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EFEITOS DOS AGROTEFEITOS DOS AGROTÓÓXICOS XICOS SOBRE AS ABELHAS SEM SOBRE AS ABELHAS SEM
FERRFERRÃÃOOProfa. Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo
TakasusukiUniversidade Estadual de Maringá
Departamento de Biotecnologia, Genética eBiologia Celular
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Colony Collapse Disorder (CCD)
• Final do ano de 2006 nos EUA - Milhares de colônias foram dizimadas – perdas consideráveis para a agricultura em função da falta de polinizadores.
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• A Sindrome do Colapso das abelhas (CCD) corresponde ao desaparecimento repentino das abelhas ou a redução, em poucas semanas ou dias, do tamanho da colônia, mesmo na presença de crias, pólen e mel, porém sem deixar vestígios de morte de abelhas.
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ProvProv ááveis causas para o desaparecimento das abelhas: veis causas para o desaparecimento das abelhas:
– Manejo das colônias - estresse– Ácaro Varroa destructor e patógenos associados– Desnutrição das abelhas – polinização de monoculturas
– acesso a somente um tipo de pólen de cada vez– pragas e patógenos recém-descobertos ou aumento de
virulência de patógenos existentes e interações entre duas ou mais das hipóteses acima
– Pesticidas
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• Departamento de Agricultura dos EUA - Maio de 2013 a morte de quase 1/3 das abelhas
• Redução, em 6 anos, de 30,5% do número de colônias de abelhas nos EUA.
• Santa catarina – relatos do desaparecimento de um terço das 300.000 abelhas do Estado bateu asas em 2012
• Defensivos agrícolas, particularmente os pesticidas neonicotinoides, como uma das principais hipóteses para explicar o CCD.
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ORGANOFOSFORADOS – Inibidores de acetilcolinaesterases
NEONICOTINOIDES – derivados da molécula de nicotina – age m nos receptores nicotínicos
FIPRONIL – grupo químico fenilpirazol - . Seu mecanismo de ação baseia-se no bloqueio pré e pós-sináptico da passagem dos íons cloro pelos neurotransmissores GABA, matando os parasitas por hiper-excitação
REGULADORES DE CRESCIMENTO - agem sobre a estrutura do tegumento dos insetos e sobre os mecanismos de controle da metamorfose e ecdise (troca de pele), atuando, principalmente, nas fases imaturas dos insetos.
HERBICIDAS�Novaluron - herbicida sistêmico seletivo de ação de pós - emergência�Paraquat - É um composto quaternário do amônio utilizado
como herbicida e altamente perigoso para os humanos, caso ingerido.
INSETICIDAS
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Receptor nicotínico
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Abelhas e res íduos de inseticidas
• Polinizadores de muitas espécies de plantas cultivadas e matas naturais
• As abelhas são responsáveis por 40 a 90% da polinização em áreas naturais
• O que acontece se esses insetos se contaminam com inseticidas ou outros compostos xenobióticos?
• O que acontece com a sua cria, o ninho ou colmeia e com os seus produtos que muitas vezes são utilizados por nós?
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4 espécies de abelhas do gênero Tetragonisca• Tetragonisca buchwaldi – Costa Rica, Equador
e Panamá• Tetragonisca weyrauchi – restrita a Amazônia
• Tetragonisca angustula – Desde o M éxico até o sul do Brasil (n ão ocorre no Chile)
• Tetragonisca fiebrigi – Argentina, bolívia, Brasil (Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Paran á, Rio Grande do Sul, São Paulo), Paraguai
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Quatro classes de agrotóxicos de acordo com a CL50 para abelhas:
•Classe 1- extremamente tóxicos CL50 > 2µg/abelha• Classe 2- altamente tóxicos CL50 entre 22µg e 10,99µg/abelha• Classe 3- moderadamente tóxicos CL50 entre 11µg e 100µg/abelha• Classe 4- pouco tóxicos CL50 < 100µg/abelha
(Larini, 1999; Hunt, 2000)
Toxicidade dos inseticidas medida CL50 (concentração letal que proporciona a morte de 50% da população)
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Como os experimentos são montados
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• Fizemos experimentos para estimar a CL50 em Apis mellifera contaminadas com inseticidas:
• Thiamethoxam (neonicotinoide): – A CL50 por ingestão foi de 4,7x10-5 a 10x1010-5 mg/mL
(0,000047 a 0,0001 mg/mL)– A CL50 por contato variou de 3,2 a 4,5 mg/mL– Aplicação por contato e por ingestão desse inseticida levou a
uma inibiinibi çãçãoo parcial da atividade relativa das esterases 1,2, 4 esterases 1,2, 4 e 5 e 5 das operárias – essas enzimas degradam compostos xenobióticos (estranhos ao organismo das abelhas)
• Organofosforados – methil-parathion e malathion– Com o malathion houve aumento aumento da atividade relativa da ESTEST--3 3
e inibiinibi çãção parcial da ESTo parcial da EST --4 4 . Com o metil-parathion inibiinibi çãção o parcial das ESTparcial das EST --3 e EST3 e EST--44
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Abelhas jata í Tetragonisca angustula eTetragonisca fiebrigi
• Nesse estudo foram avaliadas as alterações ocorridas na expressão das esterases de abelhas do gênero Tetragonisca após contaminação com agrotóxicos
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Perfil eletroforético das esterases em gel de poliacrilamida. A = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragonisca fiebrigi e B = extratos de cabeça/tórax de operárias de Tetragonisca angustula.
