716. F: 1720. G: 1727. H: 1729. I: 1737. J: 1738 e K: 1851
Conclusões
O crescimento micelial das linhagens de Basidiomycetes difere para cada corante (Azul
Brilhante de Remazol R e Vermelho Congo), assim como a absorção e degradação dos
mesmos.
A maioria dos fungos testados apresenta potencial biorremediador.
Dentre estes estão Daedalea sp., Polyporales, Agaricales, Antrodiella sp., Panus sp. e
Perenniporia sp., que degradaram ambos os corantes comparado com a testemunha
Trametes villosa, e S. commune, Earliela corrugata e Flavodon flavus que absorvem
ambos os corantes em meio sólido.
150
Agradecimentos
À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior - CAPES pelo apoio
financeiro.
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Identificação de fungos de água doce pelo sequenciamento das regiões Its,
isolados de madeira submersa em decomposição de um lago do município
de Iranduba-AM.
Figueiredo T.F.1, Souza V.C.
2, Cortez A.C.A.
3, Souza J.V.B.de
3
1Bolsista PIBIC/CNPq - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia;
2 Pesquisador, Instituto
Leônidas e Maria Deane - FIOCRUZ - Amazônia, 3 Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia. Emails: [email protected], [email protected], [email protected],
Resumo
No ecossistema aquático, os fungos exercem vários papéis como o de decomposição de
materiais orgânicos, parasitária, predadora e mutualista. No bioma Amazônico, atuam na
decomposição do material orgânico que se deposita no fundo dos rios promovendo a
clivagem dessas matérias, suprindo toda uma cadeia alimentar a partir dos substratos
gerados por essa ação. Embora representem grande importância, estudos científicos que
relatem a biodiversidade desses microrganismos presentes no ecossistema de água doce
amazônico são escassos. Dessa forma, observando-se a necessidade de preencher essa
lacuna, este trabalho teve como objetivo, realizar a identificação de fungos de água doce
provenientes de um lago do Município de Iranduba, através da aplicação da metodologia
de sequenciamento das regiões Its do rDNA de 11 amostras que se encontravam
preservadas sob refrigeração em geladeira há mais de um ano. Obteve-se o sequenciamento
satisfatório de quatro amostras, onde Spinulospora pucciophila apresentou 90% de
similaridade com o fungo Rigidopurus crocatus, Dothideomycetes 1 apresentou 99% de
similaridade com o fungo Exophiala oligosperma, Mitosporico 1 apresentou 100% de
similaridade com a classe Calosphaeriales, e Sordariomycetes 4 apresentou 97% de
similaridade com Aquaticola hogkongensis. A aplicação da metodologia de
sequenciamento das regiões Its do rDNA demonstrou-se satisfatória na identificação de
microrganismos pouco conhecidos.
Palavras-chave: Decomposição, Biodiversidade, Amazônia, Dothideomycetes,
Mitosporico
Introdução
Os fungos são seres aclorofilados e heterotróficos, ou seja, incapazes de produzir os
nutrientes necessários para a sua alimentação, vivendo dessa forma como saprófitos ou
parasitas; são eucariontes e possuem em sua membrana celular, um esterol encontrado
exclusivamente neles, o ergosterol. São divididos pela diferença apresentada em sua
morfologia em duas formas distintas: unicelulares (leveduras) e pluricelulares (bolores)
(Oliveira, 2012). Atualmente, estima-se que haja no mundo aproximadamente 1,5 milhões
153
de espécies desses microrganismos (Hawksworth, 2001). Estão presentes nos mais diversos
ecossistemas e podem ser facilmente isolados dos mais diversos substratos (Oliveira,
2012).
A partir de 1971, o Instituto de Micologia das Comunidades Britânicas, responsável
pela edição do Dicionário de Fungos de Ainsworth e Bisby, elevou os fungos à categoria
de Reino, devido ao seu peculiar modo de alimentação através de absorção e as relações
filogenéticas que possuem entre si (Whittaker, 1969). Até então, a identificação das
espécies era realizada através da análise de suas características macro e micromorfológicas
(taxonomia clássica). Porém, com o advento das técnicas moleculares, mais
especificamente da sequência de multilocus, os cientistas melhoraram a classificação
filogenética desses microrganismos, analisando e avaliando as relações existentes entre
suas famílias e baseando-se nas similaridades das suas sequências gênicas. De acordo com
a classificação mais moderna, são identificados oito Filos, sendo alguns deles ainda
praticamente desconhecidos por falta de material científico que os descreva (ICB, 2012).
No ecossistema aquático, os fungos exercem vários papeis, como o de
decomposição de materiais orgânicos, parasitária, predadora e mutualista (Shearer et al.,
2007). No bioma amazônico, atuam na decomposição do material orgânico que se deposita
no fundo dos rios, promovendo a clivagem dessas matérias, suprindo toda uma cadeia
alimentar a partir dos substratos gerados por essa ação. Além disso, auxiliam na limpeza
das águas dos rios e lagos (Pusch et al., 1998). Embora representem grande importância,
são escassos os estudos científicos que relatem a biodiversidade desses microrganismos
presentes no ecossistema de água doce amazônico (Galliza, 2011).
No Brasil, poucos trabalhos foram realizados investigando-se a diversidade de
fungos em ambientes aquáticos (Silveira, 2012). Um estudo realizado por Galliza (2011)
explorou a diversidade de fungos em água doce no sudeste do país. Especificamente na
Amazônia, apenas um trabalho foi realizado, porém, diz respeito à Amazônia peruana, e
foi realizado por Shearer et al. (2015). Isso demonstra a pobreza de informações a respeito
dos microrganismos existentes nos ecossistemas aquáticos amazônicos. Essa ausência de
informações acarreta em atraso científico, perda de material biológico em função da
biopirataria, perda do desenvolvimento de possíveis novos compostos para o combate de
doenças, além do desconhecimento do real valor e papel dos fungos nesse habitat
(Drummond et al., 2009).
Na Amazônia existem três tipos de águas: pretas, brancas e claras, e cada uma delas
possui uma microbiota típica (Silva, 2013). A coleta de material biológico fúngico nesses
154
ambientes foi realizada através de coleta randômica de pedaços de madeiras dos fundos
dos rios e lagos. Em seguida o material foi incubado, e após sete dias, as estruturas
fúngicas existentes foram observadas por meio de microscopia, visando sua identificação;
as características fenotípicas apresentadas pelos microrganismos encontrados foram
submetidas a chaves taxonômicas e seu DNA investigado através da técnica de
sequenciamento genético (Barbosa, 2011).
Trabalhos com esse desenho de investigação são importantes, uma vez que a
sociedade tem invadido e destruído o meio ambiente, ocasionando perdas da diversidade.
Dessa forma, a necessidade de se conhecer as espécies de fungos que habitam as águas
doces da Amazônia aponta para um potencial de descoberta científica ainda não explorada,
e abre portas para a busca de novos compostos químicos e farmacológicos que poderão
auxiliar no combate de inúmeras doenças.
Em vista disso, a proposta deste trabalho foi realizar a identificação de fungos de
água doce provenientes de um lago do Município de Iranduba, através da aplicação da
metodologia de sequenciamento das regiões Its do rDNA.
Material e Métodos
Através de expedições de coleta realizadas em um lago de águas negras localizado no
Km 23 da estrada Manuel Urbano – Iranduba, foram coletadas 40 amostras de madeiras
que estavam depositadas no fundo do mesmo. São pedaços de paus e pequenos gravetos
em decomposição (Figura 1). Esse material foi trazido ao Laboratório de Micologia onde
foi incubado por sete dias à temperatura ambiente. Após, através de microscopia, foram
observadas as estruturas reprodutivas desses microrganismos (Figura 2). Os mesmos foram
isolados para cultivo em placas de Petri contendo meio Agar Batata Dextrose (BDA) para a
produção de biomassa.
Figura 1- Material vegetal coletado do fundo do lago em Iranduba
155
Figura 2- Estruturas reprodutivas isoladas utilizadas para semeadura
Foram selecionados 11 isolados e semeados em triplicata em tubos de ensaio contendo
meio Batata Dextrose Ágar (BDA), incubando-os à temperatura ambiente, aguardando-se
sua maturação durante cerca de quatro meses. Em seguida, as amostras foram submetidas
ao processo de extração de DNA através da metodologia descrita por Ferrer et al. (2009),
que consiste em:
Extração do DNA: Os micélios foram transferidos para microtubos de 2 mL. A seguir,
adicionou-se ao tubo 500 µL de tampão de lise (contendo SDS a 0,5%, NaCl a 1,4%,
EDTA a 0,73% e 20 mL de Tris-HCl para 100 mL de água destilada) e 5 µL de β-
mercaptoetanol. Os microtubos foram submetidos a aquecimento de 65 ºC por 1 hora, com
a finalidade de romper as estruturas celulares. Foram adicionados 500 µL de uma solução
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (v:v:v 25:24:1). O material foi agitado em vortex até a
obtenção de uma suspensão homogênea. Em seguida, essa suspensão foi centrifugada
(14.000 rpm, 15 minutos) e o sobrenadante foi retirado e transferido para um novo
microtubo de 1,5 mL. Adicionou-se Isopropanol ao sobrenadante em volume igual; a
mistura foi homogenizada e incubada a -20 oC overnight, para precipitação do DNA. O
DNA precipitado foi centrifugado (14.000 rpm por 15 minutos), lavado duas vezes
seguidas com etanol 70% e ressuspendido em 100 µL de água-bidestilada estéril.
Quantificação do DNA: A concentração de DNA foi estimada em espectrofotômetro Gene
Quant pro 127 V; a absorbância medida foi a de 230 nm a 260 nm. Foram realizadas duas
quantificações do DNA puro. Em seguida, as amostras foram submetidas ao processo de
Reação de PCR, de acordo com o protocolo descrito por White et al. (1990):
Reação de PCR: Teve um volume final de 50 µL consistindo de Tampão de PCR (10 mM
Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl), 1,5 mM MgCl2, 0,5 µM dos primers ITS-1 (5'-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS-4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), 200
µM dNTPs, 1,5U ampli-tag DNA polimerase e 100 ng do DNA fúngico. As amostras
foram levadas ao termociclador onde: após desnaturação inicial de 94 o
C por 5 min, foram
realizados 35 ciclos de desnaturação do DNA 94oC por 1 min, anelamento a 55
oC por 1
156
min e extensão a 72 oC por 2 min e por fim foi realizada uma extensão final a 72
oC por 10
minutos. Os produtos de DNA foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%,
corados com brometo de etídio a 0,5µg.mL-1
, visualizados em transiluminador e
fotografados. Por fim, as reações amplificadas foram purificadas seguindo a descrição de
Dunn e Blattner (1987):
Purificação do DNA amplificado: Os produtos de amplificação foram purificados
utilizando-se uma solução de polietilenoglicol-PEG (10g de polietilenoglicol 800, 7,3 g de
NaCl em 35 mL de água). Volumes iguais das soluções de PEG e de amplicons foram
transferidos para microtubo (1,5 mL), homogeinizados e incubados (37 ºC por 15 minutos).
Em seguida, a mistura foi centrifugada (15 minutos a 6.000 g), o sobrenadante foi
descartado, o precipitado foi lavado duas vezes com etanol a 70%, seco em estufa de
secagem até a evaporação completa de todo o etanol. Em seguida, os produtos foram
ressuspensos em água-bidestilada estéril em volume igual ao da PCR e receberam agitação
de 10 segundos. Foram armazenados à temperatura de - 20 o
C overnight para melhor
eluição do DNA.
Edição e alinhamento das sequências: Os fragmentos de DNA foram sequenciados nas
direções senso e antissenso no Laboratório de Genômica do Instituto Leônidas e Maria
Deane - ILMD/Fiocruz, Manaus. A edição dos eletroferogramas gerados foi realizada com
o auxílio do programa BioEdit v7.2.5. Sequências de referência correspondentes a região
genômica do Its foram comparadas com outras regiões depositadas no GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) pela ferramenta BLAST. As sequências que
mostraram boa qualidade foram submetidas à análise filogenética através dos softwares:
MUSCLE, T-Coffee, ClustalW e ProbCons, encotrados no site www.phylogeny.fr.
Resultados e Discussão
Das 11 amostras que tiveram seu DNA sequenciado, quatro apresentaram
sequências satisfatórias para a análise filogenética (Figura 3).
157
Figura 3- Árvore filogenética das amostras sequenciadas e suas similaridades.
Os representantes do filo Basidiomycota estão divididos em três classes/sub-filos:
Agaricomycotina, Pucciniomycotina e Ustilaginomycotina. São considerados cosmopolitas
que vivem predominantemente em ambiente terrestre, mas podem ocorrer em ambiente
aquático. Conhecidos popularmente como cogumelos, têm como característica principal a
presença de basídio contendo basidiósporos. São predominantemente miceliais, podendo
também ser unicelulares ou pseudomiceliais. A reprodução é sexuada e ou assexuada. São
sapróbios, porém, alguns são parasitas de animais, algas, vegetais e de outros fungos
(Hibbett et al., 2007). O pareamento das sequências genicas da amostra Spinulospora
pucciophila com o fungo Rigidopurus crocatus apresentou 90% de similaridade e seu
posicionamento na árvore filogenética demonstra a alta semelhança entre essas espécies.
A classe Dothideomycetes, filo Ascomycota, apresenta o ascomata na forma de
cleistotécio ou peritécio com ascos bitunicados ou fissitunidados. Podem ser patógenos de
vegetais, endófitos ou sapróbios. Crescem em restos de madeira e folhas em decomposição
(Spatafora et al., 2006). As espécies de água doce correspondem a aproximadamente 30%
158
dos Ascomycetes aquáticos e pertencem ao táxon Pleosporomycetidae, principalmente nas
ordens Pleosporales e Jahnulales (Shearer et al., 2007). Os Dothideomycetes mais descritos
em ambientes de água doce são Jahnula e Mamillisphaeria (Vijaykrishna et al., 2006;
Zhang et al., 2006). No presente trabalho, a amostra Dothideomycete 1 apresentou 99% de
similaridade com o fungo Exophiala oligosperma, e sua localização na árvore filogenética
indica alta similaridade entre os microrganismos.
Fungos Anamorfos ou Mitospóricos têm como característica principal, a
reprodução assexuada, onde ocorre a produção de conídios. Podem ter a forma filamentosa
ou leveduriforme, onde a reprodução é por brotamento e formação de pseudomicélio. São
sapróbios, parasitas e mutualistas. Neste grupo encontram-se os Hifomicetos aquáticos, os
quais apresentam os conídios hidrodinâmicos ou tetraradiados, classificados como fungos
ingoldianos e aeroquáticos, são cosmopolitas, mas predominando em ambientes lóticos
(Shearer et al., 2007; Barlocher, 2009; Jones e Pang, 2012). No presente trabalho, a
amostra Mitosporico 1 apresentou 100% de similaridade com a classe Calosphaeriales e
sua posição na árvore indica alta semelhança entre esses microrganismos.
A classe Sordariomycetes do filo Ascomycota é a mais importante entre os fungos
de água doce. Na atual classificação, encontram-se três subclasses a Hypocreomycetidae,
Sordariomycetidae e Xylariomycetidae. Apresentam o ascoma em forma de peritécio ou
com menos frequência, cleistotécio; os ascos são inoperculados e unitunicados ou
prototunicados. A presença ou ausência de um anel apical (amilóide ou não amilóide) é
uma característica importante na classificação. Esses são organismos cosmopolitas e atuam
em quase todos os ecossistemas como sapróbios, agentes patogênicos, endofíticos e
parasitas, de artrópodes, mamíferos e fungos (Zhang et al., 2006; Donga et al., 2009). Os
gêneros, pertencentes aos Sordariomycetes, exclusivos de água doce são Aquaticola,
Cataractispora, Pseudoproboscispora, Rivulicola e Torrentispora (Vijaykrishna et al.,
2006; Zhang et al., 2006). No presente trabalho, a amostra Sordariomycete 4 apresentou
97% de similaridade com Aquaticola hogkongensis, e sua localização na árvore
filogenética indica alta similaridade entre os microrganismos.
Conclusão
Através do sequenciamento das regiões Its do rDNA das 11 amostras, obteve-se
quatro sequenciamentos satisfatórios, possibilitando um alinhamento ao nível de gênero e
159
classe, demonstrando dessa forma, que a técnica é satisfatória para encontrar correlação
genética de microrganismos pouco conhecidos.
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Análise nutricional e microbiológica de resíduos de abacaxi Ananas sp.
Galúcio V.A.1, Teixeira N.S.
2, Prestes A.G.
2, Nunes A.S.
1, Sales-Campos C.
3
1
Doutoranda em Biotecnologia – Universidade Federal do Amazonas, 2
Bacharel em Zootecnia –
Universidade Federal do Amazonas, 3
Doutora em Biotecnologia – Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia. Emails: [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
O Brasil é um país de grande atividade agrícola, sendo o terceiro maior produtor de frutos
tropicais. O processo de industrialização nesta área gera resíduos, causando sérios
problemas, como a poluição ambiental, porém o seu aproveitamento é uma forma para
gerar produtos de valor agregado, como na alimentação animal, por serem fontes valiosas
de proteínas, fibras, vitaminas, minerais e compostos antioxidantes, como é o caso dos
resíduos de abacaxi (Ananas sp.), fruta bastante consumida tanto in natura quanto
industrializada. Além do valor nutricional, é importante observar as características
microbiológicas que indicam se as condições sanitárias destes resíduos são satisfatórias.
Sendo assim, o presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a composição
nutricional e microbiológica dos resíduos de abacaxi (casca e coroa), visando sua
utilização como suplemento na alimentação animal. As análises nutricionais realizadas
quanto ao teor de umidade, matéria seca, MM, NT, PB, EE, FDN, FDA, pH e SST,
demonstraram que importantes características nutricionais da fruta in natura são mantidas
nas partes residuais. Nas análises microbiológicas, realizadas através da Técnica de Tubos
Múltiplos, observou-se a presença de colônias características do grupo coliformes. As
análises bromatológicas realizadas demonstraram a viabilidade do aproveitamento destes
resíduos para a alimentação animal.
Palavras-chave: Alimentação animal; Análise microbiológica; Aproveitamento de
resíduos; Valor nutricional.
Introdução
O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo e líder na produção de
frutas tropicais, chegando a aproximadamente 44 milhões de toneladas de frutos por ano
(IBGE 2012). Por ser um país de grande atividade agrícola, é um dos que mais produzem
resíduos agroindustriais, que podem representar sérios problemas, como a poluição
ambiental gerada pelas indústrias, sendo que o destino correto para os mesmos ainda não é
feito de maneira ecologicamente correta (Silva et al., 2013).
Uma das alternativas para a utilização dos resíduos agroindustriais é seu uso na
alimentação animal, por serem fontes valiosas de proteínas, fibras, vitaminas, minerais e
162
compostos antioxidantes, importantes para um bom desempenho das funções fisiológicas
humanas ou animais (Kim et al., 2007, Pieniz et al. 2009). Além do valor nutricional, é
importante observar as características microbiológicas que indicam se as condições
sanitárias destes resíduos são satisfatórias, principalmente quanto à presença de
microrganismos patogênicos como coliformes termotolerantes, o que pode ser facilmente
avaliado através de análises microbiológicas.
Segundo Martins et al. (2000), na criação de ruminantes, a alimentação é
responsável por grande parte dos custos (60 a 70%), principalmente em regiões de difícil
acesso como a Amazônia. Portanto, é de fundamental importância conhecer as
características dos alimentos e seu balanceamento na formulação de rações, as quais devem
ser formuladas para suprir as necessidades dos animais, explorando sua máxima
capacidade digestiva.
Sendo assim, as pesquisas que visam alimentos alternativos vêm ganhando atenção,
especialmente a utilização de resíduos que seriam descartados na natureza e que
apresentam valor nutricional e propriedades semelhantes a outras partes da fruta, como é o
caso do abacaxi, Ananas sp., utilizado tanto para o consumo in natura quanto na
industrialização, em diferentes formas: pedaços em calda, suco, pedaços cristalizados,
geleias, licor, vinho, vinagre e aguardente (Franco, 1989).
A composição química do abacaxi varia muito de acordo com o local e clima onde
é produzido, possuindo elevado valor energético, devido à sua alta composição de açúcares
e valor nutritivo pela presença de sais minerais (cálcio, fósforo, magnésio, potássio, sódio,
cobre e iodo) e de vitaminas, principalmente ácido ascórbico, tiamina, riboflavina e
Niacina (Franco, 1989).
Conhecendo-se a qualidade nutritiva dos subprodutos gerados e os baixos custos
dos mesmos, pode-se determinar a forma de inclusão em dietas para ruminantes. Sendo
assim, o presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a composição
nutricional e microbiológica dos resíduos de abacaxi (casca e coroa), visando sua
utilização como suplemento na alimentação de ruminantes.
Material e Métodos
Os resíduos de abacaxi (casca e coroa) foram doados pela Fábrica de Polpa de
Frutas de Parintins Parintins Polpas e levados ao Laboratório de Nutrição Animal do
163
ICSEZ – Parintins/AM para serem triturados, expostos ao sol para secagem, sendo
posteriormente moídos e armazenados para análises bromatológicas descritas abaixo.
O teor de umidade foi determinado pelo método de dessecação de cada amostra até
massa constante, em estufa modelo 315 SE a 105°C (AOAC, 2012). A umidade foi
expressa em %, pela fórmula abaixo e a massa seca foi calculada como sendo MS% = 100
– U.
U% = M1 – M2 x 100
M1
U = Percentual de umidade; M1 = Massa inicial da amostra; M2 = Massa final da amostra
As análises de cinzas foram feitas com adição de 1,0g das amostras em cadinhos,
em triplicata, posteriormente submetidos em forno mufla a 550°C por 4 horas. As cinzas
foram pesadas e os resultados expressos em porcentagem (AOAC, 2012)
Para análise do nitrogênio total aplicou-se o método de Kjeldahl, envolvendo três
etapas: digestão, destilação e titulação. As amostras foram digeridas com ácido sulfúrico
até conversão em sulfato de amônia. Após este processo, o sulfato de amônia foi destilado
em destilador de nitrogênio Marcone-MA036 em meio básico (NaOH 60%), liberando gás
amônia o qual foi recolhido em ácido bórico formando borato de amônia. O borato de
amônia foi titulado com ácido clorídrico a 0,1N (Silva e Queiroz 2002). Os resultados
foram expressos em % de nitrogênio utilizando-se a fórmula abaixo.
Nitrogênio % = (V x N x 0,014 / M) x 100
V = Volume em mL de HCL gasto na titulação; N = 0,1; M = Massa da amostra (g)
Para a conversão do nitrogênio em proteína foi utilizado à fórmula: N% x 6,25,
considerando-se que 100g de proteína contêm, em média, 16% de nitrogênio.
O extrato etéreo foi realizado através da adição de 1g de amostra em cartuchos tipo
Soxhlet o qual passou por um processo de extração contínua em conjunto Soxhlet por um
período de 4 a 5 horas em temperatura de 30 a 60°C, tendo o éter de petróleo como
reagente extrator. A gordura extraída foi calculada pela diferença de peso (AOAC 2012).
Os teores de fibra em detergente neutro e em detergente ácido (FDN e FDA) foram
determinados através da adição de 0,350g da amostra em saquinho (TNT gramatura
164
100g/m2) o qual passou por um processo de hidratação por 30 minutos, seguida pela adição
da solução de ureia e alfa amilase. Essa mistura permaneceu em Banho Maria a
temperatura de 90°C por 15 minutos. Após esse processo, foi realizada a digestão em
detergente neutro para FDN e digestão em detergente ácido para FDA. As amostras foram
então lavadas com água deionizada e os saquinhos passaram por um processo de secagem
em estufa de circulação de ar forçada a 105°C por 4 horas (Silva e Queiroz, 2002).
Para a medição do pH foram adicionadas 10 gramas das amostras em 90 mL de
água destilada, em triplicata (AOAC, 2012). As suspensões foram submetidas à agitação
por cinco minutos e, após sedimentação, foi realizada a leitura em potenciômetro digital
portátil KASVI – K390014P.
Para medir o índice da solução de açúcar contido nas amostras (sólidos solúveis
totais) foi utilizada a refratometria. Com o uso de refratômetro portátil Instrutherm RTB-
300 foram medidos os índices de refração da solução de açúcar contido nas amostras, onde
10 gramas destes foram homogeneizados em 100 mL de água destilada e os resultados
expressos em grau BRIX como sólidos solúveis (AOAC, 2012).
Foi realizada a contagem padrão de Coliformes Totais e microrganismos
Termotolerantes, através da Técnica de Tubos Múltiplos e os resultados dados em
Números Mais Prováveis (NMP) e Unidade Formadora de Colônia (UFC), segundo a
AOAC (2012). As análises foram realizadas de acordo com a legislação determinada pela
ANVISA sobre padrões microbiológicos – RDC nº12 (Brasil 2001).
Inicialmente, como padrão para amostras sólidas, foram realizadas duas diluições,
sendo a primeira 1:50 (10 gramas de amostra em 490 mL de água destilada) e a segunda
1:10 (25 mL da primeira diluição em 225 mL de água peptonada a 0,1%). A partir desta
segunda diluição, considerada 5.10-2
, foram preparadas diluições decimais sucessivas, pela
transferência de 1 mL da diluição anterior em 9 mL de diluente água peptonada a 0,1%, até
10-4
. Essas diluições foram utilizadas para a determinação dos microrganismos em meios
de cultura vertidos em tubos de ensaio com tubos de Durhan invertidos em seu interior.
Foram utilizados os seguintes meios de cultura, Caldo Lauryl e Caldo EC para o
crescimento de coliformes totais e Escherichia coli e Caldo SC (Selenito de Cistina) para
Salmonella sp. Após a inoculação, os tubos foram encubados em estufa bacteriológica a
35ºC por 3 dias, a leitura foi realizada a cada 24 horas para a observação de produção de
gás e turvação do meio. Após este período, alíquotas de 100 µL retiradas dos tubos
contendo Caldo SC foram adicionadas em placas de Petri, em triplicata, contendo os meios
TSI (Triple Sugar Iron Agar) e BVB (Agar Verde Brilhante modificado), incubadas a 35ºC
165
por 3 dias para a confirmação da presença de Salmonella sp. A identificação das colônias
foi feita de acordo com as características morfológicas descritas pelo fabricante de cada
meio específico, baseado na cor, aspecto e alteração do meio pelo crescimento de colônias
características.
Os dados das análises foram avaliados segundo a Instrução Normativa nº 7, de 5 de
abril de 1999, da Secretaria de Desenvolvimento Rural do Ministério da Agricultura e do
Abastecimento (Brasil 1999).
Resultados e Discussão
Os dados das análises nutricionais constam na Tabela 01, sendo relevantes para
avaliar características fundamentais para o aproveitamento dos resíduos de abacaxi
coletados, transformando-os em produtos de valor agregado para suplementação da ração
animal.
Tabela 1: Dados das análises nutricionais de resíduos de abacaxi (casca e coroa).
Resíduo Característica físico química dos resíduos
U MS MM NT PB EE FDN FDA pH SST
Abacaxi
(Casca) 89,62 10,38 3,47 1,13 7,08 1,56 51,41 21,71 4,1 2,9
Abacaxi
(Coroa) 83,42 16,57 4,98 1,78 11,15 1,68 58,49 30,50 5,6 1,3
U (%) – umidade; MS (%) – matéria seca; MM (%) – matéria mineral; NT (%) – nitrogênio total; PB (%) –
proteína bruta; EE (%) – extrato etéreo; FDN (%) – fibra em detergente neutro; FDA (%) – fibra em
detergente ácido; pH – potencial hidrogeniônico; SST (ºBrix) – sólidos solúveis totais.
As análises realizadas demonstraram que importantes características das frutas in
natura são mantidas nos resíduos após seu processamento (Soares 2004, Gondim 2005).
Verifica-se que a umidade obtida nos resíduos, casca (89,62%) e coroa (83,42%)
aproximam-se do valor de teor de água da fruta in natura, que é de 86,46% (Costa et al.,
2007). Após processo de secagem, os teores de matéria seca obtidos nos resíduos casca e
coroa foram de 10,38% e 16,57%, respectivamente. A umidade é uma característica
importante demonstrada na coloração e sabor das frutas (Souza et al., 2008). Estes
resultados indicam a influência do clima da região Amazônica na umidade das frutas como
um alto valor presente também nos resíduos, fator este destacado por Abud e Naraim
(2009), como sendo de grande importância, uma vez que a umidade presente no material
interfere na preservação do alimento.
166
De acordo com Bortolatto e Lora (2008), os teores de cinzas variam em função da
localidade da plantação e da composição do solo onde crescem. Os valores das cinzas
foram de 3,47% e 4,98% para casca e coroa, respectivamente. Costa et al. (2007)
encontraram valores de cinzas de 2,15% para o pó do resíduo de abacaxi desidratado e
2,03% na casca do abacaxi. É importante observar que a composição das cinzas
corresponde à quantidade de substâncias minerais presentes nos alimentos, são
consideradas como medida geral de qualidade e frequentemente é utilizada como critério
na identificação dos alimentos (Chaves et al. 2004).
Em relação ao conteúdo de nitrogênio, observaram-se valores de 1,13% e 1,78%
para casca e coroa, respectivamente (Tabela 1). Os teores de proteína acompanharam os
mesmos valores de nitrogênio já que a proteína é determinada pela quantidade de N% em
cada amostra multiplicada pelo fator 6,25.
A casca do abacaxi apresentou teor de PB de 7,08% e 1,56% de EE; enquanto que a
coroa apresentou 11,15% de PB e 1,68% de EE, segundo Van Soest (1994) as condições
mínimas para satisfazer o bom funcionamento do rúmen varia de 6 a 8% de proteína bruta.
Com relação aos alimentos convencionais, o valor de PB dos resíduos de abacaxi
aproximou-se dos valores encontrados para o milho com 7,88% de PB e polpa cítrica com
6,77% (Rostagno et al. 2011) esses resíduos quando devidamente balanceados podem ser
uma alternativa prática e econômica para as épocas de escassez de forragem.
Os valores de FDN e FDA da casca do abacaxi foram de 51,41% e 21,71%,
respectivamente, e para coroa de abacaxi estão entre 58,49% e 30,50%, respectivamente.
Segundo Figueiredo (1996) os alimentos com percentuais de FDN acima de 35% garantem
teor normal de gordura do leite e, segundo as recomendações do NRC (1989) para
alimentação de vacas em lactação o valor exigido é no mínimo de 21% de FDA. Segundo
Van Soest (1994), elevados níveis de FDA das forragens estão associados à menor
digestibilidade do alimento. Alimentos fibrosos são importantes na manutenção da taxa de
passagem no trato gastrointestinal, mas que em maiores concentrações pode limitar o
consumo e comprometer o desempenho dos animais, podendo ser necessário algum tipo de
tratamento químico ou biológico dependendo do processo de aproveitamento empregado
(Alencar 2005, Sales-Campos 2008).
O pH encontrado foi de 4,1 e 5,6 para casca e coroa, respectivamente. A acidez do
abacaxi é devida, principalmente, aos ácidos cítrico e málico, que contribuem,
respectivamente, com 80 e 20% da acidez total (Dull 1971). Segundo Costa et al. (2007), a
acidez é um parâmetro importante na apreciação do estado de conservação de um produto
167
alimentício, sendo este um fator de fundamental importância na limitação dos diferentes
microrganismos capazes de se desenvolver no produto (Hoffmann 2001).
Os valores de sólidos solúveis totais expressos em °Brix encontrados nas amostras
dos resíduos de abacaxi foram de 2,9 para a casca e 1,3 para a coroa. O alto suprimento de
água diminui a percentagem de açúcarese estão de acordo com Sales-Campos (2008) que
evidenciou pouca ou ausência desses compostos, indicando baixo conteúdo de açúcares.
Foram realizadas análises microbiológicas com intuito de verificar fatores que
pudessem potencializar a possibilidade de contaminação, demonstrando as condições
higiênico-sanitárias dos resíduos após secagem e trituração, avaliando-se assim a
necessidade de se aplicar técnicas mais eficientes de desinfecção antes de seu
aproveitamento, pois alterações microbiológicas são indesejáveis em qualquer tipo de
alimento bem como a presença de patógenos.
Os resultados das análises microbiológicas (Tabela 2) demonstraram características
preocupantes, pois apresentaram resultados positivos elevados para coliformes nas cascas e
nas coroas dos frutos de abacaxi.
Tabela 2: Avaliação microbiológica com pesquisa de Coliformes a 35ºC (Totais e
Termotolerantes) e Salmonella sp. em amostras de resíduos de Abacaxi (casca e coroa).
Amostra Microrganismo
Coliformes (NMP/g) Salmonella sp. em 25g
Abacaxi (Casca) 150 +
Abacaxi (Coroa) >1.100 +
Os testes quantitativos em placas de Petri contendo os meios TSI e BVB seletivos
para a detecção de Salmonella sp. foram positivos, demonstrados pela presença de
crescimento de colônias características nas amostras de abacaxi (casca e coroa). Entretanto,
dependendo do uso a que se destinam tais resíduos, como para a produção de ração animal
em condição asséptica, recomenda se o processo de esterilização do resíduo.
Os resultados foram avaliados a partir do critério de presença e ausência de
crescimento microbiano, de acordo com a legislação vigente para polpa de frutas, tendo em
vista que não existe uma legislação específica para análise de resíduos, mas levou-se em
consideração a característica patogênica dessas bactérias, principalmente quando se busca
o aproveitamento para a nutrição animal.
168
Conclusões
As análises realizadas demonstraram a viabilidade do aproveitamento dos resíduos
de abacaxi para a suplementação na alimentação animal.
As análises nutricionais confirmaram que muitas características dos resíduos de
abacaxi in natura são semelhantes as das partes residuais após processamento, importantes
na nutrição animal, podendo o resíduo ser utilizado como suplemento na dieta dos
ruminantes, de modo a reduzir os custos com alimentação.
Os resíduos de abacaxi secos apresentaram boas características (acidez, pH e
umidade), permitindo o armazenamento destes por longos períodos, em condições
adequadas.
As análises microbiológicas evidenciaram a necessidade de se empregar técnicas de
desinfecção antes do processo de aproveitamento, tais como a autoclavagem a 121 ºC,
capaz de eliminar microrganismos mais resistentes.
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Caracterização parcial de protease alcalina produzida por Aspergillus
pulverulentus em resíduo lignocelulósico
Gomes, D.M.D.
1, Nascimento, A.P.F.
1, Silva, L.P.
1, Amaral, P.A.S.
1, Machado, A.R.G.
2,
Martim, S.R.2, Alecrim, M.M.
2, Teixeira, M.F.S.
3
1Graduando em Ciências Biológicas na Universidade Federal do Amazonas,
2Mestre em Ciências
do Alimentos na Universidade Federal do Amazonas, 3Professor Associado na Universidade
Federal do Amazonas. E-mail: [email protected], [email protected],
Resumo
As proteases são enzimas de origem vegetal, animal e microbiana que apresentam ampla
aplicabilidade industrial. Este trabalho teve por objetivo caracterizar as proteases de A.
pulverulentus obtidas por fermentação em matriz sólida. A. pulverulentus foi cultivado em
exocarpo de cupuaçu e semente de açaí suplementados com farelo de arroz, amido e
peptona, na proporção de 9:1, pH 6,0. O bioprocesso foi conduzido a 30ºC por sete dias.
As enzimas foram extraídas com água destilada esterilizada, sob agitação (200 rpm) por 15
minutos e o extrato bruto foi recuperado por filtração a vácuo. A atividade proteolítica foi
determinada utilizando azocaseína como substrato. As proteases desse fungo apresentaram
maiores atividades sob pH 8 e temperatura de 60°C e, os íons Cu2+
e Zn2+
reduziram a
atividade das peptidases, enquanto os íons Ca2+
estimularam a atividade. A. pulverulentus
produz proteases com potencial para aplicação na indústria de detergentes.
Palavras-chave: peptidases, fermentação, atividade proteolítica.
Introdução
Proteases, peptidases ou proteinases são enzimas produzidas por bactérias, fungos,
animais e vegetais que podem ser usadas no processamento de alimentos, couro, produtos
farmacêuticos, na recuperação de prata de filmes de raios-x, tratamento de resíduos
industriais e como aditivos detergentes. Entre essas enzimas que diferem uma da outra pela
especificidade do substrato, sítio ativo e mecanismo de ação, as de origem microbianas são
as mais importantes e constituem aproximadamente 70% do mercado total de enzimas
comercializadas (Rodarde et al., 2011; Srilakshmi et al., 2014).
Entre os produtores de proteases, os fungos são fonte potencial, por sua
susceptibilidade à manipulação genética, pela diversidade bioquímica ampla, alta
172
produtividade e por serem facilmente recuperáveis do meio de fermentação. Além desses
fatores, a maioria das espécies tem comprovado potencial econômico e capacidade de
sintetizar e excretar biocompostos em larga escala (Neustadt et al., 2009).
Várias espécies de fungos filamentosos têm sido exploradas em processos
industriais para a produção de metabolitos, em especial enzimas que são usadas na
indústria de alimentos, farmacêutica e como aditivo de detergentes. Dentre estes, os
Aspergillus são geralmente considerados como seguros, condição que favorece o uso de
espécies para a produção de proteases ácidas, neutras e alcalinas (Tichota et al., 2010;
Cavalcante-Silva, 2015; Escaramboni1 et al., 2013; Castro e Sato, 2014).
Aspergillus pulverulentus está classificado no grupo niger, representado por
espécies de ocorrência mundial e que podem ser isolados de diversos substratos, solo,
grãos, produtos lácteos e forragens, várias frutas, legumes, feijões, nozes, tecidos e carnes.
As espécies não toxigênicas desse grupo são utilizadas na indústria de fermentação para
produzir várias enzimas e ácidos orgânicos (Jurjević et al., 2012).
Entre os processos usados para a produção de proteases, a fermentação no estado
sólido vem sendo um método mais adequado, porque os substratos sólidos oferecem
condições semelhantes ao habitat natural dos fungos, proporcionando assim, crescimento
adequado e a secreção de uma variedade de enzimas extracelulares. Também é um
processo simples, de baixo custo, que favorece rendimentos elevados e concentrações das
enzimas e o uso de resíduos agrícolas de baixo valor econômico e amplamente disponível
ambientalmente. No Brasil, esse processo desperta interesse nas áreas que disponibilizam
quantidades de resíduos agroindustriais, por exemplo, os resíduos do processamento de
soja, trigo, algodão, laranja e de frutos (Chutmanop et al., 2008; Castro et al., 2014). O
objetivo desse estudo foi caracterizar parcialmente as proteases de A. pulverulentus obtidas
por fermentação no estado sólido.
Material e Métodos
Para a produção de enzimas foi selecionado A. pulverulentus DPUA 478 do acervo da
Coleção de Culturas DPUA/UFAM. A cultura estoque foi preparada em meio CYA
(Czapek-Dox + extrato de levedura), utilizando cultivos em CYA, mantidos sob
refrigeração (4 oC). A obtenção da colônia e do microcultivo em meio de cultura seletivo
foi realizado conforme Klich (2002).
173
Para a fermentação em estado sólido (FES), o inóculo foi preparado com água
destilada na cultura estoque, suspensão celular (concentração 10-1
). Dessa suspensão
celular foi retirado volume equivalente a 2% (p/v) do volume de substrato e semeado nos
resíduos lignocelulósicos, em tubo de ensaio.
A fermentação foi realizada utilizando resíduos de cupuaçu (exocarpo) e de açaí
(semente) suplementados com farelo de arroz, amido e peptona, na proporção de 9:1. O
substrato foi umedecido com uma solução salina (g/L) contendo fosfato monobásico (0,1),
sulfato de magnésio (0,5), cloreto de sódio (0,5) e sulfato ferroso (0,004). O pH foi
ajustado para 6,0, e o substrato foi distribuído em tubos de ensaio (200x25mm). Os
substratos acondicionados em tubo de ensaio foram esterilizados a 121ºC por 15 minutos.
A fermentação foi realizada a 30ºC por sete dias. As enzimas foram extraídas por
adição de água destilada esterilizada ao substrato fermentado e submetidos à agitação de
200 rpm por 15 minutos. O extrato bruto foi separado por filtração a vácuo usando papel
filtro Whatman® nº 1.
Para a determinação da atividade enzimática proteolítica, foram adicionados 250
µL de solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1M, pH 7,2, em 150 µL de
extrato bruto. Os tubos reação foram incubados a 25ºC por 60 minutos em câmara escura.
A reação foi interrompida adicionando-se 1,2 mL de ácido tricloroacético 10% (p/v) e em
seguida procedeu-se a centrifugação a 10.000 rpm por 10 minutos. Em seguida, foram
transferidos 0,8 mL do sobrenadante para tubos de ensaio contendo 1,4 mL de hidróxido de
sódio 1M. A leitura das amostras foi realizada a 440 nm. Como branco, foi utilizada a
solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1M, pH 7,2. Todas as análises
foram realizadas em triplicatas (Tavares et al., 2012 e Alecrim et al., 2015).
Para avaliar o efeito do pH e temperatura na atividade proteolítica, o extrato bruto
com maior atividade proteolítica foi selecionado para avaliação do efeito do pH na
atividade das proteases. Nestes experimentos, as proteases de Aspergillus foram testadas
em diferentes faixas de pH (5,0 – 10,00), a 25ºC por 60 minutos. E os tampões utilizados
foram Citrato Fosfato 0,2M (pH 5,0 e 6,0), Tris-HCl 0,2M (pH 7,0 e 8,0) e Glicina-NaOH
(pH 9,0 e 10,0). A atividade das enzimas também foi avaliada sob diferentes temperaturas
(30 oC a 80
oC) (Alecrim et al. 2015). Todos os experimentos foram realizados em
triplicata e os dados foram apresentados como valor médio.
174
Para verificar a estabilidade das enzimas na presença de íons, o extrato bruto foi
incubado na presença da solução de sulfato ferroso (FeSO4), sulfato de magnésio (MgSO4),
sulfato de cobre (CuSO4), sulfato de zinco (ZnSO4), sulfato de manganês (MnSO4), cloreto
de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl) e cloreto de cálcio (CaCl2), na concentração
final de 10 mM. Os experimentos foram realizados em temperatura ótima de atividade das
proteases por 30 minutos. Como controle foi utilizada mistura reacional sem a adição dos
íons metálicos e, em seguida, a atividade proteolítica e os resultados foram expressos em
média (Alecrim et al. 2015).
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e ao teste de
Tukey (p < 0,05), utilizando o software Minitab® versão 17.0. Com o auxílio do mesmo
programa, foram construídos gráficos para melhor visualização dos resultados.
Resultados e Discussão
No estudo realizado por Silva et al. (2016), foi verificado que A. pulverulentus
produziu quantidade significativa de proteases quando cultivado em exocarpo de cupuaçu
suplementado com peptona. Para investigar a importância industrial dessas enzimas, o
extrato bruto obtido por esses autores foi analisado visando à caracterização parcial das
proteases desse fungo quanto ao efeito do pH, temperatura e de íons metálicos.
