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书书书

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2013,33(9):3844

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技术与方法

E.coliT蛋白 CM的原核表达及核磁方法指导下的晶体优化

芮 斌 谢长林 江 娜 文 汉(安徽农业大学生命科学学院 合肥 230036)

摘要 越来越多的研究表明许多致病菌的病原性与生物体内莽草酸途径中的分支酸变位酶(chorismatemutase,CM)有着密切的关系,因此CM成为了开发新型抗生素和抗菌药物的热门靶标酶。采用分子克隆的方法,在感受态细胞BL21Gold(DE3)中重组表达大肠杆菌(E.coli)T蛋白的CM(CMT)。通过NiNTA亲和层析柱、GESuperdex75凝胶过滤层析柱和 GEMonoQ阳离子交换层析柱纯化后得到电泳纯的重组蛋白,质谱鉴定结果与原始序列基本吻合。经过蛋白质晶

体试剂盒的初步筛选,在30% PEG4000,100mmol/LNaAcpH4.6,200mmol/LNH4Ac条件中发现

CMT晶体。利用核磁共振方法,分析CMT的1H15NHSQC谱图信息,指导设计CMT晶体的优化方

案,成功获得高衍射能力的CMT晶体,为CMT结构的解析奠定了坚实的基础。关键词 分支酸变位酶 CMT 原核表达 HSQC 晶体优化

中图分类号 TQ138

收稿日期:20130417  修回日期:20130507通讯作者,电子信箱:lifwen1000@163.com

  莽草酸途径是生成芳香族氨基酸、泛醌、甲酸、维

生素E和维生素K等多种代谢产物的共同途径,在植

物和微生物的合成代谢中起着重要的作用。哺乳动物

的细胞中不存在莽草酸途径,其自身也无法合成芳香

族氨基酸[1]。分支酸变位酶(chorismatemutase,CM)

是莽草酸途径中催化分支酸变构,使其走向苯丙氨酸

(Phe)和酪氨酸(Tyr)合成途径的重要功能酶[2]。许多

致病菌的病原性与生物体内的CM的存在有关,这一特

点使CM成为了国内外研究人员设计抗生素、抗菌药物

和肺结核等传染性疾病的重要靶标酶[3]。

  大肠杆菌P蛋白和T蛋白是分支酸途径中均含有

CM的双功能酶。前者具有分支酸变位酶(CMP)和预

苯酸脱水酶(PDT)活性,参与催化分支酸转化为预苯

酸,再进一步转化为苯丙酮酸,是合成苯丙氨酸的重要

步骤。后者具有分支酸变位酶(CMT)和预苯酸脱氢酶

(PDH)活性,能够转化分支酸为预苯酸,进而转化为

羟基苯丙酮酸,是合成酪氨酸的重要步骤[4]。尽管在

生物体内催化着同一反应,但 CMT与 CMP同源性只有

30%左右。CMP的结构已被Lee等[5]解析出来,包含3

个α螺旋,并且其酶活位点、催化机制和抑制分子都已

经被揭示。作为功能相似的 CMT,其结构特点,酶活位

点以及催化机制如何,是否和CMP的一致,都有待于进

一步的研究和探索。而CMT的结构信息是解决这一问

题的重要基础。

  要获得原子水平上的蛋白质结构,核磁共振波谱

法和X射线晶体衍射法是结构生物学中两种最主要的

技术。两种技术都有各自的优点和缺点,但又能够互

补。核磁共振波谱法可以在液体或固体的状态下解析

蛋白质的结构,但本身固有的技术缺陷却往往不能得

到高分辨率的蛋白质结构[6]。X射线晶体衍射法解析

蛋白质结构是建立在高质量蛋白质晶体的基础上,但

很多蛋白很难结晶、不结晶或其晶体无衍射能力[7]。

  初次筛选得到的晶体往往不能满足衍射的需要,

晶体的后续优化是得到高质量晶体的重要工作。传统

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2013,33(9) 芮 斌 等:E.coliT蛋白CM的原核表达及核磁方法指导下的晶体优化