A B
EST-2 EST-3
EST-4
EST-1
EST-4
+
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Agroquímico CL50 (%) 95% Limite de confiançaFipronil – contato 0,00062 0,00053 – 0,00075
Fipronil – ingestão 0,00123 0,00121 – 0,00127Malathion – contato 0,50 -----Malathion – ingestão 0,38 0,22 – 0,55
Nim - contato ----- -----Nim - ingestão ----- -----
Thiamethoxam -contato
0,79 0,61 – 1,04
Thiamethoxam –ingestão
0,21 0,17 – 0,27
Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas Tetragonisca fiebrigi submetidas ao fipronil, malathion, Nim e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento)
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ConcentraçõesEsterases
EST-1 EST-2 EST-4Fipronil (%)
0,0001 - - -0,0005 - - -0,0006 - - -0,0007 - - -0,0011 - - -
Malathion (%)0,0017 - - -0,0018 - - -0,0019 - - -0,002 - - -0,004 - - -
Thiamethoxam (%) 0,7 - - -
0,8 - - -0,85 - - -0,9 - - ++1 - - -
Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragonisca fiebrigiapós contato com fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (++) aumento de intensidade da banda
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ConcentraçõesEsterases
EST-1 EST-2 EST-4Fipronil (%)
0,0011 - - -0,0012 + - +
0,00125 - - -0,0025 - - -0,025 - - -
Malathion (%)0,2 - - +0,3 - - -0,4 - - -
0,45 - - +0,5 - - -
Thiamethoxam (%)0,15 - - -0,2 - - -
0,22 - - -0,24 - - -0,5 - - -
Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragonisca fiebrigiapós ingestão de fipronil, malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial
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MalathionControle
EST-4
+
EST-3
Perfil eletroforético das esterases de extratos de cabeça/tórax de Tetragonisca angustula, mostrando a inibição parcial da EST-3 e EST-4, após contaminação por contato com o inseticida malathion na concentração de 0,003%.
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Agroquímico CL50 (%) 95% Limite de confiançaFipronil – contato 0,00053 0,00024 – 0,00064
Fipronil – ingestão 0,00056 0,00053 – 0,00059Malathion – contato 0,00315 -----Malathion – ingestão 1,33 0,54467 – 2,18486
Nim – contato ----- -----Nim – ingestão ----- -----
Thiamethoxam -contato
0,1622 0,06343 – 0,34581
Thiamethoxam –ingestão
0,2133 -0,00039 – 0,5357
Concentrações letais a 50% (CL50) das abelhas Tetragonisca angustula submetidas ao fipronil, malathion, Nim e thiamethoxam, tanto por contato (papel filtro) como por ingestão (alimento)
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ConcentraçõesEsterases
EST-3 EST-4Malathion (%)
0,0025 - +0,0028 - -0,003 + +0,004 - -
0,1 - -Thiamethoxam (%)
0,05 - -0,07 - -0,1 + +0,2 - -0,3 - -
Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragonisca angustula após contato com malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial
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ConcentraçõesEsterases
EST-3 EST-4Malathion (%)
0,4 - -0,6 - -1 + +2 - +3 - -
Thiamethoxam (%)0,005 - -0,008 - -0,01 - -0,02 - -0,03 - -
Inibição da atividade das esterases detectada em Tetragonisca angustula após ingestão de malathion e thiamethoxam. (-) ausência de inibição; (+) inibição parcial
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Herbicida Diluição (%) Concentração (g/ml)
Sanson 40 SCNicossulfuron 40 g/l
100 0,000375 0,00022550 0,0001510 0,000031 0,000003
Gramoxone 2001,1'−dimetil−4,4'−bipiri
dilio dicloreto (paraquat) 200g/l
100 0,001510 0,000151 0,000015
0,1 0,0000015
Análise de isoenzimas e citoquímica de Tetragonisca angustula and Tetragonisca fiebrigi
após contaminação com herbicide
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Teste Concentração (%)
Concentração
(g/ml)
Mortas
Vivas % Indivíduos mortos
Controle(água
destilada) ---- 0 56 0
Sanson 40 SC®
(nicosulfuron)
1 0,000003 0 60 010 0,00003 4 57 6,550 0,00015 0 60 075 0,000225 4 46 8,0
100 0,0003 0 60 0Total 8 339
Controle(água
destilada)----
0 60 0
Gramoxone 200®
(paraquat)
0.1 0,0000015 0 40 01 0,000015 0 40 010 0,00015 0 40 0
100 0,0015 4 36 10,0Total 4 216
Mortalidade de T. angustula nos bioensaios com os herbicidas nicosulfuron (Sanson 40 SC®) e paraquat (Gramoxone 200®) após 24h de exposição.