Os resultados mostraram que as proteases de A. pulverulentus foram ativas na faixa
de pH avaliada, nas condições de análise. Contudo, a maior atividade das proteases foi
observada no pH 8,0 (Figura 1), característica que indica a presença de peptidases
alcalinas no extrato bruto da espécie investigada. Resultados semelhantes foram reportados
em diversos estudos para A. terreus (Chellapandi, 2010), A. flavipes (Ortiz, 2016). Sharma
e De (2011) relataram que as proteases de A. tamarii apresentaram máxima atividade
catalítica na faixa de pH entre 8,0 e 9,0. As peptidases alcalinas de origem microbiana são
enzimas utilizadas principalmente em formulações de detergentes para facilitar a limpeza
de manchas proteicas, tais como sangue, leite, ovos e carne (Mushtaq et al., 2014).
175
Figura 1 . Influência do pH na atividade proteolítica de A. pulverulentus
As proteases de A. pulverulentus apresentaram maiores atividades na temperatura
de 60 °C (Figura 2). As melhores temperaturas para a atividade de proteases fúngicas, com
poucas exceções, varia entre 35 e 50 °C (Nirmal et al., 2011). Nesta mesma temperatura
(60°C) foi verificada as melhores atividades de A. oryzae e A. tamarii, conforme relatado
por Yin et al. (2013) e Sharma e De (2011), respectivamente. Outros estudos reportaram
máxima atividade de proteases neutras de espécies de Aspergillus em temperaturas
distintas das apresentadas neste estudo. Abidi et al. (2014) relataram que as peptidases de
A. niger apresentaram significativa atividade catalítica a 50 °C. Ahmed et al. (2011)
verificaram máxima atividade proteolítica de A. tamarii na temperatura de 45 °C.
O efeito de íons na atividade proteolítica de A. pulverulentus está demonstrado na
tabela 1. Pela análise estatística, observa-se que não houve efeito significativo dos íons
testados quando comparados ao tratamento controle, exceto quando ocorreu a adição de
Cu2+
, Zn2+
e Ca2+
. Ao adicionar-se Ca2+
, a atividade enzimática foi aumentada em 31%; em
contrapartida, a adição de Cu2+
e Zn2+
reduziu a atividade das enzimas de A. pulverulentus
em 43% e 36%, respectivamente.
Diversos autores relatam o aumento da atividade de proteases alcalinas de
Aspergillus na presença de Ca2+
(Yin et al., 2013; Anitha e Palanivelu, 2013; Niyonzima e
More, 2015). Niyonzima e More (2015) também afirmam que os íons de cálcio são
importantes na manutenção do sítio ativo e termoestabilidade de enzimas proteolíticas de
Aspergillus.
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
5 6 7 8 9 10A
tivid
ad
e P
rote
olí
tica (
U/m
L)
pH
176
Figura 2 - Influência da temperatura na atividade proteolítica de A. pulverulentus
Registros na literatura mostram que os cátions de zinco (Zn2+
) são capazes de
reduzir a atividade de peptidase de Aspergillus de 15% até 23% (Anitha e Palanivelu,
2013; Castro e Sato, 2014). Quanto à atividade inibitória do cobre, outros estudos também
relatam esse efeito sobre proteases de A. niger e A. oryzae (Siala et al., 2012; Yin et al.,
2013).
Tabela 1 - Efeito de íons na atividade proteolítica de A. pulverulentus
Íons (10 mM) Atividade relativa (%)
Controle 100 ± 0 b,c
Cu2+
57,37 ± 1,76 e
Zn2+
64,48 ± 2,78 d,e
K+ 83,05 ± 3,36
b,c,d
Ca2+
131,14 ± 1,15 a
Mg2+
103,27 ± 2,00 b
Fe2+
79,23 ± 2,34 c,d,e
Mn2+
103,27 ± 1,15 b
Na+ 105,46 ± 8,06
b
Obs.:Médias com letras iguais nas colunas não diferem significativamente pelo teste Tukey a 5%.
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
30 40 50 60 70 80
Ati
vid
ad
e E
nzi
máti
ca (
U/m
L)
Temperatura (°C)
177
Conclusões
Aspergillus pulverulentus DPUA 478 produz protease alcalina com as maiores
atividades catalíticas em pH 8,0 e temperatura de 60°C.
As proteases desse fungo se mostraram sensíveis a íons Cu2+
e Zn2+
e estimuladas
pela adição de íons Ca2+
.
De acordo com as características de atividade enzimática, as peptidases produzidas
por A. pulverulentus apresentam potencial para aplicação na indústria de detergentes.
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1, Oliveira D.A.S.
2, Santos J.F.S.
2, Magalhães F.F.C.
2. Souza D.H.
2, Couceiro D.M.
3
1Pesquisador, COTEI - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. Emails: [email protected];
2Coloborador, COTEI- Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia-INPA.
3 Bolsista Apoio Técnico, COTEI – Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Resumo
As árvores desempenham um papel fundamental no bem estar das comunidades
urbanas. No entanto, elas estão sujeitas aos macrofungos lignocelulolíticos que
podem causar danos em árvores vivas e até mesmo leva-las á morte. O trabalho teve
como objetivo identificar as espécies de macrofungos (Aphyllophorales) da área
arborizada da cidade de Manaus e verificar as zonas urbanas com maiores
ocorrências destes fungos, com o intuito de ampliar o conhecimento da diversidade
macrofungica urbana. Os basidiomas foram coletados de árvores vivas e mortas ou
tombadas, troncos de árvores cortados ou quebrados e galhos nas copas e caídos nas
ruas, avenidas, praças e parques das vias públicas de 22 bairros das zonas (Centro-
Sul, Centro-Oeste, Leste, Norte, Oeste e Sul). A identificação das espécies foi
realizada através da análise de características macroscópicas e microscópicas. Um
total de 560 macrofungos foi coletado. Destes, 116 espécimes estão distribuídos na
zona urbana Oeste, 198 Centro-Sul, 137 Sul, 26 Centro-Oeste, 43 Leste, e 40 na
Norte. Auricularia cornea, A. polytricha Earliella scabrosa Hexágona hydnoides,
Perenniporia compacta, Plebiopsis roumeguerii, Phanerochaete sórdida, G.
australe, Fomitiporia punctata, P. gilvus e Flavodon flavus são as espécies de maior
ocorrência nas seis zonas da cidade Manaus.
Palavras-chave: vegetação urbana, cidade de Manaus, fungos fitopatogenicos
Introdução
As áreas arborizadas públicas, como as dos parques e praças são alternativas para a
relação do homem com a natureza, pois a vegetação urbana de acordo com (Pivetta, 2002)
contribue para a recreação e lazer estimulando a sociabilidade urbana, tendo em vista que
as árvores desempenham um papel fundamental na qualidade de vida das comunidades,
além da valorização ornamental dos espaços urbanos (Azevedo et al., 2011), amenizam a
poluição sonora; reduzem o impacto da água de chuva e seu escorrimento superficial,
diminuem a temperatura, pois, absorvem os raios solares e refrescam o ambiente pela
grande quantidade de água transpirada pelas folhas; melhoram a qualidade do ar (Pivetta,
2002 e Brazolin, 2010). No entanto, as árvores estão sujeitas a danos biológicos, e dentre
181
estes, os macrofungos que causam maior dano em árvores vivas, pois favorecem a
degradação da madeira e que podem levar à morte das árvores (Brazolin et al., 2010).
Estudos relacionados com a ocorrência de macrofungos em áreas urbanas são poucos
realizados para o Brasil, com ressalva os de Campos et al., 2006; Silva e Gibertoni, 2006;
Figueirêdo, 2008; Freitas et al., 2009; Leal e Gugliota, 2008; Brazolin et al., 2010 e
Quevedo et al., 2010. Esses autores relatam que Ganodermataceae, Hymenochaetaceae e
Polyporaceae apresentam maior diversidade de espécies em árvores urbanas. Dentre os
macrofungos associados ao apodrecimento do lenho que podem causar a morte das árvores
destacam-se muitos representantes destas famílias (Tovar et al., 2007). Com intuito de
ampliar o conhecimento da diversidade de macrofungos (Basidiomycetes,
Aphyllophorales), foi realizado um levantamento destes em árvores na área urbana da
cidade de Manaus, a fim de conhecer a diversidade de Aphyllophorales, visando obter
informações que forneçam subsídios para o manejo adequado para a preservação da
vegetação urbana.
Material e Métodos
A cidade de Manaus está localizada no centro da maior floresta tropical do mundo,
sua superfície total é de 377 Km², com população estimada em 2,1 milhões de habitantes
(IBGE, 2016). Apresenta clima tropical úmido, com temperatura média anual de 26,5 °C e
ocorre alternância entre duas estações, sendo uma estação úmida chuvosa, que ocorre entre
os meses de novembro a maio e outra seca entre junho e outubro (Velloso et al., 2002).
O levantamento dos macrofungos foi realizado entre 2015 e 2016 nas principais
avenidas, praças e parques das vias públicas de 28 bairros (Tabela 1) de seis zonas,
(Centro-Sul, Centro-Oeste, Leste, Norte, Oeste e Sul) (Figura 1). Os basidiocarpos foram
coletados de árvores vivas e mortas ou tombadas, troncos de árvores cortados, quebrados
ou tombados, e galhos caídos. Os fungos foram secos em ambiente natural ou com ar
condicionado a 20o
C. Os dados de coleta de cada fungo, tais como: coletor, tipo de
substrato e local foram informatizados de acordo com a planilha do programa BRAHMS
(Botanical Research and Herbarium Management System) adotado pelo Herbário do
INPA. As exsicatas dos macrofungos foram depositadas no Herbário-INPA.
As características macroscópicas dos espécimes como a forma, tamanho, cor e
consistência do basidiocarpo, assim como as micro estruturas como hifas (generativas,
esqueléticas ou de conexão); elementos estéreis (cistídios, gleocistídios, dentre outras; e
182
estruturas reprodutivas (basídios e basidiósporos) foram analisadas. Os corantes KOH 3%,
vermelho congo e o reagente Melzer foram usados para visualizar as microestruturas e
verificar as reações dextrinoídes e amiloídes dos esporos, hifas e cistídios conforme
descrito por Ryvarden e Johansen (1980).
A identificação das espécies foi realizada com auxílio das chaves taxonômicas
elaboradas por Eriksson e Ryvarden (1975; 1976), Eriksson et al. (1978; 1981; 1984),
Boidin et al. (1985), Hallenberg e Eriksson (1985), Jung (1987), Hjortstam et al. (1987,
1988), Stalpers (1996), Ryvarden (1991), Nunez e Ryvarden (1995), Ryvarden e Johansen
(1980), Lowy (1951, 1952, 1968, 1971), Montoya-Alvarez et al. (2011), Jesus (1988) e
Sierra (2008). Foram acessados os sites Index Fungorum, Flora do Brasil e Mycobank que
disponibilizam as descrições e distribuição das espécies.
Tabela 4. Relação das zonas e bairros da área urbana de Manaus em que os macrofungos
foram coletados de diversos substratos lignoceluloliticos.
Zona Bairro
Centro-Sul Adrianópolis, Chapada, Aleixo, Flores, Parque 10, São Geraldo
Sul Cachoeirinha, Educandos, Distrito Industrial I, Japiim, Centro,
Petrópolis e Raiz.
Norte Cidade Nova, Cidade de Deus, Nova Cidade, Novo Aleixo,
Novo e Israel.
Oeste Compensa, Ponta Negra, São Jorge e Tarumã.
Centro- Oeste Alvorada, Com Pedro e Planalto.
Leste Armando Mendes, Coroado, Distrito Industrial II e Jorge
Teixeira.
Resultados e Discussão
Um total de 560 espécimes de Aphylophorales foi coletado nas seis zonas da cidade
de Manaus, deste, 116 registrados na zona Oeste, 198 Centro-Sul e 137 Sul, 26 Centro-
Oeste, 43 Leste, e 40 na Norte. Destes macrofungos, 142 espécimes pertencem a
Polyporaceae, 134 a Hymenochaetaceae, seguida de Corticiaceae com 95,
Ganodermataceae 82, e Auriculariaceae com 67, Merulliaceae com 21, e as demais
famílias com menos de 9 espécimes (Tabela 2).
183
Tabela 2. Relação dos macrofungos (Basidiomycetes) que ocorrem em diferentes zonas
urbanas da cidade de Manaus.
Táxon
Zona
Total Centro-
Oeste
Centro-
Sul Leste Norte Oeste Sul
AURICULAREACEAE
Auricularia auricula-judae (Bull.) Schröt. - 2 - 2 - - 4
A. cornea Ehrenb. - 5 1 4 7 3 20
A. delicata (Mont.) Henn. - 2 - 2 2 2 8
A. fuscosuccinea (Mont.) Henn. - 2 - - - - 2
A. mesentrica (Dicks.) Pers. - 7 - - 1 1 9
A. polytricha (Mont.) Sacc. - 14 1 3 3 3 24
CORTICIACEAE
Aleurodiscus sp. - - - - - 1 1
Botryobasidium obtusisporum J.Erikss. - - - 1 - - 1
B. pruinatum (Bres.) J. Erikss. - 1 - - - - 1
Cystostereum artocreas (Berk. & M.A. Curtis
: Cooke) Hallenb. & Ryv. - - 1 - - - 1
Gloeocystidiellum convolvens (P. Karst.) Donk - 1 - - - - 1
G. luridum (Bres.) Boidin - - - - - 1 1
Hyphoderma incrustatissimum Bodin & Gilles - 1 - - 3 1 5
H. incrustatum K.H. Larss. - - - - 3 - 3
H. nemorale K.H. Larss. 1 - - - 1 - 2
H. neopuberum Sheng H. Wu - - - - 1 2 3
H. orphanellum (Bourdot & Galzin) Donk - 1 - - - - 1
H. praetermissum (P. Karst.) J.Erikss. & A. Strid - - - - 1 - 1
H. subsphaerosporum Boidin & Gilles - 1 1 3 6 2 13
Hyphodontia abieticola (Bourdot & Galzin)
J.Erikss. - - - - - 1 1
H. aspera (Fr.) J. Erikss. - 1 - - - - 1
H. crustosa (Pers.) J. Erikss. - - - - - 1 1
Leucogyrophana sp. - - - - - 1 1
Peniophora incarnata (Pers.) P. Karst. - - 1 - 1 - 2
P. lilacea Bourdot & Galzin - 1 - - - - 1
P. lycii (Pers.) Höhn. & Litsch. - - - - - 1 1
P. pubera (Fr.) Sacc. - - - - - 1 1
P. quercina (Pers.) Cooke - - 1 - - - 1
Peniophora sp. - 2 - 1 2 4 9
Phanerochaete calotricha (P. Karst.) J.Erikss & Ryv. - 1 1 - - 1 3
P. galactites (Bourdot & Galzin) J. Erikss. &
Ryv. - - - - - 1 1
P. himalayensis (Dhingra) Sheng H. Wu - - - - - 1 1
P. laevis (Fr.) J. Erikss. & Ryv. - - - 1 1 - 2
P. sordida (P. Karst.) J. Erikss. & Ryv. 2 11 2 2 6 5 28
Plebiopsis roumeguerii (Bres.) Jülich & Stalpers - - - - 2 3 5
Resinicium bicolor (Alb. & Schwein.) Parmasto 1 - - - - - 1
Tubulicrinis borealis J. Erikss. - 1 - - - - 1
FOMITOPSIDACEAE
Antrodia serialis (Fr.) Donk. 1 - - - - - 1
A. ramentacea (Berk:Br) Donk. - 1 - - - - 1
184
Cont. tabela 2. Relação dos macrofungos (Basidiomycetes) que ocorrem em diferentes zonas
urbanas da cidade de Manaus.
Táxon Zona
Total Centro-
Oeste
Centro-
Sul Leste Norte Oeste Sul
GANODERMATACEAE
Ganoderma amazonense (Fr.) Pat. - 4 3 - 1 - 8
G. applanatum (Pers.) Pat. 1 2 - - 1 - 4
G. australe (Fr.) Pat. 2 11 3 1 2 - 19
G. chalceum (Cooke) Steyaert - 5 - - - - 5
G. citriporum Ryv. & Iturr. - 2 1 - - - 3
G. curtisii (Berk.) Murrill - - 1 - - - 1
G. resinaceum Boud. 2 5 4 - 1 1 13
Ganoderma spp. - 12 6 - 7 4 29
GLOEPHYLLACEAE
Gloeophyllum abietinum (Bull.:. Fr.) Karst. - - 1 - - - 1
HYMENOCHAETACEAE
Cyclomyces setiporus (Berk.) Pat. - 1 1 - - - 2
Fomitiporella umbrinella (Bres.) Murrill - - - - - 3 3
Fomitiporia expansa Decock & Amalfi - - 1 - - - 1
F. maxonii Murrill 2 2 1 2 3 5 15
F. punctata (P. Karst.) Murrill - 8 2 3 10 18 41
Fulvifomes cesatii (Bres.) Y.C. Dai - 2 - 3 1 1 7
F. kanehirae (Yasuda) Y.C. Dai - 1 - - - - 1
F. melleoporus (Murrill) Baltazar & Gibertoni - - - - - 1 1
F. nilgheriensis (Mont.) Bondartseva & S. Herrera - - - - 1 - 1
Hymenochaete adusta (Lév.) Pat. - - - - 1 - 1
H. aspera Berk. & M.A. Curtis - - 1 - - - 1
H. damicornis (Link) Lév. - - - - - 1 1
H. rubiginosa (Dicks.) Lév. - - - - - 3 3
H. sordida Speg. - - - - - 1 1
Inonotus costaricensis Ryv. - - - - - 1 1
I. micantissimus (Rick) Rajchenb. - - - - - 1 1
I. pruinosus Bondartsev - - - 1 - - 1
I. venezuelicus Ryv. - - - - - 1 1
Phellinus apiahynus (Speg.) Rajchenb. & J.E.
Wright - - - - - 1 1
P. appositus (Lév.) Pat. - - - - - 1 1
P. calcitratus (Berk. & M.A. Curtis) Ryv. - - - - - 1 1
P. callimorphus (Lév.) Ryv. - 1 - - - - 1
P. caryophylleus (Cooke) Ryv. - - - - - 1 1
P. chryseus (Lév.) Ryv. - - - - - 1 1
P. contiguus (Pers.) Pat. - - - - - 1 1
P. extensus (Lév.) Pat. - 1 - - - 1 2
P. gilvus (Schwein.) Pat. 2 9 1 - 2 10 24
P. glaucescens (Petch) Ryv. - - - - - 2 2
P. linteus (Berk. & M.A. Curtis) Teng 1 5 - - - - 6
P. luctuosus (Ces.) Ryv. - - - - - 1 1
P. rhabarbarinus (Berk.) G. Cunn. - - - - - 1 1
P. shaferi (Murrill) Ryv. - - - - - 1 1
P. undulatus (Murrill) Ryv. - - 1 - - - 1
185
Cont. tabela 2. Relação dos macrofungos (Basidiomycetes) que ocorrem em diferentes zonas
urbanas da cidade de Manaus.
Táxon Zona
Total Centro-
Oeste
Centro-
Sul Leste Norte Oeste Sul
Phylloporia fruticum (Berk. & M.A. Curtis)
Ryv. 1 1 - - - - 2
P. spathulata (Hook.) Ryv. - - - 1 - - 1
MERIPILACEAE
Rigidoporus biokoensis (Lloyd.) Ryv. - 1 - - - - 1
R. lineatus (Pers.) Ryv. - 2 - - 3 2 7
Meripilus giganteus (Pers.) P. Karst. - - - - 1 - 1
MERULLIACEAE
Flavodon flavus (Kl.). Ryv. - 4 3 3 6 5 21
POLYPORACEAE
Coriolopsis byrsina (Mont.) Ryv. - 8 - - 1 - 9
C. caperata (Berk.) Murrill. - 2 - - - - 2
C. gallica (Fr) Ryv. - 2 - - - - 2
C. polyzona (Pers) Ryv. - 3 - - 1 - 4
Earliella scabrosa (Pers.) Gilb. & Ryv. 5 15 2 - 17 6 45
Fomes fasciatus (Sw.) Cooke. 1 - - - - - 1
Hexagonia hydnoides (Sw.) M. Fidalgo 1 23 - 2 2 12 40
H. variegata Berk. - 1 - - - 2 3
H. tenuis (Hook.) Fr. 1 1 - - - 1 3
Lenzites elegans (Spreng.) Fr. - - - - 1 - 1
Megasporoporia cavernulosa (Berk.). Ryv. 1 - - - 4 - 5
M. setulosa (Henn.) Rajch. 1 - - 4 - - 5
Polyporus brumalis Pers.: Fr. - 1 - - - - 1
P. tenuiculus (P. Beav.) Fr. - 1 - - 1 2 4
Polyporus sp. - - - - - 1 1
Perinniporia compacta (Over.) Ryv. & Gilb. - 2 - - - - 2
Pycnoporus sanguineus (L.) Murril - 3 - - 1 2 6
Trametes elegans (Spreng.) Fr. - - - - 1 - 1
T. hirsuta (Fr.) Pilát. - - 1 - - - 1
T. leonina (Kl.) Pat. - 2 1 - - - 3
T. villosa (Sw.). Kreisel. - - - - 1 - 1
T. versicolor (L.) Lloyd. - - - 1 - 1 2
SCHIZOPHYLLACEAE
Schizophyllum commune Fr. - - - - 5 2 7
Total 26 198 43 40 116 137 560
Dentre estas famílias, Hymenochaetaceae está representada com o maior numero de
espécies (35), Corticiaceae 32, Polyporaceae 23 e Ganodermataceae por 8, enquanto que
Fomitopsidaceae, Gloeophyllaceae, Meripilaceae, Merulliaceae e Schizophyllaceae
apresentam até três espécies (Tabela 2).
186
Nas Polyporaceae Fr. ex Corda (1839) estão agregados os basidiomas contendo
himenio com tubo vertical terminando em poros; alguns apresentam lamelas e outros,
tubos alongados, destacando-se entre as familias listadas por estar amplamente distribuída
com 142 espécimes nas seis zonas da cidade (Figura 1). E. scabrosa (Fig. 2 D) é de maior
ocorrência com 45 espécimes, sendo que a maioria ocorre nas copas de muitas árvores bem
altas, localizadas nas zonas Centro Sul e Oeste. Também, H. hydnoides (Fig.2A), coletada
em arvores das zonas Centro Sul e Sul, sendo que muitas delas estavam mortas, porém em
pé. Este macrofungo fitopatogênico ataca árvores, principalmente aquelas sujeitas á
poluição urbana (Leite, 2010) e geralmente crescem quando os galhos já estão mortos.
Outro fungo lignocelulolitico saprofita, C. byrsina (Fig. 2 F) ocorre com nove espécimes,
principalmente em troncos caídos ou troncos de árvores cortadas e galhos caídos.
Os representantes de Hymenochaetaceae Donk (1948) são saprófitas ou parasitas de
muitas espécies de plantas. São causadores de podridão branca (Ryvarden, 1991). Seus
basidiocarpos variam de amarelo para marrom escuro, alguns com setas. Esses fungos
estão distribuídos nas seis zonas da cidade de Manaus, 60 na zona Sul, 31 Centro Sul e 19
na Oeste (Figura 1). Phellinus, representado com maior número de espécies, P. appositus,
P. calcitratus, P. caryophylleus, P. extensus, P. laucescens, P. linteus, P. luctuosus, P.
shaferi, P. undulatus e P. gilvus (Tabela 2). Fomitiporia com maior número de espécimes,
sendo que 41 e 15 são de F. punctata e P. maxonii, respectivamente.
Figura 1. Numero de espécimes de cada família de Basidiomycetes distribuído em cada
zona urbana da cidade de Manaus.
Centro-oesteCentro-sul
LesteNorte
OesteSul
0
10
20
30
40
50
60
Zona
Familia
Num
ero
de e
specím
es
187
Ambas as espécies são as maiores causadoras de doenças em essências florestais (Cabrera
et al.. 2014). P. gilva, com 24 espécimes distribuidos nas zonas, Sul e Centro Sul (10 e 9),
respectivamente. Muitas árvores atacadas por Phellinus e, Fomitiporia, principalmente
aquelas das avenidas Rodrigo Otavio, São Jorge, Joaquim Nabuco e da Ponta Negra,
estavam mortas, ou foram retiradas das vias públicas durante o levantamento dos
macrofungos, pela Secretaria Municipal de Meio Ambiente e Sustentabilidade (SEMMAS)
ou por outros meios.
Corticiaceae Herter apresenta basidiomas ressupinados, efuso-reflexos,
cupuliformes-discoides ou dimidiados a estipitados. Foram coletados 95 espécimes, sendo
27 para cada zona Oeste e Sul, e 22 para Zona Centro Sul (Figura 1), com destaque para
Hyphoderma com sete espécies, dentre estas H. subsphaerosporum (Fig. 2 E) com
distribuição de 13 espécimes. Phanerochaete está representado por Phanerochaete.
calotricha (03), P. galactites (01), P. himalayensis (01), P. laevis (02) e P. sordida (28)
(Tabela 2).
A maioria dos macrofungos corticoides ocorre em árvores vivas, no entanto estes
fungos não podem ser considerados fitopatogênicos, tendo em vista que há poucos estudos
sobre a atuação deles como fitopatógenos, com rara exceção de Phanerochaete
chrysosporium Burds que de acordo com o site Mycobank é fitopatogênico. Na literatura
há relato de Corticiaceae em galhos e galhos finos que caem das árvores e permanecem no
solo em ambiente florestal. Já no ambiente urbano, a maioria dos galhos e galhos finos
caídos é recolhida das vias pela limpeza pública, ou é descartada por vários meios. E neste
caso, houve registro somente daqueles fungos atacando os galhos da copa. É importante
ressaltar que apesar de Corticiaceae não ser registrada em áreas urbanas, na cidade de
Manaus ocorrem 35 espécies, muitas delas com um único espécime (Tabela 2).
Ganodermataceae (Donk) Donk 1997 é caracterizada basicamente pelos esporos
truncados e ornamentados (Ryvarden, 1997). São associados ao apodrecimento do cerne
das árvores vivas, por exemplo, Ganoderma Karsten (1881), que causa a morte de diversas
árvores em ambiente urbano, atacando inicialmente a parte basal do tronco até a copa
(Tovar e Garza, 2013). Um total de 82 espécimes de Ganodermataceae ocorre na área
urbana, com maior distribuição nas zonas Centro Sul e Leste (41e 18) para cada (Figura 1).
G. australe (Fr.) Pat., considerado parasita e saprófito, ocorre com 19 espécimes, destes, 11
foram coletados na arborização da zona Centro Sul. Número semelhante de espécimes
deste fungo foi registrado para a mesma zona por Cruz (2012). As árvores com ataque de
Ganoderma observadas por esse autor não foram encontradas, em alguns casos, restaram
188
os troncos cortados e, geralmente com os basidiomas. Já neste estudo, muitas das arvores
com Ganoderma encontravam se em estádio avançado de degradação ou mortas ou
tombadas, sendo que muitas delas estavam infestadas com outros macrofungos
considerados fitopatogenicos, principalmente H. hydnoides e ou Auricularia.
Dentre as famílias listadas na Tabela 2, Auriculariaceae Fr. difere das demais com
relação ao basidiocarpo, o qual é gelatinoso com coloração variando entre marrom e verde
musgo, e os basídios com septos longitudinais (Teixeira, 1945). Um total de 67 espécimes
de Auricularia ocorre nas zonas urbanas, (32) na zona Centro Sul e (13) Oeste (Figura 1).
A maioria destes (24) é de A. polytricha (Tabela 2). É relatada como saprófita ou
fracamente parasita, causando podridão branca. No entanto, arbustos apresentaram
basidiomas nos galhos altos, principalmente os das mortas, como a que se encontrava em
frente o Condomínio Residencial Ephigênio Salles na Avenida Rodrigo Otavio. Muitas das
arvores atacadas por A. polytricha também estavam com H. hydnoides e S. commune (Fig.
2 A e B).
Nas zonas urbanas existe também um número significativo de espécies de outras
famílias de macrofungos (Basidiomycetes) considerados fitopatogênicos e ou causadores
de podridão do lenho ou degradadores de madeira, por exemplo S. commune
(Schizophyllaceae) um oportunista e patógeno (Freitas et al., 2009), que infectou a parte
superior dos arbustos da Avenida Rodrigo Otavio, e das do Parque do Bilares, os quais
ficam secos e de cor escura (preto), resultando na morte de todos rapidamente. F. flavus
(Merulliaceae) (Fig. 2C), distribuído com 21 espécimes em galhos das árvores e galhos
caídos (Tabela 2), registrou-se por fotografia em árvores com copas bem altas em todas as
zonas da cidade de Manaus, principalmente aquelas da ponta Negra, Centro e Centro Sul.
É importante, ressaltar que provavelmente, o número de espécies de macrofungos na
área urbana da cidade de Manaus deve ser maior do que o registrado, tendo em vista que
muitos são recolhidos junto com os resíduos lignoceluloliticos das vias pela limpeza
pública, assim como os galhos podados devido à fiação, ou os galhos são descartados por
diversos meios. Além disso, as árvores, principalmente das grandes avenidas como
Joaquim Nabuco, Getulio Vargas, as das praças das zonas Centro Sul são bastante altas, ou
as árvores se localizam em locais de difícil acesso ou de risco, particularmente devido a
fiação aérea da rede elétrica, acúmulo de lixo, dentre outros aspectos de infraestrutura
urbana que inviabilizam a coleta dos macrofungos.
189
Os diversos fatores acima mencionados, dentre outros podem ter contribuído para o
descarte de muitos fungos. No entanto, 102 espécies de Aphyllophorales são registradas na
área urbana da cidade de Manaus.
Figura 2. Macrofungos (Basidiomycetes) em diferentes substratos na área urbana de
Manaus- AM. (A) H. hydnoides. (B) ). S. commune. (C) F. flavus atacando galho em
árvore morta, (D) E. scabrosa atacando árvore viva, (E) H. subsphaerosporum e (F) C.
byrsina.
Este número pode ser associado ao tamanho da área amostral que abrange 28
bairros, as condições fitossanidade das árvores do ambiente urbano e climáticas,
principalmente pelo fato que a maior ocorrência de macrofungos é nas zonas Centro e Sul,
Sul e Oeste que apresentam intenso fluxo de carros, e considerando que as chuvas ácidas
podem contribuir com a alta taxa de poluição emitida pelos veículos, e consequentemente
com a diminuição da resistência das árvores e ou provocar injúrias nas raízes das árvores,
190
deixando-as susceptíveis a ataques de macrofungos lignoceluloliticos (Brena, 2000, Pivetta
2002 e Leite, 2010).
Em vista da ocorrência de 560 espécimes de macrofungos nas áreas verdes da
cidade de Manaus, recomenda-se estudos complementares das espécies conhecidas como
fitopatogênicas, visando o conhecimento de doenças causadas por eles na vegetação e
assim, contribuir para o estudo de controle das doenças das áreas urbanas da cidade de
Manaus. Com isso, permite a busca de alternativas ecológicas e sustentáveis para a
melhoria da qualidade da vegetação urbana, uma vez que as espécies de árvores do
ambiente urbano, principalmente das zonas Centro-sul, Oeste e Sul, demonstram ser
suscetíveis aos macrofungos fitopatogênicos e muitas delas morreram ou se encontravam
em estádio avançado de degradação. Por exemplo, se todas as árvores da avenida Joaquim
Nabuco em estádio avançado de degradação, com risco de queda ou tombamento, dentre
outros, fossem retiradas, praticamente poucas restariam. Diante disso, a revitalização das
áreas verdes torna se necessária.
Muitas árvores encontram-se em condições fitossanitárias criticas, com ataque de
macrofungos associados ou não com outros agentes degradadores que podem favorecer a
queda ou tombamento delas, o que podem causar inúmeros impactos ambientais e sociais
para o ambiente urbano. De modo que se recomenda o controle da vegetação com ataque
destes macrofungos, reposição das árvores por espécies resistentes aos mesmos visando a
manutenção e preservação das comunidades urbanas da cidade.
Neste contexto, a preservação e conservação da vegetação devem ser inseridas em
programa de arborização urbana com mapeamento e sistema de controle que possibilitem
realizar tanto a reposição como o plantio de arvores, considerando que os benefícios da
arborização estão relacionados com o planejamento urbano adequado visando melhoria da
qualidade de vida da fauna e do homem que vivem na cidade.
Conclusões
Um total de 104 espécies de macrofungos (basidiomycetes) ocorre nas áreas
urbanas da cidade de Manaus.
Dentre as espécies, destacam-se Earliella scabrosa, Hexágona hydnoides e
Fomitiporia punctata, com mais de 40 espécimes cada uma, distribuídos nas seis zonas da
cidade de Manaus.
Nas zonas Centro Sul, Sul e Oeste de Manaus ocorrem os maiores numeros de
macrofungos Aphylophorales.
191
Hymenochaetaceae, Corticiaceae, Ganodermataceae, e Auriculariaceae são
representadas com maior numero de espécimes, enquanto que Fomitopsidaceae,
Gloeophyllaceae, Meripilaceae, Merulliaceae e Schizophyllaceae com os menores nas áreas
verdes da cidade de Manaus.
Maior atenção deve ser dada a Ganodermataceae, tendo em vista que a maioria das
árvores atacadas com Ganoderma morreu ou encontra-se em estádio avançado de
degradação, ou tombadas.
As árvores com Hymenochaetaceae, principalmente com Phellinus e Fomitiporia,
considerados fitopatógenos, persistem por mais tempo, pois degradam o lenho mais
lentamente.
As árvores das avenidas e parques infectadas por S. comune morrem rapidamente,
principalmente os arbustos.
Agradecimentos
Á Fundação de Amparo à pesquisa do Estado do Amazonas-Fapeam pelos recursos
financeiros e bolsas que permitiram a realização deste trabalho.
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Caracterização parcial de proteases de extratos orgânicos de cogumelos
comestíveis
Machado A.R.G.1, Martim S.R.
1, Prado F.B.
2 Teixeira M. F. S.
3
1PG Biodiversidade Biotecnologia – Rede Bionorte, Universidade Federal do Amazonas,
2 PG
Biotecnologia , Universidade Federal do Amazonas, 3Professora associada e curadora da coleção de
culturas DPUA, Universidade Federal do Amazonas. Emails: [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected].
Resumo
As proteases são enzimas que possuem ampla utilização comercial e industrial. As
peptidases de origem fúngica apresentam vantagens como alta diversidade, fácil produção
em larga escala e recuperação. O objetivo deste estudo foi caracterizar parcialmente
proteases de extratos orgânicos de cogumelos comestíveis. A cultura matriz foi preparada
em meio OMYA (aveia + extrato de levedura. Os extratos dos cogumelos foram obtidos
por processo de extração com etanol e álcool:água (1:1). O extrato bruto foi filtrado
sucessivamente em tecido de algodão e membrana polietersulfônica de 0,22 µm. Nos
extratos enzimáticos foi determinada a atividade proteolítica utilizando azocaseína como
substrato. Os resultados demonstraram que o extrato de P. ostreatoroseus obtido da
mistura de água:álcool (1:1) foi fonte de proteases que apresentaram atividade catalítica
significativa em pH 5 a 40˚C.
Palavras-chave: Peptidases, Pleurotus albidus, Pleurotus ostreatoroseus.
Introdução
Cogumelos são fontes de nutrientes e compostos bioativos que conferem
propriedades medicinais e terapêuticas. São produtos que despertam pouco interesse para
comercialização, embora que contribuem de forma significativa para a subsistência de
várias populações, no mundo (Bernaud; Rodrigues, 2013; Mattila et al. 2016; Zoho et al.
2016).
Os fungos do gênero Pleurotus, conhecidos por causar a podridão branca da
madeira, apresentam a capacidade de se desenvolver em vários resíduos agroindustriais
195
que contenham celulose, hemicelulose, lignina, amido, pectina e proteínas. (Figueiró e
Graciolli, 2011; Minotto et al., 2011).
Proteases são enzimas utilizadas em diferentes setores industriais. Estes
biocatalisadores são usados na fabricação de queijo e de pães, amaciamento de couro,
aditivo de detergentes, além de possuírem importância medicinal e cosmética (Sawant;
Nagendran, 2014). As peptidases são obtidas de diversas fontes vegetais, animais e de
micro-organismos, Dentre os fungos, os cogumelos têm se destacado como produtores de
enzimas proteolíticas, além de serem utilizados como alimentos (Fonseca et al., 2014).
Diversos estudos tem sido realizados sobre a extração de compostos bioativos de
cogumelos por solventes orgânicos (Silva et al. 2009). Contudo ainda há poucos relatos
sobre o potencial biotecnológico deste macrofungo.
Sendo assim o objetivo deste trabalho foi caracterizar parcialmente proteases de
extratos orgânicos de cogumelos comestiveis.
Material e Métodos
Para a produção de enzimas, foram utilizados Pleurotus albidus DPUA 1692 e
Pleurotus ostreatoroseus DPUA 1720 do acervo da Coleção de Culturas DPUA/UFAM.
As culturas foram reativadas e cultivadas em placas de Petri contendo ágar OMYA (aveia
+ extrato de levedura) durante sete dias a 25°C.
Os extratos de cogumelo foram obtidos por processo de extração com etanol e
álcool:água (1:1). O processo de extração ocorreu sob agitação contínua em agitador
orbital a 150 rpm, a 25 °C. Posteriormente os extratos foram filtrados em papel de filtro
Whatman n°1 e foram feitas as análises subsequentes.
Para determinação da atividade enzimática proteolítica foi adicionado 250 µL de
solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2 em 150 µL de extrato
bruto. Os tubos reação foram incubados por 1 hora a 25 °C em câmara escura. Para
interrupção da reação foi adicionado 1,2 mL de ácido tricloroacético 10% (p/v) e em
seguida procedeu-se a centrifugação por 10 minutos a 10000 rpm, a 4 °C. Em seguida, de
cada sobrenadante, foi retirado 0,8 mL e transferido para tubos de ensaio contendo 1,4 mL
de hidróxido de sódio 1M. A leitura das amostras foi realizada a 440 nm. Como branco foi
utilizado tampão na solução de azocaseína 1% (p/v) em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2.
Para avaliar o efeito do pH e da temperatura na atividade proteolítica, a partir do extrato
bruto onde foi determinada a maior atividade proteolítica analisou-se o efeito do pH na
atividade proteolítica, incubando-se o extrato enzimático em diferentes faixas de pH (5,0 –
196
10,0), a 25 ºC por 60 minutos. Os tampões utilizados foram Citrato Fosfato 0,2 M (pH 5,0-
6,0), Tris-HCl 0,2M (pH 7,0-8,0), Glicina-NaOH (pH 9,0-10,0). O efeito da temperatura
foi determinado em 25 ºC, 30 ºC, 40 ºC, 50 ºC, 60 ºC e 70 ºC, em 60 minutos. A atividade
das proteases foi determinada conforme descrito anteriormente. Todos os experimentos
foram realizados em triplicata
Os dados foram submetidos à análise estatística descritiva média, desvio padrão,
gráfico e os cálculos de atividade enzimática (R2 ≥ 95%) por meio de análise de variância
(Anova) e teste Tukey (p < 0,05), utilizando o software Minitab ® versão 17.0.
Resultados e Discussão
Neste estudo, P. albidus e P. ostreatoroseus excretaram proteases em todas as
condições avaliadas, sendo que o maior quantitativo de proteases (185 U/mL) foi
verificado quando P. ostreatoroseus foi extraído com água:álcool (1:1). Os menores
valores de atividade proteasica (80 U/mL e 102 U/mL) são observados nos extratos de P.
albidus em solventes etanol e água:álcool (1;1) respectivamente (Tabela 1).
Tabela 1. Atividade proteolítica de P. albidus e P.ostreatoroseus extraídos em
diferentes solventes orgânicos.
Taxa Solvente Atividade proteolítica
(U/ml)
Pleurotus albidus Água:álcool (1:1) 102±0,1c
P. ostreatoroseus Água:álcool (1:1) 185±0,1ª
P. albidus Etanol 80±0,0d
P. ostreatoroseus Etanol 129±0,1b
O extrato bruto com maior atividade proteolítica foi submetido à caracterização
parcial de proteases. O efeito do pH na atividade proteolítica consta na figura 1 (A). As
proteases do extrato de P. ostreatoroseus extraído com água:álcool (1:1) apresentaram
atividade máxima em pH 5,0 com valores de 308 U/mL. Esses dados sugerem a presença
de proteases ácidas no extrato enzimático avaliado. Nos trabalhos realizados por Fonseca,
et al (2014), os autores verificaram que as proteases extraídas dos basidiomas de P.
ostreatoroseus demonstraram máxima atividade em pH 6,0.
Conforme indicado na Figura 1 B, a temperatura ótima de atividade proteolítica é
de 40°C, com decréscimo de atividade nas temperaturas subsequentes, enquanto que em
70°C e 80 °C ocorre perdas de 63,3% e 60,5%, respectivamente. Dados semelhantes foram
197
obtidos por Fonseca et al. (2014) e Kirsch et al. (2013) nos trabalhos realizados com
extratos dos basidiomas de P. ostreatoroseus e outros cogumelos comestíveis.
Em relação à importância das proteases ácidas, pesquisas mostram que a maior
significância está associada à propriedade coagulante das proteínas do leite (caseínas),
processo evidenciado mundialmente e que tem contribuído para substituição da quimosina
animal pelas proteases microbianas por questões dos direitos dos animais. Espécies de
Mucor, Rhizopus, Aspergillus e Penicillium são reportadas como fonte dessas proteases
(Daboor et al., 2010).
Figura 1- Efeito do pH (A) e da temperatura (B) na atividade proteolítica de
P.ostreatoroseus
Conclusões
O extrato P. ostreatoroseus obtido da mistura de água:álcool (1:1) foi fonte de
proteases com atividade catalítica significativa em pH 5 a 40˚C.
Este estudo sugere a possibilidade do uso de P. ostreatoroseus obtido da mistura de
água e álcool como fonte de proteases para aplicação industrial com extrato orgânico.
0
50
100
150
200
250
300
350
5 6 7 8 9 10
Ati
vid
ade
pro
teolí
tica
(U
/mL
)
pH
0
50
100
150
200
250
300
350
400
20 30 40 50 60 70 80
Ati
vid
ade
Pro
teolí
tica
(U
/mL
)
Temperatura C°
A B
198
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Efeito da temperatura e do pH no crescimento micelial do fungo
amazônico Lentinus crinitus (L.) Fr.
Magalhães A.A.S1., Carvalho T.B.
2, Souza A.Q.L
3., Pereira J.O.