的晶体优化主要针对的是晶体成核后的优化,而成核

前的蛋白聚集体的状态(分子的大小、构象等)往往直

接影响着晶体成核的情况[8],从而对晶体的质量产生重

要的影响。

  在现有的技术中,NMR因其化学位移的超高分辨

率和灵敏性使得核磁共振波谱法在无需预知生物大分

子的任何结构信息情况下就能对其构象特征进行研

究[9]。最重要的是,这种构象特点直接反应了被研究

样品的构象特点,获取的信息对获得高质量晶体有着

非常重要的指导作用,核磁共振波谱法还可以被用于

监测样品的状态、追踪在加入添加剂后样品状态的改

变[1011]。这些特点很好的改善了晶体筛选和优化时出

现的“allornothing”的情况[12],可以为晶体的优化方案

的选择和设计提供有效直观的信息支持。

  为了更加深入地了解大肠杆菌 CMT的结构信息,

将CMT的基因亚克隆至 p28a载体中,转化至 BL21

Gold(DE3)中,经 IPTG诱导表达。NiNTA亲和层析

柱、GESuperdex75凝胶过滤层析柱和 GEMonoQ阳离

子交换层析柱三步纯化后得到电泳纯的重组蛋白。利

用晶体试剂盒的筛选技术得到蛋白质的初晶,结合核

磁共振波谱法1H15NHSQC谱图信息,指导建立 CMT晶体的优化方案,最终得到了高衍射能力的CMT晶体,

为其结构的解析奠定了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒与培养基

  菌株与质粒:原核表达载体 p28a和感受态细胞

DH5α、BL21Gold(DE3)均由中国科技大学施蕴渝教授

实验室提供。

  培养基:LB培养基:10g/L蛋白胨,5g/L酵母提取

物,10g/L的NaCl,pH调节至7.0。

  LR14培养基:24g/LKH2PO4,5g/LNaOH,0.5g/L14NH4Cl,pH调节至7.0。0.1mmol/LCaCl2,2.2mmol/L

MgSO4,2.5g/L葡萄糖 (115℃、15min),140mg/ml

FeSO4(0.22μm抽滤灭菌)

  LR15培养基:用15NH4Cl替代 LR14中的14NH4Cl,

其他成分同LR14。

  以上培养基未特别注明的均在121℃条件下湿热

灭菌20min。

1.2 主要试剂和仪器

  试剂:PrimerStar购自TaKaRa公司,限制性内切酶

NdeI、XhoI和 T4DNA连接酶购自 Fermentas公司,质

粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒是 OMEGA公司产品,Chaps为BiobasicInc生物工程公司产品。  仪器:PCR仪为 BioRadC1000,纯化系统为 GEAKTApurifier,核磁谱仪为安捷伦科技公司产品。1.3 引物设计与合成  结合前期研究的结果和Jpred预测信息,确定 CMT的边界为 Tprotein的残基 189aa。以大肠杆菌(EscherichiacoliK12)原始质粒为模版,设计引物,在上游引物中加入 NdeI酶切位点,下游引物中加入 XhoI

酶切位点,并在前段加入相应的保护碱基。

  上游引物CMa:5′ACGTCATATGATGGTTGCTGAATTGACCGCAT3′  下游引物CMb:5′GCTACTCGAGTTATTTGTCGTTTTCACTGGAG3′  (下划线为酶切位点)。引物由上海华大基因有限

公司合成。

1.4 表达载体的构建与测序1.4.1 目的基因CMT的扩增与双酶切 以E.coliK12菌株原始质粒为模版,采用 CMa和 CMb为引物,对CMT目的基因进行扩增。  PCR体系(50μl):25μl2×PrimeStar、2μl上游引物、2μl下游引物、1μlE.coli原始质粒和20μlddH2O。PCR程序:98℃ 5min;98℃ 30s,72℃ 30s,共30循环;72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,采

用OMEGA胶回收试剂盒纯化后回收,在37℃条件下经NdeI、XhoI双酶切处理,产物经1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收。

