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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 1Elektrophoretische Analytik
Elektrophorese von Proteinen I
H.Schlichting
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 2Elektrophorese dient zur Analyse von Proteinen
Proteine• bestehen aus 50 – 5000 Aminosäuren (20 Typen)• haben Molekulargewicht 5 – 500 kDa• sind ausgestreckt 20 – 1000 nm lang• sind zunächst ungeladen, jedoch mit inhomogener Ladungsverteilung
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 3Übersicht
Bewegung von Ionen (Proteine) im freien ElektrolytenLeitfähigkeitHydrathülle
Bewegung von Ionen (Proteine) in GelenOgston ModellReptation Modell
Elektrophoretische TechnikGelbildungIonenbeweglichkeit
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 4Bewegung eines positiven Ions im freien Elektrolyten
fc
+
EqFe ⋅=
Elektrostatische Kraft
vFfr ⋅=
Reibungs-Kraft
Gleichgewicht
fre FF =
Er
frFr
eFr
vr
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 5Definition der Beweglichkeit
Durch Kraft verursachte Bewegung eines Körpersin einem Medium mit Reibung,
die durch die Bewegung verursacht wird:
Kräfte-Gleichgewichtfre FF =
Da Kräfte-Gleichgewicht herrscht, ist die Bewegung gleichförmig,also nicht beschleunigt, solange die Feldstärke konstant bleibt.Die Geschwindigkeit ist konstant.
Ev=:µBeweglichkeit
Ev ⋅= µKonstante Geschwindigkeit
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 6Bewegungskräfte durch viskose Reibung
Die Proteine bewegen sich in einer "zähen" Flüssigkeit. Diese verursacht Reibungskräfte, ähnlich derviskosen, laminaren Reibung in einer Flüssigkeit.
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 7Bewegung in Flüssigkeiten: Das Stokessche Gesetz
Reibungskraft auf eine makroskopische ungeladene Kugelbei laminarer Bewegung in einer freien Flüssigkeit
vηπrFfr ⋅⋅= 6
ηDynamische Viskosität
Stokessches Gesetz
frFr
vr
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 8Die Viskosität einer Flüssigkeit
ηDynamische Viskosität
Die Viskosität ist die Eigenschaft eines Gases oder Flüssigkeitdie dessen Zähigkeit beschreibt.
Hohe Viskosität -> zähflüssigNiedrige Viskosität -> dünnflüssig
Einheit Pa s (Pascal Sekunde) = N s / m2
Luft 17,2 µPas
Wasser 1,002 mPas (25C)
Ethanol 1,2 mPas
Olivenöl 80,8 mPas
Glycerin 1480 mPas
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 9Stokessches Modell der Beweglichkeit im freien Elektrolyten
Stokessches Modell der Bewegung eines Ions im Elektrolyten:Das Ion verhält sich wie eine Kugel die an andere Atome in der Flüssigkeitstößt und dadurch abgebremst wird.Elektrische Kräfte spielen für die Reibung keine Rolle.
vηπrEq ⋅⋅=⋅ 6fre FF =
Ev=µ
ηπrq
⋅=
6
3
34 rm ⋅= πρKugelförmiges Ion
mq ∝Homogene Ladungsverteilung
Weitere Annahmen:
31
mr ∝
Resultierende Beweglichkeit
32
m∝µResultierende Beweglichkeit
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 10Resultate des Stokesschen Modells
32
m∝µBeweglichkeit des Ions im freien Elektrolyten
Ergebnis des Modells:Die Beweglichkeit nimmt zu mit steigender Masse.Bei konstanter Feldstärke bewegen sich schwere Ionen schneller als leichte !
Das steht im krassen Widerspruch zum Experiment,in Realität ist der Massen-Exponent
null (freier Elektrolyt) oder negativ (Gel)
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 11Stab-Modell für Ionen-Bewegung im freien Elektrolyten
Stab-Modell:Protein als langestreckter biegsamer StabMasse proportional zur LängeLadung proportional zur Länge (auf chemischem Weg)
->Reibungskraft proportional zur Länge (laminare Reibung prop. Fläche)Elektrische Kraft proportional zur Länge
->Beweglichkeit unabhängig von Länge also auch von Masse
EqLFe ⋅⋅∝ 0fre FF = η⋅⋅∝ 2rLFfr
0m∝µResultierende Beweglichkeit
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 12Bewegungskräfte durch Wechselwirkung mit Ionen
Die Proteine bewegen sich in einer Träger-Flüssigkeit,zusammen mit anderen teil-dissoziierenten Molekülen,die über Ladung und Reibung gegenseitig wechselwirken.