3
1Doutoranda do Curso de Pós-Graduação da Rede BIONORTE, Universidade Estadual do
Amazonas, 2Professora do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Amazonas,
3Professor da Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Amazonas, Emails:
[email protected], [email protected], [email protected],
Resumo
A Amazônia é uma região de grande biodiversidade, seu clima tropical com altas
temperaturas justifica essa pluralidade ecológica que abriga uma enorme quantidade de
espécies. Dentre estas, há os basidiomicetos, comumente utilizados na medicina popular de
povos asiáticos devido ao seu valor terapêutico. Cogumelos são capazes de sintetizar uma
grande variedade de metabólitos secundários que apresentam atividade antitumoral,
antioxidante, antiinflamatória, hipoglicêmica e antibiótica. Neste estudo avaliou-se o
crescimento micelial in vitro de Lentinus crinitus (L.) Fr. em meio de cultura sólido BDA
em diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 °C) e faixas de pH (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 e
7,5). As avaliações foram realizadas por meio de medições de quatro diâmetros das
colônias, a cada 24 horas, durante quatro dias de incubação no escuro. Com base nos
resultados, verificou-se que a temperatura de 35 °C foi a mais favorável para o crescimento
micelial, assim como, a faixa de pH entre 5,0 e 5,5 se mostrou mais adequada para o
cultivo deste fungo. A maior biomassa micelial foi obtida nos dez primeiros dias de
crescimento no meio de cultivo. O cultivo in vitro pode contribuir para o conhecimento das
potencialidades de um basidiomiceto da Amazônia e despertar o interesse no uso dos
cogumelos como suplementos nutracêuticos.
Palavras-chave: Basidiomiceto, Cogumelo, Biomassa micelial.
Introdução
Os fungos compreendem um dos maiores grupos de organismos do planeta em
número de espécies, participando praticamente de quase todas as modificações físicas ou
químicas na natureza, pois são decompositores importantes nos ecossistemas e associados
essencialmente a muitos organismos (Floudas et al., 2015). Apesar disso, a diversidade
microbiana da Amazônia e suas relações ecológicas é pouco conhecida (Pereira et al.,
2017).
201
O fungo Lentinus crinitus (L.) Fr. é sapróbio, lamelar e decompositor de madeira,
pertencente à família Polyporaceae (filo Basidiomycota), representada por 40 espécies
conhecidas (Kirk et al., 2001). O gênero tem distribuição essencialmente tropical e
algumas espécies são raramente encontradas em regiões polares (Rolén, 2001). Estudos
etnomicológicos têm identificado diferentes espécies de fungos comestíveis do gênero
Lentinus, consumidos por grupos indígenas como os Yanomami na Amazônia brasileira
(Prance, 1984). De acordo com a literatura científica, são escassos os estudos sobre L.
crinitus, logo o conhecimento das potencialidades dessa espécie poderá contribuir para o
aproveitamento racional da biodiversidade brasileira, permitindo reverter à riqueza do solo,
fauna e flora brasileira em desenvolvimento econômico sustentável. Para isso, torna-se
necessário conhecer as condições ótimas de crescimento deste fungo. Hatvani (2001) relata
a importância de se conhecer os meios de cultura, tempos de incubação, pH e temperaturas
mais adequados para o crescimento dos microrganismos. A avaliação do crescimento
micelial pode ser feita de diferentes formas, tais como crescimento radial, vigor,
velocidade de crescimento e massa do micélio (Hatvani, 2001).
Em condições experimentais, o uso de meio de cultura sólido para avaliação do
crescimento de fungos é considerado adequado, pois na natureza, os fungos comumente
desenvolvem-se em substratos sólidos, tais como resíduos vegetais e animais, ou no solo
(Bononi et al. 1999). O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da
temperatura e do pH no crescimento micelial de L. crinitus em meio de cultura sólido afim
de se determinar as melhores condições de obtenção da biomassa e a partir destes dados
realizar o cultivo em meio liquido e encontrar o tempo ideal da produção da biomassa.
Material e Métodos
O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Microbiologia Industrial do
Centro de Apoio Multidisciplinar (CAM) da Universidade Federal do Amazonas (UFAM),
Manaus, AM. Foi utilizada uma linhagem de L. crinitus coletada na Reserva do Campus
Universitário da UFAM depositada no acervo da Micoteca DPUA da Universidade Federal
do Amazonas. O crescimento micelial foi avaliado por meio de testes em placa de Petri
inoculado com discos de 5 mm de diâmetro da linhagem de L. crinitus em meio de cultura
Batata-Dextrose-Ágar (BDA) (Figura 1).
202
Figura 1. Lentinus crinitus (L.) Fr cultivado em placa de Petri por oito dias à temperatura
de 35 °C.
As placas foram distribuídas inteiramente ao acaso e mantidas em estufa
incubadora BOD nas temperaturas de 30, 35, 37 e 40 °C, com seis repetições para cada
tratamento. A cada 24 horas foram realizadas medições de crescimento radial do fungo na
superfície do meio de cultura por meio de quatro medições equidistantes entre si. Essas
medidas foram realizadas durante quatro dias de incubação, período em que a colônia
fúngica atingiu a proximidade das bordas da placa de Petri. Foi considerada a média diária
do crescimento micelial após quatro dias de observações em cada temperatura.
O crescimento micelial também foi avaliado em placas de Petri inoculado com
discos de 5 mm de diâmetro com a linhagem de L. crinitus em meio de cultura BDA
submetidas à seis tratamentos experimentais com diferentes pH: 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 e
7,5. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com os seis pH
em meio de cultura BDA. Cada tratamento foi composto por cinco repetições, sendo cada
repetição correspondente a uma placa de Petri, totalizando 30 placas.
Para o teste da curva de crescimento foram inoculados cinco fragmentos de 5mm de
diâmetro de L. crinitus em frascos erlenmeyer contendo 100 mL de meio líquido Batata
Dextrose com extrato de levedura 0,5% (p/v) (BDL) e incubado sob agitação (120 rpm) a
35 ° C por 30 dias (Souza et al., 2004). Foram preparados 25 erlenmeyers, sendo 24 para
inóculo do fungo e um controle. A cada cinco dias eram retirados quatro frascos
(quadruplicatas) da incubadora para filtração à vácuo, utilizando papel filtro estéril com o
peso previamente determinado. A biomassa fúngica foi pesada em balança analítica e em
seguida colocada em estufa a 60 º C. Em intervalos de 24 horas, os papéis de filtro foram
pesados e esse procedimento repetiu-se até que o peso constante fosse atingido. A
biomassa foi calculada pela diferença entre a massa do papel de filtro juntamente com o
micélio e a massa do papel antes da filtração
203
Os dados de crescimento nas diferentes temperaturas e condições de pH foram
submetidos à Análise de Variância de uma via. Para a comparação da massa fúngica ao
longo dos 30 dias foi utilizada Análise de Variância para medidas repetidas. O teste de
Tukey foi utilizado para as comparações múltiplas, sendo considerado α ≤ 0,05 para
significância estatística. Todas as análises citadas acima são baseadas em Zar (1999).
Resultados e Discussão
Houve efeito da temperatura no crescimento micelial de L. crinitus após quatro dias
de incubação (ANOVA, F=38,89; p=0,001; Figura 2), sendo o maior crescimento
observado a 35 oC e o menor a 40
oC. O crescimento micelial de cogumelos do gênero
Lentinus já foram relatadas em diversos estudos. Gbolade et al. (2006), analisando o
comportamento de L. subnudus, um cogumelo comestível da Nigéria em temperaturas
variando entre 0 ºC e 45 ºC observaram que, embora o fungo tenha crescido na faixa de
temperatura entre 15 ºC a 40 ºC, o melhor crescimento foi obtido a 30º C; Lechner e
Albertó (2007) testaram a temperatura ótima para o crescimento micelial de linhagens de
L. tigrinus e observaram que a temperatura de 30° C foi a mais favorável. Manjunathan et
al. (2011) observaram em L. tuberregium coletado da floresta de Keeriparai na Índia, um
crescimento mais favorável na temperatura de 25° C.
Figura 2. Média diária (± dp) do crescimento micelial (mm) de Lentinus crinitus
submetidos a diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 °C). Letras diferentes indicam
diferença estatística significativa (Tukey, p < 0,05).
Vargas-Isla e Ishikawa (2008) avaliando as condições ótimas do crescimento
micelial de uma linhagem de L. strigosus isolada da Amazônia brasileira, verificaram que a
temperatura mais adequada foi de 35° C. Sales-Campos et al. (2010) testaram sete
204
temperaturas de incubação (20, 25, 30, 35, 40, 45 e 50 °C) no cultivo de uma linhagem de
L. strigosus de ocorrência na Amazônia em meios de cultura à base de malte acrescido com
diferentes substratos, verificaram que a temperatura de 35 °C foi a mais promissora para o
crescimento micelial. Os resultados destes trabalhos na Amazônia corroboram com os
achados deste estudo.
Houve efeito do pH no crescimento micelial de Lentinus crinitus após quatro dias
de incubação (ANOVA, F=8,94; p=0,001; Figura 3) sendo mais evidente nas condições
submetidas aos pH 5,0 e 5,5. Este resultado difere do que foi encontrado por De Leon et al.
(2017) ao testarem sete pH (5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 e 8,0) no cultivo de um cogumelo
comestível selvagem recentemente domesticado nas Filipinas (Lentinus squarrosulus), os
autores observaram que pH de 6,5-7,0 foi o mais adequado para o crescimento micelial.
Segundo Chang e Miles (1989), a concentração de O2 e o pH influenciam os processos
metabólicos dos fungos e, conseqüentemente, a habilidade de utilizar substâncias nutritivas
tais como carbono, nitrogênio, vitaminas e minerais. A importância do pH está
primordialmente relacionada com metabolismo dos nutrientes, evidenciando a necessidade
de se conhecer a faixa ótima para o cultivo desses fungos.
Câmara de Assessoramento Científico - PESQUISA
Figura 3. Média diária (± dp) do crescimento micelial (mm) de Lentinus crinitus
submetidos a diferentes condições de pH (5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0 e 7,5). Letras diferentes
indicam diferença estatística significativa (Tukey, p < 0,05).
Os resultados do cultivo submerso mostraram que a maior massa micelial de L.
crinitus foi obtida nos primeiros dez dias de incubação (ANOVA para medidas repetidas,
F=16,21; p=0,001, Figura 4), o que provavelmente está relacionado à presença de maior
substrato energético durante esse período. Como não houve diferença de produção de
205
biomassa fúngica entre o quinto e décimo dia (Tukey, p=0,002), conclui-se que os cinco
primeiros dias é suficiente para a obtenção de uma maior produção de biomassa. Hassan et
al. (2012) testaram o melhor período de incubação (5, 10, 15 e 20 dias) no cultivo
submerso de um cogumelo comestível e medicinal (Flammulina velutipes) em diferentes
meios de cultura e verificaram que 15 dias de fermentação foi o mais adequado para uma
maior produção de biomassa micelial. Segundo Anike et al. (2015) fatores como
nutrientes, volume, agitação, temperatura podem afetar a produção de biomassa micelial;
conhecer as melhores condições de cultivo podem gerar benefícios na busca de novos
compostos bioativos.
Figura 4. Média (± dp) da biomassa micelial (grama) de Lentinus crinitus cultivado em
meio BDL durante trinta dias à temperatura de 35° C. Letras diferentes indicam diferença
estatística significativa (Tukey, p < 0,05).
Conclusões
Foi possível evidenciar a temperatura e a faixa de pH ótimos para o crescimento
micelial de L. crinitus.
Um rápido crescimento micelial é importante, uma vez que reduz os índices de
contaminações e crescimento de outros organismos competidores.
O conhecimento das melhores condições de cultivo in vitro deste fungo pode
contribuir na geração de subsídios para o desenvolvimento de adjuvantes alimentares,
nutracêuticos ou fármacos com novas substâncias bioativas.
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Estabilidade e toxicidade de extratos proteolíticos de Pleurotus
ostreatoroseus e Lentinus citrinus cultivados em resíduo lignocelulósico da
Amazônia
Martim S.R.1, Silva L.S.C
1, Prado F.B
2, Machado A.R.G
1, Teixeira M.F.S
3
1Doutorado Rede BIONORTE, Universidade Federal do Amazonas,
2Mestrado em Biotecnologia,
Universidade Federal do Amazonas, 3Professora, Universidade Federal do Amazonas. Emails:
salomã[email protected], [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected]
Resumo
As proteases catalisam diversas reações químicas vitais para manutenção de micro-
organismos e apresentam ampla aplicação industrial. Este estudo teve por objetivo avaliar
o efeito do tempo e da temperatura de armazenamento na estabilidade e a toxicidade de
extratos proteolíticos de Pleurotus ostreatoroseus e Lentinus citrinus. Os macrofungos
foram cultivados em semente de açaí suplementada com farelo de arroz (90:10, p/p), pH 6,
umidade (60%). O bioprocesso foi conduzido por 10 dias a 25 °C. As proteases foram
extraídas em água destilada esterilizada. Os extratos brutos foram filtrados e armazenados
durante oito meses a 4°C e -10°C. A atividade proteolítica foi determinada utilizando
azocaseína como substrato. A toxicidade dos extratos foi determinada pelo método de
difusão em ágar contra Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Candida albicans. As
proteases de todos os extratos testados se mantiveram ativas durante oito meses de
armazenamento. No extrato de P. ostreatoroseus mantido a 4°C, houve redução de 8% de
atividade proteolítica, contudo na temperatura de -10oC o extrato manteve 97,35% de
atividade residual. Os extratos de L. citrinus mantiveram estabilidade nas condições
avaliadas. Os extratos testados não apresentaram toxicidade contra E. coli, S. aureus e C.
albicans e apresentam possível potencial para aplicação na indústria de alimentos.
Palavras-chave: peptidase, Pleurotus ostreatoroseus, Lentinus citrinus, armazenamento.
Introdução
As proteases ou peptidases são enzimas que catalisam reações hidrolíticas em que
as moléculas de proteínas são degradadas em peptídios e aminoácidos. A proteólise é um
processo essencial para o desenvolvimento e manutenção da vida de diferentes organismos.
Em fungos as proteases estão relacionadas com a germinação e formação de esporos, na
patogênese e nos processos de regulação pós-traducional (Mandujano-González et al.,
2016).
Microrganismos são as fontes mais comuns de enzimas comerciais devido as suas
propriedades fisiológicas e bioquímicas, facilidade das condições de cultivo e de
209
manipulação celular. Dentre as enzimas microbianas, as proteases são as mais importantes
para a indústria, constituindo 65% do mercado total de enzimas industriais. Estes
biocatalisadores são usados para processamento de alimentos, elaboração de produtos
farmacêuticos, beneficiamento do couro, produção de detergentes e em processos de
biorremediação. Os estudos relacionados com a estabilidade dos extratos proteásicos, em
diferentes condições de armazenamento, são imporatntes para indicar suas aplicações
industriais (Rodarte et al., 2011; Inácio et al., 2015).
Dentre os microrganismos os cogumelos têm se destacado como produtores de
peptidases: Lentinus edodes (Alemu, 2014), L. citrinus (Machado et al., 2016), Pleurotus
ostreatoroseus (Fonseca et al., 2014), P. sajor-caju (Ravikumar et al., 2012).
Além de serem utilizados como fonte de alimento, os cogumelos sintetizam
metabólitos bioativos, como por exemplo, espécies de Pleurotus, Ganoderma e Lentinula.
Pleurotus ostreatus têm sido utilizadas para combater cepas resistentes de Escherichia coli,
Staphylococcus epidermidis e S. aureus e espécies de Candida (Sharma et al., 2014).
Este estudo teve por objetivo avaliar a estabilidade enzimática de extratos de
Pleurotus ostreatoroseus e Lentinus citrinus armazenados em temperaturas de 4 °C e -
10 °C e verificar a toxicidade dos extratos contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli
e Candida albicans.
Material e Métodos
Neste trabalho foram usadas culturas viáveis e puras dos cogumelos comestíveis
Pleurotus ostreatororeus DPUA 1720 e Lentinus citrinus DPUA 1693 acessados da
Coleção de Culturas do Departamento de Parasitologia da Universidade do Amazonas –
Coleção DPUA. As culturas foram cultivadas em ágar batata dextrose + extrato de
levedura 0,5% (p/v) (Figura 1). Para o bioprocesso em estado sólido foram utilizados,
como meio de cultivo, semente de açaí, suplementados com farelo de arroz (90:10, p/p).
Esta mistura teve o pH corrigido para 6 e a umidade ajustada para 60%, seguido de
esterilização a 121 °C por 1 hora. Foram adicionados cinco discos miceliais de 50 mm (Ø)
sobre o meio de cultivo solido e o bioprocesso foi conduzido por 10 dias a 25 °C. As
proteases produzidas por fermentação em estado sólido foram extraídas a 30 oC, em água
destilada esterilizada na razão 1:5 (substrato:água, m/v), a 150 rpm. Após 30 minutos o
extrato bruto foi recuperado por filtração sob vácuo utilizando papel Whatman no
1. Em
seguida o extrato enzimático foi filtrado em membrana de éster de celulose com
210
porosidade de 0,45 µm (Ø) e armazenados em temperaturas de 4 °C e -10 °C, em
refrigerador doméstico. Nos extratos enzimátcos foi determinada a atividade proteolítica
no tempo inicial (tempo zero) e a cada dois mêses durante 8 meses. A atividade proteolítica
foi determinada de acordo com a metodologia descrita por Leighton et al. (1973) que
utiliza azocaseína a 1% (p/v) como substrato enzimático. Uma unidade de atividade
proteolítica foi definida como a quantidade de enzima capaz de produzir um aumento na
absorvância de 0,01 em 1 hora e expressa em U/mL.
Figura 1. L. citrinus (A) e P. ostreatoroseus (B) cultivados em BDA suplementado com
extrato de levedura (0,5%).
A avaliação da toxicidade foi realizada pelo método de difusão em ágar. Os micro-
organismos testados foram cultivados em ágar Sabouraud a 25°C por 48 horas (Candida
albicans DPUA 1340) e em ágar Müeller-Hinton, a 37°C por 24 horas (Staphylococcus
aureus (CCT 1352), Escherichia coli (CCT 0547). Nesses cultivos foi preparada uma
suspensão celular de concentração semelhante à coluna no1 da escala de MacFarland. De
cada suspensão, foram retirados 100 µL para serem semeados na superfície ágar Sabouraud
e ágar Müeller-Hinton, em placa de Petri (10 mm x 90 mm, Ø), formando uma camada
uniforme. Nesses cultivos foram retirados discos com 8 mm (Ø) e adicionados 100 µL de
extrato bruto obtido por fermentação em matriz sólida. As placas foram incubadas a 25 °C
e 37 °C por 24 e 48 horas, respectivamente. Como padrão foram utilizados itraconazol e
cloranfenicol (200 µg/ mL). A toxicidade dos extratos de P. ostreatoroseus e L. citrinus
contra os micro-organismos testados foi avaliada medindo-se o halo de inibição.
Os dados foram submetidos à análise estatística descritiva (média e desvio
padrão) a um nível de significância de 95 % pelo Teste de Tukey utilizando o software
Minitab, versão 16.0. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
(A) (B)
211
Resultados e Discussão
A temperatura e o perfil de estabilidade são características bioquímicas que são
usadas para indicar a aplicação de enzimas em processos industriais e biotecnológicos
(Castro et al., 2013). A inativação de enzimas durante a estocagem é um fator limitante
para sua aplicação industrial (Merheb-Dini, 2010).
As atividades proteolíticas dos extratos de P. ostreatoroseus e L. citrinus, no tempo
zero foram 87 U/mL e 93 U/mL, respectivamente. O efeito do tempo e da temperatura de
armazenamento na atividade proteásica dos extratos de P. ostreatoroseus e L. citrinus
constam nas figuras 2 e 3, respectivamente.
Figura 2. Efeito do armazenamento na atividade proteolítica de P. ostreatoroseus.
As proteases de P. ostreatoroseus e L. citrinus se mantiveram ativas durante o
armazenamento a 4 °C e a -10 °C. O tempo e a temperatura de armazenamento
influenciaram significativamente na atividade proteolítica de P. ostreatoroseus, mas a
atividade proteásica dos extratos de L. citrinus se mantiveram estáveis nas condições de
estudo. Houve redução de atividade dos extratos enzimáticos de P. ostreatoroseus
mantidos em temperaturas de 4° C durante o tempo de armazenamento. No segundo mês
de análise, a atividade proteolítica do extrato bruto de P. ostreatoroseus reduziu 3% e após
oito meses foi verificada decréscimo de 8% de atividade proteolítica. Apesar da redução na
atividade proteolítica, o extrato de P. ostreatoroseus manteve atividade residual superior a
90 %. Enquanto que sob congelamento, o extrato de P. ostreatoroseus manteve 97,35% de
atividade proteásica, após oito meses de armazenamento. Ito et al. (2010) também
observaram decréscimo de atividade das peptidases excretadas por Beauveria bassiana
durante o tempo de armazenamento, sendo que sob condições de refrigeração as enzimas
50
60
70
80
90
100
110
0 2 4 6 8 10
Ati
vid
ade
resi
dual
(%
)
Armazenamento (meses)
4 °C
10°C
Temperatura de armazenamento
212
mantiveram 80 % de atividade proteolítica. Merheb-Dini (2010) relataram que as proteases
de Thermomucor Indicae-Seudaticae N31 mantiveram estáveis durante dez semanas sob
refrigeração a 7 °C.
A atividade proteolítica dos extratos de L. citrinus no tempo zero foi de 93,00
(±0,00) U/mL. Esta atividade se manteve estável independente do tempo e das condições
de armazenamento. Merheb-Dini (2010) também verificou estabilidade das peptidases do
extrato enzimático de Thermomucor indicae-seudaticae N31 sob condições de temperatura
de -7 °C. Ito et al. (2007) relataram que as proteases de Beauveria bassiana mantiveram 90
% de atividade a -18 °C. Contudo Silva (2013) verificou que as proteases de T. indicae-
seudaticae N31 perderam 25 % de atividade durante armazenamento a -20 °C.
Segundo Oetterer et al. (2006), as enzimas perdem atividade devido à ação do frio e
ao método de congelamento utilizado para conservação de matérias-primas e produtos
alimentícios. Os métodos de congelamento podem ser classificados em lento e rápido. O
congelamento lento é realizado em freezer doméstico, enquanto que no congelamento
rápido são utilizados equipamento específicos como congeladores de ar forçado ou de
placa. Quanto menor a temperatura de estocagem sob congelamento, menor é a taxa de
alterações bioquímicas. Contudo, o congelamento e o armazenamento congelado não
inativam completamente as enzimas (Fellows, 2006). Merheb-Dini (2010) relata que a
perda de atividade proteolítica em temperaturas de congelamento ocorrem devido à
formação de cristais de gelo que podem ter alterado a estrutura conformacional da proteína
resultando em perda de atividade e menor conservação do extrato proteolítico de T.
indicae-seudaticae N31.
A utilização de microrganismos vivos como fungos e bactérias para investigar a
toxicidade em compostos químicos e em produtos naturais, tornou-se uma opção viável ao
longo dos anos (Viera et al., 2013). O consumo de cogumelos tem crescido nos últimos
anos. Estes macrofungos, além de serem ricos nutricionalmente, sintetizam compostos
bioativos com potencial medicinal e antimicrobiano (Nidadavolu et al., 2010).
213
Figura 3. Efeito do armazenamento na atividade proteolítica de L. citrinus.
A toxicidade dos extratos brutos de L. citrinus e P. ostreatoroseus frente a
Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans está demonstrada nas figuras
4, 5 e 6, respectivamente. Nas condições avaliadas, os extratos de P. ostreatoroseus e de L.
citrinus não apresentaram toxicidade contra S. Aureus. Estes resultados estão de acordo
com os estudos de Akyuz et al. (2009) e Gbolagade e Fasidi (2005) que não verificaram
atividade tóxica dos extratos de P. ostreatus e Auricularia polytricha, respectivamente,
contra S. aureus. Contudo os resultados obtidos no presente estudo diferem dos relatados
por Alves et al. (2012) que avaliaram a atividade dos extratos de Russula delica e de
Fistulina hepática contra S. aureus.
Figura 4. Teste de toxicidade dos extratos de L. citrinus e P. ostreatoroseus contra S.
aureus: A1: L. citrinus (-10°C); A2: L. citrinus (4 °C); B1: P. ostreatoroseus (-10 °C); B2:
P. ostreatoroseus (4°C); C: (Controle – Cloranfenicol).
Os extratos de L. citrinus e P. ostreatoroseus também não demonstraram toxicidade
contra Escherichia coli. Estes resultados corroboram com os dos estudos de Akyuz et al.
(2010) que não verificaram toxicidade dos extratos de Terfezia boudieri, Pleurotus
ostreatus e Pleurotus sajor-caju frente a E. coli. Dados diferentes daqueles apresentados
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10
Ati
vid
ade
resi
dual
(%
)
Armazenamento (meses)
4 °C10…
Temperatura de armazenamento
A1 A2
B1 B2
C
214
por Ramesh e Pattar (2010) que verificaram toxicidade dos extratos de Lycoperdon
perlatum, Pleurotus pulmonarius, Marasmius oreades e Clavaria vermiculris contra E.
coli.
Figura 5. Teste de toxicidade dos extratos de L. citrinus e P. ostreatoroseus contra E. coli:
A1: L. citrinus (-10°C); A2: L. citrinus (4 °C); B1: P. ostreatoroseus (-10 °C); B2: P.
ostreatoroseus (4°C); C: (Controle – Cloranfenicol).
Não foi verificada toxicidade dos extratos de L. citrinus e P. ostreatoroseus frente a
Candida albicans. Gbolagade e Fasidi (2005) também não relataram ação dos extratos
obtidos de macrofungos Basidiomycetes (Auricularia polytricha e Tricholoma lobayensis)
e Ascomycetes, Daldinia concentrica contra C. albicans. Contudo os extratos de Pleurotus
pulmonarius e Marasmius oreades foram ativas contra C. albicans, conforme Ramesh e
Pattar (2010).
Figura 6. Teste de toxicidade dos extratos de L. citrinus e P. ostreatoroseus contra C.
albicans. A1: L. citrinus (-10°C); A2: L. citrinus (4 °C); B1: P. ostreatoroseus (-10 °C);
B2: P. ostreatoroseus (4°C); C: (Controle – Itraconazol).
A1 A2
B1 B2
C
A1 A2
B1 B2
C
215
A produção em grandes quantidades e a eficiência catalítica sem processamento
adicional (in natura) são requisitos essenciais para que as peptidases sejam aplicadas a
nível industrial (El-Baky et al., 2011).
Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que os extratos
proteolíticos de P. ostreatoroseus e L. citrinus não são tóxicos e apresentam potencial para
aplicação na indústria de alimentos. Proteases obtidas de cogumelos Termitomyces
clypeatus (Majumder et al. 2015), Hericium erinaceum (Nakamura et al. 2014) e Coprinus
lagopides (Shamtsyan et al., 2014). Apresentam possíveis potenciais para aplicação na
indústria de laticínios como agentes coagulantes do leite:
Estudos recentes têm evidenciado a aplicação segura de cogumelos na produção de
produtos alimentícios. Souza et al. (2016) desenvolveram três bioprodutos formulados com
exocarpo de abacaxi e micélio de Pleurotus albidus, Pleurotus florida e Lentinus citrinus.
Machado et al. (2016) relatam que o corpo de frutificação de L. citrinus é fonte de
proteínas, aminoácidos essenciais e fibras, demonstrando potencial para utilização na
alimentação humana e em processos industriais.
Conclusões
Os extratos de Pleurotus ostreatoroseus e Lentinus citrinus mantêm atividade em
temperaturas de 4 °C e a -10 °C, após oito meses sob armazenamento.
A estocagem a 4°C interfere na estabilidade do extrato proteolítico de P.
ostreatoroseus, contudo a atividade proteásica dos extratos de L. citrinus não é afetada
pelo armazenamento refrigerado.
Os extratos de P. ostreatoroseus e L. citrinus não são tóxicos para Escherichia coli,
Staphylococcus aureus e Candida albicans e apresentam possíveis potenciais para
aplicação na indústria de alimentos.
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Capacidade de microrganismos autóctones de solos amazônicos em usar
o petróleo como fonte de carbono com meios nutricionais distintos
Moura D.C.G1 , Oliveira L.A.
2
1Mestre em Biotecnologia, Universidade do Estado do Amazonas,
2Pesquisador, Instituto Nacional
de Pesquisas da Amazônia. Emails: [email protected], [email protected]
Resumo
A biorremediação é uma técnica que vem alcançando importância mundial, uma
vez que o aumento da atividade industrial está degradando, cada vez mais, os ecossistemas
naturais. Para os hidrocarbonetos, em especial, a velocidade de degradação comumente
depende da concentração do contaminante e da quantidade de espécies catalisadoras, como
as enzimas geradas in situ pelos microrganismos. Estimular esses microrganismos a se
reproduzirem e liberar enzimas é possível por meio da adição de soluções de fertilizantes.
O objetivo desta pesquisa foi estudar duas soluções de nutrientes que estimule o
crescimento de microrganismos naturais do solo, de forma a otimizar o processo de
biodegradação de petróleo. Foram selecionadas previamente seis linhagens de
microrganismos potencialmente degradadoras de petróleo isoladas a partir de solos da
Província Petrolífera de Urucu, Coari-Amazonas. A capacidade das linhagens estudadas
foi avaliada utilizando uma metodologia previamente testada, em placas de Petri, onde
avaliou-se a taxa de crescimento das bactérias ao usarem o petróleo como fonte de
carbono. A solução de nutrientes INPA, quando comparada à BH, proporcionou maiores
taxas de crescimento das bactérias a partir do sexto dia de avaliação até o final do
experimento, aos 15 dias, sendo considerada a mais apropriada para as linhagens
estudadas.
Palavras-chave: Biorremediação, metabolismo microbiano, petróleo, solos amazônicos,
microbiologia ambiental.
Introdução
O petróleo é uma mistura complexa de hidrocarbonetos e outras substâncias,
resultantes de processos físico-químicos sofridos pela matéria orgânica, que se depositou
juntamente com fragmentos de rochas durante a formação de estruturas sedimentares,
milhões de anos atrás. Hidrocarbonetos parafínicos, naftênicos, aromáticos e oleofinas
constituem essencialmente o petróleo. Em proporções menores, encontram-se compostos
contendo nitrogênio, oxigênio, enxofre e metais pesados (Santestavan, 2008).
Com a exploração e comercialização do petróleo e seus derivados, vazamentos
indevidos e acidentais vêm ocorrendo, gerando graves danos ao meio ambiente o que torna
imprescindível o desenvolvimento de tratamentos a fim de remediar a área contaminada
(Biello, 2010), uma vez que devido, principalmente, à complexidade dessa mistura,
normalmente o tratamento de áreas contaminadas por essas substâncias torna-se difícil e
problemático (Andrade et al., 2010).
219
A descontaminação de sítios pode ser obtida por técnicas de biorremediação. A
biorremediação pode ser considerada como uma nova tecnologia para tratar locais
contaminados mediante o uso de agentes biológicos capazes de modificar ou decompor
poluentes alvos. Estratégias de biorremediação incluem: a utilização de microrganismos
autóctones, ou seja, do próprio local, sem qualquer interferência de tecnologias ativas de
remediação (biorremediação intrínseca ou natural); a adição de agentes estimulantes como
nutrientes, oxigênio e biossurfactantes (bioestimulação); e a inoculação de consórcios
microbianos enriquecidos (bioaumento). O benefício desses processos é a mineralização do
poluente, isto é, a transformação em gás carbônico, água e biomassa (Mariano, 2006). Um
super microrganismo fracassa porque compete com as comunidades adaptadas ao meio.
Contudo, encorajar esses microrganismos a trabalhar mais, é teoricamente possível por
meio de uso de fertilizantes como o ferro, nitrogênio e fósforo. De fato, este processo
acelerou a atividade microbiana no sedimento ao longo da costa do Alasca, após desastre
com Exxon Valdez (Biello, 2010).
Tendo essas definições e reconhecendo a importância da biorremediação para a
recuperação de ambientes degradados, tem-se um cenário propício e estimulante à
pesquisas que visem identificar novas e melhores formas de reduzir impactos ambientais
ou, atuando na correção de agressões já geradas, promovendo alternativas na remediação
de locais contaminados.
Assim, essa pesquisa buscou avaliar a capacidade de consumo de petróleo como
fonte de carbono por seis linhagens de bactérias isoladas de solos Amazônicos por meio de
duas soluções de nutrientes, INPA e BH, através da avaliação de taxas de crescimento
microbiano.
Material e Métodos
Para o teste de capacidade microbiana em usar petróleo como fonte de carbono em
meios nutricionais distintos foram utilizados os tratamentos com os meios BH e INPA,
ambos com pH 6,0 com três repetições cada, em placas de Petri, com petróleo como fonte
de carbono na superfície do Agar, utilizando as bactérias seis linhagens previamente
selecionadas.
O meio BH – Bushnell Haas é recomendado desde 1963 em uma publicação
especial pelo Comitê da Sociedade de Microbiologia Industrial – SIM – para a análise
microbiológica de combustíveis na deterioração por microrganismos de uma variedade de
hidrocarbonetos como querosene, óleos minerais, parafina e gasolina. É um meio mineral,
que contém alguns dos nutrientes necessários para o crescimento de bactérias que são
capazes de decompor hidrocarbonetos. Neste estudo foi feito um comparativo entre o meio
INPA, meio também mineral, diferenciado por conter nutrientes como Se2+
, Zn2+
, Cu2+
,
Fe2+
, Mn2+
, estudado na degradação de hidrocarbonetos por microrganismos, em análise ao
meio BH.
220
Tabela 1 - Meio Mineral Bushnell Haas (Meio BH)
Componentes Quantidade
KH2PO4 1,0g
K2HPO4 1,0 g
*NH4NO3 1,0 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
FeCl3. H2O 0,05 g
CaCl2.2H2O 0,02 g
H2O destilada 1000 mL
Nota: *Substituído por 1,65g de (NH4)2SO4. Fonte: Atlas (1995)
Tabela 2 - Meio Mineral INPA (Meio INPA)
Componentes Quantidade
KH2PO4 1,5 g
K2HPO4 0,5 g
(NH4)2SO4 2,5 g
MgSO4.7H2O 0,4 g
Ca(CH3COOH)2. H2O 0,02 g
FeSO4.7H2O 0,05 g
FeCl3.6H2O 0,05 g
ZnSO4.7H2O 0,01 g
CuSO4. 5H2O 0,01 g
MnSO4 .7H2O 0,01 g
Na4Se O3 0,01 g
H2O destilada 1000 mL
Para a avaliação do crescimento microbiano foi utilizado o método de riscagem
proposto por Oliveira e Magalhães (1999). As avaliações foram feitas a cada três dias
durante um período de 15 dias, no qual as bactérias ficaram no laboratório a uma
temperatura de 28 oC ± 2 ºC. De acordo com o crescimento celular nas respectivas zonas
(Figura 1), foram dados valores de crescimento para cada microrganismo variando de 1
(sem crescimento visível após riscagem) a 4 (máximo crescimento), podendo ter valores
intermediários entre esses extremos.
O método consiste em riscar o microrganismo em 4 zonas, como descrito abaixo:
Zona 1: consiste em uma linha, riscando-se várias vezes os microrganismos com
auxílio de uma alça de platina, em ambas direções conforme indica a seta;
221
Zona 2: é compreendida por quatros linhas paralelas entre si, cada uma com uma
intercessão na zona 1, na parte direita-terminal, no sentido indicado pela seta;
Zona 3: formada por quatros linhas paralelas entre si, cada uma com intercessão na
zona 2, na parte direita-terminal;
Zona 4: Composta por quatros linhas paralelas entre si, com uma intercessão na
zona 3, na parte direita-terminal, no sentido indicado pela seta.
Figura 1. Ilustração do método de riscagem proposto por Oliveira e Magalhães (1999).
Figura 2. Valores de crescimento para as bactérias selecionadas nos respectivos
tratamentos em placas de Petri com meio BH e INPA.
2.0 3.0 4.0
1.0 1.25 1.5
Zona 3
Zona 4
Zona 2
Zona 1
222
Este método permitiu ainda avaliar as bactérias a partir da escala determinada na
Tabela 3 e classificá-las de acordo com o grau de tolerância.
Tabela 3 - Escala de valores para a avaliação do crescimento da bactéria nos meios BH e
INPA (pH 6,0; pH 6,0 respectivamente).
Graus de crescimento Intervalos de pontuação
Baixo 1,00 - 2,00
Médio 2,06 * - 3,00
Elevado 3,06 * - 4,00
* Três repetições com nota 2,0 e uma com 2,25.
** Três repetições com nota 3,0 e uma com 3,25.
Resultados e Discussão
Ao se usar o método de Oliveira e Magalhães (1999) para a mesma avaliação de
crescimento em meio de cultura contendo o petróleo de Urucu como fonte de carbono e as
soluções de nutrientes INPA e BH como complementos em placas de petri (Tabela 4),
observou-se de um modo geral, que onde a solução INPA foi adicionada houve maior
crescimento das bactérias a partir do sexto dia de crescimento até o final do experimento,
aos 15 dias de incubação em laboratório.
Tabela 4- Classificação da capacidade dos microrganismos consumirem petróleo pelo
método de Oliveira e Magalhães (1999).
Monitoramento 3º dia 6º dia 9º dia 12º dia 15º dia
Tratamento INPA BH INPA BH INPA BH INPA BH INPA BH
Bactéria 1 1,00 1,00 2,00 1,50 3,50 2,50 3,75 2,75 4,00 3,00
Bactéria 2 1,00 1,00 2,50 2,50 3,66 3,25 3,75 3,50 4,00 3,75
Bactéria 3 1,00 1,00 2,50 2,00 3,50 3,00 3,75 3.25 4,00 3,66
Bactéria 4 1,00 1,00 2,00 1,00 3,25 1,25 3,50 2,50 3,83 3,00
Bactéria 5 1,00 1,00 2,00 1,75 3,25 3,00 3,50 3,25 3,83 3,50
Bactéria 6 1,00 1,00 1,75 2,50 3,25 3.00 3,50 3,25 3,75 3,50
Médias 1,00 1,00 2,12 1,87 3,40 2,66 3,62 3,08 3,90 3,40
Esse método foi utilizado primeiramente para avaliar graus de tolerância à acidez e
Al tóxico por isolados de rhizobia (Magalhães e Oliveira, 1999; Hara e Oliveira, 2004,
223
2005, 2007), considerando-se tolerantes, aqueles quando atingem a nota mínima de 3,06.
Usando o mesmo raciocínio, poder-se-ia usar a mesma nota para indicar maiores
capacidades das bactérias aqui estudadas, em degradarem o petróleo. Desse modo,
observa-se que todas as seis bactérias já apresentam essas notas já no nono dia de
crescimento quando foi usada a solução mineral INPA, enquanto que nesse mesmo dia,
apenas uma das seis bactérias apresentou essa nota quando se usou o meio BH. Aos 12
dias, somente três das seis bactérias apresentaram essa nota no meio com BH e aos 15 dias,
ainda haviam duas bactérias por atingir essa nota mínima nesse meio.
Esses dados comprovam que o meio mineral INPA se mostrou superior ao BH
quanto à habilidade dos microrganismos usarem o petróleo como fonte de carbono, que em
termos práticos significa maior capacidade de degradação desse composto orgânico.
Desta forma, ficou evidente que o meio INPA aumentou consideravelmente a
capacidade dos microrganismos em consumirem petróleo como fonte de carbono quando
comparado ao meio BH (Figura 3), evidenciando que a solução ajustada com nutrientes
como Se2+
, Zn2+
, Cu2+
, Fe2+
, Mn2+
aumenta a velocidade de crescimento microbiano, e por
conseguinte, uma maior taxa de degradação.
Conclusões
A capacidade de degradação de petróleo pelas seis bactérias foi aumentada
utilizando meio INPA quando comparado ao BH.
A solução INPA apresentou ser uma alternativa viável como técnica de
bioestímulo, pelo uso de nutrientes que favorecem o crescimento de microrganismos
naturais de ecossistemas contaminados.
Agradecimentos
Ao INPA e UEA pelo apoio da infraestrutura e, CNPq, FAPEAM e FINEP, pelo apoio
financeiro para a realização dessa pesquisa.
224
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Análise comparativa de captação de fosfato usando bactérias isoladas do
rio Negro e rio Solimões Nonato L. da S.
1, Nascimento N. J. C. do
2, Silva M. da S.
3 ,Santos S. F.
4, Mota A. J.
5
1 Graduanda de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Amazonas,
2 Graduanda de
Zootecnia da Universidade Federal do Amazonas, 3Mestrando de Biotecnologia na Universidade
Federal da Amazonas, 4
Pesquisadora da Universidade Federal do Amazonas, 5Docente da
Universidade Federal do Amazonas.
E-mails: [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected] , [email protected]
Resumo
O fósforo é um dos elementos mais importantes para os seres vivos por ser constituinte de
várias moléculas essenciais sem as quais não existiria vida. Porém, há uma possível crise
desse elemento, devido à grande exploração de suas jazidas. Apesar de finito, o fósforo
pode ser reciclado através de processos químicos e biológicos, sendo este último
empregando microrganismos. Estudos limnológicos mostram que há uma diferença de
riqueza e limitação desse nutriente entre os rios Solimões e Negro, respectivamente. Logo,
a hipótese que naturalmente surge é que a pressão seletiva do rio Negro selecione
captadores eficientes de fosfato. O objetivo foi comparar a capacidade de captação de
fosfato entre as cepas isoladas dos dois rios. Foram isoladas 756 bactérias desses ambientes
e até o momento foi possível testar 55 isolados usando um meio de cultura salino e com
baixa concentração de fosfato. A mensuração da captação de fosfato foi feita por diferença
de concentração do elemento existente no meio de cultura no início do experimento menos
a concentração residual depois do cultivo. De forma qualitativa foi possível observar que
houve uma maior prevalência de bactérias eficientes na captação de fosfato isoladas a
partir do rio Negro.
Palavras-chave: Captação de Fosfato, Regulon PHO, Microbiologia, Sistemas PIT/PST
Introdução
O fósforo é um dos elementos mais importantes para a existência e manutenção dos
seres vivos. É constituinte, por exemplo, do material genético, além de lipídios, proteínas e
açúcares (Wanner, 1993; 1996), a vida, portanto, seria inviável em uma eventual escassez
desse nutriente.
O fósforo é explorado principalmente pela indústria de fertilizantes, visto que é um
dos três nutrientes necessários para o crescimento das plantas, juntamente com o
226
Nitrogênio (N) e o Potássio (K) (Abelson, 1999). Porém, uma possível crise do elemento
fósforo vem sendo discutida pelos especialistas há algumas décadas, devido à grande
exploração das jazidas de rochas fosfáticas pelo mundo (Hubbert, 1956). De acordo com o
United States Geological Survey (USGS), a estimativa (2010) de exploração
economicamente viável da reserva mundial de fosfato, com a tecnologia existente à época,
é da ordem de 16.000 Mt (megatonelada = 1 milhão de tonelada). Em 2011, já haviam sido
extraídas 191 Mt de rocha fosfática, e nesse ritmo de consumo, as reservas de fósforo irão
se esgotar num prazo de 80 anos (Jasinski, 2012). Colheitas sucessivas que retiram o
fósforo do solo e o crescimento populacional, que acelera a taxa de depleção de suas
reservas, são outros fatores que contribuem para um cenário preocupante em relação à crise
do fósforo.
