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Elettroforesi di DNA su gel di agarosio
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Principio:Consente di separare molecole cariche grazie all’applicazione di un campo elettrico
Il DNA, carico (–) a pH neutro, migra verso il polo positivo
(anodo)
(CATODO) (ANODO)
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Da cosa dipende la velocità di migrazione
� DIMENSIONE DEL DNA
� CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO NEL GEL
� CONFORMAZIONE DEL DNA
� VOLTAGGIO APPLICATO � circa 5 Volt/cm (distanza anodo-
catodo)
� PRESENZA DI BROMURO DI ETIDIO
� COMPOSIZIONE (FORZA IONICA) DEL BUFFER �
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V =V =LogLog1010 bpbp
KKrelazione di proporzionalità diretta tra pb e PM:
-- molecole grandimolecole grandi migrano migrano lentamentelentamente
-- molecole piccolemolecole piccole migrano migrano velocementevelocemente
(K varia al variare della concentrazione di agarosio nel gel)
� DIMENSIONE DEL DNA
Direzione migrazione
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� CONCENTRAZIONE DI AGAROSIO NEL
GEL
• L’agarosio è un polimero lineare che forma una matrice semisolida avente pori di dimensione diversa in funzione della concentrazione utilizzata
• La sua concentrazione determina il potere risolutivo del gel
D-Galattoso-3,6-Anidro-L-Galattoso
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� CONFORMAZIONE DEL DNA
DNA superavvolto, lineare e circolare hanno velocità di migrazione diversa anche se di dimensione uguale:
- La forma SUPERAVVOLTA corre piùveloce perché è più compatta;
- La forma CIRCOLARE corre più lentaperché è la più “ingombrante” e fa piùfatica a muoversi all’interno dei pori del gel;
- La forma LINEARE si colloca a metà (la forma lineare è, ad esempio, quella che si ritrova come prodotto nella PCR).
Superavvolto
Lineare
Ve
locità
Circolare
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� PRESENZA DI BROMURO DI ETIDIO
• Colorante fluorescente (intercalante) che consente di visualizzare il DNA
• Assorbimento a 254 nm (U.V.) ed emissione nel visibile (590 nm)
• Riduce la velocità di migrazione di circa il 15%
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Pesare la
quantità
desiderata di
agaroso e
scioglierla in
un volume
adatto di
tampone
Bollire,
aggiungere
etidio bromuro
e versare
nell’apposito
apparato per la
corsa
elettroforetica
Caricare la reazione alla
quale sia stato aggiunto
un colorante, in uno dei
pozzetti del gel d’agarosio
o e far avvenire la corsa
elettroforetica fornendo
energia elettrica.
Avvenuta la
corsa,
illuminare il
gel con raggi
UV per
rendere
visibile il DNA
Preparazione del gel di agarosio
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1 2 3
4 5 6
7 8 9
Preparazione del gel di agarosio
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Caricamento del gel
I campioni di DNA vengono miscelati ad un colorante
(orangeorange) con funzione di addensante ed indicatore del fronte elettroforetico
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Caricamento del gel
Marcatore di dimensioni:
È costituito da frammenti di DNA aventi dimensioni note e consente di determinare la dimensione del DNA campione
Viene fatto migrare
insieme ai campioni di DNA
come riferimento
dimensionale
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Il risultato della PCR
Risultato della PCR
612
M8 1 2 3 4 5 6 7 8 b
501bp
692bp
612bp