1.4.2 表达载体 p28a双酶切 抽提原始表达载体p28a,经NdeI、XhoI双酶切处理后,琼脂糖凝胶电泳分离纯化后胶回收目的条带。

1.4.3 连接反应与重组质粒测序 将双酶切后的目的片段和表达载体按8∶1的比例混合,在 T4DNA连接酶的作用下,16℃水浴过夜连接。将连接产物转化至感受态细胞 DH5α中,并依据质粒所带的抗性(KanaR)进行转化子筛选。将筛选到的阳性菌落保种并送样测序。

1.5 重组蛋白的诱导表达、纯化与鉴定1.5.1 重组蛋白的诱导表达 抽提测序正确的阳性单克隆的质粒,转化至感受态 BL21Gold(DE3)细胞中,涂布于含50μg/mlKana抗生素的 LB筛选平板上,

置于恒温箱37℃过夜培养,挑取单克隆于5mlLB培养

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基中(含50μg/mlKana),过夜后扩大培养。诱导条件

经优化后,确定为37℃、0.3mmol/LIPTG、5h,在上清液

可获得大量的重组蛋白。

1.5.2 重组蛋白的纯化与鉴定 用 BindingBuffer

(20mmol/LTrispH8.0,500mmol/LNaCl)重悬收集到

的菌体,冰浴超声破碎10min后,13000r/min30min离

心收集上清液。将上清液载入用BindingBuffer预平衡

的NiNTA亲和柱中,用 BindingBuffer和含30mmol/L

咪唑的缓冲液(WashBuffer)依次洗涤杂蛋白,再用

300mmol/L咪唑缓冲液(ElutionBuffer)洗涤融合蛋白。

将 300mmol/L咪唑洗脱液浓 缩 至 5ml上 样 GE

Superdex75柱,收集目的峰蛋白质溶液,SDSPAGE凝

胶电泳检测蛋白纯度与状态。再将融合蛋白溶液浓缩

至5ml并透析至低盐 Buffer(20mmol/LTrispH8.0,

100mmol/LNaCl)中,上样阳离子交换层析柱 MonoQ

柱,高盐Buffer与 BindingBuffer成分一致。收集各接

样管的蛋白溶液,电泳检测纯度,收集纯度达到电泳纯

标准的样品,同时送样质谱鉴定。

1.6 重组蛋白晶体试剂盒的初步筛选

1.6.1 结晶的蛋白样品准备 根据前期测定的 CMT的溶解度特性,确定作为首批蛋白质晶体试剂盒筛选

的样品浓度为40mg/ml和20mg/ml,蛋白溶液的缓冲

液成分为:20mmol/LTrispH8.0,200mmol/LNaCl。

1.6.2 结晶条件的筛选 采用HamptonResearch公司

的 IndexScreen试剂盒;MolecularDimensions公司的

StructureScreen(1和2)试剂盒;EmeraldBioStructures

公司的 Wizard(Ⅰ 和 Ⅱ)试剂盒;Sigma公 司 的

CrystallizationKitforProteinProteinComplexes试剂盒,

共计340个条件。

  结晶方法:坐滴结晶法;结晶体系:1μlCMT溶液+

1μl平衡液;结晶温度:10℃,20℃。

1.7 重组蛋白15N标记样品的准备和1H15NHSQC谱

图的收集

  用LR15培养基培养重组细菌,15NCMT的诱导、表

达及纯化步骤与CMT的操作一致。将经过阳离子交换

层析纯化后的电泳纯蛋白样品过夜透析至15NCMT能

够稳定存在的的核磁缓冲液(20mMNaH2PO4pH6.8,

200mmol/LNaCl)中。将透析后的15NCMT溶液分别浓

缩至1mg/ml,2mg/ml,4mg/ml,8mg/ml。向不同浓度的

450μl蛋白溶液中加入50μl重水(D2O)锁场后记1H15

NHSQC谱,记谱的温度为25℃、探头为500mol/L。筛

选添加剂时,逐渐增加添加剂的浓度。

1.8 基于核磁方法指导下的晶体优化

  根据1H15NHSQC谱图提供的信息,优化 CMT晶

体时将样品浓度控制在4mg/ml以下,去垢剂 Chaps浓

度控制在0.5%(w/v)以下。结合原始出晶条件30%

PEG 4000,100mmol/L NaAc pH4.6,200mmol/L

NH4Ac,运用“网络法”梯度优化蛋白质的出晶条件。

2 结 果