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 13Leitfähigkeit eines Elektrolyten
Die gesamte Leitfähigkeit eines Elektrolyten setzt sich aus der Leitfähigkeitdurch Anionen und Kationen zusammen.
+− += σσσSpezifische Leitfähigkeit
( )+++−−− +⋅⋅= zczcF µµασSpezifische Leitfähigkeit
lmolcKonzentration der Ionen (Molarität) Einheit
FFaraday KonstantemolAs
Einheit
αDissoziationskonstante
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 14Leitfähigkeit eines Elektrolyten
Grundsätzliche Idee der Leitfähigkeit:Jedes in die Lösung eingebrachte Molekül dissoziiertJedes der Anionen und Kationen trägt mit seiner konstanten Beweglichkeitzur Leitfähigkeit bei.
Realität:Nicht jedes Molekül dissoziiertDie Beweglichkeit hängt von den anderen Ionen ab
=>Modelle für die Leitfähigkeit unter unterschiedlichen Bedingungen
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 15Reaktionsgleichgewicht
+− +↔+ OHAOHHA 32Reaktionsgleichung schwache Säure HA(z.B. HCl, gilt aber auch für Elektrolyt NaCl)
Reaktionsgleichgewicht allgemeinonRückreakti
nHinreaktio
VVK =
Reaktionsgeschwindigkeit v ~ Konzentration der Ausgangsprodukte
[ ][ ][ ][ ]OHHA
OHAK2
3+−
=Dissoziationsgleichgewicht
[ ]Xchemische Schreibweise für Konzentration
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 16Das Ostwaldsche Verdünnungsgesetz
[ ]c
A−
=αDefinition Dissoziationsgrad
cAusgangskonzentration der Säure
αα−
=1
2cDissoziationsgleichgewicht [ ][ ][ ][ ]OHHA
OHAK2
3+−
=
[ ] cA α=− [ ] cOH α=+3 [ ] 12 =OH[ ] cHA )1( α−=
−
+⋅= 141
2
21
c
c
Kc
cKαAllgemein
1<<αfür kleine Dissoziationsgrade
Ostwaldsches Verdünnungsgesetzc
Kc=α
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 17Resultierende reale Leitfähigkeiten von Elektrolyten
Schwache Elektrolyte, verdünntOstwaldsches Verdünnungsgesetz c
Kc=α
( )+++−−− +⋅⋅= zczcF µµασSpezifische Leitfähigkeit
( ) c⋅+∝ +− µµσKonzentrationsabhängige LeitfähigkeitSchwacher verdünnter Elektrolyte
Starke Elektrolyte, verdünnt 1=α
( ) c⋅+∝ +− µµσKonzentrationsabhängige LeitfähigkeitStarker verdünnter Elektrolyte
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 18Molare Leitfähigkeiten von Elektrolyten
c∝σSchwache verdünnte Elektrolyte Nicht alle Ionen sind dissoziert
c∝σStarke verdünnte Elektrolyte Alle Ionen sind dissoziert
cσ=Λ :Molare Leitfähigkeit
0lim:
→∞ Λ=Λc
Die Grenzleitfähigkeit:Leitfähigkeit im Linitunendlicher Verdünnung
∞Λ=ΛStarke verdünnte Elektrolyte
−
+⋅⋅Λ=Λ ∞ 141
2
21
c
c
Kc
cK
Schwache Elektrolyte
c1⋅Λ=Λ ∞Schwache verdünnte Elektrolyte
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 19Reale Elektrolyte
schwacher Elektrolyt
starker Elektrolyt
Mol
are
Leitf
ähig
keit Λ
Konzentration c
schwacher Elektrolyt
starker Elektrolyt
Leitf
ähig
keit σ
schwacher Elektrolyt
starker Elektrolyt
Konzentration c
Die Grenzleitfähigkeit schwacher Elektrolyte ist oft größer als die starker
Auch starke Elektrolyte dissoziieren bei hohen Konzentrationen nicht vollständig
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 20Kohlrausch's Gesetz
1 KCl 2 LaCl3
3 CaCl2 4 Na2SO4
5 LiCl 6 MgSO4
∞Λ=ΛMolare LeitfähigkeitStarker verdünnter Elektrolyte
Kohlrausch's Gesetz(empirisch)Molare LeitfähigkeitStarker Elektrolyte
cK 1−Λ=Λ ∞
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 21Das Debye-Hückel-Modell
Bestätigung des Kohlrausch-Gesetzes durch das Debye-Hückel-Onsager-Modell
Erklärung der verbleibenden Konzentrationsabhängigkeitaus Hydrathülle