Não há nenhum substituto para o fósforo na natureza. Porém, diferentemente do
petróleo, este elemento pode ser reciclado. Existem maneiras de recuperação/captação de
fosfato do meio ambiente, como a recuperação química do fosfato a partir de águas
residuais e uso de microrganismos.
Os microrganismos armazenam naturalmente fosfato na forma de polifosfato
inorgânico, polímero com cadeias de dezenas a centenas de resíduos de fosfato, os quais
podem ser clivados e liberar moléculas de ortofosfato (Rao et al., 1999).
O processo biológico de remoção de Pi de águas residuárias, por exemplo, tem sido
objeto de pesquisas para compreender melhor os mecanismos utilizados pelos
microrganismos para captar Pi e possibilitar a substituição do processo de remoção
química do fosfato. Bactérias como Escherichia coli (Taschner et al. 2004) e Pseudomonas
aeruginosa, são protagonistas em estudos no tema “captação de fosfato”. As descobertas
feitas até o momento levaram à descrição de um conjunto de genes, denominado Regulon
PHO, responsável pelo controle de proteínas relacionadas ao metabolismo de fosfato em
condições limitantes desse nutriente, em geral abaixo de 4 mM.
Na natureza, as plantas e animais perecem e os microrganismos degradam moléculas
complexas ao nível de estruturas químicas simples que são então utilizadas para o
crescimento de outras plantas e animais, constituindo um ciclo fechado e contínuo. Antes
do advento da Revolução Verde, a resposta à depleção de fosfatos e de outros nutrientes,
era, entre outras, devolver estrume animal para cultivar o solo. Só nos EUA, mais de 1.800
Mt de estrume animal são produzidos anualmente. Porém, a agricultura necessária para
alimentar 7 bilhões de pessoas não pode apoiar-se neste tipo de adubação primitiva.
227
Sendo o fósforo um mineral “finito e insubstituível”, há uma grande preocupação com
a escassez desse elemento dentro de algumas décadas, causada pelo esgotamento das
reservas naturais. A “reciclagem contínua” constitui o “motif” básico do ecossistema
global, mas o homem tende a interromper este balanço ecológico natural, introduzindo um
sistema linear para fora do ciclo, extraindo matérias-primas, drenando recursos naturais
finitos e produzindo bioprodutos prejudiciais durante o processo. Há necessidade de uma
intercessão neste processo, evitando desta forma o acúmulo de lixos tóxicos, o
esgotamento de recursos naturais e o perecimento do ecossistema.
A reciclagem do fosfato é uma alternativa. O processo químico já está bem
estabelecido, principalmente aqueles voltados para a formação de cristais de estruvita.
Entretanto as pesquisas agora avançam para a fronteira da recuperação biológica, como por
exemplo, o projeto Phos Farm coordenado pela companhia Fraunhofer Institute for
Interfacial Engineering and Biotechnology IGB, que usa enzimas imobilizadas para isolar
fosfatos ligados a compostos orgânicos/bioquímicos. Nesse projeto, estrumes suínos,
bovinos e de aves apresentam mais de 50% de fósforo na forma de compostos orgânicos.
Contudo, o custo do processo encarece o produto final, os fertilizantes, o que ainda
inviabiliza uma aplicação comercial.
Outra alternativa é o uso de microrganismos eficientes na captação de fosfato e com
grande capacidade para estocá-lo na forma de polímeros. Nesse sentido, duas frentes se
destacam: o uso de microalgas e o uso de bactérias. É interessante notar que tanto algas
como bactérias usam o mesmo mecanismo genético para captura e estoque de fosfato, o
regulon PHO, o qual controla vários genes que respondem à carência de fosfato. O regulon
PHO de Escherichia coli é um dos mais conhecidos, composto por pelo menos 31 genes e
operons (Wanner, 1996; Baek e Lee, 2006).
Esse regulon é ativado apenas em concentrações de extrema carência de fosfato
(Lamache et al. 2008), abaixo de 4 µmM. Assim, espera-se que ambientes onde
naturalmente a oferta desse nutriente seja baixa, a pressão seletiva tenha selecionado
bactérias com potencial de captação mais eficiente de fosfato quando comparado com
bactérias que vivem em outros ambientes ricos nesse mineral. No presente estudo
resolvemos testar essa hipótese e isolamos bactérias tanto do Rio Negro, devido à sua
característica de baixa concentração de fosfato, cerca de 30 µM, sugerindo que as bactérias
que naturalmente crescem neste ambiente devem estar expressando um sistema de
incorporação de fosfato mais eficiente, e também bactérias isoladas do Rio Solimões,
228
ambiente rico em fosfato e, portanto, com uma microbiota menos eficiente na captação
desse nutriente.
Material e Métodos
As amostras foram coletadas em quatro pontos: (1) rio Araçá (afluente do rio
Negro); (2) rio Solimões próximo à cidade de Manacapuru; (3) rio Negro, nas
dependências do Centro de Projetos e Estudos Ambientais do Amazonas e (4) Fazenda
Experimental da UFAM. As coletas foram realizadas nos meses de Fevereiro a Março de
2015 na profundidade de 15 cm, conforme determina CETESB (2011) para esse tipo de
coleta.
As amostras coletadas foram diluídas sucessivamente em 0,9% Solução Salina até a
concentração de 10-5
. Cada diluição, incluindo a amostra não diluída, foi semeada pela
técnica de espalhamento de placa no meio de cultura Ágar Triptona de Soja (TSA) e Ágar
Luria-Bertuni (LB) e incubadas a 28°C pelo período de 24 horas (Hitchins et al. 1992). Os
isolados foram categorizados de acordo com a coloração Gram e depois criopreservados
em LB 15% glicerol, em ultracongelador -70°C.
O teste de verificação da eficiência de algumas bactérias em captar fosfato consiste
em medir a concentração de fosfato inorgânico remanescente no sobrenadante do meio de
cultura em que as bactérias foram cultivadas (Chen et al. 1956). A quantificação de fosfato
remanescente baseia-se em uma solução reveladora duas vezes concentrada: 1 volume de
167 mM de ácido sulfúrico, 1 volume de 2,5% de molibdato de amônia, 1 volume de 10%
de ácido ascórbico e 2 volumes de água deionizada. Para curva de calibração mistura-se
2X reagente de trabalho e fosfato de potássio (KH2PO4) volume/volume para as seguintes
concentrações finais de fosfato de sódio: 0,16 mM; 0,08 mM; 0,04 mM; 0,02 mM; 0,01
mM.
As bactérias foram cultivadas em meio de cultura, denominado TGP (Tris, Glicose
e Fosfato) (Tabela 1) durante 18 horas a 37°C com agitação.
Após 18 horas, as bactérias cultivadas foram centrifugadas por 10 min a 5.000 g. O
sobrenadante foi coletado e diluído 50 vezes para então ser misturado ao reagente de
trabalho volume/volume e incubado a 37°C por um intervalo de uma a duas horas. A
reação entre o fosfato remanescente com molibdato de amônio e posterior redução com
ácido ascórbico resulta na formação de um complexo de cor azul, cuja intensidade da cor
está diretamente relacionada à concentração de fosfato; o teste colorimétrico pode ser
229
quantificado por absorbância utilizando espectrofotômetro ajustado para o comprimento de
onda de 820 nm. (Chen et al., 1956).
Tabela 5: Meio de Cultivo TGP
Composição Concentração
Glicose 0,4%
Cloreto de sódio 4,68 g.L-1
Cloreto de potássio 1,5 g.L-1
Cloreto de amônia 1,08 g.L-1
Tris-base 14,52 g.L-1
Cloreto de magnésio 0,2 g.L-1
Sulfato de sódio 0,35 g.L-1
Cloreto de cálcio 0,1 M
Cloreto de ferro 1 mM
Cloreto de zinco 1 mM
Fosfato de potássio 4 mM
Fonte: Chen et al. (1956)
Para transformar os valores absolutos da absorbância em concentração de Pi foi
utilizada uma equação da reta calculada a partir dos valores obtidos na curva de calibração,
tomada por referência.
Duas cepas de Pseudomonas aeruginosa foram usadas como controle. Uma cepa
selvagem, usada como controle negativo de captação de Pi, e uma geneticamente
modificada, ∆phoU, que capta eficientemente fosfato de forma constitutiva.
Essa metodologia foi adaptada para microplacas de 96 poços, a fim de economizar
tempo e reagentes, visto a quantidade de amostras a serem processadas. Para tanto, as
bactérias foram cultivadas em microplacas de 96 poços contendo 100 µl TGP por 18h e
centrifugadas a 2.500 g por 20 min. Em seguida 2 µL do sobrenadante foram transferidos
para nova placa contendo 98 µL de água ultrapura e 100 µL da solução reveladora,
incubada a 37°C/1h e lido em λ de 820 nm.
Resultados e Discussão
Dos quatro locais de coleta, foram isoladas e preservadas 756 bactérias. Dessas, 39%
foram do Rio Araçá, 35% do Rio Solimões, 19% do Rio Negro (CEPEAM) e 7% da
Fazenda Experimental da UFAM (Fig. 1). Quanto à forma, há predominância de bacilos e
quanto à estrutura da parede, há predominância de Gram (+) (Fig. 2). Segundo Madigan
(2010), a maioria das bactérias encontradas no meio ambiente é Gram (+) na forma de
bacilo.
230
Figura 3. Percentual de bactérias isoladas em cada ponto de coleta
Figura 4. Análise dos perfis morfotintoriais das bactérias testadas.
Um total de 756 cepas foram isoladas e destas, foi possível testar até o momento,
quanto à capacidade de captação de fosfato, apenas 55. Dessas, 10 captaram pelo menos
50% do fosfato total disponível no meio mínimo TGP.
De acordo com a hipótese proposta nesse trabalho, espera-se uma predominância de
microrganismos eficientes na captação, isolados a partir do rio Negro. Apesar de os
resultados começarem a apontar essa tendência, ainda não temos dados suficientes para
aceitar a hipótese proposta. Na Figura 3 destacamos em vermelho os isolados que captaram
acima de 50% do fosfato total disponível no meio TGP. Observa-se que no rio Negro,
cinco isolados ultrapassaram a marca de 50%, contra um do rio Solimões. Considerando os
231
desvios, pelo menos oito isolados do rio Negro potencialmente ultrapassam 50% de
acúmulo desse nutriente.
Figura 5 - Consumo de fosfato das bactérias isoladas nos diferentes locais
Conclusão
Os resultados preliminares indicam que há uma frequência maior de bactérias que
captam fosfato de forma eficiente entre os isolados do rio Negro, resultado previsto na
hipótese proposta.
Agradecimentos
Ao CNPq e FAPEAM pelo apoio financeiro.
Referências
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Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L. Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017. Editora INPA
Biotransformação de rutina por Guinardia sp.
Ohse, K.C.
1,2, Gorayeb, G.
2, Sabino, C.V.M.
2, Lima, B.R.
4,5, Silva, F.M.A.
5, Souza,
A.Q.L1,3,5
, Souza, A.D.L1,4,5
, Lima, E.S.1,2
1PPG Bionorte,
2Faculdade de Ciências Farmacêuticas/UFAM,
3Faculdade de Ciências
Agrárias/UFAM, 4PPG Química,
5CAM-Central Analítica/UFAM,
UFAM (Universidade Federal
do Amazonas). E-mails: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
As biotransformações são reações químicas realizadas por um agente biológico, onde
ocorre a conversão de um substrato em produtos através de catalisadores enzimáticos. É
significativo usar micro-organismos para efetuar reações na síntese assimétrica de
flavonóides bioativos, devido a regiosseletividade destes. A partir de um screening,
contendo cinco linhagens de Ascomicetos endofíticos isolados de Murraya paniculata e
três moléculas, foram realizados bioensaios a fim de comparar os processos de
biotransformações dessas moléculas pelos diferentes fungos endofíticos. Foi verificado que
os resultados obtidos da biotransformação com Guignardia sp. e Rutina, apresentaram as
maiores atividades anti-glicantes. Ocorreu o desaparecimento das moléculas de rutina em
até quatro dias, visualizado nas análises de LC-MS. As analises das amostras de micélio do
fungo mostrou que a molécula não estava presente também, indicando sua
biotransformação e neste período foram detectados os íons moleculares em m/z 575 e m/z
721. As análises de PCA indicam que esses íons são os principais responsáveis pela
segregação dos grupos formados e foram estas réplicas que apresentaram a maior atividade
anti-glicante. Os grupos aparecem separados, caracterizando que são diferentes entre si
com maior intensidade.
Palavras-chave: bioconversão, fungos endofíticos, flavonóides, produtos glicados.
Introdução
As biotransformações são reações químicas realizadas por um agente biológico,
onde ocorre a conversão de um substrato, sendo esta na maioria das vezes uma substância
orgânica, em um ou mais produtos através de catalisadores enzimáticos (Demirjian et al.,
1999). A biotransformação pode ser compreendida como um conjunto de alterações
químicas (ou estruturais) que as substâncias sofrem no organismo, geralmente, ocasionadas
por processos enzimáticos, com o objetivo de formar derivados mais polares e mais
234
hidrossolúveis. As enzimas são capazes de catalisar a transformação do substrato num
único passo (Müller, 2009).
A biotransformação é uma alternativa com potencial para produzir novos
flavonóides bioativos (Bartmańska et al., 2013). Abordagens biológicas disponíveis para a
produção de flavonóides bioativos incluem biotransformação microbiológica, engenharia
enzimática e engenharia metabólica (Hosoda et al., 2013; Ludwig-Müller et al., 2014). É
significativo usar micro-organismos para efetuar reações na síntese assimétrica de
flavonóides bioativos (Shimoda et al., 2010), em vista que a transformação é um processo
que modifica as estruturas naturais e produz bioativos de flavonoides e de outras classes de
substâncias. O uso de produtores microbiológicos naturais apresentam vantagens, por
crescer rapidamente, facilidade de produção em larga escala, favorável ao meio ambiente e
livre de solventes. Além disso, a biotransformação melhora a seletividade dos produtos
naturais sem quaisquer produtos químicos tóxicos. A aplicação de microrganismos para a
biotransformação de chalconas, por exemplo, pode formar novos flavonoides por meio de
ciclização, hidroxilação, redução, metilação e reações de desidrogenação. Cepas de
Cunninghamella, Penicillium e Aspergillus são muito populares para converter flavonóides
com excelentes rendimentos, por meio de hidroxilação, desidroxilação, O-metilação, O-
desmetilação, glicosilação, desglicosilação, desidrogenação, hidrogenação, ciclização e
redução (Cao et al., 2015).
Os microrganismos endofíticos (vivem no interior do seu hospedeiro) são capazes
de produzir uma variedade de metabólitos secundários com atividades biológicas
(Masurekar, 1992; Weber et al., 2007). O endófito Guignardia sp, que ainda é pouco
explorado quanto a sua diversidade metabólica, no entanto é uma importante fonte de
produtos naturais a ser explorada na medicina, agricultura e indústria, pois possui atividade
antifúngica e bactericida, cujo principal metabólito derivado é o ácido guignardico
(Rodrigues-Heerklotz et al., 2002), usado em composições farmacêuticas. Considerando
que não há registros de estudos de biotransformação com linhagens de Guignardia
associada a rutina. Este estudo visa verificar a capacidade de Ascomicetos endofíticos em
biotransformar moléculas da classe dos flavonoides.
Material e Métodos
Os cinco Ascomicetos endofíticos utilizados foram cedidos pelo LabMicrA/UFAM
(Laboratório de Bioensaios e Microrganismos da Amazônia, da Central Analítica da
UFAM). Estes isolados foram repicados, cultivados e associados às moléculas de rutina,
235
cumarina e estigmasterol, a fim de obter as biotransformações. Os ensaios foram realizados
no LabMicrA e as análises químicas dessas biotranformações foram realizadas no
Laboratório de Espectrometria de Massas (LEMAH), da Central Analítica da Universidade
Federal do Amazonas. O teste biológico de inibição da formação de produtos glicados in
vitro foi realizado no Laboratório de Atividade Biológica (Biophar), da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal do Amazonas.
Os ascomicetos endofíticos isolados de M. paniculata no bairro do Coroado,
Manaus-AM: Guinardia sp., Colletotrichum sp., Xylaria sp., Fusarium sp. e um
ascomiceto não identificado foram repicados e cultivados de acordo com Souza (2006),
durante oito dias em temperatura de 28 °C. Após o crescimento, a biomassa foi transferida
por meio de fragmento de ágar contendo as hifas (5x5 mm), para 25 erlenmeyers de 125
mL (três fragmentos para cada erlenmeyer), contendo 30 mL de meio Saboraud HiMedia®
M063-500G, reduzindo a fonte de carbono para 50%. Os erlenmeyer foram submetidos à
agitação orbital em incubadora da Solab® a 120 rpm, a 28 °C. Após 5 dias de cultivo
foram acrescentados 10 mg de cada molécula em cada erlenmeyer. Decorrido os 10 dias
de incubação, foi realizada a filtragem a vácuo em sistema de filtração com membrana
Milipore® 0,22 µm, e o micélio foi transferido para outro erlenmeyer de 125mL contendo
50 mL de metanol.
As análises dos extratos biotransformados, obtidos a partir da técnica de extração
em fase sólida (Solid Phase Extraction-SPE), foram realizadas no aparelho de
espectrometria de massas marca Thermo Fisher, modelo íon trap (LCQ Fleet) equipado
com fonte de ionização por eletrospray (ESI) no modo negativo.
A análise multivariada foi realizada através do software Chemoface 17, versão 1.5.
Íons com intensidade abaixo de 5 % em relação ao íon mais abundante foram
negligenciados. Os componentes principais (PCA) foram calculados através da variação de
seis variáveis, correspondendo aos 54 íons registrados.
Para os ensaios de inibição de produtos glicados, foram preparadas as soluções:
tampão fosfato, fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico, solução de
albumina sérica bovina (BSA), solução de glicose 0,1M, solução de frutose 0,1M e solução
de gliceraldeído, conforme protocolo de Kumagai et al. (2015), inclusive a solução da
amostra. Estas foram incubadas em temperatura controlada de 37 °C, com ausência de luz
por 15 dias para glicose. Para avaliação da formação de produtos glicados, realizou-se
Espectrofluorometria, com comprimento de onda de excitação 370 nm e 440 nm de
emissão.
236
O delineamento experimental consistiu em biotransformações, ou seja, cinco
fungos x três moléculas usadas para a biotransformação, cujo tratamento foi 5 x 3, sendo
realizado 3 repetições (são 3 replicas de cada experimento e três análises em massas de
cada replica, totalizando 9 analises de cada experimento). Os dados gerados pela analise de
LC/MS foram tratados por PCA, conforme descrito anteriormente.
Resultados e Discussão
A partir de um screening com cinco isolados de Ascomicetos endofíticos isolados
de M. paniculata, (Guinardia sp., Colletotrichum sp., Xylaria sp., Fusarium sp. e um
ascomiceto não identificado) coletada no bairro do Coroado em Manaus/AM e três
moléculas, verificou-se que os resultados obtidos com Guignardia sp. e rutina, resultaram
no sumiço da molécula, a presença de dois ions m/z 575 e m/z 721, e a melhor atividade
anti-glicante quando comparado aos outros sistemas (Tabela 1).
Tabela 1. Reações de biotranformações utilizando linhagens de fungos endofíticos e três
substâncias naturais.
Obs.: (0 = Ausência da substância e 1 = Presença da substância, indicando o consumo ou não da substância
pelo fungo nas triplicatas de biotransformações). Guinardia sp, consumiu toda a Rutina inserida no meio, ao
longo do tempo de reação – 2-4 dias, indicada a ausência da Rutina (0 - zero)
Na análise por espectrometria de massa, o pico característico de rutina, em m/z de
609 [M-H], no tempo, após 1 dia de incubação, já com adição da substância (Figura 1).
Desta forma, a partir do padrão de espectros de massa para Rutina há indícios de
biotransformação da molécula pela linhagem de Guignardia sp. Nos espectro de ESI-MS
abaixo, pode-se observar que a rutina foi metabolizada pelo fungo após 2 dias de
incubação (Figura 1). O surgimento desses íons em determinados pontos e
desaparecimento ou diminuição de intensidade em outros pontos ao longo do tempo,
resulta da atividade enzimática realizada pelo fungo.
A análise de Componentes Principais (PCA) da biotransformação de Rutina pelo
fungo endofítico Guignardia (Figura 12), foi calculado através da variação de 54 variáveis,
Substância
Microrganismos
Fusarium sp.
Ascomiceto não identificado
Colletotrichum sp.
Xylaria sp. Guignardia sp.
Cumarina 1 1 0 - - - 1 1 1 0 0 0 1 0 0
Estigmasterol 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0
Rutina 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
237
correspondendo aos 54 íons registrados, sendo a ligação média dos seis primeiros
componentes principais, cuja variação acumulada representa 99,86%.
É possível verificar que os íons em m/z 609 (Rutina), 575 e 721, são os principais
responsáveis pela segregação dos grupos formados. Ambos os grupos, gerados a partir da
metabolização da rutina, aparecem bem separados, caracterizando possíveis diferentes
grupos entre si, com maior intensidade.
Figura 1. Espectro de íons totais (full scan) das biotransformações de Rutina pelo fungo
endofítico Guignardia sp. após 1, 4 e 8 dias de incubação da molécula no meio.
A
B
C
Após 1 dia
Após 4 dias
Após 8 dias
238
A análise de Componentes Principais (PCA) da biotransformação de Rutina pelo
fungo endofítico Guignardia (Figura 2), foi calculado através da variação de 54 variáveis,
correspondendo aos 54 íons registrados, sendo a ligação média dos seis primeiros
componentes principais, cuja variação acumulada representa 99,86 %.
Figura 2. ACP (Análise dos Componentes Principais) da dispersão dos íons de grupos das
variáveis.
Considerando a importância de se estudar fontes naturais de inibidores de formação
de produtos glicados e como também que a rutina é descrita como um anti-glicante natural,
podendo agir nas fases iniciais e tardias da glicação competindo por aminogrupos,
atenuando a glicoxidação e/ou estresse oxidativo pelo sequestro de radicais livres (Barbosa
et al., 2008), foi observado que algumas das réplicas biológicas nos ensaios apresentaram
A B
C
239
maior atividade anti-glicante, quando comparadas com outros ensaios envolvendo outros
fungos endofíticos (Figura 3) e em testes envolvendo diferentes extratos de réplicas
biológicas de amostras biotransformadas após 15 dias de cultivo (Figura 4).
Figura 3. Formação de produtos glicados de biotransformações de rutina por ascomicetos
endofiticos isolados de M. paniculata.
Figura 4. Formação de produtos glicados de biotransformações de rutina, utilizando
Guignardia sp., com maior atividade anti-glicante (Bt= biotransformação).
Conclusões
Ocorreu o metabolismo da molécula de rutina pelo ascomiceto endofítico
Guignardia sp., considerando o seu desaparecimento durante a biotransformação, em até
dois dias, visualizado nas análises de LC-MS.
A análise por CG-MS indicou que a rutina não estava presente no micélio e
portanto, há mais uma indicação de sua biotransformação.
Os produtos da biotrasnformação foram capazes de inibir a reação da frutose com a
albumina, como produtos de glicação.
05
1015202530
Form
ação
de
Pro
du
tos
Glic
ado
s %
0,000
20,000
40,000
60,000
80,000
Bt 1a Bt 1b Bt 2a Bt 2b Bt 3a Bt 3b Rutina
Form
ação
de
Pro
du
tos
Glic
ado
s %
240
Agradecimentos
À CAPES, (Pró-Amazônia), FAPEAM e Bionorte pelo incentivo e financiamentos. À
Universidade Federal do Amazonas (UFAM) pela infraestrutura ee condições de trabalho.
Referências
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Rizobactérias de solos amazônicos com habilidade de degradar gasolina obtida da
Refinaria de Manaus (REMAN)
Oliveira FR1; Moreira, FW
1, Oliveira LA
1
1Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA. E-mail: [email protected],
[email protected], [email protected]
Resumo
A contaminação ambiental por derivados do petróleo, como a gasolina, diesel e entre
outros, causa grande impacto ecológico e as técnicas para sua remediação têm recebido
destaque nas últimas décadas. O presente trabalho teve como objetivo testar isolados de
rizobactérias com habilidade em degradar gasolina. Foi utilizado o método de estriagem
em placa, contendo meio de cultura YMA modificado com 0,1 mL de gasolina como fonte
de carbono. Em seguida foi verificada a capacidade dos microrganismos em tolerar e
degradar esse composto, avaliando seu crescimento em meio contendo 0,1 mL de gasolina
na superfície da placa de Petri. Os resultados mostraram que os isolados testados foram
capazes de crescer e usar a gasolina como fonte de carbono. Do total de 90 rizobactérias
avaliadas, 12 cresceram bem usando a gasolina como fonte de carbono, pois apresentaram
um crescimento elevado na presença desse combustível no meio sólido, sendo elas,
INPA_R561, R586, R589, R610, R614, R620, R621, R626, R630, R633, R652 e R732.
Das demais, 41 mostraram crescimento moderado e as outras 37 tiveram dificuldades de
crescer nesse meio.
Palavras-chave: Biorremediação, rizobactérias, tolerância à gasolina.
Introdução
O petróleo é um composto orgânico, formado por processos biogeoquímicos,
constituído em sua maior parte por uma mistura complexa de hidrocarbonetos. A
contaminação ambiental por esta substância e por seus derivados (gasolina, álcool, diesel,
etc.) causa grande impacto ecológico e as técnicas para sua remediação têm recebido
destaque nas últimas décadas. A maior parte dos compostos de petróleo é passível de
biodegradação; no entanto, trata-se de um processo lento, podendo levar décadas até a total
descontaminação do ambiente.
243
A comercialização da gasolina tem como consequências negativas a possibilidade
de derramamento nos solos e águas regionais. Não há ainda no Estado do Amazonas,
estudos sobre o impacto negativo da contaminação dos solos e rios por esse composto
químico, bem como as características da população microbiana tolerante e possivelmente
responsável pelo processo de biorremediação natural.
Os processos biológicos de descontaminação, enquadrados na categoria de
biorremediação, utilizam, geralmente, microrganismos autóctones ou introduzidos com
capacidade de biodegradar, resultando em produtos de degradação com estruturas menos
recalcitrantes em relação à molécula original. A biorremediação é uma tecnologia que
utiliza microrganismos para minimizar ou remover poluentes, assim como os
hidrocarbonetos dos compostos derivados do petróleo no ambiente sem afetar o equilíbrio
ecológico (Autry e Ellis, 1992; Desai e Banat, 1997; Oliveira et al., 2017).
Rizobactérias tem se mostrado capazes de degradar o petróleo e o óleo diesel (Brito
et al., 2015, 2017a,b; Oliveira et al., 2017) e por serem não patogênicas ao homem, plantas
e outros animais, são uma fonte segura de microrganismos. Desse modo, elas podem
também, degradar componentes mais simples como a gasolina. O presente trabalho teve
como objetivo, avaliar a capacidade de 90 rizobactérias em degradarem a gasolina visando,
portanto, indicar as com maiores potenciais de degradação desse produto para serem
utilizados no processo de biorremediação de solos e/ou rios contaminados.
Material e Métodos
Os isolados de rizobactérias foram obtidos do banco de microrganismos do
LEBMAM (Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Microrganismos da Amazônia) no
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA. Cada isolado foi inoculado em
placas de Petri contendo meio de cultura YMA (10g manitol, 0,5 g K2HPO4, 0,2g MgSO4,
0,1g NaCl, 0,5g extrato de levedura, 15g ágar em 1 L de água destilada) (Vincent, 1970) e
incubados a 26,5º- 28º C até o crescimento das colônias (por cerca de 3 dias) para
posteriores estudos e análises com gasolina. O meio de cultivo YMA é historicamente
utilizado para o isolamento, purificação e crescimento de bactérias indutoras de nódulos
em leguminosas, genericamente denominadas de rizóbios. As bactérias utilizadas foram
isoladas dos nódulos das raízes de plantas e de solos da rizosfera coletados em diferentes
localidades de Manaus/AM e municípios circunvizinhos.
Para avaliar a capacidade de degradação da gasolina e o crescimento bacteriano,
foram testados 90 isolados de rizobactérias por meio do método proposto por Oliveira e
244
Meio Agar-Manitol Meio Agar-Gasolina
Magalhães (1999), realizado em placas de Petri contendo meio de cultura YMA
modificado, onde foram utilizados 0,1 mL de gasolina como fonte de carbono ao invés de
manitol, colocados na superfície do meio após sua solidificação nas placas de Petri. Como
controle usou-se o meio sem gasolina e os testes foram realizados em quadruplicata. As
avaliações foram feitas após 10 dias de crescimento à temperatura ambiente (± 26 ºC). O
processo de avaliação consistiu na atribuição de notas de 1,00 (sem crescimento visível) a
4,00 (máximo crescimento). Foram também atribuídas notas intermediárias, subdivididas
em 0,25, ou seja, 1,00, 1,25, 1,50, 1,75, 2,00 até 4,00. Consideraram-se como as de
melhores crescimentos, as que apresentaram notas médias acima de 3,06.
Resultados e Discussão
Na figura 1 observa-se a nota 4 de crescimento bacteriano, indicando uma
rizobactéria (INPA_R586) com crescimento elevado usando o manitol e a gasolina como
fontes de carbono.
Figura 1. Método segundo Oliveira e Magalhães, 1999 (em duplicata). Bactéria
INPA_R586 cultivada em meio Agar-Manitol e Agar-Gasolina por um período de 10 dias
em temperatura ambiente usando o método de Oliveira e Magalhães (1999).
Conforme o método proposto por Oliveira e Magalhães (1999), foi observado que
todos os isolados avaliados apresentaram crescimento no meio de cultura YMA
modificado, adicionado com 0,1 mL de gasolina, uma vez que a menor nota observada foi
1,13, indicando pouco crescimento na zona 1 de crescimento na placa de Petri (Tabela 1).
Do total de 90 isolados bacterianos avaliados, 12 cresceram bem usando a gasolina
como fonte de carbono, pois apresentaram um crescimento elevado na presença desse
combustível no meio sólido (notas acima de 3,06), sendo eles INPA_R561, R586, R589,
R610, R614, R620, R621, R626, R630, R633, R652 e R732. Dos demais isolados, 41
245
mostraram crescimento moderado (notas 2,06 - 3,00) e os outros 37 tiveram dificuldades
de crescer nesse meio (notas 1,13 - 2,00) (Tabela 1).
Observa-se (Tabela 1), que houve pouca diferença em relação ao crescimento dos
isolados nos dois meios utlizados (Agar-Manitol e Agar-Gasolina), uma vez que as
bactérias que cresceram bem em manitol também mostraram bom crescimento no meio
contendo gasolina e, as que tiveram dificuldades para usarem o manitol também
apresentaram baixos crescimentos no meio com manitol, sem excessão para as 90
rizobactérias.
A gasolina é um dos principais produtos resultantes da destilação do petróleo,
podendo apresentar de 6-12 átomos de carbono em sua cadeia (Farias, 2008);. É um
composto complexo e que pode servir como fonte utilizável no metabolismo de
determinados microrganismos. Esses podem ser utilizados por meio do uso de suas
enzimas capazes de degradar essa substância presente em solos ou outros ambientes
contaminados.
Ecologicamente, microrganismos degradadores de hidrocarbonetos são amplamente
distribuídos e as dificuldades encontradas para caracterizar comunidades microbianas de
ambientes impactados por esses compostos são agravadas pela grande quantidade de
substratos específicos e interações metabólicas possíveis (Wetler-Tonini et al., 2011). Tais
microrganismos podem ser encontrados no próprio ambiente impactado, sendo na sua
maioria, os responsáveis pelo desaparecimento dos contaminantes e são capazes de
degradar a maioria desses compostos para suprir as suas necessidades energéticas e de
crescimento, iniciando assim o processo de biodegradação (Bernoth et al,. 2000). Alguns
trabalhos foram realizados utilizando isolados de rizóbios na degradação de compostos
derivados do petróleo (Lindström et al. 2003; Poonthrigpun et al. 2006; Coelho et al. 2010;
Wen et al. 2011; Brito et al., 2015, 2017 a,b).
A grande motivação de pesquisas e estudos de biodegradação é, sem dúvida, a busca de
microrganismos versáteis capazes de degradar, de maneira eficiente, uma grande variedade
de poluentes a baixo custo operacional, utilizando aqueles que não prejudiquem a vida
existente nas áreas contaminadas. Entre as rizobactérias de interesse, o gênero Rhizobium
apresenta características adequadas para ser utilizado num processo de biorremediação,
pois além de apresentar todas as características citadas, não são patogênicas, não
prejudicando assim o homem, a fauna e a flora existentes no meio ambiente.
246
Tabela 1. Crescimento dos isolados de rizobactérias em meio Agar-manitol (M) e Agar-
gasolina (G) após 10 dias de incubação à temperatura ambiente (Notas segundo Oliveira e
Magalhães, 1999).
Com base nos resultados obtidos, foi possível constatar que todas as rizobactérias
testadas apresentaram crescimento no meio contendo gasolina, sendo que 12 se
Isolados M G Isolados M G Isolados M G
INPA R007 1,3 1,3 INPA R571 2,0 2,0 INPA R621 3,8 3,4
INPA R020 2,6 2,4 INPA R572 1,3 1,3 INPA R624 2,0 1,7
INPA R028 2,3 2,8 INPA R573 2,0 2,0 INPA R625 2,0 2,0
INPA R076 2,3 2,4 INPA R575 2,7 2,3 INPA R626 3,9 3,9
INPA R178 2,3 2,3 INPA R576 2,1 2,1 INPA R628 2,9 2,4
INPA R183 3,0 2,7 INPA R577 2,9 2,9 INPA R630 3,8 3,7
INPA R529 2,1 2,5 INPA R578 1,7 1,3 INPA R631 3,0 2,5
INPA R537 2,5 2,4 INPA R580 3,0 2,5 INPA R633 3,9 3,1
INPA R545 2,6 2,4 INPA R581 2,0 2,0 INPA R634 3,0 2,6
INPA R546 2,4 2,1 INPA R582 2,8 2,9 INPA R640 3,0 2,5
INPA R547 3,0 2,8 INPA R583 1,7 1,3 INPA R642 2,0 2,0
INPA R548 2,0 2,0 INPA R586 4,0 4,0 INPA R644 3,0 2,5
INPA R549 3,0 2,5 INPA R587 2,0 1,8 INPA R645 3,0 2,8
INPA R550 3,0 2,5 INPA R588 2,4 2,3 INPA R646 1,8 1,6
INPA R551 2,0 1,5 INPA R589 3,1 3,1 INPA R649 1,3 1,3
INPA R552 2,6 2,9 INPA R590 2,5 3,0 INPA R650 2,6 2,1
INPA R553 3,0 2,5 INPA R592 1,9 1,9 INPA R650 2,0 2,0
INPA R554 3,0 3,0 INPA R593 2,0 1,8 INPA R651 3,0 2,5
INPA R555 2,6 2,1 INPA R595 3,0 2,9 INPA R652 4,0 3,5
INPA R556 3,0 2,5 INPA R597 1,9 1,4 INPA R654 1,4 1,5
INPA R557 2,0 2,0 INPA R599 2,0 2,0 INPA R655 2,0 1,5
INPA R558 2,5 2,1 INPA R607 1,3 1,3 INPA R656 1,8 1,6
INPA R559 1,7 2,0 INPA R610 3,8 3,2 INPA R662 2,2 2,3
INPA R560 3,0 2,5 INPA R612 3,0 2,5 INPA R666 3,0 2,5
INPA R561 3,9 3,1 INPA R613 2,0 1,5 INPA R667 1,6 1,6
INPA R562 1,4 1,4 INPA R614 3,1 3,3 INPA R668 2,0 1,6
INPA R563 1,9 1,9 INPA R615 2,0 1,6 INPA R674 1,3 1,3
INPA R566 2,5 3,0 INPA R618 2,0 1,5 INPA R675 1,4 1,6
INPA R568 2,5 2,1 INPA R619 2,0 1,6 INPA R676 1,4 1,3
INPA R569 3,0 2,7 INPA R620 3,2 3,8 INPA R732 4,0 3,7
247
sobressaíram em relação às demais. Há, entretanto, necessidade de uma busca de um maior
número de isolados e testes mais aprofundados para avaliar a eficiência enzimática dessas
bactérias, como forma de indicar as mais aptas para serem utilizadas no processo de
biorremediação de solos e rios amazônicos contaminados.
Conclusões
Do total de 90 isolados de rizobacterias, apenas doze mostraram-se altamente
capazes de degradarem a gasolina, sendo eles, INPA_R561, R586, R589, R610, R614,
R620, R621, R626, R630, R633, R652 e R732.
Dos demais isolados, 41 mostraram crescimento moderado e os outros 37 tiveram
dificuldades de crescer no meio contendo gasolina.
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Rhizobactérias de solos amazônicos com habilidade para degradar óleo
diesel
Oliveira, K.K.C.1; Moreira, F.W.
2; Oliveira, L.A.
2
1PPG Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas;
2Pesquisador, Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia. E-mails: [email protected], [email protected],
Resumo
O óleo é um combustível derivado do petróleo sendo constituído basicamente
por hidrocarbonetos. A contaminação de solos por este combustível tem aumentado devido
a acidentes causados durante o seu transporte e armazenamento. Por isso, é necessária a
aplicação de técnicas para descontaminação de ambientes poluídos. Assim, o objetivo
deste trabalho foi avaliar o crescimento e tolerância de rizobactérias de solos da Amazônia
na presença de óleo diesel. Foi utilizado o método de estriagem em placas contendo óleo
diesel como fonte de carbono. A avaliação consistiu na avaliação de crescimento e
atribuição de notas, classificando as bactérias como baixo, moderado ou alto crescimento.
Os resultados mostraram que a maior parte dos isolados testados. A maior parte das
rizobactérias testadas mostrou-se tolerante à presença de óleo diesel no meio de cultivo,
além de utilizá-lo como fonte de carbono para seu crescimento. Do total de 81
rizobactérias, dez apresentaram baixo crescimento, oito moderado e, 63 alto crescimento
em meio com óleo diesel. Destas últimas, INPA_R28, R76, R233, R517, R555, R557,
R560, R569, R572, R575, R577, R578, R586, R602, R613, R626, R627, R633, R648,
R649, R654, R655, R657, R668, R674 e R676, mostraram crescimento elevado no 3º dia
de incubação no meio com óleo diesel e poderão então, ser submetidas a novos testes
visando uma futura utilização na biorremediação de solos contaminados com esse óleo.
Palavras-chave: Rizobactérias, biorremediação, Amazônia.
Introdução
O óleo diesel é proveniente do processo de refinamento do petróleo cru, via
destilação fracionada. É uma mistura complexa composta principalmente por alcanos de
cadeia linear, mas também possui hidrocarbonetos de cadeia ramificada e compostos
aromáticos (Knothe, 2010). Estes, por sua vez, são moléculas que possuem átomos de
carbono e hidrogênio, podendo também ser encontrados enxofre, nitrogênio e oxigênio em
menores quantidades (Bento, 2005).
250
A intensificação na exploração do petróleo como fonte de energia gera um aumento
dos riscos de contaminação ambiental ligado às etapas de extração, refino, transporte,
armazenamento e distribuição deste e de seus derivados, como o óleo diesel (Das e
Chandran, 2011).
Como uma das estratégias para recuperar e minimizar estes impactos destaca-se a
biorremediação, que pode ser definida como uma tecnologia para o tratamento de áreas
contaminadas através do uso de agentes biológicos capazes de modificar ou decompor
determinados poluentes. Este é um processo realizado por meio da adição de
microrganismos nativos ou exógenos, cujo maior benefício é a mineralização do poluente,
levando por fim à formação de CO2, H2O e biomassa (Schneider, 1990; Prince, 1996).
Além disso, seu conjunto de tecnologias é compatível com as rotas biogeoquímicas
naturais de reciclagem de nutrientes (El Fantroussi e Agathos, 2005).
A biodegradação de hidrocarbonetos por população natural de microrganismos é
uma prática usada em diversas regiões do planeta. Para comprovar esta capacidade, foram
realizadas diversas pesquisas usando bactérias e fungos degradadores de petróleo, gasolina
e óleo diesel (Saratale et al., 2007; Souza, 2009; Zanaroli et al., 2010; Brito et al., 2015;
2017a,b; Oliveira et al., 2017). Os microrganismos são os seres vivos preferenciais para
desempenhar essa função devido à sua natureza ubíqua, sua ampla diversidade genética e
catalítica e capacidade de atuação sob condições ambientais extremas. Estas e outras
características têm levado a busca pela compreensão de suas rotas biogeoquímicas de
degradação, caracterização genética e ao desenvolvimento de metodologias para aplicação
desses organismos em campo (Megharaj et al., 2011; Moraes e Tornisielo, 2009).
Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de rizobactérias
usarem o óleo diesel para seus crescimentos em meio de cultivo, visando selecionar as
mais aptas para serem utilizadas no processo de biorremediação de solos contaminados
com este hidrocarboneto.
Material e Métodos
Foram selecionadas 81 rizobactérias do banco de microrganismos do LEBMAM
(Laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Microrganismos da Amazônia) do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA. Estas foram reativadas em meio Yeast
Manitol Ágar (YMA) (Vincent, 1970) e incubadas à temperatura ambiente por três dias.
251
Para avaliar a capacidade de degradação de óleo diesel e o crescimento bacteriano,
as rizobactérias foram testadas pelo método de riscagem de Oliveira e Magalhães (1999)
modificado, sendo inoculadas em placas de Petri contendo meio de cultura YA, utilizando-
se 0,1 mL de óleo diesel como fonte de carbono. Como controle utilizou-se o meio de
cultura YMA. Esse teste foi realizado em quadruplicata. As avaliações foram feitas a cada
três dias, no período total de 15 dias, no qual as bactérias foram mantidas em laboratório à
temperatura ambiente. De acordo com o desenvolvimento das colônias nas quatro zonas da
placa (Figura 1), foram atribuídos valores para o crescimento de cada microrganismo
variando de 1 (sem crescimento visível na placa) a 4 (máximo crescimento em todas as
zonas), segundo escala apresentada na Figura 2. Com base no crescimento em placas de
Petri, os isolados foram classificados como pouco, moderado ou elevado crescimento
(Tabela 1). Esta análise foi feita ao 6º dia de incubação e serviu para identificar os isolados
com maior potencial a serem utilizados em testes posteriores.
Figura 1. Esquema ilustrando o método de riscagem para avaliação
do crescimento de bactérias (Oliveira e Magalhães, 1999).
Figura 2 - Valores atribuídos de acordo com o crescimento
bacteriano (Oliveira e Magalhães, 1999).
252
Tabela 1. Faixa de pontuação para avaliação do
crescimento bacteriano (Oliveira e Magalhães,
1999).