2.1 PCR扩增CMT的目的基因和重组质粒的测序结

  扩增出的目的基因和预期结果相一致,约 300bp

处有目的条带(图1)。构建的重组质粒的测序结果表

明,目的基因正确连接到载体中,基因序列及读码框均

正确。

图1PCR扩增目的基因

Fig.1 SynthesisofCMTbyPCR

1:Themolecularweightofthefragment

ofCMT;2:DL2000DNAMarker

2.2 融合蛋白的诱导表达、纯化及鉴定

  扩大培养p28aCMTGold重组菌至100mlLB培养

基中,优化后确定的最佳表达条件为37℃、0.3mmol/L

IPTG、5h。诱导结束后,收集菌体,超声破碎离心取上

清液,经NiNTA亲和层析纯化,12% SDSPAGE电泳

检测后,结果如图2所示。CMT在上清液中大量表达,

占总蛋白量的85%以上。融合蛋白的挂柱效果非常

好,Elution洗脱液中的目的蛋白较为干净,但纯度还不

适用于晶体的筛选。

  将 Elution洗脱液浓缩至5ml上样 GESuperdex75

柱,U280吸收值曲线图如图3所示。从出峰的位置我们

可以计算出目的蛋白的分子量在20kDa左右,与前期

实验结果:CMT以二聚体的状态存在于缓冲液中相吻

合。峰型尖锐,说明状态较为优良,取峰尖处蛋白样

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图2 CMT的NiNTA柱纯化及

Superdex75柱纯化电泳结果

Fig.2 TheelectrophoresisresultsofCMTpurifiedby

NiNTAcolumnandSuperdex75column1:CMTinclusionbody;2:CMTsupernatant;3:CMTflowthrough;

4:Bindingbuffereluant;5:Proteinmarker;6:Washbuffereluant;

7:Elutionbuffereluant;8:CMTpurifiedbyGEsuperdex75column

品,12%SDSPAGE电泳检测后,结果如图2中8所示,

在目的条带相近处仍有一条较为明显的杂带。

  将收集到的目的蛋白浓缩至 5ml,透析至低盐

Buffer(20mmol/LTrispH8.0,100mmol/LNaCl)中,上

样阳离子交换层析GEMonoQ柱,高盐Buffer与Binding

Buffer成分一致。结果如图 4所示,在 Cond%在 0~

18h,能成功将目的蛋白和杂蛋白分离,当 Cond%处于

19以上时杂蛋白的条带依然存在,质谱鉴定结果与原

始序列大致吻合。

图3 CMTGESuperdex75柱纯化情况

Fig.3 TheCMTpurificationresultby

GESuperdex75column

2.3 晶体试剂盒的初筛

  将阳离子层析分离得到电泳纯的 CMT持续浓缩,

发现其溶解度能达到40mg/ml。根据传统晶体试剂盒

筛选工作的经验,选择用于晶体试剂盒筛选的 CMT浓

度为40mg/ml、20mg/ml。经过试剂盒的初次筛选,30d

图4 CMT阳离子交换层析纯化及SDS电泳检测情况

Fig.4TheresultsofCMTpurifiedafter

cationexchangechromatography

andSDSelectrophoresisM:Proteinmarker

后在 30% PEG 4000,100mmol/L NaAc,pH4.6,

200mmol/LNH4Ac条件中发现晶体如图 5所示,经

12%PAGE电泳检测后,确定此晶体为 CMT的蛋白质

晶体。通过X射线衍射仪衍射发现晶体无衍射能力。

梯度优化PEG、pH及 NH4Ac的浓度,发现所有条件出

现的晶体与原始晶体的晶型相似,且衍射能力无法得

到提高。

图5 30% PEG4000,100mmol/LNaAc(pH4.6),

200mmol/LNH4Ac条件中的CMT晶体

Fig.5 TheCMTcrystalintheconditionof30%

PEG4000,100mmol/LNaAcpH4.6,

200mmol/LNH4Ac

2.4 目的蛋白CMT的异核单量子关系(HSQC)