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 22Hydrathülle, Solvatisierung
HHO
H2O-Dipol
+Zentral-Ion
Hydrathülle
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 23Bewegungskräfte im Debye-Hückel-Modell
Konsequenzen der Hydrathülle:Das Debye-Hückel-Onsager-Modell bestätigt Kohlrausch's Gesetz
cK 1−Λ=Λ ∞
Molare Leitfähigkeit
relFRelaxations-Kraft
retFRetardations-Kraft
Der effektive Teilchenradius ist erheblich größer als das einfache IonBei Bewegung entstehen Relaxationskräfte aufgrund derVerformung der Hydrathülle
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 24Visualisierung der Reibungskräfte auf Ionen im freien Elektrolyten
( )BvqFrr×⋅=Lorentz-Kraft⇔Reibungskraft
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 25Bewegungskräfte in / durch Trennmatrix
Bisher alle Überlegungen im freien Elektrolyten
Bei der Elektrophorese bewegen sich die Proteine in
einer porösen Matrix die mit Elekrolyt 'gefüllt' ist
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 26Bewegungskräfte auf ein Ion in einer Trennmatrix
+
Er
vr
frFr
eFr
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 27Bewegungskräfte auf ein langestrecktes Ion in einer Trennmatrix
Unterschiedliche Regime die von der Masse des Ions (Proteins) abhängen
0m∝µ
1−∝ mµ
Rg= a
−∝
2
expa
Rgµ
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 28Das Ogston Modell
Das Ogston Modell, Bewegung kleiner Ionen in einer MatrixIon als harte KugelBewegung in Hohlräumen die die Kugel unterschiedlich weit ausfüllt
Resultierende Beweglichkeit:
−∝
2
expaRµ
Radius RaMaschenweite
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 29Das Reptation Modell
Das Reptation Modell, Bewegung mittlerer und großer Ionen in einer MatrixIon als Knäul das sich durch Höhlräume schlängelt und dabei teilweise entwirrtBewegung in Röhre
Resultierende Beweglichkeit:
1−∝ mµ
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 30Ionen unterschiedlicher Massen im Reptation-Modell
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 31Modell - Tatsächliche Reptation
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 32Auftrennung von Proteinen mittels Elektrophorese
PorigesHydro-Gel
GrößenMark
Protein-
proben
Protein-
proben
Protein-Probe
5 kDa
200 kDa
Färbung
Massentrennungdurch Laufzeit"Bremseffekt" er
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 33Manuelle Elektrophorese
Separation time: 1 - 2 hSeparation by Molecular Weight
Assembly of Equipment
Detection by StainingSDS-PAGE, 14 Steps
Total time: 2 - 4 h
Total time: 8 -12 h
Detection via AntibodiesWesternBlot, 27 Steps
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 34Typische Apparaturen der Gel-Elektrophorese
Vertikale Elpho Horizontale Elpho
Röhrchen Elpho Kapillar Elpho
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 35Typischer Elpho-Run in Vertikaler Kammer
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 36Hydrogel als Trennmatrix: Polyacrylamid
5%-Gel Porengröße 5,3nm20%-Gel Porengröße 3,3nm
90 % Wasser10 % (Acrylamid + Bis-Acrylamid)
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 37Bildung des Netzwerks durch radikalische Reaktion
Chemische Polymerisation• Reaktionsstart durch thermische Radikalbildung aus
Ammoniumperoxodisulfat (NH4)2S2O8 (Initiator)
• Übertragung der Radikale auf TEMED (Katalysator) und von dort auf Acrylamid-Momomere Bildung von Polymerketten + Querverknüpfungen