Crescimento Pontuação
Pouco 1,00 - 2,00
Moderado 2,06 – 3,00
Elevado 3,06 – 4,00
Resultados e Discussão
Todas as rizobactérias testadas neste trabalho foram capazes de crescer em meio de
cultura YA acrescido de óleo diesel (Figura 3, Tabela 2), adaptando-se a este
hidrocarboneto e usando-o como fonte de carbono. Entretanto, é necessária a execução de
novos testes para verificar o potencial destas bactérias para serem utilizadas em processos
de biorremediação.
Figura 3. Crescimento de rizobactéria em meio com óleo diesel após três dias de incubação
A fim de demonstrar o potencial de bactérias na biorremediação de óleo diesel,
vários trabalhos têm sido realizados. Souza (2009) realizou testes de biodegradação de óleo
diesel em água do mar utilizando um isolado de Candida lipolytica, obtendo resultados
positivos. Este autor concluiu que este microrganismo tem potencial para ser utilizado em
processos de biorremediação de ambientes marinhos contaminados por óleo diesel e outros
derivados de petróleo. Silva (2012) isolou microrganismos de amostras poluídas por
A
253
derivados de petróleo, a partir dos quais formou consórcios, testando sua eficiência em
biodegradar óleo diesel. Os microrganismos com maiores potencialidades para esta
finalidade e que não desenvolveram atividade antagônica foram Staphylococcus
saprophyticus, Serratia marcescens, Rhodotorula aurantiaca e Candida ernobii.
Na tabela 2 pode-se observar o crescimento das rizobactérias utilizando as duas
fontes de carbono (óleo diesel e manitol), notando-se diferenças com relação aos tempos de
crescimento. Isso sugere que, além da velocidade de crescimento natural de cada
rizobactéria, cada uma possui um tempo de adaptação às condições impostas pela fonte de
carbono no meio.
Dentre os isolados analisados, cinco (6,17%) apresentaram baixo crescimento, 11
(13,58%) moderado e 65 (80,2%) alto crescimento no 6º dia de incubação em meio YMA
(controle). Em meio com óleo diesel, dez (12,3%) apresentaram baixo crescimento, oito
(9,9%) moderado e 63 (77,8%) alto crescimento. Assim, observa-se que praticamente o
mesmo número de bactérias que tiveram crescimento moderado e alto em YMA (76) foi
capaz de se adaptar e crescer em meio contendo óleo diesel (71) como fonte de carbono.
As rizobactérias com melhor crescimento em meio YA com óleo diesel foram
INPA_R28, R76, R233, R517, R555, R557, R560, R569, R572, R575, R577, R578, R586,
R602, R613, R626, R627, R633, R648, R649, R654, R655, R657, R668, R674 e R676,
todas com notas que variaram de 3,06 a 4,00 no 3º dia de incubação. Estas bactérias
poderão então ser submetidas a novos testes para futura utilização na biorremediação de
solos contaminados com óleo diesel.
Conclusões
A maior parte das rizobactérias testadas mostrou-se tolerante à presença de óleo
diesel no meio de cultivo, além de utilizá-lo como fonte de carbono para seu crescimento.
As rizobactérias mostraram poucas diferenças quando comparadas ao meio de
cultivo contendo manitol como fonte de carbono.
As 26 rizobactérias que apresentaram crescimentos superiores a 3,0 aos três dias de
avaliação nas placas de Petri são as mais promissoras para futuros testes visando indicar
como inoculantes para biorremediar solos contaminados com óleo diesel.
254
Agradecimentos
Ao INPA pelo apoio de infraestrutura e, ao CNPq, FINEP e FAPEAM pelos recursos
financeiros. À FINEP pela bolsa de pesquisa dada à primeira autora do trabalho.
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256
Isolado 3º dia 6º dia 9º dia 12º dia 15º dia
Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel
INPA_R1 2,31 1,87 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R7 2,06 2,18 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R20 2,00 1,00 2,25 1,00 2,25 1,00 2,25 1,06 2,25 1,06
INPA_R21 1,75 1,31 3,62 3,12 3,75 3,37 3,75 3,37 3,75 3,56
INPA_R26 2,87 2,81 3,37 3,19 3,37 3,19 3,50 3,19 3,50 3,19
INPA_R28 3,62 3,75 3,62 3,81 3,62 3,81 3,62 3,81 3,62 3,94
INPA_R76 3,75 3,37 3,75 3,56 3,75 3,56 3,75 3,56 3,75 3,56
INPA_R178 3,12 2,19 3,75 2,44 3,75 2,75 3,75 2,81 3,75 2,87
INPA_183 1,00 1,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R233 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R505 2,75 2,81 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R517 4,00 3,56 4,00 3,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R529 2,19 2,00 2,75 3,19 2,75 3,75 3,06 3,75 3,06 3,75
INPA_R532 2,62 1,37 3,87 2,75 4,00 3,37 4,00 3,37 4,00 3,50
INPA_R546 1,12 1,00 1,62 1,50 3,00 2,69 3,62 3,87 3,87 3,87
INPA_R547 1,25 1,37 2,62 2,31 3,19 4,00 3,19 4,00 3,31 4,00
INPA_R548 1,25 2,37 1,62 3,87 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R549 1,31 1,06 3,75 3,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R550 1,06 1,00 2,25 1,50 3,25 3,44 3,25 3,50 3,25 3,50
INPA_R551 1,00 1,00 3,37 4,00 3,87 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R552 2,00 2,12 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R553 1,50 1,00 3,56 2,31 3,87 4,00 3,87 4,00 3,87 4,00
INPA_R555 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R556 1,00 1,25 2,37 4,00 3,62 4,00 3,62 4,00 3,62 4,00
INPA_R557 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R560 2,37 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
Tabela 2. Crescimento de rizobactérias em meio sólido utilizando manitol e óleo diesel como fontes de carbono
257
Isolado 3º dia 6º dia 9º dia 12º dia 15º dia
Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel
INPA_R561 3,44 3,00 4,00 3,56 4,00 3,81 4,00 3,87 4,00 3,87
INPA_R562 1,00 1,00 2,25 1,44 2,94 3,81 3,19 4,00 3,37 4,00
INPA_R564 3,37 3,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R566 1,00 1,00 3,81 3,19 4,00 3,75 4,00 3,87 4,00 3,87
INPA_R568 2,12 2,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R569 3,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R572 3,37 3,50 3,50 3,62 3,62 3,75 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R575 2,00 3,25 3,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R576 1,00 1,00 3,93 3,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R577 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R578 2,12 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R580 1,25 1,00 3,25 2,12 3,81 3,87 3,81 3,87 4,00 4,00
INPA_R581 1,00 1,00 3,50 3,87 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R582 1,00 1,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R583 2,44 3,00 3,94 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R586 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R588 1,00 1,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R589 1,37 1,00 1,87 1,75 2,62 2,00 3,87 2,37 3,87 2,50
INPA_R590 1,87 1,00 3,06 2,12 3,37 3,87 3,37 3,87 3,37 3,87
INPA_R592 1,50 1,25 2,31 3,62 4,00 3,87 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R593 2,06 2,06 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R595 2,00 2,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R602 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R610 2,19 1,19 4,00 2,00 4,00 3,81 4,00 3,87 4,00 3,87
INPA_R613 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R614 3,37 3,00 3,75 3,94 3,94 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
258
Isolado 3º dia 6º dia 9º dia 12º dia 15º dia
Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel Manitol Diesel
INPA_R615 1,19 1,00 2,87 1,44 3,56 4,00 3,56 4,00 3,69 4,00
INPA_R618 3,25 3,00 3,87 3,12 4,00 3,31 4,00 3,50 4,00 3,50
INPA_R620 3,56 2,06 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R621 2,25 2,75 3,00 3,44 3,25 3,81 3,75 3,87 3,87 4,00
INPA_R624 1,00 1,00 3,50 4,00 3,87 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R626 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R627 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R630 3,00 2,06 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R631 2,00 2,25 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R633 2,12 3,12 3,56 4,00 3,81 4,00 3,81 4,00 3,81 4,00
INPA_R634 1,81 1,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R640 1,75 1,00 2,25 1,00 3,00 2,69 3,62 3,25 4,00 3,44
INPA_R642 1,00 1,12 2,00 4,00 3,62 4,00 3,62 4,00 3,62 4,00
INPA_R644 1,00 1,00 3,81 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R645 1,00 1,06 3,44 3,94 3,75 3,94 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R648 3,62 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R649 3,12 3,19 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R651 1,06 1,00 4,00 3,56 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R652 1,06 1,00 3,50 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R654 1,25 3,50 1,25 3,62 2,06 3,75 2,06 3,75 2,06 3,75
INPA_R655 4,00 3,25 4,00 3,62 4,00 3,94 4,00 3,94 4,00 3,94
INPA_R657 3,00 3,06 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R662 1,25 1,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
INPA_R668 3,31 3,06 4,00 3,50 4,00 3,56 4,00 3,69 4,00 3,75
INPA_R674 3,25 3,44 3,62 3,87 3,69 4,00 3,75 4,00 3,75 4,00
INPA_R676 4,00 3,75 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
259
Oliveira L.A., Bentes J.L.S., Jesus M.A., Rocha L.C., Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L.
Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017. Editora INPA
Uso de resíduos de abacaxi (Ananas comosus) e maracujá (Passiflora
edulis) para a produção de bioplásticos por bactérias.
Oliveira R. C.1, Santos J. P.
1, Santos S. F.
2, Mota A. J.
3
1 Graduação em Engenharia de Alimentos, Universidade Federal do Amazonas – UFAM,
2
Graduação em Ciências Biológicas, Centro Universitário do Norte – UNINORTE, 3
Professsor,
Universidade Federal do Amazonas - UFAM. Emails: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
Os polihidroxialcanoatos (PHAs), biopolímeros armazenados por bactérias como fontes de
carbono, são alternativas viáveis aos polímeros petroquímicos, usados como matéria-prima
para os plásticos convencionais, porque possuem propriedades termoplásticas semelhantes,
porém são biodegradáveis. Contudo, o alto custo dos substratos para a sua produção é um
fator limitante. Por outro lado, o descarte inadequado de resíduos de alimentos,
provenientes de empresas alimentícias, gera impactos socioambientais, além do
desperdício energético, uma vez que esses resíduos são fontes ricas de carbono. No intuito
de solucionar os problemas com o descarte inapropriado de resíduos, e diminuir os custos
da produção de PHA, é proposto nesse trabalho um processo de reaproveitamento dos
resíduos agroindustriais, provenientes das empresas de alimentos de Manaus-AM, como
fonte de carbono para produção de PHA. Foram testadas diversas formulações de meio de
cultivo acrescido de resíduos de abacaxi e maracujá e o acúmulo de PHA foi monitorado
pelo corante vermelho do nilo. Os meios adaptados com resíduos de abacaxi e maracujá
apresentaram grande potencial para a produção de PHA, sobretudo o meio de abacaxi na
concentração de 2% (m/v).
Palavras-chave: biopolímero, polihidroxialcanoatos, resíduos de alimentos.
Introdução
A humanidade sempre busca tecnologias que ofereçam conforto às pessoas, em
geral, explorando os recursos naturais do planeta. Porém, muitas vezes esses recursos não
são aproveitados integralmente e geram mais resíduos sólidos para o meio ambiente. Nesse
contexto, esses resíduos devem ser considerados matérias-primas para a produção de novos
produtos naturais, evitando a exploração massiva dos recursos naturais e reduzir a
produção de resíduos sólidos (Andreoli et al., 2013).
260
Com o desenvolvimento de países emergentes como o Brasil, a produção de
resíduos sólidos orgânicos tem aumentado, o que tem sido responsável pela contaminação
de solos e águas superficiais e subterrâneas em áreas próximas a aterros sanitários (Herbets
et al. 2005). Além disso, esses resíduos geram “chorume”, líquidos percolados que causam
mau cheiro e atraem animais vetores de doenças (Portal Educação 2013). As indústrias de
alimentos contribuem majoritariamente na produção desses resíduos, sendo evidente a
necessidade de aproveitar e transformar essa matéria-prima rica em carbono.
Polihidroxialcanoatos são polímeros naturais sintetizados e acumulados na forma
de inclusões celulares por uma grande quantidade de bactérias, podendo representar cerca
de 80% da massa seca da célula. Esses biopolímeros armazenam energia, e ainda são
fontes de carbono para o anabolismo microbiano. (Figueiredo et al., 2014, Rodrigues,
2005, Kessler e Withoult, 2001). Os PHAs são produzidos na presença de fonte de carbono
abundante e carência de nutrientes essenciais para o crescimento celular como: nitrogênio,
oxigênio, enxofre, fósforo, magnésio entre outros.
Estes biopolímeros tem despertado interesse biotecnológico, pois os mesmos
apresentam características físicas, químicas e termoplásticas muito semelhantes as dos
polímeros de natureza petroquímica (ex: polipropileno) (Bucci, 2003) que são largamente
utilizados em todos os setores das indústrias em geral, e que se acumulam densamente nos
lixos urbanos, pois o tempo de decomposição é excessivamente longo. Em contraste, os
PHAs são completamente biodegradáveis na presença de micro-organismos, em condições
aeróbicas e anaeróbicas (Lavorato, 2008), pois são substratos que as bactérias metabolizam
em busca de carbono e energia.
Em contrapartida, a produção em escala industrial desses biopolímeros ainda é
modesta, devido ao alto custo da biomassa necessária para sua produção (glicose e
sacarose). Frente ao custo na síntese de polímeros a base de petróleo, a produção de PHA
fica para segundo plano. Uma alternativa para a solução desse problema seria reduzir o
custo dos meios de cultivo microbiano, o que podem representar até 40% de economia no
processo de produção de PHA (Figueiredo et al., 2014)
Como a grande problemática de inserir este biopolímero nas indústrias está no alto
custo da matéria-prima, e concomitantemente existe um cenário de desperdício de matéria
orgânica associado à danos ambientais, pretende-se utilizar resíduos ricos em carbono
derivados das indústrias como o abacaxi (Ananas comosus) e maracujá (Passiflora edulis)
para síntese microbiana de PHA, o que poderá contribuir para uma melhor relação
261
custo/benefício, favorecendo o crescimento desse mercado, e ainda, beneficiando a política
de uso sustentável dos recursos naturais.
Material e Métodos
As bactérias utilizadas no presente trabalho foram acessadas da coleção do
Laboratório de Biotecnologia da UFAM. As linhagem foram isoladas de diferentes
microambientes do Rio Negro. Estas bactérias foram testadas quanto à capacidade de
acumular PHA através do teste em placa com Vermelho do Nilo (Spiekerman, 1999).
Foram utilizadas 5 linhagens de bactérias: MM1.2.10-8, 2SAT1bLB, 7RP1T3LB,
MagLB e 1423. Os isolados MM1.2.10-8 e 2SAT1bLB foram coletadas no Rio Negro e
são produtoras de biopolímero. Os isolados 7RP1T3LB e MagLB também foram coletados
no Rio Negro, porém não produzem PHA e foram usados nesse trabalho como controle
negativo. O controle positivo foi realizado com a linhagem ICB/USP 1423 de Ralstonia
eutropha (cortesia do Prof. Beny Spira, ICB/USP), que acumula PHA em até 80% da sua
massa seca (Rodrigues, 2005).
O meio sintético TGP (Tris, Glicose, Fosfato), que induz a produção de PHA, foi
usado em todas as etapas do trabalho. Consiste de um meio mínimo que possui minerais
essenciais para crescimento microbiano em concentrações baixas: [4,67 g/L de NaCl; 1,49
g/L de KCl; 1,32 g/L de NH4Cl; 14,53 g/L de Tris; 0,54 g/L de KH2PO4; 17 g/L de Ágar;
0,199 g/L de MgCl2; 0,28 g/L de Na2SO4; 0,022 g/L de CaCl2; 20 g/L de Dextrose, 0,6 mL
de 1M FeCl2; 1 mL de 1M Zn2SO4; 1 mL de Elemento Traço [0.22 g/L CoCl2·6H2O, 9.70
g/L FeCl3, 7.80 g/L CaCl2, 0.12 g/L NiCl2·6H2O, 0.11 g/L CrCl3·6H2O, e 0.16 g/L
CuSO4·5H2O]] (Numata e Doi, 2012). Para indicar a produção e acúmulo de PHA foi
acrescido ao TGP, o corante vermelho do Nilo na concentração de 0,5 μg/L; o complexo
corante PHA emite um brilho rosa/lilás característico quando excitado por luz UV. Quanto
maior for o brilho, maior é a capacidade do microrganismo em produzir o biopolímero
(Spiekerman, 1999).
Com o objetivo de se obter um um extrato rico em fonte de carbono solúvel, açúcares,
os resíduos de abacaxi (Ananas comosus) e maracujá (Passiflora edulis) foram triturados
em liquidificador industrial com 250 mL água destilada nas concentrações de 10%, 6% e
2% (m/v) para abacaxi e 3%, 2% e 1% (m/v) para maracujá, com posterior filtração em
toucas do tipo turbante. O ajuste na concentração para o extrato de maracujá foi necessário
porque o resíduo é muito higroscópico, o que impedia o processo de filtração em
262
concentrações maiores. O tempo de extração foi de 20s. Após obtidos os extratos
(aproximadamente 200 mL), foi adicionado ágar para concentração final de 1,7% (m/v),
0,5 μg/L de Vermelho do Nilo. O pH foi ajustado para 7,3 e o meio foi esterilizado a 121º
C por 15 min em autoclave. As bactérias foram semeadas sobre o meio solidificado, e as
placas foram incubadas em estufa a 30 ºC durante 72h. O teste foi realizado em triplicata e
o acúmulo de PHA foi avaliado com auxílio de transluminador UV (λ 354 nM). As
bactérias também foram inoculadas no meio sintético TGP para efeitos de comparação.
Resultados e Discussão
Os ensaios com os meios de cultura modificados, i. e., suplementados com resíduos
de abacaxi e maracujá apresentaram resultados semelhantes àqueles obtidos com TGP, pois
o brilho caracterísito do complexo vermelho do Nilo PHA foi observado apenas nos
isolados produtores (Fig. 1).
Figura 1. Placa de Petri com 2% de resíduo de abacaxi (Ananas comosus) em 250 mL de
meio. As bactérias 1423(1) e 1423(2) são cepas diferentes da mesma espécie. Mag LB e
7RP1T3LB são as bactérias de controle negativo.
Observou-se maior eficiência do acúmulo de PHA para os extratos obtidos a partir
dos resíduos de abacaxi (Tabela 1), havendo ainda, uma relação entre a concentração de
resíduo e produção de PHA, uma vez que concentrações menores resultaram em brilho
mais intenso (dados não mostrados). Em estudos cinéticos para o crescimento de Ralstonia
eutropha e acúmulo de PHA, Rodrigues (2005) verificou que para a produção de PHA ser
eficiente, a concentração de carbono deve ser mantida em uma quantidade ótima.
1423 (1)
1423
(2)
2SAT1b
MM1.2.10-8
7RP1T3LB
Mag LB
263
Suwannasing et al. (2015) realizaram o teste com o resíduo de abacaxi para produção de
PHA com Bacillus sp. e em seus testes a concentração ótima foi de 3% (v/v) do suco de
resíduo do abacaxi. É preciso encontrar a concentração ótima para os resíduos usados nesse
trabalho, considerando-se o cultivar e os microrganismos empregados.
Tabela 1. Intensidade do brilho em UV para detecção da produção de PHA por bactérias
em meio de cultura com resíduos.
Legenda: +++ : Brilho intenso; ++ : Brilho moderado; + : Brilho discreto; - : Não houve brilho.
A utilização de resíduos da agroindústria como matéria-prima para outros
produtos é uma fronteira que vem sendo desafiada. O presente trabalho apresenta uma
alternativa viável que pode solucionar o problema do descarte inadequado de resíduos
orgânicos das indústrias de alimentos do Amazonas, por empregar tais resíduos na cadeia
produtiva dos biopolímeros. Assim, é possível vislumbrar em um futuro próximo, a
possibilidade de produção de bioplástico cujo valor seja competitivo com os plásticos
petroquímicos. Para que esse produto, ainda sem valor agregado, possa ser de fato utilizado
pelas indústrias de bioplásticos, é necessário realizar mais estudos sobre a cinética de
produção, a caracterização do polímero produzido e verificar condições de suplementação
que ofereçam melhores condições de acúmulo de polihidroxialcanoatos.
Conclusão
Os resíduos de abacaxi (Ananas comosus) e maracujá (Passiflora edulis) são
matérias-primas potenciais para a produção de PHA, sobretudo o resíduo de abacaxi, em
formulações com concentrações próximas a 2% (m/v).
Linhagens
Residuo
(concentração do extrato - %)
Abacaxi Maracujá
TGP
10 6 2 3 2 1
MM1.2.10-8
+ ++ +++ - - + ++
2SA1T1b LB + + +++ - - + ++
Mag LB - - - - - - -
7RP1T3LB - - - - - - -
1423 + + +++ + + + ++
264
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Distribuição de mating type e diversidade de Fusarium decemcellulare
isolados de mudas de guaranazeiro em viveiro
Queiroz C.A. de1, Sousa S.B.de
2, Hanada R.E
3, Silva G.F.
4
1;2
PPG em Biotecnologia - Universidade Federal do Amazonas / Embrapa Amazônia Ocidental; 3Pesquisador, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia;
4Pesquisador, Embrapa Amazônia
Ocidental; Email: [email protected]
Resumo
O guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis) é uma espécie nativa da região
amazônica de importância econômica devido ao alto teor de cafeínas e outros compostos
bioativos produzidos nas sementes que são utilizadas como matéria-prima para a produção
de bebidas industrializadas. Entre os problemas responsáveis pela baixa produção de
guaraná no Amazonas estão as doenças causadas por fungos, entre elas o superbrotamento
causado por Fusarium decemcellulare, que coloniza tecidos meristemáticos em mudas e
plantas adultas. Visando comparar a distribuição de mating type e diversidade genética, o
patógeno entre mudas obtidas de viveiro e plantas adultas em fase de produção, no
presente trabalho foram analisados 81 dos diferentes sintomas da doença, sendo 64 obtidos
de mudas sintomáticas e 17 de plantas cultivadas no campo. A distribuição de mating type
(Mat-1 e Mat-2) revelou uma significativa diferença na proporção 1/1 nos e entre os fungos
isolados em mudas de viveiro (58 dos 64 isolados pertencem ao Mat-1), em relação aos
isolados em condições de campo, onde a razão entre Mat-1 e Mat-2 foi igual, indicando
uma possível habilidade do patógeno em realizar reprodução sexuada e consequente
aumento da variabilidade genética em ambiente aberto. Os dados de agrupamento com
base em 72 bandas polimórficas obtidas com o marcador ISSR mostraram uma maior
correlação entre os isolados obtidos de mudas conforme o esperado. Contudo, não houve
nenhuma correlação genética entre sintomas e tipo de mating nos grupos formados.
Palavras-chave: Superbrotamento, ISSR, mating type, marcador molecular, reprodução
sexuada
Introdução
O guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis (Mart.) Ducke) é uma espécie
nativa da Amazônia de grande importância econômica para a região. As sementes de
guaraná são ricas em cafeína, flavonoides e taninos, que lhes conferem características
estimulantes e medicinais (Campos et al., 2011). Essas sementes servem de matéria-prima
266
para a produção de bebidas industrializadas, antitérmico, antidiarreico, estimulante,
analgésico e antigripal (Costa et al., 2005).
O principal produtor nacional, até a década de 80, era o município de Maués com
90% da pequena produção brasileira, seguido por outros, como Parintins, Itacoatiara,
Manacapuru e Manaus (Correa et al., 1989). Nessa época, com a ampliação do uso
comercial da semente, vários agricultores do baixo Sul da Bahia, antiga zona cacaueira
iniciou cultivo de guaraná. Em menos de dez anos, com plantios mais novos e produtivos,
a Bahia tornou-se o maior produtor, com 2.800 mil toneladas de sementes anuais, enquanto
o Amazonas passou para a segunda posição, com a produção média de 1.100 toneladas na
safra (IBGE 2014). Atualmente, o sul da Bahia exporta o produto em pó e em grãos para
diversos países, como Estados Unidos, Alemanha, Itália e França (EBDA, 2014). Na Bahia
praticamente não havia problemas de pragas e doenças que causam danos econômicos aos
guaranazeiros, ao contrário do município amazonense de Maués, que com a antracnose em
seu plantio associada com outras doenças como o superbrotamento causado por F.
decemcellulare, atinge órgãos em crescimento ativo como as gemas vegetativas e
apresentam pelo menos três sintomas bem característicos, como o superbrotamento das
gemas vegetativas, hipertrofia floral e galhas no caule (Araujo et al., 2007).
O superbrotamento atinge tecidos meristemáticos e ocorre desde a muda até a
planta adulta, independente, portanto, do estádio fenológico, podendo ocorrer durante todo
o ano. A doença provoca maiores perdas quando atinge os tecidos florais, pois inviabiliza a
produção de frutos.
Quanto ao sistema de reprodução, o F. decemcellulare possue as formas
homotálica e heterotálica. A habilidade de autofecundação dos isolados homotálicos em
comparação com os heterotálicos, não necessitam do encontro de mating types distintos,
que promove, o aumento da diversidade genética da população (Leslie e Summerel, 2006).
Desde a identificação do agente etiológico do superbrotamento em guaranazeiro
na década de 80 por Batista & Bolkan (1982) e os trabalhos epidemiológicos realizados por
Araújo et al. (2007), pouca importância foi dada a este patossistema e questões sobre os
mecanismos moleculares utilizados pelo patógeno no desenvolvimento da doença ainda
são uma incógnita.
Este trabalho teve como foco o estudo da distribuição de mating type e
diversidade genética de isolados de F. decemcellulare obtidos de mudas em viveiro e
análise comparativa com isolados obtidos de plantas adultas em fase de produção, ambos
oriundos da cidade de Manaus, e analise da distribuição de mating type e das correlações
267
genéticas entre os sintomas de hiperplasia de gemas vegetativas, hipertrofia floral ou
galhas no caule por meio do marcador molecular ISSR.
Material e Métodos
A pesquisa foi realizada no laboratório de Biologia Molecular na Embrapa da
Amazônia Ocidental (CPAA) localizada na cidade de Manaus-AM.
O isolamento foi realizado conforme descrito por Batista e Bolkan (1982) a partir
de três diferentes sintomas de superbrotamento (galhas, superbrotamento de gemas e
hipertrofia floral). A partir do isolamento foi realizado o cultivo monospórico. Os isolados
foram obtidos em meio batata-dextrose BD sob agitação de 150 rpm para obtenção de
massa micelial, que foi filtrada e em seguida realizada a extração de DNA utilizando o
protocolo descrito por Doyle e Doyle (1990). A quantificação de DNA foi mensurada por
meio de espectrofotômetro Nanodrop e em gel de agarose (0,8%).
A verificação de mating types na população de F. decemcellulare foi realizada
com base em dois pares de primers para cada Mating (Tabela 1). As reações de PCR foram
realizadas com um volume final de 20 µL, com 1µL de primers (0,25 µM), tampão 10X
(500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl pH 8,4; 1% Triton X-100), 1,2 µL MgCl2 (1,5 mM), 0,4
µL dNTP (0,2 mM), 0,05 U/µL Taq polimerase, 20 ng/µL de DNA.
Tabela 1. Lista de primers utilizados para verificação de mating type em F.
decemcellulare
As condições dos ciclos foram: desnaturação inicial de 94 ºC por 03 minutos; 30
ciclos de desnaturação (94 ºC por 30 segundos), anelamento (60 ºC por 01 minuto para os
MATING
TYPE PRIMERS ORIENTAÇÃO SEQUÊNCIA (5’-3’)
N° DE
BASES pb
MAT-1
FDC MAT 1.1.1
Forward
Reverse
ACGCTTTCATGGCTTTTCG
GCCCATTTGTTGCGATTATG
19
20
190
FDC MAT 1.1.3
Forward
Reverse
TGCTTTGACTTCTGGATTCTCA
CCCAAATTCGAGGTCCCTAT
22
20 591
MAT-2
FDC MAT 1.2.1
Forward
Reverse
ATGAGCTCCTTCACTGGCGC
CCATTGCCGTCAAGAGCAAAC
20
21 300
FDC MAT 1.2.3
Forward
Reverse
ACAGTCATGGCTGGAATGCA
CCCACCCCAAATCACCTGAAT
20
21 400
268
primers do mat1 e 62° C por 01 minuto para o primers do mat 2) e extensão (72 ºC – 02
minutos); e extensão final em 70 °C por 10 minutos.
Os isolados foram genotipados com 5 marcadores (Tabela 3) previamente
selecionados da lista de 100 primers de ISSR (UBS set#9). As reações de PCR foram
realizadas em volume de 20µL utilizando 50ng de DNA; tampão 1X com 1,5 mM de
MgCl2; 0,5mM de dNTPs; 1U de Taq DNA Polimerase e 0,25 µM de primer. As
condições de amplificação foram: desnaturação inicial a 94 °C por 3 minutos, 40 ciclos de
desnaturação a 92 ºC por 30 segundos, anelamento por 1 minuto (com temperatura
variando de acordo com cada primer selecionado), síntese a 72 °C por 2 minutos e
extensão final por 10 minutos a 72°C. Os produtos da PCR foram separados em gel de
agarose 1,0% e fotodocumentados para posterior análise do perfil de bandas obtido para
cada isolado.
A dispersão dos isolados de F. decemcellulare, de acordo com os dados de
diversidade dos marcadores ISSR, foi realizada por Análise de Coordenadas Principais
(PCoA), assim como a variação genética entre e dentro de populações pela análise de
variância molecular (AMOVA) foram realizadas usando o GenAlex 6.5 (Peakall e Smouse
2012). Para análise da dissimilaridade foi utilizado o programa DARwin 6 (Perrier e
Jacquemoud-Collet, 2006), utilizando o coeficiente de similaridade de jaccard pelo método
Neighbor-joining.
A estrutura genética da população foi estimada por meio de análise bayesiana
utilizando o programa STRUCTURE (Pritchard et al., 2000) como proposto por Falush et
al. (2007). Para cada valor de número de populações K (1 a 5), foram feitas vinte
simulações independentes, onde em cada simulação foram feitas 100.000 iterações com um
descarte inicial (burn-in), para evitar distorção dos resultados. O número provável de
populações (K) foi determinado por meio dos valores de ΔK, segundo Evanno et al.
(2005). O limite arbitrário de 80% foi considerado para a inclusão de determinado isolado
de acordo com o número de população determinado pelo valor de K.
Resultados e Discussão
Utilizando 64 mudas de guaranazeiro crescidas em viveiro e 17 plantas de
guaranazeiro do campo em fase de produção, obtivemos 81 isolados de F. decemcellulare
(Tabela 2).
269
Tabela 2. Distribuição de mating type dos isolados de F. decemcellulare obtidos de diferentes
sintomas de superbrotamento em guaranazeiro (Paullinia cupana var. sorbilis)
Sintomas Tecidos: HGV (Hiperplasia gema vegetativa); HF (Hipertrofia floral); G (galha);
ISOLADOS
MATING
TYPE LOCAL DA COLETA ORIGEM DO GENÓTIPO SINTOMAS ISOLADOS
MATING
TYPE
LOCAL DA
COLETA ORIGEM DO GENÓTIPO SINTOMAS
F02 2 EMBRAPA (A100) PLANTA 002 HGV F132 2 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP HGV
F04 1 EMBRAPA (A100) CLONE 003 HGV F133 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP HGV
F06 1 EMBRAPA (A100) CLONE 003 HGV F135 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP HGV
F15 1 EMBRAPA (A100) PLANTA 001 HGV F136 1 VIVEIRO MANAUS 574 BAG G
F85 1 AREA ORGANICA 41 HF F137 1 VIVEIRO MANAUS 575 BAG G
F87 1 AREA ORGANICA 41 HF F138 1 VIVEIRO MANAUS 576 BAG G
F91 2 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A HGV F139 1 VIVEIRO MANAUS 577 BAG G
F92 1 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A HGV F140 2 VIVEIRO MANAUS PL 1752 BRS AMAZONAS HF
F93 2 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A HGV F141 2 VIVEIRO MANAUS PL 1752 BRS AMAZONAS HF
F94 2 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A HGV F142 2 VIVEIRO MANAUS PL 1752 BRS AMAZONAS HF
F95 2 VIVEIRO MANAUS 305 B G F143 2 VIVEIRO MANAUS PL 1752 BRS AMAZONAS HF
F97 1 VIVEIRO MANAUS 307 B G F145 1 VIVEIRO MANAUS PL 1752 BRS AMAZONAS
HF
F98 1 VIVEIRO MANAUS 308 B G F146 1 VIVEIRO MANAUS PL 1752 BRS AMAZONAS
HF
F99 1 VIVEIRO MANAUS 309 B G F147 1 VIVEIRO MANAUS PL 1752 BRS AMAZONAS
HF
F100 1 VIVEIRO MANAUS 310 B G F148 1 VIVEIRO MANAUS PL 1779 CLONE 217
HF
F101 1 VIVEIRO MANAUS 311 B G F150 1 VIVEIRO MANAUS PL 1779 CLONE 217
HF
F102 1 VIVEIRO MANAUS 312 B G F151 1 VIVEIRO MANAUS BAG 296 E 145 A HGV
F103 1 VIVEIRO MANAUS P382 G F152 1 VIVEIRO MANAUS BAG 296 E 145 A HGV
F104 1 VIVEIRO MANAUS P383 G F155 1 VIVEIRO MANAUS BAG 296 E 145 A HGV
F106 1 VIVEIRO MANAUS P385 G F156 1 VIVEIRO MANAUS PL 1797 CLONE 609
HGV
F107 1 VIVEIRO MANAUS P386 G F157 1 VIVEIRO MANAUS PL 1797 CLONE 610
HGV
F108 2 VIVEIRO MANAUS P387 G F158 1 VIVEIRO MANAUS P702 G
F109 1 VIVEIRO MANAUS P382 G F159 1 VIVEIRO MANAUS P702 G
F111 1 VIVEIRO MANAUS P384 HF F160 1 VIVEIRO MANAUS P702 G
F112 1 VIVEIRO MANAUS P385
HF F163 1 VIVEIRO MANAUS PL 1797 CLONE 609 G
F113 1 VIVEIRO MANAUS P386
HF F164 1 VIVEIRO MANAUS PL 1797 CLONE 609 G
F114 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F165 1 VIVEIRO MANAUS PL 1797 CLONE 609 G
F115 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F166 1 VIVEIRO MANAUS P 328 G
F116 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F167 1 VIVEIRO MANAUS P 329 G
F117 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F170 1 MANAUS Embrapa HF
F118 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F398 1 MANAUS Embrapa HGV
F119 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F400 1 MANAUS Embrapa HGV
F120 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F401 1 MANAUS Embrapa G
F121 1 VIVEIRO MANAUS E29 G F402 2 MANAUS Embrapa G
F125 1 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A G F403 2 MANAUS Embrapa G
F126 1 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A G F404 2 MANAUS Embrapa G
F127 1 VIVEIRO MANAUS FMI 305 A G F406 2 MANAUS Embrapa HGV
F128 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP G F407 2 MANAUS Embrapa G
F129 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP G F408 2 MANAUS Embrapa G
F130 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP G F409 2 MANAUS Embrapa HGV
F131 1 VIVEIRO MANAUS BRS LUZEIA PL 1816/EXP G - - - - -
270
A análise do mating type dos 81 isolados não mostrou a ocorrência de
homotálicos e identificou 63 isolados do Mat-1 e 18 Mat-2 (Tabela 2). A distribuição de
mating nos isolados analisados difere da proporção 1/1, contudo, a ocorrência dos dois
mating type na população indica o potencial para a reprodução sexuada na população de F.
decemcellulare em guaranazeiro. Dos 17 isolados de F. decemcellulare do campo, nove
são do Mat 1 e oito do Mat 2, com distribuição similar de 1/1 o que é esperado para
reprodução sexuada. Já dos 64 isolados de viveiro, 58 pertencem ao Mat 1 e apenas 6 ao
Mat 2. Essa diferença na distribuição de mating type se deve provavelmente às condições
limitadas de dispersão do patógeno.
De acordo com MCDonalds e Linde (2002), um fator determinante no aumento da
diversidade genética de um patógeno é a possibilidade de ocorrência de diferentes tipos de
reprodução podendo ser sexuada/fluxo gênico, assexuada/fluxo genotípico ou mista,
aumentando capacidade de mutação e seleção de genes de virulência que é maior que a
capacidade de mutação e seleção de gene de resistência do hospedeiro.
A diversidade genética dos 81 isolados foi analisada por meio do marcador
molecular ISSR com base em 72 bandas polimórficas. O número de bandas por marcador
usado variou de 11 (UBC 811) a 16 (UBC 827). Todas as bandas foram polimórficas,
indicando que os primers de ISSR selecionados foram altamente informativos (Tabela 3).
Hinz et al. (2009), analisando 95 isolados de Fusarium oxysporum com oito marcadores
ISSR, obtiveram apenas 52 bandas das quais 92,3% foram polimórficos, diferente do
resultado encontrado neste estudo onde 100% das bandas é polimórfica para todos os 5
marcadores utilizados. Bayraktar e Dolar (2011) analisaram a diversidade genética de 70
isolados de Fusarium spp. usando primers ISSR obtiveram uma alta variabilidade genética
entre os isolados reforçando a aplicação desta técnica em estudo de diversidade genética.
Com base na similaridade genética, foi possível reunir os isolados em 6 grupos
relacionados ao local de coleta, entretanto sem nenhuma correlação com o tipo de tecido
sintomático do qual o fungo foi isolado (galha, gema vegetativa e flor) ou mating type
(mat-1 e mat-2) (Tabela 2 e Figura 1). Esses resultados demonstram que a variação do tipo
de sintoma não está relacionada com possível especialização fisiológica ou genética do
patógeno e sim com o local de infecção no hospedeiro.
Queiroz et al. (2016) analisaram 72 isolados de F. decemcellulare de diferentes
sintomas pela técnica de Eric-PCR e encontraram uma alta diversidade entre os indivíduos
e nenhuma correlação entre os sintomas. Silva (2009) usaram os marcadores RAPD e SSR
em 66 isolados de Fusarium oxysporum f. sp. cubense de diferentes municípios de Santa
271
Catarina, observando que não se agruparam por origens geográficas e que são distribuídos
indistintamente nos grupos apresentando uma alta diversidade entre eles.
Tabela 3. Primers ISSR selecionados para análise da diversidade em Fusarium decemcellulare.
N = Número de bandas. P (%)b Percentagem de polimorfismo
Figura 1. Dendrograma da similaridade entre os 81 isolados de F. decemcellulare, obtido
pelo método UPGMA
Primer Repetição Anelamento N
P (%)b
UBC 807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 49°C 15 100
UBC 811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 51°C 11 100
UBC 826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 49°C 15 100
UBC 827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 50°C 16 100
UBC 828 TGT GTG TGT GTG TGT GA 49°C 15 100
272
A relação entre os 81 isolados foi comparada pela análise das coordenadas
principais (PCoA) entre os isolados de viveiro e de campo. As duas primeiras coordenadas
principais apresentaram 21,26% e 31,37% da variação total. Nesta análise foi observada
uma tendência de agrupamento dos isolados obtidos em viveiro que foi confirmada pela
análise da estrutura das duas populações (Figura 2 A e B). A variância dentro das
populações apresentou o maior valor (72%) da variação total, enquanto que 28% da
variação foi observada entre as populações.
A
B
Figura 2. Em A representação gráfica da análise de coordenadas principais (PCoA) representa a diversidade genética entre os 81 isolados de Fusarum decemcellulare
avaliados a partir de marcadores moleculares ISSR. Em B estrutura da população
do patógeno obtida em viveiro em verde e no campo em vermelho. Escala na vertical corresponde à porcentagem de probabilidade de atribuição ao grupo
genético pertencente ao viveiro ou campo.
Co
ord
. 2 =
31,
37%
Coord. 1= 21,26%
Analíse das Coordenadas Principais (PCoA)
Viveiro
Campo
Campo Viveiro
273
Conclusões
A diferença significativa na razão entre Mat-1 e Mat-2 identificada na população
de isolados obtidas em viveiro indica ausência de reprodução sexuada.
Uma elevada diversidade foi identificada em ambas as populações analisadas com
base no marcador molecular ISSR independente da destruição e proporção 1/1 de mating
type.
Duas populações estruturadas foram identificadas de acordo com o local de coleta
e ausência de correlação genética entre os isolados e o sintoma do qual o fungo foi obtido.
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Síntese de nanopartículas de prata por espécies de Aspergillus do grupo
Niger
Silva L.S.C.1, Silva L.P.
2, Souza B.C.
3, Silva T.A.
1, Vieira L.F.S.
4, Durán, N.
5, Teixeira
M.F.S.6
1Doutorado Rede BIONORTE, Universidade Federal do Amazonas,
2Graduação em Ciências
Biológicas, Universidade Federal do Amazonas, 3Graduação em Farmácia, UniNorte,
4Bolsista,
Universidade Federal do Amazonas, 5Professor, Universidade Estadual de Campinas,
6Professora,
Universidade Federal do Amazonas. Emails: [email protected], larissa-
[email protected], [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
A síntese biogênica de nanopartículas de prata por Aspergillus está sendo uma alternativa
vantajosa por secretarem enzimas extracelulares que reduzem íons metálicos. Este estudo
foi realizado com a finalidade de investigar a síntese de nanopartículas de prata por
Aspergillus do grupo Niger. As espécies foram autenticadas com base nas características
morfológicas e moleculares. Nos cultivos em meio sólido foi preparada suspensão de
esporos com água destilada esterilizada e transferida para frascos Erlenmeyer de 500 mL,
contendo 200 mL de Extrato de malte, glicose, extrato de levedura-peptona, obtendo-se
concentração final de 106
esporosmL de meio. A fermentação foi realizada a 25 ºC, 180
rpm. Após 96h, a biomassa foi separada em papel de filtro por filtração a vácuo, lavada
com água deionizada e armazenada em frascos Erlenmeyer de 1000 mL, contendo 200 mL
de água e incubada nas condições de fermentação. No extrato micelial recuperado foi
adicionado solução de AgNO3 até concentração final 1 mM. A mistura reacional foi
incubada por 96h, na ausência de luz, 25 ºC, 180 rpm. As leituras foram realizadas a 200 a
800 nm. A mudança de cor na solução e presença de banda a 433 nm indicaram a síntese
de nanopartículas de prata.
Palavras-chave: Aspergillus niger, Biossíntese, Bioprocesso, Extrato micelial, Coleção de
fungos.