  利用晶体下游的优化技术对晶体的晶型和衍射能

力没有明显的改善,考虑 CMT在缓冲液中的状态是否

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会对晶体生长有影响。通过记录15NCMT的1H15N

HSQC谱图可动态的检测蛋白质在缓冲液中的状态。

根据1.7中所述方法获得15NCMT蛋白相应浓度的样

品,在25℃、500mol/L探头下记录1H15NHSQC谱图。

从图 6、7对比的结果可知:当 CMT 浓度 4mg/ml

时1H,15NHSQC谱图中谱峰分散均匀,信号较为均一,

说明蛋白质具有一定的二级结构且蛋白溶液均一性良

好。当浓度上升到8mg/ml时,CMT的1H15NHSQC谱

图中的谱峰明显聚集在中间,信号强弱十分不均。与

图6相比,图7中峰的数目也有所增加。这些都说明蛋

白质已经处于高聚状态,此时的 CMT溶液状态非常地

不均一。于是选择性地向8mg/mlCMT中加入不同种

类和浓度的去垢剂,来寻找改善聚合的方法。经过筛

选,从图7与图8的对比结果,可以发现 Chaps对 CMT的聚合情况有明显的改善,从图8与图9的对比结果,

可以看出Chaps浓度过高对蛋白状态有着负面的影响。

图6 4mg/mlCMT的1H15NHSQC结果

Fig.6 The1H15NHSQCresultof4mg/mlCMT

图7 8mg/mlCMT的1H15NHSQC结果

Fig.7 The1H15NHSQCresultof8mg/mlCMT

2.5 核磁方法指导下的晶体生长及其衍射图谱

  基于1H,15NHSQC的指导,采用晶体筛选的蛋白

图8 8mg/mlCMT+0.5%Chaps的1H15NHSQC结果

Fig.8 The1H15NHSQCresultof

8mg/mlCMT+0.5%Chaps

图9 8mg/mlCMT+1.0%Chaps的1H15NHSQC结果

Fig.9The1H15NHSQCresultof

8mg/mlCMT+1.0%Chaps

质浓度为 4mg/ml和 2mg/ml,再进行 PEG、pH及

NH4Ac优化的,对添加到 CMT溶液中的 Chaps进行了

梯度的优化。最终在26% PEG4000,100mmol/LNaAc

(pH5.0),160mmol/LNH4Ac,0.3%Chaps条件下发现

衍射能力达2埃的晶体,晶体图片如图10所示,X射线

衍射图谱如图11所示。

3 讨 论

  分支酸变位酶催化分支酸转化成预苯酸,为苯丙

氨酸与酪氨酸的合成提供前体。这种酶促反应十分特

殊,因 为 它 是 克 莱 森 重 排 (pericyclic claisen

rearrangement)代谢中的特例[13]。不同种属的分支酸

变位酶成为国内外研究人员热门的研究对象,其中对

结核分支杆菌的CM研究最为深入,它的结构、酶活位

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图10 优化后CMT晶体

Fig.10 TheCMTcrystalafteroptimization

图11 优化后CMT晶体的衍射图谱

Fig.11 ThediffractionpatternoftheCMT

crystalafteroptimization

点、催化机制以及抑制分子的筛选合成和衍化都已经

取得了初步的成果,对新型肺结核药物的开发有着重

要的意义[1415]。目前对于大肠杆菌 T蛋白中的 CM研

究还相对较少。

  实验利用PCR技术,构建了p28aCMT原核表达载

体,转化进 BL21Gold(DE3)感受态细胞中,获得了高

效可溶性表达的 CMT。经过 NiNTA柱纯化后纯度较

高,但未达到电泳纯的标准。据 CMT在 Superdex75中

的出峰位置可确定重组表达的CMT以二聚体的形式存

在于缓冲液中。但是,通过电泳检测发现,分子筛纯化

不能将CMT与其分子量十分相近的杂蛋白进行有效的

分离。最后,通过阳离子交换层析的纯化方法获得电

泳纯的CMT样品。

  获得电泳纯的 CMT样品后,经过初步的蛋白质晶

体试剂盒的筛选,30d后在30% PEG4000,100mmol/L

NaAcpH4.6,200mmol/LNH4Ac条件下发现晶体,通过

电泳检测确定为 CMT的蛋白质晶体。随后,在进行传

统的蛋白质晶体的下游优化时,始终未能得到理想的

具有衍射能力的晶体。影响蛋白质晶体质量的因素有

很多,目前为止没有任何一套理论适用于每个晶体的