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Isoenzimas
Herbicidas MDH-2 MDH-3 SOD-1 EST-3 EST-4
Nicosulfuron (%)
1% + + + + +
10% + + + + +
50% + + + + +
75% + + + +- +-
100% + + + +- +-
Paraquat (%)
0,1% + + + + +
1% + + + +- +-
10% + + ++ - -
100% + + ++ - -
Inibição da atividade das isoenzimas malato desidrogenase (MDH), superóxido dismutase (SOD) e esterase (EST) detectada em T. angustula após contato com Nicosulfuron e Paraquat. (+) ausência de inibição; (+-) inibição parcial; (-) inibição total; (++) aumento na expressão.
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Experimentos por longo tempo com Tetragonisca angutula
• Contaminação por contato com inseticidas reguladores de crescimento:– Natuneem e azamax – azadiractina – atua no
hormônio ecdisona (hormônio de muda)– Galaxy – novaluron – inibe a síntese de
quitina
• Utilizando papel filtro embebido no inseticida
• Análises feitas após 48, 120, 168 horas, 30 e 60 dias.
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Azadiracta indica – nome popular nim ou amargosa
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Inseticidas utilizados Concentrações em %
Gallaxy EC 100 0,5%
6,25%
10%
NatuNeem 0,5%
2,5%
100%
AzaMax 1%
5%
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Scaptotrigona bipunctata -tubuna
• Testes por contato com natuneem –regulador de crescimento– Apresentou baixa toxicidade para as S.
bipunctata
– Não houve alteração na expressão das esterases
– Mas houve alteração em nível de cromatina, indicando que outras enzimas e proteínas aumentaram sua expressão após a contaminação
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NatuNeem 0,5%
NatuNeem 2,5%
AzaMax1%
AzaMax5%
Gallaxy 0,5%
Gallaxy 6,25%
48 horas
s.a. + - s.a. s.a. s.a.120 horas
s.a. n.e s.a. s.a. s.a. n.e
168 horas
n.e n.e s.a. s.a. n.e n.e
30 dias - n.e n.e n.e s.a. n.e60 dias s.a. n.e + s.a. + n.e
Análise da intensidade relativa da esterase EST-4 em Tetragonisca angustula, após a contaminação por NatuNeem. Legenda: - = inibição parcial; + = aumento da atividade relativa; s.a. = sem alteração; n.e. = não estimado
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Atualmente estamos realizando testes para verificar possíveis alterações na expressão
gênica em Tetragonisca angustula utilizando técnicas de PCR quantitativo em tempo real
– analisando a expressão de genes de estresse.
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• Os resultados obtidos em relação a mortalidade das abelhas Tetragonisca submetidas a contaminação com inseticida thiamethoxam (neonicotinoide) e organofosforado, mostraram que há uma correlação dose resposta – Ou seja, quanto maior a quantidade de
inseticida utilizado maior a mortalidade das abelhas
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• As Tetragonisca fiebrigi são mais suscetíveis aos inseticidas testados que as Tetragonisca angustula
• Os inseticidas reguladores de crescimento também causam alterações na expressão de enzimas esterases (detoxificação do organismo das abelhas) de Tetragonisca angustula mesmo depois de 60 dias da contaminação
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Resultados iniciais tem mostrado que S. bipunctata são mais tolerantes ao inseticida
natuneem que as abelhas T. angustula.
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Obrigada!