Introdução
Dentre as nanopartículas metálicas, as nanopartículas de prata (AgNPs) são utilizadas
na indústria de eletrônicos, alimentos e bebidas, embalagens, farmacêutica, têxtil e
cosméticas (Lateef e Adeeyo, 2015). Estudos mostram que as AgNPs possuem atividade
antimicrobiana contra uma ampla faixa de microrganismos patogênicos devido sua maior
276
área superficial (Singh et al., 2014). Estas nanopartículas podem sem sintetizadas através
de métodos químicos, fotoquímicos, físicos ou biológicos, porém as produzidas por meios
físicos e químicos possuem custos maiores e toxicidade elevada (Hemath et al., 2010;
Elgorban et al., 2016). Por isso, a síntese biológica intermediada por microrganismos está
sendo utilizada para reduzir esses efeitos adversos (Vahabi et al., 2011; Maliszewska et al.,
2014). Os fungos apresentam vantagens em relação às bactérias, devido ao quantitativo da
secreção de proteínas extracelulares com propriedade de reduzir íons metálicos mais
rapidamente. Além disso, tem ciclo de crescimento mais lento, o micélio suportar
procedimentos industriais, como pressão de fluxo e agitação em biorreatores, o que
proporciona um maior rendimento das nanopartículas (Pavani et al., 2012; Barabadi et al.,
2014). Entre os deuteromicetos, o gênero Aspergillus se destaca devido ao seu grande
potencial de adaptação fisiológica e além disso, muitas espécies são importantes produtoras
de moléculas com atividade biológica relevante para as indústrias (Bracarense, 2013;
Niyonzima e More, 2013). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi selecionar linhagens
de Aspergillus do grupo Niger depositadas na Coleção de culturas DPUA da Universidade
Federal do Amazonas que sejam eficientes na síntese de nanopartículas de prata.
Material e Métodos
As espécies de Aspergillus do grupo Niger, A. niger DPUA 398, A. niger DPUA
399, A. pulverulentus DPUA 478, A. japonicus DPUA 542, A. japonicus DPUA 613, A.
awamorii DPUA 1473 e A. japonicus DPUA 1727, preservadas em água destilada
esterilizada, foram cedidas pela Coleção de Culturas DPUA, da Universidade Federal do
Amazonas. A autenticação foi feita com base nas características morfológicas e
moleculares. Para confirmação das características macro e micro morfológicas, as espécies
foram cultivadas em ágar CYA (Czapek-Dox + extrato de levedura), CZ (Czapek-Dox) e
Malte (Klich, 2002). Os cultivos foram mantidos a 30 °C durante sete dias. Para
identificação molecular foi feita a extração do DNA fúngico (método CTAB) modificado
nas condições do Laboratório de Princípios Bioativos de Origem Microbiana. A
amplificação da região ITS foi realizada por meio da técnica da PCR em termociclador,
marca MyGenie 96 ThermalBlock da Bioneer, utilizando os primers ITS 1, ITS 4, ITS3
fungal ribosomal generic, Uni-R e 28S. O produto das reações foi analisado em gel de
agarose 1% (p/v) para visualização dos fragmentos. Para reação de sequenciamento foi
utilizado o kit BigDye® Terminator v 3.1 CycleSequencing Kits. A reação de
sequenciamento foi feita em termociclador da marca MyGenie 96 ThermalBlock da
277
Bioneer. As sequências obtidas a partir do gene ITS pelo sequenciamento foram utilizadas
para confirmação das espécies, por meio do banco de dados NCBI (National Center for
Biotechnology Information - http://ncbi.nlm.nih.gov), ferramenta BLASTn. Para síntese de
AgNPs, os fungos foram cultivados em CYA (ágar Czapek extrato de levedura), em tubos
de ensaio, a 25 °C, por sete dias. Nos cultivos CYA foi preparada uma suspensão de
esporos com água destilada esterilizada. Dessa suspensão, uma amostra foi transferida para
frascos Erlenmeyer de 500 mL contendo 200 mL de MGYP [Extrato de malte 0,3% (p/v),
glicose 1% (p/v), extrato de levedura 0,3% (p/v) e peptona 0,5% (p/v)], para obtenção da
concentração final de 106
esporosmL de meio. A fermentação foi realizada em 96 h, a
25ºC, 180 rpm. Para a extração das biomoléculas, a biomassa foi separada do extrato bruto
por filtração a vácuo e em seguida lavada com água ultra pura e acondicionado em frascos
de Erlenmeyer de 1000 mL, contendo 200 mL de água e deixado nas condições de
fermentação. No extrato micelial aquoso recuperado foi adicionada solução de AgNO3 (1
mM), incubada por 96 h, sem luz, a 25 ºC, 180 rpm. As AgNPs foram detectadas por
visualização da mudança de cor da solução e por espectrofotometria de UV-Vis (Cary 50
ProbeAgilent). As leituras foram realizadas nos comprimentos de onda de 200 a 800 nm
(Sudhakar et al., 2014).
Resultados e Discussão
Nos testes de autenticação, as análises morfológicas e moleculares confirmaram a
idenficação de A. niger DPUA 398, A. niger DPUA 399, A. pulverulentus DPUA 478, A.
japonicus DPUA 542, A. japonicus DPUA 613, A. awamorii DPUA 1473 e A. japonicus
DPUA 1727. Na síntese biogênica, os resultados obtidos mostraram que das quatro
espécies avaliadas no extrato micelial aquoso intermediado por A. niger DPUA 398 foi
observada a síntese de AgNPs. Gade et al. (2008) também relataram a biossíntese
extracelular de nanopartículas de prata por A. niger isolado de solo. Com base nesses dados
estão apresentadas nas figuras 1 e 2, as características morfológicas de A. niger DPUA 398
em meio padrão [CYA (Figura 1A), Cz (Figura 1B e ágar Malte (Figura 1C). Segundo
Schuster et al. (2002), foi definido que espécies que apresentam esporos de cor
castanha/preta, vesícula na extremidade de conidióforo, esterigmas e conídios em cadeia
fazem parte do grupo A. niger.
278
(A) (B)
Segundo Silva et al. (2015), a taxonomia de espécies de Aspergillus precisa ter uma
abordagem que integre características fenotípicas, juntamente com sequências de DNA.
Sendo assim, a similaridade obtida por comparação de sequências da região ITS de A.
niger DPUA 398 com as sequências contidas no banco de dados do GenBank através da
ferramenta Blastn, foi de 99% para A. niger (número de acesso KX664417.1).
Na síntese de nanopartículas foi observada visualmente a mudança de cor na
solução aquosa obtida da lavagem da massa micelial de A. niger DPUA 398, após 96h de
reação (Figura 3 A e B). Phanjom e Ahmed (2015) citaram que a alteração na cor durante a
síntese se deve à ressonância de plasma de superfície das nanopartículas de prata. A
espectroscopia de UV-vis é a técnica mais utilizada para determinação da redução dos íons
de prata (Jain et al., 2010). Deste modo, a figura 3C mostra os resultados da leitura em 200
a 800 nm que revela a presença de banda única com pico máximo em 433 nm. Isto mostra
Figura 1 – Características macromorfológicas de A. niger DPUA 398 nos cultivos obtidos em sete
dias em meio sólido (A) CYA; (B) CZ; (C) Malte.
Figura 2 – Microestruturas de A. niger DPUA 398: (A) Conídios e hifa septada; (B) Conidióforo, vesícula,
esterigmas e conídios.
279
a possível relação da liberação de proteínas na solução pelo microrganismo e a síntese de
nanopartículas de prata (Prahbu e Poulose, 2012). Afonso (2015) citou que A. niger
sintetiza proteínas únicas responsáveis por mecanismos de biossíntese de compostos que
não ocorrem em outras espécies de fungos filamentosos, sendo altamente versátil.
Figura 3 – (A) Filtrado celular de A. niger DPUA 398 isento de AgNO3 e (B) Nano partículas de prata
sintetizas após 96h de reação; (C) Espectroscopia de UV-vis com a presença de banda com pico máximo em
433 nm.
Conclusões
A. niger DPUA 398 despontou como um bom produtor de metabólitos que
participam da síntese extracelular de nanopartículas de prata.
A formação das nanopartículas de prata foi confirmada pela mudança de cor da
solução e o aparecimento da banda de ressonância plasmônica de superfície no espectro de
UV-Vis.
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Isolamento e caracterização de policetídeos diméricos em Talaromyces
sp., um fungo endofítico de Duguetia stelachantha
Silva P.H.F.1, Silva S.R.S.
1,2, Batista R.M.
3, Soares L.N.
4, Souza A.D.L.
2,5, Costa E.V.
5 de,
Koolen H.H.F.1,6
, Souza A.Q.L. de1,2,5
1PPG Biotecnologia e Recursos Naturais da Amazonia - Universidade do Estado do Amazonas, ,
PPG Bionorte – Universidade do Estado do Amazonas , 2PIBIC - Universidade Federal do
Amazonas, 3Graduação em Quimica - UFAM,
4Pesquisador, Universidade Federal do Amazonas
5Pesquisador, Universidade do Estado do Amazonas. E-mails: [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
Os principais metabólitos secundários produzidos por indivíduos do gêneto
Talaromyces são derivados de alcaloides, peptídeos e principalmente policetídeos, que são
de interesse para estudos químicos e biotecnológicos. O presente estudo teve como
objetivo a caracterização química de metabólitos produzidos pelo fungo Talaromyces sp.
(DgCr22.1b), um endófito isolado de Duguetia stelachantha e que apresentou potencial
citotóxico e antimicrobiano em avaliações preliminares. O fungo foi cultivado em meio
ISP2 por 28 dias sob temperatura de 28 ºC. Após o cultivo, foi obtido o extrato bruto que
em seguida foi fracionado em coluna de sílica gel usando eluição gradiente. Após análises
cromatográficas, a fração 03 apresentou características compatíveis com policetídeos
(baixo fator de retenção e coloração da revelação amarelada). Esta fração foi submetida à
CCD preparativa levando ao isolamento de cinco substâncias puras. Após análise estrutural
por RMN e MS foi possível identificar as substâncias isoladas como ácido secalônico A
(1), blenolídeo G (2), peniciloxantona A (3), versixantona A (4), além de uma nova
substância denominada paecilina D (5). A linhagem estudada é capaz de sintetizar como
principais metabólitos dímeros de xantonas, em detrimento às espécies monoméricas, bem
como outros policetídeos. A linhagem de Talaromyces DgCr22.1b mostrou-se capaz de
sintetizar como principais metabólitos, dímeros de xantonas, em detrimento às espécies
monoméricas. Adicionalmente, a paecilina D descrita neste trabalho apresentou potencial
antifúngico, até então não relatado na literatura.
Palavras-chave: Talaromyces, Xantonas, Endófito.
Introdução
Os fungos são microrganismos utilizados na produção de alimentos, na
fermentação, na indústria farmacêutica entre outras. Também estão inseridos em processos
de biodegradação, tratamento de efluentes, produção de enzimas, além de apresentar
grande importância no equilibrio ecológico (Abreu et al., 2015).
283
Algumas espécies de fungos são capazes de produzir metabólitos biologicamente
ativos, como os antibióticos penicilinas obtidos de Penicillium spp., o imunossupressor
ciclosporina de Beauveria nivea e agentes redutores do colesterol como as estatinas de
Aspergillus terreus.
O gênero Talaromyces, pertencente a familia Trichocomaceae é um estado
teleomórfico de Penicillium (Zhai et al., 2016) e que compreende aproximadamente 75
espécies. Fungos pertencentes a este gênero foram inicialmente isolados de amostras de
solo, sendo em seguida descritos em alimentos, algas e mais recentemente como endofítos
(Miao et al., 2012). Segundo Strobel et al. (2004), fungos endofíticos constituem uma
promissora fonte de substâncias que estão em constante avaliação de suas potencialidades
biológicas, o que visa atender a crescente necessidade da indústria farmacêutica. Uma das
principais características dos fungos endofíticos, diz respeito a capacidade destes não
causarem danos visíveis a sua planta hospedeira (Clay, 1988). Os metabólitos produzidos
são a resposta a certas condições ambientais, acreditando-se que estes metabólitos estejam
diretamente ligados a processos de interação microrganismo/planta, bem como diversas
outras finalidades (Vieira, 2008). Quimicamente, este gênero é pouco explorado, sendo
descritos até então alcaloides, peptídeos e principalmente, policetídeos como principais
metabólitos produzidos por diferentes espécies (Zhai et al., 2016).
O presente estudo teve como objetivo a caracterização química dos principais
dímeros de xantonas produzidos pelo fungo Talaromyces sp. (DgCr22.1b), um endófito
isolado de Duguetia stelachantha e que apresentou potenciais citotóxico e antimicrobiano
em avaliações preliminares de triagem de atividades biológicas.
Material e Métodos
O cultivo da linhagem DgCr22.1b foi realizado no Laboratório de Bioensaios e
Microrganismos da Amazônia (LabMicra) da Universidade Federal do Amazonas
(UFAM). Esta linhagem faz parte da coleção de trabalho do Grupo de Pesquisa GEMMA,
sendo reativado em meio cultura ISP2 sólido (amido, extrato de malte, extrato de levedura,
dextrose e agarose) suplementado com 0,05% de ampicilina. Em sequência, preparou-se a
solução de esporos (100 μL), estes foram inoculados em frascos Erlenmeyer de 1000 mL
contendo 300 mL de meio ISP2 líquido por 28 dias a 28 ºC.
A extração dos metabólitos foi realizada por meio da partição líquido-líquido.
Inicialmente, o caldo foi separado do micélio por meio de uma filtração a vácuo. O
284
procedimento de extração foi conduzido utilizando acetato de etila como solvente extrator.
Aproximadamente 1 g do extrato em acetato de etila foi fracionada em coluna de sílica gel
(mesh 230-400), sendo obtidas 4 frações. A fração 3 (eluída com 100% acetato de etila)
apresentou substâncias com fator de retenção semelhante a um padrão autêntico de ácido
secalônico D. Cerca de 100 mg desta fração foram submetidas a um procedimento de
isolamento em cromatografia de camada delgada preparativa (CCDP). Deste
procedimento, foram isoladas quatro substâncias posteriormente caracterizadas por
ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e
13C e espectrometria de massas (MS).
Resultados e Discussão
Do fracionamento do extrato de acetato de etila do fungo Talaromyces DgCr22.1b,
quatro substâncias foram isoladas. A comparação dos dados de RMN de 1H e
13C e MS
conduziram a identificação destes metabólitos como sendo policetídeos pertencentes à
classe das xantonas. Diferente de outras linhagens de Talaromyces, DgCr22.1b foi capaz
de priorizar em sua via biossintética a formação de compostos diméricos. Após
aprofundada comparação dos dados espectroscópicos com dados previamente publicados,
foi possível caracterizar as substâncias isoladas como sendo: ácido secalônico A (1),
blenolídeo G (2), peniciloxantona A (3), versixantona A (4), além de uma nova substância
denominada paecilina D (5). (Figura 1).
Figura 1. Substância isoladas: ácido secalônico A (1), blenolídeo G (2), peniciloxantona A
(3), versixantona A (4) e paecilina D (5). Fonte: Silva, P.H.F., 2016.
285
Ácidos secalônicos são dímeros de tetraidroxantonas que incialmente foram
descritos em Claviceps purpurea (Wazeman et al., 2015). Posteriormente, ácidos
secalônicos (A-F) foram descritos em linhagens dos fungos Gliocladium, Aspergillus e
mais recentemente Talaromyces (Liu et al., 2007). Moléculas pertencentes a este restrito
grupo são conhecidas por seu potencial citotóxico. Estudos indicam que o ácido secalônico
D induz apoptosis em células de leucemia (Zhang et al., 2009). Adicionalmente, os ácidos
secalônicos D e F mostraram potentes atividades alelopáticas (Zeng et al., 2004). Como
contra partida, ambos foram descritos como substâncias de elevada toxidez, além disso,
foram observados efeitos teratogênicos em ratos, o que levou ao descontinuamento dos
estudos ainda em fases inciais (Wang e Polya, 1996). Estes compostos foram obtidos como
majoritários nos extratos de Talaromyces DgCr22.1b, o que nos leva a concluir que
potencialmente a alta atividade citotóxica observada no extrato bruto possa estar
diretamente relacionada a presença destes dois metabólitos.
Os Blenolídeos inicialmente foram descritos como sendo unidades monoméricas
dos ácidos secalônicos (ácidos hemisecalônicos) (Siddiqui et al., 2011). Estudos
posteriores conduziram ao isolamento de blenolídeos rearranjados, tanto nas formas
monoméricas como diméricas, estes últimos recebendo a denominação de versixantonas
(Zhang et al., 2008). O metabólito blenolídeo G foi anteriormente isolado apenas de
Blennoria sp. e Alternaria sp. (Cai et al., 2014). As paecilinas são outro grupo restrito de
homodímeros, anteriormente encontrados em poucos registros. Até então apenas três
compostos desta subclasse eram descritos, e sem qualquer atividade biológica relatada.
Nos testes antimicrobianos, a versixantona A apresentou moderada atividade antifúngica
(31,3 μg/mL), enquanto que a nova molécula paecilina D apresentou potencial pode
fungicida com CIM de 15 μg/mL contra Candida albicans.
Conclusões
A linhagem de Talaromyces DgCr22.1b mostrou-se capaz de sintetizar como
principais metabólitos, dímeros de xantonas, em detrimento às espécies monoméricas.
O estudo destas frações permitiu a identificação de cinco substâncias, entre elas
uma nova xantona homodimérica da subclasse das paecilinas, raras como produto natural.
Adicionalmente, a paecilina D descrita neste trabalho apresentou potencial
antifúngico, até então não relatado na literatura.
286
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Maia, S.S2.
1POSAGRO, Universidade Federal de Roraima.
2Universidade Federal de Roraima, 69310-000,
Boa Vista, RR, Brasil. E-mail: [email protected]; [email protected].
Resumo
Nos últimos anos tem se buscado conciliar o incremento da produção de alimento com a
manutenção da sustentabilidade dos sistemas de produções agrícolas, onde o uso racional e
otimizado da água na agricultura irrigada tem sido destaque. Objetivou-se com esse estudo,
avaliar os indicadores microbiológicos do solo cultivado com arroz submetido a diferentes
manejos de água. O experimento foi instalado em blocos casualizados em esquema de
faixas. Os tratamentos foram constituídos pelos sistemas de manejos: M1: Inundação
intermitente; M2: Inundação intermitente na fase vegetativa, seguida de inundação
contínua; M3: Inundação contínua na fase vegetativa, seguida de inundação intermitente
até a maturação e M4: Inundação contínua durante todo o ciclo, além destas também foi
inserida uma área adjacente não cultivada (testemunha) e por duas cultivares de arroz: C1:
BRS Tropical e C2: IRGA 424. Foram avaliados os seguintes atributos químicos,
microbiológicos e bioquímicos: carbono orgânico do solo (COS), carbono da biomassa
microbiana (C-BMS), coeficiente metabólico (qMIC), fosfatase ácida e urease. Maiores
teores de COS proporcionam melhores condições para atividade dos microrganismos em
área de cultivo de arroz em várzea, denotada por maiores teores de C-BMS e maior
atividade enzimática.
Palavras-chave: Indicadores do solo, enzimas do solo, Oryza sativa, água na agricultura.
Introdução
No estado de Roraima, a rizicultura é a única cadeia produtiva efetivamente bem
estabelecida (Cordeiro et al., 2007). O Estado possui uma área de várzea de cerca de 160
mil hectares com grande parte apresentando aptidão para o cultivo de arroz (Barberena et
al., 2011).
No entanto, a produção não deve ser a única preocupação no manejo agrícola das
culturas, com a qualidade do solo e da água devendo ser consideradas, pois estes recursos
naturais são afetados com os tipos de manejo empregados, e tem consequências positivas
ou negativas na sustentabilidade nos sistemas de produção.
288
O alagamento para o cultivo de arroz promove mudanças nas propriedades
químicas, físicas e biológicas dos solos, sendo que a principal alteração ocorre em virtude
do processo de redução do solo, que surge a partir da respiração anaeróbica de bactérias,
resultante da diminuição do oxigênio, que ocasiona oxidação menos eficiente da matéria
orgânica, levando a alterações significativas no potencial redox e no pH (Leisack et al.,
2001; Vahl, 2004; Adhya e Rao, 2005; Nayak et al., 2007). As propriedades biológicas são
alteradas pela mudança do ambiente aeróbico para anaeróbico, o que promove a
diminuição da biota microbiana do solo (Moreira e Siqueira, 2006).
Com o desenvolvimento de pesquisas nas áreas de microbiologia e bioquímica do
solo, observou-se que os atributos microbiológicos e bioquímicos apresentavam boa
sensibilidade em detectar mudanças, mesmo mínimas, no manejo do solo (Mendes et al.,
2012). O entendimento das interações entre os atributos do solo, químicos, físicos,
microbiológicos e bioquímicos (Carneiro et al., 2009; Vezzani e Mielniczuk, 2011),
levaram os cientistas a estudar não apenas um compartimento do solo, mas sim, o conjunto
de indicadores das diferentes propriedades do solo que melhor possam inferir sua
qualidade (Carneiro et al., 2009; Lima et al., 2013).
Baseado na abordagem exposta e a falta de estudos referente às mudanças nas
propriedades dos solos cultivados com arroz irrigado em Roraima, objetivou-se com este
estudo, avaliar alguns indicadores microbiológicos do solo em cultivo de arroz submetido a
diferentes manejos de água, em solos de várzea.
Material e Métodos
O experimento foi realizado no município do Cantá-RR, Fazenda Santa Cecília, na
várzea do Rio Branco, nas coordenadas geográficas de referência 60° 39’ 19’’ W; 02° 48’
29’’ N. O clima da região tipo Aw, tropical chuvoso (KÖPPEN-GEIGER), com
precipitação média anual de 1600 mm e temperatura média de 27,4 °C (Araújo et al.,
2001). O experimento foi conduzido dentro do programa de melhoramento de arroz da
EMBRAPA – RORAIMA. No período de dezembro a abril do ano agrícola 2014/2015.
O solo da área experimental foi classificado como Gleissolo Háplico Tb Distrófico
(EMBRAPA, 2013), formado em terraço fluvial de sedimentos holocênicos (Riker e
Horbe, 2007). As características química e granulométrica da área antes do plantio na
camada de 0 a 0,20 m foram pH em H2O = 4,9; MO = 12,9 g kg-1
; P =10,14 mg dm-3
; K+ =
43,00 mg dm-3
; Ca2+
= 0,58 cmolc dm-3
; Mg2+
= 0,27 cmolc dm-3
; Al3+
= 1,11 cmolc dm-3
;
argila = 340 g kg-1
; silte = 410 g kg-1
; areia = 250 g kg-1
.
289
O experimento foi instalado em delineamento de blocos ao acaso em esquema de
arranjo em faixas, com quatro repetições, sendo que nas faixas foram aleatorizados quatro
sistemas de manejo de água de irrigação e nas parcelas, dentro de cada faixa, as repetições
com as cultivares. As cultivares de arroz utilizadas foram: BRS Tropical (C1) e IRGA 424
(C2).
Os sistemas de manejos de irrigação foram: M1- Inundação intermitente; M2-
Inundação intermitente na fase vegetativa até 50% de floração média, seguida de
inundação contínua até a maturação (90% de panículas maduras); M3- Inundação contínua
na fase vegetativa até 50% de floração, seguida de inundação intermitente até a maturação
e M4- Inundação contínua durante todo o ciclo. Além de uma área adjacente, considerada
testemunha.
O preparo do solo foi realizado com o solo seco e consistiu de uma aração e duas
gradagens a 0,20 m de profundidade, nivelamento e construção de taipas, trinta dias antes
da semeadura, utilizando-se implementos de discos e a entaipadeira. Junto com o preparo
do solo foi feita a calagem com o equivalente a 1 t ha-1
de calcário dolomítico (PRNT
85%), tendo como base as análises químicas do solo. Essa correção ocorre a cada dois
anos, para fornecer Ca2+
e Mg2+
à cultura.
A semeadura foi realizada no dia 27/12/2014 com o solo drenado. As sementes
viáveis foram distribuídas diretamente nos sulcos de plantio, em uma densidade de 100
sementes por metro linear, com sete linhas de 5,0 m de comprimento, espaçadas de 0,20 m.
Todos os procedimentos foram realizados de forma manual. A emergência das plântulas
ocorreu no dia 09/01/2015.
A adubação de base foi de 450 kg ha-1
da fórmula 08-28-16 + micronutrientes (36
kg de N; 126 kg de P2O5;72 kg de K2O; 2,25 kg de Zn; 0,45 kg de B; 0,9 kg de Mn), com
adubação em cobertura de 300 kg ha-1
de ureia (45% de N), aplicada em duas doses de 150
kg ha-1
, no início do perfilhamento (15 dias após a emergência - DAE), e na diferenciação
do primórdio floral (45 DAE).
A água foi captada do Rio Branco, bombeada e conduzida em tubos de PVC (100
mm) até a parcela experimental, cujo sistema constou de um canal principal e derivações
laterais para a distribuição da água em cada uma das parcelas.
A irrigação foi iniciada no estádio V4 (4 folhas), correspondendo a 23 DAE,
utilizando-se como referência a escala de Counce et al. (2000). Durante o período da
irrigação, cada parcela recebeu o manejo de água correspondente, mantendo uma lâmina de
água de 0,05 m de altura para o manejo contínuo, e as parcelas de manejo intermitente
290
receberam irrigação a cada dois dias, mantendo-se as parcelas sempre em solo saturado,
com controle diário. O período de irrigação total foi de 100 dias.
As amostragens de solo ocorreram após a colheita da cultura. Em cada parcela
foram coletadas três amostras simples que formaram amostra composta por parcela, com
quatro repetições por tratamento. Foram coletadas amostras de área não cultivada, com
vegetação secundária denominada testemunha, a qual encontra-se localizada próximo ao
experimento. A testemunha foi dividida em quatro blocos de 10 m x 10 m (100 m2), os
quais compreendiam as repetições. As amostragens foram feitas na camada de 0-0,10 m.
As amostras foram divididas em duas, uma para análise química e a outra para as análises
microbiológicas e bioquímicas, sendo que essas últimas foram acondicionadas em sacos
plásticos em caixa térmica para o transporte até o laboratório da Universidade Federal de
Roraima e mantidas sob refrigeração com temperatura variando de 4º C a 7º C até a
realização das análises.
Para a realização das análises químicas, microbiológicas e bioquímicas, as amostras
foram peneiradas em malha de 2 mm, retirando os fragmentos vegetais por catação com
auxílio de pinça. Na tabela 1 estão apresentados os indicadores estudados, os métodos
utilizados para suas respectivas avaliações e suas respectivas referências.
Tabela 1. Indicadores químicos, físicos, microbiológicos e bioquímicos do solo e os
respectivos métodos utilizados para a sua determinação. Indicador Extrator Método Referência
Químico
Carbono orgânico do
solo (COS)
Dicromato (Cr2O72-) Walkley-Black Modificado Embrapa
(2009)
Microbiológico
Carbono da biomassa
microbiana (C-BMS)
Clorofórmio/Sulfato de
potássio
Fumigação e extração Vance et al. (1987);
Tate et al. (1988)
Quociente microbiano
(qMic)
-------------------- Razão entre o C-BMS e o COT
Anderson e Domsch (1993)
Bioquímica
Fosfatase ácida p-nitrofenol-fosfato Espectrofotometria Tabatabai (1994)
Urease Método do salicilato Espectrofotometria Kandeler e Gerber
(1988)
Os dados foram submetidos à análise da variância pelo teste F (p<0,05) e, quando
significativos, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05). As análises
foram realizadas utilizando o software Sisvar versão 5.5 (Ferreira, 2011). Os dados foram
comparados com os obtidos na área de referência (testemunha), aplicando a prova não
paramétrica de Kruskal Wallis (p<0,05) utilizando o programa Info-Gen (Di Rienzo et al.,
2013).
291
Resultados e Discussão
O COS apresentou diferenças significativas entre os manejos estudados e destes em
relação a testemunha. O C-BMS apresentou diferença apenas dos manejos em relação a
testemunha (Tabela 2), onde os manejos influenciaram de forma negativa o C-BMS. Já o
atributo qMic não diferiu estatisticamente entre os manejos, nem desses, em relação a
testemunha.
Tabela 2. Indicadores químicos e microbiológicos de qualidade de um gleissolo háplico
Tb Distrófico sob cultivo de arroz com diferentes manejos de água no solo.
Manejo de Irrigação
Variáveis
COS
g kg-1
C-BMS
mg C. kg-1
qMic
%
M1 4,02 b * 139,03 a* 3,45 a
M2 3,86 b * 108,72 a* 2,81 a
M3 4,37 ab * 117,0 a* 2,67 a
M4 4,47 a 142,4 a* 3,18 a
CV (%) 9,54 28,85 32,06
Testemunha 8,15 271,61 1,24
Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey
(p<0,05); e as seguidas de asterisco (*) diferem significativamente da vegetação nativa pelo teste de Kruskal
Wallis (p<0,05). M1: Inundação intermitente; M2: Inundação intermitente na fase vegetativa até 50% de
floração média, seguida de inundação contínua até a maturação (90% de panículas maduras); M3: Inundação
contínua na fase vegetativa até 50% de floração, seguida de inundação intermitente até a maturação e M4:
Inundação contínua durante todo o ciclo.
Menores valores de COS encontrado nos manejos de água em relação a testemunha
(Tabela 2), como também, o ambiente anaeróbio que o manejo de água proporciona no
solo, influenciam na diversidade e quantidade de microrganismos, como também na
eficiência dos mesmos. É sabido que ambientes anaeróbicos apresentam menores
diversidades e quantidades de microrganismos quando comparados aos de ambientes
aeróbicos (Moreira e Siqueira, 2006).
O índice qMic encontrados em todos os tratamentos estão dentro dos valores que
são considerados normais, que variam entre 1 a 4 % (Jakelaitis et al., 2008), podendo
inferir que a transformação do COS em C-BMS, ou a mineralização do COS estão
adequados ao sistema.
A fosfatase ácida diferiu estatisticamente entre os manejos, apresentando maior
atividade no M3, sendo que, em relação a testemunha apenas este manejo não apresentou
diferença. Quanto a atividade da urease, não foram observadas diferenças entre os manejos
da água, no entanto, estes apresentaram diferenças em relação a testemunha, na qual a
urease apresentou maior atividade (Tabela 3).
292
Em relação à testemunha, apenas o M3 não diferiu desta, os demais manejos
apresentaram decréscimos na atividade da fosfatase ácida. Esse resultado está relacionados
com os valores de COS, onde maior presença de COS resultou em maior atividade da
fosfatase.
Tabela 3. Indicadores bioquímicos de qualidade de um GLEISSOLO HÁPLICO Tb
Distrófico sob cultivo de arroz com diferentes manejos de água no solo.
Manejo de Irrigação
Variáveis
Fosfatase ácida
mg p-nitrofenol kg-1 solo h -1
Urease
mg NH4+ kg-1 solo h -1
M1 136,08 b* 2,91 a*
M2 148,92 ab* 3,18 a*
M3 178,99 ajjj 3,48 a*
M4 158,35 ab* 3,56 a*
CV (%) 17,18 24,84
Testemunha 267,94 6,32
Médias seguidas da mesma letra minúscula na coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey
(p<0,05); e as seguidas de asterisco (*) diferem significativamente da vegetação nativa pelo teste de Kruskal Wallis (p<0,05). M1: Inundação intermitente; M2: Inundação intermitente na fase vegetativa até 50% de
floração média, seguida de inundação contínua até a maturação (90% de panículas maduras); M3: Inundação
contínua na fase vegetativa até 50% de floração, seguida de inundação intermitente até a maturação e M4:
Inundação contínua durante todo o ciclo.
Mendes et al. (2012) observaram correlação positiva dos teores de carbono
orgânico com a atividade da fosfatase ácida em condições naturais de cerrado, cuja
atividade é aumentada em áreas preservadas, isso porque a fosfatase é responsável pela
ciclagem de fósforo orgânico (Po), transformando-o em fósforo inorgânico (Pi). O
aumento do nível de Pi no solo provoca redução da atividade da fosfatase (Cordeiro et al.,
2004).
O maior teor de COS presente na testemunha, assim como maior biomassa
microbiana, são os fatores que explicam este resultado, visto que a atividade da urease é
influenciada pela presença de microrganismos e composição do material vegetal (Reynolds
et al., 1987; Lanna et al., 2010). Aumento nos teores de matéria orgânica e de nitrogênio
tem apresentando correlação positiva com a atividade enzimática (Nayak et al., 2007).
Conclusão
Maiores teores de COS proporcionam melhores condições para atividade dos
microrganismos em área de cultivo de arroz em várzea, denotada por maiores teores de C-
BMS e maior atividade enzimática.
293
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Sorbicilinoide de Penicillium chrysogenum isolado de Gustavia sp.
Sousa A.S.1, Almeida M.F.O.
2, Souza A.Q.L. de
3, Souza A.D.L
4
1PG Química, Universidade Federal do Amazonas,
2Pesquisador, Instituto Federal de Ciências e
Tecnologia do Amazonas, 3Pesquisador, Universidade Federal do Amazonas,
4Pesquisador,
Universidade Federal do Amazonas. Email: [email protected], [email protected],
[email protected]; [email protected]
Resumo
O Penicillium chrysogenum é um fungo filamentoso, encontrado em diversos habitat,
inclusive no interior de vegetais, como endófito. Esta espécie é bastante conhecida pela
produção de antibióticos β-lactâmicos, além de crisogina, roquerfortina e sorbicilinoides.
Os sorbicilinoides são encontrados, dentre outros, na forma de dímeros, denominados
bisorbicilinoides. Membros pertencentes a essa família de compostos são considerados
como uma nova classe de substâncias com propriedades bioativas como: citotóxica,
antiviral, antimicrobiana e antioxidante, entre outras. O fracionamento do extrato MeOH
do meio de cultura líquido de P. chrysogenum, resultou no isolamento e identificação de
2’,3’-dihidrosorbicilina, um monômero da classe dos policetídios, pertencente à família
dos sorbicilinoides. Além disso, na análise por espectrometria de massas, foram
observadas várias frações ricas em substâncias dessa família. Estes são os primeiros
resultados dos estudos das frações do extrato MeOH de P. chrysogenum indicando a
presença de substâncias da família dos sorbicilinoides, justificando a continuidade dos
estudos químicos desse fungo.
Palavras-chave: Metabólito secundário, 2’,3’-diidrosorbicilina, espectrometria de massas,
policetídeos.
Introdução
Estudos têm demonstrado a grande variedade e potencial dos microrganismos
endofíticos de regiões tropicais, como a Amazônia, registrados nos trabalhos de Souza et
al. (2004), Souza et al. (2008), Koolen et al. (2012), Banhos et al. (2014). Segundo Chapla
et al. (2013), os microrganismos endofíticos ou endófitos são um grupo diversificado de
micróbios que colonizam os tecidos internos das plantas sem causar prejuízos aparentes ao
hospedeiro.
Espécies do gênero Penicillium são grandes produtoras de estruturas policetídicas
complexas com atividades biológicas bastante promissoras. Uma espécie em destaque é o
P. chrysogenum, que desde a descoberta da penicilina, vem sendo usada como fonte
296
importante de metabólitos antibacterianos, antifúngicos e citotóxicos (Meng et al., 2011;
Lopes et al., 2012; Guo et al., 2013).
No acervo de substâncias bioativas oriundas de P. chrysogenum destacam-se os
sorbicilinóides que são metabólitos policetídicos, também isolados de Trichoderma sp.,
Phialocephala sp., entre outros (Li et al., 2007; Neumann et al., 2007; Haned e Volp,
2011). Segundo Balde et al. (2010), essas substâncias representam uma nova classe de
compostos com potenciais bioativos contra células cancerígenas, fungos, vírus e bactérias
(Cabrera et al., 2006; Peng et al., 2014; El-elimat et al., 2015).
Em estudo anterior do extrato metanólico do meio líquido de uma linhagem de P.
chrysogenum isolado de Gustavia sp. foram observadas frações ricas em substâncias da
família do sorbicilinoides, como os bisorbicilinoides trichodimerol, diidrotrichodimerol e
tetraidrotrichodimerol (Almeida, 2014). Essas frações são alvo deste estudo, que visa
identificar e quantificar as substâncias dessa família de compostos.
Material e Métodos
A linhagem 401 de P. chrysogenum, mantida na coleção de estudos do Laboratório
de Microrganismos da Amazônia – LabMicrA, foi cultivada em 30 L do meio de cultura
BDL (batata, dextrose e 2% de Levedura), distribuídos em 100 frascos erlenmeyers de 1 L.
Em cada frasco foram inoculados 50 µL da suspensão de esporos da linhagem e o cultivo
prosseguiu no modo estático, a 36°C, por 20 dias. Após o período de cultivo, o líquido
fermentado foi separado da massa micelial, filtrado em papel de filtro sob vácuo e, após o
acréscimo de 3% de metanol, foi armazenado em garrafas de vidro âmbar até posterior
filtração em membrana de 0,45 micra (Figura 1).
Para a obtenção dos extratos, o líquido fermentado filtrado do cultivo foi extraído
sob vácuo em cartucho de extração em fase sólida – SPE, composto por 10 g de sílica C18,
previamente condicionado com MeOH. A cada litro do líquido fermentado, os analitos
retidos foram extraídos por duas porções consecutivas de 30 mL de MeOH. Os extratos
foram reunidos, concentrados, identificados e armazenados em dessecador (Figura 1).
O extrato metanólico do meio líquido cultivado (EMML) foi inicialmente analisado
por Cromatografia em Camada Delgada - CCD (cromatoplacas de sílica gel com indicador
de fluorescência F254 da Sorbent Techonologies), reveladas por irradiação com lâmpada
ultravioleta (UV) (264 e 365 nm) e reagente vanilina acidificada. As placas foram eluídas
em diferentes combinações de hexano/acetato de etila/ metanol.
297
Figura 6. Esquema do cultivo do fungo e obtenção dos extratos.
Após as análises por CCD, 8,17 g do extrato bruto seco foram submetidos à
cromatografia em coluna com 250 g de sílica gel (SiliCycle SiliaFlash F60) eluída com
misturas de solventes: Hex:AcOEt (1:1) - fração F1 (0,8 g); AcOEt:MeOH (9:1) - fração
F2 (2,18 g) e MeOH (100%) - fração F3 (3,84 g).
Após análise por cromatografia de camada delgada, a fração F2 (2 g) foi submetida
a um novo fracionamento em coluna cromatográfica aberta, empacotada com 30 g de sílica
gel (SiliCycle SiliaFlash F60) e eluída com mistura de solventes em gradiente crescente de
polaridade (Figura 2).
Figura 2. Esquema do fracionamento da fração F2.
Todas as frações, desde o extrato bruto, foram diluídas a 10 ppm em metanol grau
HPLC e analisadas na faixa de m/z 100-1000 por inserção direta em espectrômetro de
massas do tipo ion trap (modelo LCQ Fleet da Thermo Scientific), equipado com fonte de
ionização a pressão atmosférica – APCI, operando em modo positivo e negativo de
aquisição, na busca de substâncias da família do sorbicilinoides. A fração F2A (6,5 mg) foi
P. Chrysogenum
401
Resíduo
Micelial
Filtrado
Meio Líquido
Extrato 1
(EMML)
17,96 g
- Cultivo no modo estático em 100 frascos de 1 L com 300
mL/frasco, por 20 dias, pH: 6,5;
- Meio BDL;
- Filtração em funil de Buchner e membrana Millipore;
- Extração em fase sólida (SPE)
com MeOH;
- Extração por maceração
com MeOH;
Extrato 2
(EMM)
21,53 g
AcOEt/MeOH (9:1)
F2
2,0 g
MeOH
(100%)
Hex/AcOEt
(8:2)
Hex/AcOEt
(6:4)/(1:1)
- Cromatográfica em coluna;
- Sílica Gel fase normal: 29,47 g;
- Pastilha 4,6 g de sílica;
- Hex/AcOEt/MeOH;
F2A
6,5 mg
F2B
4,0 mg
F2C
6,7 mg
F2D
46,0 mg
F2E
250,0 mg
F2F(f,g,h)
450,0 mg
F2I
160,0 mg
F2J
480,0 mg
F2K
210,0 mg
Hex/AcOEt
(7:3)
Hex/AcOEt
(7:3)/(6:4)
Hex/AcOEt
(1:1)/(3:7)
Hex/AcOEt/MeOH
(2:7:1)
298
fracionada em CCD (5 x 10 cm), eluída com Hex/AcOEt (8:2) e revelada com lâmpada
ultravioleta (UV-264nm), resultando em quatro novas frações (Figura 3).
As frações F2A1 e F2A2 foram diluídas a 10 ppm em metanol grau HPLC e
analisadas, na faixa de m/z 100-1000, por inserção direta em espectrômetro de massas,
conforme ao descrito anteriormente.
Figura 3. Esquema do fracionamento por CCD da fração F2A.
As frações foram analisadas e encaminhadas, para análises de RMN 1D e 2D em
um espectrômetro de RMN Bruker AVANCE III HD, operando a 11,75 tesla, equipado
com uma sonda multinuclear de 5 mm (BBFO Plus SmartProbeTM
), com gradiente de
campo na direção z, observando-se os núcleos de 1H e
13C a 500,13 e 125,76 MHz,
respectivamente, utilizando metanol deuterado (MeOH-d), como solvente.
Resultados e Discussão
No espectro de íons totais do EMML e F2 de P. chrysogenum, registrado na região
de m/z 100-1000 ([M-H]-), foram observados três grupos distintos de possíveis
sobicilinoides, grupo 1: monômeros, grupo 2: os dímeros e grupo 3: os trímeros (Figura 4).
Figura 4. Espectro de íons totais (full scan) do EMML de P. chrysogenum.
Hex/AcOEt
(8:2)
F2A
6,5 mg
F2A1
1,5 mg
F2A2
1,0 mg
F2A3
1,0 mg
F2A4
1,8 mg
3 placas de CCD
(10 cm x 5 cm)
Hex/AcOEt (8:2)
EMML_EMM_FRACOES_APCI_negat_12_07_16 #144-173 RT: 2,91-3,48 AV: 30 NL: 5,80E1T: ITMS - c APCI corona Full ms [100,00-1000,00]
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rela
tive
Abun
danc
e
495,34
247,32
511,33453,43
263,30529,34352,31
657,37395,38283,43205,33 743,44
671,38651,50 759,38179,29
807,49907,53 989,20
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
299
A amostra F2A1 (Figura 3), apresentou característica de um sólido amarelo pálido,
totalmente solúvel em MeOH. A análise de massas, no modo negativo, evidenciou a
presença de um íon base com m/z 233 u, correspondendo à molécula desprotonada de
massa 234 u (Figura 5).
Figura 5. Espectro de massa de íons totais (full scan) da amostra F2A1.
Na região aromática do espectro de RMN de 1H de F2A1 (Figura 6) foi possível
observar um sinal de hidrogênio em δ 7,46 (1H, s) correlacionado com um carbono em δ
128,9 (HSQC, Figura 7) e coerente com um anel aromático pentassubstituído. Na região
alifática do espectro observaram-se: sinais de hidrogênios vinílicos sobrepostos em δ 5,50
(2H, m), correlacionados conforme experimento de HSQC a dois carbonos em δ 125,3 e
129,6; dois sinais metilênicos em δ 2,96 (2H, t, 7,45 Hz), correlacionado a um carbono em
δ 37,21 (HSQC), e em δ 2,36 (2H, m), correlacionado a um carbono em δ 27,53; três sinais
de metilas em δ 2,17 (3H, d, 0,7 Hz), 2,06 (3H, s) e 1,63 (3H, m), correlacionados aos
carbonos em δ 14,8, 6,5 e 16,6, respectivamente (HSQC).