生长。对于蛋白质晶体的优化,大部分的工作都聚焦

在下游优化上。

  除了结晶条件是影响蛋白质晶体质量的因素外,

CMT溶液的均一性也是重要的影响因素。相比较传统

的检测蛋白质均一性技术,如在晶体优化中运用最多

的动态光散射技术,核磁共振技术可以在检测水平上

精确监测蛋白质分子的每一个氨基酸残基的化学位移

变化,从而反映蛋白质溶液的特性。特别在复合物晶

体的优化方面,核磁技术能够检测分子之间的作用界

面,可以通过修饰作用界面的氨基酸残基的方式,提高

亲和力,促进复合物晶体的生长。通过对 CMT进行15N

标记,记录其1H15NHSQC谱图,谱图中每一个交叉峰

代表重组蛋白的一个氨基酸,谱峰的变化可以直接说

明重组蛋白的构象和状态的变化[7]。通过对 CMT的1H15NHSQC谱图的分析,发现当 CMT的浓度在

4mg/ml时,谱峰分散均匀,信号较为均一,说明重组蛋

白折叠正确有着一定的二级结构。但当浓度上升到

8mg/ml时,谱峰堆积严重,谱峰数明显增多,说明蛋白

质存在严重的聚合。随后,向聚合的 CMT样品中添加

了不同的去垢剂,发现 Chaps对 CMT的聚合有较大的

改善。

  研究最终确定将晶体优化时 CMT的浓度控制在

4mg/ml以下,同时向溶液中加入不同浓度的 Chaps。

通过对结晶的溶液成分进行“网络法”筛选,在20℃温

度下,26% PEG 4000,100mmol/LNaAcpH 5.0,

160mmol/LNH4Ac,0.3%Chaps条件里发现衍射能力

达2埃左右的蛋白质晶体。这为CMT晶体结构的解析

奠定了坚实的基础,也为如何利用核磁共振波谱学指

导蛋白质晶体优化提供了新的思路。

致谢 感谢中国科技大学施蕴渝教授全体研究组、安

徽大学葛宏华副教授对本次实验的支持和指导。

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ProkaryoticExpressionofCM ofTproteinfromE.coliandItsCrystalOptimizationGuidedbyNMR

RUIBin XIEChanglin JIANGNa WENHan(SchoolofLifeSciences,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei 230036,China)

  Abstract Moreandmoreresearcheshaveshownthatthepathogenicitiesofmanybacteriaarerelatedtotheirchorismatemutasesintheshikimatepathway.CMsrepresentahotselectivetargetforthedevelopmentofantibioticsandfungicides.ByPCRtherecombinantCMTwasexpressedincompetentcellsE.coliBL21Gold(DE3)successfully.ThepuritycouldreachelectrophoresispurityafterpurificationbyNiNTA affinitychromatography,GEsuperdex75gelfiltrationcolumnandGEMonoQcationexchangechromatography.TheresultofmassspectramatchedwiththeoriginalsequenceofCMTbasically.AndthenCMTcrystalwerefoundin

theconditionof30% PEG4000,100mmol/LNaAcpH4.6,200mmol/LNH4Ac.Theapplicationof1H15N

HSQCNMRprovidedguidanceforoptimizationofCMTcrystal,andfinallywesuccessfullyobtainedthehighdiffractionCMTcrystal.ThisworklaysthefoundationforthestructureofCMT.  Keywords CM CMT Prokaryoticexpression HSQC Crystaloptimization

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