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DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONOUNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNALIGASI
CLONAGGIO-IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI
-IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICAOTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA
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Il clonaggio del DNA
• Clonaggio: viene generata una molecola di DNA ricombinante, cioe’ isolata dal suo contesto e introdotta in un replicone (una unita’ di DNA capace di replicarsi detto vettore).
• Questa molecola di DNA ricombinante viene introdotta in un sistema cellulare appropriato (in genere batteri derivati dall’ Escherichia coli).
• Tutti i discendenti di questa singola cellula, detta clone, conterranno la medesima molecola di DNA ricombinante originariamente isolata, permettendo di produrne quantita’ praticamente illimitate
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Plasmidi
• Molecole extracromosomiali di DNA circolare, capaci di replicarsi e di segregare autonomamente rispetto al DNA cromosomale dei batteri. • Di solito sono portatori di geni che conferiscono ai batteri un vantaggio selettivo in particolari condizioni ambientali (resistenza agli antibiotici, ad es.)
• Possono ospitare DNA estraneo (a condizione che non sia troppo grande)
• Possono essere facilmente purificati dal DNA cromosomale in grande quantità.
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Plasmidi
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Plasmidi: Superavvolgimento
M
1
2
3
4
5
6
789
10
Non
dig
erit
o
Dig
erit
o
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Enzimi di restrizioneEnzimi di restrizioneIl DNA digerito con gli enzimi di restrizione può essere analizzato mediante elettroforesi
Plasmide (P)
DNA genomico (G) 3x 109 basi
Eco RI (E)
Eco RI
M
1
2
3
4
5
6
789
10
Bam HI (B)
P P+B P+E G+E
10 kb
+
-
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MAPPATURA ENZIMATICA DI UN TRATTO DI DNA
6.6 bp
PstI PstIHindIII HindIII
1.1 kb 0.6 kb 2.3 kb 1.2 kb 1.4 kb
PstI HindIIIM
1
2
3
4
+0,5
PstI+HindIII
1.1
1.4
4.1 -
1.7
2.32.6
1.1
0.6
2.3
1.41.2
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Le DNA ligasi sono enzimi capaci di legare covalentemente due molecole di DNA adiacenti
con estremità libere
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DNA RICOMBINANTE: due tratti di DNA che in natura non sonoadiacenti, vengono uniti in provetta.
Le proprietà degli enzimi di restrizione sono state essenziali per la tecnica del DNA ricombinante.
I due tratti da unire vengono tagliati con uno stesso enzima di restrizione.
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
EcoRI
G AATTCCTTAA G
G AATTCCTTAA G
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G CTTAA
AATTC G
GAATTCCTTAAG
Le estremità coesive prodotte da uno stesso enzima possono appaiarsi.
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GAATTCCTTAAG
5’
3’ 5’3’
DNA LIGASI ATP
5’
3’
GCTTAA
OH
P
AATTC G
OH
P
5’3’
G AATTCCTTAA G
5’
3’
OH P
OHP
G AATTCCTTAA G
OH
OH
P
P
5’
3’ 5’3’
Infine la DNA ligasi viene utilizzata per legare covalentemente le due molecole di DNA
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Solo estremità compatibili possono essere legate efficientemente
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INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO
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CLONAGGIO:
- LIGASI
- TRASFORMAZIONE
- SELEZIONE
- CRESCITA COLONIE
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IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA
BATTERICA DI INTERESSE
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Cosa può succedere in una reazione ligasica ?
1. Il vettore si richiude su se stesso senza legarsi con l’inserto
2. Il vettore si lega con l’inserto
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L’enzima beta-galattosidasi può essere utilizzato per discriminare le colonie che contengono un plasmide con inserto
da quelle che contengono un plasmide senza inserto
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ALCUNI ENZIMI PRODUCONO ESTREMITA’ TRONCHE (BLUNT)
ESTREMITA’ BLUNT POSSONO ESSERE LEGATE A ESTREMITA’ BLUNT PRODOTTEDA QUALSIASI ALTRO ENZIMA, NON CI SONO LE LIMITAZIONI IMPOSTE DALLACOMPLEMENTARIETA’ DELLE BASI DELLE CODINE APPICCICOSE.
SVANTAGGIO: LIGASI DI ESTREMITA’ BLUNT E’ MENO EFFICIENTE PECHE’ NONSI HA APPAIAMENTO TRA CODINE A SINGOLO FILAMENTO.
CCC/GGGGGG/CCC
GAT/ATCCTA/TAG
SmaI EcoRV
CCCGGG
ATCTAG
LA SEQUENZA IBRIDA CHE SI FORMA NON E’ RICONOSCIUTA DA NESSUNO DEIDUE ENZIMI.
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QUANDO E’ NECESSARIO UNIRE DUE ESTREMITA’ INCOMPATIBILI????
E’ POSSIBILE CONVERTIRE LE ESTREMITA’ STICKY IN ESTREMITA’ BLUNT
Estremita’ 5’ protruding:
5’3’5’
3’
L’estremità 3’ del filamento viene utilizzata come innesco dalla DNA POLIMERASI.Si utilizza il frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli (DNA POLIMERERASI intera ha azione 5’esonucleasica).
Estremità 5’ o 3’ protruding:
5’3’5’
3’
Si utilizza la nucleasi S1: nucleasi che funziona su singolo filamento.
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Il fago lambda come vettore di clonaggio
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Il ciclo vitale del fago lambda
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Placche di lisi
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Lisogenia
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Lisogenia
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Ricombinazione sito-specifica
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Ricombinazione omologa
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INFEZIONE
Produzione di enzimiPer la sintesi del DNA
Inizia la replicazione
Produzione di testee code del fago
packaging
lisi
FASE PRECOCE
FASE TARDIVA
Ciclo litico
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Un interruttore complesso
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Replicazione ‘rolling circle’
COS Genoma COS Genoma COS Genoma COS
Packaging
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Il fago lambda come vettore
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• VETTORI PLASMIDICI -> 0-10 kb
• VETTORI di inserzione -> 0-10 kb• VETTORI di sostituzione -> 9-23 kb• VETTORI COSMIDICI -> 30-44 kb
• VETTORI PAC (crom. artif. P1) -> 130-150 kb• VETTORI BAC (crom. artif. batt.)-> fino a 300 kb
• VETTORI YAC (crom. artif.lievito)-> 0.2-2 Mb
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Cosmidi
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P1
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YAC