O hidrogênio aromático em δ 7,46 apresenta correlação com o hidrogênio metílico
em δ 2,17 (COSY, Figura 8), correlações fortes com os carbonos em δ 14,8, 160,6 (C-OH),
161,2 (C-OH) e 204,4 (C=O) e correlações fracas com os carbonos quaternários em δ
110,4, 111,8 e 115,7 (HMBC, Figura 9). O hidrogênio em δ 2,17 está correlacionado a
longa distância com os carbonos em δ 115,7, 128,9 e 160,6. O hidrogênio metílico em δ
2,06 está correlacionado com os carbonos em δ 110,4, 160,6 e 161,2. O hidrogênio
metílico em δ 1,63 está correlacionado a um dos hidrogênios em δ 5,50 (COSY) e aos
carbonos em δ 129,5 e 125,3 (HMBC).
fracao_fat_a1_apci_pos_14_07_16 #544-550 RT: 10,70-10,81 AV: 7 NL: 2,42E3T: ITMS - c APCI corona Full ms [100,00-1000,00]
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
233,24
178,28
459,48 699,53283,41 939,63621,43 779,50502,59 821,53331,20
300
Figura 6 - Espectro de RMN de 1H da amostra F2A1(500 MHz, CD3OD).
Figura 7. Mapa de correlação HSQC da amostra F2A1 (J
1,
13C-
1H, 500 MHz, CD3OD).
O hidrogênio em δ 2,36 também está correlacionado a um dos hidrogênios em δ
5,50 e com o hidrogênio em δ 2,96 (COSY) e apresenta correlações fortes com os carbonos
em δ 125,3 e 129,5 e correlações fracas com os carbonos em δ 37,2 e 204,4. Finalmente o
hidrogênio em δ 2,96 correlaciona-se com os carbonos em δ 27,5, 129,5 e 204,4 (HMBC).
Comparando esses dados acima com os da literatura (Maskey et al., 2005; Tabela 1) foi
possível identificar a amostra F2A1 como sendo o sorbicilinóide 2’,3’-dihidrosorbicilina
2,3-dihidrosorbicillin_H1.esp
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0
Chemical Shift (ppm)
0
0.25
0.50
0.75
1.00
Norm
alize
d Inte
nsity
3.003.083.172.142.251.451.02
TMS
METHANOL-d4
Methanol
1.624
21.6
262
1.631
11.6
355
2.059
92.1
650
2.346
42.3
513
2.357
22.3
625
2.367
42.3
704
2.942
42.9
576
2.972
2
5.489
35.4
937
5.499
15.5
035
5.508
85.5
128
7.457
3
2,3-dihidrosorbicillin_H1.esp
7.55 7.50 7.45 7.40 7.35 7.30
Chemical Shift (ppm)
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Nor
mal
ized
Inte
nsity
1.02
7.45
73
2,3-dihidrosorbicillin_H1.esp
5.55 5.50 5.45 5.40 5.35 5.30
Chemical Shift (ppm)
0
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
Nor
mal
ized
Inte
nsity
1.45
5.48
935.49
375.
4991
5.50
355.
5088
5.51
28
10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
F2 Chemical Shift (ppm)
0
50
100
150F
1 C
hem
ical S
hift (p
pm
)
δ 7,46
δ 128,9
δ 5,50
δ 125,31
δ 129,51
δ 2,96
δ 37,2
δ 1,63δ 2,06δ 2,16δ 2,36
δ 27,5
δ 14,8
δ 6,50
δ 16,5
301
(Figura 10). Esta substância foi isolada anteriormente de espécies do gênero Verticillium,
Trichoderma e Penicillium e apresentou atividade citotóxica moderada contra várias
linhagens de células cancerígenas e fraca atividade contra bactérias Staphylococcus aureus
e Bacillus subtilis (Trifonov et al., 1983; Maskey et al., 2005; Lan et al., 2012).
Figura 8. Mapa de correlação COSY (
1H-
1H) (500 MHz, CD3OD) da amostra F2A1.
Figura 9 - Mapa de contorno HMBC (J
2-J
4,
1H-
13C, 500 MHz, CD3OD) da amostra F2A1.
O
CH3
OH
OH
CH3
CH3
H H
H
H
H
H
H
110,4
161,2
111,8
160,6
115,7
128,9
204,4
37,2
27,5
129,5
125,3
16,5
1,63
5,50
5,50
2,36
2,96
7,46
2,17
14,8
6,502,06
O
CH3
OH
OH
CH3
CH3
12
3
45
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
COSY
HMBC-correlações fortes
HMBC-correlações fracas
Figura 10 - 2',3'-dihydrosorbicilina e as correlações observadas para a amostra F2A1.
302
Tabela 1. Comparação dos dados de RMN da amostra F2A1 e da substância 2’,3’-
dihidrosorbicilina. Substância F2A1
1 2′,3′-Dihidrosorbicilina2
nº 1H δ (mult.; J
em Hz)
COSY
(1H-
1H)
HSQC
(1H-
13C)
HMBC (1H-
13C)
3 1
H δ (mult.; J em
Hz)
HSQC
(1H-
13C)
1' 204,4 207,3
2' 2,96 (2H; t; 7,5) 2,36 37,2 27,5; 129,5; 204,4 3,02 (2H; t; 7,2) 39,2
3' 2,36 (2H; m) 2,96; 5,50 27,5 125,3; 129,5;
37,2; 204,4
2,37 (2H; m) 28,5
4', 5' 5,5 (2H; m) 2,26; 1,63 129,5;
125,3
27,5 5,49 (2H; m) 130,8;
127,0
6' 1,63 (3H; m) 5,5 16,5 125,3; 129,5 1,63 (3H; m) 18,0
1 111,8 117,3
2-OH 161,2 161,4
3 110,4 122,8
3-CH3 2,06 (3H; s) 6,5 110,4; 160,6;
161,2
2,24 (3H; s) 10,3
4-OH 160,6 156,6
5 115,7 124,6
5-CH3 2,17 (3H; d;
0,7)
7,46 14,8 115,7; 128,9;
160,6
2,35 (3H; d; 0,8) 17,2
6 7,46 (1H; s) 2,17 128,9 14,8; 160,6;
161,2; 204,4;
110,4; 111,8;
115,7
7,56 (1H; s) 130,0
1 Espectrômetro BRUKER AVANCE III HD (500 MHz em MeOD); 2 Espectrômetro AMX 300 (300.135 MHz em MeOD), (Maskey et al., 2005); 3 Valores em negrito indicam correlações fortes;
Conclusões
As análises do perfil químico indicaram a presença de monômeros, dímeros e
trímeros de substâncias da família dos sorbicilinoides na composição dos extratos e frações
de P. chrysogenum.
Na segunda fração foi encontrada a substância 2’,3’-dihidrosorbicilina, um dos
monômeros do perfil químico, justificando a continuidade do estudo dos sorbicilinoides
produzidos pela linhagem de P. chrysogenum.
Agradecimentos
À CAPES pela bolsa e pelo financiamento através do projeto Pró-Amazônia; FINEP;
Central Analítica da UFAM.
303
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Diferenciação genética entre as formas homotálicas e heterotálicas de
Fusarium decemcellulare por meio de marcadores moleculares
Sousa T.F.1, Queiroz C.A.de.
2, Sousa S.B.de
2, Silva G.F.
4
1Universidade do Estado do Amazonas – UEA;
2Universidade Federal do Amazonas –UFAM;
3Embrapa Amazônia Ocidental, Laboratório de Biologia Molecular. [email protected]
Resumo
Fusarium decemcellulare já foi reportado em mais de 80 diferentes espécies
vegetais em regiões tropicais e subtropicais, sendo identificadas quanto à reprodução
sexuada em: homotálico (autofértil) e heterotálico. As diferenças filogenéticas e no número
de ascósporos formados entre homotálicos e heterotálicos indicam a possível ocorrência de
um complexo de espécies. Contudo, até o momento as principais formas de diferenciação
estão relacionadas a uma laboriosa caracterização do número de ascósporos ou
identificação molecular de sistema de mating type. Deste modo, este trabalho teve como
objetivo avaliar a habilidade dos marcadores moleculares ISSR e ERIC-PCR em
diferenciar as formas homotálicas e heterotálicas. Foram analisados 20 isolados, sendo 10
heterotálicos e 10 homotálicos com base em três marcadores ISSR que geraram 109 loci
polimórficos e ERIC-PCR com 41. Quando comparados com ambos marcadores, a análise
de variância molecular (AMOVA) indica que a maior variação ocorre dentro (75%) do que
entre os grupos (25%). Embora os dois marcadores apresentem elevado grau de
polimorfismo, o marcador ERIC-PCR foi mais eficaz em separar essas duas populações.
Palavras chave: Diferenciação genética, mating-type, ISSR, ERIC-PCR.
Introdução
De ocorrência em regiões tropicais e subtropicais, F. decemcellulare já foi
reportado em espécies de importância econômica como Mangifera indica (manga),
Theobroma cacao (cacau) e Piper nigrum (pimenta-do-reino). Em Paullinia cupana var.
sorbilis (Mart.) Ducke (guaranazeiro) é o agente causal do superbrotamento que pode
provocar perdas de até 100% da produção de guaraná. A crescente incidência da doença no
estado do Amazonas vem se tornando um sério problema, contribuindo para a baixa
produtividade da cultura (Leslie, Summerell, 2006; Araújo et al., 2007).
O sistema de mating-type em F. decemcellulare consiste de um locus MAT e dois
idiomorfos, MAT-1 e MAT-2, sequências não relacionadas presentes na mesma posição do
cromossomo. Os indivíduos que apresentam somente MAT-1 ou MAT-2 são chamados de
heterotálicos, já os que apresentam os dois no mesmo genoma são denominados de
306
homotálicos. A existência desses idiomorfos sugere que a reprodução de F. decemcellulare
pode ser mista (sexuada e assexuada). No que concerne à reprodução sexuada, a forma
homotálica é capaz de fazer autofecundação, enquanto que na forma heterotálica o
cruzamento é feito somente por meio de encontro entre isolados que possuem mating-types
distintos, tendo como consequência o aumento da diversidade genética da população
(Alexander, Carmichael, 1973; Ferreira, 2005; Leslie, Summerell, 2006, Guimarães, 2013).
A diferença na patogenicidade entre os isolados homotálicos e heterotálicos foi
relatada por Ford et al. (1967) e Thomas e Snyder (1970), que usando isolados de
cacaueiro, observaram que a forma homotálica não causa doença, diferentemente da
heterotálica.
Guimarães (2013), com base em sequências parciais dos genes tef-1α, rpb2, acl1 e
da região ITS-LSU de isolados obtidos de sintomas como galha-floral e superbrotamento
de mangueira, cacaueiro, espatódea, pimenta-do-reino, guaranazeiro e de substratos como
serapilheira e solo, mostrou a ocorrência de duas espécies filogenéticas uma homotálica e
outra heterotálica, indicando a existência de um complexo de espécies em F.
decemcellulare.
Este trabalho utilizou os marcadores ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) e ERIC-
PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus), caracterizado como pequenas
unidades repetitivas de 127 pb contendo região central altamente conservada com
repetições invertidas de 40 pb (Hulto et al., 1991). O uso de ambas as técnicas em F.
decemcellulare permitiu identificar variações dentro e entre as formas homotálicas e
heterotálicas, contribuindo assim para um maior entendimento da genética e evolução entre
os dois grupos.
Material e Métodos
Foram utilizados 20 isolados de F. decemcellulare, sendo 10 homotálicos e 10
heterotálicos oriundos de diferentes locais de coleta e hospedeiros (Tabela 1).
Os isolados monospóricos foram repicados e colocados em frascos com 50 mL de
meio de cultura BD (batata, dextrose) sob agitação 125 rpm e temperatura de 25 °C por
quatro dias para obtenção de massa micelial, que foi filtrada e seca para posterior extração
de ácido nucléico. A extração do DNA foi realizada usando protocolo de extração com o
detergente catiônico CTAB 2% (Doyle e Doyle, 1987).
Foram utilizados dois marcadores moleculares para analisar a variação genética
entre isolados homotálicos e heterotálicos de F. decemcellulare. Para o marcador
307
molecular ERIC-PCR foram utilizados os primers ERIC 1R e ERIC2 conforme descrito
por Queiroz et al (2016) e para o marcador ISSR os primers utilizados foram UBC836,
UBC 840 e UBC 842 (Tabela 2). As reações de PCR foram realizadas com volume de
20µL, utilizando 50 ng de DNA; tampão 1X com 1,5 mM de MgCl2; 0,5mM de dNTPs;
1U de Taq DNA Polimerase e 0,25 µM de primer. As condições para amplificação foram:
desnaturação inicial a 94 ºC por 3 min, 40 ciclos de 94 ºC por 30 seg.; a temperatura de
anelamento variou de acordo com o primer utilizado (Tabela 2), extensão de 72 ºC por 2
min, seguido pela extensão final de 72ºC por 10 minutos.
Tabela 1. Lista de isolados de Fusarium decemcellulare de acordo com mating-type, local
de coleta e hospedeiro ou substrato
CML: Coleção Micológica de Lavras, NRRL: National Center for Agricultural Utilization Reseach
(USDA), FDC: Coleção de Fusarium decemcellulare da Embrapa Amazônia Ocidental, Ho: homotálicos, Mat 1: mating 1 e Mat 2: mating 2
Os dados foram analisados usando uma matriz binária, onde (1) indica a presença e
(0) a ausência do produto da amplificação para ambos marcadores aqui chamados de loci
ou bandas. A percentagem de loci polimórficos foi calculada de acordo com a fórmula: %
de bandas polimórficas = número de bandas polimórficas/ número total de bandas x 100%.
A estrutura genética dos isolados de F. decemcellulare foi avaliada por análises da
dispersão e agrupamentos dos acessos. A Análise de Coordenadas Principais (PCoA) foi
realizada usando o GenAlex 6.5 (Peakall e Smouse, 2012). Para a análise da
ISOLADO MATING-TYPE LOCALIDADE SUBSTRATO
CML 0038
CML 0800
CML 2241
CML 2245
CML 2246
CML 2248
CML 2249
CML 2250
CML 2370
NRRL 13412
FDC 200
FDC 193
FDC 307
FDC 272
CML 2251
CML 2271
CML 2255
CML 2332
CML 2409
FDC 356
Ho Ho
Ho
Ho Ho
Ho
Ho
Ho Ho
Ho
Mat 2 Mat 2
Mat 1
Mat 1
Mat 1 Mat 1
Mat 2
Mat 2 Mat 1
Mat 2
Belém/PA Marrocos
Uruçuca/Bahia
Lavras/MG Lavras/MG
Santo Amaro/BA
Bahia
Bahia Igrapiúma/BA
República Dominicana
Maués/AM Maués/AM
Urucará/AM
Itapiranga/AM
Ponta Grossa/AM Tecoman, México
Uricurituba/AM
Ilhéus/BA Manaus/AM
Rio Preto da Eva
Solo Nd
Galha floral/Cacaueiro
Spathodea campanulata/ Espatódea Spathodea campanulata/ Espatódea
Theobroma cacao
Piper nigrum/ Pimenta-do-reino
Piper nigrum/ Pimenta-do-reino Serra pilheira
Cafeeiro
Paullinia cupana Paullinia cupana
Paullinia cupana
Paullinia cupana
Theobroma cacao Mangifera indica
Mangifera indica
Theobroma cacao Paullinia cupana
Paullinia cupana
308
dissimilaridade foi utilizado o programa DARwin 6 (Perrier e Jacquemoud-Collet, 2006)
utilizando o coeficiente de similaridade de jaccard pelo método Neighbor-joining.
Resultados e Discussão
Dos 20 isolados de F. decemcellulare analisados com base em ERIC-PCR, foram
obtidas um total de 41 loci sendo todos polimórficos (Tabela 2). No entanto, quando
analisada a porcentagem de loci polimórficos entre heterotálicos e homotálicos foi obtido
uma porcentagem de 85,37 e 75,61%, respectivamente.
Tabela 2. Lista dos primers de ERIC-PCR e ISSR utilizados para avaliar a diversidade de
isolados homotálicos e heterotálicos de Fusarium decemcellulare.
PRIMER SEQUÊNCIA TM N° %
ERIC 1R
ERIC 2
ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC
AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG
48°C 41 100
UBC 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 55°C 52 100
UBC 840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 49°C 28 100
UBC 842 GAGAGAGAGAGAGAGAYG 53°C 29 96,5
TM: temperatura de anelamento; N°: Número de bandas; % polimorfismo
O marcador ERIC-PCR foi eficaz em separar os isolados homotálicos dos
heterotálicos (Figura 1), onde a relação entre os isolados das formas homotálicas tiveram
resultado similar ao da análise filogenética realizada por Guimarães (2013). A relação
entre os 20 isolados foi comparado pela análise das coordenadas principais (PCoA) (Figura
2) onde foi possível notar que a dispersão dos isolados corroborou com os grupos
identificados pelo dendrograma utilizando o algoritmo de Neighbor-joining.
A diferenciação genética entre as populações foi analisada pela AMOVA e a
variância dentro de cada grupo apresentou 75% da variação total, enquanto que 25% da
variação foi observada entre homotálicos e heterotálicos.
309
Figura 1. Dendrograma com base na técnica de ERIC-PCR obtido por meio do algoritmo
Neighbor-joining dos isolados de Fusarium decemcellulare, homotálicos em azul
e heterotálicos em vermelho.
Figura 2. Análise de coordenadas principais (PCoA) mostrando a distribuição com base na
variação genética de 41 loci obtidos com o marcador ERIC-PCR em F. decemcellulare. As cores dos pontos correspondem às linhagens P1= homotálicas (azul) e P2= heterotálicas (vermelho).
PC
oA
2
PCoA 1
PCoA
P1P2
310
Com base nos três marcadores ISSR foram obtidos 109 loci. O primer UBC 842 foi
o único com 1 lócus monomórfico dos 29 gerados e apresentou 96,5% de polimorfismo,
enquanto que os demais 100% dos loci foram polimórficos (Tabela 2).
Assim como o marcador ERIC-PCR, a análise da AMOVA, com base no marcador
ISSR, mostrou maior variação dentro dos grupos (88%) que entre as formas homotálicas e
heterotálicas (12%).
Os isolados heterotálicos mostram uma porcentagem de loci polimórficos de
87,16% em relação aos homotálicos 80,73%. Apesar dessa alta porcentagem de
polimorfismos, quando comparadas pela análise das coordenadas principais (PCoA) não
foi possível notar um agrupamento formado apenas por homotálicos ou heterotálicos, da
mesma forma que não foi possível observar no dendrograma separação entre os dois
grupos (Figura 3).
A separação das duas populações pelo marcador molecular ERIC-PCR em
contraposição ao marcador ISSR pode ter ocorrido pelo fato de que as regiões entre os
microssatélites onde os marcadores ISSR amplificam, são regiões que apresentam alto grau
de evolução genética, sendo menos conservadas entre as formas homotálicas e
heterotálicas. Já as regiões amplificadas pelo marcador ERIC, caracterizado como
pequenas unidades repetitivas de 127 pb com repetições invertidas de 40 pb (Hulton et al.,
1991) são regiões mais conservadas, e permitiu uma melhor análise evolutiva entre dos
dois grupos.
Figura 3. Dendrograma obtido com base no marcador molecular ISSR usando o algoritmo de
Neighbor-joining em Fusarium decemcellulare. Em vermelho isolados heterotálicos e em
azul homotálicos.
311
Conclusão
Com base nos resultados é possível sugerir que apesar dos dois marcadores
apresentarem alto grau de polimorfismo em F. decemcellulare, o marcador ERIC-PCR foi
mais eficaz em separar os isolados homotálicos e heterotálicos.
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Avaliação de consórcios de fungos amazônicos (Trametes lactinea e
Hexagonia glabra) contra as bactérias Escherichia coli, Staphylococcus
aureus e Proteus vulgaris
Carvalho W.O.
1, Fonseca N.F.
2 , Silva J.R
3.
1
Especializando em Micorobiologia Geral, Escola Superior Batista do Amazonas,2Graduada em
Licenciatura em Ciências Biológicas, Universidade do Estado do Amazonas, 3Especializando em
Biologia Celular e Molecular, Universidade Cândido Mendes. Emails: [email protected], [email protected] , [email protected]
Resumo
A Região Amazônica abriga numerosas formas de vida com grande potencial
biotecnológico, dentre estes, estão os fungos que são produtores de metabólitos de
interesse industrial. Portanto dentre estes cabe conhecer a atividade antimicrobiana do
Trametes lactineae e Hexagonia glabra e sua possível interação sinergética, possibilitando
assim alternativas viáveis na busca de novas substâncias antimicrobianas. A Coleta foi
realizada no município de Tefé-AM. Os basidiocarpos foram desidratados á 350C por 24
horas, utilizou-se 0,4 µg do extrato bruto, diluiu-se em 20µl de DMSO, posteriormente
acrescido 1,96 mL de água destilada. As cepas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus
e Proteus vulgaris foram semeadas nas placas de Petri contendo meio Mueller Hinton. O
experimento foi realizado em triplicata, utilizou-se a técnica de difusão de discos de ± 0,5
cm sendo usado 4 discos por placa. De modo geral, todos microrganismos foram sensíveis
aos metabólitos produzidos pelos fungos Trametes lactinea e hexagonia glabra. Cabe
ressaltar que houve interação sinergética entre os extratos avaliados, potencializado em
mais de 100% de atividade contra o microrganismo Proteus vulgaris.
Palavras–chave: Fungos, microrganismos, metabólitos , Antimicrobiano.
Introdução
A Região Amazônica abriga numerosas formas de vida com grande potencial
biotecnológico, em grande parte ainda desconhecido pela ciência. Tal fato mostra a
extrema relevância do estudo da aplicabilidade das espécies encontradas na região a fim de
desenvolver produtos com a finalidade de satisfazer as necessidades presente, sem
comprometer a capacidade das gerações futuras (Petrini, 1991).
Dentre essas formas de vida encontram-se os fungos, que tem um papel essencial
nos ecossistemas terrestres na decomposição de matérias orgânicas, na liberação de
313
nutrientes e dando suporte à vida da planta através da associação simbiótica com as raízes
de aproximadamente 80% de todas as espécies de plantas terrestres (Vander Heijdenv et
al., 1998).
Muitos fungos secretam enzimas no substrato onde se encontram e absorvem as
moléculas resultantes da ação dessas enzimas (Putzke e Putzke, 2002). Devido a esta
grande versatilidade, os fungos vêm sendo estudados, principalmente quanto à sua
aplicabilidade biotecnológica (Esposito e Azevedo, 2004; Azevedo et al., 2009).
Muitos dos antibióticos utilizados para o tratamento de doenças foram extraídos a
partir de fungos, como exemplo da Penicilina, substância produzida pelo fungo Penicilium
notatum, descoberta por Alexander Fleming em 1928 (Alexopoulos, 1996).
A descoberta dos antibióticos revolucionou a medicina, permitindo o tratamento de
infecções que até então eram fatais. A sua disponibilidade tem criado segurança para a
população em relação a doenças infecciosas adquiridas na comunidade (Pereira, 2004).
Apesar da redução na mortalidade pelas doenças infecciosas e da diminuição
significativa na morbidade por um conjunto importante dessas doenças, ao mesmo tempo,
em outra direção, configura-se, no Brasil, um quadro que, além de expor as frágeis
estruturas ambientais urbanas, que tornam as populações vulneráveis a doenças que
pareciam superadas, amplia a alta carga de doenças da população (Brasil, 2010).
Muitos estudos têm mostrado que a frequência de isolados multi-resistentes está
aumentando no mundo, com a resistência desenvolvendo-se para quase todas as classes de
antibióticos, tanto naturais como sintéticos (Walsh, 2003; Projan e Shlaes, 2004).
A Escherichia coli é uma bactéria Gram-negativa considerada a principal
representante dos patógenos termotolerantes, sendo isolado do sistema gastrointestinal dos
seres humanos e animais. Esta espécie pode causar diarréias, infecções urinárias,
septicemias e meningites (Analytica, 2012).
A espécie Staphylococcus aureus é um coco Gram-positivo que apresenta arranjos
em cachos e é isolada principalmente nas narinas, pele de aproximadamente 15% dos seres
humanos e de animais, estando envolvida em lesões de pele, formação de abscessos e
septicemias (Analytica, 2012).
A Proteus vulgaris é uma bactéria Gram negativa sendo um dos agentes envolvidos
em infecções urinárias. A infecção sintomática do trato urinário (ITU) situa-se entre as
mais freqüentes infecções bacterianas do ser humano, figurando como a segunda infecção
mais comum na população em geral (Avilla, 2005).
314
Um fato preocupante sobre esses microrganismos consiste na prevalência de
Staphyloccocus aureus resistente a meticilina permanecer extremamente elevada em
muitos países (Bax et al., 2000; Bush, 2004; Butler e Buss, 2006). Entretanto, um fato que
têm recebido pouca atenção, porém não menos importante, é o aumento destas bactérias na
comunidade, que acaba tornando-se um importante reservatório para a resistência a
antimicrobianos (Furuya e Lowy, 2006).
Portanto, dada a relevância e a busca por antimicrobianos novos é que foi avaliada
a atividade antimicrobiana dos extratos oriundos das cepas amazônicas dos fungos
Trametes lactinea e Hexagonia glabra e seu possível efeito sinergético entre frações 1:1
dos extratos e quantificados contra a Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Proteus
vulgaris, por serem estes microrganismos, dentre vários outros, frequentemente isolados
em infecções que apresentam elevada resistência aos antimicrobianos.
Material e Métodos
A presente pesquisa foi desenvolvida no Município de Tefé no estado do Amazonas
no perímetro rural do município de Tefé-AM, na estrada da EMADE. Durante o período da
pesquisa, o município de Tefé segundo os dados do IBGE de 2010 contava com 61.453
habitantes.
As coletas dos basidiocarpos foram realizadas durante o período de verão nos
meses de julho a agosto de 2012, tendo duração de 7 dias, sendo levados para o laboratório
de Biologia no Centro de Estudos Superiores de Tefé (CEST/UEA), onde foram
preparados os extratos e o bioensaio para verificar seu efeito contra os microrganismos
(Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Proteus vulgaris) .
Foi utilizado como solvente, álcool 70 % para a retirada dos componentes bioativos
presente nos basidiocarpos. Após a coleta, o material foi selecionado e desidratado à
temperatura de 350
C na estufa por 24 horas, sendo posteriormente triturado em
liquidificador industrial e passado em peneira de 60 mesh.
Para cada 30 gramas do material biológico triturado foram acrescidos 250 mL do
solvente e deixado em repouso por um período de 72 h em um recipiente âmbar, para
evitar possíveis reações com a luz. Os extratos obtidos foram concentrados em fluxo
forçado em capela de exaustão em temperatura de 28 – 30º C, até se obter um concentrado.
Essa metodologia foi descrita pela primeira vez por Smânia (2003).
315
Para avaliar o possível efeito sinergético entre os extratos, foi associada uma fração
de 1:1, ou seja, 1 mL do extrato obtido a partir dos basidiocarpos de Trametes lactineae e
1 mL do extrato da Hexagonia glabra, ambos obtidos a partir da técnica de extração a frio .
As diluições dos extratos foram de 0,4 µg para ambos e diluídos em 20 µL de
Dimetil Sulfóxido (DMSO), posteriormente acrescentando 1,96 mL de água destilada.
As cepas bacteriológicas foram cedidas pelo laboratório de microbiologia da UEA-
MBT (Universidade do Estado do Amazonas – MBT- Mestrado em Biotecnologia) e pelo
LACEA Laboratório de Análises Clinica Especialista do Amazonas .
Os microrganismos foram semeados em tubos de ensaios contendo meio nutriente
(NA) (glicose, peptona e caldo de carne), para o crescimento e mantidas em estufa a 37 0C
por 24 h. Após o crescimento das bactérias, o inóculo foi ajustado a partir da escala de
Mac Farland, utilizando-se o tubo 0,5 da mesma concentração padrão, o que equivale a
1,5x108 bactérias/mL.
As cepas de Escherichia colli, Staphylococcus aureus e Proteus vulgaris, foram
semeadas nas placas de Petri contendo meio nutriente Mueller Hinton.
Os testes dos bioensaios produzidos a partir dos extratos das cepas amazônicas e de
seus consórcios foram realizados em triplicatas contra os microrganismos patogênicos
semeados nas placas de petri, sendo que para cada placa de petri utilizou-se um grupo
controle para a detecção da sensibilidade dos microrganismos frente ao potencial
antimicrobiano dos bioensaios.
Resultados e Discussão
As bactérias foram sensíveis ao extrato de Trametes lactinea na concentração
testada. Para as cepas de Proteus vulgaris (Tabela 1), foram observados halos de inibição
com uma média de 3,3 mm, resultado este semelhante ao obtido por Felício (2011).
Contra S. aureus (Tabela 1) observou-se uma inibição média de 7,2 mm. Valor
semelhante foi também obtido por Felício (2011) para o mesmo microrganismo, que
visualizou um halo inibição de 14 mm.
A maior sensibilidade ocorreu com a bactéria Gram-negativa Escherichia coli, cujo
halo de inibição foi de 13,5 mm. Felício (2011) obteve resultado semelhante para uma cepa
de E. coli, observando um halo de 16mm de inibição.
316
Ao se analisar o extrato da Hexagonia glabra (Tabela 1), observou-se resultados
menores daqueles obtidos com T. lactinea. Seu extrato mostrou um halo de inibição de 3,8
mm contra S. aureus, 4,5 mm contra E. coli e 3,8 mm contra P. vulgaris.
A atividade de inibição observada no presente trabalho provavelmente se deve à
presença de substâncias fenólicas que possuem capacidade de complexar-se a proteínas
extracelulares da membrana bacteriana, provocando sua morte (Cowan, 1999). Estudos
anteriores demonstraram que várias bactérias são sensíveis a taninos, dentre elas,
Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia, Bacillus anthracise, Shigella
adysenteriae (Monteiro et al., 2005).
Tabela 1. Halos de inibição de diferentes extratos a frio de cepas Amazônicas contra as
bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coll, e Proteus vulgaris.
Amostras S. aureus E.coli P. vulgaris
----------------------- mm ---------------------------
Trametes lactinea 7,2 ± 2,5 13,5 ± 1,9 3,3 ± 0,9
Hexagonia glabra 3,8 ± 1,1 4,5 ± 0,9 2,8 ± 0,3
Consórcio das duas amostras 7,8 ± 1,7 11,8 ± 2,1 9,2 ± 2,4
Obs.: Os valores representam a média e o desvio-padrão de triplicatas dos halos de inibição.
O consórcio das cepas Trametes lactinea e Hexagonia glabra não foi tão eficiente
para Escherichia coli (Tabela 1) quando comparado com o extrato apenas de T. lactinea.
Essa resistência pode ter ocorrido devido microrganismos Gram-negativos como a
Escherichia coli possuírem duas membranas, uma na face externa da parede celular e outra
na face interna. Assim drogas com baixa lipossolubilidade têm maior dificuldade em agir
sobre as bactérias Gram-negativas por causa da membrana externa (Hashimoto et al., 1997;
Ferreira, 2010).
O consórcio das cepas Trametes lactinea e hexagonia glabra mostrou-se mais
eficiente contra a Staphylococcus aureus e P. vulgaris pois os halos de inibição foram
maiores do que quando usados os extratos dos dois microrganismos separadamente (Tabela
1). O efeito foi mais significativo contra P. vulgaris, mas discreto contra S. aureus.
Este discreto aumento no halo de inibição pode estar relacionado com uma possível
interação dos metabólitos produzidos pelos fungos Trametes lactinea e Hexagonia glabra
317
e até mesmo pela Staphylococcus aureus ser uma bactéria Gram-positiva, o que dificulta a
ação do bioensaio testado frente a membrana celular (Tabela 1). Da mesma maneira, pode
ter ocorrido uma interação entre alguns dos metabólitos dos fungos o que proporcionou
uma sensibilidade maior da cepa de Proteus vulgaris (Tabela 1) observada pelo aumento
do halo de inibição em 100% em relação ao extrato individual dos fungos Trametes
lactinea e Hexagonia glabra. Efeito sinergético também foi observado por Coutinho et al.
(2010) entre o extrato alcoólico de Eugenia uniflora e o antibiótico gentamicina contra
duas linhagens de Escherichia coli (EC 27 e ATCC 8539) numa concentração inibitória ≥
1.02µg/mL.
Para o grupo controle dos extratos analisados individualmente e de seus consórcios,
as cepas de microrganismos cresceram normalmente não ocorrendo formação de halo de
inibição, evidenciando o potencial antimicrobiano dos extratos de ambos os fungos e de
seus consórcios no crescimento das bactérias testadas (Figura 01).
Figura 1. Atividade antimicrobiana do extrato a frio do
consorcio das cepas de fungos amazônicos Trametes lactinea e
hexagonia glabra contra a bactéria Proteus vulgaris.
Apesar dos resultados favoráveis, a presente pesquisa mostrou algumas lacunas que
devem ser contempladas para o entendimento melhor do processo de consórcios, como por
exemplo o fracionamento dos extratos, para determinar quais metabólitos estão sendo
eficientes na sensibilidade dos microrganismos e a determinação da concentração mínima
inibitória (CIM). Cabe ainda avaliar sua possível ação sinergética entre os consórcios para
então otimizar de maneira mais eficiente sua ação. Outro ponto a ser contemplado é o uso
de solventes de diferentes gradientes de polaridades e diferentes técnicas de extração destes
metabólitos. Isso na possibilidade futura de se formular um produto final.
Grupo controle
318
Conclusões
As bactérias testadas foram sensíveis aos metabólitos produzidos pelos fungos
Trametes lactinea e Hexagonia glabra;
O extrato obtido da cepa Amazônica Trametes lactinea, apresentou melhor
resultado de inibição para Escherichia coli;
O extrato do consorcio dos fungos potencializou o efeito antimicrobiano contra a
Proteus vulgaris.
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4
1Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Condições de Vida e Situações de Saúde na
Amazônia - ILMD/Fiocruz. 2Bolsista DCTA no Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD/Fiocruz).
3Pesquisadora em Micologia da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-
HVD). 4Pesquisadora no Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD/Fiocruz). E-mails:
Resumo
Desde o advento da Biologia Molecular, cada vez mais métodos estão sendo empregados
nas diversas áreas de estudos em dermatofitose, os quais se mostram cada vez mais
necessários para um diagnóstico preciso nos estudos de epidemiologia molecular e
biodiversidade de dermatófitos. Para que as técnicas em biologia molecular sejam
empregadas com êxito, é necessário uma obtenção eficiente de ácidos nucleicos, onde o
presente estudo objetivou uma investigação sobre qual o melhor e quais modificações
deveriam ser feitas para se alcançar um método de extração eficiente, em quantificação,
pureza e amplificação da região ITS em PCR para dermatófitos. Utilizando três métodos de
extração de DNA genômico, Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado, Blood & Tissue kit
Qiagen e Mini Kit Qiagen Dneasy Plant, e analisando concentração e a relação A260/280,
foi possível concluir que a modificação na quebra e lise celular do micélio proporcionou
um melhor resultado quanto à concentração de DNA obtido. E, o método de Ferreira e
Grattapaglia (1998) com modificações se mostrou o melhor para extração de ácidos
nucleicos dos dermatófitos testados.
Palavras-chave: Extração de ácidos nucleicos, Reação da polimerase em cadeia,
Dermatófito.
Introdução
Os dermatófitos são fungos com a capacidade de invadir os tecidos queratinizados,
principalmente de mamíferos, causando uma infecção cutânea chamada dermatofitose, que
é comum por todo o mundo, e com grande importância para a saúde pública e veterinária
(Cafarchia et al., 2013; De Baere et al., 2010).
Dentre os parâmetros de diagnóstico aplicados aos dermatófitos, os principais
foram características clínicas de culturas e morfologia de conídios, ainda utilizados, apesar
das variações conhecidas e pleomorfismo (culturas podem mudar drasticamente após
321
algumas transferências em meio de cultura em laboratório). No entanto, a identificação por
técnicas moleculares (de fingerprinting e tecnologias de sequenciamento) mostraram-se
essenciais para o diagnóstico, além de contribuírem significativamente para a compreensão
da biodiversidade de dermatófitos (Cafarchia et al., 2013; Gräser et al., 1999).
Um método eficiente de extração de DNA genômico é necessário para dar
prosseguimento às técnicas moleculares a serem empregadas. A extração de DNA em
métodos convencionais consiste nas etapas de lise celular, purificação e precipitação. Os
kits comerciais se baseiam nessas etapas, mas com diferenças nas etapas de purificação e
precipitação do DNA, utilizando em sua maioria, colunas de sílica (Caldart et al., 2011).
Nosso grupo de pesquisa do ILMD/FIOCRUZ, que trabalha com fungos
patogênicos na Amazônia, utiliza o método de extração em kit da Qiagen (Blood & Tissue)
para as espécies de Candida e Cryptococcus. No entanto, para dermatófitos o método não
se mostrava eficiente e foi feita uma investigação sobre qual o melhor e quais modificações
deveriam ser feitas para se alcançar um método de extração eficiente, em quantificação,
pureza e amplificação da região ITS em PCR (região utilizada para estudos de
identificação) para dermatófitos.
Material e Métodos
Foram utilizadas nove amostras de dermatófitos, três da espécie Microsporum canis,
um Microsporum gypseum e cinco Trichophyton rubrum, para a análise de três protocolos
de extração, Ferreira & Grattapaglia (1998) modificado, kit Qiagen Blood & Tissue e Mini
kit Qiagen Dneasy Plant.
Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado
Na etapa de trituração do micélio foram utilizadas nove culturas puras de dermatófitos
com tempo de crescimento entre sete e 14 dias em meio de cultura Agar Sabouraud. As
culturas foram removidas do meio de cultura e acondicionadas em papel filtro a -80
ºC/30min. Após o congelamento, o micélio foi transferido para um microtubo de 2mL
junto de beads de aço inox e congelado em Nitrogênio líquido (N2) por um tempo de
exposição de 15 segundos. Em seguida foi mantido sob agitação vigorosa em Tissuelyser
programado com 50 oscilações/min durante cinco minutos. Ao se obter um pó fino do
micélio, seguiu-se para a etapa de obtenção e purificação do DNA. Na etapa de obtenção e
purificação do DNA, foram utilizados 200mg do micélio em pó e 800µL de Tampão de
lise (NaCl 1,4M; Tris-HCl 100mM, pH8,0; CTAB 4%; β-mercaptoetanol 1,5%). Após a
322
homogeneização em vórtex, adicionou-se 20µL de Proteinase K, e foi incubado a -56
ºC/overnight. Depois do tempo de incubação, foi adicionado CIA (Clorofómio-álcool
isoamílico, 24:1) misturado por inversão 20 vezes, seguindo com uma centrifugação a
12000 rpm por cinco minutos. A fase aquosa foi transferida para um microtubo de 1,5 mL,
onde adicionou-se Isopropanol gelado e misturou-se por inversões suaves, e o DNA foi
precipitado durante a incubação a -20ºC/1h. Após a precipitação do DNA, centrifugou-se a
14000rpm por cinco minutos, descartou-se o sobrenadante e o pellet foi lavado com 500
µL de Etanol 70 % gelado. Após uma centrifugação a 14000 rpm por cinco minutos, o
sobrenadante foi descartado e o pellet foi seco à temperatura ambiente, quando foram
adicionados 100 µL de Tampão de eluição (Tris-HCl 10mM, pH 8,0; EDTA 1mM, pH 8,0)
e incubou-se a 37ºC por 30min.
Kit Qiagen Blood & Tissue e Mini Kit Qiagen Dneasy Plant
Foram utilizados os protocolos descritos nos respectivos Manuais de cada kit. Mas foi
feita uma modificação no início do protocolo, utilizando os mesmos passos de quebra e lise
celular do micélio utilizado no protocolo de Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado,
onde foram usados 200 µL do micélio em solução com tampão de lise (NaCl 1,4M; Tris-
HCl 100mM, pH8,0; CTAB 4%; β-mercaptoetanol 1,5%) e proteinase K. Seguiu-se com as
instruções recomendadas nos Manuais da Qiagen do kit Blood & Tissue e Dneasy Mini Kit
Plant, partindo da adição de 200 µL de Etanol (96%-100%) e do Tampão P3 (130μL)
respectivamente.
Reação da polimerase em cadeia (PCR) da região ITS
Para a reação de amplificação da região ITS, as concentrações de DNA foram diluídas
em tampão de eluição de DNA (Tris-HCl 10mM, pH 8,0; EDTA 1mM, pH 8,0) para uma
concentração de 7,5 ng/μL, massa total de DNA de 15 ng em 25 μL de volume de PCR. As
condições utilizadas foram de 95ºC por dois minutos, 95ºC por 30 segundos, 35 ciclos em
55ºC por 40 segundos e 72ºC por 45 segundos, com uma extensão de 10 minutos em 72ºC.
Resultados e Discussão
Com o auxílio do BioDrop™, pode-se estimar a concentração de DNA obtido em 100
μL de Tampão de Eluição (em cada método de extração foi utilizado seu próprio tampão de
323
eluição), e também o grau de pureza do DNA obtido, utilizando os parâmetros de relação
de A260/280 entre 1,8 e 2,0 (Wilfinger et al., 1997).
Com base na concentração e pureza estimados, o método de extração de DNA do kit
Qiagen Blood & Tissue apresentou uma média de 19,9 ng/μL de DNA em 100 μL de
tampão de eluição, e média de pureza em 2,0 de absorbância na relação 260/280. O método
Mini Kit Qiagen Dneasy Plant apresentou média de concentração 5,1 ng/μL e pureza em
1,9 na relação 260/280, e o método Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado apresentou
média de concentração 39,1 ng/μL e pureza em 1,9 na relação 260/280 (Tabela 1).
Tabela 6 - Resultados de concentração, pureza e amplificação de DNA obtidos para cada
amostra relacionado com o método de extração de DNA utilizado.
Legenda: (a) Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado; (b) método kit Qiagen Blood &Tissue; e (c) método
Mini kit Qiagen Dneasy Plant.