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 38Bildung des Netzwerks durch radikalische Reaktion
Photo-Polymerisation• UV-Bestrahlung eines photosensitiven Initiators (UVA-UVC)
• Radikalbildung durch:
• Spaltung des Initiators in 2 radikalische Moleküle (Benzoin-Derivate)
• H-Abstraktion (Quinone, Benzophenone)
• charge transfer (Riboflavin) Rib • + TEMED • Acrylamid • PAA
• Übertragung der Radikale auf Acrylamid Polymerisation
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 39Geltypen als Trennmatrix
3 - 6 nm einstellbar150nm - 500nm(Konz:1% - 0.2%)
Porengröße
Proteine, Peptide, DNAfür Moleküle >10nm øDNA, Proteine>500kDa
Anwendung
2 Doppel-Helices lateral, verknüpft an den EndenZwischenräume gefüllt mit crosslinked Polymeren
Netzwerk aus crosslinked Polymeren(AA : BA = 19 bis 40 : 1)
2 Doppel-Helices lateral, verknüpft an den Enden
Struktur
Acrylamid/Bisacrylamid + Agarose
Acrylamid/BisacrylamidPolysaccharid(aus Rotalgen)
Bestand-teile
CompositePolyAcrylamidAgarose
T= (a+b)*100/V
C=b*100/(a+b)
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 40Verhalten ungeladener Teilchen in Flüssigkeit: Diffusion
sm2
1xcDj
∆∆⋅−=1. Fick'sches Gesetz
sm2
DDiffusionskonstante
H+ in Wasser 9,3 10-9 m2s-1
Dextrose in Wasser 1,3 10-9 m2s-1
Protein in Wasser 0,02 10-9 m2s-1
Diffusions-Länge 1mm30 s3 min5 h
Diffusion durch Membran cPj ∆⋅−=
Permeabilität P sm
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 41Diffusion
Zusammenhang zwischen Diffusionskonstante und Beweglichkeit eines Ions
Einstein RelationzFRTD ⋅= µ
Stokes-Einstein Relationr
kTDπη6
=
Hergeleitet für:Ion ist eine Kugel mit Radius rKräfte durch Reibung in der Flüssigkeit mit Viskosität η
2. Fick'sches Gesetz2
2
zcD
tc
∂∂⋅=
∂∂
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 42Beispiele Diffusion
⋅
Φ−=tD
zCtzC NN 2
12
),(0
Dtz
NN e
tDctzC 4
0 2
),(−
⋅⋅=
π
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 43Diffusion Osmose
Was ist Unterschied zwischen Diffusion und Osmose ?
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 44Schwierigkeiten: Bandenverbreiterung - Sensitivität
Probe typisches Volumen 5 µl = 5 mm3
TrennRichtung Gel-Matrix
Die Konzentration der Proben ist vorgegeben.Damit man eine ausreichende Sensitivität erzielt,benötigt man eine bestimmte Stoffmenge.Je geringer die Konzentration desto breiter wird die Probe im Gel 'verschmiert'.Lösung:Ankonzentrierung der Probe durch StackerGel
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 45Ionen im freien Elektrolyten: unterschiedliche Konzentrationen
ii c~σLeitfähigkeit
Konzentration ic
1c 2c
Ir
iiE
σ1~Feldstärke da nur 1 Strompfad
Geschwindigkeiti
i cv µ~ Ev ⋅= µda
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 46Ionen im freien Elektrolyten: Konzentrations-Grenze
21 cc <
cKonzentration
c~σ σLeitfähigkeit
σ1~E
EFeldstärke
vGeschwindigkeit
cv µ~
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 47Ionen im freien Elektrolyten: Wandernde Konzentrations-Grenze
An einem Konzentrations-Anstieg desElektrolyten 'stauen' sich die Ionen.
21 cc <0=t
1tt =
1
2
2
1
cc
vv =
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Elpho 1 WS08 H.Schlichting 48Probe im freien Träger-Elektrolyten: Stacking
Verwendung eines Konzentrations-Anstieg desTräger-Elektrolyten um die Probe anzukonzentrieren.
21 cc <0=t 0=t
1tt =
1
2
2
1
cc
vv =Wenn Trägerobe µµ <Pr