EspécieMétodo de
extração
Pureza
(A260/A280)[DNA] ng/µl
Amplificação ITS
em PCR
(a) 1,5 149,6 Sim
(b) 1,9 41,4 Não
(c) 2 8,7 Não
(a) 2 28 Não
(b) 2,1 37,5 Sim
(c) 1,9 7,2 Sim
(a) 1,8 3,8 Sim
(b) 2 5,3 Não
(c) 1,9 1,3 Não
(a) 2 16 Não
(b) 2 23,6 Não
(c) 1,9 6,8 Sim
(a) 2 46,1 Sim
(b) 2 15 Não
(c) 2 6,8 Não
(a) 2 93,7 Não
(b) 2 17 Não
(c) 1,9 5,3 Sim
(a) 1,8 5,6 Sim
(b) 2 15,9 Não
(c) 1,9 6,7 Não
(a) 1,8 4,4 Sim
(b) 2 15,1 Não
(c) 1,7 1,5 Não
(a) 1,8 4,4 Não
(b) 2 8,1 Não
(c) 1,8 1,3 Não
Trichophyton rubrum
(1714 M)
Trichophyton rubrum
(179 S)
Trichophyton rubrum
(325 S)
Microsporum gypseum
(107 M)
Microsporum canis
(1080 M)
Microsporum canis
(126 M)
Microsporum canis
(1409)
Trichophyton rubrum
(1197 S)
Trichophyton rubrum
(1523 M)
324
Apesar da maior média de concentração de DNA extraído não ser pelo método de
extração kit Qiagen Blood&Tissue, ele apresentou dados bem reproduzidos em todas as
amostras (Tabela 1).
Houve concentração de DNA excelente para quase todas as amostras pelo método de
extração do Kit Qiagen Blood &Tissue, porém com pureza estimada em 2,0 (260/280), o
que pode indicar a presença de RNA (Wilfinger et al., 1997), podendo ser um fator de
interferência na PCR, dentre outros (Lee et al., 2010), visto que somente a amostra 1080M
apresentou amplificação na PCR (amostra de numeração 27 na Figura 1) quando utilizado
esse método.
Figura 1- As amostras foram aplicadas de acordo com os métodos de extração de DNA realizados
anteriormente à PCR: 1 a 9 - Ferreira e Grattapaglia (1998) modificado; 10 a 18 - Mini kit Qiagen
Dneasy Plant; e, 19 a 27 - Kit Qiagen Blood & Tissue. Amplificações consideradas bem-sucedidas a partir de 200pb, sendo desconsideradas as bandas 14, 23, 24, 25 e 26. Dermatófitos: 107M (1, 10,
19), 1714M (2, 11, 20), 126M (3, 12, 21), 179S (4, 13, 22), 1197S (5, 14, 23), 1523 (6, 15, 24),
325S (7, 16, 25), 1409 (8, 17, 26), 1080M (9, 18, 27).
O método que mostrou melhores resultados foi o de Ferreira e Grattapaglia (1998)
modificado, apesar de não ter apresentado uma boa reprodução em todas as amostras, e
indicado graus de proteínas encontradas em pelo menos uma amostra (valor da relação
260/280 menor que 1,8 na amostra 107M), e presença de RNA em outras quatro (valores
na relação 260/280 maior que 2,0), este método se mostrou mais eficiente na PCR, onde
obtivemos amplificações das amostras 107M, 1714M, 126M, 179S e 1197S, coforme
observado na Figura 1, como as amostras 1, 2, 3, 4, e 5 respectivamente.
O método de extração Mini Kit Qiagen Dneasy Plant não foi eficiente para uma
concentração ideal de DNA, mas para a concentração obtida estimou-se um grau de pureza
dentro do padrão preconizado na biologia molecular, com apenas duas amostras
apresentando 2,0 na relação 260/280, e apresentando amplificações que podem ser vistas
nas amostras 325S, 1409, 1080M, na Figura 1 como 16, 17 e 18.
325
Conclusão
A pulverização do micélio no início do protocolo de extração de DNA permite uma
eficiência do método, no entanto, quando se leva em conta a purificação do DNA, seja por
precipitação ou por afinidade em coluna de sílica, ambos proporcionam um resultado
eficiente para dar sequência às análises em Biologia Molecular necessárias. Mas, o método
de Ferreira e Grattapaglia (1998) com modificações se mostrou o melhor para extração de
ácidos nucleicos dos dermatófitos testados.
Referências
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Detecção de Micobactérias de Crescimento Rápido em aparelhos
videoscópicos na cidade de Manaus - AM.
Silva, T.G1., Teles, A.L.M
1., Souza, L.C.A
2., Araujo, K.S
3., Cordeiro, A.T.D
3., Santos,
J.G4., Cruz Filho, R.F
4.
1Graduada em Medicina pela Universidade Federal do Amazonas,
2Graduanda em Ciências
Naturais pela Universidade Federal do Amazonas, 3Graduanda em Ciências Biológicas pela
Universidade Federal do Amazonas, 4Professor da Universidade Federal do Amazonas. Email:
[email protected], [email protected].
Resumo
Micobactérias de crescimento rápido (MCR) são bacilos álcool-ácido resistentes que vêm
assumindo destaque nos casos de infecções hospitalares no Brasil. As MCR são
patógenos oportunistas geralmente associados a infecções pós-operatórias. Em 2007,
pacientes submetidos a procedimentos médicos que utilizaram aparelhos videoscópicos
desenvolveram quadros ainda não vistos no país. Estava-se à frente de um surto de
micobacteriose. Ao contrário das metodologias utilizadas em estudos vigentes, este não
fez uso de amostras orgânicas como fonte de pesquisa. As coletas foram feitas a partir de
aparelhos de vídeo previamente reprocessados, utilizados em clínicas e hospitais públicos
e privados de Manaus – AM durante o período de agosto/2009 a julho/2011, visando
verificar se estes são as fontes condutoras da infecção. Coletaram-se amostras de pontos
específicos com swabs estéris dos videoscópios antes de serem utilizados. Utilizaram-se
2 (dois) métodos de análise: baciloscopia com coloração de Ziehl-Neelsen, para verificar
a positividade ou não para bacilo álcool ácido resistente (BAAR), e a cultura a partir do
meio Löwenstein Jensen (LJ). Do total de 175 amostras, 3 (1,71%) apresentaram BAAR
positivo, o que se torna relevante frente a análise de aparelhos que deveriam estar estéreis
antes dos procedimentos médicos.
Palavras-chave: Micobactérias de Crescimento Rápido, Aparelhos Videoscópicos,
Reprocessamento de Materiais, Infecções Hospitalares.
Introdução
Surtos e infecções associados a micobactérias de crescimento rápido (MCR) vêm
sendo relatados desde 1938, quando o primeiro caso foi citado mundialmente. Em
praticamente todas as infecções hospitalares causadas por este grupo de microrganismos,
houve falhas nos processos de esterilização de instrumentos e dispositivos médicos, e
com soluções cirúrgicas (Duarte et al., 2009; Fontana, 2008).
Recentemente tem-se observado um aumento do número dessas infecções após
implantes mamários e, cirurgias/processos vídeo-assistidos. A resistência desses
327
organismos ao gluteraldeído, a baixa suscetibilidade a desinfetantes de alto nível, a
exposição do instrumental à água contaminada com um grande número de micobactérias,
e a cloração inadequada são hipóteses levantadas como causas (Lorena et al., 2009).
As MCR são ambientais, sendo encontradas no solo e na água. Não são
consideradas nocivas ao homem, mas em condições favoráveis, como em pacientes
imunossuprimidos, tornam-se patogênicas (Murillo et al., 2000; Tortoli, 2004; Kanai,
2006).
Infelizmente, a detecção desta bactéria no organismo humano só é feita depois de
instalado o quadro infeccioso. O diagnóstico é realizado a partir de baciloscopia e cultura
do líquido orgânico e/ou da biópsia da ferida cirúrgica (Brasil, 2008; Barreto e Campos,
2000).
A ausência de dados sobre as infecções pós-cirúrgicas causadas pelas micobactérias na
literatura científica de Manaus – AM e a prevalência delas nas demais cidades brasileiras
impulsionam uma investigação minuciosa dos materiais cirúrgicos e de seus
procedimentos de limpeza, visto que são tidos, inclusive pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA, 2004 a,b,c), como ambientes de proliferação – formação
de biofilmes - e causas de infecção por MCR (Macedo e Henriques, 2009;
DVE/DVS/CEVS/SES/ERGS. NT nº1, 2007; Pitombo et al., 2009).
Este trabalho teve como objetivo, verificar se o instrumental é uma fonte da
infecção hospitalar. Embora muito se especule, não há na literatura científica, pesquisa
ou metodologia específica em tal âmbito, o que torna o projeto inédito. Em 2009, não
havia relatos de surtos de micobacterioses na cidade de Manaus – Am. Entretanto em
2010, Manaus passou a fazer parte dessa estatística (Dantas, 2010; Freire, 2010).
Material e Métodos
A coleta das amostras foi realizada em clínicas e hospitais, públicos e privados de
Manaus – AM de acordo com a autorização destes e dos médicos responsáveis pelos
aparelhos videoscópicos, perante carta de informação à instituição e termo de
consentimento, respectivamente
As amostras foram analisadas no laboratório de Microbiologia do Departamento de
Parasitologia do Mini-Campus da Universidade Federal do Amazonas (UFAM),
conforme Normativas da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2004
a,b,c).
328
As coletas ocorreram a partir de videoscópios previamente reprocessados. Eles
foram divididos, didaticamente, em críticos, aqueles que são introduzidos diretamente na
corrente sanguínea ou em outras partes do corpo, sendo, portanto, invasivos, devendo ser
obrigatoriamente esterilizados; e semi-críticos, cujo contato é restrito a mucosas íntegras,
devendo no mínimo ser submetidos à desinfecção de alto nível.
Foram excluídos aparelhos termossensíveis, descartáveis e não reprocessados.
As coletas foram realizadas através de swab estéril, com certificação da ANVISA.
No aparelho videolaparoscópico coletaram-se em três áreas distintas: pinça Meriland,
ponta da ótica e trocater. No endoscópico, em três locais: ponta da ótica, pinça de biópsia
e guia (trocater). A semeadura em ziguezague foi feita no sítio cirúrgico em tubos de
ensaio com 5 mL do meio sólido Löwenstein Jensen (LJ), não tendo sido necessário o
uso de meios de transporte (Barrow e Feltham, 1999).
Os tubos de ensaio ficaram na estufa a 37 ºC, sendo realizadas análises diárias até 7
dias após a semeadura. Quando houve colonização bacteriana, realizou-se a coloração de
Ziehl-Neelsen, verificando-se a positividade ou não para BAAR (ANVISA, 2004 a,b,c).
Quando nas primeiras análises não se observava crescimento de colônias, os tubos
passavam a ser analisados uma vez por semana até a 8ª semana, para não descartar a
possibilidade de encontrar micobactérias de crescimento lento (MCL) (Della-Latta e
Weitzman, 1998; Barrow e Feltham, 1999; Cabral e Andrade, 2011;
MBT/MS/SVS/CRHF/DVE/ CLSP, 2005).
A coleta em um mesmo aparelho foi, na sua maioria, realizada cinco vezes,
entretanto em dias alternados e/ou durante o intervalo de um procedimento e outro,
quando possível, buscando-se a fidedignidade das amostras.
Resultados e Discussão
Entre agosto/2009 e julho/2011 foram realizadas coletas em clínicas e hospitais
públicos e privados de Manaus – AM, em 10 aparelhos de vídeo previamente
reprocessados, sendo 3 críticos e 7 semi-críticos. Do total de 175 amostras, 44 (25%)
correspondem aos aparelhos críticos (videolaparocopias) e 131 (75%) aos semi-críticos
(endoscopias) (Figura 1)
329
25%
75%
Figura 1: Amostras por Aparelhos Videoscópicos : críticos e semi-críticos.
Das amostras adquiridas nos aparelhos críticos, todas (44 amostras) foram
coletadas a partir de procedimentos de cirurgia geral. As dos aparelhos semi-críticos
correspondem às endoscopias, sendo 91(69%) de endoscopias digestivas altas, 14 (11%)
de cistoscopias, 7 (5%) de laringoscopias, 17 (13%) de broncoscopias e 2 (2%) de
colonoscopias (Figura 2).
Figura 2: Amostras por prodecimentos de aparelhos videoscópicos semi-críticos.
De todas as amostras, 3 (1,71%) apresentaram baciloscopia positiva para BAAR.
Conforme análise do tempo de crescimento, pode-se dizer que foram encontradas duas
amostras com MCR e uma com MCL (Tabela 1).
330
Tabela1: Amostras com coloração de Ziehl-Neelsen positivas. (MCR: Micobactéria de
Crescimento Rápido; MCL: Micobactéria de Crescimento Lento)
Amostras Procedimentos BAAR Tempo de
crescimento
Micobacterias
A4 – Ótica Cistoscopia + 4 semanas MCL
A4– Guia
(Trocater)
Cistoscopia + 1 semana MCR
G2 – Ótica Cirurgia Geral + 48 horas MCR
Não foi possível identificar as subespécies das colônias de micobactérias
encontradas, pois não dispúnhamos de instrumentos para a realização de análise
molecular, o método mais indicado.
A preocupação com o reprocessamento de aparelhos de vídeo deve ser maior, uma
vez que a biossegurança do paciente durante a realização de procedimentos médicos não
está sendo respeitada totalmente e as consequências estão surgindo com o passar do
tempo.
O aparecimento de colônias de microrganismos em aparelhos que estariam
devidamente reprocessados é um dado significante para este trabalho, visto que coloca o
videoscópio como a fonte da infecção. E levanta outro questionamento: onde estaria o
erro? Segundo Cabral e Andrade (2011), fatores como a formação de biofilme, as
complexas estruturas dos videoscópios e o não cumprimento do tempo de
reprocessamento estão entre as possíveis respostas.
Conclusões
A detecção de microrganismos em aparelhos que passaram pelas etapas de
reprocessamento servem de alerta. Maior importância deve ser dada aos procedimentos
básicos de limpeza dos videoscópios.
Faz-se necessário um controle mais rigoroso nas etapas de reprocessamento e nas
inspeções das Centrais de Materiais e Esterilizações (CMEs), dos videoscópios assim como
do instrumental médico.
Referências
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Avaliação da patogenicidade de fungos filamentosos: Aldeia Fronteira –
Mundurukú, Borba–AM.
Souza I. S. ¹, Silva D. M.², Fernandes O.C.C. ¹, Rodrigues J. C.¹
¹Instituto Leônidas e Maria Deane/Fiocruz-Amazônia, ²Universidade Federal do Amazonas, E-
mails: [email protected], [email protected],
[email protected], [email protected].
Resumo
Os fungos são agentes causadores de processos infecciosos ou micoses de grande
relevância, por apresentar quadros que podem passar de benignos sintomáticos a
assintomáticos. Sua rápida evolução pode causar uma hipersensibilidade imediata ou
tardia, promovendo quadros alérgicos, ou intoxicações pela eliminação de toxinas, ou por
ingestão de fungos macroscópicos toxígenos. Portanto o objetivo deste trabalho foi avaliar
o potencial de patogenicidade de fungos filamentosos isolados da nasofaringe de índios da
aldeia fronteira, Borba – AM. Neste estudo foram utilizados 39 fungos, coletados da aldeia
de contato frequente do Mundurukú, Borba–AM, isolados e purificados em Ágar Saboroud
com cloranfenicol para verificar a viabilidade celular e pureza das culturas para posterior
realização dos ensaios biológicos e identificação em nível de gênero. Três parâmetros
patogênicos foram testados: Crescimento a 37 ºC, produção de urease e teste de
micotoxina. Observou-se que das 39 amostras, 30 foram capazes de crescer a 37 ºC, 34
produzem ureases e 10 são produtoras de micotoxina. Das 39 culturas fúngicas testadas, 10
apresentarem resultados positivos para todos os parâmetros investigados.
Palavras chave: Fungos, patogenicidade, micotoxina.
Introdução
Fungos são seres dispersos no meio ambiente que apresentam uma capacidade de
adaptação em diversos tipos de substratos naturais, tais como, em vegetais, ar atmosférico,
solo e água e, embora sejam estimados em 250 mil espécies, menos de 150 foram descritos
como patógenos aos seres humanos (Bressan, 2005). Muitos fungos também apresentam
característica patogênica, ou seja, capacidade de infectar o homem e animais, causando-lhe
micoses do tipo: superficiais, cutâneas, subcutâneas, sistêmicas e oportunistas. A principal
334
razão para a patogenicidade dos fungos pode ser expressa pela habilidade do fungo crescer
a temperaturas de 35 – 37 ºC e possuir um sistema enzimático que possibilita o parasitismo
em tecidos animais e circunstâncias que exponham o hospedeiro aos esporos fúngicos
(Oliveira, 2005).
No entanto, essa habilidade dos fungos em causar doenças em humanos parece ser
um fenômeno acidental, diagnosticado como infecções oportunistas, com raríssimas
exceções, e estaria associada ao estado imunitário do indivíduo e a sua exposição ao
ambiente (Wanke et al., 2000). Muitos gêneros são oportunistas, podendo tornar-se
potencialmente patogênicos ao homem que se encontra com sua imunidade comprometida,
ou seja, imunodeprimidos e crescem rapidamente formando colônias maduras em poucos
dias, tornando-se patógenos oportunistas causando graves doenças (Andraus, 2003).
O conhecimento dos fungos como agentes causadores de processos infecciosos ou
micoses é de grande relevância, pois os quadros podem passar de benignos sintomáticos
para assintomáticos, graves e de rápida evolução, bem como os causadores de
hipersensibilidade imediata ou tardia, promovendo quadros alérgicos, ou intoxicações pela
eliminação de toxinas, ou por ingestão de fungos macroscópicos toxígenos (Lima, 2012).
Diante deste contexto torna-se importante avaliar o potencial de patogenicidade de fungos
filamentosos isolados da nasofaringe de índios da aldeia fronteira, Borba – AM.
Material e Métodos
Neste estudo foram utilizados 39 fungos filamentosos isolados em Ágar Saboroud
com Cloranfenicol, da nasofaringe de índios da aldeia de contato frequente do Mundurukú,
Borba – Amazonas, para avaliação do potencial de patogenicidade e identificação em nível
de gênero (Tabela 1).
Três parâmetros patogênicos foram testados: Crescimento a 37 ºC, produção de
urease, e teste de micotoxina.
As amostras purificadas foram semeadas em meio Ágar Malte e incubadas em
estufa de crescimento do tipo B.O.D. à temperatura de 37 °C com observações diárias
durante sete dias (Da Silva, 1999; Silva-Neves, 2006). As culturas que apresentaram
crescimento após o período de incubação foram consideradas para os testes de urease e
micotoxinas (Figura 1).
335
Tabela 1. Fungos isolados da nasofaringe de índios da Aldeia do Mundurukú.
Para o teste de urease as culturas purificadas foram semeadas em tubos de ensaios
com meio Ágar Christensen e incubadas à temperatura de 24 °C - 28 °C com observações
diárias durante sete dias (Da Silva, 1999; Silva-Neves, 2006). Após esse período um
padrão de coloração vermelho – fuccina do meio indicava resultado positivo (Figura 2).
Código Gênero Código Gênero Código Gênero Código Gênero
AFM 20 Aspergillus sp. AFM 49 Aspergillus sp. AFM 68 Penicillium sp. AFM 90 Aspergillus sp.
AFM 64 Penicillium sp. AFM 31 Aspergillus sp. AFM 91 Aspergillus sp. AFM 55 Penicillium sp.
AFM 60 Aspergillus sp. AFM 38 Penicillium sp. AFM 66 Penicillium sp. AFM 69 Penicillium sp.
AFM 34 Penicillium sp. AFM 62 Penicillium sp. AFM 70 Penicillium sp. AFM 65 Penicillium sp.
AFM 11 Penicillium sp. AFM 32 Aspergillus sp. AFM 28 Penicillium sp. AFM 61 Aspergillus sp.
AFM 27 Penicillium sp. AFM 52 Aspergillus sp. AFM 63 Penicillium sp. AFM 30 Aspergillus sp.
AFM 01 Penicillium sp. AFM 48 Aspergillus sp. AFM 35 Penicillium sp. AFM 59 Penicillium sp.
AFM 57 Penicillium sp. AFM 71 Penicillium sp. AFM 45 Penicillium sp. AFM 33 Penicillium sp.
AFM 92 Aspergillus sp. AFM 94 Aspergillus sp. AFM 67 Penicillium sp. AFM 50 Aspergillus sp.
AFM 42 Penicillium sp. AFM 53 Penicillium sp. AFM 93 Aspergillus sp.
Figura 1. Crescimento em 37 °C
Figura 2. Teste para a produção de urease
336
As culturas foram semeadas em meio específico Ágar Coco e incubadas em estufa
de crescimento do tipo B.O.D à temperatura ambiente de 26 °C – 28°C com observações
diárias durante sete dias (Lin e Dianese, 1976). Para a leitura dos resultados, as colônias
foram examinadas visualmente e sob luz UV de comprimento onda longa de 365 nm
(Figura 3).
Resultados e Discussão
Com base nos resultados obtidos, observou-se que das 39 amostras, 76,9 % (30)
foram capazes de crescer a 37 ºC; 84,6 (33) para o teste de ureases e 25,6% (10) foram
positivas quanto à produção de micotoxina (Tabela 2). Das 39 culturas fúngicas testadas,
10 culturas apresentaram resultados positivos para todos os parâmetros investigados.
Verificou-se que todos os 15 Aspergillus cresceram a 37 ºC e que 33 das 39
culturas analisadas produziram urease. Apesar da importância da atividade ureásica na
patogenicidade do fungo encontrar-se em debate, vários estudos já vem mostrando o papel
dessa enzima como facilitadora de infestação no sistema nervoso central (Olszewski et al.,
2002; Varma et al., 2006;) e também mostra correlação positiva com a patogenicidade de
outros fungos patogênicos para humanos, como o Paracoccidioides
brasiliensis (Rappleye., et al., 2006) e as leveduras Cryptococcus neoformans e C. gattii
(Cox et al., 2000).
Quanto ao teste de micotoxinas, dez culturas (25,6%) apresentaram alteração na
coloração no meio indicando sua produção. As micotoxinas são metabolitos tóxicos
secundários produzidos por uma variedade de fungos que surgem de forma natural em
Figura 3. Teste para a produção de micotoxina
337
produtos agroalimentares em todo o Mundo, principalmente os gêneros Aspergillus,
Penicillium e Fusarium, sendo tóxicas para humanos e animais, quando ingeridas em
pequenas quantidades (Freire, 2007).
Tabela 2. Fungos capazes de crescer em 37 °C, produzir ureases e micotoxinas. Código/ Gênero Crescimento em 37 °C Produção de ureases Produção de micotoxina
AFM 01 Penicillium sp. + + +
AFM 20 Aspergillus sp. + + +
AFM 27 Penicillium sp. + + +
AFM 28 Penicillium sp. + + +
AFM 30 Aspergillus sp. + - -
AFM 31 Aspergillus sp. + + -
AFM 32 Penicillium sp. + + -
AFM 33 Penicillium sp. + + -
AFM 35 Penicillium sp. + + -
AFM 38 Penicillium sp. - + -
AFM 42 Penicillium sp. + + +
AFM 45 Penicillium sp. + + -
AFM 48 Aspergillus sp. + + -
AFM 49 Aspergillus sp. + + -
AFM 50 Aspergillus sp. + + -
AFM 52 Aspergillus sp. + - -
AFM 53 Penicillium sp. + + -
AFM 55 Penicillium sp. + + -
AFM 57 Penicillium sp. + + +
AFM 59 Aspergillus sp. - + -
AFM 60 Aspergillus sp. + + +
AFM 61 Aspergillus sp. + + -
AFM 62 Penicillium sp. + + -
AFM 63 Penicillium sp. - + -
AFM 64 Penicillium sp. - + -
AFM 67 Penicillium sp. + + +
AFM 68 Penicillium sp. + + -
AFM 69 Aspergillus sp. + + -
AFM 70 Penicillium sp. - + -
AFM 71 Penicillium sp. + + -
AFM 90 Aspergillus sp. + + -
AFM 91 Aspergillus sp. + + -
AFM 92 Aspergillus sp. + + -
AFM 93 Aspergillus sp. + + +
AFM 94 Aspergillus sp. + + +
338
Os principais efeitos tóxicos destas micotoxinas são: hemorragias intestinais e
renais, tumores no fígado e hepatite aguda, edema cerebral e pulmonar, convulsões,
náuseas temporárias e vômitos, dor de cabeça, tontura, febre e anorexia e dentre outras
doenças. A severidade dos efeitos tóxicos depende grandemente das quantidades ingeridas,
(se ingeridas em grandes quantidades, podem causar a morte - micotoxicoses), do tempo de
exposição e das possíveis sinergias toxicológicas que podem advir da ingestão de diversas
micotoxinas simultaneamente (Soares, 2013).
Conclusões
Das 39 amostras, 30 foram capazes de crescer a 37º C;
Trinta e três produzem ureases;
Dez são produtoras de micotoxina, sendo quatro Aspergillus sp. (AFM 20, AFM 60
e AFM 93 e AFM 94) e seis Penicillium sp. (AFM 01, AFM 27, AFM 28, AFM 42, AFM
57, AFM 67).
Agradecimentos
Ao Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/ Fiocruz – AM.
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Fernandes O.C., Andrade S.L., Souza A.Q.L. Diversidade Microbiana da Amazônia. vol. 2, 2017. Editora INPA
Microbiota bacteriana da mucosa oral de cães (Canis lupus familiaris)
atendidos em clínica veterinária na cidade de Manaus, AM.
Xavier M.S.1, Lisbôa R.S.
2, Guedes V.T.M.
3, Souza F.S.
2
1Graduação em Medicina Veterinária, Escola Superior Batista do Amazonas,
2Doutor(a) em
Ciências Veterinárias, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,3Mestre em Ciências de
Alimentos, Universidade Federal do Amazonas. Emails: [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected]
Resumo
A microbiota oral é semelhante entre os animais domésticos, sendo a superfície
bucal, a língua e os dentes. habitados por microrganismos aeróbios facultativos e
obrigatórios. As bactérias na mucosa oral podem penetrar na corrente sanguínea, se
acumular e causar lesões em outros órgãos. O presente trabalho objetivou analisar a
microbiota bacteriana da mucosa oral de cães comparando-a com o tipo de alimentação e
presença de doença periodontal de animais atendidos por uma clínica veterinária da cidade
escola de Manaus, AM. Foram coletadas amostras da cavidade oral de 30 cães sem
distinção de raça, sexo ou idade, utilizando swabs estéreis de três sítios anatômicos
distintos. Após a coleta, foram confeccionados esfregaços diretos, fixados na chama de
uma vela e posteriormente corados pela técnica de Gram e analisados. Os microrganismos
detectados foram classificados de acordo com suas características morfológicas. A
incidência de Simonsiella spp. foi de 100% nas amostras de mucosa oral analisadas. Em
sua maioria, os microrganismos encontrados eram Gram-positivos, com os cocos (86,7%)
em maior proporção de ocorrências seguidos pelos bacilos (66,7%), estreptobacilos
(56,7%) e diplococos (53,3%). Independentemente do tipo de alimentação recebida, os
animais estudados apresentaram, em sua maioria, os mesmos grupos de microrganismos. A
presença de doença periodontal não influenciou na diversidade de microrganismos
encontrados, assim como a alimentação.
Palavras-chave: Canídeos, Microrganismos, Placa bacteriana. Animais de companhia.
Introdução
A microbiota oral é semelhante entre os animais domésticos sendo a superfície
bucal, a língua e os dentes habitados por microrganismos aeróbios facultativos e
obrigatórios. Estes incluem estafilococos, estreptococos α e β hemolíticos, Pasteurella
spp., Actinomyces spp. (A. viscosus e A. hordeovulveris), Proteus spp., Bacteroides spp.,
Micrococcus spp., Lactobacillus spp., Mycoplasma spp., bacilos fusiformes, coliformes,
Neisseria spp., EF-4 (“fermentador eugônico”), Simonsiella spp., espiroquetas, leveduras e
hemófilos (Hirsh e Zee, 2009; Rocco, 2009).
341
Braga et al. (2005) realizaram coletas da microbiota periodontal de cães da raça
pastor alemão provenientes do canil da Polícia Militar de Belo Horizonte, MG e
encontraram 49 espécies diferentes com predomínio dos gêneros Pasteurella,
Staphylococcus, Porphyromonas e Fusobacterium. Já Fonseca et al. (2011), em Brasília,
relataram que das 20 amostras que coletaram de cães da raça Labrador Retriever, os
gêneros mais frequentemente isolados foram Staphylococcus e Pasteurella, sendo que
Staphylococcus é compositor da microbiota oral de cães saudáveis e, por isso, não indica
necessariamente doença por possuir baixo potencial periodontopatogênico. Portanto, a
boca é rica em microbiota, sendo comum encontrar agentes microbianos com ou sem
significado patogênico. A sua importância depende do tipo de agente e das lesões
causadas. Por exemplo, as bactérias do gênero Simonsiella, apesar de se apresentarem em
grande número na cavidade oral, não são patogênicas (Peleteiro et al., 2011).
Porém, as bactérias existentes na mucosa oral do animal podem, através de lesões,
penetrar na corrente sanguínea, se acumular e causar lesões em outros órgãos como rins,
fígado, coração e articulações, podendo assim a boca atuar como foco de infecção
(Rezende et al., 2004; Pieri e Moreira, 2010). Um exemplo desencadeador deste processo
pode ser a partir da doença periodontal que é causada pelo acúmulo de bactérias, formando
uma placa, sobre a superfície dental. Estas bactérias interagem com os componentes da
resposta imune celular e humoral do hospedeiro, levando a uma inflamação gengival e
destruição dos tecidos podendo levar à perda do elemento dental envolvido podem migrar
pela corrente sanguínea e colonizar órgãos vitais causando doenças diversas (Rezende et
al., 2004; Roza, 2004; Pieri e Moreira, 2010).
O canal alimentar é o único local contaminado em que o esfregaço direto pode
ajudar a determinar se há uma doença bacteriana infecciosa, tendo a técnica de coloração
de Gram como uma das determinações mais importantes na identificação presuntiva dos
microrganismos, sendo um recurso auxiliar no diagnóstico de doenças bacterianas (Freitas
e Picoli, 2007; Koneman et al., 2001). A morfologia das células bacterianas, sua disposição
e suas características na coloração são suficientemente diferentes para permitir a
identificação presuntiva em um esfregaço (Koneman et al., 2001).
O aumento da expectativa de vida dos animais de estimação tem gerado uma
preocupação maior com a saúde bucal já que as doenças orais podem interferir na saúde
geral do cão, portanto é necessário identificar microrganismos patogênicos existentes na
cavidade oral de cães para facilitar a escolha do tratamento em casos de mordeduras ou até
342
lambeduras, já que a intimidade tem sido maior entre animal e proprietário, aumentando o
risco de transmissão de doenças.
Visando contribuir com a escassa pesquisa na região amazônica, o presente trabalho
objetivou analisar a microbiota bacteriana da mucosa oral de cães, comparando-a com o
tipo de alimentação e presença de doença periodontal de animais atendidos por uma clínica
veterinária da cidade escola de Manaus, AM.
Material e Métodos
O presente trabalho usou um delineamento observacional descritivo do tipo
transversal.
Foram utilizados 30 cães sem distinção de raça, sexo ou idade, do atendimento da
clínica veterinária escola da cidade de Manaus, Amazonas. Os animais foram oriundos do
atendimento clínico, sendo 21 levados à clínica e nove atendidos na comunidade ribeirinha
Tupé, na qual a clínica veterinária escola participou de um projeto social e os médicos
veterinários realizaram atendimentos a domicílio.
As amostras foram coletadas com swabs estéreis girados sobre a superfície de três
sítios anatômicos distintos, como mucosa gengival, biofilme dental do canino superior
direito ou esquerdo e quarto pré-molar inferior dos cães. Todas as coletas foram realizadas
com as mãos calçadas com luvas de procedimento .
Os cães utilizados no estudo foram colocados sobre a mesa de atendimento e
contidos de forma manual pelos estagiários ou pelo próprio dono, sem a colocação de
focinheira. Apenas um cão, anestesiado para procedimento cirúrgico, a contenção não foi
necessária.
Após as coletas, foram feitas perguntas aos tutores dos animais para um inquérito
epidemiológico de dados sobre o animal (nome, sexo, raça, idade), tipo de alimentação
(ração, comida ou ambos), outras informações relacionadas à saúde bucal do animal e
regime de criação, sendo considerados domiciliados (animais com dono, supervisionados
ou controlados, que não saem na rua sem acompanhamento), semidomiciliados (dependem
do dono para sua alimentação e seu abrigo, mas têm livre acesso à rua) e errantes (ninguém
se responsabiliza por eles, vivem nas ruas) (WHO e WSPA, 1992).
Os tutores dos animais assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TCLE) existente na clínica veterinária escola para a realização de diferentes
procedimentos.
343
O projeto foi aprovado pelo comitê de ética de uso animal sob o número CEUA
ESBAM Nº 16, sendo todos os procedimentos executados de acordo com os critérios
éticos aplicados ao uso animal no ensino e nas pesquisas regulamentados pela Lei Federal
11.794, de 08 de outubro de 2008 e pela Resolução do CFMV nº 879 de 15 de fevereiro de
2008.
Imediatamente após as coletas, os swabs foram levados ao laboratório da clínica
veterinária escola para a confecção de esfregaços diretos realizados por rolamento do swab
em lâmina. Estes foram fixados na chama de uma vela, posteriormente corados pela
técnica de Gram e deixados secar. Depois as lâminas foram observadas em microscópio
óptico (ZEISS®) em objetiva de imersão (1.000x).
Após a coloração, a microbiota da mucosa oral dos cães foi classificada de acordo
com suas características morfológicas (reação tintorial, morfologia e arranjo).
Resultados e Discussão
Das amostras coletadas de um total de 30 animais, 70% (21/30) foram de animais
levados à clínica e 30% (9/30) de animais atendidos na comunidade ribeirinha Tupé.
Quanto à raça, um exemplar das raças Sharpei, Dálmata, Dachshund, Chow Chow,
Yorkshire, Bulldog Inglês, Pastor Alemão, Shitzu, dois exemplares das raças Labrador, Pit
Bull, Poodle e 16 animais sem raça definida (SRD), com idade entre dois meses e 13 anos,
sendo nove filhotes, 13 adultos, dois idosos e seis animais os proprietários não souberam
informar a idade. Quanto ao sexo, 46,7% (14/30) eram machos e 53,3% (16/30) eram
fêmeas (Tabela 1).
Apenas 30% (9/30) dos animais avaliados apresentaram halitose. Quanto à
alimentação, 53,3% (16/30) comiam ração, 26,7% (8/30) comida caseira, 16,7% (5/30)
ambas e 3,3% (1/30), o proprietário não soube informar, pois havia retirado o animal da
rua recentemente. Quanto ao domicílio, 66,7% (20/30) eram domiciliados, 30% (9/30)
semi-domiciliados e 3,3% (1/30) eram errantes. Apenas dois animais, da raça Poodle, já
haviam feito tratamento odontológico e os mesmos apresentavam perda de dentes. Todas
as informações coletadas resumiram-se na Tabela 1.
Quanto à coloração dentária, os animais foram classificados em três categorias:
normal (dentes hígidos, brancos e sem acúmulo de placa bacteriana visível), amarelada
(dentes já apresentando placa bacteriana) e escurecida (dentes que já se apresentavam
344
cobertos por placa bacteriana deixando-os com aspecto marrom a preto). Nesta
classificação, 70% (21/30) dos animais apresentaram dentes de coloração normal, 23,3%
(7/30) amarelada e 6,7% (2/30) escurecida. Nenhum dos animais analisados apresentou
sinais de gengivite ou sangramento.
Tabela 1. Distribuição da frequência das variáveis raça, idade, sexo, alimentação e tipo de
criação dos 30 animais avaliados durante a pesquisa.
Cães Raça Idade Sexo Alimentação Tipo de Criação
1 Dachshound 2 meses M R D
2 SRD 3 meses F R D
3 Pit Bull 4 meses F R D
4 SRD - F - E
5 Dálmata 2 meses F R D
6 Labrador 2 anos F A D
7 Labrador 1 ano M A D
8 Sharpei 1 ano F A D
9 Chow Chow 5 meses M R D
10 SRD - F R D
11 SRD - M R D
12 SRD - M R D
13 Yorkshire 4 meses M R D
14 SRD - M R D
15 SRD 6 anos F R D
16 Poodle 13 anos M A D
17 Podlee 12 anos M R D
18 Bulldog Inglês 2 meses F R D
19 Pit Bull 7 anos F R D
20 Pastor Alemão 2 anos M R D
21 SRD 3 anos F CC SD
22 SRD 5 anos F CC SD
23 SRD 8 anos M CC SD
24 SRD 1 ano M CC SD
25 SRD 2 anos F CC SD
26 SRD - M CC SD
27 SRD 8 anos M CC SD
28 SRD 8 anos F A SD
29 SRD 6 meses F CC SD
30 Shitzu 7 meses F R D SRD = Sem Raça Definida, M = Macho, F = Fêmea, R = Ração, CC = Comida caseira, A = Ambas, D =
Domiciliado, SD = Semi-domiciliado, E = Errante.
Os microrganismos bacterianos encontrados foram classificados segundo sua
reação tintorial como Gram-positivos ou Gram-negativos, segundo sua morfologia como
345
cocos, bacilos, cocobacilos, diplococos, bacilos em ou filamentosos, e segundo seu arranjo
como estafilococos, estreptococos, estreptobacilos ou sarcinas (Tabela 2).
Devido à sua morfologia característica, bacilos grandes com estriação transversal, a
bactéria Simonsiella spp. foi a única classificada em nível de gênero.
Tabela 2. Classificação morfológica da microbiota encontrada nos 30 animais avaliados
durante a pesquisa.
Microrganismos Quantidade
de animais
%
Cocos Gram-positivos 26 86,7
Cocos Gram-negativos 14 46,7
Cocos Gram-positivos semelhantes a Estreptococos 8 26,7
Cocos Gram-positivos semelhantes a Estafilococos 8 26,7
Cocos Gram-negativos semelhantes a Estafilococos 1 3,3
Diplococos Gram-positivos 16 53,3
Cocobacilos Gram-positivos 4 13,3
Cocos semelhantes a Sarcinas Gram-positivas 2 6,7
Bacilos Gram-positivos 20 66,7
Bacilos Gram-negativos 3 10
Bacilos em espiral Gram-positivos 3 10
Simonsiella Gram-negativas 30 100
Estreptobacilos Gram-positivos 17 56,7
A presença de Simonsiella spp. foi observada em 100% dos animais, semelhante a
Nyby et al. (1977), que observaram esta mesma bactéria em 99% de suas amostras na
Califórnia. No presente estudo, destacou-se que em um animal (amostra 02) Simonsiella
spp., foi a única bactéria encontrada, ressaltando a conclusão desses autores que a
consideraram uma bactéria residente comum da cavidade oral de cães.
No presente estudo, as formas bacterianas encontradas foram em sua maioria Gram-
positivas, como encontrado por Domingues et al. (1999) e citado por Roza (2004).
Os microrganismos observados, quanto a sua morfologia e arranjo, foram
predominantemente cocos isolados, diplococos, agrupados (estafilococos) ou em cadeia
(estreptococos). De acordo com Koneman et al. (2001), nos esfregaços diretos, os pares e
as cadeias curtas de microrganismos não podem ser diferenciados dos estreptococos,
micrococos ou peptoestreptococos, embora os estreptococos frequentemente apareçam
como cadeias de diplococos, em lugar de cadeias de células individuais, como observado
na amostra 23.
346
Dos animais analisados, 53,3% (16/30) eram alimentados com ração e apresentaram
os seguintes microrganismos: cocos Gram-positivos, cocos Gram-negativos, bacilos Gram-
positivos, bacilos Gram-negativos, diplococos Gram-positivos, cocobacilos Gram-
positivos, cocos Gram-positivos semelhantes a estreptococos, cocos Gram-positivos
semelhantes a estafilococos, estreptobacilos Gram-positivos, bacilos em espiral e
Simonsiella spp.
Os alimentados com comida caseira eram 26,7% (8/30) e apresentaram todos os
microrganismos acima, com exceção de cocobacilos Gram-positivos. Duas dessas amostras
apresentaram microrganismos com morfologia semelhante a sarcinas Gram-positivas.
Os animais alimentados com ração e comida caseira foram 16,7% (5/30) e
apresentaram os seguintes microrganismos: cocos Gram-positivos, cocos Gram-negativos,
bacilos Gram-positivos, cocos Gram-positivos semelhantes a estreptococos, cocos Gram-
positivos semelhantes a estafilococos, estreptobacilos Gram-positivos, bacilos em espiral e
Simonsiella spp.
O animal que o tutor não soube informar o tipo de alimentação (3,3% - 1/30)
apresentou cocos Gram-positivos, cocos Gram-negativos, bacilos Gram-positivos,
diplococos Gram-positivos, cocos Gram-positivos semelhantes a estreptococos,
estreptobacilos Gram-positivos e Simonsiella spp.
Na literatura consultada não foram encontrados dados para comparar com os
resultados quanto ao tipo de alimentação. Embora a alimentação inadequada, como rações
úmidas enlatadas ou dieta caseira que não proporcionam abrasão necessária, seja um fator
predisponente ao acúmulo de placa e de cálculo (Engelkirk e Duben-Engelkirk, 2012).
Nenhum dos tutores realizava a escovação ou limpeza dentária dos animais
avaliados nesse estudo, concordando com Miller e Harvey (1994), que relataram que
menos de 10% dos tutores de cães escovam os dentes de seus animais, sendo a escovação
um dos métodos mais eficaz de interromper a formação da placa bacteriana (Santos et al.,
2012).
Dentre os animais estudados, oito tinham idade acima de quatro anos, mas apenas
dois apresentaram acúmulo excessivo de placa bacteriana, tendo os dentes escurecidos
(amostras 16 e 17). Outros dois apresentaram pouco acúmulo de placa e tinham dentes
amarelados (amostras 15 e 19), e os outros quatro apresentaram dentes sem placa visível
(amostras 22, 23, 26 e 27), embora a literatura relate que a prevalência de doença
periodontal alcance 85% dos animais com idade acima de quatro anos de idade.
347
Os animais com maior acúmulo de cálculo dentário eram animais idosos, que já
haviam feito tratamento dentário anteriormente; ambos apresentaram perda de dentes e um
se alimentava apenas de ração e o outro de ração e comida caseira. Nas amostras desses
animais foram observados em comum, cocos Gram-positivos, bacilos Gram-positivos e
Simonsiella spp. Além desses microrganismos, um animal (amostra 16) apresentou cocos
Gram-positivos semelhantes a estafilococos e bacilos Gram-positivos em espiral, enquanto
o outro (amostra 17) apresentou bacilos Gram-negativos, diplococos Gram-positivos e
estreptobacilos Gram-positivos.
Conclusões
A incidência de Simonsiella spp. foi de 100% nas amostras de mucosa oral
analisadas.
Em sua maioria, os microrganismos encontrados eram Gram-positivos, com os
cocos (86,7%) em maior proporção de ocorrências seguidos pelos bacilos (66,7%),
estreptobacilos (56,7%) e diplococos (53,3%).
Independentemente do tipo de alimentação recebida, os animais estudados
apresentaram, em sua maioria, os mesmos grupos de microrganismos.
A presença de doença periodontal não influenciou na diversidade de
microrganismos encontrados, assim como a alimentação.
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